JP5241711B2 - 両親媒性分子、それを含む分子集合体及びその用途 - Google Patents

両親媒性分子、それを含む分子集合体及びその用途 Download PDF

Info

Publication number
JP5241711B2
JP5241711B2 JP2009515278A JP2009515278A JP5241711B2 JP 5241711 B2 JP5241711 B2 JP 5241711B2 JP 2009515278 A JP2009515278 A JP 2009515278A JP 2009515278 A JP2009515278 A JP 2009515278A JP 5241711 B2 JP5241711 B2 JP 5241711B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
group
molecular assembly
amphiphilic molecule
functional group
present
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2009515278A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2008143339A1 (ja
Inventor
真司 武岡
洋輔 小幡
祥二 田島
学 伊藤
篤志 水野
名津子 西山
良人 竹内
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Waseda University
JCR Pharmaceuticals Co Ltd
Original Assignee
Waseda University
JCR Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Waseda University, JCR Pharmaceuticals Co Ltd filed Critical Waseda University
Priority to JP2009515278A priority Critical patent/JP5241711B2/ja
Publication of JPWO2008143339A1 publication Critical patent/JPWO2008143339A1/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5241711B2 publication Critical patent/JP5241711B2/ja
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127Liposomes
    • A61K9/1271Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127Liposomes
    • A61K9/1271Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1273Polymersomes; Liposomes with polymerisable or polymerised bilayer-forming substances
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07CACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C237/00Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
    • C07C237/02Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C237/04Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C237/12Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to an acyclic carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07CACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C271/00Derivatives of carbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C271/06Esters of carbamic acids
    • C07C271/08Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C271/10Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C271/22Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms to carbon atoms of hydrocarbon radicals substituted by carboxyl groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

本発明は、pH変化に応答して分子集合体に保持される物質の放出挙動を制御することが可能な分子集合体の構成成分として用いられる両親媒性分子、それを含む分子集合体及びその用途に関する。
従来、リポソームなどの分子集合体に保持させた目的物質の放出を制御する方法として、pH応答性が汎用されている。ここで「pH応答性」とは、分子集合体がpH変化に応答して分子充填状態や保持物質の放出特性などを変化させる性質をいう。特にホスファチジルエタノールアミン型リン脂質を用いたpH応答性のリポソームがよく知られている(例えば、D.PapahadjopoulosらBiochemistry,24(1985)3091−3098、D.H.ThompsonらLangmuir,19(2003)6408−6415参照)。これは、ホスファチジルエタノールアミン型リン脂質がpHに応答して構造転移し、リポソーム二分子膜の分子充填状態が変化する性質を利用したものであるが、血清存在下ではそのような構造転移が起きにくく、in vivoでの実用性は低い。
さらに、pH応答性リポソームとしては、アニオン性脂質とカチオン性脂質とを混合したリポソームが知られている(G.Shiら、Journal of Controlled Release 80(2002)309−319参照)。しかし、アニオン性脂質とカチオン性脂質とを組み合わせる必要があることから、目的に応じたpH応答性の調整が困難である。また、カチオン性脂質自体は血中滞留性が低く、細胞毒性も高い。さらに、低pHでアニオン性生体膜との融合が可能であるのはカチオン性脂質のみであることから、リポソームの融合度が低いという問題があった。
上記のような状況において、薬剤または核酸などを保持することができ、かつ、簡便な方法でその放出挙動を制御することができるpH応答性分子集合体の開発が望まれている。特に、血中投与可能なpH応答性分子集合体が求められている。
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、親水部に両イオン性官能基を複数有する両親媒性分子を構成成分として含む分子集合体が、生理的なpH環境下で小胞体構造を形成して目的物質を保持し、酸性pH環境下でゼータ電位がプラスとなりアニオン性膜(アニオン性生体膜)との相互作用により小胞体構造が変化して目的物質を小胞体の外側に放出させることを見出し、本発明を完成させるに至った。この性質を利用することにより、生体内において、エンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれたpH応答性分子集合体がエンドソーム内の低pH環境下でエンドソーム膜と相互作用し、その保持する目的物質を細胞質に放出させることも可能である。
すなわち、本発明は、下記の両親媒性分子、分子集合体、薬剤、試薬及びキット等を提供する。
[1]式(I):
または、式(II):
[式中、X、X、X及びXは、それぞれ独立して、両イオン性官能基であり、A、A、A、A、A、A11、A12、A21及びA22は、それぞれ独立して、−COO−、−OCO−、−CONH−または−NHCO−であり、Rc及びRdは、それぞれ独立して、炭素数8〜22の鎖状炭化水素基であり、m、n、p及びqは、それぞれ独立して、1〜4の整数である。]
で表される両親媒性分子。
[2]式(Ia):
[式中、Raは、一つがカチオン性官能基であり、Raが複数ある場合、その他のRaは水素原子であり、Ra’は、一つがカチオン性官能基であり、Ra’が複数ある場合、その他のRa’は水素原子であり、Rb及びRb’は、それぞれ独立して、アニオン性官能基であり、Rc及びRdは、それぞれ独立して、炭素数8〜22の鎖状炭化水素基であり、A、A、A、A及びAは、それぞれ独立して、−COO−、−OCO−、−CONH−または−NHCO−であり、k、l、m及びnは、それぞれ独立して、1〜4の整数である。]
で表される両親媒性分子。A、A及びAは、それぞれ独立して、−CONH−または−NHCO−であることが好ましく、−CONH−がより好ましい。また、A及びAは、それぞれ独立して、−COO−または−OCO−であることが好ましく、−COO−がより好ましい。
[3]水溶液中、生理的なpH環境下でカチオン性官能基及びアニオン性官能基がそれぞれイオン化してカチオンまたはアニオンになり、酸性pH環境下でアニオン性官能基のイオン化傾向が減少し、塩基性pH環境下でカチオン性官能基のイオン化傾向が減少する、[2]記載の両親媒性分子。
[4]カチオン性官能基は、第1級アミノ基、第2級アミノ基、第3級アミノ基及び第4級アンモニウム塩からなる群より選ばれるものである、[2]または[3]記載の両親媒性分子。
[5]アニオン性官能基は、カルボキシル基である、[2]〜[4]のいずれか1項に記載の両親媒性分子。
[6]kが3であり、lが3であり、mが4であり、nが2である、[2]〜[5]のいずれか1項に記載の両親媒性分子。
[7]kが2であり、lが2であり、mが4であり、nが2である、[2]〜[5]のいずれか1項に記載の両親媒性分子。
[8]kが3であり、lが2であり、mが4であり、nが2である、[2]〜[5]のいずれか1項に記載の両親媒性分子。
[9]kが2であり、lが3であり、mが4であり、nが2である、[2]〜[5]のいずれか1項に記載の両親媒性分子。
[10]kが3であり、lが3であり、mが4であり、nが1である、[2]〜[5]のいずれか1項に記載の両親媒性分子。
[11]kが2であり、lが2であり、mが4であり、nが1である、[2]〜[5]のいずれか1項に記載の両親媒性分子。
[12]kが3であり、lが2であり、mが4であり、nが1である、[2]〜[5]のいずれか1項に記載の両親媒性分子。
[13]kが2であり、lが3であり、mが4であり、nが1である、[2]〜[5]のいずれか1項に記載の両親媒性分子。
[14]鎖状炭化水素基がミリスチル、パルミチル、ステアリル及びオレイル基からなる群から選ばれるものである、[1]〜[13]のいずれか1項に記載の両親媒性分子。
[15]式(Ia−1)〜(Ia−8):
[式中、Rc及びRdは、それぞれ独立して、炭素数8〜22の鎖状炭化水素基である。]
のいずれかで表される両親媒性分子。
[16]水溶液中、生理的なpH環境下で−NHが−NH になり、かつ、−COOHが−COOになって両イオン性を示すが、酸性pH環境下で−COOHのイオン化傾向が減少し、塩基性pH環境下で−NHのイオン化傾向が減少する、[15]記載の両親媒性分子。
[17]生理的なpH環境下でゼータ電位が中性あるいはマイナスの小胞体構造を形成して目的物質を保持し、酸性pH環境下でゼータ電位がプラスとなり、アニオン性生体膜との相互作用により小胞体構造が変化して目的物質を小胞体の外側に放出させる分子集合体を構成する、両親媒性分子。
[18][1]〜[16]のいずれか1項に記載の両親媒性分子である、[17]記載の両親媒性分子。
[19][1]〜[18]のいずれか1項に記載の両親媒性分子を含む分子集合体。前記分子集合体は、薬物、プローブ、核酸、タンパク質、ペプチド、金属イオン及び金属錯体からなる群から選択される少なくとも1種を保持するものであることが好ましい。
[20]生理的pH環境下でゼータ電位が中性あるいはマイナスの小胞体構造を形成して目的物質を保持し、酸性pH環境下でゼータ電位がプラスとなりアニオン性生体膜との相互作用により小胞体構造が変化して目的物質を小胞体の外側に放出させるものである、[19]記載の分子集合体。
[21]分子集合体が細胞内にエンドサイトーシスによって取り込まれたときに目的物質をエンドソームの外側に放出させるものである、[19]または[20]に記載の分子集合体。
[22]目的物質が、薬物、プローブ、核酸、タンパク質、ペプチド、金属イオン及び金属錯体からなる群から選択される少なくとも1種である、[20]または[21]記載の分子集合体。
[23][22]記載の分子集合体を含む薬剤。
[24]静脈内投与用薬剤である[23]記載の薬剤。
[25]局所投与用薬剤である[23]記載の薬剤。
[26]プローブまたは核酸を保持する[19]〜[21]のいずれか1項に記載の分子集合体を含む試薬。
[27]細胞内の遺伝子発現を制御するものである、[26]記載の試薬。
[28][26]または[27]記載の試薬を含むキット。
[29]タンパク質を保持する[19]〜[21]のいずれか1項に記載の分子集合体を含む酵素補充治療用タンパク質製剤。
本発明によれば、pH応答性を有する分子集合体及び両親媒性分子を提供することができる。
本発明の好ましい態様によれば、本発明の分子集合体は、pHが生理的な値よりも低くなると分子集合体に保持させた目的物質を放出する放出制御機能を有する。これにより、血中あるいは培地中に滞留していた分子集合体が、細胞内にエンドサイトーシスによって取り込まれたときにのみ、効率良く、薬物、蛋白質または核酸などをエンドソームから細胞質に放出させることが可能となる。
本発明の好ましい態様によれば、本発明の分子集合体は、血中滞留時に血管壁などに吸着されやすいN−[1−(2,3−Dioleoyloxy)propyl]−N,N,N−trimethylammonium methyl−sulfate(DOTAP)、1,2−Dimyristyloxypropyl−3−dimethyl−hydroxyethyl ammonium bromide(DMRIE)などのカチオン性脂質を用いることなく、目的物質を小胞体及びエンドソームの外側に送達することができる。このため、本発明の好ましい態様によれば、本発明の分子集合体は、アニオン性の生体膜との融合度が高く、生体適合性に優れており、血中滞留性も示すことから、in vivo製剤としての実用性に優れている。
本発明の好ましい態様によれば、本発明の両親媒性分子は、アミノ酸と長鎖アルコールとから合成することができるので、血液適合性が高く、細胞毒性も低いと考えられる。また、pH応答性分子集合体の調製を低コストかつ簡便な方法で行うことができるといった利点もある。
本発明を利用することにより、高機能の薬物運搬体あるいは核酸運搬体の創製に道筋を付けることができる。
図1は、本発明の分子集合体が、生体内に投与された後に、血中を滞留して目的の細胞内に取り込まれ、その保持していた目的物質を放出する挙動を示した概念図である。
図2は、化合物3を膜成分とするリポソームのゼータ電位測定結果を示したグラフである。
図3は、pH応答性リポソームとアニオン性リポソームの凝集度のpHによる変化を示したグラフである。
図4は、pH応答性リポソームとアニオン性リポソームの各pHにおける相対的な膜融合度を示したグラフである。
図5は、(化合物3)/cholesterol/PEG−Glu2C18を膜成分とするローダミン標識アルブミン内包リポソームのCOS−7及びCCD−32SKにおける細胞内動態を観察した共焦点顕微鏡写真である。
図6は、siRNAを内包した(化合物3)/cholesterol/PEG−Glu2C18を膜成分とするリポソームによる、ルシフェラーゼタンパク発現CHO細胞の遺伝子発現抑制評価の結果を示したグラフである。
図7は、(化合物3)/cholesterol/PEG−Glu2C18を膜成分とするリポソームの細胞毒性評価の結果を示したグラフである。
図8は、(化合物3)/cholesterol/PEG−Glu2C18を膜成分とするリポソーム投与後の化合物3のLC/MS/MS測定による血漿中濃度の時間変化の測定結果を示したグラフである。
図9は、(化合物3)/cholesterol/PEG−Glu2C18を膜成分とするリポソーム投与後の化合物3のLC/MS/MS測定による臓器分布の測定結果を示したグラフである。
図10は、(●)化合物7/cholesterol/PEG−Glu2C18(5/5/0.03(モル比))または(○)化合物8/cholesterol/PEG−Glu2C18(5/5/0.03(モル比))を膜成分とするリポソームのゼータ電位測定結果を示したグラフである。
図11は、(●)化合物3/cholesterol/PEG−Glu2C18(5/5/0.03(モル比))または(○)化合物12/cholesterol/PEG−Glu2C18(5/5/0.03(モル比))を膜成分とするリポソームのゼータ電位測定結果を示したグラフである。
図12は、化合物3または12を膜成分とするリポソームと、アニオン性リポソームの各pHにおける相対的な膜融合度を示したグラフである。
図13は、siRNA内包リポソーム1(DPPC/cholesterol/DHSG/PEG−Glu2C18)、siRNA内包リポソーム2(αGluGlu2C16/cholesterol/PEG−Glu2C18)及びsiRNA内包リポソーム3(化合物3/cholesterol/PEG−Glu2C18)による、ルシフェラーゼタンパク発現CHO細胞の遺伝子発現抑制評価の結果を示したグラフである。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、両親媒性分子、分子集合体、薬剤、試薬及びそのキット等を含むものである。以下、それぞれについて詳しく説明する。
[1]両親媒性分子
まず、本発明の両親媒性分子について述べる。
本発明の両親媒性分子は、式(I):
または、式(II):
[式中、X、X、X及びXは、それぞれ独立して、両イオン性官能基であり、A、A、A、A、A、A11、A12、A21及びA22は、それぞれ独立して、−COO−、−OCO−、−CONH−または−NHCO−であり、Rc及びRdは、それぞれ独立して、炭素数8〜22の鎖状炭化水素基であり、m、n、p及びqは、それぞれ独立して、1〜4の整数である。]で表される構造を有している。
本発明の両親媒性分子は、式(I)または(II)で示されるように、親水部に両イオン性官能基を複数有している。ここで「両イオン性官能基」とは、生理的なpH環境下及び酸性pH環境下でカチオン性を示す「カチオン性官能基」と、生理的なpH環境下でアニオン性を示す「アニオン性官能基」とを併有する官能基をいう。
本発明の両親媒性分子は、このように両イオン性官能基を複数有し、pH変化によるカチオン性またはアニオン性の電荷密度が大きいために、両イオン性置換基を一つしか持たない場合に比べて、pH応答性がより鋭敏になる。
なお、本発明の技術思想に基づいて、両イオン性置換基の数をさらに増加させることもできる。例えば、式(I)における結合基A11に、さらに下式:
[式中、X及びXは、それぞれ独立して、両イオン性官能基であり、A11、A112及びA112は、それぞれ独立して、−COO−、−OCO−、−CONH−または−NHCO−であり、rは、1〜4の整数である。]
で示されるような両イオン性置換基X及びXを持つ置換基を導入することによって、両イオン性官能基を親水部に樹岐状に形成していくことも可能である。
本発明の好ましい態様によれば、本発明の両親媒性分子は、このように親水部に両イオン性官能基を有するものであるので、生理的なpH環境下で中性を示し、酸性pH環境下でカチオン性を示し、さらには塩基性pH環境下でアニオン性を示すことができる。
本発明において、「生理的なpH環境下」とは、水溶液のpHが中性域であること、好ましくはpH6.0以上8.0未満、より好ましくは7.0以上7.6以下、さらに好ましくは7.2以上7.5以下であることをいう。
また、「酸性pH環境下」とは、水溶液のpHが中性域より低いこと、好ましくはpH7.2未満、より好ましくはpH7.0未満、さらに好ましくはpH6.5未満、特に好ましくはpH6.0未満、とりわけ好ましくはpH5.5以下であることをいう。
さらに、「塩基性pH環境下」とは、水溶液のpHが中性域より高いこと、好ましくはpH8.0超12以下であることをいう。
本発明において、「カチオン性官能基」は、水溶液中、生理的なpH環境下及び酸性pH環境下でカチオン性を示すものであれば特に制限されない。このようなカチオン性官能基としては、アミノ基、アンモニウム塩、グアニジノ基、イミダゾール基及びこれらの誘導体などが挙げられる。ここで「誘導体」とは、アミノ基、アンモニウム塩、グアニジノ基、イミダゾール基のもつ水素原子が、低級アルキル基(メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n−ブチル、iso−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、ヘキシルなど)、アミノアルキル基(アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピル、アミノブチルなど)、これに対応するオリゴ糖のアルキル基、水酸基、ヒドロキシルアルキル基(ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピルなど)、オリゴオキシアルキル基(オリゴオキシメチル、オリゴオキシエチル、オリゴオキシプロピルなど)などの置換基で置換された化合物をいう。これらの中でも、好ましいカチオン性官能基としては、1級アミノ基(−NH)、2級アミノ基(−NHR)、3級アミノ基(−NR)または4級アンモニウム塩(−NR )などが挙げられる。ここで、Rは、それぞれ独立して、低級アルキル基(メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n−ブチル、iso−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、ヘキシルなど)を示し、Xはハロゲン原子又は炭素数1〜2のアルキル硫酸あるいはパラトルエンスルホン酸を示す。中でも、1級アミノ基が特に好ましい。
本発明において、「アニオン性官能基」は、水溶液中、生理的pH環境下及び塩基性pH環境下でアニオン性を示すものであれば特に制限されない。例えば、このようなアニオン性官能基としては、カルボキシル基が好ましい。
本発明において、両イオン性官能基の構造は特に制限されないが、分子集合体を形成したときにより表面側にアニオン性官能基が位置する構造であることが好ましい。より具体的には、カチオン性官能基とアニオン性官能基とがメチレンスペーサーを介して結合していることが好ましく、特にメチレン基が1または2のメチレンスペーサーを介して結合していることがより好ましく、とりわけカチオン性官能基側は疎水部を構成する側に結合している構造であることが好ましい。
本発明の一実施形態において、本発明の両親媒性分子は、式(Ia)で表されるものであることが好ましい。
[式中、Raは、一つがカチオン性官能基であり、Raが複数ある場合、その他のRaは水素原子であり、Ra’は、一つがカチオン性官能基であり、Ra’が複数ある場合、その他のRa’は水素原子であり、Rb及びRb’は、それぞれ独立して、アニオン性官能基であり、Rc及びRdは、それぞれ独立して、炭素数8〜22の鎖状炭化水素基であり、A、A、A、A及びAは、それぞれ独立して、−COO−、−OCO−、−CONH−または−NHCO−であり、k、l、m及びnは、それぞれ独立して、1〜4の整数である。]
本発明の好ましい態様によれば、本発明の両親媒性分子は、水溶液中、生理的なpH環境下でカチオン性官能基及びアニオン性官能基がそれぞれイオン化してカチオン性官能基はカチオンになり、アニオン性官能基はアニオンになるが、酸性pH環境下ではアニオン性官能基のイオン化傾向が減少し、塩基性pH環境下ではカチオン性官能基のイオン化傾向が減少する。ここで、「イオン化傾向が減少する」とは、生理的なpH環境下において示したイオン化比率よりもイオン化比率が減少することをいう。
本発明において、A、A、A、A、A、A11、A12、A21及びA22は、それぞれ独立して、−COO−、−OCO−、−CONH−または−NHCO−である。A、A、A、A11、A12、A21及びA22は、それぞれ独立して、−CONH−または−NHCO−が好ましく、特に−CONH−が好ましい。A、A、A、A11、A12、A21またはA22が−CONH−であると、天然のアミノ酸またはその誘導体を原料に用いることができるため、低毒性かつ低価格であるという利点がある。なお、本明細書において「−結合基−」のように表記した場合、結合位置は、紙面左側が親水部、右側が疎水部である。A及びAは、それぞれ独立して、−COO−または−OCO−が好ましく、特に−COO−が好ましい。AまたはAが−COO−であると、天然のアミノ酸またはその誘導体を原料に用いることができるため、低毒性かつ低価格であるという利点がある。
本発明において、Rc及びRdは、それぞれ独立して、炭素数8〜22の鎖状炭化水素基である。鎖状炭化水素基は、共有結合にて導入できる疎水性の基であれば特に限定されない。鎖状炭化水素基は、直鎖または分岐鎖のいずれであってもよく、直鎖であることが好ましい。また、鎖状炭化水素基は、アルキル鎖、アルケニル鎖、アルキニル鎖、イソプレノイド鎖、ビニル基、カルボキシル基、水酸基、アミノ基、およびメルカプト基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。鎖状炭化水素基の炭素数は、12〜20が好ましく、14〜18がより好ましい。また、鎖状炭化水素基は二重結合や三重結合などの不飽和結合を有していてもよく、その場合にその数は1〜4が好ましい。炭化水素鎖は分岐鎖であってもよく、分岐鎖としては、例えば、長鎖にイソプレノイド構造を持つものが挙げられる。本発明において、鎖状炭化水素基は、ミリスチル、パルミチル、ステアリル、及びオレイル基からなる群から選ばれる基であることが好ましく、特にパルミチル基であることが好ましい。鎖状炭化水素基で構成される疎水部と親水部との組み合わせによって分子集合体を形成した際のゼータ電位挙動やアニオン性生体膜に対する融合度を調整することが可能である。鎖状炭化水素基は、親−疎水バランスを考慮しながら、両親媒性分子の親水部との組み合わせ、分子集合体の組成、目的及び用途等に応じて適宜選択すればよい。
本発明において、k、l、m、n、p及びqは、それぞれ独立して、1〜4の整数である。kは3であることが好ましく、lは3であることが好ましい。k及びlが3であると、グルタミン酸やその誘導体を原料に用いることができるため、低毒性かつ低価格であるという利点がある。また、kまたはlが2であると、アスパラギン酸やその誘導体を原料に用いることができるため、低毒性かつ低価格である。但し、k及びlの両方が2であると分子集合体を形成するときに小胞体構造を形成しにくい場合があるため、kまたはlのいずれか一方は3であることが好ましい。尚、カチオン性官能基とアニオン性官能基とはメチレンスペーサーを介して結合していてもよく、カチオン性官能基とアニオン性官能基とが同一の炭素原子に結合していてもよいが、既に述べたとおり、カチオン性官能基とアニオン性官能基とはメチレンスペーサーを介して結合していることが好ましく、特にメチレン基が1または2のメチレンスペーサーを介して結合していることがより好ましい。
また、m、p及びqは、それぞれ独立して、1〜4の整数であるが、4であることが好ましい。m、p及びqが4であるとリジンを原料に用いることができるため、低毒性かつ低価格である。
nは1〜4の整数であるが、2〜4であることが好ましい。nが2〜4であると、二分子膜中で本発明の両親媒性分子の鎖状炭化水素基を膜平面に対して略垂直に配向させることが期待できる。また、nが2〜4であると、水溶液中で両親媒性分子が集合して形成する二分子膜の親−疎水界面が安定であり小胞体構造を形成しやすい。さらに、nが2であると、グルタミン酸及びその誘導体を原料に用いることができるため、低毒性かつ低価格であるという利点もある。nが1であると、アスパラギン酸またはその誘導体を原料に用いることができるため、低毒性かつ低価格であるが、nが2の場合に比べて分子集合体の小胞体構造を形成しにくい場合がある。
式(Ia)における好ましいk、l、m及びnの組み合わせ(k,l,m,n)は、(3,3,4,2)、(2,2,4,2)、(3,2,4,2)、(2,3,4,2)、(3,3,4,1)、(2,2,4,1)、(3,2,4,1)(2,3,4,1)などである。
本発明の両親媒性分子の好ましい実施態様を以下に示す。
[式中、Rc及びRdは、前記で定義したとおりである。]
これらの中でも、本発明においては、上記式(Ia−1)、(Ia−2)及び(Ia−4)で示される化合物が好ましく、特に上記式(Ia−1)で示される化合物が好ましい。式中のRc及びRdの好適例は、前記したとおりである。
本発明の好ましい態様によれば、式(Ia−1)〜(Ia−8)で表される本発明の両親媒性分子は、水溶液中では、生理的なpH環境下で−NHが−NH になり、かつ、−COOHが−COOになって両イオン性を示すが、酸性pH環境下で−COOHのイオン化傾向が減少し、塩基性pH環境下で−NHのイオン化傾向が減少する。
本発明の両親媒性分子は、公知の反応を組み合わせることによって極めて簡便な方法で製造することができる。例えば、本発明の両親媒性分子は三官能性化合物を順次反応させ、例えば、下記式(I):
または、式(II):
[式中、X、X、X及びXは、それぞれ独立して、両イオン性官能基であり、A、A、A、A、A、A11、A12、A21及びA22は、それぞれ独立して、−COO−、−OCO−、−CONH−または−NHCO−であり、m、n、p及びqは、それぞれ独立して、1〜4の整数である。]
で表されるようなコア構造を作製する。鎖状炭化水素基は、予め鎖状炭化水素基の供給源を三官能性化合物の一つと反応させて導入し、それを他の三官能性化合物と順次反応させてもよいし、2つ以上の三官能性化合物からなる複合体に導入してもよい。
本発明に用いられる三官能性化合物は、アミノ基、カルボキシル基、水酸基等の反応性官能基を少なくとも3つ有するものであれば特に制限されない。例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジンなどの各種アミノ酸またはその誘導体、グリセロール、オリゴ糖類、オリゴペプチド類、ポリエステル類、ビニル系オリゴマーまたはこれらから構成される多分岐構造、例えばデンドロン構造などが挙げられる。
ここで、「アミノ酸の誘導体」とは、アミノ酸に含まれる水素原子が、低級アルキル基(メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n−ブチル、iso−ブチル等)、アミノアルキル基(アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピル、アミノブチルなど)や対応するオリゴアミノアルキル基、水酸基、ヒドロキシアルキル基(ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピルなど)、オリゴオキシアルキル基(オリゴオキシメチル基、オリゴオキシエチル基、オリゴオキシプロピルなど)などの置換基で置換された化合物が含まれる。
例えば、リジンの繰り返しからなるオリゴペプチド鎖は、側鎖にアミノ基を任意の数だけ有しており、そこに両イオン性官能基をアミド結合にて任意の数だけ導入することができる。疎水部はオリゴペプチド鎖のN末端のカルボキシル基に結合することができる。リジンからなるモノデンドロンでは、末端の官能基の数を世代数にて制御することができる。すなわち、第一世代では2個、第二世代では4個、第三世代では8個となる。
本発明に用いられる鎖状炭化水素基の供給源は、三官能性化合物あるいはそれらからなるコア構造と共有結合しうる反応性官能基、例えばアミノ基、水酸基またはカルボキシル基などを有する鎖状炭化水素基であれば特に制限されない。
本発明に用いられるカルボキシル基を有する鎖状炭化水素基の供給源としては、脂肪酸が挙げられる。例えば、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、イソ吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ウンデカン酸、ラウリル酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、マーガリン酸、ステアリン酸、ノナデカン酸、アラキン酸、ベヘン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸等であり、それぞれ分岐鎖体も含まれる。また、それらの酸無水物、または酸クロライドも含まれる。
また、アミノ基を有する鎖状炭化水素基の供給源としては、直鎖第一アミンとして、ドデシルアミン、トリデシルアミン、テトラデシルアミン、ペンタデシルアミン、ヘキサデシルアミン、ヘプタデシルアミン、オクタデシルアミン、ドコシルアミン、オレイルアミン等が挙げられ、それらの分岐鎖体も含まれる。さらに分岐状のイソプレノイド等のアミンも使用できる。また、アミノ基を有する脂肪族炭化水素基の供給源には、N−メチル−ドデシルアミン、N−メチル−テトラデシルアミン、N−メチル−ヘキサデシルアミン、N−エチル−ドデシルアミン、N−エチル−テトラデシルアミン、N−エチル−ヘキサデシルアミン、N−プロピル−ドデシルアミン、N−プロピル−テトラデシルアミン、N−プロピル−ヘキサデシルアミン、ジオレイルアミン等の第二アミンも含まれ、それらの分岐鎖体も用いられる。
水酸基を有する鎖状炭化水素基の供給源としては、直鎖第一飽和アルコールとしてラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ベヘニルアルコール等が挙げられる。その他、1,1−ドデセノール、1−オレイルアルコール、リノレニルアルコール等の直鎖第一飽和アルコール、分岐第一飽和アルコール、分岐第一不飽和アルコール、第二飽和アルコールあるいは第二不飽和アルコールが挙げられる。また、これらアルコール類をグリセリンの1,3−位あるいは1,2−位に結合したジアルキルグリセロール、第一飽和アルコール及び第一不飽和アルコールで構成されたジアルキルグリセロールが挙げられる。
その他、本発明に用いられる鎖状炭化水素基の供給源としては、ステロール類が挙げられる。例えば、コレステロール、コレスタノール、シトステロール及びエルゴステロール等である。
本発明の両親媒性分子の代表的な合成経路を示すと以下のとおりである。
まず、化合物(a)に、鎖状炭化水素基の供給源(例えば、Rc−OHまたはRd−OH)を反応させ、化合物(b)を得る。反応は、酸触媒による脱水縮合反応、活性エステル化法、酸無水物法、混合酸無水物法、カルボン酸ハロゲン化法、カルボン酸アジド法等を用いて行うことができる。中でも、酸触媒による脱水縮合が最も簡便であり、精製も容易であるので好ましい。脱水縮合反応は常法に従い行うことができる。但し、酸触媒による脱水縮合の場合、加熱を必要とするため、原料が熱に対して不安定な場合は他の方法を選択するのが好ましい。なお、目的の部位で目的の反応を生じさせるために、必要に応じて、化合物(a)の反応性官能基をtert−ブトキシ基、tert−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基等の保護基で保護しておくことが好ましい。
次に、上記で得られた化合物(b)に、化合物(c)を反応させ、化合物(d)を得る。化合物(c)は、予めアミノ基をtert−ブトキシ基、tert−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基などにより保護し、カルボキシル基はN−ヒドロキシスクシンイミドなどにより活性化しておくことが望ましい。次の工程で、化合物(e)及び(e’)が異なる化合物である場合、化合物(c)の2つのアミノ基は、それぞれ反応性の異なる保護基で保護しておくことが好ましい。例えば、一方をtert−ブトキシカルボニル基で保護し、他方をベンジルオキシカルボニル基で保護しておくと、次の工程で化合物(e)または(e’)を化合物(c)のそれぞれのアミノ基と選択的に反応させることができる。反応は、活性エステル法、酸無水物法、混合酸無水物法等を用いることができる。また、通常のペプチド合成と同様の方法で固相合成を行うこともできる。なお、反応は、第三級アミンなどの触媒の存在下で行うことが好ましい。
反応終了後は、トリフルオロ酢酸などの酸で処理して脱保護し、常法により精製して化合物(d)を得ることができる。なお、反応の終点は、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、核磁気共鳴スペクトル及び赤外吸収スペクトル等によって確認することができる。
次いで、得られた化合物(d)のアミノ基に化合物(e)及び(e’)を反応させる。化合物(e)及び(e’)は、予め、アミノ基をtert−ブトキシ基などにより保護し、カルボキシル基は一方をtert−ブトキシ基で保護し、他方をN−ヒドロキシスクシンイミドなどにより活性化しておくことが望ましい。反応は、活性エステル法、酸無水物法、混合酸無水物法等を用いることができる。また、通常のペプチド合成と同様の方法で固相合成を行うこともできる。反応は、第三級アミンなどの触媒の存在下で行うことが好ましい。
反応終了後は、上記と同様にして脱保護し、常法に従い精製して化合物(f)を得ることができる。反応の終点は、上記と同様にして確認することができる。
なお、上記反応は、いずれも室温で行うことができる。また、反応は、加圧、減圧または大気圧のいずれの圧力下でも行うことができるが、操作が簡便であることから、大気圧雰囲気下で行うことが望ましい。
本発明の両親媒性分子は、上記のようにして製造することができる。本発明の好ましい態様によれば、本発明の両親媒性分子を分子集合体の構成成分として用いることにより、生理的条件下でゼータ電位が中性あるいはマイナスの小胞体構造を形成して目的物質を保持し、酸性条件下でゼータ電位がプラスとなりアニオン性生体膜との相互作用により小胞体構造が変化して目的物質を小胞体の外側に放出させることができる。
本発明の両親媒性分子は、親水部にカチオン性官能基とアニオン性官能基とを有することにより上記のような特性を有する分子集合体を構成することができるものであれば、その構造は前記したものに限られない。本発明の技術思想に基づき、設計変更等された化合物であって、上記のような機能を奏するものであればすべて、本発明の範囲内に含まれることが理解されるべきである。
[2]分子集合体
本発明の分子集合体は、その構成成分として、前述した本発明の両親媒性分子を含む。ここで「分子集合体」とは、本発明の両親媒性分子を、必要に応じてステロイド類及び他の両親媒性分子と共に水系媒体に分散させたときに形成される特定の形態をもつ分子の集合物をいう。
本発明の好ましい態様によれば、本発明の分子集合体は、その構成成分として本発明の両親媒性分子を含むものであるので、pH応答性を示すことができる。すなわち、水溶液中、生理的なpH環境下ではゼータ電位が中性あるいはマイナスの小胞体構造を形成するが、酸性pH環境下では本発明の両親媒性分子においてアニオン性官能基のイオン化傾向が減少し、分子集合体の正味の電荷がカチオン性になるため、ゼータ電位がプラスとなり、アニオン性生体膜と相互作用しやすくなる。より好ましくは、本発明の分子集合体は、生理的なpH環境下でゼータ電位が中性あるいはマイナスの小胞体構造を形成して目的物質を保持し、酸性pH環境下でゼータ電位がプラスとなりアニオン性生体膜との相互作用により小胞体構造が変化して目的物質を小胞体の外側に放出させることができる。
本発明の分子集合体のゼータ電位がマイナスからプラスに変化するpH範囲は特に限定されるものではない。本発明の分子集合体のゼータ電位がマイナスからプラスに変化するpH範囲は、用いる両親媒性分子の種類や他の構成成分との組み合わせ及びその配合比等によって調整可能であり、目的や用途等に応じて適宜選択することができる。本発明の分子集合体のゼータ電位がマイナスからプラスに変化する好ましいpH範囲は4.0以上、より好ましくは4.5以上、さらに好ましくは5.0以上、特に好ましくは5.5以上である。また、該pHは、好ましくは7.2未満、より好ましくは7.0未満、さらに好ましくは6.5未満、特に好ましくは6.0未満、とりわけ好ましくはpH5.5以下である。本明細書では、これらの上限と下限を自由に組み合わせた範囲が開示されているものとする。
本発明の一実施形態において、本発明の分子集合体は、エンドソーム内環境の代表的なpH4.0〜6.0にてゼータ電位がマイナスからプラスに変化することができるため、標的細胞に取り込まれた際にエンドソーム膜融合して保持している目的物質を細胞質側に放出する能力が高いと考えられる。
本発明の分子集合体が示すこのような挙動は、水溶液のpHに応答して、両親媒性分子の親水部の電荷バランスが変化し、それが分子集合体の分子充填状態に影響して分子集合体の構造が変化することによって生じるものと考えられる。本発明の好ましい態様によれば、本発明の分子集合体の上記性質を利用することにより、目的物質を目的患部に効率よく送達させることができる。また、本発明の好ましい態様によれば、本発明の分子集合体は、細胞内のアニオン性生体膜であるエンドソームに取り込まれたときに目的物質をエンドソームの外側の細胞質に放出させることができる。
以下、図面を参照しながら本発明の分子集合体の放出挙動について説明する。図1は、本発明の分子集合体が、目的の細胞内に取り込まれ、その保持していた目的物質を放出する挙動を示した概念図である。
まず、本発明の分子集合体は、細胞内に取り込まれる前は、生理的なpH環境下で分子集合体の小胞体構造を保持し、内包物を安定に保持している(図1(a))。生理的なpH環境下では、分子集合体のゼータ電位は中性またはマイナスであることから、例えば血中に投与した際には、血中滞留時の表面電位がマイナスである血管壁などへの吸着は回避され、良好な血中滞留性を示す。この分子集合体は、生体内を循環しながら細胞膜に近づき、そこでエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれる(図1(b))。
エンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれた分子集合体は、エンドソーム内の酸性pH環境下でゼータ電位が中性またはマイナスからプラスに変化し、負電荷脂質が豊富なエンドソーム膜はゼータ電位がマイナスであるためにエンドソーム膜への吸着が促進される。そして、エンドソーム膜との相互作用(好ましくは融合)により分子集合体の小胞体構造が変化する。これによって、保持していた目的物質をエンドソームの外側に放出させることができる(図1(c))。
本発明の好ましい態様によれば、本発明の分子集合体は、エンドソームの環境に近いpH環境下で目的物質を送達させることができるため、より多くの目的物質を短時間で細胞質内に送達させることができる。
通常、異物は、細胞内にエンドサイトーシスによって取り込まれた後、分解酵素を含むライソソームにおいて消化されてしまう。これに対し、本発明の分子集合体は目的物質を分子集合体に保持させたものであるので、ライソソームにおける分解を受ける前に目的物質を細胞内あるいは核内に効率よく送達させることが可能である。なお、図1は一例であり、分子集合体の形状、目的物質の保持方法、目的物質の放出挙動などは図1に何ら制限されない。
本発明の分子集合体において、使用する本発明の両親媒性分子は1種であっても、2種以上の組み合わせであってもよい。本発明の分子集合体における両親媒性分子の含有量は、分子集合体の構成成分の合計モル数に対して、10〜100モル%が好ましく、20〜80モル%がより好ましく、30〜60モル%がさらに好ましい。本発明の両親媒性分子の含有量が高いほど、目的物質の放出速度または放出率を高めることができる。本発明の両親媒性分子の含有量は、目的物質を導入したい体内の部位、所望の放出率または所望の放出速度などによって適宜調整することができる。
本発明の分子集合体はまた、本発明の両親媒性分子に加えて、他の構成成分を含むことができる。例えば、本発明の分子集合体はステロイド類を含むことができる。ステロイド類としては、ステロール類、胆汁酸、プロビタミンD、ステロイドホルモンなど、ペルヒドロシクロペンタノフェナントレンを有する全てのステロイドが挙げられる。中でもステロール類を用いることが好ましい。ステロール類としては、例えば、エルゴステロール、コレステロール等が挙げられる。中でもコレステロールを用いることが好ましい。
本発明の分子集合体に用いられるステロイド類の含有量に特に制限はないが、分子集合体の構成成分の合計モル数に対して、10〜60モル%が好ましく、20〜50モル%がより好ましい。ステロイド類は、分子集合体の安定化剤として作用することができるので、所望の放出速度及び放出率などに応じて適宜調整すればよい。これらのステロイド類は1種でも2種以上を組み合わせて使用してもよい。
さらに、本発明の分子集合体は、本発明の目的を損なわない範囲、特に、本発明の分子集合体を血中投与する場合は血中滞留性に悪影響を及ぼさない範囲であれば、本発明の両親媒性分子以外の両イオン性脂質、カチオン性脂質及びアニオン性脂質からなる群から選ばれる少なくとも1種のイオン性の脂質成分を含んでもよい。
これらのイオン性脂質は1種単独でも2種以上を組み合わせて使用することもできる。これらの脂質の含有量は特に制限されるものではないが、分子集合体の構成成分の合計モル数に対して、0〜90モル%が好ましく、0〜50モル%がより好ましい。但し、これらのカチオン性脂質は、血中滞留時の血管壁などに吸着されやすいことから、分子集合体の血中滞留性を低下させる場合があるので、カチオン性脂質の使用量は、分子集合体の構成成分の合計モル数に対して、0〜50モル%程度であることが好ましい。
さらに本発明の分子集合体には、ポリエチレングリコール型脂質を含有することもできる。ポリエチレングリコール型脂質を構成成分として用いることにより、分子集合体の凝集が抑制され、生体内に投与された後の血中滞留時間を延長させることができる。ポリエチレングリコール型脂質は1種単独でも2種以上を組み合わせて使用することもできる。これらのポリエチレングリコール型脂質の含有量は特に制限されるものではないが、分子集合体の構成成分の合計モル数に対して、0〜30モル%が好ましく、0.1〜0.5モル%がより好ましい。本発明に用いることができるポリエチレングリコール型脂質のポリエチレングリコール部の分子量は特に制限されないが、200〜5万程度であることが好ましく、5000〜2万程度であることがより好ましい。
その他、本発明の分子集合体は、卵黄レシチン、大豆レシチン、水添卵黄レシチン、水添大豆レシチン、ホスファチジルコリン類、ホスファチジルグリセロール類、ホスファチジルエタノールアミン類、スフィンゴミエリン、多種の糖脂質など分子集合体の構成成分として知られているリン脂質を1種または2種以上含有することができる。これらの脂質の含有量は特に制限されるものではないが、分子集合体の構成成分の合計モル数に対して、0〜80モル%が好ましく、40〜70モル%がより好ましい。
本発明の好ましい態様によれば、本発明の分子集合体は目的物質を保持している。ここで「分子集合体が目的物質を保持している」とは、分子集合体内部の親水領域(水相)あるいは脂質二分子膜内または分子膜の外側表面に目的物質が相互作用している状態のことをいう。例えば、(i)水溶性もしくは疎水性の目的物質が分子集合体内部の水相に局在する状態、(ii)水溶性もしくは疎水性の目的物質が親水性高分子により包括されている複合体が、分子集合体内部の水相に局在する状態、あるいは(iii)疎水性の目的物質が二分子膜内の疎水領域または二分子膜の外側表面に局在する状態などが挙げられる。
本発明の分子集合体に用いられる目的物質は、本発明の分子集合体に保持することができるものであれば特に限定されない。目的物質は、標的となる臓器または組織、細胞の少なくとも一つに作用するものであることが好ましい。例えば、薬物、プローブ、核酸(任意のDNA、RNA、siRNAなどを含む)、タンパク質、ペプチド、金属イオン(任意のリチウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、鉄イオン、銅イオン等を含む)及び金属錯体(任意の鉄錯体、銅錯体、白金錯体、ガドリニウム錯体、バナジウム錯体、亜鉛錯体、マンガン錯体を含む)からなる群から選択される少なくとも1種であることが好ましい。本発明の好ましい態様によれば、本発明の分子集合体に保持されたこれらの物質は、エンドサイトーシスによって細胞内のエンドソーム内に取り込まれた後、細胞質内に放出されることにより、効率良く細胞内に送達することができる。本発明の分子集合体に保持させる目的物質の分子量は、通常5〜1000000、好ましくは30〜1000000、より好ましくは200〜500000、さらに好ましくは300〜100000である。
本発明に用いられる目的物質は、例えば、酵素、ペプチドまたはタンパク質、抗体(単鎖抗体含む)、受容体、リガンド、各種抗生物質、各種ペプチド性ホルモン、DNA、RNA、siRNA、プラスミド、プローブ、各種抗がん剤、中枢神経系用薬、末梢神経用剤、感覚器官用薬、循環器官用薬、呼吸器官用薬、消化器官用薬、ホルモン剤、泌尿生殖器官及び肛門用薬、外皮用薬、歯科口腔用剤、ビタミン剤、滋養強壮薬、血液および体液用薬、人工透析用薬、その他の代謝性医薬品、細胞賦活用剤、腫瘍用薬、放射性医薬品、アレルギー用薬、生薬および漢方処方に基づく医薬品、抗生物質製剤、化学療法剤、生物学的製剤、診断用薬などが挙げられる。ペプチドまたはタンパク質の一例としては、抗体、受容体、リガンド、インターロイキン等の各種サイトカイン、細胞伝達因子、細胞成長因子、フィブリノーゲン、コラーゲン、ケラチン、プロテオグリカン等細胞外マトリックス剤としてのポリペプチドまたはその構造の一部としてのオリゴ体、あるいはオキシトシン、ブラジキニン、チロトロビン放出因子、エンケファリン等の機能性ポリペプチドが挙げられる。酵素としては、カタラーゼ、キモトリプシン、チトクローム、アミラーゼなどが挙げられるが、これらに何ら限定されるものではない。プローブの一例としては、抗体、抗原、色素、あるいは蛍光色素など諸種の標識体や活性物質などが挙げられる。これらの物質は、1種単独で用いてもよく、2種以上を組み合わせて用いることもできる。
本発明の分子集合体に保持される目的物質の含有量は、目的物質の種類または目的等によって大きく異なるものではあるが、分子集合体の構成成分の全重量(但し、目的物質の重量を除く)に対して、0.001〜1000重量%が好ましく、0.01〜200重量%がより好ましく、0.1〜50重量%がさらに好ましい。
本発明の分子集合体の形状は特に制限されないが、例えば、高分子集合体(ポリマーコンプレックス、高分子ミセル、高分子化リポソーム等)、エマルジョン、リピドマイクロスフィア、二分子膜小胞体(リポソーム)、その他の分子集合体(チューブ、ファイバー、リボン、シート等)などが挙げられる。中でも、リポソームであることが好ましい。
本発明の分子集合体がリポソームである場合、リポソームを水性媒体中に分散させると、リポソームは内水相を含むことができる。このとき、分子集合体に保持されている目的物質は、リポソーム内水相に溶解または分散しているものであることが好ましい。あるいは、リポソーム二分子膜の疎水性領域内に目的物質を保持させるなど、目的物質が二分子膜内に局在したものであってもよい。
なお、本明細書において、分子集合体の構成成分の含有量をいう場合、内水相は考慮しないこととする。
本発明の分子集合体の粒径は、25〜10000nmが好ましく、100〜500nmがより好ましく、150〜300nmがさらに好ましい。
本発明の分子集合体の製造方法は特に限定されるものではなく、公知の方法に準じて製造することができる。例えば、リポソームの製造の手法としては、単独または混合脂質の粉末もしくは薄膜を水和させ分散させた後、高圧押出し(エクストルージョン)法、超音波照射法、撹拌(ボルテックスミキシング、ホモジナイザー)法、高速攪拌法、フレンチプレス法、凍結融解法、マイクロフルイダイザー法などを用いて製造する方法、単独または混合脂質を有機溶媒に溶解させた溶液を水相に注入した後、エタノールまたはエーテルなどの有機溶媒を減圧または透析で除去して形成する方法、あるいは、単独または混合脂質をコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、Triton X−100、オクチルグリコシドまたはラウリルエーテルなどの非イオン性界面活性剤と共に水相に分散させてエマルジョンを形成させ、透析によって除去して形成する方法、その他、逆相蒸発法、インキュベーション法などを採用することができる。
本発明の分子集合体に目的物質を保持させる方法は、目的物質の種類等に応じて適宜選択すればよい。例えば目的物質が水溶性薬物である場合は、分子集合体の製造時に該薬物を水相に溶解し、前述した方法で分子集合体を形成する際に、分子集合体(例えばリポソームの内水相)に内包させることができる。あるいは膜透過性のある水溶性薬物の場合には、分子集合体(リポソーム)を形成させてから、外水相に薬物を溶解して、膜透過性を利用して内水相に内包させることができる。内包されなかった水溶性物質はゲルろ過、超遠心分離または限外ろ過膜処理などにより内包小胞体と分離できる。
あるいは、目的物質が脂溶性や両親媒性の薬物である場合は、単独または混合脂質が有機溶媒に溶けている状態で当該薬物を混合して、前述した方法で分子集合体を形成することにより、分子集合体の疎水部(例えばリポソームの二分子膜内)に薬物を保持させることができる。あるいは前述した方法で分子集合体の分散液を調製してからエタノールやDMSOなど水と混ざる溶媒に薬物を溶解した溶液を添加して薬物を疎水部に保持させることができる。
目的物質がプローブ、核酸またはタンパク質などの場合は、上記と同様の方法で分子集合体に目的物質を保持させるか、あるいは分子集合体の外側表面に目的物質を局在させることにより目的物質を保持することができる。
[3]分子集合体の用途
(1)薬剤
例えば、本発明の分子集合体に薬物を保持させた場合、本発明の分子集合体は薬剤として使用することができる。薬物の含有量は、薬物の種類または目的に応じて適宜決定することができるが、分子集合体の構成成分の全重量(但し、目的物質の重量を除く)に対して0.001〜1000重量%が好ましく、0.01〜100重量%がより好ましく、0.1〜10重量%がさらに好ましい。本発明の薬剤の投与方法は特に限定されない。本発明の薬剤は、例えば、経口、非経口、静脈、口内、直腸、膣、経皮、鼻腔経路経由または吸入経由、さらには疾患部位に対して直接投与(局所投与)することができる。本発明の薬剤の投与量は、有効量の範囲内であれば良く、対象疾患、投与対象、投与方法、症状などによっても異なるが、通常、体重1kg当たり、1日につき、約0.001〜約1400mg(分子集合体の構成成分(脂質)重量)である。
本発明の分子集合体に保持する薬物としては、各種抗がん剤、中枢神経系用薬、末梢神経用剤、感覚器官用薬、循環器官用薬、呼吸器官用薬、消化器官用薬、ホルモン剤、泌尿生殖器官及び肛門用薬、外皮用薬、歯科口腔用剤、ビタミン剤、滋養強壮薬、血液および体液用薬、人工透析用薬、その他の代謝性医薬品、細胞賦活用剤、腫瘍用薬、放射性医薬品、アレルギー用薬、生薬および漢方処方に基づく医薬品、抗生物質製剤、化学療法剤、生物学的製剤などが含まれる。
(2)試薬、診断薬及びキット
また、本発明の分子集合体にプローブ、抗体または核酸を保持させた場合、本発明の分子集合体は試薬または診断薬として使用することができる。例えば、本発明の分子集合体にプローブを保持させた場合、本発明の分子集合体は遺伝子等の生体物質検出用試薬・診断薬に、または細胞内物質の局在または機能を診断するための試薬として有用である。
本発明に用いられるプローブは、遺伝子、遺伝子産物等の特定の物質、部位、状態などを検出するための分子であれば特に制限されない。プローブの一例としては、抗体、抗原、色素あるいは蛍光色素など諸種の標識体または活性物質が挙げられる。このうち、生理活性物質(生体に対して作用する物質)として、例えば核酸、タンパク質、その他小分子を含む。例えば、プローブとして蛍光色素を保持させた場合、本発明の試薬は、生体内でのリポソームの局在部位を検出する際などに使用することができる。
本発明の分子集合体に保持させるプローブの含有量は、その種類または目的に応じて適宜決定することができるが、分子集合体の構成成分の全重量(但し、目的物質の重量を除く)に対して0.001〜1000重量%が好ましく、0.01〜100重量%がより好ましく、0.1〜10重量%がさらに好ましい。
また、例えば、本発明の分子集合体に核酸を保持させた場合、本発明の分子集合体は核酸導入剤として有用である。本発明の分子集合体を含む核酸導入剤は、ライソソームによって消化されることなく、細胞質内あるいは細胞核内に効率良く目的遺伝子を送達することができるので遺伝子治療等に有用である。
例えば、本発明の分子集合体に、デコイDNA、siRNAまたはアンチセンスDNAなどの遺伝子発現を制御する核酸を保持させることにより、特定遺伝子のノックダウンを促す試薬等として有用である。
本発明の試薬を遺伝子治療に用いるときは、例えば、経口、非経口、静脈、口内、直腸、膣、経皮、鼻腔経路経由または吸入経由さらには疾患部位に対して直接生体内に投与することができる。
本発明の試薬を核酸導入に用いるときは、その使用量は、細胞1×10個あたり0.001〜100pmol、好ましくは0.1〜10pmol程度の量(分子集合体の構成成分(脂質)モル数)であるが、従来の遺伝子導入試薬として用いられてきたリポフェクトアミン、トランソーム、DOTAPおよびDMRIEなどのカチオン性脂質を構成脂質にしたリポソーム試薬等の使用量を参考にして適宜設定することができる。この用量により、従来の遺伝子導入試薬(リポフェクトアミン)に比べて細胞毒性を伴うことなく同程度の導入効率が得られる。
また、本発明は、上記試薬または診断薬を含む、生体物質検出用、細胞内物質の局在または機能診断用あるいは遺伝子治療用キットを提供する。本発明のキットには、緩衝液、pH調整剤、細胞保護液などを単独で、または適宜組み合わせて含めることができる。必要に応じて、トランスフェクションの対照として用いられる標準核酸を含んでもよい。このような核酸としては、レポーター又はマーカータンパク質(例えばルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、GFP等)をコードする核酸が挙げられる。核酸は、プラスミドベクターの形態であってもよい。さらに、本発明のキットには、必要に応じて例えばDEAEデキストラン等のトランスフェクション増強試薬及び他の添加剤を含めることが可能である。さらに、本発明のキットには、遺伝子、遺伝子産物等の特定の物質、部位、状態などを検出するための使用説明書あるいは核酸を導入するための使用説明書を含めることができる。キットに含まれる各成分は、例えば、各成分を容器中に封入した包装形態としてもよい。
(3)酵素補充治療用タンパク質製剤
本発明の分子集合体にタンパク質を保持させた場合、本発明の分子集合体は酵素補充治療用製剤として使用することができる。タンパク質としては、アデノシンデアミナーゼ、一酸化窒素合成酵素、スーパーオキシドディスムターゼ、アルギノコハク酸合成酵素、フェニルアラニン水酸化酵素、α−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼなどが挙げられる。本発明の酵素補充治療用製剤は、例えば、特定酵素の発現が全くあるいは十分に行われない患者に対して用いることができる。タンパク質の含有量は、種類または目的に応じて適宜決定することができるが、分子集合体の構成成分の全重量(但し、目的物質の重量を除く)に対して0.001〜1000重量%が好ましく、0.01〜200重量%がより好ましく、0.1〜50重量%がさらに好ましい。本製剤の投与方法は、特に限定されない。本製剤は、例えば、経口、非経口、静脈、口内、直腸、膣、経皮、鼻腔経路経由または吸入経由で投与することができる。製剤の使用量は、有効量の範囲内であれば良く、対象疾患、投与対象、投与方法、症状などによっても異なるが、通常、体重1kg当たり、1日につき、約0.001〜約1400mg(分子集合体の構成成分(脂質)重量)である。
以下、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら制限されない。
〔実施例1〕
pH応答性両親媒性分子(GGLG:Ia−1)の合成
工程(A):p−トルエンスルホン酸一水和物(4.56g、24mmol)のベンゼン溶液(100mL)を85℃にて沸点還流し、Dean−Starkを用いて反応前に水を除去した。反応液にグルタミン酸(2.96g、20mmol)とヘキサデシルアルコール(10.7g、44mmol)を添加し、10時間かけて生成水を除去しながら沸点還流した。反応の進行に伴い、懸濁液は徐々に溶解し透明に変化した。
反応終了後、溶媒を減圧除去し、クロロホルムに溶解して、炭酸ナトリウム飽和水溶液で3回洗浄した。クロロホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧除去した。残留物はメタノールから4℃にて再結晶し、化合物1(収率83%)を白色粉末で得た。
(1)化合物1の分析結果は以下のとおりであった。
薄層クロマトグラフィー(シリカゲルプレート、クロロホルム/メタノール(4/1)(容量/容量):R:0.83(モノスポット))。
赤外吸収スペクトル(cm−1):1737(νC=O,ester).
H−NMR(CDCl、500MHz、δppm):0.88(t,6H,−CH);1.25(br,52H,alkyl);1.62(m,4H,−CO−O−C−CH−);1.84(m,1H,glu β−CH−);2.08(m,1H,glu β−CH−);2.45(t,2H,glu γ−CH−);3.45(t,1H,glu α−CH−);4.06,4.12(t,4H,−CO−O−CH−)
MS(ESI)Calcd:595.9;Found:597.3(MH)
工程(B):工程(A)で得られた化合物1(1.0g、1.67mmol)と、トリエチルアミン(202mg、2.0mmol)をジクロロメタン30mLに溶解し、1時間室温で撹拌した。その後、アミノ基をt−ブトキシ基で保護し、カルボキシル基をN−ヒドロキシスクシンイミドにより活性化させたリジン(617mg、1.4mmol)を添加し、さらに6時間室温で撹拌した。
反応終了後、溶媒を減圧除去し、クロロホルムに溶解して、炭酸ナトリウム飽和水溶液で3回洗浄した。クロロホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧除去した。残留物はメタノールから4℃で再結晶し、グラスフィルター(G6)ろ過して、アミノ基が保護されたリジン誘導体を得た。
得られた誘導体にトリフルオロ酢酸(20mL)を加え、4℃で、2時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧除去し、クロロホルムに溶解して、炭酸ナトリウム飽和水溶液で4回洗浄した。クロロホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧除去した。残留物はメタノールから4℃で再結晶し、ろ過し、乾燥して、化合物2(80%)を白色粉末として得た。
化合物2の分析結果は以下のとおりであった。
):薄層クロマトグラフィー(シリカゲル、クロロホルム/メタノール(4/1)(容量/容量):R:0.63(モノスポット))
赤外吸収スペクトル(cm−1):1737(νC=O,ester);1673(νC=O,amide)
H−NMR(CDCl,500MHz,δ(ppm)):0.83(t,6H,−CH);1.19(br,52H,−CH−);4.33(d,1H,glu α−CH−);4.50(br,1H,lys α−CH−);7.8,8.2(br,2H,−NH
工程(C):工程(B)で得られた化合物2(500mg,691mmol)とトリエチルアミン(107μl,829mmol)をジクロロメタン30mLに溶解し、1時間室温で撹拌した。その後、アミノ基がt−ブトキシ基、γ−カルボキシル基がt−ブチルエステル基で保護され、α−カルボキシル基がN−ヒドロキシスクシンイミドにより活性化されたグルタミン酸(639mg、1.45mmol)を添加し、さらに6時間室温で撹拌した。
反応終了後、溶媒を減圧除去し、クロロホルムに溶解して、炭酸ナトリウム飽和水溶液で3回洗浄した。クロロホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧除去した。残留物はメタノールから4℃で再結晶し、グラスフィルター(G6)ろ過して、アミノ基を保護したリジン誘導体を得た。
得られたリジン誘導体にトリフルオロ酢酸(20mL)を加え、4℃で、2時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧除去し、クロロホルムに溶解して、炭酸ナトリウム飽和水溶液で2回洗浄した。クロロホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧乾燥して、本発明の両親媒性分子である化合物3(GGLG:Ia−1)(65%)を白色粉末として得た。
化合物3の分析結果は以下のとおりであった。
):薄層クロマトグラフィー(シリカゲル、クロロホルム/メタノール(4/1)(容量/容量):R:0.05(モノスポット))
赤外吸収スペクトル(cm−1):1737(νC=O,ester);1673(νC=O,amide)
H−NMR(CDCl、500MHz、δ(ppm)):0.84(t,6H,−CH);1.23(br,52H,alkyl);3.88,3.93(t,1H,glu α−CH−Lys−);4.34(q,1H,lys α−CH−);4.44(q,1H,glu α−CH−COO−)
合成された本発明の両親媒性分子は、三段階で合成でき、精製も再結晶のみで行うことができるため、短時間でかつ簡便な方法で40%超の高収率で大量合成できる利点を持つ。これは、現在までに報告されているDOPEなどのリン脂質誘導体と比較しても格段に有利な点である。
〔実施例2〕
リポソームの調製
化合物3(174mg、0.177mmol)、コレステロール(69.3mg、0.179mmol)、N−methoxypolythylene glyco−1,5−dioctadecyl−L−glutamate(PEG−Glu2C18:PEG,Mw5000)(6.0mg、1.0μmol)をベンゼンに溶解させ、凍結乾燥して混合脂質を調製した。この混合脂質20mgを注射用水1mLに分散し、6時間攪拌後、高圧押出法(最終孔径0.22μm)にて粒子径約225nmのリポソーム(以下、「pH応答性リポソーム」という場合がある。)を調製した。
(ゼータ電位測定)
調製したリポソーム([lipid]=10mg/ml)をpH7.4,7,6,5,4の酢酸緩衝液(30mM)にそれぞれ添加し、最終濃度を[lipid]=1mg/mLとして37℃におけるゼータ電位を測定した。Malvern社製の型式Zetasizer4を用いて、測定濃度に希釈したリポソーム分散液をキャピラリーセルに充填し、37℃にて3回測定した。その結果を図2に示す。
図2からわかるように、化合物3を構成成分とするリポソームは、pHの低下に伴ってゼータ電位が上昇し、マイナスからプラスへと変化した。これは、pH7.4ではリポソームのゼータ電位がマイナスであり、親水部のγ位のカルボキシル基がアミノ基よりも表面に突出しているためであると考えられる。すなわち、pHの低下(pH5−6)に伴い、ゼータ電位がプラスとなるのはグルタミン酸のカルボキシル基が解離状態から非解離状態になったためであると考えられる。図2において、(○)は化合物3/cholesterol/PEG−Glu2C18(5/5/0.03(モル比))のゼータ電位変化を示す。
(アニオン性生体膜との相互作用の検討1)
エンドソーム膜はホスファチジルセリン(PS),ホスファチジルグリセロール(PG)などのアニオン性脂質が多く含有することが知られている。そこで、エンドソーム内におけるpH応答性リポソームの挙動解析として、アニオン性生体膜への吸着作用を明らかとするために、アニオン性リポソーム(c.a.250nm)とpH応答性リポソーム(c.a.250nm)の各pHでの凝集度(融合も含む)を粒径変化によって測定した。
アニオン性リポソーム(ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)/cholesterol/ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)=4/5/1(モル比),[lipid]=1mg/ml)とpH応答性リポソーム([lipid]=1mg/ml)を、30mM酢酸緩衝液に各々50μL添加し、粒径を光散乱光度計により測定した。Beckman社製の型式N4 PLUS Submicron Particle Size Analyzerを用いて、測定濃度に希釈したリポソーム分散液2mLをセルに充填し、動的光散乱法により3回見かけの粒子径を測定した。その結果を図3に示す。図3において、各pH(4,5,6,7,7.4)における凝集度を示した(n=3)。
図3からわかるように、アニオン性リポソームまたはpH応答性リポソームはpHによらず粒子径は一定であったが、pH応答性リポソームをアニオン性リポソームと混合すると、分散媒のpH低下に伴い粒径が増大した。pH6でpH応答性リポソームの粒径は約400nmになり、さらにpHの低下とともに粒径は増大し、pH4でその粒径は約650nmとなった。これはリポソーム間での凝集を意味している。その凝集度はpH応答性リポソームのゼータ電位がプラスになるほど大きくなった。これによりpH応答性リポソームがエンドソーム内のpH環境下で、エンドソーム膜との凝集と融合を促進させるのに必要な性質を有していることを示唆している。
(アニオン性生体膜との相互作用の検討2)
さらに、エンドソーム内のpH環境下におけるpH応答性リポソームとエンドソーム膜を仮想したアニオン性生体膜との膜融合度を、FRET(蛍光共鳴エネルギー移動)を利用した希釈法により測定した。
仮想エンドソームとしてジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)/cholesterol/ジオレオイルホスファチジルセリン(DOPS)/1,2−Dioleoyl−sn−glycero−3−phosphoethanolamine−N−(7−nitro−2−1,3−benzoxadiazol−4−yl)(NBD−PE)/1,2−dioleoyl−sn−glycero−3−phosphoethanolamine−N−(lissamine rhodamine B sulfonyl)(R−PE)(=3/1/0.3/0.0022/0.0022、モル比)を構成成分とするアニオン性リポソームを調製した。まず、pHの異なる酢酸緩衝液200μlに対し、500μMアニオン性リポソーム25μlと4.5mM pH応答性リポソーム(化合物3/cholesterol/PEG−Glu2C18=5/5/0.03,モル比)25μlを添加し、インキュベート(37℃,30分)した。続いて、この混合液20μlを150mM生理食塩水80μlに添加し、プレートリーダー(Perkin Elmer Japan Co.,Ltd、ARVO Mx−3)にて535nmにおける蛍光強度(Fluorescent Intensity,F.I.)を検出した(Ex:485nm)。式(1.1)を用いて各pHにおける膜融合度を算出し、さらに式(1.2)を用いてpH7.4における膜融合度に対する相対的な膜融合度の値を、各pHについて算出した。膜融合度の測定結果を図4に示す。
図4からわかるように、膜融合度はpH7.4−6.0の範囲ではほぼ変化しなかったが、pH6.0−4.0の範囲内で膜融合度の増大が認められた。そしてpH5.0において、pH7.4における膜融合度の約3.7倍に達した。このことから、pH応答性リポソームはpH5−6環境下において、ゼータ電位がマイナスからプラスへと変化し、アニオン性生体膜と静電的吸着を経て、膜融合が促進されることが示された。オリジナルデータは表1に示したとおりである。
〔実施例3〕
pH応答性リポソームの細胞内動態(TRITC標識アルブミン内包リポソームの調製)
Tetramethylrhodamine−5−(and−6)−isothiocyanate(TRITC)2mgを0.1N−NaOH aq.に溶解し、pHを7.4に調整した。その水溶液をアルブミン1mL(25g/dL)と混合し3時間撹拌後、ゲルカラム(Sephadex G−25)にて未結合ローダミンを除去し、ローダミン標識アルブミンを調製した。
次に、pH応答性混合脂質(化合物3/cholesterol/PEG−Glu2C18=5/5/0.03,モル比)25μlををローダミン標識アルブミン水溶液(10mg/mL)で水和し、高圧押出法(最終孔径0.22μm)にてアルブミン内包リポソーム(以下、ローダミン標識アルブミン内包pH応答性リポソームともいう)を調製した。
(共焦点顕微鏡によるアルブミン内包リポソームの細胞内動態解析)
細胞に取込まれた後のリポソーム内包物の放出挙動を解析するために、細胞内の動態観察を共焦点顕微鏡を用いて行った。まず、COS−7(アフリカミドリザル腎細胞)1x10cellsを35mmガラスボトムディッシュに播種し、24時間培養した(37℃、5%CO)。続いてダルベッコ改変イーグルス培地(DMEM)(10%ウシ血清)で希釈した各リポソームを細胞に添加([lipid]=50μg/dish)し、2時間培養した。その後、PBS(−)で2回洗浄後、ライソトラッカー(450nM)にてエンドソームまたはリソソームを染色し、共焦点顕微鏡(LSM5Pascal,Carl Zeiss Co.,Ltd.)にて内包ローダミン標識アルブミン(赤)とエンドソーム(緑)の局在を観察した。また、CCD−32SK細胞についても、MEM培地に置換し、同様に細胞に取り込まれたリポソームの動態観察を行った。観察結果を図5に示した。
図5からわかるように、ローダミン標識アルブミン内包pH応答性リポソームは、アルブミン単独で局在している箇所が見られ、アルブミンがエンドソームから脱出していることが示唆された。このことからpH応答性リポソームは、リポソーム内のアルブミンを細胞質へ送達できることが示された。
〔実施例4〕
siRNA内包リポソームの調製
実施例1で得られた化合物3(20mg)を0.1%DEPC(diethyl pyrocarbonate)水溶液に分散させた10nmol/mL siRNA(21bp)水溶液500μLで6時間水和させた後、高圧押出法(最終孔径0.22μm)にてsiRNA内包リポソームを調製した。また、siRNAを添加していないことを除いて、上記と同様の方法でsiRNAを内包しないリポソームを調製した。
(siRNA内包pH応答性リポソームによるルシフェラーゼ合成阻害評価)
ルシフェラーゼタンパク合成遺伝子が恒常的に発現するCHO細胞を作製し、siRNA内包リポソーム添加後の、RNAiによる合成阻害に関する評価を行った。ルシフェラーゼ発現CHO細胞5x10cellsを12wellsプレートに播種し、24時間培養した(37℃、5%CO)。その後、siRNA内包リポソームを血清存在下で細胞に添加([lipid]=100または200μg/well)し、24時間培養した(37℃、5%CO)。PBS(−)で2回洗浄後、細胞を可溶化し、基質添加後の発光強度を測定しルシフェラーゼ発現量を算出した。その結果を図6に示した。なお、コントロールは、培地のみを添加した場合とした。図6中、siRNA内包リポソームをsiRNA(+)、siRNAを内包しないリポソームをsiRNA(−)と表記した。
図6からわかるように、添加量の増大とともにルシフェラーゼの発現量が有意に減少し、[Lipid]=100μg/wellで約50%、[Lipid]=200μg/wellで約75%のルシフェラーゼ合成阻害が達成された。このことは、すなわち、pH応答性リポソームがsiRNAをエンドソームから細胞質へ脱出させ、siRNAによりルシフェラーゼの合成阻害が起こり、細胞に発現していたルシフェラーゼ量のノックダウンに寄与したことを意味する。この結果より、本発明の分子集合体がRNAiを利用した遺伝子治療に有用な運搬体であることが示された。
(pH応答性リポソームの毒性評価)
pH応答性リポソームの毒性評価をWST Assayを用いて行った。ルシフェラーゼ発現CHO細胞1x10cellsを96wellsプレートに播種し、24時間培養した(37℃、5%CO)。その後、リポソームを血清存在下で細胞に添加[lipid]=5,10,20または40μg/well)し、24時間培養した(37℃、5%CO)。続いてDMEM(10%FBS)で2回洗浄後、WST1/ECS試薬(ImmunoKontact社)を添加した。1時間培養(37℃、5%CO)した後、450nmにおける吸光度をプレートリーダーにて測定した。細胞生存率(Cell survival)は下記の式を用いて算出し、その結果を図7に示した。
:細胞なし I100:リポソーム添加無し I:リポソーム添加有り
図7からわかるように、pH応答性リポソームでは、脂質添加量[Lipid]μg/mLが20μg/well以下では、細胞の生存率がほぼ100%であり、40μg/well添加系における細胞生存率はほぼ70%であった。細胞試験は96wellプレートで実験したが、ルシフェラーゼ活性測定は12wellプレートで実験した。よって毒性評価の結果を12wellで換算すると200μg/well添加時では細胞毒性は全く示されていないと類推できる。よって、細胞質でのルシフェラーゼの発現の減少はリポソーム膜脂質由来の毒性からではなく、pH応答性リポソームにより送達したsiRNAに由来した結果であるといえる。
〔実施例5〕
牛血清アルブミン(BSA)内包pH応答性リポソームのin vivo体内動態試験
BSA内包pH応答性リポソームのラット血漿及び組織中における化合物3の濃度測定を行った。BSA内包pH応答性リポソームのラット血漿及び組織中における化合物3の濃度をLC/MS/MSにより測定した。
なお、pH応答性リポソームの体内動態解析として以下の分析装置を利用した。
遠心機:MX−301(トミー精工)
HPLC:LC−20Aシステム(島津製作所)
システムコントローラー;SCL10Avp
ポンプ;LC−20AD
デガッサー;DGU−20A3
オートインジェクター;SIL−20AC
カラムオーブン;CTO−20AC
MS:API2000(Applied Biosystems/MDS SCIEX)
インターフェース;TurboIon Spray
(投与実験)
混合脂質(化合物(3)/cholesterol/PEG−Glu2C18=5/5/0.03(mol))から高圧押出法にてpH応答性リポソームを調製した。粒子径は200−250nmになるように調製した。また内水相にBSAを内包した。調製したpH応答性リポソームをエーテル麻酔下、SD系ラット(オス、体重300g以下)の尾静脈から、pH応答性リポソーム([Lipid]=20mg/mL)を2ml/kgで投与した。ラット使用例数をN=3とする。投与前、投与後5分、1、2、6、24時間に採血(500μL程度)を行い、遠心(2,000xg、20分)して血漿を得(リポソーム浮遊血漿)、これを−80℃で保存した。また、投与後24時間の採血を終えた後、肝、脾、肺、腎を摘出して湿重量を測定し、−80℃で保存した。その後、臓器湿重量の4倍量の生理食塩水でホモジネートした.
(測定用サンプルの調製方法)
・検量線およびLC−MS分析用サンプル
10μLの血漿及び肝臓ホモジネート溶液に対して100μLのGGLG標準溶液を添加するところまで行ったものを検量線測定用サンプルとした。
・試料測定用サンプル
10μLの血漿及び臓器ホモジネート溶液に対して100μLのメタノールを添加するところまで行ったものを試料測定用サンプルとした。
上記測定用サンプルに内部標準物質(1,5−dihexadecyl N−glutamyl−L−glutamate(αGlu−Glu2C16))添加溶液(900μL)を加え、ボルテックス攪拌した後、室温にて10分間以上静置させた。その後、再度ボルテックス攪拌し、4℃、10,000xgで15分間遠心分離して、その上清をLCバイアルに移した。
高速液体クロマトグラフ(HPLC)−タンデム質量分析計(MS/MS)(LC/MS/MS)
HPLC条件
カラムにCAPLCELLPAK C18 MG(株式会社資生堂)(3μm、2.0×50mm)を用い、カラム温度は40℃に設定した。0.1%酢酸水溶液(A)−0.1%酢酸メタノール(B)でグラジェント溶出させた。流速は0.25mL/分でグラジェントプログラムは表2に示したとおりである。なお、オートインジェクター温度は15℃とし、ニードル洗浄液は洗浄ポンプをクロロホルム/メタノール(1:1)洗浄ポートをメタノールで行った。
MS/MS条件
HPLCで分離した溶離液をpositive ESIイオン化し、MRMモードで測定した。パラメータは表3に示したとおりである。
内部標準物質として化合物3に構造が近似した次式で示されるαGluGlu2C16を用いた。
血漿及び製剤中の化合物3(GGLG)の濃度
血漿測定用検量線検体を測定し、1/xの重み付け,Quadraticで1−300μg/mL血漿の検量線を作成した。得られた検量線の式に血漿測定用検体のピークエリア/ISピークエリアを代入して血漿中の化合物3の濃度を算出した。その結果を表4に示した。図8は、この結果をグラフで示したものである。なお、図8中、(−◇−)はanimal 1、(‥□‥)はanimal 2、(−・△・−)はanimal 3の結果をそれぞれ示す。PKパラメータは表5に示したとおりである。
LC/MS/MS測定における血漿中の化合物3の濃度から、化合物3の半減期は4.8時間であることがわかった。以上の結果により、化合物3を含有するpH応答性リポソームが良好な血中滞留性を示すことがわかった。
(組織中の化合物3(GGLG)の濃度)
組織測定用検量線検体を測定し,1/xの重み付け,Quadraticで1−100μg/mlの検量線を作成した。得られた検量線の式に組織測定用検体のピークエリア/ISピークエリアを代入して組織中の化合物3の濃度を算出した(組織ホモジネートの比重を1g/mLとして計算)。結果を表6に示した。なお、図9は、この結果をグラフにしたものである。
LC/MS/MS測定における投与24時間後の臓器中の化合物3の分布は主に肝臓、脾臓に局在していた。これは通常のリポソーム製剤の臓器分布と同じであった。化合物3が腎臓あるいは肺にはほとんど局在していないことから、pH応答性リポソームが血中滞留性を有することを示している。従って、pH応答性リポソームは臓器を標的とした薬物、プローブ、核酸及びタンパク質の運搬体として有用であることがわかる。
〔実施例6〕
pH応答性両親媒性分子の合成
実施例1の工程(A)で得られた化合物1(1.0g,1.67mmol)と、トリエチルアミン(202mg,2.0mmol)をジクロロメタン30mLに溶解し、1時間室温で撹拌した。その後、γアミノ基をt−ブトキシカルボニル(Boc)基、εアミノ基をベンジルオキシカルボニル(Z)基で保護し、カルボキシル基をN−ヒドロキシスクシンイミドにより活性化させたリジン(617mg,1.4mmol)を添加し、さらに6時間室温で撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧除去し、クロロホルムに溶解して、炭酸ナトリウム飽和水溶液で3回洗浄した。クロロホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧除去した。残留物はメタノールから4℃で再結晶し、グラスフィルター(G6)ろ過して凍結乾燥後、化合物4を得た。
化合物4をTFA処理してBoc基を脱保護し、クロロホルムに溶解し、炭酸ナトリウム飽和水溶液で3回洗浄した。純水にて洗浄後、クロロホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧除去し、化合物5を得た。
化合物5(500mg、0.58mmol)とトリエチルアミン(71mg、0.70mmol)をジクロロメタン30mLに溶解し、1時間室温で撹拌した。その後、αアミノ基をBoc基、γカルボキシル基をOtBu基で保護し、αカルボキシル基をN−ヒドロキシスクシンイミドにより活性化させたグルタミン酸Boc−Glu(OtBu)−OSu(310mg、0.7mmol)を添加し、さらに6時間室温で撹拌して反応させた。反応終了後、溶媒を減圧除去し、クロロホルムに溶解して、炭酸ナトリウム飽和水溶液で3回洗浄した。クロロホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧除去した。残留物はメタノールから4℃で再結晶し、グラスフィルター(G6)ろ過して、凍結乾燥後化合物6を得た。
化合物6をH/Pd−Black存在下で、Z基を脱保護し、αアミノ基をBoc基、βカルボキシル基をOtBu基で保護し、αカルボキシル基をN−ヒドロキシスクシンイミドにより活性化させたアスパラギン酸Boc−Asp(OtBu)−OSuを反応させTFAにて脱保護し、化合物7(Ia−2)を得た。
化合物7(Ia−2)の同定:
薄層クロマトグラフィー(シリカゲル、クロロホルム/メタノール(5/1)(容量/容量):R:0.05(モノスポット))
H−NMR(CDCl,500MHz,δ(ppm)):0.88(t,6H,−CH);1.30(br,52H,alkyl);1.62(m,4H,COO−CH−CH−);4.28(q,1H,lys α−CH−);4.47(q,1H,glu α−CH−COO−);
化合物7を得る方法と同様にして、Boc−Glu(OtBu)の代わりにBoc−Asp(OtBu)−OSuを用い、Boc−Asp(OtBu)−OSuの代わりにBoc−Glu(OtBu)を用いて化合物8(Ia−4)を合成した。
化合物8(Ia−4)の同定:
薄層クロマトグラフィー(シリカゲル、クロロホルム/メタノール(5/1)(容量/容量):R:0.07(モノスポット))
H−NMR(CDCl、500MHz、δ(ppm)):0.84(t,6H,−CH);1.23(br,52H,alkyl);3.68,3.94(t,1H,glu α−CH−Lys−);4.34(q,1H,lys α−CH−);4.60(q,1H,glu α−CH−COO−)
実施例1の工程(B)で得られた化合物2(500mg,691mmol)とトリエチルアミン(107μl,829mmol)をジクロロメタン30mLに溶解し、1時間室温で撹拌した。その後、アミノ基をBoc基、βカルボキシル基をt−ブチルエステル基で保護し、α−カルボキシル基をN−ヒドロキシスクシンイミドにより活性化させたアスパラギン酸Boc−Asp(OtBu)−OSu(639mg、1.45mmol)を添加し、さらに6時間室温で撹拌して反応させた。
反応終了後、溶媒を減圧除去し、クロロホルムに溶解して、炭酸ナトリウム飽和水溶液で3回洗浄した。クロロホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧除去した。残留物はメタノールから4℃で再結晶し、グラスフィルター(G6)ろ過して、アミノ基を保護したリジン誘導体を得た。
得られたリジン誘導体にトリフルオロ酢酸(20mL)を加え、4℃で2時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧除去し、クロロホルムに溶解して、炭酸ナトリウム飽和水溶液で2回洗浄した。クロロホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧乾燥して、本発明の両親媒性分子である化合物9(Ia−3)を白色粉末として得た。
化合物9(Ia−3)の同定:
薄層クロマトグラフィー(シリカゲル、クロロホルム/メタノール(5/1)(容量/容量):R:0.15(モノスポット))
H−NMR(CDCl、500MHz、δ(ppm)):0.83(t,6H,−CH);1.24(br,52H,alkyl);3.64,3.88(t,1H,Asp α−CH−Lys−);4.33(q,1H,lys α−CH−);4.61(q,1H,Asp α−CH−COO−)
〔実施例7〕
リポソームの調製
化合物7,8または9(0.177mmol)、コレステロール(0.179mmol)、PEG−Glu2C18(1.0μmol)をベンゼンに溶解させ、凍結乾燥して混合脂質を調製した。この混合脂質20mgを注射用水1mLに分散し、6時間攪拌後、高圧押出法(最終孔径0.22μm)にて粒子径約240nmのリポソームを調製した。
調製したリポソーム([lipid]=10mg/ml)をpH7.4,7,6,5,4の酢酸緩衝液(20mM)に添加し、最終濃度を[lipid]=1mg/mLとして37℃におけるゼータ電位を測定した。
化合物9(Ia−3)を主成分として用いた場合、この脂質組成の混合脂質を水に分散させた際に凝集し、高圧押出時にろ過されてしまったと考えられる。おそらく親水部にアスパラギン酸を用いた脂質は、水和しにくいと考察できる。
これに対して、化合物7を主成分として用いた場合、及び化合物8を主成分として用いた場合はリポソームを形成した。図10中、(●)は化合物7を主成分とするリポソーム(化合物7/cholesterol/PEG−Glu2C18(5/5/0.03(モル比))のゼータ電位変化を示し、(○)は化合物8を主成分とするリポソーム(化合物8/cholesterol/PEG−Glu2C18(5/5/0.03(モル比))のゼータ電位変化を示す。化合物7(Ia−2)を主成分としたリポソームでは、ゼータ電位がマイナスからプラスへの転じるpHがおよそ5.5程度であったのに対し、化合物8(Ia−4)を主成分とするリポソームではそのpHは4.8程度であった。この結果より親水部にグルタミン酸とアスパラギン酸とを用いた両親媒性分子はリポソームを形成し、pH変化によりゼータ電位が変化するpH応答性を示すことが明らかとなった。
〔実施例8〕
アルキル鎖長の異なる両イオン性脂質の合成
実施例1の工程(A)と同様の方法にて、グルタミン酸とテトラデシルアルコールまたはステアリルアルコールを用いて、アルキル鎖長が14または18である化合物10(1,5−tetradecyl−L−glutamate)及び化合物11(1,5−octadecyl−L−glutamate)をそれぞれ合成した。
化合物10及び化合物11を用いて、アルキル鎖の異なるグルタミン酸を2個親水部に持つ化合物12及び13をそれぞれ合成した。
化合物12の同定:
薄層クロマトグラフィー(シリカゲル、クロロホルム/メタノール(5/1)(容量/容量):R:0.05(モノスポット))
H−NMR(CDCl、500MHz、δ(ppm)):0.88(t,6H,−CH);1.27(br,44H,alkyl);1.55(br,4H,COO−CH−CH−),4.34(q,1H,lys α−CH−);4.44(q,1H,glu α−CH−COO−)
化合物13の同定:
薄層クロマトグラフィー(シリカゲル、クロロホルム/メタノール(5/1)(容量/容量):R:0.04(モノスポット))
H−NMR(CDCl、500MHz、δ(ppm)):0.88(t,6H,−CH);1.27(br,60H,alkyl);1.65(br,4H,COO−CH−CH−),4.12(t,1H,glu α−CH−Lys−);4.35(q,1H,glu α−CH−COO−);3.60(t,4H,COO−CH−CH−)
〔実施例9〕
リポソームの調製ならびにゼータ電位及び融合度の測定
化合物3、12または13を構成成分とするリポソームをそれぞれ調製し、得られたリポソームを用いてゼータ電位及び融合度を測定し、物性を比較した。
(リポソームの調製)
化合物3、12または13(0.177mmol)、コレステロール(0.179mmol)、PEG−Glu2C18(1.0μmol)をベンゼンに溶解させ、凍結乾燥して混合脂質を調製した。この混合脂質20mgを注射用水1mLに分散し、6時間攪拌後、高圧押出法(最終孔径0.22μm)にて粒子径約240nmのリポソームを調製した。
(ゼータ電位測定)
調製した各リポソーム([lipid]=10mg/ml)をpH7.4,7,6,5,4の酢酸緩衝液(20mM)にそれぞれ添加し、最終濃度を[lipid]=1mg/mLとして37℃におけるゼータ電位を測定した。その結果を図11に示す。図中、(●)は化合物3を主成分とするリポソーム(化合物3/cholesterol/PEG−Glu2C18(5/5/0.03(モル比))のゼータ電位変化を示し、(○)は化合物12を主成分とするリポソーム(化合物7/cholesterol/PEG−Glu2C18(5/5/0.03(モル比))のゼータ電位変化を示す。
化合物13を主成分として用いた場合、混合脂質を調製した後、水に分散させた際に分散性が悪く、凝集し、高圧押出時にろ過されてしまった。疎水部の大きな化合物13は、この脂質組成では親−疎水バランスが悪く、小胞体構造をとりにくいためであると考えられる。これに対して、化合物3を主成分として用いた場合、及び化合物12を主成分として用いた場合はリポソームを形成した。化合物3を主成分としたリポソームでは、ゼータ電位がマイナスからプラスへの転じるpHがおよそ5.7程度であったのに対し、化合物12を主成分とするリポソームではそのpHは7.0程度であった。これによりリポソーム膜成分である両親媒性分子の親水部構造が同じ場合でも、疎水部のアルキル鎖長によってゼータ電位挙動が変わることが判明した。
(融合度測定)
実施例2と同様の方法で、アニオン性リポソーム(DOPC/DPPG,5/1(モル比))に対するpH応答性リポソームの融合度を算出した。測定方法は以下のとおりである。1mMのアニオン性リポソームと9mM(混合脂質換算)の各pH応答性リポソームをそれぞれ50μLを1.9mLの各pHの酢酸緩衝液に添加し、37℃で静置した。30min経過後、100mLを分注し1.9mLのHEPES緩衝液(pH7.4)に加え、石英セルに移し蛍光測定(λex:460nm,λem:530nm)した。測定は、Shimadzu社製の型式RF−5300PCを用いて行った。結果を図12に示す。
化合物3を主成分としたリポソームでは、従来の報告どおりpH7.4では15%程度の融合度であったが、pH5.5で融合度が極大値をとり、その値は60%程度であった。他方、アルキル鎖長が14である化合物12を主成分としたリポソームではpH7.4でも融合度が45%程度と高く、また融合の極大はpH6.5で65%を超えていた。
ゼータ電位測定結果を考慮すると、化合物12は中性領域でもゼータ電位がプラスとなり、さらには相転移温度が低いことから、アニオン性のリポソームに融合しやすいものと考察される。
〔実施例10〕
siRNA内包リポソームのルシフェラーゼ合成阻害評価
(siRNA内包リポソームの調製)
従来用いられている脂質組成である、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)/cholesterol/DHSG/PEG−Glu2C18(5/5/1/0.033,モル比)から成るsiRNA内包または未内包リポソーム群(リポソーム1)、αGluGlu2C16/cholesterol/PEG−Glu2C18(5/5/0.03,モル比)から成るsiRNA内包または未内包リポソーム群(リポソーム2)をそれぞれ調製し、これらを本発明の化合物3を主成分とする化合物3/cholesterol/PEG(5/5/0.03,モル比)から成るsiRNA内包または未内包リポソーム群(リポソーム3)と比較した。尚、αGluGlu2C16(1,5−hexadecyl−N−glutamyl−L−glutamate)は、実施例5でも述べたとおり下記式で示される親水部に両イオン性官能基を一つ有する化合物である。
ここで用いた1,5−hexadecyl N−succinyl−L−glutamate(DHSG)は負電荷脂質であり、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)はリン脂質である。
以下のようにして、ルシフェラーゼタンパク合成遺伝子が恒常的に発現するCHO細胞に、各siRNA内包リポソーム添加した後のRNAiによる合成阻害に関する評価を行った。まず、ルシフェラーゼ発現CHO細胞5x10cellsを12wellsプレートに播種し、24時間培養した(37℃、5%CO)。その後、siRNA内包リポソームを血清存在下で細胞に添加([lipid]=200μg/well)し、24時間培養した(37℃、5%CO)。PBS(−)で2回洗浄後、細胞を可溶化し、基質添加後の発光強度を測定し、ルシフェラーゼ発現量を算出した。その結果を図13に示した。なお、コントロールは、培地のみを添加した場合とした。図中、siRNA内包リポソームをsiRNA(+)、siRNAを内包しないリポソームをsiRNA(−)と表記した。
ルシフェラーゼ発現CHO細胞のみでは、ルシフェラーゼ発現量が4.2x10RLU/μg−protein程度であった。これに対しsiRNA内包リポソーム1(DPPC/cholesterol/DHSG/PEG−Glu2C18)ではやや発現量が低下したが、siRNA未内包リポソーム1添加時の発現量とほぼ同等であった。よってリポソーム1では内包したsiRNAによる阻害は起きていないと判断した。
一方、siRNA内包リポソーム2(αGluGlu2C16/cholesterol/PEG−Glu2C18)あるいはリポソーム3(GGLG/cholesterol/PEG−Glu2C18)では、コントロール群と比較してそれぞれ15、70%程度のルシフェラーゼ合成阻害が確認された。siRNA未内包リポソーム群では、この阻害が起きていないことから、この結果は、内包したsiRNAによりルシフェラーゼの合成阻害が起こったことを意味している。さらに、siRNAデリバリーの効率はリポソーム2よりもリポソーム3の方が優れていた。
本発明の分子集合体は、薬物、プローブ、核酸及びタンパク質等をエンドソーム内から細胞質側へ効率よく放出させる運搬体として有用であり、各種疾患治療用の製剤として利用価値が十分にあると考えられる。

Claims (16)

  1. 式(Ia):
    [式中、Raは、一つがカチオン性官能基であり、Raが複数ある場合、その他のRaは水素原子であり、Ra’は、一つがカチオン性官能基であり、Ra’が複数ある場合、その他のRa’は水素原子であり、Rb及びRb’は、それぞれ独立して、アニオン性官能基であり、Rc及びRdは、それぞれ独立して、炭素数8〜22の鎖状炭化水素基であり、A、A、A、A及びAは、それぞれ独立して、−COO−、−OCO−、−CONH−または−NHCO−であり、k、l、m及びnは、それぞれ独立して、1〜4の整数である。]
    で表される両親媒性分子。
  2. 水溶液中、生理的なpH環境下でカチオン性官能基及びアニオン性官能基がそれぞれイオン化してカチオンまたはアニオンになり、酸性pH環境下でアニオン性官能基のイオン化傾向が減少し、塩基性pH環境下でカチオン性官能基のイオン化傾向が減少する、請求項1記載の両親媒性分子。
  3. カチオン性官能基は、第1級アミノ基、第2級アミノ基、第3級アミノ基及び第4級アンモニウム塩からなる群より選ばれるものである、請求項1または2記載の両親媒性分子。
  4. アニオン性官能基は、カルボキシル基である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の両親媒性分子。
  5. 、A及びAは、それぞれ独立して、−CONH−または−NHCO−であり、A及びAは、それぞれ独立して、−COO−または−OCO−である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の両親媒性分子。
  6. 鎖状炭化水素基がミリスチル、パルミチル、ステアリル及びオレイル基からなる群から選ばれるものである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の両親媒性分子。
  7. 式(Ia−1)〜(Ia−8):
    [式中、Rc及びRdは、それぞれ独立して、炭素数8〜22の鎖状炭化水素基である。]
    のいずれかで表される両親媒性分子。
  8. 水溶液中、生理的なpH環境下で−NHが−NH になり、かつ、−COOHが−COOになって両イオン性を示すが、酸性pH環境下で−COOHのイオン化傾向が減少し、塩基性pH環境下で−NHのイオン化傾向が減少する、請求項7記載の両親媒性分子。
  9. 請求項1〜8のいずれか1項に記載の両親媒性分子を含む分子集合体。
  10. 生理的pH環境下でゼータ電位が中性あるいはマイナスの小胞体構造を形成して目的物質を保持し、酸性pH環境下でゼータ電位がプラスとなりアニオン性生体膜との相互作用により小胞体構造が変化して目的物質を小胞体の外側に放出させる、請求項9記載の分子集合体。
  11. 細胞内にエンドサイトーシスによって取り込まれたときに目的物質をエンドソームの外側に放出させるものである、請求項10記載の分子集合体。
  12. 薬物、プローブ、核酸、タンパク質、ペプチド、金属イオン及び金属錯体からなる群から選択される少なくとも1種を保持するものである、請求項9〜11のいずれか1項に記載の分子集合体。
  13. プローブまたは核酸を保持するものである請求項9〜11のいずれか1項に記載の分子集合体を含む試薬。
  14. 細胞内の遺伝子発現を制御するものである、請求項13記載の試薬。
  15. 請求項13または14記載の試薬を含むキット。
  16. タンパク質を保持する請求項9〜11のいずれか1項に記載の分子集合体を含む酵素補充治療用タンパク質製剤。
JP2009515278A 2007-05-17 2008-05-16 両親媒性分子、それを含む分子集合体及びその用途 Expired - Fee Related JP5241711B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009515278A JP5241711B2 (ja) 2007-05-17 2008-05-16 両親媒性分子、それを含む分子集合体及びその用途

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2007132179 2007-05-17
JP2007132179 2007-05-17
JP2009515278A JP5241711B2 (ja) 2007-05-17 2008-05-16 両親媒性分子、それを含む分子集合体及びその用途
PCT/JP2008/059499 WO2008143339A1 (ja) 2007-05-17 2008-05-16 両親媒性分子、それを含む分子集合体及びその用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2008143339A1 JPWO2008143339A1 (ja) 2010-08-12
JP5241711B2 true JP5241711B2 (ja) 2013-07-17

Family

ID=40032023

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2009515278A Expired - Fee Related JP5241711B2 (ja) 2007-05-17 2008-05-16 両親媒性分子、それを含む分子集合体及びその用途

Country Status (4)

Country Link
US (1) US8241647B2 (ja)
EP (1) EP2157096B1 (ja)
JP (1) JP5241711B2 (ja)
WO (1) WO2008143339A1 (ja)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5588619B2 (ja) 2009-03-11 2014-09-10 一丸ファルコス株式会社 pH応答性リポソーム
DK2474306T3 (en) 2009-08-31 2017-02-06 Nanocarrier Co Ltd PARTICLE COMPOSITION AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING SAME
GB201614120D0 (en) * 2016-08-18 2016-10-05 Univ Of Kwazulu-Natal pH-responsive lipids
KR20200050982A (ko) * 2017-09-04 2020-05-12 이치마루 화루코스 가부시키가이샤 pH 감수성 리포솜 및 그 제조 방법
JP6462073B1 (ja) * 2017-09-04 2019-01-30 一丸ファルコス株式会社 pH感受性リポソームの製造方法
JP6399530B1 (ja) * 2017-09-04 2018-10-03 一丸ファルコス株式会社 pH感受性リポソーム
CN112755005B (zh) * 2019-11-04 2022-05-13 四川大学 一种利用小分子营养物质介导的口服纳米递药系统
EP4321524A1 (en) * 2021-04-09 2024-02-14 Sogo Pharmaceutical Co., Ltd. Lipid and composition

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001016211A1 (fr) * 1999-08-31 2001-03-08 Japan Science And Technology Corporation Compose amphipathique a structure dendritique
WO2002038530A1 (fr) * 2000-11-10 2002-05-16 Japan Science And Technology Corporation Lipide de type acide carboxylique
WO2003018539A1 (fr) * 2001-08-24 2003-03-06 Oxygenix Co., Ltd. Compose lipide amphotere et son utilisation
WO2006098415A1 (ja) * 2005-03-16 2006-09-21 Oxygenix Co., Ltd. 薬物運搬体

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5998482A (en) * 1997-11-10 1999-12-07 David; Sunil A. Use of synthetic polycationic amphiphilic substances with fatty acid or hydrocarbon substituents as anti-sepsis agents
DE10208673A1 (de) * 2002-02-28 2003-09-04 Mercedes Benz Lenkungen Gmbh Fahrzeuglenkung mit Einrichtung zur variablen Mittenzentrierung
KR100464787B1 (ko) 2002-03-20 2005-01-06 박용석 글루탐산염을 이용한 양전하 지질의 제조방법
US20040166261A1 (en) * 2003-02-20 2004-08-26 Pockat Gregory Robert Heat-shrinkable packaging receptacle
JP2005154514A (ja) * 2003-11-21 2005-06-16 Univ Waseda 機能性生分解性材料およびその製造方法
JP5253716B2 (ja) * 2006-02-09 2013-07-31 日本ケミカルリサーチ株式会社 pH応答性分子集合体
EP1938843A1 (en) * 2006-12-19 2008-07-02 Novosom AG Lipids and lipid assemblies comrising transfection enhancer elements
LT2494993T (lt) * 2007-05-04 2018-12-27 Marina Biotech, Inc. Aminorūgščių lipidai ir jų panaudojimas

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001016211A1 (fr) * 1999-08-31 2001-03-08 Japan Science And Technology Corporation Compose amphipathique a structure dendritique
WO2002038530A1 (fr) * 2000-11-10 2002-05-16 Japan Science And Technology Corporation Lipide de type acide carboxylique
WO2003018539A1 (fr) * 2001-08-24 2003-03-06 Oxygenix Co., Ltd. Compose lipide amphotere et son utilisation
WO2006098415A1 (ja) * 2005-03-16 2006-09-21 Oxygenix Co., Ltd. 薬物運搬体

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6013014116; 高分子学会予稿集 vol.54, no.2, 2005, p.4943-4944[3V11] *

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2008143339A1 (ja) 2010-08-12
EP2157096B1 (en) 2013-02-20
EP2157096A4 (en) 2010-12-22
EP2157096A1 (en) 2010-02-24
WO2008143339A1 (ja) 2008-11-27
US8241647B2 (en) 2012-08-14
US20100209458A1 (en) 2010-08-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5241711B2 (ja) 両親媒性分子、それを含む分子集合体及びその用途
JP5117648B2 (ja) カチオン性peg脂質および使用方法。
US5965434A (en) Amphipathic PH sensitive compounds and delivery systems for delivering biologically active compounds
US6852334B1 (en) Cationic peg-lipids and methods of use
US7060291B1 (en) Modular targeted liposomal delivery system
JP3525393B2 (ja) 脂質及び例えばリポソーム中でのその使用
JP2004521917A (ja) 両性ステロール類およびその使用
EP1068306B1 (en) Pentaerythritol lipid derivatives
JP5403324B2 (ja) タンパク質又は遺伝子導入用試薬
US20210170046A1 (en) Improved lipid-peptide nanocomplex formulation for mrna delivery to cells
EP0904282B1 (en) Novel cationic cholesteryl derivatives containing cyclic polar groups
JP7411824B2 (ja) アミノ脂質化合物、その調製方法、およびその用途
Kono et al. Design of fusogenic liposomes using a poly (ethylene glycol) derivative having amino groups
JP5253716B2 (ja) pH応答性分子集合体
JP2003514843A (ja) モジュラー標的化リポソーム送達システム
KR101647178B1 (ko) 효소 절단성 링커 또는 올리고 라이신을 포함하는 폴리에틸렌글리콜-리피드를 이용한 안정화된 플라스미드-지질 입자
JP2008031142A (ja) 脂肪組織標的化ペプチド及び該ペプチドを有するリポソーム
WO2024041372A1 (zh) 一种用于有效递送核酸的分支链结构多肽载体及其变化形式
JP7419542B2 (ja) 脂質化合物及びその組成物
Kaur et al. Calorimetric Investigations of Non-Viral DNA Transfection Systems
CN117843712A (zh) 一种小肽脂质纳米递送系统及其应用
Habib Galactosylated liposomes with proton sponge capacity: a novel hepatocyte-specific gene transfer system.
Mason et al. LipidÀPeptide Vesicle Nanoscale Hybrids for Triggered Drug Release by Mild Hyperthermiain Vitroandin Vivo
Tang Biodegradable cationic lipids in plasmid DNA delivery

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20110405

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20130326

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20130402

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20160412

Year of fee payment: 3

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

S533 Written request for registration of change of name

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees