CN113968968A - 氨基脂质化合物、其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及一种氨基脂质化合物、其制备方法和包含所述氨基脂质改性聚乙烯亚胺类聚合物的脂质颗粒。该氨基脂质化合物通过改性聚乙烯亚胺类聚合物得到，以聚乙烯亚胺作为母核，与取代的环状酸酐反应，采用一步法同时引入疏水链和羧基来得到，不但具有增强的基因传递能力，而且具有较低的电荷密度，从而降低了聚乙烯亚胺因高电荷密度所引起的细胞毒性，生物相容性得到改善。所述改性聚乙烯亚胺类聚合物具有官能团多样性强、数量众多的特点，所述改性聚乙烯亚胺类聚合物的制备方法具有原料易得、反应条件温和、反应选择性好、反应产率高、仪器设备要求低和操作简单的优点。
Description
技术领域
本公开涉及一种氨基脂质化合物、其制备方法和包含所述氨基脂质化合物的脂质颗粒。所述脂质颗粒可用于递送生物活性剂至细胞中。本发明还涉及包含所述氨基脂质化合物的脂质颗粒作为药物的用途。
背景技术
基因治疗是通过人工手段将具有特定遗传信息的基因输送到靶细胞，表达的目标蛋白对先天或后天基因缺陷造成的病症具有调节、治疗甚至治愈的效果。核酸与细胞膜均带有负电荷，裸核酸很难直接导入到细胞内，且极易被细胞质中的核酸降解酶降解，达不到基因导入和基因治疗的作用，因此要借助外力或载体来实现基因传递。
虽然基因治疗的优势明显，但基因载体缺乏安全性和高效性，使之无法广泛用于临床。基因载体通常分为病毒型载体和非病毒型载体。由于病毒性载体在体内和体外的转染效率极高，但是它们同时具有诸多缺陷，如毒性大，免疫反应强烈，基因容量小，靶向性差，制备过程复杂等。而非病毒载体由于容易制备、运输、储藏，且安全、有效、无免疫原性等优点，已引起越来越多专家学者的注意。
PEI(聚乙烯亚胺)含有大量带正电的氮原子，被广泛应用于水处理、食品造纸等领域。由于PEI电荷密度大，1995年被首次用作基因载体，此后被大量用于基因载体研究，并被认为是最有效的人工合成阳离子型基因载体之一。PEI从结构上可分为支化PEI(BPEI)和线性PEI(LPEI)，PEI产品的分子量为600Da至1600K Da。研究表明，随着PEI分子量增加，基因转染效率增大，同时载体对细胞的毒性也随之增大。低分子量PEI如PEI 600Da,PEI 1.2KDa和PEI 1.8K Da几乎不具有基因转染的能力。PEI之所以被广泛应用于基因转染，主要有两方面原因：一是电荷密度高。由于PEI富含氨基，主链上平均三个原子就有一个N原子，有利于与带负电的核酸药物通过静电作用形成复合物。二是缓冲能力强。在生理条件下，PEI的氨基中大约有80％未被质子化，复合物进到细胞内溶酶体后，这部分氨基能大量吸收质子，使载有核酸药物的PEI因“质子海绵效应”从溶酶体中逃逸，从而释放出核酸药物。PEI的正电荷能与DNA静电结合和容易被细胞摄取而具有良好的基因转染的能力，但也正是过多的正电荷导致诸多致命缺陷，例如正电荷与细胞膜结构上的蛋白或磷脂分子发生过强的静电相互作用，会导致膜结构和功能的损坏从而引起细胞毒性，如载体与DNA的复合物在体循环中与血红细胞发生过强作用会致溶血；与血液中的蛋白发生非特异性结合会致血栓，同时使载体的功能丧失。
为了解决上述现有技术中存在的问题而进行本发明。
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是提供改性聚乙烯亚胺类聚合物库，该系列改性聚乙烯亚胺类聚合物库具有官能团多样性强、数量多的特点，通过对低分子量的PEI进行疏水修饰，使分子成为两亲性的分子，在水相中能自组装形成纳米颗粒，从而提高基因转染效率；同时向PEI分子中引入羧基以中和部分碱性，以降低载体的毒性。
本发明的另一目的是提供一种原料易得、反应条件温和、反应选择性好、产率高、仪器设备要求低和操作简单的改性聚乙烯亚胺类聚合物的制备方法。
本发明的另一目的是提供包含所述改性聚乙烯亚胺类聚合物的脂质颗粒。
技术方案
根据本发明的一个方面，提供一种改性聚乙烯亚胺类聚合物，由以下化学式I表示：
[化学式I]
其中，A是
q是1、2、3、4或5；
B是氢或A，
其中，R选自C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C2-C24酰基，其中，所述C1-C24烷基、所述C2-C24烯基、所述C2-C24炔基和所述C2-C24酰基任选地被C1-C6烃基取代，并且当存在多个R时，多个R彼此相同或不同；
优选地，R选自C3-C18烷基、C3-C18烯基、C3-C18炔基和C3-C20酰基，其中，所述C3-C18烷基、所述C3-C18烯基、所述C3-C18炔基和所述C3-C20酰基任选地被C1-C6烃基取代，并且当存在多个R时，多个R彼此相同；
L选自C1-C12亚烷基、C2-C12亚烯基和C2-C12亚炔基，其中，所述C1-C12亚烷基、所述C2-C12亚烯基和所述C2-C12亚炔基任选地被选自烃基、羧基、酰基和烷氧基中的一个或多个取代基取代，或者是包含选自氮、硫和氧中的杂原子的任选地取代的4至10元杂环，并且当存在多个L时，多个L彼此相同或不同；
优选地，L选自C1-C10亚烷基、C2-C10亚烯基或C2-C10亚炔基，其中，所述C1-C10亚烷基、所述C2-C10亚烯基和所述C2-C10亚炔基任选地被选自烃基、羧基、酰基和烷氧基中的一个或多个取代基取代，或者是包含选自氮、硫和氧中的杂原子的任选地取代的4至6元杂环，并且当存在多个L时，多个L彼此相同；
更优选地，L为亚甲基；
由化学式I表示的改性聚乙烯亚胺类聚合物中A基团的总摩尔量占N原子的总摩尔量的0.1％至100％；优选为1％至90％；更优选为1％至50％；
m,n,x,y分别为0至600的整数，并且满足m+n+x+y为10至600；优选地，m,n,x,y分别为0至250的整数，并且满足m+n+x+y为10至250；
所述改性聚乙烯亚胺类聚合物的平均分子量在300至50000的范围内；优选地，所述改性聚乙烯亚胺类聚合物的平均分子量在400至30000的范围内；更优选地，所述改性聚乙烯亚胺类聚合物的平均分子量在600至25000的范围内。
根据本发明的另一方面，提供一种改性聚乙烯亚胺类聚合物，该改性聚乙烯亚胺类聚合物通过由以下化学式II表示的聚乙烯亚胺类聚合物与酸酐反应制备而成：
[化学式II]
所述酸酐为
q是1、2、3、4或5；
R选自C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C2-C24酰基，其中，所述C1-C24烷基、所述C2-C24烯基、所述C2-C24炔基和所述C2-C24酰基任选地被C1-C6烃基取代，并且当存在多个R时，多个R彼此相同或不同；
优选地，R选自C3-C18烷基、C3-C18烯基、C3-C18炔基和C3-C20酰基，其中，所述C3-C18烷基、所述C3-C18烯基、所述C3-C18炔基和所述C3-C20酰基任选地被C1-C6烃基取代，并且当存在多个R时，多个R彼此相同；
L选自C1-C12亚烷基、C2-C12亚烯基和C2-C12亚炔基，其中，所述C1-C12亚烷基、所述C2-C12亚烯基和所述C2-C12亚炔基任选地被选自烃基、羧基、酰基和烷氧基中的一个或多个取代基取代，或者是包含选自氮、硫和氧中的杂原子的任选地取代的4至10元杂环，并且当存在多个L时，多个L彼此相同或不同；
优选地，L选自C1-C10亚烷基、C2-C10亚烯基或C2-C10亚炔基，其中，所述C1-C10亚烷基、所述C2-C10亚烯基和所述C2-C10亚炔基任选地被选自烃基、羧基、酰基和烷氧基中的一个或多个取代基取代，或者是包含选自氮、硫和氧中的杂原子的任选地取代的4至6元杂环，并且当存在多个L时，多个L彼此相同；
更优选地，L为亚甲基；
所述反应中，加入的酸酐的摩尔量是由化学式II中表示的聚乙烯亚胺类聚合物中包含的N原子的总摩尔量的0.1％至100％；优选为1％至90％；更优选为1％至50％；
m,n,x,y分别为0至600的整数，并且满足m+n+x+y为10至600；优选地，m,n,x,y分别为0至250的整数，并且满足m+n+x+y为10至250；
所述由化学式II表示的聚乙烯亚胺类聚合物的平均分子量在400至50000的范围内；优选地，所述由化学式II表示的聚乙烯亚胺类聚合物的平均分子量在600至20000的范围内；更优选地，所述由化学式II表示的聚乙烯亚胺类聚合物的平均分子量在600至5000的范围内。
根据本发明的又一方面，提供一种改性聚乙烯亚胺类聚合物的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
使由以下化学式II表示的聚乙烯亚胺类聚合物与酸酐在40℃至90℃的温度下优选在50℃至80℃的温度下反应10小时至30小时优选反应16小时至20小时：
[化学式II]
所述酸酐为
加入的酸酐的摩尔量是由化学式II中表示的聚乙烯亚胺类聚合物中包含的N原子的总摩尔量的0.1％至100％；优选为1％至90％；优选为1％至50％；
R、L、q、m、n、x和y与上面描述的相同
有益效果
本发明的改性聚乙烯亚胺类聚合物具有官能团多样性强、数量众多的特点，通过对低分子量的PEI进行疏水修饰，使分子成为两亲性的分子，在水相中能自组装形成纳米颗粒，从而提高基因转染效率；同时向PEI分子中引入羧基以中和部分碱性，以降低载体的毒性。
所述改性聚乙烯亚胺类聚合物的制备方法具有原料易得、反应条件温和、反应选择性好、反应产率高、仪器设备要求低和操作简单的优点，本发明的制备方法是非常通用的，可以用于改性聚乙烯亚胺类聚合物库的快速合成，可以以非常廉价的方式用于快速的基于细胞的筛选实验。
本发明所提供的改性聚乙烯亚胺类聚合物的官能团种类、改性率的组合方式多样，通过常规的针对转染效率、细胞毒性、待传送至细胞中的药剂的粘附、脂质颗粒的稳定性、脂质颗粒的大小等特征的筛选，可方便地适用于将不同核酸物质递送至不同细胞，提高了递送系统的针对性和有效性。
本发明的改性聚乙烯亚胺类聚合物可以采用组合化学的方法高通量地、高效率地制备，制备方法简单、收率高，可快速地用于筛选实验中。
本发明提供包含所述改性聚乙烯亚胺类聚合物的脂质颗粒及其用于将生物活性剂传送至细胞中的用途。
本发明还涉及包含改性聚乙烯亚胺类聚合物的脂质颗粒作为药物的用途。
附图说明
图1显示了采用参照试剂(PEI25K)和根据实施例12的用BPEI600-A11-y6处理后的Hela细胞的显微图像，其中，图1(a)显示了采用参照试剂(PEI25K)处理后的Hela细胞核的Hoechst染色图像；图1(b)显示了根据实施例12采用BPEI600-A11-y6处理后的Hela细胞核的Hoechst染色图像，图1(c)显示了采用参照试剂(PEI25K)处理后的Hela细胞的GFP图像，图1(d)显示了根据实施例12采用BPEI600-A11-y6处理后的Hela细胞的GFP图像；
图2示出了根据本申请的实施例2中BPEI600-Ax-y聚乙烯亚胺类聚合物的平行合成的操作示意图；
图3示出了根据本申请的实施例3中BPEI600-A11-y6改性聚乙烯亚胺类聚合物的合成中，原料和产物的红外光谱对比分析结果；
图4示出了根据本申请的实施例11中选取BPEI600-A11-y6和LPEI600-A13-y4两种改性聚乙烯亚胺聚合物评价其对Hela细胞的存活率的影响，以PEI 25K作为对照，得到的评价结果。
具体实施方式
下文中，将更详细地描述本说明书。
本发明所用的术语“任选地取代的”意指与原子或基团连接的一个或多个氢原子独立地未被取代，或被一个或多个例如一、二、三或四个取代基取代，所述取代基独立地选自：氘(D)、卤素、-OH、巯基、氰基、-CD3、C1-C6烷基(优选C1-C3烷基)、C2-C6烯基、C2-C6炔基、环烷基(优选C3-C8环烷基)、芳基、杂环基(优选3-8元杂环基)、杂芳基、芳基C1-C6烷基-、杂芳基C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、-OC1-C6烷基(优选-OC1-C3烷基)、-OC2-C6烯基、OC1-C6烷基苯基、C1-C6烷基-OH(优选C1-C4烷基-OH)、C1-C6烷基-SH、C1-C6烷基-O-C1-C6烷基、OC1-C6卤代烷基、NH2、C1-C6烷基-NH2(优选C1-C3烷基-NH2)、-N(C1-C6烷基)2(优选-N(C1-C3烷基)2)、-NH(C1-C6烷基)(优选-NH(C1-C3烷基))、-N(C1-C6烷基)(C1-C6烷基苯基)、-NH(C1-C6烷基苯基)、硝基、-C(O)-OH、-C(O)OC1-C6烷基(优选-C(O)OC1-C3烷基)、-CONRiRii(其中Ri和Rii是H、D和C1-C6烷基，优选C1-C3烷基)、-NHC(O)(C1-C6烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C6烷基)C(O)(C1-C6烷基)、-N(C1-C6烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C6烷基、-C(O)杂芳基(优选-C(O)-5-7元杂芳基)、-C(O)C1-C6烷基苯基、-C(O)C1-C6卤代烷基、-OC(O)C1-C6烷基(优选-OC(O)C1-C3烷基)、-S(O)2-C1-C6烷基、-S(O)-C1-C6烷基、-S(O)2-苯基、-S(O)2-C1-C6卤代烷基、-S(O)2NH2、-S(O)2NH(C1-C6烷基)、-S(O)2NH(苯基)、-NHS(O)2(C1-C6烷基)、-NHS(O)2(苯基)和-NHS(O)2(C1-C6卤代烷基)，其中所述的烷基、环烷基、苯基、芳基、杂环基和杂芳基中的每一个任选地被选自以下中的一个或多个取代基进一步取代：卤素、-OH、-NH2、环烷基、3-8元杂环基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基-、-OC1-C4烷基、-C1-C4烷基-OH、-C1-C4烷基-O-C1-C4烷基、-OC1-C4卤代烷基、氰基、硝基、-C(O)-OH、-C(O)OC1-C6烷基、-CON(C1-C6烷基)2、-CONH(C1-C6烷基)、-CONH2、-NHC(O)(C1-C6烷基)、-NH(C1-C6烷基)C(O)(C1-C6烷基)、-SO2(C1-C6烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C6卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C6烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C6烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C6卤代烷基)。当一个原子或基团被多个取代基取代时，所述多个取代基可以相同或不同。
本发明所用的术语“烃基”意指脂肪烃失去一个氢原子后剩余的基团，包括直链的或支链的、饱和的或不饱和的烃基，所述烃基包括烷基、烯基和炔基，优选地所述烃基为C1-C10的烃基，C1-C6烃基，或C1-C3的烃基。
本发明所用的术语“烷基”是指C1-C24烷基，C1-C20烷基，C1-C18烷基，C1-C12烷基，C1-C6烷基，C3-C24烷基，C3-C20烷基，C3-C18烷基，C3-C12烷基，C3-C6烷基，C6-C24烷基，C6-C20烷基，C6-C18烷基或C6-C12烷基。
本发明所用的术语“烯基”是指C2-C24烯基，C2-C20烯基，C2-C18烯基，C2-C12烯基，C2-C6烯基，C3-C20烯基，C3-C18烯基，C3-C12烯基，C3-C6烯基，C6-C24烯基，C6-C20烯基，C6-C18烯基或C6-C12烯基。
本发明所用的术语“炔基”是指C2-C24炔基，C2-C20炔基，C2-C18炔基，C2-C12炔基，C2-C6炔基，C3-C20炔基，C3-C18炔基，C3-C12炔基，C3-C6炔基，C6-C24炔基，C6-C20炔基，C6-C18炔基或C6-C12炔基。
本发明中的术语“酰基”意指烃基-羰基，优选地所述酰基是C4-C24酰基、C6-C18酰基、C6-C12酰基、C6-C10酰基、C4-C6酰基。
本发明中的术语“烷氧基”意指烷基-氧基，优选所述烷氧基是C1-C10烷氧基，更优选地，所述烷氧基为C1-C6烷氧基，最优选地，所述烷氧基为C1-C3烷氧基。
本发明中的术语“杂环”意指包含选自N、O、S等杂原子的饱和的或不饱和的环状基团，优选地，所述杂环为包含选自N、O、S中的1至6个杂原子的任选地取代的4至10元杂环，或者为包含选自N、O、S中的1，2，或3个杂原子的任选地取代的4至6元饱和杂环。所述杂环可以任选被一个或多个取代基取代，取代基的种类参见上述有关“任选地取代的”的定义。
下面将详细描述根据本申请的实施方案。
根据本申请的一个实施方案，提供一种改性聚乙烯亚胺类聚合物，由以下化学式I表示：
[化学式I]
其中，A是
q是1、2、3、4或5；
A是由酸酐衍生的基团。其中，包含羧基，向聚乙烯亚胺聚合物分子中引入羧基以中和部分碱性，以降低载体的毒性。
B是氢或A，其中，B为氢表示末端的-NH2未被酰化的情况，B为A基团表示末端的-NH2被酰化的情况。
R选自C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C2-C24酰基，其中，所述C1-C24烷基、所述C2-C24烯基、所述C2-C24炔基和所述C2-C24酰基任选地被C1-C6烃基取代，当存在多个R时，多个R彼此相同或不同。
优选地，R选自C3-C18烷基、C3-C18烯基、C3-C18炔基和C3-C20酰基，其中，所述C3-C18烷基、所述C3-C18烯基、所述C3-C18炔基和所述C3-C20酰基任选地被C1-C6烃基取代，当存在多个R时，多个R彼此相同。
R是疏水链，引入R基团以对聚乙烯亚胺聚合物进行疏水修饰，使分子成为两亲性的分子，在水相中能自组装形成纳米颗粒，从而提高基因转染效率。
L选自C1-C12亚烷基、C2-C12亚烯基和C2-C12亚炔基，其中，所述C1-C12亚烷基、所述C2-C12亚烯基和所述C2-C12亚炔基任选地被选自烃基、羧基、酰基和烷氧基中的一个或多个取代基取代，或者是包含选自氮、硫和氧中的杂原子的任选地取代的4至10元杂环，当存在多个L时，多个L彼此相同或不同。
优选地，L选自C1-C10亚烷基、C2-C10亚烯基或C2-C10亚炔基，其中，所述C1-C10亚烷基、所述C2-C10亚烯基和所述C2-C10亚炔基任选地被选自烃基、羧基、酰基和烷氧基中的一个或多个取代基取代，或者是包含选自氮、硫和氧中的杂原子的任选地取代的4至6元杂环，当存在多个L时，多个L彼此相同。
更优选地，L为亚甲基。
由化学式I表示的改性聚乙烯亚胺类聚合物中A基团的总摩尔量占N原子的总摩尔量的0.1％至100％；优选为1％至90％；更优选为1％至50％。
m,n,x,y分别为0至600的整数，并且满足m+n+x+y为10至600；优选地，m,n,x,y分别为0至250的整数，并且满足m+n+x+y为10至250。
所述改性聚乙烯亚胺类聚合物的平均分子量在300至50000的范围内；优选地，所述改性聚乙烯亚胺类聚合物的平均分子量在400至30000的范围内；更优选地，所述改性聚乙烯亚胺类聚合物的平均分子量在600至25000的范围内。
根据本申请的一个实施方案，在化学式I中，m＝0，y＝0，并且在m＝0，y＝0的情况下，由化学式I表示的改性聚乙烯亚胺类聚合物中A基团的总摩尔量占N原子的总摩尔量的0.1％至100％；优选为1％至90％；更优选为1％至50％。
当在化学式I中，m＝0，y＝0时，由化学式I表示的改性聚乙烯亚胺类聚合物是由以下化学式I-1表示的改性聚乙烯亚胺类聚合物：
[化学式I-1]
根据本申请的另一实施方案，在化学式I中，n＝0，x＝0，并且在n＝0，x＝0的情况下，由化学式I表示的改性聚乙烯亚胺类聚合物中A基团的总摩尔量占N原子的总摩尔量的0.1％至60％；优选为1％至50％。
当在化学式I中，n＝0，x＝0时，由化学式I表示的改性聚乙烯亚胺类聚合物是由以下化学式I-2表示的改性聚乙烯亚胺类聚合物：
[化学式I-2]
更具体地，A可以选自以下的A1至A18：
根据本发明的另一实施方案，提供一种改性聚乙烯亚胺类聚合物，该改性聚乙烯亚胺类聚合物通过由以下化学式II表示的聚乙烯亚胺类聚合物与酸酐反应制备而成：
[化学式II]
所述酸酐为
q是1、2、3、4或5；
R、L、m、n与上面描述的相同。
在所述反应中，加入的酸酐的摩尔量是由化学式II中表示的聚乙烯亚胺类聚合物中包含的N原子的总摩尔量的0.1％至100％；优选为1％至90％；更优选为1％至50％。
m,n,x,y分别为0至600的整数，并且满足m+n+x+y为10至600；优选地，m,n,x,y分别为0至250的整数，并且满足m+n+x+y为10至250。
所述由化学式II表示的聚乙烯亚胺类聚合物的平均分子量在400至50000的范围内；优选地，所述由化学式II表示的聚乙烯亚胺类聚合物的平均分子量在600至20000的范围内；更优选地，所述由化学式II表示的聚乙烯亚胺类聚合物的平均分子量在600至5000的范围内。
在上述m,n,x,y和平均分子量的范围内，同时含有疏水链、羧基的改性聚乙烯亚胺类聚合物不但具有增强的基因传递能力，而且具有较低的电荷密度，从而降低了聚乙烯亚胺因高电荷密度所引起的细胞毒性，生物相容性得到改善。
根据本申请的另一实施方案，在化学式I中，m＝0，y＝0，并且在m＝0，y＝0的情况下，加入的酸酐的摩尔量是由化学式II中表示的聚乙烯亚胺类聚合物中包含的N原子的总摩尔量的0.1％至100％；优选为1％至90％；优选为1％至50％；
根据本申请的另一实施方案，在化学式I中，n＝0，x＝0，并且在n＝0，x＝0的情况下，加入的酸酐的摩尔量是由化学式II中表示的聚乙烯亚胺类聚合物中包含的N原子的总摩尔量的0.1％至60％；优选为1％至50％。
具体地，所述聚乙烯亚胺类聚合物可以选自以下的LPEI600、LPEI1200、LPEI1800、LPEI5000、BPEI600、BPEI1200、BPEI1800、BPEI5000：
LPEI600表示化学式II中m＝0，y＝0，并且平均分子量为600的聚乙烯亚胺类聚合物；
LPEI1200表示化学式II中m＝0，y＝0，并且平均分子量为1200的聚乙烯亚胺类聚合物；
LPEI1800表示化学式II中m＝0，y＝0，并且平均分子量为1800的聚乙烯亚胺类聚合物；
LPEI5000表示化学式II中m＝0，y＝0，并且平均分子量为5000的聚乙烯亚胺类聚合物；
BPEI600表示化学式II中n＝0，x＝0，并且平均分子量为600的聚乙烯亚胺类聚合物；
BPEI1200表示化学式II中n＝0，x＝0，并且平均分子量为1200的聚乙烯亚胺类聚合物；
BPEI1800表示化学式II中n＝0，x＝0，并且平均分子量为1800的聚乙烯亚胺类聚合物；
BPEI5000表示化学式II中n＝0，x＝0，并且平均分子量为5000的聚乙烯亚胺类聚合物。
具体地，所述酸酐可以选自以下的A-1至A-18：
根据本发明的又一实施方案，提供一种改性聚乙烯亚胺类聚合物的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
使由以下化学式II表示的聚乙烯亚胺类聚合物与酸酐在40℃至90℃的温度下优选在50℃至80℃的温度下反应10小时至30小时优选反应16小时至20小时：
[化学式II]
所述酸酐为
在所述反应中，加入的酸酐的摩尔量是由化学式II中表示的聚乙烯亚胺类聚合物中包含的N原子的总摩尔量的0.1％至100％；优选为1％至90％；优选为1％至50％；
R、L、q、m、n、x和y分别与前面描述的相同。
根据本申请的另一实施方案，在化学式I中，m＝0，y＝0，并且在m＝0，y＝0的情况下，加入的酸酐的摩尔量是由化学式II中表示的聚乙烯亚胺类聚合物中包含的N原子的总摩尔量的0.1％至100％；优选为1％至90％；优选为1％至50％；
根据本申请的另一实施方案，在化学式I中，n＝0，x＝0，并且在n＝0，x＝0的情况下，加入的酸酐的摩尔量是由化学式II中表示的聚乙烯亚胺类聚合物中包含的N原子的总摩尔量的0.1％至60％；优选为1％至50％。
可以看出，根据本发明的改性聚乙烯亚胺类聚合物的制备方法是非常通用的，可以用于阳离子氨基脂质化合物库的快速合成，以非常廉价的方式用于快速的基于细胞的筛选实验。
本发明的另一实施方案涉及含有前述改性聚乙烯亚胺类聚合物的脂质颗粒。由于本发明的改性聚乙烯亚胺类聚合物中包含长的非极性残基，所得到的化合物全部具有疏水性特征，并且由于包含氨基，同时又具有亲水性特征。这种两性特征可以用于形成脂质颗粒，例如，脂质双层、胶束、脂质体等。
在本发明的范围内，术语“脂质颗粒”意思是将改性聚乙烯亚胺类聚合物放入水溶液中制得的纳米大小的物质，这些颗粒特别是脂质双层泡囊(脂质体)、多层泡囊或胶束。
在本发明的优选实施方案中，所述脂质颗粒是含有前述改性聚乙烯亚胺类聚合物的脂质体。在本发明的范围内，脂质体是由包裹含水隔室的脂质两性(两亲(amphiphilic)分子的双层组成的微泡囊。
脂质体形成不是一个自发的过程。当脂质放入水中时首先形成脂质泡囊，因此形成一个双层或一系列双层，每个通过水分子分开。可以通过在水中超声波处里脂质泡囊来形成脂质体。
在本发明的范围内，术语“脂质双层”意思是由两层脂质分子形成的薄膜。术语“胶束”意思是分散在液体胶体中的表面活性剂分子的聚集物。水溶液中的典型胶束接触水时与亲水性头部区域形成聚集物，螯合胶束中心的疏水性单尾区。
在本发明的范围内，术语“细胞”意思是一般术语，并且包括单个细胞、组织、器官、昆虫细胞、禽类细胞、鱼细胞、两栖类细胞、哺乳动物细胞、初级细胞、连续细胞系、干细胞和/或遗传工程化细胞(如表达异源多肽或蛋白的重组细胞)的培养。重组细胞包括，例如，表达异源多肽或蛋白(如生长因子或血液因子)的细胞。
在优选的实施方案中，所述脂质颗粒或脂质体进一步含有辅助脂质。在优选的实施方案中，所述辅助脂质是非阳离子脂质。在更优选的实施方案中，所述辅助脂质是非阳离子磷脂。在本发明的范围内，非阳离子脂质可以含有阳离子官能团(例如，铵基)，但应当含有阴离子官能团，以至少中和分子。脂质分子中的所有官能团的总体应当是非阳离子的。由阳离子氨基脂质和非阳离子(中性)磷脂的混合物组成的脂质体对于将核酸传送至细胞中是最有效的。在甚至更优选的实施方案中，所述非阳离子脂质是DOPE。
在进一步优选的实施方案中，脂质颗粒或脂质体进一步包含固醇。固醇，如胆固醇，是细胞膜中的天然成分。其可以用于稳定颗粒，并且帮助与细胞膜的整合。
在本发明的另一个实施方案中，脂质颗粒或脂质体进一步含有生物活性剂。在本发明的范围内，生物活性剂是引入细胞或宿主中时具有生物作用的物质，例如，通过刺激免疫应答或炎性应答、通过发挥酶活性或通过补充突变等来起作用，生物活性剂特别是核酸、肽、蛋白、抗体和小分子。将脂质体用于将药物包裹在脂质双层内或脂质体的内部含水空间中时，都可以使用术语“脂质颗粒药物”。
在最优选的实施方案中，生物活性剂是核酸。在另一个优选的实施方案中，所述生物活性剂是选自抗肿瘤剂、抗生素、免疫调节剂、抗炎剂、作用于中枢神经系统的药剂、多肽或多肽类(polypeptoid)的成员。
在另一个实施方案中，脂质颗粒或脂质体进一步含有至少一种聚乙二醇(PEG)-脂质。PEG脂质有助于保护颗粒及其内含物免受体外或体内降解。此外，PEG在脂质体表面上形成保护层，并且提高了体内循环时间。其可以用于脂质体药物传送中(PEG-脂质体)。
含有生物活性剂的脂质颗粒或脂质体可以用于将多种治疗剂中的任何一种传送至细胞中。本发明包括如上所述的脂质颗粒(尤其是脂质体)用于将生物活性剂传送至细胞中的用途。
优选，所述生物活性剂是核酸，包括但不限于，信使RNA(mRNA)、反义寡核苷酸、DNA、质粒、核糖体RNA(rRNA)、微RNA(miRNA)、转移RNA(tRNA)、小的抑制RNA(siRNA)和小的核RNA(snRNA)。生物活性剂还可以是抗肿瘤剂、抗生素、免疫调节剂、抗炎剂、作用于中枢神经系统的药剂、抗原或其片段、蛋白、肽、多肽类、疫苗和小分子，或其混合物。如上所示，含有本发明中限定的氨基脂质化合物的脂质颗粒或脂质体适用于将生物活性剂传送至细胞中。可以对通过所述通用合成方法合成的多种不同氨基脂质化合物给予脂质体的特定特征进行筛选。重要的特征例如是转染效率、细胞毒性、待传送至细胞中的药剂的粘附、脂质体的稳定性、脂质体的大小等。本发明的方法可以形成特定适应的脂质体，以用于特定的应用。
例如，脂质颗粒或脂质体可以用于转染多细胞组织或器官。这给病人提供了新的治疗处理的可能性。
根据本发明，病人可以是任何哺乳动物，优选选自人、小鼠、大鼠、猪、猫、狗、马、山羊、牛和猴子和/或其他。最优选，病人是人。
本发明的重要实施方案是所述含有根据由化学式I表示的的氨基脂质化合物的脂质颗粒或脂质体用作药物的用途。
特别地，所述脂质颗粒或脂质体可以给予病人，用于基因治疗、基因疫苗接种、反义治疗或通过干扰RNA的治疗中。具体的应用范围包括但不限于：
(1)本发明的脂质颗粒可以传递核酸以用于基因治疗。通过本发明的氨基脂质将外源基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗目的。其中也包括转基因等方面的技术应用，也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病，如常见的肺癌、胃癌、肝癌、食管癌、结肠癌、胰腺癌、脑癌、淋巴癌、血癌、前列腺癌等。还可导入经过基因编辑的核酸物质以用于多种遗传疾病的治疗，如血友病，地中海贫血、高雪氏病等。
(2)本发明的脂质颗粒可以用于疫苗接种中。本发明的脂质颗粒或脂质体可以用于传送抗原或编码抗原的核酸。本发明的脂质颗粒还可以用于引发对抗各种抗原的免疫应答，所述抗原用于治疗和/或预防多种病症，如癌症、过敏、毒性和病原体(如，病毒、细菌、真菌和其他致病生物体)感染。
上述的脂质颗粒可用于制备用于核酸转移的药物，优选地，所述核酸为RNA、信使RNA(mRNA)、反义寡核苷酸、DNA、质粒、核糖体RNA(rRNA)、微RNA(miRNA)、转移RNA(tRNA)、小的抑制RNA(siRNA)和小的核RNA(snRNA)。
为了使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：改性聚乙烯亚胺类聚合物的合成
为了系统研究烷基链长短、烷基链饱和度、改性比等与转染能力的关系，使用4种支状聚乙烯亚胺(BPEI600、BPEI1200、BPEI1800、BPEI5000)和4种线性聚乙烯亚胺(LPEI600、LPEI1200、LPEI1800、LPEI5000)，18种具有3至18个碳原子的琥珀酸酐(用A-1至A-18表示)，在15种改性比条件(分别为：1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、25％、30％、40％、50％)下，应用组合化学的方法高通量地合成2160种(选自以下的组合：8种聚乙烯亚胺；18种酸酐；15种改性比条件)同时含有疏水链、羧基的改性聚乙烯亚胺类聚合物。
(a)合成路径
由化学式II表示的聚乙烯亚胺类聚合物与酸酐反应合成由化学式I表示的改性聚乙烯亚胺类聚合物，如以下反应式I所示：
[反应式I]
(b)合成砌块
8种聚乙烯亚胺类聚合物(即，由化学式II表示的PEI)分别为：
LPEI600：化学式II中m＝0，y＝0，并且平均分子量为600的聚乙烯亚胺类聚合物；
LPEI1200：化学式II中m＝0，y＝0，并且平均分子量为1200的聚乙烯亚胺类聚合物；
LPEI1800：化学式II中m＝0，y＝0，并且平均分子量为1800的聚乙烯亚胺类聚合物；
LPEI5000：化学式II中m＝0，y＝0，并且平均分子量为5000的聚乙烯亚胺类聚合物；
BPEI600：化学式II中n＝0，x＝0，并且平均分子量为600的聚乙烯亚胺类聚合物；
BPEI1200：化学式II中n＝0，x＝0，并且平均分子量为1200的聚乙烯亚胺类聚合物；
BPEI1800：化学式II中n＝0，x＝0，并且平均分子量为1800的聚乙烯亚胺类聚合物；
BPEI5000：化学式II中n＝0，x＝0，并且平均分子量为5000的聚乙烯亚胺类聚合物。
18种酸酐(用Ax表示)分别为：
15种改性比条件(用y表示)分别为：
1％(y1)、2％(y2)、4％(y4)、6％(y6)、8％(y8)、10％(y10)、12％(y12)、14％(y14)、16％(y16)、18％(y18)、20％(y20)、25％(y25)、30％(y30)、40％(y40)、50％(y50)。
此处的改性比是指加入的酸酐的摩尔量占由化学式II中表示的聚乙烯亚胺类聚合物中包含的N原子的总摩尔量的百分比例。
实施例2：BPEI600-Ax-y改性聚乙烯亚胺类聚合物的平行合成
用移液枪分别将0.1mL的BPEI600的DMSO溶液(其中，BPEI600的质量浓度为43mg/mL)转移至270个容量分别为1.5mL的EP管中(每个EP管中包含0.1mL的DMSO溶液，相当于每个EP管中的以聚乙烯亚胺类聚合物的构成单元乙烯亚胺单元计的摩尔量为0.1mmol)；
然后，向各个EP管中分别加入如下体积的18种取代琥珀酸酐(A-1至A-18)的THF溶液(其中，取代琥珀酸酐的摩尔浓度为0.5mmol/mL)：
2μL(其中，包含取代琥珀酸酐的摩尔量为0.001mmol，对应改性比为1％)、
4μL(其中，包含取代琥珀酸酐的摩尔量为0.002mmol，对应改性比为2％)、
8μL(其中，包含取代琥珀酸酐的摩尔量为0.004mmol，对应改性比为4％)、
12μL(其中，包含取代琥珀酸酐的摩尔量为0.006mmol，对应改性比为6％)、
16μL(其中，包含取代琥珀酸酐的摩尔量为0.008mmol，对应改性比为8％)、
20μL(其中，包含取代琥珀酸酐的摩尔量为0.01mmol，对应改性比为10％)、
24μL(其中，包含取代琥珀酸酐的摩尔量为0.012mmol，对应改性比为12％)、
28μL(其中，包含取代琥珀酸酐的摩尔量为0.014mmol，对应改性比为14％)、
32μL(其中，包含取代琥珀酸酐的摩尔量为0.016mmol，对应改性比为16％)、
36μL(其中，包含取代琥珀酸酐的摩尔量为0.018mmol，对应改性比为18％)、
40μL(其中，包含取代琥珀酸酐的摩尔量为0.02mmol，对应改性比为20％)、
50μL(其中，包含取代琥珀酸酐的摩尔量为0.025mmol，对应改性比为25％)、
60μL(其中，包含取代琥珀酸酐的摩尔量为0.03mmol，对应改性比为30％)、
80μL(其中，包含取代琥珀酸酐的摩尔量为0.04mmol，对应改性比为40％)、
100μL(其中，包含取代琥珀酸酐的摩尔量为0.05mmol，对应改性比为50％)；
之后，于加热型振摇反应器(Thermo-Shaker)中在50℃下反应24h。
反应结束后，加入定量的无水乙醇，使以乙烯亚胺计的浓度为0.1mmol/mL。反应产物无需纯化，可直接用于基因传递效率的初步筛选。
BPEI600-Ax-y聚乙烯亚胺类聚合物的平行合成的操作示意图示于图2中。从图2可以看出，应用组合化学的方法可以高通量地合成改性聚乙烯亚胺类聚合物，在选用BPEI600作为聚乙烯亚胺类聚合物的情况下，可以高通量地合成270种改性聚乙烯亚胺类聚合物。
实施例3：BPEI600-A11-y6改性聚乙烯亚胺类聚合物的合成
在干燥的反应瓶中加入BPEI600(430mg，对应乙烯亚胺单元为10mmol)，DMSO(10mL)，加入十二烯基丁二酸酐(酸酐A11,160mg,0.6mmol)，加热至50℃反应24h。即得到粗产物。
将粗产品用去离子水溶解后，用透析袋透析72小时，期间换水3-4次，冷冻干燥得到白色固体，即为以BPEI600为母核，用6％的酸酐A11改性得到的改性聚乙烯亚胺类聚合物(BPEI600-A11-y6)543mg，收率为92％。
IR(KBr):νCO 1710；1650。分别对两种原料和产物进行红外光谱对比分析(图3)，十二烯基丁二酸酐异构体混合物(A11)的红外光谱图中，2920cm-1和2850cm-1的强吸收归属于亚甲基，1900cm-1和1800cm-1的中到强吸收归属于酸酐(参见图3的a)；BPEI600的红外光谱中，3250cm-1，1600cm-1的中到强吸收归属于氨基，2900cm-1和2810cm-1的中到强吸收归属于亚甲基(参见图3的b)；目标聚乙烯亚胺类聚合物(BPEI600-A11-y6)的红外光谱中，未见1900cm-1和1800cm-1左右的酸酐吸收峰，并可见有酰胺(3300cm-1、1650cm-1)和羧酸(1710cm-1)的强吸收峰(参见图3的c)。
实施例4：BPEI1200-A4-y50改性聚乙烯亚胺聚合物的合成
在干燥的反应瓶中加入BPEI1200(430mg,10mmol对应乙烯亚胺单元),DMSO(10mL)，加入环丁烷-1,2-二甲酸酐(A4,630mg,5mmol)加热至50℃反应24h。即得到粗产物。
将粗产品用去离子水溶解后，用透析袋透析72小时，期间换水3-4次，冷冻干燥得到白色固体，即为BPEI1200为母核，用50％的A4改性得到的改性聚乙烯亚胺类聚合物(BPEI1200-A4-y50)859mg，收率81％。IR(KBr):νCO1710；1652.
实施例5：BPEI1800-A8-y10改性聚乙烯亚胺聚合物的合成
在干燥的反应瓶中加入BPEI1800(430mg,10mmol对应乙烯亚胺单元),DMSO(10mL)，加入正辛基琥珀酸酐(A8,212mg,1.0mmol)加热至50℃反应24h。即得到粗产物。
将粗产品用去离子水溶解后，用透析袋透析72小时，期间换水3-4次，冷冻干燥得到白色固体，即为bPEI1800为母核，用10％的A8改性得到的改性聚乙烯亚胺类聚合物(BPEI1800-A8-y10)571mg，收率89％。IR(KBr):νCO 1712；1653。
实施例6：BPEI5000-A17-y1改性聚乙烯亚胺聚合物的合成
在干燥的反应瓶中加入BPEI5000(430mg,10mmol对应乙烯亚胺单元),DMSO(10mL)，加入十八烯基琥珀酸酐(A17,35mg,0.1mmol)加热至50℃反应24h。即得到粗产物。
将粗产品用去离子水溶解后，用透析袋透析72小时，期间换水3-4次，冷冻干燥得到白色固体，即为bPEI5000为母核，用1％的A17改性得到的改性聚乙烯亚胺聚合物(BPEI5000-A17-y1)446mg，收率96％。IR(KBr):νCO 1711；1650.
实施例7：LPEI600-A13-y4改性聚乙烯亚胺聚合物的合成
在干燥的反应瓶中加入lPEI600(430mg,10mmol对应乙烯亚胺单体),DMSO(10mL)，加入十二烷基丁二酸酐(A13,107mg,0.4mmol)加热至50℃反应24h。即得到粗产物。
将粗产品用去离子水溶解后，用透析袋透析72小时，期间换水3-4次，冷冻干燥得到白色固体，即为lPEI600为母核，用4％的A13改性的聚乙烯亚胺聚合物(LPEI600-A13-4)505mg，收率94％。IR(KBr):νCO 1712；1653.
实施例8：LPEI1200-A7-y20改性聚乙烯亚胺类聚合物的合成
在干燥的反应瓶中加入lPEI1200(430mg,10mmol对应乙烯亚胺单体),DMSO(10mL)，加入2-辛烯基琥珀酸酐(A7,420mg,2mmol)加热至50℃反应24h。即得到粗产物。
将粗产品用去离子水溶解后，用透析袋透析72小时，期间换水3-4次，冷冻干燥得到白色固体，即为lPEI1200为母核，用20％的A7改性得到的改性聚乙烯亚胺聚合物(LPEI1200-A7-y20)739mg，收率87％。IR(KBr):νCO 1710；1652.
实施例9：LPEI1800-A6-y8改性聚乙烯亚胺聚合物的合成
在干燥的反应瓶中加入lPEI1800(430mg,10mmol对应乙烯亚胺单体),DMSO(10mL)，加入1,2-环己二酸酐(A6,123mg,0.8mmol)加热至50℃反应24h。即得到粗产物。
将粗产品用去离子水溶解后，用透析袋透析72小时，期间换水3-4次，冷冻干燥得到白色固体，即为lPEI1800为母核，用8％的A6改性得到的改性聚乙烯亚胺聚合物(LPEI600-A6-y8)509mg，收率92％。IR(KBr):νCO 1710；1652.
实施例10：LPEI5000-A2-y16改性聚乙烯亚胺聚合物的合成
在干燥的反应瓶中加入LPEI5000(430mg,10mmol对应乙烯亚胺单体),DMSO(10mL)，加入(2-甲基-2-丙烯基)琥珀酸酐(A2,246mg,1.6mmol)加热至50℃反应24h。即得到粗产物。
将粗产品用去离子水溶解后，用透析袋透析72小时，期间换水3-4次，冷冻干燥得到白色固体，即为lPEI5000为母核，用16％的A2改性得到的改性聚乙烯亚胺聚合物(LPEI5000-A2-y16)608mg，收率90％。IR(KBr):νCO 1715；1652.
实施例11：代表性聚合物的细胞毒性评价
细胞系：Hela细胞
培养基：补充了10％胎牛血清的DMEM
筛选形式：CCK-8法
1.将处于对数生长期的Hela细胞进行消化，用DMEM细胞培养液(含有10％胎牛血清，5％双抗)，将消化离心后的细胞重悬成单个细胞悬液，以5000/孔的密度接种于96孔板中，放于含有5％CO2 37℃恒温孵箱中培养24h。
2.待细胞融合至80％左右，用不含有双抗和血清的DMEM培养液将聚合物分别配成10,30,50,100,200μg/mL的不同浓度的溶液，每个浓度设置有3个复孔，按照每孔100μL的体积替换原来的细胞培养液。聚合物溶液与细胞放于孵箱里共孵育4h。新鲜配置的含有10％胎牛血清和5％双抗的完全培养液替换原含有聚合物的培养液，再放回孵箱继续培养48h。
3.每孔加入10μ的CCK-8试剂，继续放于37℃条件下培养2h后，从孵箱取出，至酶联免疫检测仪中，设置操作程序，震荡30s，在450nm波长下测定OD值，根据OD值计算细胞的存活率，公式如下:
选取BPEI600-A11-y6和LPEI600-A13-y4两种改性聚乙烯亚胺聚合物评价其对Hela细胞的存活率的影响，以PEI 25K作为对照，结果如图4所示。从图4中可以看出，即使随着两种改性聚乙烯亚胺聚合物浓度的增大，其对于细胞几乎没有抑制作用，细胞存活率达到90％以上，PEI 25K在浓度为50μg/mL时，细胞存活率即降为50％，而在浓度为200μg/mL时，细胞的存活率只有24％，而BPEI600-A11-y6和LPEI600-A13-y4两种改性聚乙烯亚胺聚合物，即使是在浓度为200μg/mL时，细胞存活率仍高达70％以上。
实施例12：改性聚乙烯亚胺类聚合物作为DNA载体的初步筛选
细胞系：Hela细胞
培养基：补充了10％胎牛血清的DMEM
筛选形式：96孔板细胞转染
检测(读出)：相对于总细胞数(使用核染料Hoechst测定总细胞数)的GFP荧光细胞数百分比例。PEI25K用作阳性对照组。
方法：使用8通道移液管加样。所示的含量为96孔平板的单孔。
1.将实施例1中制备得到的改性聚合物(0.1mmol/mL的乙醇溶液)中取出7.5μL和7.5μL的DOPE乙醇溶液(0.01M)混合后，向混合物中加入35μL的0.2M醋酸钠缓冲液(pH5.6)中，使用恒定的涡旋30s，制得50μL溶液。再从50μL脂质体溶液中取出4μL至46μL的0.02M乙酸钠缓冲液(pH 5.6)中，使用恒定的涡旋30s以形成最终的脂质体。从上述最终的脂质体中取出5μL与溶于5μL的0.02M醋酸钠缓冲液的75ng质粒DNA(pSin-EGFP-IRES-Puro)混合，室温下放置30min，以形成脂质/DNA转染复合物。
2.10μL的脂质/DNA转染复合物在室温下孵育30min后，加入90μL新鲜重悬浮的细胞(3-5×104细胞)，并用移液管混合。将100μL的细胞+脂质/DNA复合物立即转移至96-孔培养平板的分开孔中，并且置于37℃的含有5％CO2的培养箱中。
3.细胞初始转染后20至24小时，将Hoechst33258以0.2μg/ml的终浓度加入细胞中，在37℃黑暗下培养15min。然后用PBS溶液清洗细胞一次，再加入培养基培养20至24小时。
4.将细胞置于高通量共聚焦显微镜(Molecular Devices ImageXpress)中，从每个孔捕获的细胞的4个图像视野，对于每个样品，捕获3种激光波长图像：细胞的亮视野图像，显示总细胞核的Hoechst染色图像(图1(a)和图1(b))和显示用质粒DNA成功转染并表达GFP的GFP图像(图1(c)和图1(d))。用MetaXpress软件对获得的Hoechst染色图像和GFP图像分别进行细胞计数，再将表达GFP的细胞数除以总细胞核数，即为细胞绝对转染效率。PEI25K为阳性对照。两者的比值即为相对转染效率，计算如下：
结果：2160种改性聚合物对Hela细胞的DNA的相对转染效率示于表1中。
表1 2160种改性聚合物对Hela细胞的DNA的相对转染效率(PEI25K为阳性对照)。
实施例13：改性聚乙烯亚胺类聚合物作为mRNA载体的初步筛选
细胞系：Hela细胞
培养基：补充了10％胎牛血清的DMEM
筛选形式：96孔板细胞转染
检测(读出)：相对于总细胞数(使用核染料Hoechst测定总细胞数)的GFP荧光细胞数百分比例。PEI25K作为阳性对照组。
方法：实验方法与实施例12相同，转染的EGFP mRNA质量为50ng每孔。
结果：2160种改性聚合物对Hela细胞的mRNA相对转染效率示于表2中。
表2 2160种改性聚合物对Hela细胞的mRNA的相对转染效率(PEI25K为阳性对照)
实施例14：改性聚乙烯亚胺类聚合物作为DNA载体对MCF7细胞株的转染细胞系：MCF7细胞
培养基：补充了10％胎牛血清的DMEM
筛选形式：96孔板细胞转染
检测(读出)：相对于总细胞数(使用核染料Hoechst测定总细胞数)的GFP荧光细胞数百分比例。PEI25K用作阳性对照组。
方法：实验方法与实施例2基本相同。
结果：192种改性聚合物对MCF7细胞的DNA相对转染效率示于表3中
表3 192种改性聚乙烯亚胺类聚合物对MCF7细胞的DNA相对转染效率(以PEI25K作为阳性对照)
实施例15：改性聚乙烯亚胺聚合物作为mRNA载体的对MCF7细胞株的转染
细胞系：MCF7细胞
培养基：补充了10％胎牛血清的DMEM
筛选形式：96孔板细胞转染
检测(读出)：相对于总细胞数(使用核染料Hoechst测定总细胞数)的GFP荧光细胞数百分比例。PEI25K作为阳性对照组。
方法：实验方法与实施例4基本相同，转染的EGFP mRNA质量为50ng每孔。
结果：192种改性聚合物对MCF7细胞的mRNA绝对转染效率示于表4中。
表4 192种改性聚合物对MCF7细胞的mRNA相对转染效率(PEI25K作为阳性对照)
实施例16：改性聚乙烯亚胺类聚合物作为DNA载体在难转染细胞系(胚胎干细胞)的筛选
细胞系：胚胎干细胞
培养基：mTeSR1(STEMCELL)
筛选形式：96孔板细胞转染
检测(读出)：相对于总细胞数的GFP荧光细胞数百分比例。Lipofectamine Stem用作阳性对照组。
方法：使用8通道移液管加样。所示的含量为96孔平板的单孔。
1.在基质胶处理过的96孔板中培养干细胞至每孔3-5×104细胞。
2.将实施例1中制备得到的聚合物(0.1mmol)溶解在1mL的无水乙醇中，超声溶解后，取7.5μL和7.5μL的DOPE乙醇溶液(0.01M)混合后，向混合物中加入35μL的0.2M醋酸钠缓冲液(pH5.6)中，使用恒定的涡旋30s。再从中取出4μL至46μL的0.02M醋酸钠缓冲液(pH5.6)中，使用恒定的涡旋30s以形成脂质体。将5μL以上脂质试剂与溶于5μL的0.02M醋酸钠缓冲液的75ng质粒DNA(pSin-EGFP-IRES-Puro)混合，室温下放置30min，以形成脂质/DNA转染复合物。
3.10μL的脂质/DNA转染复合物在室温下孵育30min后，加入90μL mTeSR1培养基，并用移液管混合。将100μL的混合物加至96-孔培养平板的分开孔中，并且置于37℃的含有5％CO2的培养箱中。
4.细胞转染后48小时，用0.05％的Trypsin-EDTA消化细胞，并且将细胞在PBS缓冲液中重悬，过滤。将细胞悬液放入流式细胞仪中，测量不少于2000个细胞中表达GFP的细胞数量，从而得到细胞转染的绝对效率。将细胞转染效率与阳性对照组Lipofectamine Stem作对比，得到细胞转染的相对效率。
结果：108种改性聚合物对胚胎干细胞的DNA相对转染效率示于表5中
表5 108种改性聚合物对胚胎干细胞的DNA相对转染效率(Lipofectamine Stem用作阳性对照)
| PEI | 改性比(y) | A7 | A8 | A9 | A10 | A11 | A12 |
| BPEI600 | 4％ | 0.3 | 0.2 | 0.5 | 0.9 | 1.1 | 0.9 |
| BPEI600 | 6％ | 1.0 | 0.8 | 2.1 | 1.3 | 0.9 | 1.9 |
| BPEI600 | 8％ | 0.8 | 1.2 | 1.7 | 2.5 | 2.9 | 1.7 |
| BPEI600 | 10％ | 2.1 | 0.9 | 0.6 | 1.7 | 2.0 | 1.4 |
| BPEI1200 | 2％ | 0.2 | 0.3 | 0.8 | 0.9 | 1.7 | 0.3 |
| BPEI1200 | 4％ | 0.1 | 0.3 | 0.9 | 0.9 | 2.1 | 0.0 |
| BPEI1200 | 6％ | 0.1 | 0.3 | 0.7 | 1.0 | 1.0 | 0.2 |
| BPEI1800 | 4％ | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.2 | 1.1 | 1.0 |
| LPEI600 | 4％ | 0.2 | 0.9 | 0.1 | 0.1 | 1.6 | 0.2 |
| LPEI600 | 6％ | 1.3 | 1.2 | 0.1 | 0.1 | 1.6 | 0.0 |
| LPEI600 | 8％ | 0.1 | 0.0 | 0.1 | 0.9 | 0.8 | 0.0 |
| LPEI600 | 10％ | 0.0 | 0.0 | 0.1 | 1.5 | 0.1 | 0.1 |
| LPEI1200 | 6％ | 0.0 | 0.9 | 1.2 | 1.1 | 1.8 | 0.4 |
| LPEI1200 | 8％ | 0.1 | 1.7 | 1.3 | 0.7 | 0.7 | 0.1 |
| LPEI1200 | 10％ | 1.5 | 0.9 | 1.5 | 0.8 | 0.2 | 0.1 |
| LPEI1800 | 2％ | 0.1 | 0.4 | 0.3 | 0.5 | 1.2 | 0.0 |
| LPEI1800 | 4％ | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.6 | 1.3 | 0.6 |
| LPEI1800 | 6％ | 0.1 | 0.2 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 |
实施例17：改性聚乙烯亚胺聚合物作为mRNA载体在难转染细胞系(胚胎干细胞)的筛选
细胞系：胚胎干细胞
培养基：mTeSR1(STEMCELL)
筛选形式：96孔板细胞转染
检测(读出)：相对于总细胞数的GFP荧光细胞数百分比例。Lipofectamine Stem用作阳性对照组。
方法：实验方法与实施例6基本相同，转染的EGFP mRNA质量为50ng每孔。
结果：108种改性聚合物对胚胎干细胞的mRNA绝对转染效率示于表6中。
表6 108种改性聚合物对胚胎干细胞的mRNA相对转染效率(Lipofectamine Stem用作阳性对照)
| PEI | 改性比 | A7 | A8 | A9 | A10 | A11 | A12 |
| BPEI600 | 4％ | 0.4 | 0.3 | 0.7 | 1.3 | 1.5 | 1.3 |
| BPEI600 | 6％ | 1.4 | 1.2 | 2.9 | 1.8 | 1.3 | 2.7 |
| BPEI600 | 8％ | 1.1 | 1.7 | 2.5 | 3.5 | 4.1 | 2.4 |
| BPEI600 | 10％ | 3.0 | 1.3 | 0.8 | 2.4 | 2.8 | 1.9 |
| BPEI1200 | 2％ | 0.3 | 0.4 | 1.2 | 1.3 | 2.5 | 0.4 |
| BPEI1200 | 4％ | 0.2 | 0.5 | 1.3 | 1.2 | 2.9 | 0.1 |
| BPEI1200 | 6％ | 0.1 | 0.5 | 1.0 | 1.5 | 1.5 | 0.2 |
| BPEI1800 | 4％ | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.3 | 1.6 | 1.5 |
| LPEI600 | 4％ | 0.3 | 1.3 | 0.2 | 0.1 | 2.2 | 0.3 |
| LPEI600 | 6％ | 1.9 | 1.7 | 0.1 | 0.1 | 2.3 | 0.0 |
| LPEI600 | 8％ | 0.1 | 0.0 | 0.2 | 1.3 | 1.2 | 0.1 |
| LPEI600 | 10％ | 0.0 | 0.0 | 0.2 | 2.0 | 0.2 | 0.2 |
| LPEI1200 | 6％ | 0.0 | 1.3 | 1.7 | 1.5 | 2.6 | 0.6 |
| LPEI1200 | 8％ | 0.2 | 2.5 | 1.9 | 1.0 | 1.0 | 0.2 |
| LPEI1200 | 10％ | 2.0 | 1.3 | 2.0 | 1.1 | 0.2 | 0.1 |
| LPEI1800 | 2％ | 0.1 | 0.5 | 0.4 | 0.7 | 1.7 | 0.0 |
| LPEI1800 | 4％ | 0.4 | 0.4 | 0.5 | 0.9 | 1.9 | 0.9 |
| LPEI1800 | 6％ | 0.2 | 0.2 | 0.3 | 0.5 | 0.9 | 1.2 |
缩写列表
DMEM 基础高糖培养基
DNA 脱氧核糖核酸
DOPE 二油酰基磷脂酰乙醇胺
GFP 绿色荧光蛋白
EGFP 增强的GFP
kD 千道尔顿
RNA 核糖核酸
THF 四氢呋喃
DMSO 二甲基亚砜
Claims (15)
1.一种改性聚乙烯亚胺类聚合物，由以下化学式I表示：
[化学式I]
其中，A是
q是1、2、3、4或5；
B是氢或A，
其中，R选自C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C2-C24酰基，其中，所述C1-C24烷基、所述C2-C24烯基、所述C2-C24炔基和所述C2-C24酰基任选地被C1-C6烃基取代，并且当存在多个R时，多个R彼此相同或不同；
优选地，R选自C3-C18烷基、C3-C18烯基、C3-C18炔基和C3-C20酰基，其中，所述C3-C18烷基、所述C3-C18烯基、所述C3-C18炔基和所述C3-C20酰基任选地被C1-C6烃基取代，并且当存在多个R时，多个R彼此相同；
L选自C1-C12亚烷基、C2-C12亚烯基和C2-C12亚炔基，其中，所述C1-C12亚烷基、所述C2-C12亚烯基和所述C2-C12亚炔基任选地被选自烃基、羧基、酰基和烷氧基中的一个或多个取代基取代，或者是包含选自氮、硫和氧中的杂原子的任选地取代的4至10元杂环，并且当存在多个L时，多个L彼此相同或不同；
优选地，L选自C1-C10亚烷基、C2-C10亚烯基或C2-C10亚炔基，其中，所述C1-C10亚烷基、所述C2-C10亚烯基和所述C2-C10亚炔基任选地被选自烃基、羧基、酰基和烷氧基中的一个或多个取代基取代，或者是包含选自氮、硫和氧中的杂原子的任选地取代的4至6元杂环，并且当存在多个L时，多个L彼此相同；
更优选地，L为亚甲基；
由化学式I表示的改性聚乙烯亚胺类聚合物中A基团的总摩尔量占N原子的总摩尔量的0.1％至100％；优选为1％至90％；更优选为1％至50％；
m,n,x,y分别为0至600的整数，并且满足m+n+x+y为10至600；优选地，m,n,x,y分别为0至250的整数，并且满足m+n+x+y为10至250；
所述改性聚乙烯亚胺类聚合物的平均分子量在300至50000的范围内；优选地，所述改性聚乙烯亚胺类聚合物的平均分子量在400至30000的范围内；更优选地，所述改性聚乙烯亚胺类聚合物的平均分子量在600至25000的范围内。
2.根据权利要求1所述的改性聚乙烯亚胺类聚合物，其中，
m＝0，y＝0，并且在m＝0，y＝0的情况下，由化学式I表示的改性聚乙烯亚胺类聚合物中A基团的总摩尔量占N原子的总摩尔量的0.1％至100％；优选为1％至90％；更优选为1％至50％；
或者，n＝0，x＝0，并且在n＝0，x＝0的情况下，由化学式I表示的改性聚乙烯亚胺类聚合物中A基团的总摩尔量占N原子的总摩尔量的0.1％至60％；优选为1％至50％。
3.根据权利要求1所述的改性聚乙烯亚胺类聚合物，其中，
A选自以下的A1至A18：
A1：
A2：
A3：
A4：
A5：
A6:
A7：
A8:
A9:
A10:
A11:
A12：
A13:
A14:
A15:
A16:
A17：
A18：
4.一种改性聚乙烯亚胺类聚合物，该改性聚乙烯亚胺类聚合物通过由以下化学式II表示的聚乙烯亚胺类聚合物与酸酐反应制备而成：
[化学式II]
所述酸酐为
q是1、2、3、4或5；
R选自C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C2-C24酰基，其中，所述C1-C24烷基、所述C2-C24烯基、所述C2-C24炔基和所述C2-C24酰基任选地被C1-C6烃基取代，并且当存在多个R时，多个R彼此相同或不同；
优选地，R选自C3-C18烷基、C3-C18烯基、C3-C18炔基和C3-C20酰基，其中，所述C3-C18烷基、所述C3-C18烯基、所述C3-C18炔基和所述C3-C20酰基任选地被C1-C6烃基取代，并且当存在多个R时，多个R彼此相同；
L选自C1-C12亚烷基、C2-C12亚烯基和C2-C12亚炔基，其中，所述C1-C12亚烷基、所述C2-C12亚烯基和所述C2-C12亚炔基任选地被选自烃基、羧基、酰基和烷氧基中的一个或多个取代基取代，或者是包含选自氮、硫和氧中的杂原子的任选地取代的4至10元杂环，并且当存在多个L时，多个L彼此相同或不同；
优选地，L选自C1-C10亚烷基、C2-C10亚烯基或C2-C10亚炔基，其中，所述C1-C10亚烷基、所述C2-C10亚烯基和所述C2-C10亚炔基任选地被选自烃基、羧基、酰基和烷氧基中的一个或多个取代基取代，或者是包含选自氮、硫和氧中的杂原子的任选地取代的4至6元杂环，并且当存在多个L时，多个L彼此相同；
更优选地，L为亚甲基；
所述反应中，加入的酸酐的摩尔量是由化学式II中表示的聚乙烯亚胺类聚合物中包含的N原子的总摩尔量的0.1％至100％；优选为1％至90％；更优选为1％至50％；
m,n,x,y分别为0至600的整数，并且满足m+n+x+y为10至600；优选地，m,n,x,y分别为0至250的整数，并且满足m+n+x+y为10至250；
所述由化学式II表示的聚乙烯亚胺类聚合物的平均分子量在400至50000的范围内；优选地，所述由化学式II表示的聚乙烯亚胺类聚合物的平均分子量在600至20000的范围内；更优选地，所述由化学式II表示的聚乙烯亚胺类聚合物的平均分子量在600至5000的范围内。
5.根据权利要求4所述的改性聚乙烯亚胺类聚合物，其中，
m＝0，y＝0，并且在m＝0，y＝0的情况下，加入的酸酐的摩尔量是由化学式II中表示的聚乙烯亚胺类聚合物中包含的N原子的总摩尔量的0.1％至100％；优选为1％至90％；优选为1％至50％；
或者，n＝0，x＝0，并且在n＝0，x＝0的情况下，加入的酸酐的摩尔量是由化学式II中表示的聚乙烯亚胺类聚合物中包含的N原子的总摩尔量的0.1％至60％；优选为1％至50％。
6.根据权利要求4所述的改性聚乙烯亚胺类聚合物，其中，
所述聚乙烯亚胺类聚合物选自以下的LPEI600、LPEI1200、LPEI1800、LPEI5000、BPEI600、BPEI1200、BPEI1800、BPEI5000：
LPEI600表示化学式II中m＝0，y＝0，并且平均分子量为600的聚乙烯亚胺类聚合物；
LPEI1200表示化学式II中m＝0，y＝0，并且平均分子量为1200的聚乙烯亚胺类聚合物；
LPEI1800表示化学式II中m＝0，y＝0，并且平均分子量为1800的聚乙烯亚胺类聚合物；
LPEI5000表示化学式II中m＝0，y＝0，并且平均分子量为5000的聚乙烯亚胺类聚合物；
BPEI600表示化学式II中n＝0，x＝0，并且平均分子量为600的聚乙烯亚胺类聚合物；
BPEI1200表示化学式II中n＝0，x＝0，并且平均分子量为1200的聚乙烯亚胺类聚合物；
BPEI1800表示化学式II中n＝0，x＝0，并且平均分子量为1800的聚乙烯亚胺类聚合物；
BPEI5000表示化学式II中n＝0，x＝0，并且平均分子量为5000的聚乙烯亚胺类聚合物。
7.根据权利要求4所述的改性聚乙烯胺类聚合物，其中，
所述酸酐选自以下的A-1至A-18：
8.根据权利要求1至7中任意一项所述的改性聚乙烯亚胺类聚合物的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
使由以下化学式II表示的聚乙烯亚胺类聚合物与酸酐在40℃至90℃的温度下优选在50℃至80℃的温度下反应10小时至30小时优选反应16小时至20小时：
[化学式II]
所述酸酐为
加入的酸酐的摩尔量是由化学式II中表示的聚乙烯亚胺类聚合物中包含的N原子的总摩尔量的0.1％至100％；优选为1％至90％；优选为1％至50％；
R、L、q、m、n、x和y分别与权利要求1至7中任意一项中定义的相同。
9.根据权利要求8所述的改性聚乙烯亚胺类聚合物的制备方法，其中，
所述聚乙烯亚胺类聚合物选自以下的LPEI600、LPEI1200、LPEI1800、LPEI5000、BPEI600、BPEI1200、BPEI1800、BPEI5000：
LPEI600表示化学式II中m＝0，y＝0，并且平均分子量为600的聚乙烯亚胺类聚合物；
LPEI1200表示化学式II中m＝0，y＝0，并且平均分子量为1200的聚乙烯亚胺类聚合物；
LPEI1800表示化学式II中m＝0，y＝0，并且平均分子量为1800的聚乙烯亚胺类聚合物；
LPEI5000表示化学式II中m＝0，y＝0，并且平均分子量为5000的聚乙烯亚胺类聚合物；
BPEI600表示化学式II中n＝0，x＝0，并且平均分子量为600的聚乙烯亚胺类聚合物；
BPEI1200表示化学式II中n＝0，x＝0，并且平均分子量为1200的聚乙烯亚胺类聚合物；
BPEI1800表示化学式II中n＝0，x＝0，并且平均分子量为1800的聚乙烯亚胺类聚合物；
BPEI5000表示化学式II中n＝0，x＝0，并且平均分子量为5000的聚乙烯亚胺类聚合物。
10.根据权利要求8所述的改性聚乙烯亚胺类聚合物的制备方法，
所述酸酐选自以下的A-1至A-18中：
11.一种根据权利要求1至7中任意一项所述的改性聚乙烯亚胺类聚合物的用途，其中，所述改性聚乙烯亚胺类聚合物用于制备脂质颗粒，所述脂质颗粒为脂质纳米粒脂质体、多层囊泡或胶束；优选地，所述脂质颗粒为脂质纳米粒。
12.脂质颗粒，其包含权利要求1至7中任意一项所述的改性聚乙烯亚胺类聚合物，所述脂质颗粒为脂质纳米粒脂质体、多层囊泡或胶束；优选地，所述脂质颗粒为脂质纳米粒。
13.根据权利要求12所述的脂质颗粒，所述脂质颗粒进一步含有辅助脂质、固醇和生物活性剂中的一种或多种；
所述辅助脂质为非阳离子脂质，优选地，所述辅助脂质是非阳离子磷脂，进一步优选地，所述非阳离子脂质是DOPE；
所述固醇为胆固醇；
所述生物活性剂为核酸、抗肿瘤剂、抗生素、免疫调节剂、抗炎剂、作用于中枢神经系统的药剂、抗原或其片段、肽、蛋白、抗体、疫苗和小分子中的一种或多种；更优选地，所述核酸为RNA、信使RNA(mRNA)、反义寡核苷酸、DNA、质粒、核糖体RNA(rRNA)、微RNA(miRNA)、转移RNA(tRNA)、小的抑制RNA(siRNA)和小的核RNA(snRNA)。
14.一种权利要求12或13所述的脂质颗粒在药物的制备中的用途，所述药物是用于基因治疗、基因疫苗接种、反义治疗或通过干扰RNA的治疗的药物；
所述基因治疗可用于癌症和遗传疾病的治疗；优选地，所述癌症为肺癌、胃癌、肝癌、食管癌、结肠癌、胰腺癌、脑癌、淋巴癌、血癌或前列腺癌中的一种或多种，所述遗传疾病为血友病，地中海贫血、高雪氏病中的一种或多种；
所述基因疫苗接种用于治疗癌症、过敏、毒性和病原体感染；优选地，所述病原体为病毒、细菌或真菌中的一种或多种。
15.一种权利要求12或13所述的脂质颗粒在制备用于核酸转移的药物中的用途，所述核酸为RNA、信使RNA(mRNA)、反义寡核苷酸、DNA、质粒、核糖体RNA(rRNA)、微RNA(miRNA)、转移RNA(tRNA)、小的抑制RNA(siRNA)和小的核RNA(snRNA)。
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