CN114957164B - 一种脂质化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种脂质化合物及其制备方法与应用，该脂质化合物安全高效可电离，其结构分为亲水的胺基、连接基团和疏水的烷基，该脂质化合物的制备方法简单，绿色高效；该脂质化合物可广泛应用于制备药物载体中。

Description

一种脂质化合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于制药领域，具体涉及一种脂质化合物及其制备方法与应用。
背景技术
基因治疗的代表是一类核酸药物如小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)，信使RNA(Message RNA,mRNA)，质粒DNA(plasmid DNA,pDNA)等一些具有治疗目的的外源基因通过载体材料递送到靶细胞中从而发挥治疗效果。mRNA疫苗已经成为癌症免疫治疗的一个有前途的平台。在接种过程中，裸露或载药的mRNA疫苗在抗原提呈细胞(antigenpresenting cell,APCs)中有效表达肿瘤抗原，促进APC激活和先天/适应性免疫刺激。然而，mRNA治疗仍然面临着缺乏安全有效的传递系统的挑战，因为大尺寸和密集的负电荷使得裸露的mRNA难以通过细胞膜。此外，mRNA本身也是一种不稳定的分子，容易降解。因此开发一种高效安全的核酸递送系统是基因治疗的基石。
目前在核酸递送系统最常见的是两类载体：病毒载体和非病毒载体，其中病毒载体转染效率相对较高，但是存在安全性、靶向性差等问题。数十年来脂质体作为代表的非病毒载体发展迅速，因其免疫原性低、生物相容性好，转染效率高而被看作理想的核酸递送系统。相对于传统脂质体，可电离脂质在体内的稳定性，转染效率都大大提升，并且在体内运输时显电中性，从而生物毒性小。可电离脂质是一种两亲结构，具有一个亲水的头部，包含一个或多个可电离的胺和多条疏水的能促进自组装的烷烃链，以及连接头部和尾部的Linker，可电离脂质在酸性pH下胺基头部会质子化从而获得正电荷，可以通过静电作用促进带正电的脂质和带负电的mRNA结合。脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles,LNP)在细胞内环境运输时，酸性的微环境可以使正电脂质和离子内膜互相作用，促进膜融合和不稳定，从而使mRNA从LNPs释放到细胞质中。
现有的RNA疗法由于其负载的RNA对核酸酶非常敏感，而且RNA体积大、带有负电荷，无法渗透细胞膜。现有技术可通过脂质纳米颗粒将RNA传递到靶细胞，为应对包括COVID-19在内的一系列疾病提供了巨大的治愈可能。但传统的脂质化合物核酸递送系统存在效率低、毒性大、靶向性差等问题，因此有必要开发一种效率高、毒性小、靶向性优良的脂质化合物。
发明内容
为了克服现有技术存在的脂质化合物效率低、毒性大、靶向性差的问题，本发明的目的之一在于提供一种脂质化合物；本发明的目的之二在于提供这种脂质化合物的制备方法；本发明的目的之三在于提供这种脂质化合物的应用；本发明的目的之四在于提供一种药物组合物。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明第一方面提供一种脂质化合物，所述脂质化合物的结构如式(Ⅰ)所示；
式(Ⅰ)中，A选自式(1)-式(18)所示的结构，B选自式(19)所示的结构，n选自2-4的正整数；
式(19)中，R1选自C6-C12的烷基或烯基，m选自1-6的正整数。
优选的，所述式(Ⅰ)中，A选自式(3)、式(5)-式(16)所示的结构，B选自式(19)所示的结构，n为2；
所述式(19)中，R1选自C7-C9的烷基，m选自2-5的正整数。
优选的，所述脂质化合物包括以下所示结构的化合物；
本发明第二方面提供根据本发明第一方面所述脂质化合物的制备方法，包括以下步骤：
将式(Ⅱ)所示的化合物与选自式(20)-式(37)所示的化合物混合，反应，得到所述的脂质化合物；
式(Ⅱ)中，R1选自C6-C12的烷基或烯基，m选自1-6的正整数；
优选的，所述式(Ⅱ)所示的化合物与所述选自式(20)-式(37)所示化合物中活性氢原子的摩尔比为(1-2)：1；进一步优选的，所述式(Ⅱ)所示的化合物与所述选自式(20)-式(37)所示化合物中活性氢原子的摩尔比为(1-1.5)：1。
优选的，所述活性氢原子为与氮原子连接的氢原子。
优选的，所述反应的时间为24h-72h；进一步优选的，所述反应的时间为36h-60h。
优选的，所述反应的温度为70℃-110℃；进一步优选的，所述反应的温度为80℃-100℃。
优选的，所述反应为无溶剂反应。
本发明第三方面提供根据本发明第一方面所述脂质化合物在制备核酸药物、基因疫苗、多肽或蛋白质药物、小分子药物中的应用。
优选的，所述核酸药物的氮磷比为(12-36)：1；进一步优选的，所述核酸药物的氮磷比为(18-30)：1。
本发明第四方面提供根据本发明第一方面所述脂质化合物在制备药物载体中的应用。
优选的，所述药物包括RNA药物、DNA药物、蛋白质药物或小分子药物；进一步优选的，所述药物包括RNA药物、DNA药物或蛋白质药物。
优选的，所述RNA药物包括siRNA、miRNA、mRNA、antisense RNA、CRISPR guideRNAs、可复制性RNA、环状二核苷酸、poly IC、CpG ODN中的至少一种。
优选的，所述DNA药物包括plasmid DNA。
优选的，所述蛋白质药物包括细胞集落刺激因子、白介素、淋巴毒素、干扰素、肿瘤坏死因子中的至少一种。
本发明第五方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包括根据本发明第一方面所述的脂质化合物。
优选的，所述药物组合物还包括药物活性成分。
优选的，所述药物组合物包括根据本发明第一方面所述的脂质化合物与二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇(Cholesterol)、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)的复配。
优选的，所述脂质化合物与二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)或二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇(Cholesterol)、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)的摩尔比为(10-100)：(0-90)：(0-90)：(0-90)；进一步优选的，所述脂质化合物与二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)或二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇(Cholesterol)、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)的摩尔比为(30-50)：(5-15)：(40-50)：(0-5)。
本发明的有益效果是：
本发明提供的脂质化合物安全高效可电离，其结构分为亲水的胺基、连接基团和疏水的烷基，该脂质化合物的制备方法简单，绿色高效；该脂质化合物可广泛应用于制备药物载体中。
具体来说，本发明具有如下优点：
1、本发明提供脂质化合物结构中含有酯键，在体内可以快速被酶水解，易于代谢清除，具有生物降解性；该脂质化合物结构中带有支链形状，在组装脂质纳米颗粒后可以增加脂质疏水部的横截面积，帮助纳米药物从内涵体中逃脱，进而增强转染效果；该脂质化合物在酸性条件下可以获得氢质子，电离成阳离子，能够与带负电的核酸分子通过静电相互作用进行结合，与辅助性脂质组成脂质纳米颗粒，可有效递送mRNA、pDNA进入细胞内，表达目的基因；该脂质化合物的电荷可以随着pH的改变而改变，在中性条件下呈电中性，减小因正电荷过多而带来的细胞毒性，进而增加脂质纳米颗粒稳定性，而且能避免正电荷过多时在体内被迅速降解，并有助于延长所负载的核酸药物的循环时间、改善药物动力学特征。
2、相对于传统的阳离子脂质，本发明制备的可电离脂质化合物，合成步骤简单，产物分离便捷，具有高效率低毒性等优点；本发明制备的脂质化合物初始原料常见易得，反应条件简单温和，路线设计合理；本发明基于常见的烷基醇化合物和有机胺化合物，通过简单的酯化反应和迈克尔加成合成具有不同电离基团，不同支链长度的可电离脂质。
3、本发明提供的脂质化合物解决了核酸递送中的问题，可以在体内和体外高效转染mRNA，其转染效果与商业化转染试剂相当，该脂质化合物可广泛应用于制备药物和制备药物载体中。
附图说明
图1为中间产物B的核磁氢谱图。
图2为中间产物C的核磁氢谱图。
图3为实施例1制备的脂质3-2-C8的核磁氢谱图。
图4为实施例2制备的脂质10-2-C8的核磁氢谱图。
图5为中间产物D的核磁氢谱图。
图6为中间产物E的核磁氢谱图。
图7为实施例3制备的脂质3-4-C8的核磁氢谱图。
图8为实施例4制备的脂质10-4-C8的核磁氢谱图。
图9为脂质化合物相对荧光素酶活性结果图。
图10为脂质化合物相对荧光素酶活性结果热图。
图11为脂质化合物的纳米颗粒的粒径测试图。
图12为脂质化合物相对荧光素酶活性结果图。
图13为脂质化合物的相对荧光素酶活性结果图。
图14为脂质化合物的相对荧光素酶活性测试结果图。
图15为脂质化合物的荧光显微镜结果图。
图16为脂质纳米颗粒在小鼠各器官的分布图。
图17为小鼠注射脂质纳米颗粒体内成像系统检测图。
图18为脂质化合物注射时间与总通量图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器末注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
本申请实施例脂质化合物的编号含义为：A结构的结构式编号-式(19)所示结构的m取值-式(19)所示结构的R1的碳原子数，例如编号“3-2-C8”表示，式(Ⅰ)所示结构中，A选自式(3)所示结构，B选自式(19)所示结构，且m选自2，R1选自C8烷基。以此类推，“3-3-C8”与“3-2-C8”区别仅在于m选自3，其余结构相同。
实施例1
本例脂质化合物的制备步骤如下：
1)在装有磁子的100mL反应管中依次加10mmol 9-十七醇，30mL N,N'-羰基二咪唑，20mmol三乙胺和30mL二氯甲烷，反应管在40℃条件下加热过夜，待反应冷却至室温，使用二氯甲烷和饱和食盐水萃取，其中加入1mol/L的HCl(20mL)洗涤。收集有机层用无水硫酸镁干燥并过滤，使用旋转蒸发仪除去溶剂，产物A无需纯化即可进行下一步反应。具体反应式如下；
2)使用10mmol中间产物A、20mmol乙醇胺和30mL二氯甲烷加入到装有磁子的100mL反应管中，反应在40℃条件下加热24小时，待反应冷却至室温，使用二氯甲烷和饱和食盐水萃取。收集有机层用无水硫酸镁干燥并过滤，使用旋转蒸发仪除去溶剂，产物通过薄层色谱柱分离(石油醚：乙酸乙酯体积比＝5：1)，得到中间产物B，收率达89％。具体反应式如下；
图1为中间产物B的核磁氢谱图。其具体氢谱数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3):5.07-5.04(m,1H),4.73-4.70(m,1H),3.70(t,J＝4.8Hz,2H),3.34-3.30(m,2H),2.50(s,1H),1.51-1.49(m,4H),1.30-1.25(m,24H),0.87(t,J＝6.8Hz,6H)。
3)使用5mmol中间产物B，7.5mmol三乙胺和20mL二氯甲烷加入到装有磁子的三口烧瓶中，在冰浴条件下预冷30min，再使用恒压漏斗缓慢滴加6.25mmol丙烯酰氯，待丙烯酰氯滴加完毕，移走冰浴，反应在室温下过夜，然后用二氯甲烷(30mL)稀释并用1mol/L HCl(50mL)洗涤。有机层用无水硫酸镁干燥并过滤，使用旋转蒸发仪除去溶剂，产物通过薄层色谱柱分离(石油醚：乙酸乙酯＝20：1)，得到中间产物C，收率达81％。具体反应式如下；
图2为中间产物C的核磁氢谱图。其具体氢谱数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3):6.43(dd,J＝17.2,1.2Hz,1H),6.12(q,J＝6.8Hz,1H),5.85(dd,J＝10.4,1.2Hz,1H),4.80(dt,J＝49.2,6.4Hz,2H),4.23(t,J＝5.2Hz,2H),3.51-3.47(m,2H),1.50(s,4H),1.30-1.25(m,24H),0.87(t,J＝6.4Hz,6H)。
4)在装有磁子的3mL反应瓶内加入200mg 1-(2-氨乙基)吡咯烷，2倍化学当量的中间产物C，90℃搅拌48h，得到本例脂质，经过薄层色谱柱分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20：1)，得到目标产物，本例脂质名称记为3-2-C8。具体反应式如下；
图3为实施例1制备的脂质3-2-C8的核磁氢谱图。具体氢谱数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3):5.29(s,2H),4.74-4.72(m,2H),4.16(t,J＝5.2Hz,4H),3.43-3.42(m,4H),2.80(t,J＝6.8Hz,4H),2.59-2.35(m,8H),2.22(s,6H),1.53(s,8H),1.29-1.25(m,48H),0.87(t,J＝6.4Hz,12H)。
实施例2
本例脂质化合物的制备步骤如下：
1)中间产物C的制备过程与实施例1相同。
2)在装有磁子的3mL反应瓶内加入200mg 2-二甲氨基乙胺，2倍化学当量的中间产物C，90℃搅拌48h，得到本例脂质，经过薄层色谱柱分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20：1)，得到目标产物，本例脂质名称记为10-2-C8。具体反应式如下；
图4为实施例2制备的脂质10-2-C8的核磁氢谱图。具体氢谱数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3):5.31(s,2H),4.74-4.71(m,2H),4.16(t,J＝5.2Hz,4H),3.43-3.42(m,4H),2.81(t,J＝6.8Hz,4H),2.63-2.45(m,10H),1.94(s,2H),1.78-1.74(m,4H),1.51(s,8H),1.32-1.26(m,48H),0.87(t,J＝6.4Hz,12H)。
实施例3
本例脂质化合物的制备步骤如下：
1)中间产物A的制备过程与实施例1相同。
2)使用10mmol中间产物A，20mmol 4-氨基-1-丁醇和30mL二氯甲烷加入到装有磁子的100mL反应管中，反应在40℃条件下加热24小时，待反应冷却至室温，使用二氯甲烷和饱和食盐水萃取。收集有机层用无水硫酸镁干燥并过滤，使用旋转蒸发仪除去溶剂，产物通过薄层色谱柱分离(石油醚：乙酸乙酯＝5：1)，得到中间产物D，收率达83％。具体反应式如下；
图5为中间产物D的核磁氢谱图。其氢谱数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3):4.79-4.67(m,2H),3.64(s,2H),3.18(s,2H),2.20-2.02(m,2H),1.58-1.55(m,3H),1.46(s,4H),1.31-1.23(m,24H),0.85(t,J＝6.4Hz,6H)。
3)使用5mmol中间产物D，7.5mmol三乙胺和20mL二氯甲烷加入到装有磁子的三口烧瓶中，在冰浴条件下预冷30min，再使用恒压漏斗缓慢滴加6.25mmol丙烯酰氯，待丙烯酰氯滴加完毕，移走冰浴，反应在室温下过夜，然后用二氯甲烷(30mL)稀释并用1mol/L HCl(50mL)洗涤。有机层用无水硫酸镁干燥并过滤，使用旋转蒸发仪除去溶剂，产物通过薄层色谱柱分离(石油醚：乙酸乙酯＝15：1)，得到中间产物E，收率达80％。具体反应式如下；
图6为中间产物E的核磁氢谱图。其氢谱数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3):6.40(dd,J＝17.2,1.6Hz,1H),6.11(q,J＝10.4Hz,1H),5.82(dd,J＝10.4,1.6Hz,1H),4.67(dt,J＝30.8,6.4Hz,2H),4.17(t,J＝6.4Hz,2H),3.23-3.18(m,2H),1.73-1.67(m,2H),1.60-1.56(m,2H),1.48(s,4H),1.30-1.25(m,24H),0.87(t,J＝6.4Hz,6H)。
4)在装有磁子的3mL反应瓶内加入200mg 1-(2-氨乙基)吡咯烷，2倍化学当量的中间产物E，90℃搅拌48h，得到本例脂质，经过薄层色谱柱分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20：1)，得到目标产物，本例脂质名称记为3-4-C8。具体反应式如下；
图7为实施例3制备的脂质3-4-C8的核磁氢谱图。具体氢谱数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3):4.74-4.71(m,4H),4.07(t,J＝6.4Hz,4H),3.20-3.18(m,4H),2.80(t,J＝6.8Hz,4H),2.60-2.42(m,10H),2.04-1.98(m,2H),1.78-1.74(m,4H),1.68-1.46(m,16H),1.31-1.25(m,48H),0.87(t,J＝6.8Hz,12H)。
实施例4
本例脂质化合物的制备步骤如下：
1)中间产物E的制备步骤与实施例3相同。
2)在装有磁子的3mL反应瓶内加入200mg 2-二甲氨基乙胺，2倍化学当量的中间产物E，90℃搅拌48h，得到本例脂质，经过薄层色谱柱分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝20：1)，得到目标产物，本例脂质名称记为10-4-C8。具体反应式如下；
图8为实施例4制备的脂质10-4-C8的核磁氢谱图。具体氢谱数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3):4.80-4.71(m,4H),4.10(t,J＝6.4Hz,4H),3.22-3.20(m,4H),2.93-2.71(m,4H),2.59-2.38(m,8H),2.24-2.23(m,6H),1.70-1.50(m,16H),1.31-1.27(m,48H),0.89(t,J＝6.8Hz,12H)。
参照上述的制备方法(迈克尔加成反应)，通过采用不同的反应原料可得到其它结构的脂质化合物，此处未重复赘述。表1为本申请实施例制备的脂质化合物具体结构。
表1本申请实施例制备的脂质化合物具体结构
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性能测试
1.脂质化合物递送质粒DNA测试
使用脂质化合物在293T细胞系中递送编码绿色荧光蛋白(GFP)和萤火虫荧光素酶(Luc)的质粒DNA。分别使用脂质化合物3-2-C8、5-2-C8、6-2-C8、7-2-C8、8-2-C8、9-2-C8、10-2-C8、11-2-C8、12-2-C8、13-2-C8、14-2-C8、15-2-C8、16-2-C8；3-3-C8、5-3-C8、6-3-C8、7-3-C8、8-3-C8、9-3-C8、10-3-C8、11-3-C8、12-3-C8、13-3-C8、14-3-C8、15-3-C8、16-3-C8；3-4-C8、5-4-C8、6-4-C8、7-4-C8、8-4-C8、9-4-C8、10-4-C8、11-4-C8、12-4-C8、13-4-C8、14-4-C8、15-4-C8、16-4-C8；3-5-C8、5-5-C8、6-5-C8、7-5-C8、8-5-C8、9-5-C8、10-5-C8、11-5-C8、12-5-C8、13-5-C8、14-5-C8、15-5-C8、16-5-C8分别作为核酸递送材料来递送pDNA-GFP-Luc。
具体步骤如下：
1)细胞培养：实验前一天将293T细胞种与96孔细胞培养板(30％-40％密度)，待细胞密度生长到70％左右，即可进行细胞转染。
2)制备LNP-pDNA-GFP-Luc的脂质纳米颗粒进行细胞转染：使用脂质化合物3-2-C8、5-2-C8、6-2-C8、7-2-C8、8-2-C8、9-2-C8、10-2-C8、11-2-C8、12-2-C8、13-2-C8、14-2-C8、15-2-C8、16-2-C8；3-3-C8、5-3-C8、6-3-C8、7-3-C8、8-3-C8、9-3-C8、10-3-C8、11-3-C8、12-3-C8、13-3-C8、14-3-C8、15-3-C8、16-3-C8；3-4-C8、5-4-C8、6-4-C8、7-4-C8、8-4-C8、9-4-C8、10-4-C8、11-4-C8、12-4-C8、13-4-C8、14-4-C8、15-4-C8、16-4-C8；3-5-C8、5-5-C8、6-5-C8、7-5-C8、8-5-C8、9-5-C8、10-5-C8、11-5-C8、12-5-C8、13-5-C8、14-5-C8、15-5-C8、16-5-C8与二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，胆固醇(Cholesterol)，二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)按照一定浓度溶于无水乙醇中，按照一定摩尔比例脂质化合物:Cholesterol:DOPE:DSPE-PEG＝40:48:10:2均匀混合，同时吸取200ng pDNA-GFP-Luc溶于醋酸钠缓冲液中(醋酸钠缓冲液体积为脂质混合物总体积的两倍，pH＝5.3)，吸取溶于缓冲液的pDNA-GFP-Luc至脂质混合物溶液中，并快速混合均匀以组装为脂质纳米颗粒，将混合好的溶液室温孵育15min，然后使用灭菌PBS稀释体积2-3倍，分别加入到细胞培养液中进行转染，其中可电离脂质与pDNA的氮磷比例(N/P ratio)24:1为最优比例，即可电离脂质上的可质子化氨基与DNA上的磷酸基团之间的摩尔比。阴性对照组：正常培养293T细胞，不进行转染。
3)细胞转染效率分析：转染48h后，使用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白的表达；然后，将96孔细胞培养板置于冰上裂解细胞30min，离心后取上清液体，加入萤火虫荧光素酶底物，用酶标仪检测萤火虫荧光素酶含量(化学发光)。图9为脂质化合物相对荧光素酶活性结果图。图10为脂质化合物相对荧光素酶活性结果热图。由图9和图10可见，阴性对照表达萤火虫荧光素酶为最低，本发明所合成的脂质化合物大部分都有较强的转染效率，其中萤火虫荧光素酶表达强度在10万数值以上的有18/52，占总脂质的35％，表达强度在20万数值以上的有8/52，占总脂质的15％，表达强度在40万数值以上的有3/52，占总脂质的6％，这说明这种支链型可电离脂质总体化学结构设计的可靠性和高效性。
2.脂质化合物纳米颗粒的粒径、聚合物分散系数以及Zeta电位测试
使用脂质化合物3-2-C8、3-3-C8、3-4-C8、3-5-C8、10-2-C8、10-3-C8、10-4-C8、10-5-C8分别作为纳米载体材料包裹pDNA-GFP-Luc测试脂质纳米颗粒的粒径(Size)，聚合物分散系数(polymer dispersion index,PDI)以及Zeta电位(Zeta potential)测试。
1)实验步骤如下：
使用可电离脂质3-2-C8、3-3-C8、3-4-C8、3-5-C8、10-2-C8、10-3-C8、10-4-C8、10-5-C8与二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE),胆固醇(Cholesterol)，二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)按照一定浓度溶于无水乙醇中，按照一定摩尔比例可电离脂质:Cholesterol:DOPE:DSPE-PEG＝40:48:10:2均匀混合，同时吸取200ng pDNA-GFP-Luc溶于醋酸钠缓冲液中(醋酸钠缓冲液体积为脂质混合物总体积的两倍，pH＝5.3)，吸取溶于缓冲液的pDNA-GFP-Luc至脂质混合物溶液中，并快速混合均匀以组装为脂质纳米颗粒，将混合好的溶液室温孵育15min，使用动态光闪射仪器(DLS)测试粒径和电位，其中可电离脂质与pDNA的氮磷比例(N/P ratio)24:1为最优比例，即可电离脂质上的可质子化氨基与DNA上的磷酸基团之间的摩尔比。
2)实验结果分析：
图11为脂质化合物的纳米颗粒的粒径测试图。表2为脂质化合物的Zeta电位测试结果。
表2脂质化合物的Zeta电位测试结果
Main lipid Zeta potential(mV)
3-2-C8 13.0±1.56
3-3-C8 23.1±1.37
3-4-C8 20.2±3.07
3-5-C8 17.4±3.35
10-2-C8 20.7±2.77
10-3-C8 19.4±1.56
10-4-C8 23.5±4.87
10-5-C8 28.7±4.36
由图11和表2可知，测试结果表明选取的8个可电离脂质的粒径Size在30nm-60nm之间，聚合物分散系数PDI在0.1-0.3之间，Zeta电位在pH＝5.3时为正电荷，电荷为13.0±1.56-28.7±4.36mV，符合脂质纳米颗粒的特征，其粒径较小可以发挥高渗透长滞留效应(EPR)效应，更好富集在肿瘤部位。
3.脂质化合物递送RNA测试
使用脂质化合物在293T细胞系中递送编码绿色荧光蛋白(GFP)和萤火虫荧光素酶(Luc)的自我扩增RNA(Rep RNA-GFP-Luc)。分别使用脂质3-2-C8、5-2-C8、6-2-C8、7-2-C8、8-2-C8、9-2-C8、10-2-C8、11-2-C8、12-2-C8、13-2-C8、14-2-C8、15-2-C8、16-2-C8；3-3-C8、5-3-C8、6-3-C8、7-3-C8、8-3-C8、9-3-C8、10-3-C8、11-3-C8、12-3-C8、13-3-C8、14-3-C8、15-3-C8、16-3-C8；3-4-C8、5-4-C8、6-4-C8、7-4-C8、8-4-C8、9-4-C8、10-4-C8、11-4-C8、12-4-C8、13-4-C8、14-4-C8、15-4-C8、16-4-C8；3-5-C8、5-5-C8、6-5-C8、7-5-C8、8-5-C8、9-5-C8、10-5-C8、11-5-C8、12-5-C8、13-5-C8、14-5-C8、15-5-C8、16-5-C8分别作为核酸递送材料来递送Rep RNA-GFP-Luc。
具体步骤如下：
1)细胞培养：实验前一天将293T细胞种与96孔细胞培养板(30％-40％密度)，待细胞密度生长到70％左右，即可进行细胞转染。
2)制备LNP-Rep RNA-GFP-Luc的脂质纳米颗粒进行细胞转染：使用可电离脂质3-2-C8、5-2-C8、6-2-C8、7-2-C8、8-2-C8、9-2-C8、10-2-C8、11-2-C8、12-2-C8、13-2-C8、14-2-C8、15-2-C8、16-2-C8；3-3-C8、5-3-C8、6-3-C8、7-3-C8、8-3-C8、9-3-C8、10-3-C8、11-3-C8、12-3-C8、13-3-C8、14-3-C8、15-3-C8、16-3-C8；3-4-C8、5-4-C8、6-4-C8、7-4-C8、8-4-C8、9-4-C8、10-4-C8、11-4-C8、12-4-C8、13-4-C8、14-4-C8、15-4-C8、16-4-C8；3-5-C8、5-5-C8、6-5-C8、7-5-C8、8-5-C8、9-5-C8、10-5-C8、11-5-C8、12-5-C8、13-5-C8、14-5-C8、15-5-C8、16-5-C8与二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，胆固醇(Cholesterol)，二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)按照一定浓度溶于无水并且无酶乙醇中，按照一定摩尔比例可电离脂质:Cholesterol:DOPE:DSPE-PEG＝40:48:10:2均匀混合，同时吸取150ng Rep RNA-GFP-Luc溶于醋酸钠缓冲液中(醋酸钠缓冲液体积为脂质混合物总体积的两倍，pH＝5.3)，吸取溶于缓冲液的Rep RNA-GFP-Luc至脂质混合物溶液中，并快速混合均匀以组装为脂质纳米颗粒，将混合好的溶液室温孵育15min，然后使用灭菌PBS稀释体积2-3倍，分别加入到细胞培养液中进行转染，其中可电离脂质与mRNA的氮磷比例(N/P ratio)24:1为最优比例，即可电离脂质上的可质子化氨基与mRNA上的磷酸基团之间的摩尔比。
3)细胞转染效率分析：转染36h后，使用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白的表达；然后，将96孔细胞培养板置于冰上裂解细胞30min，离心后取上清液体，加入萤火虫荧光素酶底物，用酶标仪检测萤火虫荧光素酶含量(化学发光)。图12为脂质化合物相对荧光素酶活性结果图。由图12可见，阴性对照表达萤火虫荧光素酶为最低，一般来说自我复制mRNA相对于普通mRNA所包含的分子序列更多，分子量更大，表达时间也会延长，同时脂质纳米颗粒也更难有效负载并表达，本发明所合成的可电离脂质对Rep RNA也有较强的转染效率，在未经过优化的情况下，表达强度在15万数值以上的有4/52，占总脂质的8％。这说明本发明所合成的可电离脂质可以有效递送并高效转染DNA和RNA。
4.脂质化合物递送RNA的纳米颗粒组分比例优化测试
使用可电离脂质化合物3-5-C8和10-5-C8在293T细胞系中递送编码绿色荧光蛋白(GFP)和萤火虫荧光素酶(Luc)的自我扩增RNA，对制备纳米颗粒的组分进行比例优化。
1)具体制备步骤与性能测试3的脂质化合物递送RNA测试步骤相同，区别在于本例性能测试中，实验组为：可电离脂质化合物3-5-C8或10-5-C8以及二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，胆固醇(Cholesterol)，二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)，按照一定浓度溶于无水且无酶乙醇中，使用四种不同摩尔比例进行混合，比例A为可电离脂质化合物3-5-C8或10-5-C8：Cholesterol：DOPE：DSPE-PEG＝40:48:10:2；比例B为可电离脂质化合物3-5-C8或10-5-C8:Cholesterol:DOPE:DSPE-PEG＝30:28.5:10:0.75；比例C为可电离脂质化合物3-5-C8或10-5-C8:Cholesterol:DOPE:DSPE-PEG＝50:38.5:10:1.5；比例D为可电离脂质化合物3-5-C8或10-5-C8:Cholesterol:DOPE:DSPE-PEG＝35:46:16:2.5。
2)细胞转染效率分析：转染36h后，使用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白的表达；然后，将96孔细胞培养板置于冰上裂解细胞30min，离心后取上清液体，加入萤火虫荧光素酶底物，用酶标仪检测萤火虫荧光素酶含量(化学发光)。图13为脂质化合物的相对荧光素酶活性结果图。由图13可见比例A可电离脂质化合物：Cholesterol：DOPE：DSPE-PEG＝40:48:10:2为最优比例。
5.脂质化合物递送RNA的纳米颗粒中性磷脂优化测试
使用脂质化合物3-5-C8和10-5-C8在293T细胞系中递送编码绿色荧光蛋白(GFP)和萤火虫荧光素酶(Luc)的自我扩增RNA，对制备纳米颗粒的中性磷脂进行优化。
1)具体制备步骤与性能测试3的脂质化合物递送RNA测试步骤相同，区别在于本性能测试中，实验组为：脂质化合物3-5-C8或10-5-C8以及二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)或二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)，胆固醇(Cholesterol)，二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)，按照一定浓度溶于无水且无酶乙醇中，使用比例为可电离脂质化合物3-5-C8或10-5-C8：Cholesterol：DOPE或DSPC：DSPE-PEG＝40:48:10:2。
2)细胞转染效率分析：转染36h后，使用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白的表达；然后，将96孔细胞培养板置于冰上裂解细胞30min，离心后取上清液体，加入萤火虫荧光素酶底物，用酶标仪检测萤火虫荧光素酶含量(化学发光)。图14为脂质化合物的相对荧光素酶活性测试结果图。图15为脂质化合物的荧光显微镜结果图。由图15可见，当使用DSPC作为辅助性磷脂时，3-5-C8和10-5-C8表达量都有所上升，其中10-5-C8增强最为明显，达80万数值。
6.脂质化合物小鼠体内递送测试
使用可电离脂质化合物3-4-C8，8-4-C8，10-4-C8，11-4-C8在C57BL/6小鼠体内递送带有Cyanine 5(Cy5)荧光的Oligo-DNA，经小鼠尾静脉注射，经过血液循环6-24小时后牺牲小鼠取器官裂解，可以检测纳米颗粒在各种器官的分布结果。
具体步骤如下：
1)制备LNP-Cy5-Oligo脂质纳米颗粒进行小鼠尾静脉注射：具体步骤与性能测试1脂质化合物递送质粒DNA测试的相同，区别在于本性能测试中，实验组为：可电离脂质化合物3-4-C8,8-4-C8,10-4-C8或11-4-C8及二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，胆固醇(Cholesterol)，二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)，按照一定浓度溶于无水乙醇中，使用比例为可电离脂质化合物3-4-C8,8-4-C8,10-4-C8或11-4-C8:Cholesterol:DOPE:DSPE-PEG＝40:48:10:2。吸取5ug Cy5-Oligo溶于醋酸钠缓冲液中(醋酸钠缓冲液体积为脂质混合物总体积的两倍，pH＝5.3)，吸取溶于缓冲液的Cy5-Oligo至脂质混合物溶液中，并快速混合均匀以组装为脂质纳米颗粒，将混合好的溶液室温孵育15min，然后使用透析袋(14000MW)在超纯水中透析0.5小时，最后在脂质纳米颗粒溶液中加入10％葡萄糖溶液调节渗透压，进行尾静脉注射(每组小鼠数量n＝3)。其中可电离脂质与mRNA的氮磷比例(N/P ratio)24:1为最优比例，即可电离脂质上的可质子化氨基与DNA上的磷酸基团之间的摩尔比。
2)裂解器官与荧光测试脂质纳米颗粒分布：尾静脉注射12小时后，牺牲小鼠，取血和心肝脾肺肾器官，研磨组织，使用0.5％TriTon X-100裂解液置于冰上裂解30min，离心吸取上清，使用酶标仪测试荧光。
3)实验结果分析：图16为脂质纳米颗粒在小鼠各器官的分布图。可见纳米颗粒会聚集在肝，其次在肾聚集，符合脂质纳米颗粒器官分布特点；纳米颗粒经尾静脉注射，经过血液循环，分布在各个器官，这说明此发明所合成的可电离脂质可以在体内递送核酸，为后续实验奠定基础。
7.脂质化合物小鼠体内递送RNA成像测试
使用可电离脂质化合物3-4-C8，3-5-C8，10-4-C8，10-5-C8，11-4-C8在C57BL/6小鼠体内递送带有编码萤火虫荧光素酶(Luc)的自我扩增RNA(Rep RNA-Luc)，经小鼠肌肉注射，注射后3天，5天，7天使用体内成像系统(in vivo imaging system,IVIS)检测。
1)具体步骤与性能测试3脂质化合物递送RNA测试相同，区别在本例性能测试中，实验组为：可电离脂质化合物3-4-C8,3-5-C8,10-4-C8,10-5-C8或11-4-C8以及二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)，胆固醇(Cholesterol)，二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)或空白组，按照一定浓度溶于无水且无酶乙醇中，使用比例为可电离脂质化合物3-4-C8,8-4-C8,10-4-C8或11-4-C8：Cholesterol：DOPE：DSPE-PEG＝40:48:10:2。吸取1.5ug RepRNA-Luc溶于醋酸钠缓冲液中(醋酸钠缓冲液体积为脂质混合物总体积的两倍，pH＝5.3)，吸取溶于缓冲液的Rep RNA-Luc至脂质混合物溶液中，并快速混合均匀以组装为脂质纳米颗粒，将混合好的溶液室温孵育15min，然后使用透析袋(14000MW)在超纯水中透析0.5小时，最后在脂质纳米颗粒溶液中加入10％葡萄糖溶液调节渗透压，进行肌肉注射。其中可电离脂质与mRNA的氮磷比例(N/P ratio)24:1为最优比例，即可电离脂质上的可质子化氨基与DNA上的磷酸基团之间的摩尔比。
2)体内成像结果分析：图17为小鼠注射脂质纳米颗粒体内成像系统检测图。图18为脂质化合物注射时间与总通量图。IVIS结果表明脂质纳米颗粒3-4-C8，3-5-C8，10-4-C8，10-5-C8或11-4-C8在肌肉注射Rep RNA-Luc，在第3天都成功表达，随着时间增加，表达值依次增强，而空白组无表达。Rep RNA-Luc表达值在注射后12-16天达到峰值，而普通RNA-Luc根据文献报道则在注射后48h达到峰值，说明本申请可电离脂质递送这种Rep RNA表达时间更长，表达量更高，在后期mRNA疫苗应用方面带来更加持久的免疫效果。
本发明提供了一种新型支尾脂质的制备方法及其应用，该支尾型脂质为可电离脂质。这种可电离脂质的叔胺或仲胺头部可以在酸性条件下获得氢质子，带有正电荷，可以与带有负电荷的RNA、DNA或小分子药物通过静电相互作用结合，再与辅助性脂质自组装为脂质纳米颗粒(LNP)，从而对基因药物进行递送，到达靶向位点。基于目前基因药物递送中遇到的低效率、高毒性等一系列问题，该支尾型可电离脂质在其化学结构设计中巧妙的把可电离脂质的疏水尾部由单一烷基链变为双烷基链，因此：①脂质之间的间隔变大可以增强在内涵体pH条件下的质子化能力；②增加脂质疏水部的横截面积，脂质从而形成为更为锥形结构，这些都能大大增加脂质纳米颗粒在细胞内中内涵体的逃逸效率。
本发明提供了一种支链型可电离脂质，制备的脂质纳米颗粒可以在哺乳动物细胞内高效递送mRNA，pDNA，以及高效转染siRNA，特异性沉默靶向基因表达。当LNP载体通过细胞内吞到达细胞内环境后，如何在内涵体内快速逃逸是高效递送系统首先要解决的一大难题，本发明的支链型可电离脂质可以通过疏水尾部的分支加大脂质的电离程度，提高质子化能力，以及扩大脂质尾部的横截面增加，从而使得纳米颗粒在结构组装上更加锥形，从而增强了核内体逃逸，提升转染效率。此外，本发明的可电离脂质电荷可以随着pH的改变而改变，在中性条件下呈电中性，减小因正电荷过多而带来的细胞毒性，进而增加脂质纳米颗粒稳定性，而且能避免正电荷过多时在体内被迅速降解，并有助于延长所负载的核酸药物的循环时间、改善药物动力学特征。
该支尾型可电离脂质的化学结构大体可以分为亲水的氨基头部、中部连接基团和疏水的烷基尾部。与传统阳离子脂质的苛刻复杂合成路线不同，本发明提供的支尾型可电离脂质结构设计简单，反应机理明确，通过无溶剂条件下迈克尔加成反应可以得到大量结构不同的可电离脂质结构，有助于高通量筛选。
上述实例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种脂质化合物，其特征在于：所述脂质化合物的结构如式（Ⅰ）所示；
（Ⅰ）；
式（Ⅰ）中，A选自式（1）-式（9）所示的结构，B选自式（10）所示的结构，n为2；
；
；
式（10）中，R1选自C6-C12的烷基或烯基，m选自1-6的正整数。
2.根据权利要求1所述的脂质化合物，其特征在于：所述式（10）中，R1选自C7-C9的烷基，m选自2-5的正整数。
3. 根据权利要求2所述的脂质化合物，其特征在于：所述脂质化合物选自以下所示结构的化合物；
。
4.权利要求1所述脂质化合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
将式（Ⅱ）所示的化合物与选自式（11）-式（19）所示的化合物混合，反应，得到所述的脂质化合物；
（Ⅱ）；
式（Ⅱ）中，R1选自C6-C12的烷基或烯基，m选自1-6的正整数；
。
5.根据权利要求4所述脂质化合物的制备方法，其特征在于：所述式（Ⅱ）所示的化合物与所述选自式（11）-式（19）所示化合物中活性氢原子的摩尔比为(1-2)：1。
6.权利要求1-3任一项所述脂质化合物在制备核酸药物、基因疫苗、多肽或蛋白质药物、小分子药物中的应用。
7.权利要求1-3任一项所述脂质化合物在制备药物载体中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述药物包括RNA药物、DNA药物、蛋白质药物或小分子药物。
9.一种药物组合物，其特征在于：所述药物组合物包括权利要求1-3任一项所述的脂质化合物。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物还包括药物活性成分。
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