KR101170473B1 - 신규한 리피드?금나노입자 복합체 및 상기 복합체를 이용한 유전자 등의 생리활성물질의 전달 방법 - Google Patents

신규한 리피드?금나노입자 복합체 및 상기 복합체를 이용한 유전자 등의 생리활성물질의 전달 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 리피드-금나노입자 복합체, 그 제조방법 및 상기 복합체를 이용한 유전자 등의 생리활성물질의 전달 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 금나노입자 복합체는 금나노입자 및 상기 금나노입자 표면에 정전기적 상호작용에 의하여 결합된 생리활성물질을 포함한다. 또한, 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 리피드-금나노입자 복합체는 금나노입자; 상기 금나노입자 표면에 결합된 생리활성물질; 및 상기 금나노입자 및 생리활성물질을 둘러싸서 캡슐화하는 리피드를 포함한다. 본 발명에 따른 유전자 등의 생리활성물질 전달 방법은 금나노입자 복합체에 초음파를 가하거나, 또는 금나노입자와 리피드를 운반체로 이용함으로써, 전달 효율이 현저하게 향상되며, 세포 독성을 최소화할 수 있어 최적화된 전달 시스템으로서 광범위하게 이용될 수 있다.
금나노입자, 리피드, 복합체, 초음파, 생리활성물질, 전달

Description

신규한 리피드?금나노입자 복합체 및 상기 복합체를 이용한 유전자 등의 생리활성물질의 전달 방법{NOVEL LIPID-GOLD NANOPARTICLE HYBRID, AND GENE DELIVERY METHOD USING THE SAME}
본 발명은 유전자 등의 생리활성물질 전달 유전자 등의 생리활성물질의 세포 내 전달에 있어서 트랜스펙션(transfection) 효율을 월등히 향상시키고, 세포 독성을 저하시킬 수 있는 신규한 리피드-금나노입자 복합체, 그 제조방법 및 상기 복합체를 이용한 유전자 등의 생리활성물질의 전달 방법에 관한 것이다.
최근 유전학 및 생명공학 기술의 획기적인 발전에 따라 이를 이용한 분자 약물, 특히 유전자 치료에 대한 다각도의 연구가 이루어지고 있다. 특히, 유전자 전달은 현재 치료 불가능한 것으로 여겨지는 많은 선천적 또는 후천적 질병 치료에 있어서 새로운 가능성을 열 수 있는 것으로 전망된다.
유전자 전달방법으로는 화학적인 방법, 물리적인 방법 및 바이러스를 이용하는 생물학적 방법들이 알려져 있다. 화학적인 방법의 예로는 펩티드, 단백질, 고 분자 물질, 리포좀 등을 운반체로 이용하는 전달방법을 들 수 있으며, 물리적인 방법의 예로는 전기적인 충격을 가하거나 미세주입하는 방법 등을 들 수 있다.
유전자를 전달하는 유전자 전달 운반체는 바이러스성 운반체와 비바이러스성 운반체로 구분될 수 있다. 바이러스성 운반체는 전달 효율이 우수한 반면에 높은 감염성으로 인한 여러 문제점을 갖고 있으며, 비바이러스성 운반체는 전달 효율은 떨어지나 체내 안정성이 우수하며 면역부작용 등의 위험이 낮은 특성을 갖는다. 이러한 비바이러스성 운반체로서는 생체적합성(biocompatibility), 높은 담체에 대한 약물 비율(drug-to-carrier ratio), 및 직접적 약물 캡슐화 능력(straight forward drug encapsulation capability) 측면에서 우수한 특성을 갖는 리포좀이 임상적으로 널리 이용되고 있다. 그러나, 리포좀을 이용하는 운반 시스템의 경우에는 바이러스성 운반체에 비하여 전달 효율이 낮을 뿐 아니라, 세포독성(cytotoxicity) 측면에서도 여전히 문제를 갖고 있다.
이와 같이 전달 시스템을 최적화하기 위해서는 독성을 최소화하면서 전달 효율을 최대화하여야 할 필요가 있는데, 상기 두 가지 특성은 동시에 증가하거나 감소하는 경향을 가지고 있다. 따라서, 이러한 문제를 해결한 최적화된 전달 시스템에 대한 요구가 존재하는 실정이다.
한편, 최근 나노 기술의 발전에 따라 나노물질계 전달 시스템에 대한 관심이 고조되고 있으며, 특히 금나노입자(AuNPs)가 유전자 물질의 세포내 전달을 위한 우수한 운반체임이 제시되었다. 금나노입자는 높은 결합 밀도(packing density)로 표적 생분자(biomolecule)에 용이하게 결합할 수 있어, 효소 분해를 제한하면서 효 율을 최대화하며, 부가적인 형광물질(fluorophore)을 이용하지 않고도 영상화할 수 있는 장점을 갖는다.
이와 같이 유전자 전달 운반체에 대해서는 여러 연구가 이루어지고 있으나, 여전히 전달 효율 및 세포독성 측면에서 더욱 향상된 운반체 및 유전자 전달방법에 대한 요구가 존재한다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 제안된 것으로, 유전자 등의 생리활성물질의 세포 내 전달에 있어서 트랜스펙션(transfection) 효율을 월등히 향상시키고, 세포 독성을 저하시킬 수 있는 신규한 금나노입자 복합체, 그 제조방법 및 상기 복합체를 이용한 생리활성물질 전달 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 금나노입자 복합체는 금나노입자 및 상기 금나노입자 표면에 정전기적 상호작용에 의하여 결합된 생리활성물질을 포함한다.
또한, 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 리피드-금나노입자 복합체는 금나노입자; 상기 금나노입자 표면에 결합된 생리활성물질; 및 상기 금나노입자 및 상기 생리활성물질을 둘러싸서 캡슐화하는 리피드를 포함한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 금나노입자 복합체의 제조방법은 금나노입자 및 생리활성물질을 혼합하는 단계; 및 상기 금나노입자 표면에 상기 생리활성물질을 정전기적 상호작용에 의하여 결합시키는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 리피드-금나노입자 복합체의 제조방법은 금나노입자 및 생리활성물질을 혼합하는 단계; 상기 금나노입자 표면에 상기 생리활성물질을 결합시키는 단계; 및 상기 금나노입자 및 상기 생리활성물질을 리피드로 둘러싸서 캡슐화하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 생리활성물질의 전달 방법은 금나노입자 및 상기 금나노입자 표면에 정전기적 상호작용에 의하여 결합된 생리활성물질을 포함하는 금나노입자 복합체에 초음파 자극을 가하는 단계; 상기 금나노입자 복합체를 세포와 혼합하여 배양하는 단계; 및 상기 금나노입자 복합체를 세포 내에 도입하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 생리활성물질의 전달 방법은 금나노입자, 상기 금나노입자 표면에 결합된 생리활성물질, 및 상기 금나노입자 및 상기 생리활성물질을 둘러싸서 캡슐화하는 리피드를 포함하는 리피드-금나노입자 복합체를 세포와 혼합하여 배양하는 단계; 및 상기 리피드-금나노입자 복합체를 세포 내에 도입하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 신규한 리피드-금나노입자 복합체는 DNA 등의 생리활성물질의 적재 용량(loading capability)이 높은 것을 특징으로 하며, 금나노입자 상에 생리활성물질이 조밀하게 결합되어, 세포 내에서 뉴클레아제에 의하여 쉽게 분해되지 않으므로, 세포 내로 생리활성물질을 효율적으로 전달할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 복합체는 DNA 등의 생리활성물질 전달에 있어서, 생체적합성이 우수하며, 표적 생분자에 대하여 높은 결합 밀도로 용이하게 결합할 수 있다.
따라서, 본 발명의 신규한 복합체를 이용한 생리활성물질 전달방법에 따르면 전달 효율이 현저하게 향상되며, 세포 독성을 최소화할 수 있어, 최적화된 전달 방법으로서 광범위한 분야에 적용될 수 있다.
이하, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명의 기술적 사상을 용이하게 실시할 수 있을 정도로 상세히 설명하기 위하여, 본 발명의 가장 바람직한 실시예를 첨부 도면을 참조하여 설명하기로 한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 금나노입자 복합체는 금나노입자 및 상기 금나노입자 표면에 정전기적 상호작용에 의하여 결합된 생리활성물질을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에서, 금나노입자는 전달하고자 하는 생리활성물질의 적재 용량이 높으며, 세포 내에서 분해효소에 의하여 쉽게 분해되지 않고, 세포 내 독성을 일으키지 않는 것으로 보고되고 있어, 세포 내 특정 생리활성물질 전달에 있어서 우수한 운반체로서 생리활성물질을 효율적으로 전달할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 금나노입자는 유전자 등의 생리활성물질 전달 시 세포 독성 또는 전달 효율 측면에서 발생가능한 문제점을 최소화할 수 있는 관점에서, 약 100 ㎚ 이하의 크기를 갖는 것이 바람직하며, 특히 약 15~100 ㎚의 크기를 갖는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에서, 생리활성물질은 DNA, RNA, 플라스미드 DNA, 펩티드, 단백질, 폴리뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 생리활성물질은 정전기적 상호작용(electrostatic interaction)에 의하여 금나노입자 표면에 직접 결합될 수 있다. 일반적으로 금나노입자는 용액 상태로 합성되며, 시트르산 등의 표면안정화제로 덮여 있다. 이러한 금나노입자와 생리활성물질을 혼합하는 경우, 금나노입자를 덮고 있는 표면안정화제가 생리활성물질에 의하여 치환됨으로써 정전기적 상호 작용에 의하여 금나노입자와 생리활성물질이 결합되며, 이에 의하여 금나노입자는 안정화될 수 있다(도 1 참조).
본 발명의 일 실시예에서, 금나노입자 복합체는 금나노입자 표면에 결합된 폴리에틸렌글리콜(PFG)과 같은 폴리머를 더 포함할 수 있다. 폴리에틸렌글리콜과 같은 폴리머를 금나노입자 표면에 결합시킴으로써, 면역성 플라즈마 단백질, 예를 들어 항체 등을 포함하는 생분자(biomolecule)의 비특이적 결합을 최소화할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 금나노입자 복합체는 금나노입자 표면에 결합된 펩티드, 단백질, 항체 및 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 표적화 물질을 더 포함할 수 있다. 이러한 표적화 물질은 특정 세포 또는 생체 내 특정 부위에 선택적 및 특이적으로 결합할 수 있으므로, 생리활성물질 전달에 있어서 표적 생분자에 대한 결합 효율을 높일 수 있다.
한편, 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 리피드-금나노입자 복합체는 금나노입자; 상기 금나노입자 표면에 결합된 생리활성물질; 및 상기 금나노입자 및 생리활성물질을 둘러싸서 캡슐화하는 리피드를 포함하는 것을 특징으로 한다.
여기에서, 금나노입자 및 생리활성물질에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 실시예에 있어서, 금나노입자와 생리활성물질의 결합은 전술한 바와 같은 정전기적 상호작용 뿐 아니라, 작용기를 이용한 결합 등 다양한 형태의 결합을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 리피드는 금나노입자 및 금나노입자 표면에 결합된 생리활성물질을 둘러싸서 캡슐화할 수 있다. 도 1에 도시된 바와 같이, 금나노입자 및 상기 금나노입자 표면에 결합된 생리활성물질과 리피드를 혼합 배양하면, Ｉ형 및 Ⅱ형의 두 가지 형태 중 Ⅱ형 복합체가 지배적으로 형성될 수 있다. 이 경우, 리피드 혼합시 약간의 초음파 자극을 가하면 복합체 합성에 유용한 역할을 할 수 있다.
이와 같이 금나노입자 및 생리활성물질을 리피드로 둘러싸서 캡슐화함으로써 금나노입자 표면에 결합된 DNA 등의 생리활성물질을 보호하여 세포 트랜스펙션(transfection)을 용이하게 할 수 있다. 또한, 리피드 헤드 그룹(head group)은 양이온성이고, DNA 등의 생리활성물질이 표면에 결합된 금나노입자는 음이온성이므로, 이와 같이 금나노입자 및 금나노입자 표면에 결합된 DNA 등의 생리활성물질을 둘러싸서 리피드로 캡슐화함으로써 DNA 등의 생리활성물질의 높은 음전하 노출을 최소화하거나 제거할 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 복합체를 생리활성물질의 생체 내 전달에 이용하면, 약한 음전하를 나타내는 세포막을 통한 전달이 효율적으로 이루어질 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서 금나노입자 플랫폼은 이러한 리피드 복합체를 구조적으로 안정화시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 리피드는 이중의 지질막으로 이루어진 리포좀(liposome)을 포함하며, 이외의 다양한 구성성분의 리피드가 이용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 금나노입자 복합체는 리피드 표면에 결합된 폴리에틸렌글리콜(PFG)과 같은 폴리머를 더 포함할 수 있다. 폴리에틸렌글리콜과 같은 폴리머를 금나노입자 표면에 결합시킴으로써, 면역성 플라즈마 단백질, 예를 들어 항체 등을 포함하는 생분자(biomolecule)의 비특이적 결합을 최소화할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 금나노입자 복합체는 리피드 표면에 결합된 펩티드, 단백질, 항체 및 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 표적화 물질을 더 포함할 수 있다. 이러한 표적화 물질은 특정 세포 또는 생체 내 특정 부위에 선택적 및 특이적으로 결합할 수 있으므로, 생리활성물질 전달에 있어서 표적 생분자에 대한 결합 효율을 높일 수 있다.
한편, 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 금나노입자 복합체의 제조방법은 금나노입자 및 생리활성물질을 혼합하는 단계; 및 상기 금나노입자 표면에 상기 생리활성물질을 정전기적 상호작용에 의하여 결합시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기에서, 금나노입자 및 생리활성물질은 각각 용액 상태일 수 있으며, 금나노입자는 시트르산 등의 표면안정화제로 덮여 있을 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 생리활성물질은 DNA, RNA, 플라스미드 DNA, 펩티드, 단백질, 폴리뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 금나노입자와 생리활성물질의 결합은 금나노입자를 덮고 있는 표면안정화제가 생리활성물질에 의하여 치환됨으로써 정전기적 상호 작용에 의하여 이루어질 수 있으며, 이에 의하여 금나노입자는 안정화될 수 있다.
예를 들어, 플라스미드 DNA를 생리활성물질로 이용하는 경우, 플라스미드 DNA의 포스페이트(phosphate)의 결합 에너지가 금나노입자를 덮고 있는 표면안정화제인 시트르산의 카르복실레이트(carboxylate)의 결합 에너지보다 높다. 따라서, 금나노입자와 플라스미드 DNA를 혼합하면, 플라스미드 DNA가 금나노입자 표면의 시트르산을 대체하는 치환 반응이 가능하다. 즉, 플라스미드 DNA 사슬의 음전하는 폴리덴테이트(polydentate)로서 작용하여, 플라스미드 DNA에 의한 금나노입자 상의 시트르산의 치환을 용이하게 할 수 있다. 이와 같이 플라스미드 DNA와 금나노입자의 혼합에 의하여 금나노입자는 플라스미드 DNA에 의하여 안정화될 수 있다.
상기 결합 단계는 혼합된 금나노입자 및 생리활성물질을 25~40℃에서 5~15시간 동안 교반하면서 배양함으로써 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 혼합 단계 전에, 금나노입자 용액을 원심분 리함으로써, 금나노입자 주변에 존재하는 시트르산 등의 표면안정화제를 일부 제거하여 DNA 등의 생리활성물질에 의한 치환을 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 금나노입자 복합체의 제조방법은 금나노입자 표면에 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 결합시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 금나노입자 복합체의 제조방법은 금나노입자 표면에 펩티드, 단백질, 항체 및 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 표적화 물질을 결합시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
한편, 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 리피드-금나노입자 복합체의 제조방법은 금나노입자 및 생리활성물질을 혼합하는 단계; 상기 금나노입자 표면에 상기 생리활성물질을 결합시키는 단계; 및 상기 금나노입자 및 상기 생리활성물질을 리피드로 둘러싸서 캡슐화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기에서, 금나노입자 및 생리활성물질은 각각 용액 상태일 수 있으며, 금나노입자는 시트르산 등의 표면안정화제로 덮여 있을 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 생리활성물질은 DNA, RNA, 플라스미드 DNA, 펩티드, 단백질, 폴리뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 실시예에 있어서, 금나노입자와 생리활성물질의 결합 단계는 전술한 바와 같은 정전기적 상호작용 뿐 아니라, 작용기를 이용한 결합 등 다양한 형태의 결합에 의하여 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 이용될 수 있는 리피드는 이중의 지질막으로 이루어 진 리포좀(liposome)을 포함할 수 있으며, 이외의 다양한 구성성분의 리피드를 이용할 수 있다.
상기 실시예에 있어서, 리피드로 금나노입자 및 금나노입자 표면에 결합된 생리활성물질을 둘러싸서 캡슐화하는 단계는 리피드와 금나노입자 및 금나노입자 표면에 결합된 생리활성물질을 혼합한 후, 20~30℃에서, 10~30분 동안 배양함으로써 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 캡슐화 단계는 금나노입자 및 상기 생리활성물질과 리피드의 혼합물에 초음파 자극을 가하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이와 같이 약한 초음파 자극을 가하면 복합체 합성에 유용할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 리피드-금나노입자 복합체의 제조방법은 수화(hydration) 및 추출(extrusion) 방법에 의한 리피드 합성 방법을 이용하여, 다양하게 이루어질 수 있다.
이와 같이 리피드를 운반체로 이용함으로써 금나노입자 표면에 결합된 DNA 등의 생리활성물질을 보호하여 세포 트랜스펙션(transfection)을 용이하게 할 수 있다. 또한, 리피드 헤드 그룹(head group)은 양이온성이고, DNA 등의 생리활성물질이 표면에 결합된 금나노입자는 음이온성이므로, 이와 같이 금나노입자 및 금나노입자 표면에 결합된 DNA 등의 생리활성물질을 둘러싸서 리피드로 캡슐화함으로써 DNA 등의 생리활성물질의 높은 음전하 노출을 최소화하거나 제거할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 리피드-금나노입자 복합체의 제조방법은 리피드 표면에 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 결합시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 리피드-금나노입자 복합체의 제조방법은 리피드 표면에 펩티드, 단백질, 항체 및 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 표적화 물질을 결합시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
한편, 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 생리활성물질의 전달 방법은 전술한 바와 같은 금나노입자 및 상기 금나노입자 표면에 정전기적 상호작용에 의하여 결합된 생리활성물질을 포함하는 금나노입자 복합체에 초음파 자극을 가하는 단계; 상기 금나노입자 복합체를 세포와 혼합하여 배양하는 단계; 및 상기 금나노입자 복합체를 세포 내에 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에서, 금나노입자 복합체에 대하여 초음파 자극을 가함으로써, 복합체의 재배치가 일어나 세포에의 트랜스펙션(transfection)을 용이하게 하여 생리활성물질을 효율적으로 전달할 수 있다.
초음파 자극을 가하는 단계는 예를 들어, 팁 기반의 초음파 기기(tip-based ultrasonicator)를 이용하여, 40~280 W의 세기로 1~5초 동안 이루어질 수 있다.
한편, 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 생리활성물질의 전달 방법은 전술한 바와 같은 금나노입자, 상기 금나노입자 표면에 결합된 생리활성물질, 및 상기 금나노입자 및 상기 생리활성물질을 둘러싸서 캡슐화하는 리피드를 포함하는 리피드-금나노입자 복합체를 세포와 혼합하여 배양하는 단계; 및 상기 리피드-금나노입자 복합체를 세포 내에 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
도 1에 도시된 바와 같이, 리피드로 캡슐화된 복합체, 즉 리피드-금나노입자 복합체는 세포 내로 트랜스펙션되어 생리활성물질을 전달할 수 있으며, 예를 들어 유전자 발현에 의하여 세포 표현형 변화를 일으키게 되는 유전자 전달에 이용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 생리활성물질의 전달 방법에 따르면, 생리활성물질의 전달에 있어서 전달 운반체로서 금나노입자와 리피드를 함께 이용함으로써, 트랜스펙션 효율은 현저하게 향상되고 세포독성도 최소화할 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 플라스미드 DNA - 금나노입자 ( pDNA - AuNPs ) 복합체 제조(1)
플라스미드 DNA(pEGFP-N1)를 pH 9의 10 mM의 인산염 완충액에서 20 ng/㎕로 희석하였다. 3.8 nM의 금나노입자(15㎚; Ted Pella, Inc. Redding, CA, USA)) 용액 15 ㎕을 14,000 rpm으로 20분 동안 원심분리하였다. 원심분리된 금나노입자 용액에 pH 9의 10 mM 인산염 완충액 중의 200 ng의 pDNA 희석액을 가하고, 격렬하게 혼합한 후, 혼합 용액을 하룻밤 동안 37℃에서 오비탈 교반기로 교반하면서 배양하였다.
형성된 pDNA-AuNPs 컨쥬게이트(conjugate)의 안정성을 확인하기 위하여, 200 mM NaCl로 염 농도를 50 mM로 증가시켜 시험하였다. 이 과정에서 붉은 빛이 도는 와인색에서 보라색으로의 색 변화는 금나노입자에 대한 pDNA의 불안정하거나 불완전한 결합에 기인하는 금나노입자의 응집을 의미하였다.
실시예 2: 플라스미드 DNA - 금나노입자 ( pDNA - AuNPs ) 복합체 제조(2)
0.35 nM의 금나노입자(30 ㎚; Ted Pella, Inc. Redding, CA, USA)) 용액 20 ㎕을 13,500 rpm으로 20분 동안 원심분리하여 이용한 점을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법에 따라 플라스미드 DNA-금나노입자 복합체를 제조하였다.
실시예 3: 플라스미드 DNA - 금나노입자 ( pDNA - AuNPs ) 복합체 제조(3)
94.0 pM의 금나노입자(50 ㎚; Ted Pella, Inc. Redding, CA, USA)) 용액 25 ㎕을 13,000 rpm으로 20분 동안 원심분리하여 이용한 점을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법에 따라 플라스미드 DNA-금나노입자 복합체를 제조하였다.
실시예 4: 플라스미드 DNA - 금나노입자 ( pDNA - AuNPs ) 복합체 제조(4)
2.19 pM의 금나노입자(80 ㎚; Ted Pella, Inc. Redding, CA, USA)) 용액 40 ㎕을 12,000 rpm으로 20분 동안 원심분리하여 이용한 점을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법에 의하여 플라스미드 DNA-금나노입자 복합체를 제조하였다.
실시예 5 내지 8: 리피드 -플라스미드 DNA -금나노입자(L- pDNA -AuNPs) 복합체 제조
상기 실시예 1 내지 4에서 제조된 플라스미드 DNA-금나노입자 복합체 용액에 150 ng 리포좀(L150)의 경우, 1.5 ㎕의 리포좀(100 ng/㎕; Lipofectamine™ 2000, Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, USA)을 가하고, 23.5 ㎕의 FBS-free DMEM 으로 희석하였다. 300 ng 리포좀의 경우 3.0 ㎕의 리포좀(100 ng/㎕; Lipofectamine™ 2000, Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, USA)을 가하고, 22 ㎕의 FBS-free DMEM 으로 희석하였다. 이와 같이 수득된 용액을 마이크로피펫으로 격렬하게 혼합한 후, 25℃에서 20분 동안 배양하여 리피드-플라스미드 DNA-금나노입자 복합체를 제조하였다. 이 때, 약한 초음파 자극(Water Bath Based: ~135 W)을 가하는 것도 리피드-플라스미드 DNA-금나노입자 복합체 형성에 도움을 준다.
실시예 9 내지 12: 플라스미드 DNA - 금나노입자 ( pDNA - AuNPs ) 복합체에 대한 초음파 자극
상기 실시예 1 내지 4에 따라 제조된 플라스미드 DNA-금나노입자 복합체에 팁 베이스드 초음파기기(tip-based ultrasonicator)를 이용하여 초음파 자극을 가하였다. 초음파 자극의 세기는 40 W ~ 280 W 로, 1초~5초 동안 다양하게 할 수 있다.
시험예 1: 금나노입자당 적재된 플라스미드 DNA 의 수 결정
실시예 1 내지 4에서 형성된 플라스미드 DNA-금나노입자 복합체에 대하여 자 외선-가시광선 분광광도계(UV-Vis spectrophotometer; Agilent Technology, Inc., Waldbronn, Germany)를 이용하여 금나노입자당 플라스미드 DNA의 수를 결정하였다. 각각의 크기의 금나노입자당 플라스미드 DNA의 수는 플라스미드 DNA의 수를 금나노입자의 수로 나눔으로써 얻어졌으며, 그 결과를 도 2에 나타낸다. 도 2에 도시된 바와 같이 금나노입자당 pDNA의 수는 산출된 금나노입자 당 표면적에 대략적으로 비례하였다. 이러한 결과로부터 금나노입자는 그 크기에 따라 입자당 10~100개의 pDNA 스트랜드를 운반하는 것을 확인하였다.
시험예 2: 리피드 -플라스미드 DNA - 금나노입자 (L- pDNA - AuNPs ) 복합체 구조의 영상화
실시예 5 내지 8에서 얻어진 리피드-플라스미드 DNA-금나노입자 복합체의 구조를 크라이오 투과전자현미경(cryo-transmission electron microscope(cryo-TEM); 200㎸, Tecnai G2, FEI, Netherlands)을 이용하여 확인하였다. 영상화 이전에, 상기 복합체는 그리드에 고정되자마자 액체 질소로 동결수화된 상태(frozen-hydrated state)이었다. 얻어진 복합체의 cryo-TEM 영상을 도 3에 나타낸다. 도 3에 도시된 바와 같이, 두 가지의 주요 구조가 관찰되었는데, Ⅱ형 복합체가 Ⅰ형 복합체에 비하여 더 많이 발견되었다. 전술한 바와 같이 리피드 헤드 그룹은 양이온성이고 플라스미드 DNA로 개질된 AuNPs는 음이온성이므로, 캡슐화 리피드가 pDNA-AuNPs 주위에 지질층을 형성하여 변성 플라스미드 DNA와 리피드 사이에 정전기적 상호작용 을 최대화할 수 있다. Ⅰ형 복합체는 Ⅱ형 복합체의 전구체인 것으로 생각되었다.
시험예 3: 제타전위 ( zeta potential ) 측정
실시예 5 내지 8에서 형성된 리피드-플라스미드 DNA-금나노입자(L-pDNA-AuNPs) 복합체의 제타전위를 금나노입자(AuNPs) 및 플라스미드 DNA-금나노입자(pDNA-AuNPs) 복합체와 비교하여 측정하였다. 각각의 입자 주위에 형성된 전기적 이중층에 의하여 야기된 물질의 제타전위를 측정함으로써 그 표면 전하를 간접적으로 확인할 수 있다. 제타전위 분석기(zeta potential analyzer; Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)로 측정한 결과를 도 4에 나타낸다. 도 4는 양이온성 리피드에 의하여 제공된 양전하에 기인하여 복합체의 음전하가 감소된 것을 나타내며, 이로부터 리피드-플라스미드 DNA-금나노입자(L-pDNA-AuNPs) 복합체 형성을 확인할 수 있다.
시험예 4: 트렌스펙션 어세이( transfection assay )
상기 실시예 1 내지 4에 따라 제조된 플라스미드 DNA-금나노입자(pDNA-AuNPs) 복합체, 실시예 5 내지 8에 따라 제조된 리피드-플라스미드 DNA-금나노입자(L-pDNA-AuNPs) 복합체, 실시예 9 내지 12에 따라 제조된 초음파 자극을 가한 플라스미드 DNA-금나노입자 복합체에 대하여, 플라스미드 DNA(pDNA) 및 리피드-플라스미드 DNA(L-pDNA) 와 비교하여 트렌스펙션 어세이를 수행하였다. 상기 어세이에 있어서는, 트렌스펙션된 경우 세포 표면 상에 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein(EGFP)) 발현을 유발하는 pDNA(pEGFP-N1)를 이용하였다.
트렌스펙션은 P.L. Felgner, T.R. Gadek, M. Holm et al. Proc Natl Acad Sci USA 84(21), 7413(1987)에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 인간 폐암 세포주(A549)를 10%(vol/vol) 우태아혈청이 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)(GIBCO, Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA, USA)를 구비한 96-웰 플레이트에서 웰당 1.6×104 세포의 초기 밀도로 배양하였다. 트렌스펙션을 한 날에 약 80% 융합(confluent)일 수 있다. 24시간 파종(seeding) 후, 세포를 무혈청 DMEM로 세척한 후 각각의 웰에 100 ㎕의 무혈청 DMEM을 가하였다. 이와 같은 세포를 전술한 pDNA 또는 pDNA-개질 복합체로 트랜스펙션하였다. 5% CO2하, 37℃에서 5시간 배양한 후, 배지를 10% FBS 함유 DMEM으로 변경하였다. 모든 실험은 3회 반복하였다.
37℃에서 48시간 배양한 후, EGFP 발현에 기인한 형광 시그널을 형광현미경(Axiovert 200, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 측정 및 분석하였다. 각각의 경우의 EGFP 형질도입(transduction) 영상을 도 5(a)에 나타내며, 트렌스펙션의 효율을 도 5(b) 및 표 1에 나타낸다. 초음파 자극에 의한 유전자 전달 방법에 대한 결과는 대표적인 예로 120 W의 세기로 2초 동안 자극을 가한 경우에 의한 것으로 나타낸다.
트렌스펙션 방법 트렌스펙션 효율(%)
pDNA 무시할 수 있을 정도의 발현
L300-pDNA 42%
L150-pDNA 23%
L300-pDNA-AuNP(15㎚) 62%
L150-pDNA-AuNP(15㎚) 52%
pDNA-AuNP(15㎚) 5%
L300-pDNA-AuNP(30㎚) 80%
L150-pDNA-AuNP(30㎚) 76%
pDNA-AnNP(30㎚) 7%
L300-pDNA-AuNP(50㎚) 81%
L150-pDNA-AuNP(50㎚) 78%
pDNA-AnNP(50㎚) 7%
L300-pDNA-AuNP(80㎚) 85%
L150-pDNA-AuNP(80㎚) 79%
pDNA-AnNP(80㎚) 12%
pDNA-Ultrasound 5 %
Ultrasound-AuNP (15 nm) 60 %
Ultrasound-AuNP (30 nm) 75 %
Ultrasound-AuNP (50 nm) 80 %
Ultrasound-AuNP (80 nm) 80 %
도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 플라스미드 DNA가 리피드 및 금나노입자 없이 전달된 경우, 녹색 형광은 무시할 수 있을 정도로 검출되었다. 리피드로 캡슐화되지 않은 플라스미드 DNA-금나노입자(pDNA-AuNP)의 경우에는 트렌스펙션은 플라스미드 DNA에 비하여 약간 향상되었으나, 그 효율은 여전히 낮았다. 이러한 플라스미드 DNA-금나노입자 복합체만으로는 세포 내로의 도입이 성공적이지 않았는데, 이는 음전하를 나타내는 세포막과 역시 매우 높은 음전하를 나타내는 상기 복합체 간의 반발 작용에 기인하는 것으로 생각된다. 운반체로서 리피드를 이용한 경우에는 트렌스펙션 결과는 현저하게 향상되었으며, 트렌스펙션 효율은 이용된 리피드의 양에 비례하는 것으로 나타났다.
특히, 리피드-플라스미드 DNA-금나노입자(L-pDNA-AuNPs) 복합체를 이용한 경우에는 적은 양의 리피드가 이용되었음에도 불구하고 리피드계 전달 시스템 보다 매우 높은 트렌스펙션 효율을 나타내었다.
한편, 플라스미드 DNA-금나노입자(pDNA-AuNPs) 복합체에 초음파 자극을 가한 경우, 리피드를 운반체로 이용한 경우와 유사하게 향상된 트렌스펙션 결과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
금나노입자의 크기가 클수록 DNA의 적재 용량이 높아지므로 효율이 높았으나, 이러한 경향은 입자 직경이 30㎚를 초과하게 되면 미미한 정도였다.
또한, 본 발명에 따른 복합체 시스템의 트렌스펙션 효율은 종래의 리피드계 전달 시스템과 달리 첨가된 리피드의 양에 크게 영향을 받지 않음을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 플라스미드 DNA 트렌스펙션이 주로 리피드-플라스미드 DNA-금나노입자(L-pDNA-AuNPs) 복합체에 의하여 이루어지며, 대부분의 플라스미드 DNA 스트랜드는 금나노입자 상에 개질되어 있고, 잔여 유리 리피드는 플라스미드 DNA 트렌스펙션에 크게 기여하지 않음을 시사한다.
시험예 5: 세포독성 평가(세포 생존율 시험)
셀 카운팅 키트(Cell Counting Kit)(CCK-8, Dojindo lab., Japan)를 이용하여 각각의 트렌스펙션 방법의 세포독성을 평가하였다. A549 세포를 100 ㎕ FBS 함유 DMEM을 구비한 96-웰 플레이트에서 웰당 1.6×104 세포의 밀도로 성장시켰다. 24시간 파종한 후, 세포를 플라스미드 DNA(pDNA), 리피드-플라스미드 DNA(L-pDNA), 플라스미드 DNA-금나노입자(pDNA-AuNPs) 복합체 및 리피드-플라스미드 DNA-금나노입자(L-pDNA-AuNPs)로 48시간 동안 배양하였다. 이후, 세포 생존율 어세이를 수행하였다. CCK-8(트렌스펙션 이후 생존 세포의 수를 결정하는 민감한 비색 분석)을 이용하여 세포의 대사활성을 측정하였다(Munetaka Ishiyama, Yoko Miyazono, Kazumi Sasamoto, Yosuke Ohkura and Keiyu Ueno, Talanta 44, 1299(1997)). 10 ㎕의 CCK-8 용액을 각각의 웰의 트렌스펙션된 세포에 가하였다. 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 활성 세포의 탈수소효소(dehydrogenase)에 의하여 생성되는 포르마잔 염료(formazan dye)의 양을 마이크로플레이트 리더(Anthos 2010, Anthos Labtec, Eugendorf, Austria)에 의하여 측정하였다. 이 시험에서 생존 세포의 탈수소효소는 오렌지색으로 용액의 색변화를 일으킨다.
세포 생존율 결과를 도 5(c)에 나타낸다. 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대조군인 트렌스펙션되지 않은 세포의 경우를 100 % 의 생존률로 기준을 삼아, 리피드계 트렌스펙션 시스템(L300)은 높은 세포독성 (~45 %) 을 나타내었다. 세포가 리피드(L150)의 존재에도 금나노입자 운반체로 트렌스펙션된 경우, 세포 생존율은 약 80~90 % 정도로 나타났다. 세포 생존율은 금나노입자의 크기에 의하여 거의 영향을 받지 않았으며, 플라스미드 DNA로 개질된 금나노입자에 첨가된 리피드의 양에 의하여도 크게 영향받지 않는 것으로 나타났다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 금나노입자 복합체, 리피드-금나노입자 복합체 및 유전자 전달의 개념을 나타내는 모식도.
도 2는 본 발명의 시험예 1에 따른 금나노입자당 적재된 플라스미드 DNA의 수 결정 결과를 나타내는 그래프.
도 3은 본 발명의 시험예 2에 따른 리피드-플라스미드 DNA-금나노입자(L-pDNA-AuNPs) 복합체 구조의 주사전자현미경 사진(스케일 바 = 50㎚).
도 4는 본 발명의 시험예 3에 따른 제타전위 측정 결과를 나타내는 그래프.
도 5는 시험예 4에 따른 트랜스펙션 어세이 결과를 나타내는 주사전자현미경 사진(a)과 트렌스펙션 효율을 나타내는 그래프(b), 및 시험예 5에 따른 세포 생존율 시험 결과를 나타내는 그래프(c).

Claims (20)

  1. 금나노입자 및 상기 금나노입자 표면에 정전기적 상호작용에 의하여 결합된 생리활성물질을 포함하는 금나노입자 복합체로서,
    상기 생리활성물질은 DNA, RNA, 플라스미드 DNA, 폴리뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    상기 정전기적 상호작용에 의한 결합은 금나노입자 표면의 시트르산이 생리활성물질의 포스페이트에 의해 치환됨으로써 형성되는 것을 특징으로 하는
    금나노입자 복합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 금나노입자 표면에 결합된 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 더 포함하는
    금나노입자 복합체.
  3. 제1항에 따른 금나노입자 복합체; 및
    상기 금나노입자 복합체를 둘러싸서 캡슐화하는 리피드를 포함하는
    리피드-금나노입자 복합체.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 리피드 표면에 결합된 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 더 포함하는
    리피드-금나노입자 복합체.
  5. 금나노입자 및 생리활성물질을 혼합하는 단계; 및
    상기 금나노입자 표면에 상기 생리활성물질을 정전기적 상호작용에 의하여 결합시키는 단계를 포함하며,
    상기 생리활성물질은 DNA, RNA, 플라스미드 DNA, 폴리뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    상기 정전기적 상호작용에 의한 결합은 금나노입자 표면의 시트르산이 생리활성물질의 포스페이트에 의해 치환됨으로써 형성되는 것을 특징으로 하는
    금나노입자 복합체의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 금나노입자 표면에 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 결합시키는 단계를 더 포함하는
    금나노입자 복합체의 제조방법.
  7. 제5항에 따라 금나노입자 복합체를 제조하는 단계; 및
    상기 금나노입자 복합체를 리피드로 둘러싸서 캡슐화하는 단계를 포함하는
    리피드-금나노입자 복합체의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 리피드 표면에 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 결합시키는 단계를 더 포함하는
    리피드-금나노입자 복합체의 제조방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 캡슐화 단계는 상기 금나노입자 복합체와 리피드를 혼합하는 단계 및 상기 혼합물에 초음파 자극을 가하는 단계를 포함하는
    리피드-금나노입자 복합체의 제조방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 따른 금나노입자 복합체에 초음파 자극을 가하는 단계;
    상기 금나노입자 복합체를 세포와 혼합하여 배양하는 단계; 및
    상기 금나노입자 복합체를 세포 내에 도입하는 단계를 포함하는
    생리활성물질의 전달 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 초음파 자극은 40 W 내지 280 W의 세기로 1~5초 동안 가해지는 것을 특징으로 하는
    생리활성물질의 전달 방법.
  12. 제3항에 따른 리피드-금나노입자 복합체를 세포와 혼합하여 배양하는 단계; 및
    상기 리피드-금나노입자 복합체를 세포 내에 도입하는 단계를 포함하는
    생리활성물질의 전달 방법.
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