CN116211831A - 脂质基质局部注射制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种脂质基质局部注射制剂，其包括长效局部递送脂质、结构性脂质、聚合物共轭脂质和可电离脂质，以及任选地中性磷脂。所述脂质基质局部注射制剂能够实现药物在注射位置的富集递送和蛋白的长时间高效表达。本发明还涉及所述脂质基质局部注射制剂的制备方法，以及所述脂质基质局部注射制剂在递送生物活性物质如核酸(例如mRNA、miRNA、siRNA、saRNA、ASO、DNA等)中的应用。

Description

脂质基质局部注射制剂
技术领域
本发明涉及药物制剂领域，特别是涉及脂质基质局部注射制剂。本发明还涉及所述脂质基质局部注射制剂的制备方法，以及所述基质局部注射制剂在递送生物活性物质如核酸(例如mRNA、miRNA、siRNA、saRNA、ASO、DNA等)中的应用。
背景技术
信使核糖核酸(mRNA)能够在体内编码具有特定生物功能的蛋白质，由此可以合理设计基于mRNA的疗法。近年来，随着COVID-19mRNA疫苗的成功，mRNA药物发展迅速，得到了科研及工业界的广泛关注。mRNA药物进入临床最大的障碍在于药物递送，选择合适的药物递送系统是药物研发成功的关键。
目前，mRNA药物递送系统多选用脂质纳米粒(lipid nanoparticles，LNP)。包括已上市疫苗产品的递送系统，LNP通常由4类脂质成分组成：可离子化的阳离子脂质、磷脂、胆固醇，以及PEG脂质。研究显示，为高效递送mRNA药物，通过2-(对-甲苯氨基)-6-萘磺酸(TNS)染料结合试验测量的LNP的酸解离常数(pKa)应在6-7的范围内。该pKa特征能够确保其在生理酸碱度下保持中性，提高了在循环系统中的稳定性，但可以在内涵体的酸性环境中被质子化，从而促进mRNA的内涵体逃逸。
已上市的两种COVID-19mRNA疫苗均采用局部(肌肉)注射给药，显示了LNP采用此种给药方式的潜力。目前已知的已有近千种可导致肌肉功能障碍的的单基因疾病，对于此类疾病，肌肉注射是可考虑的优选给药方式。然而，研究发现，肌肉注射后LNP存在脱靶毒性，其分布并未限于注射的肌肉组织，而是在全身均有分布，很大一部分富集于肝脏。而且，相关蛋白质在肝脏中的表达较肌肉中更快速。
通过瘤内注射编码细胞因子的mRNA，改善整个肿瘤微环境，激活相关APC及T细胞，达到清除肿瘤细胞并产生免疫记忆的目的。相比系统性给药方式，瘤内注射可以使药物直接进入肿瘤，显著提高局部药物浓度并减少系统性毒性。但mRNA表达的细胞因子分泌后也会通过瘤内血管进入血液循环，使其同样面临系统性暴露导致的脱靶毒性，
另外，尽管mRNA被脂质包载后稳定性得到提升，本领域仍期待通过对LNP的优化更进一步提高药物的作用时间，以提升患者的顺应性，并使一些半衰期短或副作用大而难以实际应用的药物获得理想的临床效果。mRNA系统性的分布及其不可控的表达可能导致众多严重的副作用，因此将mRNA的LNP制剂靶向于特定的组织器官和细胞是近期研究的热点。
发明内容
本发明旨在解决上述问题，提供一种脂质基质局部注射制剂，能够实现药物在注射位置局部的富集递送和蛋白的长时间高效表达。
为了开发靶向肌肉的LNP制剂，发明人对处方进行了多种尝试和调整，发现将长效局部递送脂质(Long-Acting SusTained delivering lipid,LASTing lipid)，如带有永久正电形式的阳离子脂质(DOTAP、EPC等)与可电离脂质相配合后，与mRNA序列通过静电作用相结合形成的脂质纳米颗粒可以降低局部注射mRNA-LNP药物的脱靶效应，显著提高药物在注射位组织中的药峰浓度和生物利用度，还可以延长药物在注射位组织中的达峰时间和半衰期。
为了达到上述目的，本发明提供了一种用于局部注射的脂质纳米颗粒，其包括长效局部递送脂质和可电离脂质，所述脂质纳米颗粒能够在注射部位发挥作用。
在优选的实施方案中，所述局部注射的部位为肌肉或肿瘤组织，优选为肌肉。
在优选的实施方案中，与不含长效局部递送脂质的脂质纳米颗粒相比，所述脂质纳米颗粒具有更长的作用时间。
在优选的实施方案中，所述脂质纳米颗粒能够降低在非注射部位的组织或器官的脱靶作用。
在优选的实施方案中，所述非注射部位的组织或器官为肝。
在优选的实施方案中，所述脂质纳米颗粒包括以下组分：长效局部递送脂质、结构性脂质、聚合物共轭脂质和可电离脂质，以及任选地中性磷脂。
在优选的实施方案中所述脂质纳米颗粒，其包括以下组分：永久性阳离子脂质、结构性脂质、聚合物共轭脂质和可电离脂质，并且不含中性磷脂。
在另一个方面，本发明提供了一种脂质纳米颗粒组合物，其包括上述任一的脂质纳米颗粒和荷载。
在另一个方面，本发明提供了上述脂质纳米颗粒组合物的制备方法，包括：将所述各种脂质组分混合，再与荷载混合。
在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包括上述任一的脂质纳米颗粒组合物，以及药物上可接受的辅料。
在另一个方面，本发明提供了上述任一的脂质纳米颗粒组合物，或上述药物组合物在制备用于治疗、诊断或预防疾病的药物中的用途。
在另一个方面，本发明提供了上述任一的脂质纳米颗粒组合物，或上述药物组合物在制备递送荷载的药物中的用途，所述荷载选自治疗剂、预防剂或诊断剂中的一种或多种。
在另一个方面，本发明提供了一种在受试者中治疗、诊断或预防疾病的方法，包括向所述受试者给药上述任一的脂质纳米颗粒组合物，或上述药物组合物。
在另一个方面，本发明提供了上述任一的脂质纳米颗粒组合物，或上述的药物组合物，其用于治疗、诊断或预防疾病。
在另一个方面，本发明提供了一种向受试者体内中递送荷载的方法，包括向所述受试者施用上述任一的脂质纳米颗粒组合物，或上述的药物组合物。
在另一个方面，本发明提供了上述任一的脂质纳米颗粒组合物，或上述的药物组合物，其用于递送荷载。
在具体实施方案中，所述荷载选自治疗剂、预防剂或诊断剂中的一种或多种；优选地，所述治疗剂、预防剂或诊断剂为核酸。
在更具体实施方案中，所述核酸选自ASO、RNA或DNA中的一种或多种。
在更具体实施方案中，所述RNA选自干扰RNA(RNAi)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、反义RNA(aRNA)、信使RNA(mRNA)、修饰的信使RNA(mmRNA)、长非编码RNA(lncRNA)、微RNA(miRNA)、小激活RNA(saRNA)、多聚编码核酸(MCNA)、聚合编码核酸(PCNA)、引导RNA(gRNA)、CRISPRRNA(crRNA)或核酶中的一种或多种，优选为mRNA，更优选为修饰的mRNA。
定义
化学定义
下面更详细地描述具体官能团和化学术语的定义。
当列出数值范围时，既定包括每个值和在所述范围内的子范围。例如“C1-6烷基”包括C1、C2、C3、C4、C5、C6、C1-6、C1-5、C1-4、C1-3、C1-2、C2-6、C2-5、C2-4、C2-3、C3-6、C3-5、C3-4、C4-6、C4-5和C5-6烷基。
“C1-30烷基”是指具有1至30个碳原子的直链或支链饱和烃基团。“C6-30烷基”是指具有6至30个碳原子的直链或支链饱和烃基团。在一些实施方案中，C6-28烷基、C6-25烷基、C6-24烷基、C6-22烷基、C6-20烷基、C8-28烷基、C8-25烷基、C8-24烷基、C8-22烷基、C8-20烷基、C10-28烷基、C10-25烷基、C10-24烷基、C10-22烷基、C10-20烷基、C13-25烷基、C13-20烷基、C13-18烷基、C13-17烷基、C15-18烷基、C15-25烷基、C15-20烷基、C4-28烷基、C4-24烷基、C4-20烷基、C8-10烷基、C2-8烷基、C7-9烷基、C4-6烷基、C1-25烷基、C1-20烷基、C1-17烷基、C17-18烷基、C17烷基、C1-14烷基、C2-14烷基、C1-13烷基、C1-12烷基、C1-10烷基、C1-8烷基、C1-7烷基、C2-7烷基、C1-6烷基、C1-5烷基、C5烷基、C1-4烷基、C2-4烷基、C1-3烷基、C2-3烷基、C1-2烷基和Me是优选的。C1-6烷基的例子包括：甲基(C1)、乙基(C2)、正丙基(C3)、异丙基(C3)、正丁基(C4)、叔丁基(C4)、仲丁基(C4)、异丁基(C4)、正戊基(C5)、3-戊基(C5)、戊基(C5)、新戊基(C5)、3-甲基-2-丁基(C5)、叔戊基(C5)和正己基(C6)。术语“C1-30烷基”还包括杂烷基，其中一或多个(例如，1、2、3或4个)碳原子被杂原子(例如，氧、硫、氮、硼、硅、磷)替代。烷基基团可以被一或多个取代基任选取代，例如，被1至5个取代基、1至3个取代基或1个取代基取代。常规烷基缩写包括：Me(-CH3)、Et(-CH2CH3)、iPr(-CH(CH3)2)、nPr(-CH2CH2CH3)、n-Bu(-CH2CH2CH2CH3)或i-Bu(-CH2CH(CH3)2)。
“C6-30烯基”是指具有6至30个碳原子和至少一个碳碳双键的直链或支链烃基团。“C2-6烯基”是指具有2至6个碳原子和至少一个碳碳双键的直链或支链烃基团。在一些实施方案中，C10-25烯基、C13-20烯基、C13-18烯基、C13-17烯基、C15-18烯基、C17-18烯基和C2-4烯基是优选的。C2-6烯基的例子包括：乙烯基(C2)、1-丙烯基(C3)、2-丙烯基(C3)、1-丁烯基(C4)、2-丁烯基(C4)、丁二烯基(C4)、戊烯基(C5)、戊二烯基(C5)、己烯基(C6)，等等。术语“C6-30烯基”等还包括杂烯基，其中一或多个(例如，1、2、3或4个)碳原子被杂原子(例如，氧、硫、氮、硼、硅、磷)替代。烯基基团可以被一或多个取代基任选取代，例如，被1至5个取代基、1至3个取代基或1个取代基取代。
“C6-30炔基”是指具有6至30个碳原子、至少一个碳-碳叁键以及任选地一个或多个碳-碳双键的直链或支链烃基团。“C2-6炔基”是指具有2至6个碳原子、至少一个碳-碳叁键以及任选地一个或多个碳-碳双键的直链或支链烃基团。在一些实施方案中，C10-25炔基、C13-20炔基、C13-18炔基、C13-17炔基、C15-18炔基、C17-18炔基和C2-4炔基是优选的。C2-6炔基的例子包括但不限于：乙炔基(C2)、1-丙炔基(C3)、2-丙炔基(C3)、1-丁炔基(C4)、2-丁炔基(C4)，戊炔基(C5)、己炔基(C6)，等等。术语“C6-30炔基”等还包括杂炔基，其中一或多个(例如，1、2、3或4个)碳原子被杂原子(例如，氧、硫、氮、硼、硅、磷)替代。炔基基团可以被一或多个取代基任选取代，例如，被1至5个取代基、1至3个取代基或1个取代基取代。
“C1-24亚烷基”是指除去C1-24烷基的另一个氢而形成的二价基团，并且可以是取代或未取代的。在一些实施方案中，C4-20亚烷基、C8-10亚烷基、C2-8亚烷基、C7-9亚烷基、C4-6亚烷基、C1-20亚烷基、C1-14亚烷基、C2-14亚烷基、C4-14亚烷基、C1-13亚烷基、C1-12亚烷基、C1-10亚烷基、C1-8亚烷基、C1-7亚烷基、C2-7亚烷基、C1-6亚烷基、C1-5亚烷基、C5亚烷基、C1-4亚烷基、C2-4亚烷基、C1-3亚烷基、C2-3亚烷基、C1-2亚烷基和亚甲基是优选的。未取代的所述亚烷基包括但不限于：亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)、亚丙基(-CH2CH2CH2-)、亚丁基(-CH2CH2CH2CH2-)、亚戊基(-CH2CH2CH2CH2CH2-)、亚己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-)，等等。示例性的取代的所述亚烷基，例如，被一个或多个烷基(甲基)取代的所述亚烷基，包括但不限于：取代的亚甲基(-CH(CH3)-、-C(CH3)2-)、取代的亚乙基(-CH(CH3)CH2-、-CH2CH(CH3)-、-C(CH3)2CH2-、-CH2C(CH3)2-)、取代的亚丙基(-CH(CH3)CH2CH2-、-CH2CH(CH3)CH2-、-CH2CH2CH(CH3)-、-C(CH3)2CH2CH2-、-CH2C(CH3)2CH2-、-CH2CH2C(CH3)2-)，等等。
“C2-24亚烯基”是指除去C2-24烯基的另一个氢而形成的二价基团，并且可以是取代或未取代的。在一些实施方案中，C2-20亚烯基、C2-18亚烯基、C2-15亚烯基、C2-13亚烯基、C2-10亚烯基、C4-14亚烯基、C2-6亚烯基和C2-4亚烯基是特别优选的。示例性的未取代的所述亚烯基包括但不限于：亚乙烯基(-CH＝CH-)和亚丙烯基(例如，-CH＝CHCH2-、-CH2-CH＝CH-)。示例性的取代的所述亚烯基，例如，被一个或多个烷基(甲基)取代的亚烯基，包括但不限于：取代的亚乙烯基(-C(CH3)＝CH-、-CH＝C(CH3)-)、取代的亚丙烯基(-C(CH3)＝CHCH2-、-CH＝C(CH3)CH2-、-CH＝CHCH(CH3)-、-CH＝CHC(CH3)2-、-CH(CH3)-CH＝CH-、-C(CH3)2-CH＝CH-、-CH2-C(CH3)＝CH-、-CH2-CH＝C(CH3)-)，等等。
“C4-14亚炔基”是指除去C4-14炔基的另一个氢而形成的二价基团，并且可以是取代或未取代的。“C2-13亚炔基”是指除去C2-13炔基的另一个氢而形成的二价基团，并且可以是取代或未取代的。在一些实施方案中，C2-10亚炔基、C2-6亚炔基和C2-4亚炔基是特别优选的。示例性的所述亚炔基包括但不限于：亚乙炔基(-C≡C-)、取代或未取代的亚丙炔基(-C≡CCH2-)，等等。
“C3-8环烯基”是指具有3至8个环碳原子和零个杂原子的非芳香环烃基团，其中含有1、2或3个双键。
“C3-8亚环烯基”是指除去C3-8环烯基的另一个氢而形成的二价基团，并且可以是取代或未取代的。
术语“变量A的总长度为x个碳原子”，表示变量A所表示的基团中主链的碳原子数为x。
术语“变量A和变量B的总长度为x个碳原子”，表示变量A所表示的基团中主链的碳原子数和变量B所表示的基团中主链的碳原子数之和为x。
“卤代”或“卤素”是指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)和碘(I)。
因此，“C1-30卤代烷基”是指上述“C1-30烷基”，其被一个或多个卤素基团取代。在一些实施方案中，C1-25卤代烷基、C1-20卤代烷基、C1-17卤代烷基、C1-10卤代烷基、C1-6卤代烷基、C1-3卤代烷基、C1-4卤代烷基是特别优选的，更优选C1-2卤代烷基。示例性的所述卤代烷基包括但不限于：-CF3、-CH2F、-CHF2、-CHFCH2F、-CH2CHF2、-CF2CF3、-CCl3、-CH2Cl、-CHCl2、2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基，等等。卤代烷基基团可以在任何可用的连接点上被取代，例如，1至5个取代基、1至3个取代基或1个取代基。
“3至14元环烷基”是指具有3至14个环碳原子和零个杂原子的非芳香环烃基团，其中任选地含有1、2或3个双键或叁键。在一些实施方案中，3至10元环烷基、5至10元环烷基、3至8元环烷基、3至7元环烷基和3至6元环烷基是特别优选的，更优选5至7元环烷基、4至6元环烷基和5至6元环烷基，更优选5元环烷基，更优选6元环烷基。环烷基还包括其中上述环烷基环与一个或多个芳基或杂芳基稠合的环体系，其中连接点在环烷基环上，且在这样的情况中，碳的数目继续表示环烷基体系中的碳的数目。环烷基还包括其中上述环烷基环，其中任意不相邻的碳原子上的取代基相连形成桥环，一起形成共用两个或两个以上碳原子的多环烷烃。环烷基还包括其中上述环烷基环，其中同一碳原子上的取代基相连成环，一起形成共用一个碳原子的多环烷烃。示例性的所述环烷基包括但不限于：环丙基(C3)、环丙烯基(C3)、环丁基(C4)、环丁烯基(C4)、环戊基(C5)、环戊烯基(C5)、环己基(C6)、环己烯基(C6)、环已二烯基(C6)、环庚基(C7)、环庚烯基(C7)、环庚二烯基(C7)、环庚三烯基(C7)，等等。环烷基基团可以被一或多个取代基任选取代，例如，被1至5个取代基、1至3个取代基或1个取代基取代。
“3-8元亚环烷基”是指除去3-8元环烷基的另一个氢而形成的二价基团，并且可以是取代或未取代的。在一些实施方案中，C3-6亚环烷基和C3-4亚环烷基是特别优选的，尤其优选亚环丙基。
“3至14元杂环基”是指具有环碳原子和1至5个环杂原子的3至14元非芳香环系的饱和或不饱和基团，其中，每个杂原子独立地选自氮、氧、硫、硼、磷和硅，其中任选地含有1、2或3个双键或叁键。在包含一个或多个氮原子的杂环基中，只要化合价允许，连接点可为碳或氮原子。在一些实施方案中，优选3至10元杂环基，其为具有环碳原子和1至5个环杂原子的3至10元非芳香环系；在一些实施方案中，优选5至10元杂环基，其为具有环碳原子和1至5个环杂原子的5至10元非芳香环系；在一些实施方案中，优选3至8元杂环基，其为具有环碳原子和1至4个环杂原子的3至8元非芳香环系；在一些实施方案中，优选3至7元杂环基，其为具有环碳原子和1至4个环杂原子的3至7元非芳香环系；优选5至7元杂环基，其为具有环碳原子和1至3个环杂原子的5至7元非芳香环系；优选3至6元杂环基，其为具有环碳原子和1至3个环杂原子的3至6元非芳香环系；优选4至6元杂环基，其为具有环碳原子和1至3个环杂原子的4至6元非芳香环系；更优选5至6元杂环基，其为具有环碳原子和1至3个环杂原子的5至6元非芳香环系；优选5元杂环基，其为具有环碳原子和1至3个环杂原子的5元非芳香环系；优选6元杂环基，其为具有环碳原子和1至3个环杂原子的6元非芳香环系。杂环基还包括其中上述杂环基环与一个或多个环烷基稠合的环体系，其中连接点在杂环基环上，或其中上述杂环基环与一个或多个芳基或杂芳基稠合的环体系，其中连接点在杂环基环上；且在这样的情况下，环成员的数目继续表示在杂环基环体系中环成员的数目。杂环基还包括其中上述杂环基环，其中任意不相邻的碳或氮原子上的取代基相连形成桥环，一起形成共用两个或两个以上碳或氮原子的多环杂烷烃。杂环基还包括其中上述杂环基环，其中同一碳原子上的取代基相连成环，一起形成共用一个碳原子的多环杂烷烃。示例性的包含一个杂原子的3元杂环基包括但不限于：氮杂环丙烷基、氧杂环丙烷基、硫杂环丙烷基(thiorenyl)。示例性的含有一个杂原子的4元杂环基包括但不限于：氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基和硫杂环丁烷基。示例性的含有一个杂原子的5元杂环基包括但不限于：四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、二氢噻吩基、吡咯烷基、二氢吡咯基和吡咯基-2,5-二酮。示例性的包含两个杂原子的5元杂环基包括但不限于：吡唑烷基、二氧杂环戊烷基、氧硫杂环戊烷基(oxasulfuranyl)、二硫杂环戊烷基(disulfuranyl)和噁唑烷-2-酮。示例性的包含三个杂原子的5元杂环基包括但不限于：三唑啉基、噁二唑啉基和噻二唑啉基。示例性的包含一个杂原子的6元杂环基包括但不限于：哌啶基、四氢吡喃基、二氢吡啶基和硫杂环己烷基(thianyl)。示例性的包含两个杂原子的6元杂环基包括但不限于：哌嗪基、吗啉基、二硫杂环己烷基、二噁烷基。示例性的包含三个杂原子的6元杂环基包括但不限于：六氢三嗪基(triazinanyl)。示例性的含有一个杂原子的7元杂环基包括但不限于：氮杂环庚烷基、氧杂环庚烷基和硫杂环庚烷基。示例性的与C6芳基环稠合的5元杂环基(在本文中也称作5,6-双环杂环基)包括但不限于：二氢吲哚基、异二氢吲哚基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并噻吩基、苯并噁唑啉酮基，等等。示例性的与C6芳基环稠合的6元杂环基(本文还指的是6,6-双环杂环基)包括但不限于：四氢喹啉基、四氢异喹啉基，等等。杂环基还包括上述杂环基与一个环烷基、杂环基、芳基或杂芳基共享一个或两个原子，形成桥环或螺环，只要化合价允许，共享的原子可为碳或氮原子。杂环基还包括上述杂环基与杂环基基团可以被一或多个取代基任选取代，例如，被1至5个取代基、1至3个取代基或1个取代基取代。
“C6-10芳基”是指具有6-10个环碳原子和零个杂原子的单环或多环的(例如，双环)4n+2芳族环体系(例如，具有以环状排列共享的6或10个π电子)的基团。在一些实施方案中，芳基具有六个环碳原子(“C6芳基”；例如，苯基)。在一些实施方案中，芳基具有十个环碳原子(“C10芳基”；例如，萘基，例如，1-萘基和2-萘基)。芳基还包括其中上述芳基环与一个或多个环烷基或杂环基稠合的环系统，而且连接点在所述芳基环上，在这种情况下，碳原子的数目继续表示所述芳基环系统中的碳原子数目。芳基基团可以被一或多个取代基任选取代，例如，被1至5个取代基、1至3个取代基或1个取代基取代。
“5至14元杂芳基”是指具有环碳原子和1-4个环杂原子的5-14元单环或双环的4n+2芳族环体系(例如，具有以环状排列共享的6、10或14个π电子)的基团，其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫。在含有一个或多个氮原子的杂芳基中，只要化合价允许，连接点可以是碳或氮原子。杂芳基双环系统在一个或两个环中可以包括一个或多个杂原子。杂芳基还包括其中上述杂芳基环与一个或多个环烷基或杂环基稠合的环系统，而且连接点在所述杂芳基环上，在这种情况下，碳原子的数目继续表示所述杂芳基环系统中的碳原子数目。在一些实施方案中，5-10元杂芳基是优选的，其为具有环碳原子和1-4个环杂原子的5-10元单环或双环的4n+2芳族环体系。在另一些实施方案中，5-6元杂芳基是特别优选的，其为具有环碳原子和1-4个环杂原子的5-6元单环或双环的4n+2芳族环体系。示例性的含有一个杂原子的5元杂芳基包括但不限于：吡咯基、呋喃基和噻吩基。示例性的含有两个杂原子的5元杂芳基包括但不限于：咪唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基和异噻唑基。示例性的含有三个杂原子的5元杂芳基包括但不限于：三唑基、噁二唑基(例如，1,2,4-噁二唑基)和噻二唑基。示例性的含有四个杂原子的5元杂芳基包括但不限于：四唑基。示例性的含有一个杂原子的6元杂芳基包括但不限于：吡啶基或吡啶酮基。示例性的含有两个杂原子的6元杂芳基包括但不限于：哒嗪基、嘧啶基和吡嗪基。示例性的含有三个或四个杂原子的6元杂芳基分别包括但不限于：三嗪基和四嗪基。示例性的含有一个杂原子的7元杂芳基包括但不限于：氮杂环庚三烯基、氧杂环庚三烯基和硫杂环庚三烯基。示例性的5,6-双环杂芳基包括但不限于：吲哚基、异吲哚基、吲唑基、苯并三唑基、苯并噻吩基、异苯并噻吩基、苯并呋喃基、苯并异呋喃基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并噁二唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并噻二唑基、茚嗪基和嘌呤基。示例性的6,6-双环杂芳基包括但不限于：萘啶基、喋啶基、喹啉基、异喹啉基、噌琳基、喹喔啉基、酞嗪基和喹唑啉基。杂芳基基团可以被一或多个取代基任选取代，例如，被1至5个取代基、1至3个取代基或1个取代基取代。
“羟基烷基”是指被一个或多个羟基取代的烷基。
“烷氧基”是指直链或支链烷基的氧醚形式，即-O-烷基。类似地，“甲氧基”是指-O-CH3。
“任选地被······取代”是指可以被指定的取代基取代，也可以为非取代。
上文定义的烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基等基团除去另一个氢而形成的二价基团统称为“亚基”。环烷基、杂环基、芳基和杂芳基等成环的基团统称为“环基”。
本文定义的烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基等为任选取代的基团。
示例性的碳原子上的取代基包括但不局限于：卤素、-CN、-NO2、-N3、-SO2H、-SO3H、-OH、-ORaa、-ON(Rbb)2、-N(Rbb)2、-N(Rbb)3 +X-、-N(ORcc)Rbb、-SH、-SRaa、-SSRcc、-C(＝O)Raa、-CO2H、-CHO、-C(ORcc)2、-CO2Raa、-OC(＝O)Raa、-OCO2Raa、-C(＝O)N(Rbb)2、-OC(＝O)N(Rbb)2、-NRbbC(＝O)Raa、-NRbbCO2Raa、-NRbbC(＝O)N(Rbb)2、-C(＝NRbb)Raa、-C(＝NRbb)ORaa、-OC(＝NRbb)Raa、-OC(＝NRbb)ORaa、-C(＝NRbb)N(Rbb)2、-OC(＝NRbb)N(Rbb)2、-NRbbC(＝NRbb)N(Rbb)2、-C(＝O)NRbbSO2Raa、-NRbbSO2Raa、-SO2N(Rbb)2、-SO2Raa、-SO2ORaa、-OSO2Raa、-S(＝O)Raa、-OS(＝O)Raa、-Si(Raa)3、-OSi(Raa)3、-C(＝S)N(Rbb)2、-C(＝O)SRaa、-C(＝S)SRaa、-SC(＝S)SRaa、-SC(＝O)SRaa、-OC(＝O)SRaa、-SC(＝O)ORaa、-SC(＝O)Raa、-P(＝O)2Raa、-OP(＝O)2Raa、-P(＝O)(Raa)2、-OP(＝O)(Raa)2、-OP(＝O)(ORcc)2、-P(＝O)2N(Rbb)2、-OP(＝O)2N(Rbb)2、-P(＝O)(NRbb)2、-OP(＝O)(NRbb)2、-NRbbP(＝O)(ORcc)2、-NRbbP(＝O)(NRbb)2、-P(Rcc)2、-P(Rcc)3、-OP(Rcc)2、-OP(Rcc)3、-B(Raa)2、-B(ORcc)2、-BRaa(ORcc)、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，其中，每个烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基独立地被0、1、2、3、4或5个Rdd基团取代；
或者在碳原子上的两个偕氢被基团＝O、＝S、＝NN(Rbb)2、＝NNRbbC(＝O)Raa、＝NNRbbC(＝O)ORaa、＝NNRbbS(＝O)2Raa、＝NRbb或＝NORcc取代；
Raa的每个独立地选自烷基、卤代烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，或者两个Raa基团结合以形成杂环基或杂芳基环，其中，每个烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基独立地被0、1、2、3、4或5个Rdd基团取代；
Rbb的每个独立地选自：氢、-OH、-ORaa、-N(Rcc)2、-CN、-C(＝O)Raa、-C(＝O)N(Rcc)2、-CO2Raa、-SO2Raa、-C(＝NRcc)ORaa、-C(＝NRcc)N(Rcc)2、-SO2N(Rcc)2、-SO2Rcc、-SO2ORcc、-SORaa、-C(＝S)N(Rcc)2、-C(＝O)SRcc、-C(＝S)SRcc、-P(＝O)2Raa、-P(＝O)(Raa)2、-P(＝O)2N(Rcc)2、-P(＝O)(NRcc)2、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，或者两个Rbb基团结合以形成杂环基或杂芳基环，其中，每个烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基独立地被0、1、2、3、4或5个Rdd基团取代；
Rcc的每个独立地选自氢、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，或者两个Rcc基团结合以形成杂环基或杂芳基环，其中，每个烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基独立地被0、1、2、3、4或5个Rdd基团取代；
Rdd的每个独立地选自：卤素、-CN、-NO2、-N3、-SO2H、-SO3H、-OH、-ORee、-ON(Rff)2、-N(Rff)2,、-N(Rff)3 +X-、-N(ORee)Rff、-SH、-SRee、-SSRee、-C(＝O)Ree、-CO2H、-CO2Ree、-OC(＝O)Ree、-OCO2Ree、-C(＝O)N(Rff)2、-OC(＝O)N(Rff)2、-NRffC(＝O)Ree、-NRffCO2Ree、-NRffC(＝O)N(Rff)2、-C(＝NRff)ORee、-OC(＝NRff)Ree、-OC(＝NRff)ORee、-C(＝NRff)N(Rff)2、-OC(＝NRff)N(Rff)2、-NRffC(＝NRff)N(Rff)2、-NRffSO2Ree、-SO2N(Rff)2、-SO2Ree、-SO2ORee、-OSO2Ree、-S(＝O)Ree、-Si(Ree)3、-OSi(Ree)3、-C(＝S)N(Rff)2、-C(＝O)SRee、-C(＝S)SRee、-SC(＝S)SRee、-P(＝O)2Ree、-P(＝O)(Ree)2、-OP(＝O)(Ree)2、-OP(＝O)(ORee)2、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基，其中，每个烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基独立地被0、1、2、3、4或5个Rgg基团取代，或者两个偕Rdd取代基可结合以形成＝O或＝S；
Ree的每个独立地选自烷基、卤代烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂环基和杂芳基，其中，每个烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基独立地被0、1、2、3、4或5个Rgg基团取代；
Rff的每个独立地选自氢、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，或者两个Rff基团结合形成杂环基或杂芳基环，其中，每个烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基独立地被0、1、2、3、4或5个Rgg基团取代；
Rgg的每个独立地是：卤素、-CN、-NO2、-N3、-SO2H、-SO3H、-OH、-OC1-6烷基、-ON(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)3 +X-、-NH(C1-6烷基)2 +X-、-NH2(C1-6烷基)+X-、-NH3 +X-、-N(OC1-6烷基)(C1-6烷基)、-N(OH)(C1-6烷基)、-NH(OH)、-SH、-SC1-6烷基、-SS(C1-6烷基)、-C(＝O)(C1-6烷基)、-CO2H、-CO2(C1-6烷基)、-OC(＝O)(C1-6烷基)、-OCO2(C1-6烷基)、-C(＝O)NH2、-C(＝O)N(C1-6烷基)2、-OC(＝O)NH(C1-6烷基)、-NHC(＝O)(C1-6烷基)、-N(C1-6烷基)C(＝O)(C1-6烷基)、-NHCO2(C1-6烷基)、-NHC(＝O)N(C1-6烷基)2、-NHC(＝O)NH(C1-6烷基)、-NHC(＝O)NH2、-C(＝NH)O(C1-6烷基)、-OC(＝NH)(C1-6烷基)、-OC(＝NH)OC1-6烷基、-C(＝NH)N(C1-6烷基)2、-C(＝NH)NH(C1-6烷基)、-C(＝NH)NH2、-OC(＝NH)N(C1-6烷基)2、-OC(NH)NH(C1-6烷基)、-OC(NH)NH2、-NHC(NH)N(C1-6烷基)2、-NHC(＝NH)NH2、-NHSO2(C1-6烷基)、-SO2N(C1-6烷基)2、-SO2NH(C1-6烷基)、-SO2NH2、-SO2C1-6烷基、-SO2OC1-6烷基、-OSO2C1-6烷基、-SOC1-6烷基、-Si(C1-6烷基)3、-OSi(C1-6烷基)3、-C(＝S)N(C1-6烷基)2、C(＝S)NH(C1-6烷基)、C(＝S)NH2、-C(＝O)S(C1-6烷基)、-C(＝S)SC1-6烷基、-SC(＝S)SC1-6烷基、-P(＝O)2(C1-6烷基)、-P(＝O)(C1-6烷基)2、-OP(＝O)(C1-6烷基)2、-OP(＝O)(OC1-6烷基)2、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7环烷基、C6-C10芳基、C3-C7杂环基、C5-C10杂芳基；或者两个偕Rgg取代基可结合形成＝O或＝S；其中，X-为反离子。
示例性的氮原子上取代基包括但不局限于：氢、-OH、-ORaa、-N(Rcc)2、-CN、-C(＝O)Raa、-C(＝O)N(Rcc)2、-CO2Raa、-SO2Raa、-C(＝NRbb)Raa、-C(＝NRcc)ORaa、-C(＝NRcc)N(Rcc)2、-SO2N(Rcc)2、-SO2Rcc、-SO2ORcc、-SORaa、-C(＝S)N(Rcc)2、-C(＝O)SRcc、-C(＝S)SRcc、-P(＝O)2Raa、-P(＝O)(Raa)2、-P(＝O)2N(Rcc)2、-P(＝O)(NRcc)2、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，或者连接至氮原子的两个Rcc基团结合形成杂环基或杂芳基环，其中，每个烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基独立地被0、1、2、3、4或5个Rdd基团取代，且其中Raa、Rbb、Rcc和Rdd如上所述。
“核酸”是指单链或双链的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)分子及其杂合分子。核酸分子的实例包括但不限于信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、自扩增RNA(saRNA)和反义寡核苷酸(ASO)等。核酸可进一步被化学修饰，化学修饰选自假尿苷、N1-甲基-假尿苷、5-甲氧基尿苷、5-甲基胞嘧啶之一或其组合。mRNA分子含有蛋白质编码区，还可进一步含表达调控序列，典型的表达调控序列包括但不限于5'帽子(5'cap)、5'非翻译区(5'UTR)、3'非翻译区(3'UTR)、多聚腺苷酸序列(PolyA)、miRNA结合位点。
mRNA包括修饰的RNA和未修饰的RNA。术语“修饰的mRNA”涉及包含至少一种化学修饰的核苷酸的mRNA。mRNA可以包含一个或多个编码和非编码区。mRNA可以从天然来源纯化，使用重组表达系统产生，并且任选地纯化、化学合成等。在适当的情况下，例如在化学合成分子的情况下，mRNA可以包含核苷类似物，诸如具有化学修饰的碱基或糖、骨架修饰等的类似物。在一些实施方案中，mRNA是或包含天然核苷(例如，腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷)；核苷类似物(例如，假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4'-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫基T-甲基-假尿苷、2-硫基-5-氮杂-尿苷、2-硫基-二氢假尿苷、2-硫基-二氢尿苷、2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷和2'-O-甲基尿苷)；化学修饰的碱基；生物修饰的碱基(例如，甲基化碱基)；插入的碱基；改性糖(例如，2’-氟核糖、核糖、2’-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或修饰的磷酸基团(例如，硫代磷酸酯和5’-N-亚磷酰胺键)。
“脂质”是指包括但不限于脂肪酸的酯的一组有机化合物，并且特征在于不溶于水但溶于许多有机溶剂。它们通常分成至少三类：(1)“简单脂质”，其包括脂肪和油以及蜡；(2)“复合脂质”，其包括磷脂和糖脂；以及(3)“衍生的脂质”如类固醇。
“LNP”表示由脂质(例如，阳离子脂质、可电离脂质和防止颗粒聚集的缀合脂质)和核酸制成的颗粒，其中核酸包封在脂质中。当存在于本发明的脂质颗粒中时，核酸在水溶液中对使用核酸酶的降解具有抗性。
本发明的脂质颗粒通常具有约40nm至约250nm、约50nm至约250nm、约60nm至约230nm、约70nm至约230nm、约70nm至约200nm、约70nm至约180nm或约70nm至约165nm的平均直径，并且是基本上无毒的。
“长效局部递送脂质(Long-Acting SusTained delivering lipid,LASTinglipid)”指注射后可以降低局部注射mRNA-LNP药物的脱靶效应、提高药物在注射位组织中的药峰浓度和生物利用度、延长药物在注射位组织中的达峰时间和半衰期的脂质。
“阳离子脂质”是指在约生理pH下带净正电荷的脂质。阳离子脂质可以是氨基脂质，其结构中一个带正电荷的头基团(亲水基团)连接在一个或多个疏水基团上，头基团一般是带有一个或数个氨基的长链胺类基团。
“永久性阳离子脂质”是LNP对药物进行递送的整个过程涉及的体内环境中持续保持带净正电形式的阳离子脂质，如无pKa或pKa>8的阳离子脂质，优选如pKa>10的阳离子脂质或含有季铵结构的阳离子脂质。
可电离的阳离子脂质可以根据pH值以带正电的形式或中性形式存在。可电离的阳离子脂质的电离影响脂质纳米颗粒在不同pH条件下的表面电荷。
“中性磷脂”是指在特定pH条件下不带电荷的磷脂脂质分子，例如生理pH条件。中性磷脂的实例包括但不限于1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1-棕榈酰基-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、1-棕榈酰基-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(POPE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)。
“结构性脂质”是指通过填充脂质之间的间隙以增强纳米颗粒稳定性的脂质，常见的如类固醇类。类固醇为具有环戊烷骈多氢菲类碳骨架的化合物，在一个优选的实施方案中，所述类固醇选自胆固醇、谷甾醇、粪甾醇、岩皂甾醇、菜籽甾醇、麦角固醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚、豆甾醇、燕麦甾醇、麦角骨化醇或菜油甾醇。
“聚合物共轭脂质”是指含有聚合物部分和脂质部分的分子。在一些实施方式中，聚合物脂质为聚乙二醇(PEG)脂质。PEG脂质是指聚乙二醇(PEG)和脂质的任何复合物。PEG脂质没有特别限制，只要其具有抑制本发明的脂质纳米粒子的聚集的作用即可。其它能够减少聚集的脂质，如具有不带电荷、亲水性、空间阻隔部分的化合物与脂质偶联的产物亦可使用。
“脂质纳米颗粒”是指含有脂质成分、具有纳米级尺寸的颗粒。
“生物可降解基团”是指含有生物可降解键的官能团，例如酯、二硫键和酰胺等。生物降解作用可以影响从体内清除化合物的过程。本发明的生物可降解基团的方向为从可电离脂质分子中头部到尾部的方向。示例性可生物降解基团包括但不限于：-C(O)O-、-O-、-SC(O)O-、-OC(O)NR-、-NRC(O)NR-、-OC(O)S-、-OC(O)O-、-NRC(O)O-、-OC(O)-、-SC(O)-、-C(O)S-、-NR-、-C(O)NR-、-NRC(O)-、-NRC(O)S-、-SC(O)NR-、-C(O)-、-OC(S)-、-C(S)O-、-OC(S)NR-、-NRC(S)O-、-S-S-或-S(O)0-2-，其中R为H或C1-20烷基。
“疏水链”是指由碳和氢组成，可以是饱和或不饱和的链烃，如链烷烃、链烯烃、链炔烃等，常见的一些此类基团包括辛基、壬基、癸基、月桂基、肉豆蔻基、棕榈基、硬脂基、α-亚油基、硬脂酸基、亚油基，γ-亚麻基、花生四烯基和油基。
“类固醇基团”是指具有可连接官能团(如上述可生物降解基团)的环戊烷骈多氢菲类碳骨架的化合物及其衍生物，如胆固醇及其衍生物、植物甾醇，如谷甾醇及其类似物例如：
Figure BDA0004073158490000141
其它定义
本文所用的术语“治疗”涉及逆转、减轻、抑制该术语适用的障碍或病症的进展或者预防之，或者这类障碍或病症的一种或多种症状。本文所用的名词“治疗”涉及动词治疗的动作，后者是如刚才所定义的。
本文所用的术语“药学上可接受的盐”表示本发明化合物的那些羧酸盐、氨基酸加成盐，它们在可靠的医学判断范围内适用于与患者组织接触，不会产生不恰当的毒性、刺激作用、变态反应等，与合理的益处/风险比相称，就它们的预期应用而言是有效的，包括(可能的话)本发明化合物的两性离子形式。
药学上可接受的碱加成盐是与金属或胺生成的，例如碱金属与碱土金属氢氧化物或有机胺。用作阳离子的金属的实例有钠、钾、镁、钙等。适合的胺的实例有N,N'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因。
酸性化合物的碱加成盐可以这样制备，按照常规方式使游离酸形式与足量所需的碱接触，生成盐。按照常规方式使盐形式与酸接触，再分离游离酸，可以使游离酸再生。游离酸形式在某些物理性质上多少不同于它们各自的盐形式，例如在极性溶剂中的溶解度，但是出于本发明的目的，盐还是等价于它们各自的游离酸。
盐可以是从无机酸制备的硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物，酸例如盐酸、硝酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸等。代表性盐包括：氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、乙酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘甲酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐、月桂基磺酸盐和羟乙磺酸盐等。盐也可以是从有机酸制备的，例如脂肪族一元与二元羧酸、苯基取代的烷酸、羟基烷酸、烷二酸、芳香族酸、脂肪族与芳香族磺酸等。代表性盐包括乙酸盐、丙酸盐、辛酸盐、异丁酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盆、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、萘甲酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐等。药学上可接受的盐可以包括基于碱金属与碱土金属的阳离子，例如钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。还涵盖氨基酸的盐，例如精氨酸盐、葡糖酸盐、半乳糖醛酸盐等(例如参见Berge S.M.et al.，"PharmaceuticalSalts,”J.Pharm.Sci.，1977；66:1-19，引入此作为参考)。
给药的“受试者”包括但不限于：人(即，任何年龄组的男性或女性，例如，儿科受试者(例如，婴儿、儿童、青少年)或成人受试者(例如，年轻的成人、中年的成人或年长的成人))和/或非人的动物，例如，哺乳动物，例如，灵长类(例如，食蟹猴、恒河猴)、牛、猪、马、绵羊、山羊、啮齿动物、猫和/或狗。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是非人动物。本文可互换使用术语“人”、“患者”和“受试者”。
“疾病”、“障碍”和“病症”在本文中可互换地使用。
除非另作说明，否则，本文使用的术语“治疗”包括受试者患有具体疾病、障碍或病症时所发生的作用，它降低疾病、障碍或病症的严重程度，或延迟或减缓疾病、障碍或病症的发展(“治疗性治疗”)，还包括在受试者开始患有具体疾病、障碍或病症之前发生的作用(“预防性治疗”)。
通常，药物组合物的“有效量”是指足以引起目标生物反应的数量。正如本领域普通技术人员所理解的那样，本发明药物组合物的有效量可以根据下列因素而改变：例如，生物学目标、药物组合物的药代动力学、所治疗的疾病、给药模式以及受试者的年龄健康情况和症状。有效量包括治疗有效量和预防有效量。
除非另作说明，否则，本文使用的药物组合物的“治疗有效量”是在治疗疾病、障碍或病症的过程中足以提供治疗益处的量，或使与疾病、障碍或病症有关的一或多种症状延迟或最小化的量。药物组合物的治疗有效量是指单独使用或与其它疗法联用时，治疗剂的量，它在治疗疾病、障碍或病症的过程中提供治疗益处。术语“治疗有效量”可以包括改善总体治疗、降低或避免疾病或病症的症状或病因、或增强其它治疗剂的治疗效果的量。
除非另作说明，否则，本文使用的药物组合物的“预防有效量”是足以预防疾病、障碍或病症的量，或足以预防与疾病、障碍或病症有关的一或多种症状的量，或防止疾病、障碍或病症复发的量。药物组合物的预防有效量是指单独使用或与其它药剂联用时，治疗剂的量，它在预防疾病、障碍或病症的过程中提供预防益处。术语“预防有效量”可以包括改善总体预防的量，或增强其它预防药剂的预防效果的量。
“局部注射”是指使用针局部施用至机体任何区域中。在本发明的方法或用途中，优选通过注射，施用到肌肉或肿瘤中。
“组合”以及相关术语是指同时或依次给药本发明药物组合物和其它治疗剂。例如，本发明药物组合物可以与其它治疗剂以分开的单位剂型同时或依次给药，或与其它治疗剂一起在单一单位剂型中同时给药。
本发明的有益效果：
(1)本发明将长效局部递送脂质(LASTing)脂质与可电离脂质组合使用，能够显著改善药物的肝脏脱靶的效应，实验表明能够显著降低药物脱靶至肝脏的量，具有良好的局部(如肌肉)靶向效果，药物在注射原位的表达量显著高于在肝脏的表达量，有望应用于靶向局部(如肌肉)注射制剂。
(2)本发明制剂还具有延长药物在注射部位的表达时间的效果，制得的制剂在72h内高度表达，在120h仍有表达，能够减少药物用量，同时取得更好的治疗效果。
附图说明
图1示出了注射制剂1后，小鼠在不同时间点的肝和肌肉部位的荧光光强的结果。
图2示出了制剂3的配方添加了不同比例的DOTAP后在不同的时间点在肌肉部位的荧光光强的结果。
图3示出了制剂5-1与制剂5-2对比在不同时间点的分别在肝和肌肉部位的荧光光强的结果。
图4示出了制剂6-1与制剂6-2对比在不同时间点的分别在肝和肌肉部位的荧光光强的结果。
图5示出了制剂7-1与制剂7-2对比在不同时间点的分别在肝和肌肉部位的荧光光强的结果。
图6示出了制剂8-1与制剂8-2对比在不同时间点的分别在肝和肌肉部位的荧光光强的结果。
图7示出了制剂8-1与制剂8-3对比在不同时间点的分别在肝和肌肉部位的荧光光强的结果。
图8示出了制剂8-1与制剂8-4对比在不同时间点的分别在肝和肌肉部位的荧光光强的结果。
图9示出了制剂8-1与制剂8-5对比在不同时间点的分别在肝和肌肉部位的荧光光强的结果。
图10示出了制剂9-1与制剂9-2对比在不同时间点的分别在肝和肌肉部位的荧光光强的结果。
图11示出了制剂10-1与制剂10-2对比在不同时间点的分别在肝和肌肉部位的荧光光强的结果。
具体实施方案
本文中，“本发明化合物”指的是以下的式(I)或式(II)等化合物、其药学上可接受的盐、同位素变体、互变异构体或立体异构体。
本文中，化合物使用标准的命名法命名。具有非对称中心的化合物，应该明白(除非另有说明)所有的光学异构体及其混合物均包含在内。此外，除非另有规定，本发明所包括的所有异构体化合物与碳碳双键可能以Z和E的形式出现。在不同的互变异构形式存在的化合物，一个所述化合物并不局限于任何特定的互变异构体，而是旨在涵盖所有的互变异构形式。
本发明提供了一种用于局部注射的脂质纳米颗粒，其包括长效局部递送脂质和可电离脂质，所述脂质纳米颗粒能够在注射部位发挥作用。
在更具体的实施方案中，所述局部注射的部位为肌肉或肿瘤组织，优选为肌肉。
在更具体的实施方案中，与不含长效局部递送脂质的脂质纳米颗粒相比，所述脂质纳米颗粒具有更长的作用时间。
在更具体的实施方案中，所述脂质纳米颗粒能够降低在非注射部位的组织或器官的脱靶作用。
在更具体的实施方案中，所述非注射部位的组织或器官为肝。
在更具体的实施方案中，本发明提供了一种用于局部注射的脂质纳米颗粒，其包括以下组分：长效局部递送脂质、结构性脂质、聚合物共轭脂质和可电离脂质，以及任选地中性磷脂。
在更具体的实施方案中，本发明提供了上述脂质纳米颗粒，其中所述长效局部递送脂质为永久性阳离子脂质，优选为pKa>10的永久性阳离子脂质或含有季铵结构的永久性阳离子脂质。
在更具体的实施方案中，本发明提供了上述脂质纳米颗粒，其中所述永久性阳离子脂质选自式(I)化合物的药学上可接受的盐：
Figure BDA0004073158490000181
其中，
R11和R12独立地选自C6-30烷基、C6-30烯基或C6-30炔基，优选选自C10-25烷基、C10-25烯基或C10-25炔基，优选选自C13-20烷基、C13-20烯基或C13-20炔基，优选选自C13-18烷基、C13-18烯基或C13-18炔基，优选选自C15-18烷基、C15-18烯基或C15-18炔基，例如C17-18烷基、C17-18烯基或C17-18炔基；优选为C13-20烷基或C13-20烯基，优选为C13-18烷基或C13-18烯基，优选为C15-18烷基或C15-18烯基，例如C17-18烷基或C17-18烯基；优选为C13-20烯基，优选为C13-18烯基，优选为C15-18烯基，例如C17-18烯基；R11和R12任选地被1、2、3、4或5个选自如下的取代基取代：-OH、卤素、氰基、C1-30烷基、C1-30卤代烷基、-O-C1-30烷基、-S-C1-30烷基、氨基、-NH-C1-30烷基和-N(C1-30烷基)2，优选任选地被1、2、3、4或5个选自如下的取代基取代：-OH、卤素、氰基、C1-25烷基、C1-25卤代烷基、-O-C1-25烷基、-S-C1-25烷基、氨基、-NH-C1-25烷基和-N(C1-25烷基)2，优选任选地被1、2、3、4或5个选自如下的取代基取代：-OH、卤素、氰基、C1-20烷基、C1-20卤代烷基、-O-C1-20烷基、-S-C1-20烷基、氨基、-NH-C1-20烷基和-N(C1-20烷基)2，优选任选地被1、2、3、4或5个选自如下的取代基取代：-OH、卤素、氰基、C1-18烷基、C1-18卤代烷基、-O-C1-18烷基、-S-C1-18烷基、氨基、-NH-C1-18烷基和-N(C1-18烷基)2；
R13、R14和R15独立地选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基或C2-6炔基，优选选自C1-6烷基，例如Me；或者他们中任两个以及他们连接的N原子一起形成4-8元杂环，优选形成5-6元杂环；
n1和n2独立地选自0或1，优选地，n1＝n2。
优选地，所述药学上可接受的盐为单价阴离子盐，优选为对甲苯磺酸盐或卤素盐，例如氯盐或溴盐。
在更具体的实施方案中，本发明提供了上述脂质纳米颗粒，其中所述永久性阳离子脂质选自式(II)化合物的药学上可接受的盐：
Figure BDA0004073158490000182
其中，
R21和R22独立地选自C6-30烷基、C6-30烯基或C6-30炔基，优选选自C10-25烷基、C10-25烯基或C10-25炔基，优选选自C13-20烷基、C13-20烯基或C13-20炔基，优选选自C13-17烷基、C13-17烯基或C13-17炔基，优选选自C13-20烷基或C13-20烯基，优选选自C13-17烷基或C13-17烯基，其任选地被1、2、3、4或5个选自如下的取代基取代：-OH、卤素、氰基、C1-30烷基、C1-30卤代烷基、-O-C1-30烷基、-S-C1-30烷基、氨基、-NH-C1-30烷基和-N(C1-30烷基)2，优选任选地被1、2、3、4或5个选自如下的取代基取代：-OH、卤素、氰基、C1-25烷基、C1-25卤代烷基、-O-C1-25烷基、-S-C1-25烷基、氨基、-NH-C1-25烷基和-N(C1-25烷基)2，优选任选地被1、2、3、4或5个选自如下的取代基取代：-OH、卤素、氰基、C1-20烷基、C1-20卤代烷基、-O-C1-20烷基、-S-C1-20烷基、氨基、-NH-C1-20烷基和-N(C1-20烷基)2，优选任选地被1、2、3、4或5个选自如下的取代基取代：-OH、卤素、氰基、C1-17烷基、C1-17卤代烷基、-O-C1-17烷基、-S-C1-17烷基、氨基、-NH-C1-17烷基和-N(C1-17烷基)2；
R23选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基或C2-6炔基，优选选自C1-6烷基或C1-6卤代烷基，优选为Me或Et，其任选地被1、2或3个R23s取代；
R23s独立地选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、-OC(O)R2a或-C(O)OR2a，优选选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基或-C(O)OR2a；
R2a独立地选自H、C1-6烷基或C1-6卤代烷基，优选为Et；
R24、R25和R26独立地选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基或C2-6炔基，优选选自C1-6烷基，例如Me；或者他们中任两个以及他们连接的N原子一起形成4-8元杂环，优选形成5-6元杂环。
优选地，所述药学上可接受的盐为单价阴离子盐，优选为对甲苯磺酸盐或卤素盐，例如氯盐或溴盐。
在本发明的一些具体实施方式中，所述永久性阳离子脂质选自如下化合物的药学上可接受的盐：
Figure BDA0004073158490000191
Figure BDA0004073158490000201
优选地，所述药学上可接受的盐为单价阴离子盐，优选为对甲苯磺酸盐或卤素盐，例如氯盐或溴盐。
在更具体的实施方案中，所述永久性阳离子脂质可选自如下化合物：
Figure BDA0004073158490000202
Figure BDA0004073158490000211
在更具体的实施方案中，本发明提供了上述脂质纳米颗粒，其中所述永久性阳离子脂质选自以下一种或多种：氯化N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵(DOTMA)、氯化N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵(DOTAP)、乙基磷脂酰胆碱(EPC)及其衍生物、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基甲酰胺基)乙基]-3,4-二[油基氧基]-苯甲酰胺(MVL5)、双十八烷基酰胺基-甘氨酰基精四胺(DOGS)、3b-[N-(N′,N′-二甲基氨基乙基)氨甲酰基]胆固醇(DC-Chol)和溴化双十八烷基二甲基铵(DDAB)中的一种或多种，优选选自乙基磷脂酰胆碱(EPC)及其衍生物或氯化N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵(DOTAP)；优选选自氯化N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵(DOTMA)、氯化N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵
(DOTAP)或乙基磷脂酰胆碱(EPC)及其衍生物中的一种或多种；优选为乙基磷脂酰胆碱(EPC)和/或氯化N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵(DOTAP)；更优选为氯化N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵(DOTAP)。
在本发明的一个具体实施方式中，所述乙基磷脂酰胆碱(EPC)为18:1EPC。
在更具体的实施方案中，本发明提供了上述脂质纳米颗粒，其中所述永久性阳离子脂质的摩尔百分含量为＞0mol％-30mol％；优选为1.0mol％-25mol％；优选为2.5mol％-20mol％；优选为10mol％-20mol％；更优选为2.5mol％、5mol％、9.4mol％、10mol％或20mol％。
应当理解，本领域的可电离脂质均能应用于本发明。
在一个具体的实施方案中，所述可电离脂质含有两条不可降解的疏水性尾部，例如WO2010144740A1中提及的可电离脂质。
在一个具体的实施方案中，所述可电离脂质含有两条可降解的疏水性尾部，例如WO2011153493A2和WO2013086354A1中提及的可电离脂质。
在更具体的实施方案中，本发明提供了上述脂质纳米颗粒，其中所述可电离脂质选自以下一种或多种：1,2-二油酰基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DODAP)、1,2-二油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DODMA)、1,2-二亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、2,2-二亚油酰基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)、4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯(DLin-MC3-DMA)、8-[(2-羟乙基)(6-氧代-6-癸氧基己基)氨基]辛酸(十七烷-9-基)酯(SM-102)、[(4-羟基丁基)氮杂二基]双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC-0315)、本发明化合物20、化合物26、化合物46和化合物108；优选选自以下一种或多种：4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯(DLin-MC3-DMA)、[(4-羟基丁基)氮杂二基]双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC-0315)、本发明化合物20、化合物26、化合物46和化合物108。
在更具体的实施方案中，本发明提供了上述脂质纳米颗粒，其中所述可电离脂质的摩尔百分含量为30mol％-80mol％；优选为30mol％-65mol％；优选为35mol％-65mol％；优选为40mol％-50mol％；更优选为40mol％、46.3mol％、47.5mol％、49.5mol％或50mol％。
在更具体的实施方案中，本发明提供了上述脂质纳米颗粒，其中所述结构性脂质选自以下一种或多种：胆固醇、谷甾醇、粪甾醇、岩皂甾醇、菜籽甾醇、麦角固醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚、豆甾醇、燕麦甾醇、麦角骨化醇和菜油甾醇，优选选自胆固醇和/或β-谷甾醇，更优选为胆固醇。
在更具体的实施方案中，本发明提供了上述脂质纳米颗粒，其中所述结构性脂质的摩尔百分含量为30mol％-70mol％；优选为30mol％-65mol％；优选为30mol％-60mol％；优选为38.5mol％-53.5mol％；优选为38.5mol％-48.5mol％；更优选为38.5mol％、40.5mol％、42.7mol％、46.5mol％、48.5mol％或53.5mol％。
在更具体的实施方案中，本发明提供了上述脂质纳米颗粒，其中所述结构性脂质:永久性阳离子脂质的摩尔比为1:1-20:1；优选为1.5:1-19:1。
在更具体的实施方案中，本发明提供了上述脂质纳米颗粒，其中所述聚合物共轭脂质为聚乙二醇化脂质。
可选地，所述聚乙二醇化脂质选自以下一种或多种：PEG改性的磷脂酰乙醇胺、PEG改性的磷脂酸、PEG改性的神经酰胺、PEG改性的二烷基胺、PEG改性的二酰基甘油和PEG改性的二烷基甘油；
优选地，所述聚乙二醇化脂质中包含1000Da至20kDa的PEG部分，优选包含约1000Da至约5000Da的PEG部分；
优选地，所述聚乙二醇化脂质选自以下一种或多种：DMPE-PEG1000、DPPE-PEG1000、DSPE-PEG1000、DOPE-PEG1000、DMG-PEG2000、Ceramide-PEG2000、DMPE-PEG2000、DPPE-PEG2000、DSPE-PEG2000、Azido-PEG2000、DSPE-PEG2000-Mannose、Ceramide-PEG5000、DSPE-PEG5000、DSPE-PEG2000 amine和ALC-0159，优选为DMG-PEG2000和/或ALC-0159。
在更具体的实施方案中，本发明提供了上述脂质纳米颗粒，其中所述聚合物共轭脂质的摩尔百分含量为＞0mol％-5mol％；优选为0.5mol％-3mol％；优选为1.5mol％-2mol％；更优选为1.5mol％、1.6mol％或2mol％。
在更具体的实施方案中，本发明提供了上述脂质纳米颗粒，其中所述中性磷脂选自磷脂酰胆碱和/或磷脂酰乙醇胺。
可选地，所述磷脂酰胆碱选自以下一种或多种：1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)。
可选地，所述磷脂酰乙醇胺选自以下一种或多种：1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、2-((2,3-双(油酰氧基)丙基))二甲基铵基)乙基磷酸氢盐(DOCP)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)和二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)。
在更具体的实施方案中，本发明提供了上述脂质纳米颗粒，其中所述中性磷脂的摩尔百分含量为3mol％-30mol％；优选为5mol％-20mol％；优选为10mol％-20mol％。
在更具体的实施方案中，本发明提供了上述脂质纳米颗粒，其中不含中性磷脂。
在更具体的实施方案中，本发明提供了一种脂质纳米颗粒，其包括以下组分：永久性阳离子脂质、结构性脂质、聚合物共轭脂质和可电离脂质，并且不含中性磷脂。
在更具体的实施方案中，本发明提供了上述脂质纳米颗粒，其中所述永久性阳离子脂质如上所述。
在更具体的实施方案中，本发明提供了上述脂质纳米颗粒，其中所述可电离脂质如上所述。
在更具体的实施方案中，本发明提供了上述脂质纳米颗粒，其中所述结构性脂质如上所述。
在更具体的实施方案中，本发明提供了上述脂质纳米颗粒，其中所述聚合物共轭脂质如上所述。
在更具体的实施方案中，本发明提供了上述脂质纳米颗粒，其包括如下摩尔百分比的组分：
可电离脂质30mol％-80mol％，优选30％mol％-65mol％；
结构性脂质30mol％-70mol％，优选30％mol％-65mol％；
永久性阳离子脂质＞0mol％-30mol％；
聚合物共轭脂质＞0mol％-5mol％；
优选地，其包括如下摩尔百分比的组分：
可电离脂质35mol％-65mol％；
结构性脂质30mol％-60mol％；
永久性阳离子脂质1mol％-25mol％；
聚合物共轭脂质0.5mol％-3mol％；
优选地，其包括如下摩尔百分比的组分：
可电离脂质40mol％-50mol％；
结构性脂质38.5mol％-53.5mol％；
永久性阳离子脂质2.5mol％-20mol％；
聚合物共轭脂质1.5mol％-2mol％。
优选地，所述永久性阳离子脂质含量为10mol％-20mol％。
优选地，所述结构性脂质脂质含量为38.5mol％-48.5mol％。
在一些具体的实施方式中，所述可电离脂质：结构性脂质：永久性阳离子脂质：聚合物共轭脂质的摩尔比为：40:53.5:5:1.5、40:48.5:10:1.5、40:38.5:20:1.5、47.5:40.5:10:2、49.5:46.5:2.5:1.5、50:38.5:10:1.5或46.3:42.7:9.4:1.6。
在更具体的实施方案中，本发明提供了一种脂质纳米颗粒组合物，其包括上述任一的脂质纳米颗粒和荷载。
在更具体的实施方案中，本发明提供了上述脂质纳米颗粒组合物，其中所述荷载选自治疗剂、预防剂或诊断剂中的一种或多种。
可选地，所述治疗剂、预防剂或诊断剂为核酸。
可选地，所述核酸选自ASO、RNA或DNA中的一种或多种。
可选地，所述RNA选自以下一种或多种：干扰RNA(RNAi)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、反义RNA(aRNA)、信使RNA(mRNA)、修饰的信使RNA(mmRNA)、长非编码RNA(lncRNA)、微RNA(miRNA)、小激活RNA(saRNA)、多聚编码核酸(MCNA)、聚合编码核酸(PCNA)、引导RNA(gRNA)、CRISPRRNA(crRNA)和核酶，优选为mRNA，更优选为修饰的mRNA。
在更具体的实施方案中，本发明提供了上述脂质纳米颗粒组合物，其中所述永久性阳离子脂质和可电离脂质中的总N原子与所述核酸分子中的P原子的摩尔比N：P为1-15:1，优选为3-12:1，优选为4-7:1，更优选为4、6或7。
在更具体的实施方案中，本发明提供了上述脂质纳米颗粒组合物，其中所述脂质纳米颗粒的平均粒径为60-230nm，优选为70-200nm，更优选为70-165nm。
在更具体的实施方案中，本发明提供了上述脂质纳米颗粒组合物的制备方法，包括：将所述各种脂质组分混合，再与荷载混合。
优选地，包括将含有所述各种脂质组分的溶液与含有荷载的溶液混合。
优选地，采用微流控或冲击式射流的方法混合含有所述各种脂质组分的溶液与含有荷载的溶液；
优选地，所述含有脂质组分的溶液中，溶剂为有机溶剂，优选为醇类溶剂，优选为乙醇；
优选地，所述荷载为核酸，使用醋酸钠溶液将其溶解，优选使用20-30mmol/L的醋酸钠溶液。
在更具体的实施方案中，本发明提供了上述制备方法，还包括除杂步骤；优选超滤除杂；优选使用30kDa的超滤管进行超滤。
在更具体的实施方案中，本发明提供了上述制备方法，还包括除菌步骤；优选使用无菌滤膜进行过滤除菌；优选地，所述无菌滤膜的孔径为0.2μm。
在更具体的实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包括权利要求上述任一的脂质纳米颗粒组合物，以及药物上可接受的辅料。
在更具体的实施方案中，本发明提供了上述任一的脂质纳米颗粒组合物，或上述药物组合物在制备用于治疗、诊断或预防疾病的药物中的用途。
在更具体的实施方案中，本发明提供了上述任一的脂质纳米颗粒组合物，或上述药物组合物在制备递送荷载的药物中的用途，所述荷载选自治疗剂、预防剂或诊断剂中的一种或多种。
可选地，所述治疗剂、预防剂或诊断剂为核酸。
优选地，是在制备在局部递送荷载的药物中的用途。
优选地，是在制备在肌肉或肿瘤中递送荷载的药物中的用途。
更优选地，是在制备在肌肉中递送荷载的药物中的用途。
在更具体的实施方案中，本发明提供了一种在受试者中治疗、诊断或预防疾病的方法，包括向所述受试者给药上述任一的脂质纳米颗粒组合物，或上述药物组合物。
在更具体的实施方案中，本发明提供了上述任一的脂质纳米颗粒组合物，或上述药物组合物，其用于治疗、诊断或预防疾病。
在更具体的实施方案中，本发明提供了一种向受试者体内中递送荷载的方法，包括向所述受试者施用上述任一的脂质纳米颗粒组合物，或上述药物组合物；
其中，所述荷载选自治疗剂、预防剂或诊断剂中的一种或多种。
优选地，是向受试者的机体局部递送荷载。
优选地，是向受试者的肌肉或肿瘤中递送荷载。
更优选地，是向受试者的肌肉中递送荷载。
在更具体的实施方案中，本发明提供了上述任一的脂质纳米颗粒组合物，或上述药物组合物，其用于递送荷载；
其中，所述荷载选自治疗剂、预防剂或诊断剂中的一种或多种。
本发明化合物可包括一个或多个不对称中心，且因此可以存在多种立体异构体形式，例如，对映异构体和/或非对映异构体形式。例如，本发明化合物可为单独的对映异构体、非对映异构体或几何异构体(例如顺式和反式异构体)，或者可为立体异构体的混合物的形式，包括外消旋体混合物和富含一种或多种立体异构体的混合物。异构体可通过本领域技术人员已知的方法从混合物中分离，所述方法包括：手性高压液相色谱法(HPLC)以及手性盐的形成和结晶；或者优选的异构体可通过不对称合成来制备。
本发明化合物可以互变异构体形式存在。互变异构体为因分子中某一原子在两个位置迅速移动而产生的官能团异构体。互变异构体是一种特殊的官能团异构体，一对互变异构体可以互相转换，但通常以比较稳定的一种异构体为其主要的存在形式。最主要的例子为烯醇式和酮式互变异构体。
本发明还包括同位素标记的化合物(同位素变体)，它们等同于式(IV)所述的那些，但一个或多个原子被原子质量或质量数不同于自然界常见的原子质量或质量数的原子所代替。可以引入本发明化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，分别例如2H、3H、13C、11C、14C、15N、18O、17O、31P、32P、35S、18F和36Cl。含有上述同位素和/或其它原子的其它同位素的本发明化合物、其前体药物和所述化合物或所述前体药物的药学上可接受的盐都属于本发明的范围。某些同位素标记的本发明化合物、例如引入放射性同位素(例如3H和14C)的那些可用于药物和/或底物组织分布测定。氚、即3H和碳-14、即14C同位素是特别优选的，因为它们容易制备和检测。进而，被更重的同位素取代，例如氘、即2H，由于代谢稳定性更高可以提供治疗上的益处，例如延长体内半衰期或减少剂量需求，因而在有些情况下可能是优选的。同位素标记的本发明式(IV)化合物及其前体药物一般可以这样制备，在进行下述流程和/或实施例与制备例所公开的工艺时，用容易得到的同位素标记的试剂代替非同位素标记的试剂。
本发明还提供药物制剂，包含治疗有效量的式(IV)化合物或其治疗学上可接受的盐和其药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。所有这些形式都属于本发明。
药物组合物和试剂盒
在另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明纳米颗粒组合物和药学上可接受的赋形剂，所述纳米颗粒组合物包含本发明化合物。
用于本发明的药学上可接受的赋形剂是指不会破坏一起调配的化合物的药理学活性的无毒载剂、佐剂或媒剂。可以用于本发明组合物中的药学上可接受的载剂、佐剂或媒剂包括(但不限于)离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(如人类血清白蛋白)、缓冲物质(如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质(如硫酸鱼精蛋白)、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅胶、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇以及羊毛脂。
本发明还包括试剂盒(例如，药物包装)。所提供的试剂盒可以包括本发明纳米颗粒组合物和其它治疗剂或诊断剂或预防剂，以及含有本发明纳米颗粒组合物和其它治疗剂或诊断剂或预防剂的第一和第二容器(例如，小瓶、安瓿瓶、瓶、注射器和/或可分散包装或其它合适的容器)。在一些实施方案中，提供的试剂盒还可以任选包括第三容器，其含有用于稀释或悬浮本发明纳米颗粒组合物和/或其它治疗剂或诊断剂或预防剂的药用赋形剂。在一些实施方案中，提供在第一容器和第二容器中的本发明纳米颗粒组合物和其它治疗剂或诊断剂或预防剂组合形成一个单位剂型。
给药
本发明提供的药物组合物可以通过许多途径给药，包括但不限于：口服给药、肠胃外给药、吸入给药、局部给药、直肠给药、鼻腔给药、口腔给药、阴道给药、通过植入剂给药或其它给药方式。例如，本文使用的肠胃外给药包括皮下给药、皮内给药、静脉内给药、肌肉内给药、关节内给药、动脉内给药、滑膜腔内给药、胸骨内给药、脑脊髓膜内给药、病灶内给药、和颅内的注射或输液技术。
通常，给予有效量的本发明药物组合物。按照有关情况，包括所治疗或预防的病症、选择的给药途径、实际给予的药物组合物、个体患者的年龄、体重和响应、患者症状的严重程度，等等，可以由医生确定实际上给予的药物组合物的量。
当用于预防本发明所述病症时，给予处于形成所述病症危险之中的受试者本文所提供的药物组合物，典型地基于医生的建议并在医生监督下给药，剂量水平如上所述。处于形成具体病症的危险之中的受试者，通常包括具有所述病症的家族史的受试者，或通过遗传试验或筛选确定尤其对形成所述病症敏感的那些受试者。
还可以长期给予本文所提供的药物组合物(“长期给药”)。长期给药是指在长时间内给予化合物或其药物组合物，例如，3个月、6个月、1年、2年、3年、5年等等，或者可无限期地持续给药，例如，受试者的余生。在一些实施方案中，长期给药意欲在长时间内在血液中提供所述化合物的恒定水平，例如，在治疗窗内。
可以使用各种给药方法，进一步递送本发明的药物组合物。例如，在一些实施方案中，可以推注给药药物组合物，例如，为了使化合物在血液中的浓度提高至有效水平。推注剂量取决于通过身体的活性组分的目标全身性水平，例如，肌内或皮下的推注剂量使活性组分缓慢释放，而直接递送至静脉的推注(例如，通过IV静脉滴注)能够更加快速地递送，使得活性组分在血液中的浓度快速升高至有效水平。
口服组合物可以采用散装液体溶液或混悬剂或散装粉剂形式。然而，更通常，为了便于精确地剂量给药，以单位剂量形式提供所述组合物。术语“单位剂型”是指适合作为人类患者及其它哺乳动物的单元剂量的物理离散单位，每个单位包含预定数量的、适于产生所需要的治疗效果的活性物质与合适药学赋形剂。典型的单位剂量形式包括液体组合物的预装填的、预先测量的安瓿或注射器，或者在固体组合物情况下的丸剂、片剂、胶囊剂等。在这种组合物中，所述活性物质通常为较少的组分(约0.1至约50重量％，或优选约1至约40重量％)，剩余部分为对于形成所需给药形式有用的各种载体或赋形剂以及加工助剂。
对于口服剂量，代表性的方案是，每天一个至五个口服剂量，尤其是两个至四个口服剂量，典型地是三个口服剂量。使用这些剂量给药模式，每个剂量提供大约0.001mg/kg至约10mg/kg剂量的所述治疗剂或诊断剂或预防剂，优选的剂量各自提供大约0.1mg/kg至大约10mg/kg，尤其是大约1至大约5mg/kg。
可注射的组合物典型地基于可注射用的无菌盐水或磷酸盐缓冲盐水，或本领域中已知的其它可注射的赋形剂。如前所述，在这种组合物中，活性化合物典型地为较少的组分，经常为约0.05至10％重量，剩余部分为可注射的赋形剂等。
实施例
为使本发明的技术方案更清楚、明确，通过以下实施例对本发明进行进一步详细说明。以下实施例仅用于说明本发明的具体实施方式，以使本领域的技术人员能够理解本发明，但不用于限制本发明的保护范围。本发明的具体实施方式中，未作特别说明的技术手段或方法等为本领域的常规技术手段或方法等。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
表1
Figure BDA0004073158490000291
Figure BDA0004073158490000301
实施例1：化合物的合成
化合物20的合成：
Figure BDA0004073158490000302
将化合物1-1(100g,979mmol)的四氢呋喃(800mL)溶液冷却至零下40℃，向溶液中缓慢滴加LDA(2M,490mL)，滴加完成后继续搅拌1小时，相同温度下向反应体系中滴加1-2(315g,1.37mol)的四氢呋喃(100mL)溶液，反应体系搅拌过夜。反应体系用饱和氯化铵水溶液淬灭，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥。过滤、浓缩滤液至干得粗品。粗品经硅胶柱分离纯化，得化合物1-3(115g)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 1.06-1.11(m,6H),1.13-1.22(m,2H),1.29-1.39(m,2H),1.42-1.49(m,2H),1.73-1.82(m,2H),3.28-3.40(m,2H),3.55-3.66(m,3H)。
将化合物1-3(100g,398mmol)，TosMIC(38.9g,199mmol)和TBAI(14.7g,39.8mmol)的二甲基亚砜(800mL)溶液冷却至0℃，分批次缓慢加入氢化钠(20.7g,517mmol)，常温过夜反应。反应体系用饱和氯化钠水溶液淬灭，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥。过滤、浓缩滤液至干，得化合物1-4粗品115g，无需分离纯化，直接用于下步反应。
向化合物1-4粗品(110g,205mmol)的二氯甲烷(880mL)溶液中加入330mL浓盐酸，常温反应2小时，TLC监测底物反应完全。反应体系用饱和氯化铵水溶液淬灭，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥。过滤、浓缩滤液至干得粗品。粗品经硅胶柱分离纯化，得化合物1-5(30.0g,80.9mmol,产率39.4％)。
常温下将TMSOK(11.0g,86.4mmol)加入化合物1-5(8.0g,21.6mmol)的四氢呋喃(35.0mL)溶液中，反应体系加热至70℃进行搅拌，TLC监测反应原料消耗完全。反应液冷却至室温，旋蒸除去有机溶剂，粗品加入20mL水并且用二氯甲烷萃取，收集水相层，用1M盐酸调节溶液pH值小于5，用二氯甲烷进行萃取，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤收集滤液，浓缩，得化合物1-6(7.0g)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 1.03(s,12H),1.08-1.17(m,8H),1.34-1.45(m,8H),2.21(t,J＝7.2Hz,4H)。
将碳酸钾(482mg,3.48mmol)加入化合物1-6(294mg,0.87mmol)和1-7(721mg,3.48mmol)的DMF溶液中，然后反应升温至60℃反应6小时，监测反应物1-6完全消失，冷却至室温，反应体系用饱和氯化钠水溶液淬灭，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥。过滤、浓缩滤液至干得粗品，粗品经硅胶柱纯化，得化合物1-8(318mg)。
将化合物1-8(318mg,0.53mmol)溶于4.0mL甲醇中，向反应体系中加入硼氢化钠(30mg,0.80mmol)，常温反应，TLC监测反应物完全消失，反应体系用饱和氯化钠水溶液淬灭，用二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥。过滤、浓缩滤液至干，得化合物1-9粗品(242mg)，无需纯化，直接用于下步反应。
将化合物1-9粗品(242mg,0.41mmol)，1-10(81.3mg,0.62mmol)，EDCI(236mg,1.23mmol)，三乙胺(0.17mL,1.23mmol)和DMAP(50mg,0.41mmol)溶于5.0mL二氯甲烷中，反应液在常温搅拌反应12小时，反应液用饱和氯化钠水溶液淬灭，二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥。过滤收集有机相，用旋转蒸发仪除去有机溶剂得粗品，粗品经制备高效液相色谱纯化，得化合物20(130mg)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 0.89(t,J＝7.2Hz,6H),1.15(s,12H),1.27(m,34H),1.47(m,8H),1.51(m,6H),1.79(m,2H),2.23(s,6H),2.33(m,4H),4.04(t,J＝6.8Hz,4H),4.85(m,1H)；ESI-MS m/z:710.7[M+H]+。
化合物26的合成
Figure BDA0004073158490000321
参考化合物20的合成方法，制备化合物2-5，得到油状产品300mg。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 0.87(t,J＝7.2Hz,6H),1.16(s,12H),1.20-1.39(m,28H),1.45-1.54(m,12H),1.74-1.82(m,2H),2.12-2.35(m,14),4.63(t,J＝2.4Hz,4H),4.79-4.88(m,1H)；ESI-MS m/z:730.6[M+H]+。
将化合物2-5(300mg,0.41mmol)和喹啉(106mg,0.82mmol)溶于3.0mL乙酸乙酯中，常温条件下用氮气将反应体系中的空气交换2～3分钟，然后加入林德拉催化剂(16.9mg)，反应液通入氢气并且进行气体交换2～3分钟，反应体系保持在氢气氛围(15psi)下常温搅拌30分钟，LC-MS监测反应物完全消失，反应液过滤，滤饼用乙酸乙酯冲洗3～4次，收集合并乙酸乙酯，利用旋转蒸发仪除去有机溶剂得粗品，粗品用制备高效液相色谱纯化，得化合物26(31.3mg)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 0.81(t,J＝7.2Hz,6H),1.08(s,12H),1.15-1.28(m,32H),1.38-1.44(m,8H),1.70-1.79(m,2H),2.01(m,4H),2.15(s,6H),2.16-2.28(m,4H),4.54(d,J＝12.0Hz,4H),4.75(m,1H),5.39-5.59(m,4H)；ESI-MS m/z:734.6[M+H]+。
化合物46的合成：
Figure BDA0004073158490000322
将碳酸钾(1.55g,11.2mmol,4.0eq.)加入化合物1-6(959mg,2.8mmol,1.0eq.)和3-1(638mg,3.08mmol,1.1eq.)的DMF溶液中，然后反应升温至60℃反应4小时，冷却至室温，反应体系用饱和氯化钠水溶液淬灭，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥。过滤、浓缩滤液至干得粗品，经硅胶柱纯化得化合物3-2(682mg)。
将化合物3-2(324mg,0.69mmol,1.0eq.)溶于5.0mL二氯甲烷中，反应体系置于冰浴下冷却至0℃，加入2滴DMF，然后向反应液中滴加草酰氯(0.24mL,2.8mmol,4.0eq.)，滴加完成后移除冰浴，常温搅拌1小时。用旋转蒸发仪除去溶剂得油状酰氯粗品(309mg)，直接用于下步反应。
将3-3(407mg,1.9mmol,3.0eq)加入酰氯粗品(309mg)的DCE(3.0mL)溶液中，反应加热至70℃过夜反应。反应液冷却至室温，用旋转蒸发仪除去溶剂得粗品，粗品经硅胶柱纯化，得到化合物3-4(325mg)。
将化合物3-4(325mg)溶于4.0mL甲醇中，向反应体系中加入硼氢化钠(28mg,0.73mmol)，常温反应，TLC监测反应物完全消失，反应体系用饱和氯化钠水溶液淬灭，用二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥。过滤、浓缩滤液至干，得化合物3-5粗品(260mg)，无需纯化，直接用于下步反应。
将化合物3-5粗品(260mg,0.39mmol)，1-10(77.4mg,0.59mmol)，EDCI(224mg,1.17mmol)，三乙胺(0.16mL,1.17mmol)和DMAP(48mg,0.39mmol)溶于5.0mL二氯甲烷中，反应液在常温搅拌反应12小时，反应液用饱和氯化钠水溶液淬灭，二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥。过滤收集有机相，用旋转蒸发仪除去有机溶剂得粗品，粗品经制备高效液相色谱纯化，得化合物46(32.6mg)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 0.88(t,J＝7.2Hz,9H),1.14(s,12H),1.15-1.28(m,37H),1.47-1.59(m,18H),1.75-1.84(m,2H),2.24-2.35(m,10H),3.95(d,J＝5.6Hz,2H),4.03(t,J＝6.8Hz,2H),4.80-4.87(m,1H)；ESI-MS m/z:780.7[M+H]+。
化合物108的合成：
Figure BDA0004073158490000331
将化合物1-6(448mg,1.3mmol)溶于5.0mL二氯甲烷中，反应体系置于冰浴下冷却至0℃，加入DMF(10μL,0.13mmol)，然后向反应液中滴加草酰氯(0.44mL,5.2mmol)，滴加完成后移除冰浴，常温搅拌1小时。用旋转蒸发仪除去溶剂得油状酰氯粗品(330mg)，直接用于下步反应。
将1-壬硫醇4-1(418mg,2.61mmol)加入酰氯粗品(330mg,0.87mmol)的DCE(3.0mL)溶液中，反应加热至70℃过夜反应。反应液冷却至室温，用旋转蒸发仪除去溶剂得粗品，粗品经硅胶柱纯化，得到化合物4-2(400mg)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm。
化合物4-2(288mg,0.46mmol)溶于3.0mL甲醇中，分批加入NaBH4(52.5mg,1.38mmol)，将反应液在氮气氛围下常温搅拌2小时，TLC监测反应原料完全消失，反应液中加入饱和氯化铵溶液淬灭，用乙酸乙酯萃取，合并有机相并加入无水硫酸钠进行干燥，过滤收集滤液，浓缩得288mg化合物4-3粗品。无需进一步纯化，直接用于下一步反应。
将化合物4-3粗品(288mg,0.46mmol)，4-4(108mg,0.69mmol)，EDCI(264.5mg,1.38mmol)，三乙胺(0.19mL,1.38mmol)和DMAP(56.2mg,0.46mmol)溶于8.0mL二氯甲烷中，反应液在常温搅拌反应至反应原料4-3消耗完全，反应液用饱和氯化钠水溶液淬灭，二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥。过滤收集有机相，用旋转蒸发仪除去有机溶剂，粗品经制备高效液相色谱纯化，得化合物4(67.3mg)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 0.88(t,J＝6.80Hz,6H),1.18(s,12H),1.20-1.39(m,38H),1.40-1.62(m,14H),1.66-1.86(m,3H),1.89-2.10(m,2H),2.19-2.27(m,3H),2.28(br s,2H),2.79-2.83(m,4H),4.79-4.88(m,1H)；ESI-MS m/z:768.5[M+H]+。
化合物132的合成
Figure BDA0004073158490000341
将化合物132-1(101.7mg,0.15mmol)和化合物132-2(40.1mg,0.17mmol)加入5.0mL氯仿溶液中，反应液加热至45℃搅拌反应，LC-MS监测反应物132-1消耗完全。用氮气将有机溶剂吹干得到粗产物，将粗产品加入正己烷中打浆(5.0mL*3)，抽滤干燥得到白色固体产物35.9毫克。
1H NMR:(400MHz,CDCl3):δ0.89(t,J＝7.2Hz,6H),1.26-1.32(m,43H),1.54-1.67(m,4H),2.30-2.36(m,4H),3.36(s,9H),4.03(br d,J＝2.8Hz,2H),4.23-4.32(m,6H),4.57-4.74(m,4H),5.25-5.29(m,1H)；ESI-MS m/z:764.5[M]+.
化合物133的合成
Figure BDA0004073158490000351
将化合物133-1(250mg,0.32mmol)和化合物133-2(62.3mg,0.35mmol)加入10.0mL氯仿溶液中，反应液加热至45℃搅拌反应2小时，LC-MS监测反应物133-1消耗完全。用氮气将有机溶剂吹干得到粗产物，将粗产品加入正己烷中打浆(8.0mL*3)，抽滤干燥得到白色固体产物165毫克。
1H NMR:(400MHz,CDCl3):δ0.89(t,J＝7.2Hz,6H),1.26-1.38(m,58H),1.52-1.67(m,5H),2.31-2.37(m,4H),3.31(s,9H),3.92(br d,J＝2.8Hz,2H),4.16-4.34(m,6H),4.47-4.63(m,2H),5.24-5.28(m,1H)；ESI-MS m/z:818.7[M]+.
实施例2
用于脂质纳米颗粒组装的材料有：(1)可电离的脂质化合物：如本发明所设计合成的可电离脂质或者ALC-0315(购自AVT)作为对照组；(2)结构性脂质：如胆固醇Cholesterol(购自Sigma-Aldrich)；(3)磷脂：如DSPC为1,2-二硬脂酰-SN-甘油-3-磷酸胆碱(Distearoylphosphatidylcholine，购自AVT)；(4)聚乙二醇化脂质化合物：如DMG-PEG2000为二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇2000
(1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxy-polyethylene glycol-2000,购自AVT)；(5)核酸片段有效成分：如Luciferase mRNA，siRNA,CRISPR Cas 9mRNA等(自制)；(6)永久性阳离子脂质。脂质纳米颗粒组装材料名称及其结构式详见表2。
表2
Figure BDA0004073158490000352
/>
Figure BDA0004073158490000361
/>
Figure BDA0004073158490000371
脂质纳米颗粒的制备方法：(1)将可电离的脂质化合物、永久性阳离子脂质、胆固醇、磷脂和聚乙二醇化脂质分别按提供的摩尔百分比依次溶解混合于乙醇中；(2)将mRNA有效成分溶解于25mM醋酸钠溶液(pH＝4.5)；(3)使用自动化高通量微流控系统将溶解有脂质混合体的有机相和溶解有mRNA成分的水相按1:1到1:4范围的的流速比例进行混合，混合速度处于10mL/min到18mL/min；(4)制备出的脂质纳米颗粒用磷酸缓冲盐溶液进行稀释，并用截留分子量为30kDa的超滤管对纳米颗粒溶液进行超滤至原制备体积；(5)所得纳米颗粒经过0.2μm无菌滤膜的过滤除菌后于密封玻璃瓶中低温保存。脂质纳米颗粒的制备方式包括微流控混合系统，但不限于此方法，也包括T-型混合器和乙醇注入法等。
使用Zetasizer Pro(购自Malvern Instruments Ltd)以及DynaPro NanoStar(购自Wyatt)动态光散射仪对制备的脂质纳米颗粒的颗粒大小和粒径分散系数(PDI)进行测量。脂质纳米颗粒对于RNA的包载程度由包封率来表征(Encapsulation Efficiency％)，该系数反映出脂质纳米颗粒与RNA片段的结合程度。该系数由Quant-itTM RiboGreen RNAAssay(购自Invitrogen)的方法来测量。脂质纳米颗粒样品于TE缓冲液(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH＝7.5)稀释，取出部分样品溶液加入0.5％曲拉通(Triton X-100)于37℃静置30分钟。加入
Figure BDA0004073158490000381
反应液后立即于Varioskan LUX多功能酶标仪(购自Thermofisher)在吸收光波段为485nm和发射光波段为528nm条件下读取荧光值从而得到包载率数值。表征结果见表3(其中各组分的百分含量为摩尔百分含量)。
表3
Figure BDA0004073158490000382
实施例3
该实施例中展示以上的不同的可电离脂质配方中加入不同的永久正电脂质之后，通过肌肉原位注射包裹luciferase mRNA的LNP后在肌肉部位高表达荧光蛋白。
对包载有荧光素酶mRNA的纳米颗粒在小鼠体内的递送效果以及安全性的评估。试验小鼠为SPF级C57BL/6小鼠，雌性，6-8周龄，体重18-22g，购自北京斯贝福生物技术有限公司。所有动物在试验前进行适7天以上的应性饲养，试验期间自由进食饮水，光照12/12h明暗交替，室内温度为20-26℃，湿度为40-70％。将小鼠随机分组。将以上制备的包载有荧光素酶mRNA的脂质纳米颗粒以0.5mg/kg mRNA的单剂量以腿部肌肉注射给药的方式注射进入小鼠体内，于给药后6，24，48，72，120小时等用小动物活体成像系统(IVIS LUMINA III，购自PerkinElmer)对小鼠进行活体生物发光检测。检测的具体操作步骤如下：用生理盐水配制15mg/mL浓度的D-荧光素溶液，每只小鼠以腹腔注射的方式给予底物。给予底物10分钟以后将小鼠置于麻醉箱中以浓度为2.5％异氟烷进行麻醉。将麻醉好的小鼠放入IVIS中，进行荧光成像并对荧光集中分布的部位进行数据采集以及数据分析。
脂质纳米颗粒载体的体内递送效率以同一受试组内不同动物荧光强度和总光子数的平均值表示。荧光强度和总光子数的数值越高，表示脂质纳米颗粒对于该mRNA片段的体内递送效率越高。含有本发明阳离子脂质的脂质纳米颗粒具有良好的体内递送效率。
制剂1:
在化合物26可电离脂质中添加了不同比例的18:1EPC制成脂质纳米颗粒之后通过腿部肌肉原位注射的方式进入小鼠体内，结果见图1和表7。
图1显示注射制剂1后6h、24h、48h分别在IVIS仪器对小鼠的肝和肌肉部分进行活体成像，得到其荧光蛋白的发光强度。图中分别是在不同时间点的肝和肌肉部位的荧光光强的结果。每一个柱代表着3只小鼠在相应的器官部位的荧光表达量的平均值(n＝3)。
从图1和表4中可以看出，添加EPC后，荧光蛋白在肝脏中表达大幅度下降，添加5％18:1EPC的配方6h时荧光蛋白在肝脏中表达低至不含EPC的实验组的9.4％。随着EPC％添加量的增加，荧光蛋白在肝脏中表达的量显著下降，至20％的时候几乎观察不到肝脏中信号的表达，低至不含EPC的实验组的0.03％。同时，荧光蛋白在肌肉原位/肝部位荧光表达比例随着EPC％添加量的增加而逐渐增加。注射后6小时到48小时，随着注射后时间的延长，肝脏内的信号有一个快速且大幅度的衰减，但含有EPC的实验组在肌肉中的信号衰减缓慢，48h时含有EPC的实验组在肌肉中的信号强度是不含EPC实验组的33-662倍。添加了20％EPC的配方组显示出非常稳定的肌肉部位荧光信号的表达，且在48h并未发现明显的信号衰弱。
表4
Figure BDA0004073158490000391
制剂3:
制剂3是由化合物108与0％或20％DOTAP，胆固醇，和PEG脂质配比形成的配方。以与以上相同的试验方法去进一步验证不同的可电离脂质与永久正电脂质组合在肌肉原位的表达情况以及不同时间点的荧光表达量，结果见图2和表5。图2显示，制剂3添加了不同比例的DOTAP的配方在不同的时间点在肌肉部位的荧光光强的结果。每一个点代表着4只小鼠在相应的器官部位和不同时间点的荧光表达量的平均值(n＝4)。
由于化合物108脂质本身就有较好的肌肉原位的靶向性，所以在6h的荧光成像中，0％DOTAP的配方在肌肉原位的表达高于20％DOTAP的配方，但是0％DOTAP的配方在肝部位仍有比较高的表达。在6h时，0％DOTAP的配方在肌肉原位与肝部位荧光表达的比例为2.7，而对于20％DOTAP的配方，该比例提高至85.1，提高了22.7倍。说明DOTAP的添加提高了LNP总体配方在肌肉原位的富集。
随着时间的增加，至24h时，0％DOTAP的配方在肌肉原位的表达与20％DOTAP的配方相当。48h时，0％DOTAP的配方在肌肉原位的表达明显低于20％DOTAP的配方的肌肉部位的表达强度。至120h时，基本已经检测不到0％DOTAP配方在肌肉原位的表达，但是20％DOTAP仍然显示出明显的肌肉部位的表达荧光值。
表5
Figure BDA0004073158490000401
实施例4
采用实施例2相同的方法制备制剂5-1、5-2、6-1、6-2、7-1、7-2、8-1、8-2、8-3、8-4、8-5、9-1、9-2、10-1、10-2，并采用实施例3的方法进行递送效果的检测，各制剂的配方信息和检测结果见表6-表23和图3-图11。
表6
Figure BDA0004073158490000402
表7注射制剂5-1/5-2后，小鼠体内肌肉原位与肝部位的荧光光强(p/s)
Figure BDA0004073158490000403
Figure BDA0004073158490000411
根据图3和表7可知，添加了永久性阳离子化合物133的制剂5-2在肝脏中表达的量显著下降，在任何一个时间点下都明显低于未添加永久性阳离子的制剂5-1。随着注射后时间的延长，制剂5-2在肝脏内几乎检测不到蛋白的表达信号，但其在肌肉中的信号衰减缓慢，保持着明显的肌肉部位的表达荧光值。
表8
Figure BDA0004073158490000412
表9注射制剂6-1/6-2后，小鼠体内肌肉原位与肝部位的荧光光强(p/s)
制剂6-1 Liver 制剂6-2 Liver 制剂6-1 Muscle 制剂6-2 Muscle
6h 2.04E+08 1.72E+05 1.05E+08 1.62E+08
24h 2.70E+07 1.24E+05 1.23E+07 6.68E+07
48h 1.20E+07 2.42E+05 2.58E+06 6.06E+07
72h 4.27E+05 6.56E+04 9.89E+05 3.19E+07
120h 6.52E+04 1.30E+04 4.58E+05 1.75E+07
根据图4和表9可知，添加了永久性阳离子化合物133的制剂6-2在肝部的表达量显著降低，6h时仅为未添加永久性阳离子的制剂6-1表达量的0.08％，且在任何一个时间点下，制剂6-2在肌肉中表达的量都明显高于制剂6-1，并始终保持着数百倍的肌肉原位/肝部位荧光表达比例，肌肉靶向性好。
表10
Figure BDA0004073158490000413
Figure BDA0004073158490000421
表11 注射制剂7-1/7-2后，小鼠体内肌肉原位与肝部位的荧光光强(p/s)
制剂7-1 Liver 制剂7-2 Liver 制剂7-1 Muscle 制剂7-2 Muscle
6h 4.04E+09 2.73E+06 3.33E+08 5.57E+08
24h 5.32E+08 6.62E+05 2.03E+07 2.27E+08
48h 3.09E+07 1.36E+05 7.61E+06 1.94E+08
72h 1.10E+07 2.02E+05 2.75E+06 1.76E+08
120h 1.02E+06 4.01E+04 8.55E+05 2.28E+07
根据图5和表11可知，添加了永久性阳离子化合物133的制剂7-2在肝部的表达量显著降低，6h时仅为未添加永久性阳离子的制剂7-1表达量的0.07％，且在任何一个时间点下，制剂7-2在肌肉中表达的量都显著高于制剂7-1，并始终保持着数百倍甚至上千倍的肌肉原位/肝部位荧光表达比例，肌肉靶向性好。
表12
Figure BDA0004073158490000422
/>
表13注射制剂8-1/8-2后，小鼠体内肌肉原位与肝部位的荧光光强(p/s)
Figure BDA0004073158490000423
Figure BDA0004073158490000431
根据图6和表13可知，添加了永久性阳离子化合物133的制剂8-2在肝部的表达量显著降低，6h时仅为未添加永久性阳离子的制剂8-1表达量的0.6％。24h后制剂8-2在肝脏内几乎检测不到蛋白的表达信号，但其在任何一个时间点下在肌肉中表达的量都明显高于制剂8-1，肌肉靶向性好。
表14
Figure BDA0004073158490000432
表15 注射制剂8-1/8-3后，小鼠体内肌肉原位与肝部位的荧光光强(p/s)
制剂8-1 Liver 制剂8-3 Liver 制剂8-1 Muscle 制剂8-3 Muscle
6h 2.00E+09 3.21E+04 2.17E+08 2.21E+08
24h 4.05E+08 3.18E+07 1.43E+07 1.64E+08
48h 1.82E+07 1.30E+06 4.15E+06 1.46E+08
72h 6.31E+06 4.23E+05 2.11E+06 1.65E+08
120h 6.56E+05 2.75E+04 7.90E+05 3.03E+07
根据图7和表15可知，添加了永久性阳离子化合物132的制剂8-3在肝部的表达量显著降低，6h时仅为未添加永久性阳离子的制剂8-1表达量的0.02‰，且在任何一个时间点下，制剂8-3在肌肉中表达的量都明显高于制剂8-1，给药后72h至120h，肌肉原位/肝部位荧光表达比例持续达上百倍甚至上千倍，肌肉靶向性好。
表16
Figure BDA0004073158490000433
Figure BDA0004073158490000441
表17 注射制剂8-1/8-4后，小鼠体内肌肉原位与肝部位的荧光光强(p/s)
制剂8-1 Liver 制剂8-4 Liver 制剂8-1 Muscle 制剂8-4 Muscle
6h 2.00E+09 1.27E+08 2.17E+08 3.02E+08
24h 4.05E+08 2.18E+07 1.43E+07 3.37E+07
48h 9.40E+05 1.30E+06 4.15E+06 1.29E+07
72h 6.32E+06 5.36E+05 2.11E+06 2.22E+07
120h 6.56E+05 5.47E+04 7.90E+05 5.84E+06
根据图8和表17可知，添加了永久性阳离子DOTAP的制剂8-4在肝部的表达量显著降低，6h时仅为未添加永久性阳离子的制剂8-1表达量的6％，且在任何一个时间点下，制剂8-4在肌肉中表达的量都明显高于制剂8-1，同时也明显高于其在肝部位的表达量，具有良好的肌肉靶向性。
表18
Figure BDA0004073158490000442
表19注射制剂8-1/8-5后，小鼠体内肌肉原位与肝部位的荧光光强(p/s)
Figure BDA0004073158490000443
/>
Figure BDA0004073158490000451
根据图9和表19可知，添加了永久性阳离子DOTMA的制剂8-5在肝部的表达量显著降低，6h时为未添加永久性阳离子的制剂8-1表达量的6％，24h时降低至仅为制剂8-1表达量的0.08％，几乎检测不到肝部表达信号。在任何一个时间点下，制剂8-5保持着明显的肌肉部位的表达荧光值，在肌肉中表达的量都明显高于制剂8-1，同时也明显高于其在肝部位的表达量，具有良好的肌肉靶向性。
表20
Figure BDA0004073158490000452
表21注射制剂9-1/9-2后，小鼠体内肌肉原位与肝部位的荧光光强(p/s)
制剂9-1 Liver 制剂9-2 Liver 制剂9-1 Muscle 制剂9-2 Muscle
6h 2.62E+09 3.90E+05 8.76E+08 2.64E+08
24h 1.06E+08 1.32E+06 2.82E+08 5.75E+08
48h 6.66E+06 1.36E+06 1.03E+08 1.26E+09
72h 6.70E+05 3.94E+05 2.30E+07 4.23E+08
根据图10和表21可知，添加了永久性阳离子化合物133的制剂9-2在肝部的表达量显著降低。在任何一个时间点下，制剂9-2的肌肉原位/肝部位荧光表达比例都在数百倍以上，具有良好的肌肉靶向性。
表22
Figure BDA0004073158490000453
Figure BDA0004073158490000461
/>
表23注射制剂10-1/10-2后，小鼠体内肌肉原位与肝部位的荧光光强(p/s)
制剂10-1 Liver 制剂10-2 Liver 制剂10-1 Muscle 制剂10-2 Muscle
6h 1.51E+08 8.83E+05 2.96E+08 3.61E+08
24h 2.23E+07 8.66E+05 1.82E+08 4.36E+08
48h 1.93E+06 2.38E+05 7.79E+07 3.71E+08
72h 3.11E+05 2.23E+05 1.64E+07 2.57E+08
根据图11和表23可知，添加了永久性阳离子化合物133的制剂10-2在肝部的表达量显著降低。在任何一个时间点下，制剂10-2保持着明显的肌肉部位的表达荧光值，在肌肉中表达的量都明显高于制剂10-1，同时也明显高于其在肝部位的表达量，具有良好的肌肉靶向性。
综上所述，本发明采用不同的可电离脂质与不同的阳离子脂质组合得到的制剂，均能显著降低药物脱靶至肝脏的量，具有良好的肌肉靶向效果，药物在肌肉原位与肝脏荧光表达的比例可高达上千倍；同时延长了药物在肌肉注射部位的表达时间，在72h内高度表达，120h仍有表达。

Claims (19)

1.一种用于局部注射的脂质纳米颗粒，其包括长效局部递送脂质和可电离脂质，所述脂质纳米颗粒在注射部位发挥作用。
2.权利要求1的脂质纳米颗粒，所述局部注射的部位为肌肉或肿瘤组织，优选为肌肉；
优选地，与不含长效局部递送脂质的脂质纳米颗粒相比，所述脂质纳米颗粒具有更长的作用时间。
3.权利要求1的脂质纳米颗粒，其能够降低在非注射部位的组织或器官的脱靶作用；优选地，所述非注射部位的组织或器官为肝。
4.权利要求1-3任一项的脂质纳米颗粒，包括以下组分：长效局部递送脂质、结构性脂质、聚合物共轭脂质和可电离脂质，以及任选地中性磷脂。
5.权利要求1-4任一项的脂质纳米颗粒，所述长效局部递送脂质为永久性阳离子脂质，优选为pKa>10的永久性阳离子脂质或含有季铵结构的永久性阳离子脂质。
6.权利要求5的脂质纳米颗粒，其中所述永久性阳离子脂质选自式(I)化合物的药学上可接受的盐：
Figure QLYQS_1
其中，
R11和R12独立地选自C6-30烷基、C6-30烯基或C6-30炔基，其任选地被1、2、3、4或5个选自如下的取代基取代：-OH、卤素、氰基、C1-30烷基、C1-30卤代烷基、-O-C1-30烷基、-S-C1-30烷基、氨基、-NH-C1-30烷基和-N(C1-30烷基)2；
R13、R14和R15独立地选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基或C2-6炔基；或者他们中任两个以及他们连接的N原子一起形成4-8元杂环；
n1和n2独立地选自0或1；
优选地，
R11和R12独立地选自C10-25烷基、C10-25烯基或C10-25炔基，其任选地被1、2、3、4或5个选自如下的取代基取代：-OH、卤素、氰基、C1-25烷基、C1-25卤代烷基、-O-C1-25烷基、-S-C1-25烷基、氨基、-NH-C1-25烷基和-N(C1-25烷基)2；
R13、R14和R15独立地选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基或C2-6炔基；或者他们中任两个以及他们连接的N原子一起形成5-6元杂环；
n1和n2独立地选自0或1；
优选地，
R11和R12独立地选自C13-20烷基、C13-20烯基或C13-20炔基，优选选自C13-18烷基、C13-18烯基或C13-18炔基，优选选自C15-18烷基、C15-18烯基或C15-18炔基，例如C17-18烷基、C17-18烯基或C17-18炔基，其任选地被1、2、3、4或5个选自如下的取代基取代：-OH、卤素、氰基、C1-20烷基、C1-20卤代烷基、-O-C1-20烷基、-S-C1-20烷基、氨基、-NH-C1-20烷基和-N(C1-20烷基)2；
R13、R14和R15独立地选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基或C2-6炔基，优选C1-6烷基，例如Me；
n1和n2独立地选自0或1。
7.权利要求5的脂质纳米颗粒，其中所述永久性阳离子脂质选自式(II)化合物的药学上可接受的盐：
Figure QLYQS_2
其中，
R21和R22独立地选自C6-30烷基、C6-30烯基或C6-30炔基，其任选地被1、2、3、4或5个选自如下的取代基取代：-OH、卤素、氰基、C1-30烷基、C1-30卤代烷基、-O-C1-30烷基、-S-C1-30烷基、氨基、-NH-C1-30烷基和-N(C1-30烷基)2；
R23选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基或C2-6炔基，其任选地被1、2或3个R23s取代；
R23s独立地选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、-OC(O)R2a或-C(O)OR2a；
R2a独立地选自H、C1-6烷基或C1-6卤代烷基；
R24、R25和R26独立地选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基或C2-6炔基；或者他们中任两个以及他们连接的N原子一起形成4-8元杂环；
优选地，
R21和R22独立地选自C10-25烷基、C10-25烯基或C10-25炔基，其任选地被1、2、3、4或5个选自如下的取代基取代：-OH、卤素、氰基、C1-25烷基、C1-25卤代烷基、-O-C1-25烷基、-S-C1-25烷基、氨基、-NH-C1-25烷基和-N(C1-25烷基)2；
R23选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基或C2-6炔基，其任选地被1、2或3个R23s取代；
R23s独立地选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、-OC(O)R2a或-C(O)OR2a；
R2a独立地选自H、C1-6烷基或C1-6卤代烷基；
R24、R25和R26独立地选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基或C2-6炔基；或者他们中任两个以及他们连接的N原子一起形成5-6元杂环；
优选地，
R21和R22独立地选自C13-20烷基、C13-20烯基或C13-20炔基，优选选自C13-17烷基、C13-17烯基或C13-17炔基，其任选地被1、2、3、4或5个选自如下的取代基取代：-OH、卤素、氰基、C1-20烷基、C1-20卤代烷基、-O-C1-20烷基、-S-C1-20烷基、氨基、-NH-C1-20烷基和-N(C1-20烷基)2；
R23选自C1-6烷基或C1-6卤代烷基，优选为Me或Et，其任选地被1、2或3个R23s取代；
R23s独立地选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、-OC(O)R2a或-C(O)OR2a，优选选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基或-C(O)OR2a；
R2a独立地选自H、C1-6烷基或C1-6卤代烷基，优选为Et；
R24、R25和R26独立地选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基或C2-6炔基，优选C1-6烷基，例如Me；或者他们中任两个以及他们连接的N原子一起形成5-6元杂环；
优选地，所述永久性阳离子脂质选自如下化合物的药学上可接受的盐：
Figure QLYQS_3
Figure QLYQS_4
8.权利要求5-7中任一项的脂质纳米颗粒，其中所述永久性阳离子脂质选自以下一种或多种：氯化N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵(DOTMA)、氯化N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵(DOTAP)、乙基磷脂酰胆碱(EPC)及其衍生物、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基甲酰胺基)乙基]-3,4-二[油基氧基]-苯甲酰胺(MVL5)、双十八烷基酰胺基-甘氨酰基精四胺(DOGS)、3b-[N-(N′,N′-二甲基氨基乙基)氨甲酰基]胆固醇(DC-Chol)和溴化双十八烷基二甲基铵(DDAB)中的一种或多种；优选选自氯化N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵(DOTMA)、氯化N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵(DOTAP)或乙基磷脂酰胆碱(EPC)及其衍生物中的一种或多种；优选为乙基磷脂酰胆碱(EPC)和/或氯化N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵(DOTAP)。
9.权利要求5-8中任一项的脂质纳米颗粒，其中所述永久性阳离子脂质的摩尔百分含量为>0mol％-30mol％；优选为1.0mol％-25mol％；优选为2.5mol％-20mol％；优选为10mol％-20mol％；更优选为2.5mol％、5mol％、9.4mol％、10mol％或20mol％。
10.权利要求1-9中任一项的脂质纳米颗粒，其中不含中性磷脂。
11.一种脂质纳米颗粒，其包括以下组分：永久性阳离子脂质、结构性脂质、聚合物共轭脂质和可电离脂质，并且不含中性磷脂。
12.权利要求11的脂质纳米颗粒，其中所述永久性阳离子脂质如权利要求6-9任一项所述。
13.权利要求4-12任一项的脂质纳米颗粒，其包括如下摩尔百分比的组分：
可电离脂质30mol％-80mol％；
结构性脂质30mol％-70mol％；
永久性阳离子脂质>0mol％-30mol％；
聚合物共轭脂质>0mol％-5mol％；
优选地，其包括如下摩尔百分比的组分：
可电离脂质35mol％-65mol％；
结构性脂质30mol％-60mol％；
永久性阳离子脂质1mol％-25mol％；
聚合物共轭脂质0.5mol％-3mol％；
优选地，其包括如下摩尔百分比的组分：
可电离脂质40mol％-50mol％；
结构性脂质38.5mol％-53.5mol％；
永久性阳离子脂质2.5mol％-20mol％；
聚合物共轭脂质1.5mol％-2mol％；
优选地，所述永久性阳离子脂质含量为10mol％-20mol％；
优选地，所述结构性脂质脂质含量为38.5mol％-48.5mol％。
14.一种脂质纳米颗粒组合物，其包括权利要求1-13中任一项的脂质纳米颗粒和荷载。
15.权利要求14的脂质纳米颗粒组合物，其中所述荷载选自治疗剂、预防剂或诊断剂中的一种或多种；
优选地，所述治疗剂、预防剂或诊断剂为核酸；
优选地，所述核酸选自ASO、RNA或DNA中的一种或多种；
优选地，所述RNA选自以下一种或多种：干扰RNA(RNAi)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、反义RNA(aRNA)、信使RNA(mRNA)、修饰的信使RNA(mmRNA)、长非编码RNA(lncRNA)、微RNA(miRNA)、小激活RNA(saRNA)、多聚编码核酸(MCNA)、聚合编码核酸(PCNA)、引导RNA(gRNA)、CRISPRRNA(crRNA)和核酶，优选为mRNA，更优选为修饰的mRNA。
16.权利要求14-15中任一项的脂质纳米颗粒组合物的制备方法，包括：将所述各种脂质组分混合，再与荷载混合；
优选地，包括将含有所述各种脂质组分的溶液与含有荷载的溶液混合；
优选地，采用微流控或冲击式射流的方法混合含有所述各种脂质组分的溶液与含有荷载的溶液；
优选地，所述含有脂质组分的溶液中，溶剂为有机溶剂，优选为醇类溶剂，优选为乙醇；
优选地，所述荷载为核酸，使用醋酸钠溶液将其溶解，优选使用20-30mmol/L的醋酸钠溶液。
17.一种药物组合物，其包括权利要求14-15中任一项的脂质纳米颗粒组合物，以及药物上可接受的辅料。
18.权利要求14-15中任一项的脂质纳米颗粒组合物，或权利要求17的药物组合物在制备用于治疗、诊断或预防疾病的药物中的用途。
19.权利要求14-15中任一项的脂质纳米颗粒组合物，或权利要求17的药物组合物在制备递送荷载的药物中的用途，所述荷载选自治疗剂、预防剂或诊断剂中的一种或多种；
优选地，所述治疗剂、预防剂或诊断剂为核酸；
优选地，是在制备在局部递送荷载的药物中的用途；
优选地，是在制备在肌肉或肿瘤中递送荷载的药物中的用途；
更优选地，是在制备在肌肉中递送荷载的药物中的用途。
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