CN117843712A - 一种小肽脂质纳米递送系统及其应用 - Google Patents

一种小肽脂质纳米递送系统及其应用 Download PDF

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CN117843712A CN202211209610.3A CN202211209610A CN117843712A CN 117843712 A CN117843712 A CN 117843712A CN 202211209610 A CN202211209610 A CN 202211209610A CN 117843712 A CN117843712 A CN 117843712A
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田伟伟
文中行
徐健
周诚
秦兵彬
项明
吴军
苏琳瑛
张进
王德玲
杨宪斌
陆阳
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Suno Biomedical Technology Suzhou Co ltd
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Suno Biomedical Technology Suzhou Co ltd
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Abstract

本发明涉及一种小肽脂质纳米递送系统及其应用。形成该小肽脂质纳米递送系统的小肽脂质或其盐的结构为：头部‑连接部‑尾部，头部和连接部分别为单个氨基酸或由2～3个氨基酸形成的小肽；用于形成头部的氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、羟脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸或组氨酸中的一种或多种；用于形成连接部的氨基酸为天冬氨酸、谷氨酸、高谷氨酸或赖氨酸中的一种或多种；尾部数量为1～6条，尾部为碳原子数为5～40的烷/烯基链和/或含有酯键的烷/烯基链；头部和连接部以酰胺键相连；连接部和尾部以酰胺键或酯键相连。本发明能够丰富现有核酸药物递送系统，为使用者提供更多选择，有利于核酸药物的发展。

Description

一种小肽脂质纳米递送系统及其应用
技术领域
本发明属于核酸药物递送系统技术领域，具体涉及一种小肽脂质纳米递送系统及其应用。
背景技术
信使核糖核酸(mRNA)是由DNA转录而来的、携带遗传信息能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。基于mRNA的治疗方法在疫苗、肿瘤免疫治疗等领域被广泛研究。
小干扰核酸(siRNA)药物是一类新兴的新药。是长度20到25个核苷酸的双链RNA。其主要利用RNA干扰(RNAi)现象，以专一性的方式调节靶向基因的表达。2018年以来，陆续已有5个siRNA新药获批上市。
mRNA、siRNA本身成药性很差，因此都强烈依赖于一个递送系统来完成药物的体内递送。一个能有效递送mRNA/siRNA的药物递送系统是该类药物成功上市的关键，也是一直以来的国际研发的热点。
在用于递送mRNA和siRNA的递送系统中，LNP脂质纳米颗粒(Lipid Nanoparticle，LNP) 是研究最多和应用最广泛的，已在多个mRNA疫苗(Pfizer/BioNTech公司，Moderna公司) 和首个siRNA药物(Patisiran,2018,Alnylam公司)中获得上市批准应用。
LNP为多组分的脂质纳米颗粒，其通常由可离子化脂质、中性磷脂辅助脂质、胆固醇及聚乙二醇脂质四种组分经过微流控制剂工艺组装形成，制备工艺成熟。例如图1显示了siRNA 药物(Patisiran，2018)中使用的脂质体递送系统结构。
由于LNP中的关键组分可离子化脂质通常为合成的叔胺氨基脂质，在机体内能引起较大的非特异性免疫反应，因此LNP被开发作为疫苗的递送系统，既能完成递送mRNA的任务，也同时作为免疫增强剂，有效激活机体的免疫反应。但是已报道的合成的叔胺氨基脂质作为免疫增强剂，并不完美，存在多种副反应。已报道的副反应包括红肿，炎症反应(inflammation)，炎症加重反应(inflammation exacerbation)等免疫反应。同时，由于能引起免疫反应，LNP 作为siRNA和治疗作用的mRNA的递送系统也不完美。由于不希望引起免疫反应，因此在给药前需要注射皮质类固醇、对乙酰氨基酚或者抗组胺药物来减缓给药后的炎症反应。
因此，寻找一种生物毒性低、免疫原性低、递送效果好的核酸药物递送系统成为迫切的需要，而开发用于制备小肽脂质纳米递送系统的小肽脂质或其盐成为重中之重。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于制备小肽脂质纳米(LANP,lipid amino acid nanoparticle)递送系统的小肽脂质(LO,lipid oligopeptide)或其盐，使用其制备的小肽脂质纳米递送系统可用于核酸分子的递送，具有生物毒性低、免疫原性低、递送效果好等优点。
本发明的另一目的是提供一种生物毒性低、免疫原性低且递送效果好的小肽脂质纳米递送系统。
本发明的再一目的是提供生物毒性及免疫原性低且递送效率高的核酸药物。
针对上述现有技术的缺陷，本发明采取的技术方案是：
一种小肽脂质或其盐，所述的小肽脂质的结构为：头部-连接部-尾部，其中，所述的头部和连接部分别为单个氨基酸或由2～3个氨基酸通过肽键形成的小肽；用于形成所述的头部的氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、羟脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸或组氨酸中的一种或多种；用于形成所述的连接部的氨基酸为天冬氨酸、谷氨酸、高谷氨酸或赖氨酸中的一种或多种；所述的尾部的数量为1～6条，所述的尾部为碳原子数为5～40的烷/烯基链和/或含有酯键的烷/烯基链；所述的头部和所述的连接部之间通过形成酰胺键相连接；所述的连接部和所述的尾部之间通过形成酰胺键或酯键相连接。
本发明中，所述的氨基酸不限于L型或D型。
优选地，所述的尾部的数量为1～6条，进一步优选为2～4条。
优选地，所述的碳原子数为5～40的碳链为烷基链或烯基链，进一步优选碳原子数为5～30。
优选地，所述的尾部为碳原子数为5～30的直链烷/烯基链或支链烷/烯基链，或碳原子数为5～30的含有一个酯键的直链烷/烯基链或支链烷/烯基链中的一种或多种。
优选地，所述的尾部选自
中的一种或多种。
本发明还提供一种小肽脂质纳米递送系统，所述的小肽脂质纳米递送系统包括所述的小肽脂质或其盐。
优选地，所述的小肽脂质纳米递送系统还包括辅助脂质、胆固醇及其衍生物、PEG化脂质(PEG-Lipid)中的一种或多种。
优选地，所述的辅助脂质选自磷脂及其衍生物。
进一步优选地，所述的辅助脂质选自PC、DPPC、DOPC、DSPC、DOPE、DPPG中的一种或多种。
优选地，所述的PEG-Lipid选自PEG-DMG、PEG-C-DMG、PEG-DSPE中的一种或多种。
进一步优选地，所述的小肽脂质或其盐、辅助脂质、胆固醇及其衍生物和PEG-Lipid的摩尔比为(40～99.5):(0～15):(0～50):(0.5～3)。
本发明还提供一种所述的小肽脂质或其盐或所述的小肽脂质纳米递送系统在制备核酸药物中的应用。
优选地，所述的核酸药物包括mRNA疫苗和具有治疗作用的mRNA、siRNA、反义寡核苷酸(ASO)、微小核酸(miRNA)、小激活核酸(saRNA)、适配体(Aptamer)。
本发明还提供一种核酸药物，所述的核酸药物包括核酸分子和所述的小肽脂质或其盐或所述的小肽脂质纳米递送系统。
优选地，所述的核酸分子包括mRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、saRNA分子、反义寡核苷酸分子或适配体中的一种或多种。
优选地，所述的核酸药物为粒径为50～300nm的小肽脂质纳米颗粒，例如50nm，80nm， 100nm，120nm，150nm，180nm，200nm，220nm，250nm，280nm，300nm。
和/优选地，通过微流控将所述的的核酸分子和所述的小肽脂质或其盐及辅助脂质、胆固醇、PEG化脂质中的一种或多种混合得到所述的核酸药物。
优选地，所述的小肽脂质或其盐和所述的核酸分子的氮磷比(N/P)为(1～50):1。例如 1:1，3:1，5:1，6:1，8:1，10:1，12:1，15:1，18:1，20:1，25:1，30:1，35:1，40:1，45:1，50:1。
本发明的实施，至少具有如下有益效果：
本发明的小肽脂质或其盐制备的小肽脂质纳米递送系统对核酸药物分子包封效果和递送效果可以达到或超过主流纳米脂质体的效果，而生物毒性和免疫原性均较低，能够丰富现有核酸药物的递送系统，为使用者提供更多的选择，有利于核酸药物的发展及应用。
附图说明
图1为脂质纳米颗粒(LNP)的结构示意图；
图2为实施例1、2、7所得化合物对293T细胞的毒性实验结果图。
具体实施方式
为了解决现有核酸分子的递送系统存在组成复杂、制备成本高、生物毒性大、免疫原性强、内涵体逃逸率低等缺点。本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。以下将对该技术方案、实施过程及原理等作进一步的解释说明。
LNP中的可离子化脂质通常是合成的烷基取代的氨基化合物。通过氨基阳离子与负电性的RNA之间的离子作用力覆盖RNA形成脂质层，最终达到递送RNA进入细胞质的效果。其中合成的氨基化合物具有碱性强，毒性大，免疫原性强的缺点。
本发明人创造性的提出采用氨基酸组成的小肽代替合成的氨基化合物。在减弱离子作用力的同时，引入氢键作用力，同样可以将脂质覆盖于RNA分子上，同样形成脂质层，达到递送RNA的效果。
在该想法的支持下，本发明人设计出小肽脂质，采用几个氨基酸形成的小肽与脂质结合，代替了合成的氨基化合物，获得了优异的递送效果。
同时，由于氨基酸/小肽是蛋白质的组成部分，它们没有免疫原性或免疫原性低，而且由于其天然来源，自然具有低毒性的优势。同时氨基酸具有多样性，可以通过排列组合来调节其属性(例如酸碱性，亲脂亲水性等)。因此发明人设想将氨基酸或者小肽的脂质作为递送系统的主要部分，替代高毒性的合成氨类化合物，可以减小或消除递送系统引起的副反应，达到更好的递送RNA的效果。
具体地，本发明的一种小肽脂质或其盐的结构为：头部-连接部-尾部，其中，所述的头部和连接部分别为单个氨基酸或由2～3个氨基酸通过肽键形成的小肽；用于形成所述的头部的氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、羟脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸或组氨酸中的一种或多种；用于形成所述的连接部的氨基酸为天冬氨酸、谷氨酸、高谷氨酸或赖氨酸中的一种或多种；所述的尾部的数量为1～6条，所述的尾部为碳原子数为5～40的烷/烯基链和/或含有酯键的烷/烯基链；所述的头部和所述的连接部之间通过形成酰胺键相连接；所述的连接部和所述的尾部之间通过形成酰胺键或酯键相连接。
本申请的小肽脂质及其盐的通式为：H-L-Tn。
通式中，H(Head)为单个下列氨基酸或者2-3个包含下列氨基酸的通过肽键形成的小肽，氨基酸为：D或L构型的甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、羟脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸或组氨酸。
L(Linker)为下列氨基酸或者2-3个下列氨基酸通过肽键形成的小肽，氨基酸为：D或L 构型的天冬氨酸、谷氨酸、高谷氨酸及赖氨酸。
T(Tail)为1-6条脂质(n＝1-6)。该脂质为碳原子数为5～40的烷/烯基链和/或含有酯键的烷/烯基链。
Head和Linker之间通过酰胺键连接。
Linker和Tail之间通过一个或多个酰胺键或者酯键连接。
在一些优选地实施例中，Tail为
中的一种或多种。
实验发现，某些Head、linker和Tail脂质的合理组合可以实现好的递送效果，其递送荧光mRNA的效果可以达到或超过主流LNP的效果。且所有小肽脂质类化合物的生物毒性较低。
下面结合具体实施例和对比例进一步阐述本发明的技术方案和技术效果。
在没有特别说明的情况下，以下实施例中使用的原料等通过市售获得。
在没有特别说明的情况下，以下实施例中涉及到的室温(RT)指20～35℃，以下实施例中涉及到的洗脱液的比例为体积比。
以下实施例和对比例中涉及名称缩写中“C17”和“C17”等同，均表示含有17个碳原子的链。
在没有特别说明的情况下，以下实施例中涉及的实验方法或测试方法采用本领域中常规的方法。
合成实施例
实施例1.Ser-Glu-(C17)2
在N2保护下，于25mL反应瓶中加入9-Heptadecanol(600mg,2.34mmol)， Boc-L-Glutamine(579mg，2.34mmol)，DCC(965mg,4.68mmol)，DMAP(400mg,3.28mmol) 及20mLDCM，50℃水浴加热，LC-MS跟踪反应，22h后停止反应。将反应混合物过滤，除去生成的白色沉淀，用25mL DCM洗涤，浓缩滤液，所得粗品用硅胶柱纯化，洗脱剂PE/EA ＝30:1，得576mg淡黄绿色油状物Boc-Glu-(C17)2，产率68％。
在N2保护下，将Boc-Glu-(C17)2(576mg,1.59mmol)溶于6mL DCM，接着加入三氟乙酸(TFA,1.5mL)。室温反应，LC-MS跟踪反应，2h后停止反应。将反应液转移至分液漏斗，加入40mL DCM，并用饱和NaHCO3水溶液将有机层调至弱碱性，分离有机层，水层用 DCM萃取两次，合并有机层并用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用硅胶柱纯化，洗脱剂 PE/EA＝20:1。得433mg无色油状物Glu-(C17)2，产率为97％。
Rf＝0.4(PE/EA＝10/1)
ESI:m/z＝624.69[M+H]+
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.88(dp,J＝12.5,6.2Hz,2H),3.44(dd,J＝8.4,5.0Hz,1H), 2.44(t,J＝7.6Hz,2H),2.08(dtd,J＝13.0,7.8,5.0Hz,1H),1.88–1.75(m,1H),1.51(dt,J＝12.3, 6.3Hz,8H),1.34–1.17(m,48H),0.87(t,J＝6.8Hz,12H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ175.48,173.07,77.36,75.44,74.66,54.13,34.23,34.17,32.01, 32.00,31.15,30.07,29.69,29.65,29.62,29.40,25.46,25.45,22.80,14.24.
在N2保护下，于10mL反应瓶中加入Glu-(C17)2(200mg,0.32mmol)，Boc-Serine(Boc-L- 丝氨酸,99mg,0.48mmol)，HOBt(48mg,0.35mmol)及DCM/MeOH(4mL/0.7mL)，冰水浴10min后，缓慢滴加1mL含EDCI(130mg,0.51mmol)的DCM溶液，0℃继续反应1h后，升至室温，LC-MS跟踪反应，22h后停止反应。将反应液浓缩，所得粗品用硅胶柱纯化，洗脱剂PE/EA＝6:1，得274mg无色油状粗品Boc-Ser-Glu-(C17)2。在N2保护下，将所得粗品溶于6mL DCM，接着加入三氟乙酸(1.5mL)。室温反应，LC-MS跟踪反应，2h后停止反应。将反应液转移至分液漏斗，加入40mL DCM，并用饱和NaHCO3水溶液将有机层调至弱碱性，分离有机层，水层用DCM萃取两次，合并有机层并用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用硅胶柱纯化，洗脱剂PE/EA＝1:1。得118mg无色油状物Ser-Glu-(C17)2，两步产率为52％。
Rf＝0.3(PE/EA＝1:2)
ESI:m/z＝711.81[M+H]+
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.87(dd,J＝11.7,8.3Hz,1H),4.96–4.77(m,2H), 4.57(qd,J＝8.3,4.7Hz,1H),3.88(ddd,J＝10.9,8.3,4.7Hz,1H),3.69(ddd,J＝10.9,5.6,2.7Hz, 1H),3.54–3.41(m,1H),2.46–2.31(m,2H),2.25(tdd,J＝20.1,9.1,5.3Hz,1H),2.05–1.90(m, 1H),1.61–1.44(m,8H),1.25(s,48H),0.87(t,J＝6.7Hz,12H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ174.21,173.93,172.71,172.53,171.74,171.69,77.36,76.53, 76.46,75.16,75.08,56.09,55.95,52.01,51.92,34.14,34.11,34.07,34.05,33.99,31.99,29.69, 29.63,29.59,29.40,29.38,25.43,25.38,25.35,22.79,14.23.
实施例2.
Ser-Asp-(C17)2
在N2保护下，于25mL反应瓶中加入9-Heptadecanol(600mg,2.34mmol)， Boc-L-Asp-OH(546mg,2.34mmol)，DCC(966mg,4.68mmol)，DMAP(400mg,3.28mmol) 及20mL DCM，40℃水浴加热，TLC跟踪反应，21h后停止反应。将反应混合物过滤，除去生成的白色沉淀，用25mL DCM洗涤，浓缩所得滤液，所得粗品用硅胶柱纯化，洗脱剂 PE/EA＝40:1，得585mg无色油状物Boc-Asp-(C17)2，产率70％。
在N2保护下，将Boc-Asp-(C17)2(556mg,1.57mmol)溶于10mL DCM，接着加入三氟乙酸(2.5mL)。室温反应，LC-MS跟踪反应，2h后停止反应。将反应液转移至分液漏斗，加入40mLDCM，并用饱和NaHCO3水溶液将有机层调至弱碱性，分离有机层，水层用DCM 萃取两次，合并有机层并用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用硅胶柱纯化，洗脱剂PE/EA ＝30:1。得455mg淡黄色油状物Asp-(C17)2，产率为95％。
Rf＝0.4(PE/EA＝10:1)
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.89(h,J＝6.0Hz,2H),3.78(dd,J＝7.7,4.4Hz,1H),2.79(dd, J＝16.4,4.4Hz,1H),2.63(dd,J＝16.4,7.7Hz,1H),1.51(q,J＝6.1Hz,8H),1.25(s,48H),0.87 (t,J＝6.7Hz,12H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ174.13,171.16,75.74,75.27,51.57,39.35,34.16,34.11,32.00, 29.70,29.68,29.66,29.64,29.62,29.40,29.38,25.46,25.44,25.39,22.80,14.23.
在N2保护下，于10mL反应瓶中加入Asp-(C17)2(300mg,0.5mmol)，Boc-Serine(152mg, 0.75mmol)，HOBt(133mg,1.0mmol)及DCM/MeOH(3mL/0.7mL)，冰浴10min后，缓慢滴加2mL含EDCI(189mg,1.0mmol)的DCM溶液，0℃继续反应1h后，升至室温继续反应，TLC跟踪反应，16h后停止反应。将反应液浓缩，所得粗品用硅胶柱纯化，洗脱剂PE/EA ＝8:1,得355mg无色油状粗品Boc-Ser-Asp-(C17)2。在N2保护下，将所得粗品325mg溶于 8mL DCM，接着加入三氟乙酸(2mL)。室温反应,TLC跟踪反应，1.5h后停止反应。将反应液转移至分液漏斗，加入40mL DCM，并用饱和NaHCO3水溶液将有机层调至弱碱性，分离有机层，水层用DCM萃取两次，合并有机层并用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用硅胶柱纯化，洗脱剂PE/EA＝3:1。得239mg无色油状物Ser-Asp-(C17)2，两步产率为77％。
化合物Ser-Asp-(C17)2的表征数据如下：
Rf＝0.4(PE/EA＝10:1)
ESI-MS:m/z＝697.70[M+H]+
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.12(dd,J＝59.3,8.6Hz,1H),4.87(dq,J＝12.4,6.1Hz,2H), 4.79(dt,J＝9.1,4.7Hz,1H),3.86(ddd,J＝18.4,10.9,4.8Hz,1H),3.68(ddd,J＝10.6,5.7,3.7 Hz,1H),3.46(q,J＝5.1Hz,1H),2.98(ddd,J＝17.3,13.1,4.8Hz,1H),2.81(ddd,J＝16.9,7.5, 4.7Hz,1H),2.01(d,J＝18.9Hz,2H),1.51(dd,J＝12.4,6.3Hz,8H),1.25(s,48H),0.87(t,J＝ 6.7Hz,12H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ174.23,174.01,170.63,170.58,170.55,170.50,77.36,75.85, 75.82,65.82,65.71,56.12,56.03,48.79,48.65,36.56,36.31,34.03,34.00,33.89,32.01,31.99, 29.73,29.67,29.64,29.62,29.60,29.42,29.39,25.46,25.42,25.31,25.28,22.79,14.22.
实施例3.
Ser-N-Ser-Asp-(C17)2
在N2保护下，于10mL反应瓶中加入Ser-Asp-(C17)2(136mg,0.2mmol)，Boc-Serine(60 mg,0.3mmol)，HOBt(75mg,0.4mmol)及DCM/MeOH(2mL/0.4mL)，冰浴10min后，缓慢滴加1mL含EDCI(75mg,0.4mmol)的DCM溶液，0℃继续反应1h后，升至室温,TLC 跟踪反应，22h后停止反应。将反应液浓缩，所得粗品用硅胶柱纯化，洗脱剂PE/EA＝1.5/1，得206mg白色固体粗品Boc-Ser-N-Ser-Asp-(C17)2。在N2保护下，将所得粗品溶于6mL DCM，接着加入三氟乙酸(1.5mL)。室温反应，TLC跟踪反应，2h后停止反应。浓缩反应液，用DCM溶解转移至分液漏斗，加入40mLDCM，并用饱和NaHCO3水溶液将有机层调至弱碱性，分离有机层，水层用DCM萃取两次，合并有机层并用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用硅胶柱纯化，洗脱剂PE/EA＝2:1。得58.5mg白色固体Ser-N-Ser-Asp-(C17)2，两步产率为38％。
Rf＝0.5(PE/EA＝1:1)
ESI-MS:m/z＝785.82[M+H]+
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.72–7.42(m,3H),4.83(ddt,J＝15.3,11.2,6.1Hz,3H),4.73 –4.54(m,2H),4.19–3.97(m,3H),3.84–3.66(m,2H),3.53(s,1H),2.96(dt,J＝17.2,4.7Hz, 1H),2.82(ddd,J＝16.8,12.0,4.5Hz,1H),1.57–1.44(m,8H),1.25(s,48H),0.87(t,J＝6.7Hz, 12H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ171.29,171.10,170.77,170.58,170.45,169.63,169.41, 117.19,114.33,77.61,77.55,77.36,76.52,62.59,62.27,55.32,54.84,54.45,54.26,49.30,48.96, 36.14,36.05,33.86,33.79,33.75,32.00,31.98,29.75,29.72,29.69,29.65,29.61,29.57,29.43, 29.39,25.43,25.41,25.35,25.28,25.24,22.80,22.78,14.21.
实施例4.
D-Ser-D-Glu-(C17)2
在N2保护下，于100mL反应瓶中加入9-Heptadecanol(1.5g,5.85mmol)，Boc-D-Glu-OH (1.45g,5.85mmol)，DCC(2.41g,11.7mmol)，DMAP(1g,8.19mmol)及40mL DCM，50℃水浴加热，LC-MS跟踪反应，18h后停止反应。
将反应混合物过滤，除去生成的白色沉淀，用25mL DCM洗涤，浓缩所得滤液，所得粗品未经纯化，直接用于下一步反应。在N2保护下，将Boc-D-Glu-(C17)2粗品溶于36mL DCM，接着加入三氟乙酸(9mL)。室温反应，LC-MS跟踪反应，2h后停止反应。将反应液浓缩后，加入30mLDCM及5mL三乙胺，调节pH至弱碱性。减压处去溶剂及多余的三乙胺，所得粗品用硅胶柱纯化，洗脱剂PE/EA＝20:1。得779mg无色油状物D-Glu-(C17)2，两步产率为43％。
Rf＝0.4(PE/EA＝10:1)
ESI-MS:m/z＝624.79[M+H]+
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.96–4.78(m,2H),3.43(dd,J＝8.4,5.0Hz,1H),2.44(t,J＝ 7.6Hz,2H),2.08(dtd,J＝12.9,7.7,4.9Hz,1H),1.81(dq,J＝15.0,7.8Hz,1H),1.62–1.43(m, 12H),1.25(s,52H),0.87(t,J＝6.7Hz,12H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ175.57,173.06,75.40,74.64,54.15,34.24,34.18,32.00, 31.99,31.16,30.14,29.73,29.69,29.65,29.61,29.40,25.46,22.80,14.23.
在N2保护下，于25mL反应瓶中加入D-Glu-(C17)2(200mg,0.32mmol)，Boc-D-Serine(99mg,0.48mmol)，TMP(85μL,0.64mmol)及DMF(3mL)，冰浴10min后，缓慢滴加3mL 含HATU(244mg,0.64mmol)的DMF溶液，缓慢升至室温，LC-MS跟踪反应，22h后停止反应。
将反应液浓缩，所得粗品溶于10mL DCM，接着加入三氟乙酸(2.5mL)。室温反应,LC-MS跟踪反应，2h后停止反应。将反应液转移至分液漏斗，加入40mL DCM，并用饱和NaHCO3水溶液将有机层调至弱碱性，分离有机层，水层用DCM萃取两次，合并有机层并用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用硅胶柱纯化，洗脱剂PE/EA＝1:1。得123mg淡黄色油状物D-Ser-D-Glu-(C17)2，两步产率为54％。
Rf＝0.4(PE/EA＝1:3)
ESI-MS:m/z＝711.51[M+H]+
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.86(t,J＝9.0Hz,1H),4.96–4.77(m,2H),4.57(qd,J＝8.4, 4.6Hz,1H),3.88(td,J＝9.6,8.3,4.6Hz,1H),3.73–3.62(m,1H),3.46(q,J＝5.6Hz,1H),2.47– 2.16(m,3H),2.12–1.90(m,3H),1.51(dt,J＝12.9,6.5Hz,8H),1.25(s,52H),0.87(t,J＝6.7Hz, 12H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ174.05,172.71,171.70,76.46,75.17,65.59,56.11,51.91, 34.14,34.11,34.07,34.00,31.99,29.69,29.63,29.59,29.40,29.37,25.43,25.38,25.35,22.79, 14.22.
实施例5.Ser-Glu-N(C17)2
在N2保护下，于100mL反应瓶中加入9-Heptadecanamine(1.55g,6.06mmol)， Boc-L-Glu-OH(500mg,2.02mmol)，TMP(1.07mL,8.08mmol)及40mL DMF，0℃搅拌20min 后加入40mL溶有HATU(3.08g,8.08mmol)的DMF溶液，0℃搅拌，自然升至室温，42h 后停止反应。
将反应液用50mL乙酸乙酯稀释，然后用1M HCl(aq),饱和NaHCO3(aq)及饱和食盐水依次洗涤并浓缩后得粗品Boc-Glu-N(C17)2。在N2保护下，将所得粗品溶于16mL DCM，接着加入三氟乙酸(4mL)。室温反应,TLC跟踪反应，2h后停止反应。
将反应液转移至分液漏斗，加入50mL DCM，并用饱和NaHCO3水溶液将有机层调至弱碱性，分离有机层，水层用DCM萃取两次，合并有机层并用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用硅胶柱纯化，洗脱剂DCM/MeOH＝80:1。得337mg白色粉末Glu-N(C17)2，两步产率为27％。
Rf＝0.5(DCM/MeOH＝20:1)
ESI-MS:m/z＝622.79[M+H]+
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.05(d,J＝9.3Hz,1H),5.86(d,J＝9.0Hz,1H),3.84(ddq,J ＝14.7,7.7,5.2,3.7Hz,2H),3.46(t,J＝6.6Hz,1H),2.34(td,J＝6.8,6.4,3.1Hz,5H),1.95(tt,J＝ 14.5,7.1Hz,2H),1.46(q,J＝6.6Hz,4H),1.39–1.15(m,53H),0.87(t,J＝6.7Hz,12H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ173.73,172.54,54.40,49.68,49.28,35.21,35.19,33.56,32.01, 31.59,29.74,29.73,29.70,29.68,29.42,26.06,22.80,14.22.
在N2保护下，于25mL反应瓶中加入Glu-N(C17)2(300mg,0.48mmol)，Boc-Serine(149 mg,0.72mmol)，TMP(128μL,0.96mmol)及DMF(10mL)，冰浴10min后，缓慢滴加10mL 含HATU(367mg,0.96mmol)的DMF溶液，缓慢升至室温，LC-MS跟踪反应，18h后停止反应。
将反应液转移至分液漏斗，加入50mL DCM，并用饱和NaHCO3水溶液将有机层调至弱碱性，分离有机层，水层用DCM萃取两次，合并有机层并用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得粗品溶于10mL DCM，接着加入三氟乙酸(2.5mL)。室温反应，LC-MS跟踪反应，2h 后停止反应。将反应液转移至分液漏斗，加入40mL DCM，并用饱和NaHCO3水溶液将有机层调至弱碱性，分离有机层，水层用DCM萃取两次，合并有机层并用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用硅胶柱纯化，洗脱剂DCM/MeOH＝20:1。得64mg白色粉末 Ser-Glu-N(C17)2，两步产率为19％。
Rf＝0.3(DCM/MeOH＝20:1)
ESI-MS:m/z＝709.71[M+H]+
1H NMR(400MHz,CDCl3+CD3OD)δ4.20(dt,J＝9.0,3.7Hz,1H),3.76(s,2H),3.69–3.60 (m,2H),3.50(td,J＝10.5,8.8,4.6Hz,1H),3.31(d,J＝5.2Hz,1H),2.18–2.05(m,2H),1.98(ddt, J＝11.5,8.3,4.4Hz,1H),1.83–1.65(m,1H),1.43–1.29(m,4H),1.14(d,J＝10.6Hz,52H), 0.74(dd,J＝7.8,5.3Hz,12H).
13C NMR(100MHz,CDCl3+CD3OD)δ173.82,172.91,171.25,64.54,56.19,52.71,34.77, 34.73,34.67,32.52,31.75,29.51,29.46,29.42,29.19,28.95,25.86,25.83,25.80,22.52,13.84.
实施例6.Ser-Glu-(Lin)2
在N2保护下，于25mL反应瓶中加入Linolyl alcohol(860mg,3.23mmol)，Boc-L-Glu-OH (798mg,3.23mmol)，DCC(1.33g,6.46mmol)，DMAP(552mg,4.52mmol)及20mL DCM，室温搅拌，TLC跟踪反应，18h后停止反应。将反应混合物过滤，除去生成的白色沉淀，用 25mLDCM洗涤,浓缩所得滤液，所得粗品未经纯化直接投入下一步。
在N2保护下，将Boc-Glu-(Lin)2粗品溶于20mL DCM，接着加入三氟乙酸(5mL)。室温反应,LC-MS跟踪反应，2h后停止反应。将反应液转移至分液漏斗，加入40mL DCM，并用饱和NaHCO3水溶液将有机层调至弱碱性，分离有机层，水层用DCM萃取两次，合并有机层并用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用硅胶柱纯化，洗脱剂DCM/MeOH＝100:1。得350.7mg淡黄色油状物Glu-(Lin)2，纯度不高。
在N2保护下，于25mL反应瓶中加入Glu-(Lin)2(330mg,0.5mmol)，Boc-Serine(158mg, 0.75mmol)，TMP(0.14mL,1.0mmol)及DMF(5mL)，冰浴10min后，缓慢滴加5mL含HATU(390mg,1.0mmol)的DMF溶液，0℃继续反应，缓慢升至室温,TLC跟踪反应，24h 后停止反应。
将反应液用50mL乙酸乙酯稀释，然后用1M HCl(aq),饱和NaHCO3(aq)及饱和食盐水依次洗涤并浓缩后得淡黄色油状粗品Boc-Ser-Glu-(Lin)2。在N2保护下，将所得粗品溶于10mL DCM，接着加入三氟乙酸(2.5mL)。室温反应，TLC跟踪反应，2h后停止反应。
将反应液转移至分液漏斗，加入40mL DCM，并用饱和NaHCO3水溶液将有机层调至弱碱性，分离有机层，水层用DCM萃取两次，合并有机层并用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用硅胶柱纯化，洗脱剂DCM/MeOH＝50/1。得86mg淡黄色油状物Ser-Glu-(Lin)2，四步总产率为7％。
Rf＝0.5(DCM/MeOH＝15:1)
ESI-MS:m/z＝731.61[M+H]+
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.88(d,J＝8.3Hz,1H),5.45–5.24(m,8H),4.59(td,J＝8.2, 4.8Hz,1H),4.13(t,J＝6.8Hz,2H),4.06(t,J＝6.8Hz,2H),3.90(dd,J＝10.9,4.6Hz,1H),3.68 (dd,J＝10.9,5.4Hz,1H),3.46(t,J＝5.1Hz,1H),2.77(t,J＝6.5Hz,4H),2.38(td,J＝7.2,6.8, 4.2Hz,2H),2.29–2.15(m,1H),2.04(q,J＝7.0Hz,9H),1.62(dp,J＝13.5,6.8Hz,4H),1.42– 1.24(m,34H),0.88(t,J＝6.7Hz,6H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ174.02,173.04,171.94,130.35,130.20,130.18,128.19, 128.06,77.36,65.98,65.47,65.17,56.14,51.76,31.66,30.58,29.78,29.56,29.54,29.48,29.37, 29.31,28.71,28.64,27.44,27.35,26.02,25.93,25.77,22.70,14.18.
实施例7.Ser-Glu-(C25)2
称取8-Hydroxyoctanoic acid(5.4g,33.7mmol),溶于50mL DCM中。接着加入DHP(3.4 g，40.4mmol)和TsOH(20mg,0.12mmol)，室温下搅拌两小时。TLC监测反应，反应结束后，加入DCM稀释。然后用饱和NaHCO3溶液洗两次，饱和食盐水一次，有机相经无水硫酸钠干燥后，减压浓缩得到粗品。粗品经硅胶柱纯化(PE/EA＝10:1)得到6g无色油状产物8-OTHP-octanoic acid，收率72％。
称取8-OTHP-octanoic acid(6g,24.6mmol)和9-Heptadecanol(2.4g,24.6mmol)，溶于50mL DCM中。接着加入EDCI(5g,39.4mmol)，DMAP(400mg,4.9mmol)和DIPEA (5.28g,61.5mmol)，室温下搅拌过夜。TLC监测反应，反应结束后，加入DCM稀释。然后水洗两次，饱和食盐水一次，有机相经无水硫酸钠干燥后，减压浓缩得到粗品。粗品经柱纯化(PE/EA＝50:1)得到5.1g无色油状物9-Heptadecan-8-(OTHP)octanoate，收率64％。
称取9-Heptadecan-8-(OTHP)octanoate(3g,6.2mmol)溶于30mL(MeOH/DCM＝1:10)，然后加入TsOH(267mg,1.55mmol)，室温搅拌过夜，TLC监测。反应完成后，DCM稀释，水洗涤1次，饱和NaHCO3溶液2次，饱和食盐水1次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩。粗品经硅胶柱纯化(PE/EA＝10:1)得到1.95g无色油状物9-Heptadecan-8-hydroxyoctanoate，收率 92％。
Rf＝0.2(PE/EA＝10:1)
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.89-4.83(m,1H),3.63(t,J＝6.8Hz,2H),2.27(t,J＝7.6Hz, 2H),1.64-1.49(m,10H),1.38-1.33(m,6H),1.25(s,23H),0.87(t,J＝6.8Hz,6H).
称取Boc-Glu-OH(155mg,0.63mmol)，悬浮于10mL DCM中。将该悬浮液置于冰浴后，加入9-Heptadecan-8-hydroxyoctanoate(0.5g，1.26mmol),最后分别加入DCC(0.29g,1.38mmol)和DMAP(0.16g，1.58mmol)，在冰浴下搅拌半小时，缓慢升至室温，搅拌过夜。TLC监测反应，反应结束后，将悬浮液过滤，滤液减压浓缩得到粗品。粗品经硅胶柱纯化(PE/EA＝20:1)得0.51g无色油状物Boc-Glu-(C25)2，收率80％。
将Boc-Glu-(C25)2(0.51g，0.51mmol)溶于4mL DCM中，随后加入2mL三氟乙酸，室温下搅拌1h。TLC监控反应，反应结束后，减压浓缩得粗品Glu-(C25)2.TFA。
将上述Glu-(C25)2.TFA，Boc-Ser-OH(256mg，1.24mmol)和DIPEA(0.22mL，1.51.24mmol)溶于10mL DMF中。该反应液置于冰浴，加入HOBt(124mg，0.91mmol),搅拌 10min后，加入EDCI(176mg，0.91mmol)。缓慢升至室温，搅拌过夜。TLC监测反应，反应完成后，EA稀释，1NHCl溶液洗涤1次，饱和NaHCO3溶液洗涤2次，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩。粗品经硅胶柱纯化(PE/EA＝5:1)得0.42g的无色油状物Boc-Ser-Glu-(C25)2，收率45％。
将Boc-Ser-Glu-(C25)2(0.42g，0.38mmol)溶于4mL DCM中，随后加入2mL三氟乙酸，室温下搅拌1h。TLC监控反应，反应结束后，DCM稀释，饱和NaHCO3溶液洗涤2次，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩。粗品经硅胶柱纯化(DCM/MeOH＝50:1) 到0.24g无色油状物Ser-Glu-(C25)2，收率63％。
Rf＝0.2(DCM/MeOH＝50:1),
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.88(d,J＝8.4Hz,1H),4.89-4.82(m,2H),4.63-4.57(m,1H), 4.15-4.11(m,2H),4.06(t,J＝10.8Hz,2H),3.93-3.89(m,1H),3.70-3.66(m,1H),3.46(t,J＝5.2 Hz,1H),2.41-2.36(m,2H),2.29-2.23(m,5H),2.02-1.97(m,1H),1.64-1.60(m,10H),1.51-1.49 (m,8H),1.33(s,14H),1.25(s,46H).
实施例8.Ser-Asp-(C25)2
在N2保护下，于50mL反应瓶中加入9-Heptadecan-8-hydroxyoctanoate(1.22g,3.06 mmol)，Boc-L-Asp-OH(714mg,3.06mmol)，DCC(1.26g,6.12mmol)，DMAP(524mg,4.28mmol)及20mL DCM，室温搅拌，TLC跟踪反应，24h后停止反应。将反应混合物过滤，除去生成的白色沉淀，用25mL DCM洗涤,浓缩所得滤液，所得粗品未经纯化直接投入下一步。
在N2保护下，将Boc-Asp-(C25)2粗品溶于8mL DCM，接着加入三氟乙酸(2mL)。室温反应,LC-MS跟踪反应，2h后停止反应。将反应液转移至分液漏斗，加入40mL DCM，并用饱和NaHCO3水溶液将有机层调至弱碱性，分离有机层，水层用DCM萃取两次，合并有机层并用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用硅胶柱纯化，洗脱剂DCM/MeOH＝50:1。得468mg淡黄色油状物Asp-(C25)2，两步产率为17％。
Rf＝0.7(PE/EA＝2:1)
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.85(p,J＝6.3Hz,2H),4.09(dt,J＝13.3,6.8Hz,4H),3.80 (dd,J＝7.4,4.6Hz,1H),2.82–2.62(m,2H),2.27(t,J＝7.5Hz,4H),1.62(q,J＝7.1Hz,9H), 1.49(q,J＝6.2Hz,10H),1.28(d,J＝29.0Hz,68H),0.87(t,J＝6.7Hz,12H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ174.34,173.68,173.66,171.39,74.29,65.51,65.04,51.41, 39.11,34.77,34.76,34.28,31.99,29.66,29.63,29.36,29.17,29.05,29.04,28.66,28.64,25.87, 25.82,25.45,25.17,22.79,14.22.
在N2保护下，于10mL反应瓶中加入Asp-(C25)2(150mg,0.17mmol)，Boc-Ser-OH(52mg,0.26mmol)，TMP(45μL,0.34mmol)及DMF(5mL)，冰浴10min后，缓慢滴加5mL含 HATU(128mg,0.34mmol)的DMF溶液，0℃继续反应，缓慢升至室温,TLC跟踪反应，21h 后停止反应。
将反应液用50mL乙酸乙酯稀释，然后用1M HCl(aq),饱和NaHCO3(aq)及饱和食盐水依次洗涤并浓缩后得淡黄色油状粗品Boc-Ser-Asp-(C25)2。在N2保护下，将所得粗品溶于10mL DCM，接着加入三氟乙酸(2.5mL)。室温反应,TLC跟踪反应，2h后停止反应。
将反应液转移至分液漏斗，加入40mL DCM，并用饱和NaHCO3水溶液将有机层调至弱碱性，分离有机层，水层用DCM萃取两次，合并有机层并用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用硅胶柱纯化，洗脱剂PE/EA＝1:8。得33mg淡黄色油状物Ser-Asp-(C25)2，两步产率为20％。
Rf＝0.3(PE/EA＝1:10)
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.09(d,J＝8.4Hz,1H),4.94–4.77(m,3H),4.13(q,J＝6.4Hz,2H),4.07(t,J＝6.8Hz,2H),3.86(dd,J＝10.9,5.0Hz,1H),3.73(dd,J＝11.0,5.4Hz,1H), 3.55(d,J＝5.3Hz,1H),2.97(dd,J＝16.7,5.3Hz,1H),2.84(dd,J＝16.7,4.7Hz,1H),2.27(t,J＝ 7.5Hz,4H),1.61(p,J＝7.0Hz,8H),1.50(q,J＝6.2Hz,8H),1.29(d,J＝29.2Hz,68H),0.87(t,J ＝6.7Hz,12H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ173.64,173.59,170.87,170.60,77.22,74.24,74.21,66.00, 65.27,55.96,48.62,36.39,34.63,34.13,31.86,29.70,29.53,29.50,29.32,29.23,29.04,28.92, 28.86,28.48,28.41,25.70,25.61,25.32,25.01,22.66,14.10.
实施例9.Thr-Asp-(C25)2
在N2保护下，于10mL反应瓶中加入Asp-(C25)2(150mg,0.17mmol)，Boc-Thr-OH(55mg,0.26mmol)，TMP(45μL,0.34mmol)及DMF(5mL)，冰浴10min后，缓慢滴加5mL含 HATU(128mg,0.34mmol)的DMF溶液，0℃继续反应，缓慢升至室温，TLC跟踪反应，21h 后停止反应。
将反应液用50mL乙酸乙酯稀释，然后用1N HCl(aq)，饱和NaHCO3(aq)及饱和食盐水依次洗涤并浓缩后得淡黄色油状粗品Boc-Thr-Asp-(C25)2。在N2保护下，将所得粗品溶于10 mLDCM，接着加入三氟乙酸(2.5mL)。室温反应,TLC跟踪反应，2h后停止反应。
将反应液转移至分液漏斗，加入40mL DCM，并用饱和NaHCO3水溶液将有机层调至弱碱性，分离有机层，水层用DCM萃取两次，合并有机层并用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用硅胶柱纯化，洗脱剂PE/EA＝1:7。得50mg淡黄色油状物Thr-Asp-(C25)2，两步产率为30％。
Rf＝0.3(PE/EA＝1:8)
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.10(d,J＝8.4Hz,1H),4.85(p,J＝6.1Hz,3H),4.22(qd,J＝ 6.4,3.2Hz,1H),4.14(t,J＝6.7Hz,2H),4.06(t,J＝6.7Hz,2H),3.30(d,J＝3.5Hz,1H),2.95(dd, J＝16.5,5.5Hz,1H),2.86(dd,J＝16.5,4.6Hz,1H),2.27(t,J＝7.5Hz,4H),1.68–1.55(m,9H), 1.55–1.43(m,9H),1.29(d,J＝28.6Hz,71H),0.87(t,J＝6.8Hz,12H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ173.74,173.70,171.06,170.72,77.36,74.34,68.38,66.11, 65.43,59.86,48.80,36.64,34.76,34.27,32.00,29.83,29.67,29.64,29.37,29.17,29.05,29.00, 28.60,28.55,25.83,25.74,25.46,25.15,22.80,18.92,14.23.
实施例10.Met-Asp-(C25)2
在N2保护下，于10mL反应瓶中加入Asp-(C25)2(150mg,0.17mmol)，Boc-Met-OH(63mg,0.26mmol)，TMP(45μL,0.34mmol)及DMF(5mL)，冰浴10min后，缓慢滴加5mL含 HATU(128mg,0.34mmol)的DMF溶液，0℃继续反应，缓慢升至室温，TLC跟踪反应，21h 后停止反应。
将反应液用50mL乙酸乙酯稀释，然后用1N HCl(aq)，饱和NaHCO3(aq)及饱和食盐水依次洗涤并浓缩后得淡黄色油状粗品Boc-Met-Asp-(C25)2。在N2保护下，将所得粗品溶于10 mL DCM，接着加入三氟乙酸(2.5mL)。室温反应，TLC跟踪反应，2h后停止反应。
将反应液转移至分液漏斗，加入40mL DCM，并用饱和NaHCO3水溶液将有机层调至弱碱性，分离有机层，水层用DCM萃取两次，合并有机层并用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用硅胶柱纯化，洗脱剂PE/EA＝1:3。得84mg淡黄色油状物Met-Asp-(C25)2，两步产率为49％。
Rf＝0.6(PE/EA＝1:6)
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.97(d,J＝8.4Hz,1H),4.92–4.75(m,3H),4.13(t,J＝6.8Hz,2H),4.06(t,J＝6.8Hz,2H),3.54(dd,J＝8.0,4.8Hz,1H),3.00(dd,J＝16.9,4.8Hz,1H), 2.81(dd,J＝17.0,4.7Hz,1H),2.64–2.56(m,2H),2.27(t,J＝7.5Hz,5H),2.11(d,J＝6.0Hz, 4H),1.78(dd,J＝14.3,7.2Hz,1H),1.71–1.55(m,14H),1.49(q,J＝6.2Hz,10H),1.28(d,J＝ 29.1Hz,68H),0.87(t,J＝6.8Hz,12H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ174.55,173.54,170.85,170.69,77.23,74.18,65.84,65.15, 54.13,48.40,36.43,34.63,34.14,34.10,31.86,30.47,29.53,29.50,29.23,29.05,29.04,28.94, 28.87,28.50,28.42,25.72,25.62,25.32,25.04,22.66,15.26,14.09.
实施例11.Ser-Lys-(C17)(NC16)
称取Boc-Fmoc-Lys-OH(0.5g,1.07mmol)，悬浮于10mL DCM中。将该悬浮液置于冰水浴后，滴入10mL含9-Heptadecanol(0.26g，1.07mmol)的DCM溶液。最后分别加入DCC(0.24g，1.18mmol)和DMAP(0.17g，1.39mmol)的DCM溶液，在0℃搅拌半小时，缓慢升至室温，随后搅拌过夜。TLC监测反应，反应结束后，将悬浮液过滤，滤液减压浓缩得到粗品。粗品经硅胶柱纯化(PE/EA＝20/1)得0.53g无色油状Boc-Fmoc-Lys-C17，收率 73％。
将Boc-Fmoc-Lys-C17溶于4mL DMF中，随后加入4mL TEA，室温下搅拌过夜。TLC 监控反应，反应结束后，减压浓缩得粗品Boc-Lys-C17。
将Boc-Lys-C17粗品，2-Hexyldecanoic acid(294mg，1.15mmol)和DIPEA(0.2mL，1.15mmol)溶于10mL DMF中。该反应液置于冰水浴后，加入HOBt(114mg，0.84mmol)。搅拌10min后，加入EDCI(160mg，0.84mmol)。缓慢升至室温，搅拌过夜。TLC监测反应，反应完成后，DCM稀释，1N HCl溶液洗涤1次，饱和NaHCO3溶液洗涤2次，饱和食盐水1洗涤次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩。粗品经硅胶柱纯化(PE/EA＝20:1)得0.43g 油状Boc-Lys-(C17)(NC16)，收率77％。
将Boc-Lys-(C17)(NC16)溶于4mL DCM中，随后加入2mL TFA，室温搅拌1h。TLC监控反应，反应结束后，减压浓缩得Lys-(C17)(NC16)粗品。
将Lys-(C17)(NC16)粗品，Boc-Ser-OH(182mg，0.89mmol)和DIPEA(0.18mL，0.89mmol) 溶于10mL DMF中。该反应液置于冰水浴后，加入HOBt(88mg，0.65mmol)。搅拌10min 后，加入EDCI(128mg，0.65mmol)。缓慢升至室温，随后搅拌过夜。TLC监测反应，反应完成后，DCM稀释，1N HCl溶液洗涤1次，饱和NaHCO3溶液洗涤2次，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩。粗品经硅胶柱纯化(PE/EA＝10:1)得0.32g油状 Boc-Ser-Lys-(C17)(NC16)，收率66％。
将Boc-Ser-Lys-(C17)(NC16)溶于4mL DCM中，随后加入2mL TFA，室温搅拌1h。TLC监控反应，反应结束后，DCM稀释，饱和NaHCO3溶液洗涤2次，饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后得油状Ser-Lys-(C17)(NC16)。
Rf＝0.2(DCM/MeOH＝50:1)
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.83(d,J＝8.0Hz,1H),5.62(t,J＝5.6Hz,1H),4.91-4.85(m, 1H),4.57-4.52(m,1H),3.94-3.90(m,1H),3.72-3.68(m,1H),3.47(t,J＝4.4Hz,1H),3.25-3.20 (m,2H),2.29-2.11(m,4H),1.98-1.87(m,2H),1.73-1.65(m,2H),1.42-1.33(m,6H),1.25(s,44H), 0.88-0.85(m,12H).
实施例12.Ser-Glu-[Glu-(C17)2]2
将Glu-(C17)2(600mg，0.96mmol)，Boc-Glu-OH(112mg，0.49mmol),HBTU(800 mg，2.1mmol),HOAT(300mg，2.2mmol),DIPEA(810mg，6.3mmol)溶于10mL DMF 中。室温搅拌过夜。TLC监测反应，反应完成后，DCM稀释，1N HCl溶液洗涤1次，饱和 NaHCO3溶液洗涤2次，饱和食盐水1洗涤次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩。粗品经硅胶柱纯化(PE/EA＝5:1)得0.27g无色油状Boc-Glu-[Glu-(C17)2]2，收率38％。
将Boc-Glu-[Glu-(C17)2]2溶于5mL DCM中，随后加入1mL TFA，室温搅拌2h。TLC 监控反应，反应结束后，将反应液转移至分液漏斗，加入40mL DCM，并用饱和NaHCO3水溶液将有机层调至弱碱性，分离有机层，水层用DCM萃取两次，合并有机层并用硫酸钠干燥，过滤，浓缩得228mg淡黄色油状物粗品Glu-[Glu-(C17)2]2。
将228mg Glu-[Glu-(C17)2]2粗品，Boc-TBS-Ser-OH(160mg，0.5mmol)，HBTU(134mg，0.35mmol)，HOBT(49mg，0.36mmol)，DIPEA(160mg，1.24mmol)溶于6mL DMF 中。室温搅拌过夜。TLC监测反应，反应完成后，DCM稀释，1N HCl溶液洗涤1次，饱和 NaHCO3溶液洗涤2次，饱和食盐水1洗涤次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩。粗品经硅胶柱纯化(PE/EA＝5:1)得0.2g无色油状Boc-TBS-Ser-Glu-[Glu-(C17)2]2。
将Boc-TBS-Ser-Glu-[Glu-(C17)2]2溶于5mL DCM中，随后加入1mL TFA，室温搅拌2h。 TLC监控反应，反应结束后，DCM稀释，饱和NaHCO3溶液洗涤2次，饱和食盐水洗涤1 次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，粗品经硅胶柱纯化(DCM/MeOH＝60:1)得101mg无色油状 Ser-Glu-[Glu-(C17)2]2，收率58％。
Rf＝0.2(DCM/MeOH＝60:1)
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.76-7.84(m,2H),7.54-7.56(d,1H),4.75-4.85(m,4H),4.75-4.85(m,4H),4.56-4.60(m,2H),4.17-4.23(m,1H),3.64-3.76(m,2H),3.35-3.37(m,1H), 2.30-2.39(m,8H),2.10-2.18(m,4H),1.40-1.48(m,16H),1.10-1.21(m,96H),0.79-0.82(m,24H).
实施例13.Met-Glu-(C17)2
在N2保护下，于10mL反应瓶中加入Glu-(C17)2(244mg,0.39mmol)，Boc-Met-OH(146.5mg,0.585mmol)，TMP(103μL,0.78mmol)及DMF(3mL)，冰浴10min后，缓慢滴加3mL含HATU(298mg,0.78mmol)的DMF溶液，0℃继续反应，缓慢升至室温，TLC跟踪反应，25h后停止反应。
将反应液用50mL乙酸乙酯稀释，然后用1N HCl(aq)，饱和NaHCO3(aq)及饱和食盐水依次洗涤并浓缩后得淡黄色油状粗品Boc-Met-Glu-(C17)2。在N2保护下，将所得粗品溶于8mL DCM，接着加入三氟乙酸(2mL)。室温反应,TLC跟踪反应，2h后停止反应。
将反应液转移至分液漏斗，加入40mL DCM，并用饱和NaHCO3水溶液将有机层调至弱碱性，分离有机层，水层用DCM萃取两次，合并有机层并用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用硅胶柱纯化，洗脱剂PE/EA＝2:1。得189mg无色油状物Met-Glu-(C17)2，两步产率为64％。
Rf＝0.5(PE/EA＝1:1)
ESI-MS:m/z＝755.92[M+H]+
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.73(d,J＝8.2Hz,1H),4.87(dp,J＝18.8,6.2Hz,2H),4.58 (td,J＝8.2,4.8Hz,1H),3.53(dd,J＝8.2,4.7Hz,1H),2.66–2.57(m,2H),2.47–2.12(m,3H), 2.06–1.91(m,1H),1.78(dq,J＝14.6,7.3Hz,1H),1.52(dd,J＝14.1,6.5Hz,8H),1.25(s,54H), 0.87(t,J＝6.7Hz,12H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ174.60,172.40,171.62,77.23,76.19,74.87,54.23,51.61, 34.09,34.02,33.95,33.89,31.86,30.77,30.68,29.57,29.50,29.47,29.46,29.27,29.25,27.91, 25.32,25.31,25.27,25.23,22.66,15.30,14.09.
实施例14.Ser-Glu-αC17(NC17)
在N2保护下，于25mL反应瓶中加入9-Heptadecanol(800mg,3.12mmol)， Boc-5-Me-Glu-OH(978mg,3.74mmol)，DCC(1.29g,6.24mmol)，DMAP(534mg,4.37mmol) 及20mLDCM，40℃水浴加热,TLC跟踪反应，21h后停止反应。
将反应混合物过滤，除去生成的白色沉淀，用25mL DCM洗涤,浓缩所得滤液，所得粗品用硅胶柱纯化，洗脱剂PE/EA＝30:1,得1.15g无色油状物Boc-5-Me-Glu-αC17，产率74％。
在N2保护下，于25mL反应瓶中加入Boc-5-Me-Glu-αC17(573mg,1.15mmol)，5mLTHF 及4mL MeOH，反应液于0℃搅拌10min后，滴加5mL LiOH(30.2mg,1.26mmol)的水溶液，缓慢升至室温，TLC跟踪反应，6h后停止反应。
在N2保护下，于10mL反应瓶中加入Boc-Glu-αC17(410mg,0.84mmol)，Heptadecan-9-amine(324mg,1.27mmol)，TMP(223μL,1.67mmol)及DMF(10mL)，冰浴 10min后，缓慢滴加10mL含HATU(642mg,1.67mmol)的DMF溶液，0℃继续反应，缓慢升至室温,TLC跟踪反应，20h后停止反应。
将反应液用100mL乙酸乙酯稀释，然后用1N HCl(aq)，饱和NaHCO3(aq)及饱和食盐水依次洗涤并浓缩后得淡黄色油状粗品Boc-Glu-aC17(NC17)。在N2保护下，将所得粗品溶于 10mL DCM，接着加入三氟乙酸(3mL)。室温反应,TLC跟踪反应，2h后停止反应。
将反应液转移至分液漏斗，加入50mL DCM，并用饱和NaHCO3水溶液将有机层调至弱碱性，分离有机层，水层用DCM萃取两次，合并有机层并用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用硅胶柱纯化，洗脱剂DCM/MeOH＝60:1。得335mg无色油状物Glu-aC17(NC17)，两步产率为64％。
Rf＝0.5(DCM/MeOH＝30:1)
ESI-MS:m/z＝623.69[M+H]+
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.55(d,J＝9.1Hz,1H),4.88(p,J＝6.3Hz,1H),3.87(tt,J＝ 13.0,5.9Hz,1H),3.42(dd,J＝8.7,4.9Hz,1H),2.31(h,J＝7.8,7.3Hz,2H),2.20–2.07(m,1H), 1.78(dtd,J＝14.1,8.1,6.1Hz,1H),1.58–1.38(m,6H),1.25(d,J＝8.9Hz,57H),0.86(t,J＝6.7 Hz,12H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ175.59,171.80,77.36,75.53,54.15,49.38,35.34,35.32,34.18, 34.17,33.42,32.00,31.97,30.60,29.76,29.68,29.64,29.61,29.41,29.38,26.02,26.00,25.47, 25.45,22.79,14.22.
在N2保护下，于10mL反应瓶中加入Glu-aC17(NC17)(182mg,0.29mmol)，Boc-Ser-OH (90mg,0.44mmol)，TMP(77μL,0.58mmol)及DMF(3mL)，冰浴10min后，缓慢滴加2mL 含HATU(223mg,0.58mmol)的DMF溶液，0℃继续反应，缓慢升至室温，TLC跟踪反应， 21h后停止反应。
将反应液用40mL乙酸乙酯稀释，然后用1N HCl(aq)，饱和NaHCO3(aq)及饱和食盐水依次洗涤并浓缩后得淡黄色油状粗品Boc-Ser-Glu-aC17(NC17)。在N2保护下，将所得粗品溶于8mL DCM，接着加入三氟乙酸(2mL)。室温反应,TLC跟踪反应，2h后停止反应。
将反应液转移至分液漏斗，加入30mL DCM，并用饱和NaHCO3水溶液将有机层调至弱碱性，分离有机层，水层用DCM萃取两次，合并有机层并用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用硅胶柱纯化，洗脱剂PE/EA＝5:1。得白色粉末Ser-Glu-αC17(NC17)，两步产率为 27％。
Rf＝0.3(EA/PE＝5:1)
ESI-MS:m/z＝710.61[M+H]+
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.10(d,J＝8.1Hz,1H),5.87(d,J＝9.0Hz,1H),4.90(p,J＝ 6.2Hz,1H),4.54(td,J＝8.7,3.6Hz,1H),3.96–3.78(m,2H),3.70(dd,J＝10.8,5.3Hz,1H), 3.48(t,J＝4.9Hz,1H),2.24(tdd,J＝11.3,9.4,5.4Hz,3H),2.10–1.81(m,4H),1.50(dq,J＝24.8, 5.8,5.4Hz,5H),1.25(s,55H),0.87(t,J＝6.6Hz,12H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ174.32,171.76,171.55,77.36,76.55,65.51,56.16,52.19, 49.69,35.22,35.17,34.09,34.05,33.03,32.02,31.99,29.78,29.68,29.63,29.60,29.45,29.43, 29.40,29.02,26.08,26.01,25.45,25.39,22.80,22.79,14.23.
实施例15.Ser-Glu-C17(αNC17)
在N2保护下，于100mL反应瓶中加入Boc-5-Me-Glu-OH(1g,3.83mmol)，Heptadecan-9-amine(815mg,3.19mmol)，TMP(843μL,6.38mmol)及DMF(40mL)，冰浴 10min后，缓慢滴加10mL含HATU(2.43g,6.38mmol)的DMF溶液，0℃继续反应，缓慢升至室温,TLC跟踪反应，21h后停止反应。
将反应混合物用150mL DCM稀释,1N HCl(aq)洗涤，饱和NaHCO3(aq)及饱和食盐水依次洗涤并浓缩后得白色粉末状粗品Boc-Glu-5-Me-αNC17。所得粗品未纯化，直接用于下一步反应。
在N2保护下，于50mL反应瓶中加入Boc-5-Me-Glu-αNC17粗品，10mL THF及10mLMeOH,待粗品溶解后，滴加10mL LiOH(611mg,6.38mmol)的水溶液，室温搅拌，TLC跟踪反应，3.5h后停止反应。
将反应混合物用100mL DCM稀释,1N HCl(aq)洗涤，饱和食盐水洗涤，浓缩有机相，所得粗品用硅胶柱纯化，洗脱剂DCM/MeOH＝40:1,得1.4g白色粉末Boc-Glu-αNC17，两步产率90％。
在N2保护下，于50mL反应瓶中加入9-Heptadecanol(889mg,3.47mmol)， Boc-Glu-αNC17(1.4g,2.89mmol)，DCC(1.2g,5.78mmol)，DMAP(494mg,4.05mmol)及25 mL DCM，室温搅拌,TLC跟踪反应，21h后停止反应。
将反应混合物过滤，除去生成的白色沉淀，用25mL DCM洗涤,浓缩所得滤液，所得粗品Boc-Glu-C17(αNC17)未经纯化，直接用于下一步反应。在N2保护下，将所得粗品溶于20mL DCM，接着加入三氟乙酸(5mL)。室温反应,TLC跟踪反应，2h后停止反应。
将反应液转移至分液漏斗，加入100mL DCM，并用饱和NaHCO3水溶液将有机层调至弱碱性，分离有机层，水层用DCM萃取两次，合并有机层并用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用硅胶柱纯化，洗脱剂PE/EA＝3:1。得720mg无色油状物Glu-aC17(NC17)，两步产率为40％。
Rf＝0.5(DCM/MeOH＝30:1)
ESI-MS:m/z＝623.69[M+H]+
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.85(d,J＝9.3Hz,1H),4.86(p,J＝6.2Hz,1H),3.85(dtd,J＝ 15.1,8.0,6.2,3.8Hz,1H),3.38(dd,J＝7.3,5.0Hz,1H),2.42(q,J＝7.3Hz,2H),2.11(dtd,J＝ 12.5,7.5,4.9Hz,1H),1.85(dq,J＝14.4,7.3Hz,1H),1.48(dq,J＝13.7,6.5Hz,7H),1.26(d,J＝ 8.2Hz,54H),0.87(t,J＝6.8Hz,12H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ173.81,173.53,77.36,74.82,54.96,49.02,35.31,34.22,32.00, 31.18,30.57,29.75,29.67,29.65,29.63,29.42,29.40,29.39,26.05,26.03,25.47,22.79,14.22.
在N2保护下，于10mL反应瓶中加入Glu-C17(αNC17)(300mg,0.48mmol)，Boc-Ser-OH (148mg,0.72mmol)，TMP(130μL,0.96mmol)及DMF(3mL)，冰浴10min后，缓慢滴加 3mL含HATU(366mg,0.96mmol)的DMF溶液，0℃继续反应，缓慢升至室温,TLC跟踪反应，21h后停止反应。
将反应液用40mL乙酸乙酯稀释，然后用1N HCl(aq)，饱和NaHCO3(aq)及饱和食盐水依次洗涤并浓缩后得淡黄色油状粗品Boc-Ser-Glu-C17(αNC17)。在N2保护下，将所得粗品溶于6mL DCM，接着加入三氟乙酸(1.5mL)。室温反应,TLC跟踪反应，2h后停止反应。
将反应液转移至分液漏斗，加入30mL DCM，并用饱和NaHCO3水溶液将有机层调至弱碱性，分离有机层，水层用DCM萃取两次，合并有机层并用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用硅胶柱纯化，洗脱剂PE/EA＝1:1。得到无色油状物Ser-Glu-C17(αNC17)，两步产率为60％。
Rf＝0.3(EA/PE＝5:1)
ESI-MS:m/z＝710.81[M+H]+
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.83(d,J＝8.1Hz,1H),6.11(d,J＝9.0Hz,1H),4.86(p,J＝ 6.2Hz,1H),4.39(td,J＝8.0,5.4Hz,1H),3.85(dt,J＝9.8,5.1Hz,2H),3.66(dd,J＝10.8,5.8Hz, 1H),3.45(t,J＝5.3Hz,1H),2.46(dt,J＝16.5,7.4Hz,1H),2.35(dt,J＝16.5,6.7Hz,1H),2.15(dt, J＝15.6,7.7Hz,5H),1.94(dq,J＝14.4,7.1Hz,1H),1.57–1.40(m,7H),1.24(d,J＝5.1Hz,56H), 0.87(t,J＝6.6Hz,12H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ174.21,173.37,170.55,77.36,75.33,65.56,56.08,52.73, 49.77,38.75,35.20,35.16,34.12,32.00,30.98,29.70,29.68,29.66,29.63,29.41,27.96,26.04, 25.97,25.47,25.44,22.80,14.23.
实施例16.Gly-Glu-(C17)2
在N2保护下，于10mL反应瓶中加入Glu-(C17)2(300mg,0.48mmol)，Boc-Gly-OH(126mg,0.72mmol)，HATU(366mg,0.96mmol)，TMP(127μL,0.96mmol)及DMF(5mL)，室温搅拌，TLC跟踪反应，28h后停止反应。
将反应液用50mL乙酸乙酯稀释，然后用1N HCl(aq)，饱和NaHCO3(aq)及饱和食盐水依次洗涤并浓缩后得无色油状粗品Boc-Gly-Glu-(C17)2。在N2保护下，将所得粗品溶于10mL DCM，接着加入三氟乙酸(4mL)。室温反应，TLC跟踪反应，2h后停止反应。
将反应液转移至分液漏斗，加入40mL DCM，并用饱和NaHCO3水溶液将有机层调至弱碱性，分离有机层，水层用DCM萃取两次，合并有机层并用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用硅胶柱纯化，洗脱剂PE/EA＝1:1。得286mg无色油状物Gly-Glu-(C17)2，两步产率为87％。
Rf＝0.3(PE/EA＝3:1)
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.72(d,J＝8.4Hz,1H),4.86(dp,J＝22.1,6.2Hz,2H),4.62 (td,J＝8.2,4.8Hz,1H),3.36(s,2H),2.48–2.14(m,3H),2.07–1.90(m,1H),1.71–1.42(m, 12H),1.24(s,54H),0.86(t,J＝6.7Hz,12H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ172.79,172.52,171.76,77.36,76.28,74.91,51.56,44.85, 34.14,34.05,33.99,31.96,30.89,29.66,29.60,29.57,29.55,29.37,29.35,28.14,25.42,25.41, 25.36,25.32,22.76,14.19.
实施例17.Leu-Glu-(C17)2
在N2保护下，于10mL反应瓶中加入Glu-(C17)2(200mg,0.32mmol)，Boc-Leu-OH(111mg,0.48mmol)，HATU(244mg,0.64mmol)，TMP(85μL,0.64mmol)及DMF(5mL)，室温搅拌，TLC跟踪反应，27h后停止反应。
将反应液用50mL乙酸乙酯稀释，然后用1N HCl(aq)，饱和NaHCO3(aq)及饱和食盐水依次洗涤并浓缩后得无色油状粗品Boc-Leu-Glu-(C17)2。在N2保护下，将所得粗品溶于10mL DCM，接着加入三氟乙酸(3mL)。室温反应,TLC跟踪反应，2h后停止反应。
将反应液转移至分液漏斗，加入40mL DCM，并用饱和NaHCO3水溶液将有机层调至弱碱性，分离有机层，水层用DCM萃取两次，合并有机层并用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用硅胶柱纯化，洗脱剂PE/EA＝4:1。得112mg无色油状物Leu-Glu-(C17)2，两步产率为47％。
Rf＝0.5(PE/EA＝2:1)
ESI-MS:m/z＝737.81[M+H]+
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.78(d,J＝8.3Hz,1H),4.87(dt,J＝19.2,6.2Hz,2H),4.57(td, J＝8.2,4.8Hz,1H),3.40(dd,J＝9.8,3.8Hz,1H),2.44–2.29(m,2H),2.22(ddt,J＝23.7,10.3, 5.3Hz,1H),1.96(dddd,J＝13.7,10.4,8.0,5.0Hz,1H),1.83–1.66(m,2H),1.50(dt,J＝13.1,6.1 Hz,8H),1.25(s,54H),0.96(d,J＝6.3Hz,3H),0.93(d,J＝6.2Hz,3H),0.87(t,J＝6.8Hz,12H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ175.77,172.57,171.88,77.36,76.22,74.92,53.72,51.57, 44.34,34.15,34.08,34.02,31.99,30.88,29.69,29.63,29.60,29.58,29.39,29.37,28.13,25.44, 25.42,25.39,25.35,25.03,23.53,22.78,21.50,14.21.
实施例18.His-Glu-(C17)2
在N2保护下，于10mL反应瓶中加入Glu-(C17)2(200mg,0.32mmol)，Boc-His-OH(123mg,0.48mmol)，HATU(244mg,0.64mmol)，TMP(85μL,0.64mmol)及DMF(5mL)，室温搅拌，TLC跟踪反应，27h后停止反应。
将反应液用50mL乙酸乙酯稀释，然后用1N HCl(aq)，饱和NaHCO3(aq)及饱和食盐水依次洗涤并浓缩后得无色油状粗品Boc-His-Glu-(C17)2。在N2保护下，将所得粗品溶于10mL DCM，接着加入三氟乙酸(3mL)。室温反应，TLC跟踪反应，2h后停止反应。
将反应液转移至分液漏斗，加入40mL DCM，并用饱和NaHCO3水溶液将有机层调至弱碱性，分离有机层，水层用DCM萃取两次，合并有机层并用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用硅胶柱纯化，洗脱剂DCM/MeOH＝20:1。得64mg无色油状物His-Glu-(C17)2，两步产率为26％。
Rf＝0.4(DCM/MeOH＝15:1)
ESI-MS:m/z＝761.81[M+H]+
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.02(d,J＝8.1Hz,1H),7.94(d,J＝7.5Hz,0H),7.62(d,J＝ 6.9Hz,1H),6.87(s,1H),4.88(tt,J＝12.7,6.4Hz,2H),4.67–4.30(m,6H),3.68(q,J＝5.6Hz, 1H),3.13–2.93(m,2H),2.35(dt,J＝15.1,8.3Hz,0H),2.04–1.82(m,1H),1.51(h,J＝7.0,6.5 Hz,9H),1.25(d,J＝5.7Hz,52H),0.87(t,J＝6.7Hz,12H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ174.81,174.47,172.57,172.34,171.89,171.54,135.40, 135.12,131.25,120.34,77.23,76.29,75.06,54.67,51.70,33.99,33.94,33.85,31.85,31.49,30.55, 29.55,29.50,29.46,29.26,29.24,27.69,25.31,25.24,25.22,25.19,22.65,14.08.
实施例19.Ser-AAD-(C17)2的合成
在N2保护下，于25mL反应瓶中加入9-Heptadecanol(1.55g,6.0mmol)，Boc-L-高谷氨酸(Boc-AAD,530mg，2.0mmol)，DMAP(250mg,2.0mmol)，EDCI.HCl(770mg,4.0mmol) 及20mL DMF，室温搅拌，18h后停止反应。将反应液用100mL乙酸乙酯稀释，然后用1N HCl(aq)，饱和NaHCO3(aq)及饱和食盐水依次洗涤并浓缩后得油状粗品Boc-AAD-(C17)2。
在N2保护下，将所得粗品溶于10mL DCM，接着加入三氟乙酸(5mL)。室温反应， TLC跟踪反应，1h后停止反应。将反应液转移至分液漏斗，加入40mL DCM，并用饱和 NaHCO3水溶液将有机层调至弱碱性，分离有机层，水层用DCM萃取两次，合并有机层并用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用硅胶柱纯化，洗脱剂DCM/MeOH＝20:1。得200mg淡黄色油状物AAD-(C17)2，两步产率为15％。
在N2保护下，于10mL反应瓶中加入AAD-(C17)2(66mg,0.1mmol)，Boc-Ser-OH(21mg,0.1mmol)，HBTU(76mg,0.2mmol)，HOBT(27mg,0.2mmol)，DIPEA(40mg,0.3mmol)及DMF(4mL)，室温搅拌，18h后停止反应。将反应液用40mL乙酸乙酯稀释，然后用1N HCl (aq)，饱和NaHCO3(aq)及饱和食盐水依次洗涤并浓缩后得油状粗品Boc-Ser-AAD-(C17)2。
在N2保护下，将所得粗品溶于1mL DCM，接着加入三氟乙酸(0.2mL)。室温反应， 2h后停止反应。将反应液转移至分液漏斗，加入40mL DCM，并用饱和NaHCO3水溶液将有机层调至弱碱性，分离有机层，水层用DCM萃取两次，合并有机层并用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得产物用硅胶柱纯化，洗脱剂DCM/MeOH＝1:1。得50mg无色油状物 Ser-AAD-(C17)2，两步产率为70％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.91-7.89(1H,m),4.91-4.83(2H,m),4.58-4.53(1H,m),3.95-3.91(1H,m),3.77-3.55(2H,m),2.58-2.51(4H,m),2.36-2.27(2H,m),1.72-1.62(8H,m), 1.35-1.20(48H,m),0.91-0.86(12H,m).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ173.26,171.97,77.36,76.30,74.84,65.15,56.17,52.04,34.13, 34.03,33.97,33.81,31.98,31.69,29.82,29.68,29.62,29.59,29.57,29.39,29.37,25.43,25.35, 25.33,22.78,20.80,14.21.
实施例20.Ser-Glu-[C17(＝)2]2的合成
将三乙胺(8.1mL)缓慢加入(Z)-oct-3-en-1-ol(5g,39mmol)的二氯甲烷(50mL)溶液中。此溶液冷却至0℃，加入甲磺酸氯(4.53mL,58.5mmol)。反应在室温下搅拌30min后，二氯甲烷稀释反应液，然后用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩至干燥。粗品经柱纯化(PE)得到7.28g透明油状物(Z)-oct-3-en-1-yl methanesulfonate。
将所得(Z)-oct-3-en-1-yl methanesulfonate溶于2-甲基四氢呋喃(70mL)溶液中，然后加入四丁基溴化铵(15.27g,47mmol)。氮气保护下加热到80℃，搅拌30min后，浓缩反应液。浓缩液加入乙酸乙酯溶解，然后纯水洗涤三次，无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩至干燥。粗品经柱纯化(PE)得到5.48g透明油状物(Z)-1-bromooct-3-ene。
在氮气保护条件下，将(Z)-1-bromooct-3-ene的无水四氢呋喃(7mL)溶液缓慢滴入含有镁粉(690mg)的无水四氢呋喃(5mL)中。在45℃下反应搅拌2h。然后将溶液冷却到5-10℃，滴加甲酸乙酯(2.2mL)的无水四氢呋喃溶液(7mL)。将反应液在室温下搅拌15min，然后冷却至5℃，用水淬火(15ml)，然后缓慢加入6M盐酸(15ml)。在室温下搅拌溶液，直到所有镁粉都溶解，然后用正己烷萃取三次。合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩至干燥。粗品经柱纯化(PE)得到2.23g透明油状物(5Z,12Z)-heptadeca-5,12-dien-9-ol。
称取Boc-Glu-OH(255mg,1.03mmol)，悬浮于10mL二氯甲烷。将该悬浮液置于冰水浴后，滴入(5Z,12Z)-heptadeca-5,12-dien-9-ol(0.5g,1.98mmol)的二氯甲烷溶液。最后分别加入DCC(0.47g,2.27mmol)和DMAP(0.31g,2.58mmol)的二氯甲烷溶液，在0℃下搅拌30min。缓慢升至室温，随后搅拌过夜。TLC监测反应，碘熏显色。反应结束后，将悬浮液过滤，滤液减压浓缩得到粗品。粗品经柱纯化(PE/EA＝20/1)得到0.47g透明无色目标产物Boc-Glu-[C17(＝)2]2。
将上步纯品溶于4mL二氯甲烷中，随后加入2毫升三氟乙酸，室温下搅拌一小时。TLC 监控反应，反应结束后，减压浓缩得到Glu-[C17(＝)2]2的三氟乙酸盐。将该粗品，Boc-Ser-OH (209mg,1.02mmol)和DIPEA(0.18mL,1.02mmol)溶于10mL DMF中。该反应液置于冰水浴后，加入HOBt(101mg,0.75mmol)。该温度下搅拌10后，加入EDCI(143mg,0.75 mmol)。缓慢升至室温，随后搅拌过夜。TLC监测反应，碘熏显色。反应完成后，二氯甲烷稀释，1N HCl溶液洗涤1次，饱和NaHCO3溶液2次，饱和食盐水1次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩。粗品经硅胶层析纯化(PE/EA＝4/1)得到0.38g的透明油状物 Boc-Ser-Glu-[C17(＝)2]2。
将Boc-Ser-Glu-[C17(＝)2]2溶于4mL二氯甲烷中，随后加入2mL三氟乙酸，室温下搅拌 1h。TLC监控反应，反应结束后，二氯甲烷稀释，饱和NaHCO3溶液2次，饱和食盐水1 次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩。粗品经硅胶层析纯化(DCM/MeOH＝50/1)得到0.24g的透明油状物Ser-Glu-[C17(＝)2]2。
Rf＝0.2(DCM/MeOH＝50:1)
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.90-7.84(m,1H),5.41-5.30(m,8H),4.96-4.88(m,2H),4.63-4.58(m,1H),3.93-3.87(m,1H),3.70-3.66(m,1H),3.47-3.44(m,1H),2.40-2.25(m,3H), 2.08-1.99(m,16H),1.68-1.56(m,8H),1.32-1.26(m,16H),0.91-0.88(m,12H).
制剂实施例
实施例21
取上述实施例1～20所得的小肽脂质及Moderna Covid-19 Vaccine(Spikevax，mRNA-1273) 中所用的可离子化脂质SM102分别与DSPC、胆固醇、PEG-DMG按50/10/38.5/1.5的摩尔比混合溶于无水乙醇中得到脂质溶液(a)。按小肽脂质和mRNA的N/P＝5:1(摩尔比)取 Fluc mRNA溶于pH＝3～4的柠檬酸缓冲液中得到Fluc mRNA溶液(b)。将脂质溶液(a) 与mRNA溶液(b)按流速比3:1用微流控混合得产物(c)。将产物(c)用pH＝7.2～7.4的 PBS缓冲液透析24h后于4℃超滤浓缩，得到包载Fluc mRNA的小肽脂质纳米颗粒Fluc mRNA/LANP(LANP 1～20)及SM102-LNP。所有LANP样品包封率均大于90％，与SM102-LNP类似。样品的粒径电位如表1所示。
实施例22
取实施例7合成的小肽脂质6mg及PEG-DMG 0.4mg，溶于0.3mL无水乙醇中得脂质溶液(a)；取Fluc mRNA 0.2mg溶于0.9mL pH＝5.0的缓冲液中得到Fluc mRNA溶液(b)，将两者用微流控混合得到产物(c)，将产物(c)用pH＝7.2～7.4的PBS透析24h后于4℃超滤浓缩，得到包载Fluc mRNA的小肽脂质纳米颗粒(LANP 21)，其包封率大于90％，粒径电位见表1。
表1.Fluc mRNA/LANP粒径电位
实施例23
取实施例1～20所合成的部分小肽脂质及Onpattro制剂所用的可离子化脂质DLin-MC3-DMA分别与DSPC、胆固醇、PEG-C-DMG按50/10/38.5/1.5的摩尔比混合溶于无水乙醇中得到脂质溶液(a)。按小肽脂质和siRNA的N/P＝3:1(摩尔比)取siRNA溶于pH ＝3～4的柠檬酸缓冲液中得到siRNA溶液(b)。将脂质溶液(a)与siRNA溶液(b)按流速比3:1用微流控混合得产物(c)。将产物(c)用pH＝7.2-7.4的PBS缓冲液透析24h后于4℃超滤浓缩，得到包载siRNA的小肽脂质纳米颗粒siRNA/LANP(LANP 22～40)及MC3-LNP，样品包封率大于90％，其粒径电位如表2所示。本实施例中采用的siRNA为hmTF-25-2(US 20210324384A1)。
表2.siRNA/LANP粒径电位
样品 小肽脂质实施例 Size(nm) PDI Zeta Potential(mV)
LANP 22 实施例1 72.6 0.14 -0.5
LANP 23 实施例2 56.2 0.06 -0.9
LANP 24 实施例4 63.7 0.07 -2.2
LANP 25 实施例5 75.4 0.23 0.5
LANP 26 实施例6 78.9 0.09 -3.3
LANP 27 实施例7 80.4 0.04 -0.3
LANP 28 实施例8 75 0.09 -1.7
LANP 29 实施例9 80.8 0.12 -1.5
LANP 30 实施例10 77.6 0.13 -1.5
LANP 31 实施例11 91.6 0.2 0.4
LANP 32 实施例12 77 0.06 -1.5
LANP 33 实施例13 88.1 0.02 0.5
LANP 34 实施例14 166.5 0.41 0.5
LANP 35 实施例15 281.1 0.49 0.5
LANP 36 实施例16 63.3 0.05 0.0
LANP 37 实施例17 60.4 0.04 0.1
LANP 38 实施例18 67.8 0.05 0.2
LANP 39 实施例19 64.2 0.05 0.4
LANP 40 实施例20 62.2 0.06 0.4
MC3-LNP — 112.4 0.03 -0.6
细胞及动物实验实施例
实施例24
取实施例21、22制备的纳米颗粒mRNA/LANP(LANP1～21)及SM102-LNP，经肌肉注射BABL/C小鼠的大腿内测部位，1mg/kg Fluc mRNA，n＝3。观察24h及72h两个时间点的小鼠活体成像，测量荧光强度。由表3可知，所有肌肉注射了Fluc mRNA/LANP样品的小鼠，24h后均出现荧光，说明LANP能有效递送Fluc mRNA进入细胞，并在小鼠体内表达出荧光蛋白。其中LANP1，4，13，16，17递送效果达到或者超过SM102-LNP的递送效果。
表3.Fluc mRNA/LANP小鼠给药后荧光强度
实施例25
取实施例23制备的LANP 26、27，对293T细胞进行转染，同时对比MC3-LNP处方。24h后收集细胞总RNA进行反转录并采用QPCR技术检测靶基因的mRNA表达水平，TGF-β1siRNA对靶基因TGF-β1mRNA表达水平的敲低效果见表4。结果表明LANP 26、27样品对 TGFβ1的基因沉默效率与MC3-LNP接近。
表4.TGF-β1mRNA相对表达水平检测
实施例26
采用CTG法考察实施例1、2、7所得化合物对293T细胞的毒性。取2.5×105cell/mL的 293T细胞置于24孔板中，然后加入一定浓度的被测化合物孵育24h，转至96孔板继续培养 24h后加入100μL CTG和完全培养基。室温孵育10min后使用酶标仪检测540nm波长处的吸光值来计算细胞存活率。结果见图2。结果表明实施例1、2、7所得化合物，从而制备的LANP具有较低的细胞毒性。
尽管本发明描述了所述组合物和方法的某些实施例，并且出于说明的目的已经阐述了很多细节，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这些组合物和方法易受其他实施例的影响，并且某些细节在不脱离本发明基本原理的情况下，可以随本文中描述的实施方式进行改变。

Claims (10)

1.一种小肽脂质或其盐，其特征在于，所述的小肽脂质的结构为：头部-连接部-尾部，
其中，所述的头部和连接部分别为单个氨基酸或由2～3个氨基酸通过肽键形成的小肽；
用于形成所述的头部的氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、羟脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸或组氨酸中的一种或多种；
用于形成所述的连接部的氨基酸为天冬氨酸、谷氨酸、高谷氨酸或赖氨酸中的一种或多种；
所述的尾部的数量为1～6条，所述的尾部为碳原子数为5～40的烷/烯基链和/或含有酯键的烷/烯基链；
所述的头部和所述的连接部之间通过形成酰胺键相连接；
所述的连接部和所述的尾部之间通过形成酰胺键或酯键相连接。
2.根据权利要求1所述的小肽脂质或其盐，其特征在于，所述的尾部的数量为1～6条；和/或，所述的碳原子数为5～40的碳链为烷基链或烯基链。
3.根据权利要求1所述的小肽脂质或其盐，其特征在于，所述的尾部为碳原子数为5～30的直链烷/烯基链或支链烷/烯基链，或碳原子数为5～30的含有一个酯键的直链烷/烯基链或支链烷/烯基链中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的小肽脂质或其盐，其特征在于，所述的尾部选自
中的一种或多种。
5.一种小肽脂质纳米递送系统，其特征在于，所述的小肽脂质纳米递送系统包括权利要求1至4中任一项所述的小肽脂质或其盐。
6.根据权利要求5所述的小肽脂质纳米递送系统，其特征在于，所述的小肽脂质纳米递送系统还包括辅助脂质、胆固醇及其衍生物、PEG化脂质中的一种或多种；
所述的辅助脂质选自磷脂及其衍生物；
所述的PEG化脂质选自PEG-DMG、PEG-C-DMG、PEG-DSPE中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的小肽脂质纳米递送系统，其特征在于，所述的小肽脂质或其盐、辅助脂质、胆固醇及其衍生物和PEG化脂质的摩尔比为(40～99.5):(0～15):(0～50):(0.5～3)。
8.一种如权利要求1至4中任一项所述的小肽脂质或其盐或权利要求5～7中任一项所述的小肽脂质纳米递送系统在制备核酸药物中的应用。
9.一种核酸药物，其特征在于，所述的核酸药物包括核酸分子和权利要求1至4中任一项所述的小肽脂质或其盐或权利要求5～7中任一项所述的小肽脂质纳米递送系统。
10.根据权利要求9所述的核酸药物，其特征在于，所述的核酸分子包括mRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、saRNA分子、反义寡核苷酸分子或适配体中的一种或多种；
所述的核酸药物为粒径为50～300nm的小肽脂质纳米颗粒；
和/或，通过微流控将所述的核酸分子和所述的小肽脂质或其盐以及辅助脂质、胆固醇、PEG化脂质中的一种或多种混合得到所述的核酸药物；
和/或，所述的小肽脂质或其盐和所述的核酸分子的氮磷比(N/P)为(1～50):1。
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