WO2008143339A1

WO2008143339A1 - 両親媒性分子、それを含む分子集合体及びその用途

Info

Publication number: WO2008143339A1
Application number: PCT/JP2008/059499
Authority: WO
Inventors: Shinji Takeoka; Yosuke Obata; Shoji Tajima; Manabu Ito; Atsushi Mizuno; Natsuko Nishiyama; Yoshito Takeuchi
Original assignee: Waseda University; Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd.
Priority date: 2007-05-17
Filing date: 2008-05-16
Publication date: 2008-11-27
Also published as: US20100209458A1; EP2157096A1; JP5241711B2; US8241647B2; EP2157096A4; EP2157096B1; JPWO2008143339A1

Abstract

本発明は、親水部に両イオン性官能基を複数有する両親媒性分子及び該両親媒性分子を構成脂質として含む分子集合体を提供する。本発明の好ましい態様によれば、本発明の分子集合体は、生理的なｐＨ環境下で安定な小胞体構造を形成して目的物質を保持し、酸性ｐＨ環境下で小胞体構造が変化して目的物質を小胞体の外側に放出させることができる。本発明の分子集合体は、薬物、プローブ、核酸、タンパク質等の運搬体として利用可能である。

Description

両親媒性分子、それを含む分子集合体及びその用途技術分野

本発明は、 P H変化に応答して分子集合体に保持される物質の放出挙動を制御することが可能な分子集合体の構成成分として用いられる両親媒性分子、それを含む分子集合体及びその用途に関する。

明背景技術田

従来、リボソームなどの分子集合体に保持させた目的物質の放出を制御する方法として、 p H応答性が汎用されている。ここ書で「p H応答性」とは、分子集合体が p H変化に応答して分子充填状態や保持物質の放出特性などを変化させる性質をいう。特にホスファチジルエタノールアミン型リン脂質を用いた p H応答性のリボソームがよく知られている（例えば、 D. Papahadjopoulos ら Biochemistry, 24 (1985) 3091-3098、 D. H. Thompsonら Langmuir, 19 (2003) 6408-6415 参照）。これは、ホスファチジルエタノールアミン型リン脂質が p Hに応答して構造転移し、リボソーム二分子膜の分子充填状態が変化する性質を利用したものであるが、血清存在下ではそのような構造転移が起きにくく、 in vivoでの実用性は低い。

さらに、 p H応答性リボソームとしては、ァニオン性脂質とカチオン性脂質とを混合したリボソームが知られている（ G. Shi ら、 Journal of Controlled Release 80 (2002) 309-319参照）。しかし、ァニオン性脂質とカチオン性脂質とを組み合わせる必要があることから、目的に応じた p H応答性の調整が困難である。また、カチオン性脂質自体は血中滞留性が低く、細胞毒性も高い。さらに、低 p Hでァニオン性生体膜との融合が可能であるのはカチオン性脂質のみであることから、リボソームの融合度が低いという問題があった。発明の開示上記のような状況において、薬剤または核酸などを保持することができ、かつ、簡便な方法でその放出挙動を制御することができる P H応答性分子集合体の開発が望まれている。特に、血中投与可能な p H応答性分子集合体が求められている。本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、親水部に両イオン性官能基を複数有する両親媒性分子を構成成分として含む分子集合体が、生理的な p H環境下で小胞体構造を形成して目的物質を保持し、酸性 P H環境下でゼ一タ電位がプラスとなりァニオン性膜（ァニオン性生体膜）との相互作用により小胞体構造が変化して目的物質を小胞体の外側に放出させることを見出し、本発明を完成させるに至った。この性質を利用することにより、生体内において、エンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれた p H応答性分子集合体がェンドソーム内の低 p H環境下でェンドソーム膜と相互作用し、その保持する目的物質を細胞質に放出させることも可能である。

すなわち、本発明は、下記の両親媒性分子、分子集合体、薬剤、試薬及びキット等を提供する。

[ 1 ] 式（ I ) ：

または、式（I I )

[式中、 X¹、 X²、 X³及び X⁴は、それぞれ独立して、両イオン性官能基であり、 A。、 A¹, A²、 A³、 A⁴、 A¹¹, A¹²、 A²¹及び A²²は、それぞれ独立して、一 COO—、一 OC〇一、一 CONH—または一 NHCO—であり、 Rc 及び Rdは、それぞれ独立して、炭素数 8〜22の鎖状炭化水素基であり、 m、 n、 p及び qは、それぞれ独立して、 1〜4の整数である。 ]

で表される両親媒性分子。

[2] 式（ I a) ：

[式中、 R aは、一つがカチオン性官能基であり、 R aが複数ある場合、その他の R aは水素原子であり、 R a' は、一つがカチオン性官能基であり、 R a' 力複数ある場合、その他の Ra，は水素原子であり、 13及び1^13' は、それぞれ独立して、ァニオン性官能基であり、 0；及び1^(1は、それぞれ独立して、炭素数 8〜 22の鎖状炭化水素基であり、 A^Q、 A¹, A²、 A³及び A⁴は、それぞれ独立して、一COO—、 —OCO—、 — CONH—または一 NHCO—であり、 k、 1、 m及び nは、それぞれ独立して、 1〜4の整数である。 ]

で表される両親媒性分子。 A^Q、 A¹及び A²は、それぞれ独立して、一 CONH —または一 NHCO—であることが好ましく、一CONH—がより好ましい。また、 A³及び A⁴は、それぞれ独立して、一 COO—または一〇C〇—であることが好ましく、一 CO〇一がより好ましい。

[3] 水溶液中、生理的な pH環境下でカチオン性官能基及びァニオン性官能基がそれぞれイオン化してカチオンまたはァニオンになり、酸性 pH環境下でァニォン性官能基のィォン化傾向が減少し、塩基性 P H環境下で力チォン性官能基のイオン化傾向が減少する、 [2] 記載の両親媒性分子。

[4] カチオン性官能基は、第 1級ァミノ基、第 2級ァミノ基、第 3級ァミノ基及び第 4級アンモニゥム塩からなる群より選ばれるものである、 [2] または

[3] 記載の両親媒性分子。

[5] ァニオン性官能基は、力ルポキシル基である、 [2] 〜 [4] のいずれか 1項に記載の両親媒性分子。

[6 ] kが 3であり、 1が 3であり、 mが 4であり、 nが 2である、 [2] 〜 [5] のいずれか 1項に記載の両親媒性分子。

[7] kが 2であり、 1が 2であり、 mが 4であり、 nが 2である、 [2] 〜 [5] のいずれか 1項に記載の両親媒性分子。

[8] kが 3であり、 1が 2であり、 mが 4であり、 nが 2である、 [2] 〜 [5] のいずれか 1項に記載の両親媒性分子。

[ 9 ] kが 2であり、 1が 3であり、 mが 4であり、 nが 2である、 [2] 〜 [5] のいずれか 1項に記載の両親媒性分子。

[10] kが 3であり、 1が 3であり、 mが 4であり、 nが 1である、 [2] 〜 [5] のいずれか 1項に記載の両親媒性分子。

[1 1] kが 2であり、 1が 2であり、 mが 4であり、 nが 1である、 [2] 〜 [5] のいずれか 1項に記載の両親媒性分子。

[12] kが 3であり、 1が 2であり、 mが 4であり、 nが 1である、 [2] 〜 [5] のいずれか 1項に記載の両親媒性分子。

[1 3] kが 2であり、 1が 3であり、 mが 4であり、 nが 1である、 [2] 〜 [5] のいずれか 1項に記載の両親媒性分子。

[14] 鎖状炭化水素基がミリスチル、パルミチル、ステアリル及びォレイル基からなる群から選ばれるものである、 [1] 〜 [13] のいずれか 1項に記載の両親媒性分子。

[1 5] 式（I a— 1) 〜（ I a— 8) ：

[式中、 0及び1 01は、それぞれ独立して、炭素数 8〜 22の鎖状炭化水素基である。 ]

のいずれかで表される両親媒性分子。

[16] 水溶液中、生理的な pH環境下で— NH₂がー NH₃ +になり、かつ、一 C O O Hが— C O〇—になつて両ィオン性を示すが、酸性 P H環境下で— C O O Hのイオン化傾向が減少し、塩基性 pH環境下で一 NH₂のイオン化傾向が減少する、 [1 5] 記載の両親媒性分子。

[17] 生理的な pH環境下でゼ一タ電位が中性あるいはマイナスの小胞体構造を形成して目的物質を保持し、酸性 pH環境下でゼ一夕電位がプラスとなり、ァ二オン性生体膜との相互作用により小胞体構造が変化して目的物質を小胞体の外側に放出させる分子集合体を構成する、両親媒性分子。

[1 8] [1] 〜 [1 6] のいずれか 1項に記載の両親媒性分子である、 [1 7] 記載の両親媒性分子。

[19] [1] 〜 [18] のいずれか 1項に記載の両親媒性分子を含む分子集合体。前記分子集合体は、薬物、プローブ、核酸、タンパク質、ペプチド、金属ィオン及び金属錯体からなる群から選択される少なくとも 1種を保持するものであることが好ましい。

[20] 生理的 pH環境下でゼ一夕電位が中性あるいはマイナスの小胞体構造を形成して目的物質を保持し、酸性 pH環境下でゼ一タ電位がプラスとなりァニォン性生体膜との相互作用により小胞体構造が変化して目的物質を小胞体の外側に放出させるものである、 [1 9] 記載の分子集合体。

[21] 分子集合体が細胞内にエンドサイトーシスによって取り込まれたときに目的物質をエンドゾームの外側に放出させるものである、 [1 9] または [2 0] に記載の分子集合体。

[22] 目的物質が、薬物、プローブ、核酸、タンパク質、ペプチド、金属ィォン及び金属錯体からなる群から選択される少なくとも 1種である、 [20] または [21] 記載の分子集合体。

[23] [22] 記載の分子集合体を含む薬剤。

[24] 静脈内投与用薬剤である [23]'記載の薬剤。

[25] 局所投与用薬剤である [23] 記載の薬剤。

[26] プローブまたは核酸を保持する [1 9] 〜 [2 1] のいずれか 1項に記載の分子集合体を含む試薬。

[27] 細胞内の遣伝子発現を制御するものである、 [26] 記載の試薬。 [ 2 8 ] [ 2 6 ] または [ 2 7 ] 記載の試薬を含むキット。

[ 2 9 ] タンパク質を保持する [ 1 9 ] 〜 [ 2 1 ] のいずれか 1項に記載の分子集合体を含む酵素補充治療用タンパク質製剤。

本発明によれば、 p H応答性を有する分子集合体及び両親媒性分子を提供することができる。

本発明の好ましい態様によれば、本発明の分子集合体は、 p Hが生理的な値よりも低くなると分子集合体に保持させた目的物質を放出する放出制御機能を有する。これにより、血中あるいは培地中に滞留していた分子集合体が、細胞内にェンドサイト一シスによって取り込まれたときにのみ、効率良く、薬物、蛋白質または核酸などをェンドソームから細胞質に放出させることが可能となる。

本発明の好ましい態様によれば、本発明の分子集合体は、血中滞留時に血管壁などに吸着されやすレ N-[l-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N, N, N-trimethylammonium methyl- sulfate( D O T A P )、 l,2-Dimyristyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethyl ammonium bromide(D M R I E )などのカチオン性脂質を用いることなく、目的物質を小胞体及びエンドゾームの外側に送達することができる。このため、本発明の好ましい態様によれば、本発明の分子集合体は、ァニオン性の生体膜との融合度が高く、生体適合性に優れており、血中滞留性も示すことから、 in vivo 製剤としての実用性に優れている。

本発明の好ましい態様によれば、本発明の両親媒性分子は、アミノ酸と長鎖ァルコールとから合成することができるので、血液適合性が高く、細胞毒性も低いと考えられる。また、 p H応答性分子集合体の調製を低コストかつ簡便な方法で行うことができるといつた利点もある。

本発明を利用することにより、高機能の薬物運搬体あるいは核酸運搬体の創製に道筋を付けることができる。図面の簡単な説明

図 1は、本発明の分子集合体が、生体内に投与された後に、血中を滞留して目的の細胞内に取り込まれ、その保持していた目的物質を放出する挙動を示した概念図である。図 2は、化合物 3を膜成分とするリボソームのゼ一夕電位測定結果を示したグラフである。

図 3は、 pH応答性リボソームとァニオン性リボソームの凝集虔の pHによる変化を示したグラフである。

図 4は、 pH応答性リボソームとァニオン性リボソームの各 pH における相対的な膜融合度を示したグラフである。

図 5は、 (化合物 3 )/cholesterol/PEG-Glu2Ci8を膜成分とするローダミン標識アルブミン内包リボソームの COS-7 及び CCD-32SK における細胞内動態を観察した共焦点顕微鏡写真である。

図 6は、 siRNAを内包した (化合物 3 )/cholesterol/PEG-Glu2Ci₈を膜成分とするリボソームによる、ルシフェラ一ゼ夕ンパク発現 CHO細胞の遺伝子発現抑制評価の結果を示したグラフである。

図 7は、 (化合物 3 )/cholesterol/PEG-Glu2Ci8を膜成分とするリポソ一ムの細胞毒性評価の結果を示したグラフである。

図 8は、 (化合物 3 )/cholesterol/PEG-Glu2Ci8を膜成分とするリポソ一ム投与後の化合物 3の LC/MS/MS 測定による血漿中濃度の時間変化の測定結果を示したグラフである。

図 9は、 (化合物 3 )/cholesterol/PEG-Glu2C₁₈を膜成分とするリポソ一ム投与後の化合物 3の LC/MS/MS 測定による臓器分布の測定結果を示したグラフである。

図 1 0は、（）化合物 7/cholesterol/PEG_Glu2C18(5/5/0.03 (モル比））または (〇) 化合物 8/cholesterol/PEG- Glu2C18(5/5/0.03 (モル比））を膜成分とするリボソームのゼ一夕電位測定結果を示したグラフである。

図 1 1は、（像）化合物 3/cliolesterol/PEG-Glu2C18(5/5/0.03(モル比））または (〇) 化合物 12/cholesterol/PEG- Glu2C18(5/5/0.03(モル比））を膜成分とするリボソームのゼ一夕電位測定結果を示したグラフである。

図 1 2は、化合物 3または 12を膜成分とするリボソームと、ァニオン性リポゾームの各 pHにおける相対的な膜融合度を示したグラフである。

図 1 3は、 siRNA内包リボソーム 1 (DPPC/diolesterol/DHSG/PEG-Glu2C18)、 si RNA内包リボソーム 2 (otGluGIu2C16/cholesterol/PEG- Glu2C18)及び si A内包リボソーム 3 (化合物 3/cholesterol/PEG-Glu2C18)による、ルシフェラ一ゼ夕ンパク発現 C H O細胞の遺伝子発現抑制評価の結果を示したグラフである。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明は、両親媒性分子、分子集合体、薬剤、試薬及びそのキット等を含むものである。以下、それぞれについて詳しく説明する。

[1] 両親媒性分子

まず、本発明の両親媒性分子について述べる。

本発明の両親媒性分子は、式（ I) ：

または、式（I I)

[式中、 X¹、 X²、 X³及び X⁴は、それぞれ独立して、両イオン性官能基であり、 A^Q、 A A²、 A³、 A⁴、 A¹¹, A¹²、 A²¹及び A²²は、それぞれ独立して、一 COO—、一〇CO—、一 CONH—または一 NHCO—であり、 Rc 及び Rdは、それぞれ独立して、炭素数 8〜22の鎖状炭化水素基であり、 m、 n、 p及び qは、それぞれ独立して、 1〜4の整数である。 ] で表される構造を有している。

本発明の両親媒性分子は、式（ I) または（I I) で示されるように、親水部に両イオン性官能基を複数有している。ここで「両イオン性官能基」とは、生理的な ρΗ環境下及び酸性 ρΗ環境下でカチオン性を示す「カチオン性官能基」と、生理的な ρΗ環境下でァニオン性を示す「ァニオン性官能基」とを併有する官能基をいう。

本発明の両親媒性分子は、このように両イオン性官能基を複数有し、 ΡΗ変化によるカチオン性またはァニオン性の電荷密度が大きいために、両イオン性置換基を一つしか持たない場合に比べて、 ρΗ応答性がより鋭敏になる。

なお、本発明の技術思想に基づいて、両イオン性置換基の数をさらに増加させることもできる。例えば、式（I ) における結合基 Α¹¹に、さらに下式：

[式中、 X⁵及び X⁶は、それぞれ独立して、両イオン性官能基であり、 A¹¹ A¹¹²及び A¹¹²は、それぞれ独立して、 — COO—、 — OCO—、 -CONH —または—NHCO—であり、 rは、 1〜4の整数である。 ]

で示されるような両イオン性置換基 X⁵及び X⁶を持つ置換基を導入することによって、両イオン性官能基を親水部に樹岐状に形成していくことも可能である。本発明の好ましい態様によれば、本発明の両親媒性分子は、このように親水部に両イオン性官能基を有するものであるので、生理的な pH環境下で中性を示し、酸性 pH環境下でカチオン性を示し、さらには塩基性 pH環境下でァニオン性を示すことができる。

本発明において、「生理的な pH環境下」とは、水溶液の pHが中性域であること、好ましくは pH 6. 0以上 8. 0未満、より好ましくは 7. 0以上 7. 6 以下、さらに好ましくは 7. 2以上 7. 5以下であることをいう。

また、「酸性 pH環境下」とは、水溶液の pHが中性域より低いこと、好ましくは pH7. 2未満、より好ましくは pHマ. 0未満、さらに好ましくは pH6. 5未満、特に好ましくは pH 6. 0未満、とりわけ好ましくは pH 5. 5以下であることをいう。

さらに、「塩基性 pH環境下」とは、水溶液の pHが中性域より高いこと、好ましくは pH8. 0超 1 2以下であることをいう。

本発明において、「カチオン性官能基」は、水溶液中、生理的な pH環境下及び酸性 pH環境下でカチオン性を示すものであれば特に制限されない。このようなカチオン性官能基としては、アミノ基、アンモニゥム塩、グァニジノ基、イミダゾール基及びこれらの誘導体などが挙げられる。ここで「誘導体」とは、アミノ基、アンモニゥム塩、グァニジノ基、イミダゾール基のもつ水素原子が、低級アルキル基（メチル、ェチル、プロピル、イソプロピル、 n—プチル、 i s o— プチル、 t e r t—プチル、ペンチル、へキシルなど）、アミノアルキル基（ァミノメチル、アミノエチル、ァミノプロピル、アミノブチルなど）、これに対応するオリゴ糖のアルキル基、水酸基、ヒドロキシルアルキル基（ヒドロキシメチル、ヒドロキシェチル、ヒドロキシプロピルなど）、オリゴォキシアルキル基 (オリゴォキシメチル、オリゴォキシェチル、オリゴォキシプロピルなど）などの置換基で置換された化合物をいう。これらの中でも、好ましいカチオン性官能基としては、 1級ァミノ基（— N H ₂ ) 、 2級ァミノ基（一 N H R ) 、 3級アミノ基（— N R ₂ ) または 4級アンモニゥム塩（― N R ₃ + X _) などが挙げられる。ここで、 Rは、それぞれ独立して、低級アルキル基（メチル、エヂル、プロピル、イソプロピル、 n—ブチル、 i s o—ブチル、 t e r tーブチル、ペンチル、へキシルなど）を示し、 Xはハロゲン原子又は炭素数 1〜2のアルキル硫酸あるいはパラトルエンスルホン酸を示す。中でも、 1級ァミノ基が特に好ましい。

本発明において、「ァニオン性官能基」は、水溶液中、生理的 p H環境下及び塩基性 p H環境下でァニオン性を示すものであれば特に制限されない。例えば、このようなァニオン性官能基としては、力ルポキシル基が好ましい。

本発明において、両イオン性官能基の構造は特に制限されないが、分子集合体を形成したときにより表面側にァニォン性官能基が位置する構造であることが好ましい。より具体的には、カチオン性官能基とァニオン性官能基とがメチレンスぺーサ一を介して結合していることが好ましく、特にメチレン基が 1または 2のメチレンスべ一サーを介して結合していることがより好ましく、とりわけカチォン性官能基側は疎水部を構成する側に結合している構造であることが好ましい。本発明の一実施形態において、本発明の両親媒性分子は、式（I a ) で表されるものであることが好ましい。

[式中、 R aは、一つがカチオン性官能基であり、 R aが複数ある場合、その他の R aは水素原子であり、 R a' は、一つがカチオン性官能基であり、 R a' が複数ある場合、その他の R a ' は水素原子であり、尺13及び1 13' は、それぞれ独立して、ァニオン性官能基であり、じ及び！^ は、それぞれ独立して、炭素数 8〜22の鎖状炭化水素基であり、 A^Q、 A¹, A²、 A³及び A⁴は、それぞれ独立して、一 COO—、 —OCO—、 —CONH—または一 NHCO—であり、 k、し m及び nは、それぞれ独立して、 1〜4の整数である。 ]

本発明の好ましい態様によれば、本発明の両親媒性分子は、水溶液中、生理的な pH環境下でカチオン性官能基及びァニオン性官能基がそれぞれイオン化してカチオン性官能基はカチオンになり、ァニオン性官能基はァニオンになるが、酸性 pH環境下ではァニオン性官能基のイオン化傾向が減少し、塩基性 pH環境下ではカチオン性官能基のイオン化傾向が減少する。ここで、「イオン化傾向が減少する」とは、生理的な pH環境下において示したイオン化比率よりもイオン化比率が減少することをいう。

本発明において、 A。、 A¹, A²、 A³、 A⁴、 A¹ A¹²、 A²¹及び A²²は、それぞれ独立して、 —COO—、 —OCO—、 —CONH—または— NHCO— である。 A⁰、 A¹, A²、 A¹¹, A¹²、 A²¹及び A²²は、それぞれ独立して、 —CONH—または一NHCO—が好ましく、特に一 C ONH—が好ましい。 A 。、 A¹, A²、 A¹¹, A¹²、 A²¹または A²²がー CONH—であると、天然のアミノ酸またはその誘導体を原料に用いることができるため、低毒性かつ低価格であるという利点がある。なお、本明細書において「一結合基一」のように表記した場合、結合位置は、紙面左側が親水部、右側が疎水部である。 A ³及び A ⁴ は、それぞれ独立して、一 C O〇一または—O C O—が好ましく、特に一 C O O 一が好ましい。 A ³または A ⁴がー C O O—であると、天然のアミノ酸またはその誘導体を原料に用いることができるため、低毒性かつ低価格であるという利点がある。

本発明において、（：及び1^ (1は、それぞれ独立して、炭素数 8〜2 2の鎖状炭化水素基である。鎖状炭化水素基は、共有結合にて導入できる疎水性の基であれば特に限定されない。鎖状炭化水素基は、直鎖または分岐鎖のいずれであってもよく、直鎖であることが好ましい。また、鎖状炭化水素基は、アルキル鎖、ァルケニル鎖、アルキニル鎖、イソプレノイド鎖、ビニル基、カルボキシル基、水酸基、アミノ基、およびメルカプト基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。鎖状炭化水素基の炭素数は、 1 2〜2 0が好ましく、 1 4〜1 8がより好ましい。また、鎖状炭化水素基は二重結合や三重結合などの不飽和結合を有していてもよく、その場合にその数は 1〜4が好ましい。炭化水素鎖は分岐鎖であってもよく、分岐鎖としては、例えば、長鎖にイソプレノイド構造を持つものが挙げられる。本発明において、鎖状炭化水素基は、ミリスチル、パルミチル、ステアリル、及びォレイル基からなる群から選ばれる基であることが好ましく、特にパルミチル基であることが好ましい。鎖状炭化水素基で構成される疎水部と親水部との組み合わせによって分子集合体を形成した際のゼ一夕電位挙動ゃァニオン性生体膜に対する融合度を調整することが可能である。鎖状炭化水素基は、親一疎水バランスを考慮しながら、両親媒性分子の親水部との組み合わせ、分子集合体の組成、目的及び用途等に応じて適宜選択すればよい。

本発明において、 k、し m、 η、 ρ及び qは、それぞれ独立して、 1〜4の整数である。 kは 3であることが好ましく、 1は 3であることが好ましい。 k及び 1が 3であると、グルタミン酸やその誘導体を原料に用いることができるため、低毒性かつ低価格であるという利点がある。また、 kまたは 1が 2であると、ァスパラギン酸やその誘導体を原料に用いることができるため、低毒性かつ低価格である。伹し、 k及び 1の両方が 2であると分子集合体を形成するときに小胞体構造を形成しにくい場合があるため、 kまたは 1のいずれか一方は 3であることが好ましい。尚、カチオン性官能基とァニオン性官能基とはメチレンスべ一サーを介して結合していてもよく、カチオン性官能基とァニオン性官能基とが同一の炭素原子に結合していてもよいが、既に述べたとおり、カチオン性官能基とァニオン性官能基とはメチレンスべ一サ一を介して結合していることが好ましく、特にメチレン基が 1または 2のメチレンスぺ一サーを介して結合していることがより好ましい。

また、 m、 p及び qは、それぞれ独立して、 1〜4の整数であるが、 4であることが好ましい。 m、 p及び qが 4であるとリジンを原料に用いることができるため、低毒性かつ低価格である。

nは 1〜4の整数であるが、 2〜4であることが好ましい。 nが 2〜 4であると、二分子膜中で本発明の両親媒性分子の鎖状炭化水素基を膜平面に対して略垂直に配向させることが期待できる。また、 nが 2〜4であると、水溶液中で両親媒性分子が集合して形成する二分子膜の親一疎水界面が安定であり小胞体構造を形成しやすい。さらに、 nが 2であると、グルタミン酸及びその誘導体を原料に用いることができるため、低毒性かつ低価格であるという利点もある。 nが 1であると、ァスパラギン酸またはその誘導体を原料に用いることができるため、低毒性かつ低価格であるが、 nが 2の場合に比べて分子集合体の小胞体構造を形成しにくい場合がある。

式（ l a) における好ましい k、 1、 m及び nの組み合わせ（k, 1 , m, n) は、 (3, 3, 4, 2) 、 (2， 2， 4, 2) 、 (3， 2, 4, 2) 、 (2， 3, 4， 2 ) 、（3， 3, 4, 1) 、 (2 , 2, 4, 1) 、（3, 2, 4， 1) 、 (2, 3, 4, 1) などである。

本発明の両親媒性分子の好ましい実施態様を以下に示す。

[式中、 1¾ (及び（1は、前記で定義したとおりである。 ] これらの中でも、本発明においては、上記式（ I a— 1) 、（I a— 2) 及び (I a-4) で示される化合物が好ましく、特に上記式（I a— 1) で示される化合物が好ましい。式中の R c及ぴ R dの好適例は、前記したとおりである。本発明の好ましい態様によれば、式（l a— l) 〜（I a— 8) で表される本発明の両親媒性分子は、水溶液中では、生理的な pH環境下で一 NH₂が—NH

₃ ⁺になり、かつ、 — COOHが—COO—になって両イオン性を示すが、酸性 p

H環境下で一 CO OHのイオン化傾向が減少し、塩基性 pH環境下で— NH₂のイオン化傾向が減少する。

本発明の両親媒性分子は、公知の反応を組み合わせることによって極めて簡便な方法で製造することができる。例えば、本発明の両親媒性分子は三官能性化合物を順次反応させ、例えば、下記式（I) ：

または、式（I I )

[式中、 X¹、 X²、 X³及び X⁴は、それぞれ独立して、両イオン性官能基であり、 A。、 A¹, A²、 A³、 A⁴、 A¹¹, A¹²、 A²¹及び A²²は、それぞれ独立して、一COO—、一〇CO—、一CONH—または一 NHCO—であり、 m、 n、 p及び Qは、それぞれ独立して、 1〜4の整数である。 ]

で表されるようなコア構造を作製する。鎖状炭化水素基は、予め鎖状炭化水素基の供給源を三官能性化合物の一つと反応させて導入し、それを他の三官能性化合物と順次反応させてもよいし、 2つ以上の三官能性化合物からなる複合体に導入してもよい。

本発明に用いられる三官能性化合物は、アミノ基、力ルポキシル基、水酸基等の反応性官能基を少なくとも 3つ有するものであれば特に制限されない。例えば、ァスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジンなどの各種ァミノ酸またはその誘導体、グリセロール、オリゴ糖類、オリゴペプチド類、ポリエステル類、ビニル系オリゴマーまたはこれらから構成される多分岐構造、例えばデンドロン構造などが挙げられる。

ここで、「アミノ酸の誘導体」とは、アミノ酸に含まれる水素原子が、低級ァルキル基（メチル、ェチル、プロピル、イソプロピル、 n—ブチル、 i s o—ブチル等) 、アミノアルキル基 (ァミノメチル、アミノエチル、ァミノプロピル、アミノブチルなど）や対応するオリゴァミノアルキル基、水酸基、ヒドロキシァルキル基（ヒドロキシメチル、ヒドロキシェチル、ヒドロキシプロピルなど）、オリゴォキシアルキル基 (オリゴォキシメチル基、オリゴォキシェチル基、オリゴォキシプロピルなど）などの置換基で置換された化合物が含まれる。

例えば、リジンの繰り返しからなるオリゴペプチド鎖は、側鎖にアミノ基を任意の数だけ有しており、そこに両イオン性官能基をアミド結合にて任意の数だけ導入することができる。疎水部はオリゴペプチド鎖の N末端の力ルポキシル基に結合することができる。リジンからなるモノデンドロンでは、末端の官能基の数を世代数にて制御することができる。すなわち、第一世代では 2個、第二世代では 4個、第三世代では 8個となる。

本発明に用いられる鎖状炭化水素基の供給源は、三官能性化合物あるいはそれらからなるコア構造と共有結合しうる反応性官能基、例えばアミノ基、水酸基または力ルポキシル基などを有する鎖状炭化水素基であれば特に制限されない。本発明に用いられる力ルポキシル基を有する鎖状炭化水素基の供給源としては、脂肪酸が挙げられる。例えば、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、イソ吉草酸、カブロン酸、ェナント酸、力プリル酸、ゥンデカン酸、ラウリル酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、ペン夕デカン酸、パルミチン酸、マーガリン酸、ステアリン酸、ノナデカン酸、ァラキン酸、ベヘン酸、パルミトレイン酸、ォレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ァラキドン酸等であり、それぞれ分岐鎖体も含まれる。また、それらの酸無水物、または酸クロライドも含まれる。

また、アミノ基を有する鎖状炭化水素基の供給源としては、直鎖第一ァミンとして、ドデシルァミン、トリデシルァミン、テトラデシルァミン、ペン夕デシルァミン、へキサデシルァミン、ヘプ夕デシルァミン、ォクタデシルァミン、ドコシルァミン、ォレイルァミン等が挙げられ、それらの分岐鎖体も含まれる。さらに分岐状のイソプレノイド等のアミンも使用できる。また、アミノ基を有する脂肪族炭化水素基の供給源には、 N—メチルードデシルァミン、 N—メチルーテトラデシルァミン、 N—メチルーへキサデシルァミン、 N—ェチルードデシルアミン、 N—ェチルーテトラデシルァミン、 N—ェチルーへキサデシルァミン、 N— プロピル—ドデシルァミン、 N—プロピルーテトラデシルァミン、 N—プロピル一へキサデシルァミン、ジォレイルァミン等の第二アミンも含まれ、それらの分岐鎖体も用いられる。

水酸基を有する鎖状炭化水素基の供給源としては、直鎖第一飽和アルコールとしてラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ベへニルアルコール等が挙げられる。その他、 1， 1 一ドデセノール、 1一才レイルアルコール、リノレニルアルコール等の直鎖第一飽和アルコール、分岐第一飽和アルコール、分岐第一不飽和アルコール、第二飽和アルコールあるいは第二不飽和ァルコールが挙げられる。また、これらアルコール類をグリセリンの 1， 3—位あるいは 1 , 2—位に結合したジアルキルグリセ口一ル、第一飽和アルコール及び第一不飽和アルコールで構成されたジアルキルグリセロールが挙げられる。

その他、本発明に用いられる鎖状炭化水素基の供給源としては、ステロール類が挙げられる。例えば、コレステロール、コレス夕ノール、シトステロール及びエルゴステロール等である。

おりである,

O

まず、化合物（a) に、鎖状炭化水素基の供給源（例えば、 Rc— OHまたは Rd-OH) を反応させ、化合物（b) を得る。反応は、酸触媒による脱水縮合反応、活性エステル化法、酸無水物法、混合酸無水物法、カルボン酸ハロゲン化法、カルボン酸アジド法等を用いて行うことができる。中でも、酸触媒による脱水縮合が最も簡便であり、精製も容易であるので好ましい。脱水縮合反応は常法に従い行うことができる。但し、酸触媒による脱水縮合の場合、加熱を必要とするため、原料が熱に対して不安定な場合は他の方法を選択するのが好ましい。なお、目的の部位で目的の反応を生じさせるために、必要に応じて、化合物（a ) の反応性官能基を t e r t 一ブトキシ基、 t e r t —ブトキシカルポニル基、ベンジルォキシカルボニル基等の保護基で保護しておくことが好ましい。

次に、上記で得られた化合物（b ) に、化合物（c ) を反応させ、化合物 ( d ) を得る。化合物（c ) は、予めアミノ基を t e r t—ブトキシ基、 t e r t—ブトキシカルボ二ル基、ベンジルォキシカルポニル基などにより保護し、力ルポキシル基は V-ヒドロキシスクシンイミドなどにより活性化しておくことが望ましい。次の工程で、化合物（e ) 及び（e ' ) が異なる化合物である場合、化合物（c ) の 2つのアミノ基は、それぞれ反応性の異なる保護基で保護しておくことが好ましい。例えば、一方を t e r t 一ブトキシカルボニル基で保護し、他方をベンジルォキシカルポニル基で保護しておくと、次の工程で化合物 ( e ) または（e ' ) を化合物（c ) のそれぞれのァミノ基と選択的に反応させることができる。反応は、活性エステル法、酸無水物法、混合酸無水物法等を用いることができる。また、通常のペプチド合成と同様の方法で固相合成を行うこともできる。なお、反応は、第三級ァミンなどの触媒の存在下で行うことが好ましい。反応終了後は、トリフルォロ酢酸などの酸で処理して脱保護し、常法により精製して化合物（d ) を得ることができる。なお、反応の終点は、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、核磁気共鳴スぺクトル及び赤外吸収スぺクトル等によって確認することができる。

次いで、得られた化合物（d ) のァミノ基に化合物（e ) 及び（e ' ) を反応させる。化合物（e ) 及び（e ' ) は、予め、アミノ基を t e r t —ブトキシ基などにより保護し、力ルポキシル基は一方を t e r t—ブトキシ基で保護し、他方を N- tドロキシスクシンイミドなどにより活性化しておくことが望ましい。反応は、活性エステル法、酸無水物法、混合酸無水物法等を用いることができる。また、通常のペプチド合成と同様の方法で固相合成を行うこともできる。反応は、第三級アミンなどの触媒の存在下で行うことが好ましい。

反応終了後は、上記と同様にして脱保護し、常法に従い精製して化合物（ί ) を得ることができる。反応の終点は、上記と同様にして確認することができる。なお、上記反応は、いずれも室温で行うことができる。また、反応は、加圧、減圧または大気圧のいずれの圧力下でも行うことができるが、操作が簡便であることから、大気圧雰囲気下で行うことが望ましい。

本発明の両親媒性分子は、上記のようにして製造することができる。本発明の好ましい態様によれば、本発明の両親媒性分子を分子集合体の構成成分として用いることにより、生理的条件下でゼ一夕電位が中性あるいはマイナスの小胞体構造を形成して目的物質を保持し、酸性条件下でゼ一夕電位がプラスとなりァニォン性生体膜との相互作用により小胞体構造が変化して目的物質を小胞体の外側に放出させることができる。

本発明の両親媒性分子は、親水部にカチオン性官能基とァニオン性官能基とを有することにより上記のような特性を有する分子集合体を構成することができるものであれば、その構造は前記したものに限られない。本発明の技術思想に基づき、設計変更等された化合物であって、上記のような機能を奏するものであればすべて、本発明の範囲内に含まれることが理解されるべきである。

[ 2 ] 分子集合体

本発明の分子集合体は、その構成成分として、前述した本発明の両親媒性分子を含む。ここで「分子集合体」とは、本発明の両親媒性分子を、必要に応じてステロイド類及び他の両親媒性分子と共に水系媒体に分散させたときに形成される特定の形態をもつ分子の集合物をいう。

本発明の好ましい態様によれば、本発明の分子集合体は、その構成成分として本発明の両親媒性分子を含むものであるので、 p H応答性を示すことができる。すなわち、水溶液中、生理的な p H環境下ではゼ一夕電位が中性あるいはマイナスの小胞体構造を形成するが、酸性 p H環境下では本発明の両親媒性分子においてァニオン性官能基のイオン化傾向が減少し、分子集合体の正味の電荷がカチォン性になるため、ゼ一夕電位がプラスとなり、ァニオン性生体膜と相互作用しゃすくなる。より好ましくは、本発明の分子集合体は、生理的な p H環境下でゼー夕電位が中性あるいはマイナスの小胞体構造を形成して目的物質を保持し、酸性 p H環境下でゼ一夕電位がプラスとなりァニオン性生体膜との相互作用により小胞体構造が変化して目的物質を小胞体の外側に放出させることができる。

本発明の分子集合体のゼ一夕電位がマイナスからプラスに変化する p H範囲は特に限定されるものではない。本発明の分子集合体のゼ一夕電位がマイナスからプラスに変化する p H範囲は、用いる両親媒性分子の種類や他の構成成分との組み合わせ及びその配合比等によって調整可能であり、目的や用途等に応じて適宜選択することができる。本発明の分子集合体のゼ一夕電位がマイナスからプラスに変化する好ましい p H範囲は 4 . 0以上、より好ましくは 4 . 5以上、さらに好ましくは 5 . 0以上、特に好ましくは 5 . 5以上である。また、該 p Hは、好ましくは 7 . 2未満、より好ましくは 7 . 0未満、さらに好ましくは 6 . 5未満、特に好ましくは 6 . 0未満、とりわけ好ましくは p H 5 . 5以下である。本明細書では、これらの上限と下限を自由に組み合わせた範囲が開示されているものとする。

本発明の一実施形態において、本発明の分子集合体は、エンドソ一ム内環境の代表的な p H 4 . 0〜6 . 0にてゼ一夕電位がマイナスからプラスに変化することができるため、標的細胞に取り込まれた際にエンドソ一ム膜融合して保持している目的物質を細胞質側に放出する能力が高いと考えられる。

本発明の分子集合体が示すこのような挙動は、水溶液の; p Hに応答して、両親媒性分子の親水部の電荷バランスが変化し、それが分子集合体の分子充填状態に影響して分子集合体の構造が変化することによって生じるものと考えられる。本発明の好ましい態様によれば、本発明の分子集合体の上記性質を利用することにより、目的物質を目的患部に効率よく送達させることができる。また、本発明の好ましい態様によれば、本発明の分子集合体は、細胞内のァニオン性生体膜であるエンドゾームに取り込まれたときに目的物質をェンドソームの外側の細胞質に放出させることができる。

以下、図面を参照しながら本発明の分子集合体の放出挙動について説明する。図 1は、本発明の分子集合体が、目的の細胞内に取り込まれ、その保持していた目的物質を放出する挙動を示した概念図である。

まず、本発明の分子集合体は、細胞内に取り込まれる前は、生理的な p H環境下で分子集合体の小胞体構造を保持し、内包物を安定に保持している（図 1 ( a ) ) 。生理的な p H環境下では、分子集合体のゼ一夕電位は中性またはマイナスであることから、例えば血中に投与した際には、血中滞留時の表面電位がマィナスである血管壁などへの吸着は回避され、良好な血中滞留性を示す。この分子集合体は、生体内を循環しながら細胞膜に近づき、そこでエンドサイト一シスによって細胞内に取り込まれる（図 1 ( b ) ) 。

エンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれた分子集合体は、エンドソ一ム内の酸性 P H環境下でゼ一タ電位が中性またはマイナスからプラスに変化し、負電荷脂質が豊富なェンドソーム膜はゼ一夕電位がマイナスであるためにエンドゾーム膜への吸着が促進される。そして、エンドゾーム膜との相互作用（好ましくは融合）により分子集合体の小胞体構造が変化する。これによつて、保持していた目的物質をエンドゾームの外側に放出させることができる（図 1 ( c ) ) 。本発明の好ましい態様によれば、本発明の分子集合体は、エンドゾームの環境に近い p H環境下で目的物質を送達させることができるため、より多くの目的物質を短時間で細胞質内に送達させることができる。

通常、異物は、細胞内にエンドサイト一シスによって取り込まれた後、分解酵素を含むライソソ一ムにおいて消化されてしまう。これに対し、本発明の分子集合体は目的物質を分子集合体に保持させたものであるので、ライソソームにおける分解を受ける前に目的物質を細胞内あるいは核内に効率よく送達させることが可能である。なお、図 1は一例であり、分子集合体の形状、目的物質の保持方法、目的物質の放出挙動などは図 1に何ら制限されない。

本発明の分子集合体において、使用する本発明の両親媒性分子は 1種であっても、 2種以上の組み合わせであってもよい。本発明の分子集合体における両親媒性分子の含有量は、分子集合体の構成成分の合計モル数に対して、 1 0〜1 0 0 モル％が好ましく、 2 0〜8 0モル％がより好ましく、 3 0〜6 0モル％がさらに好ましい。本発明の両親媒性分子の含有量が高いほど、目的物質の放出速度または放出率を高めることができる。本発明の両親媒性分子の含有量は、目的物質を導入したい体内の部位、所望の放出率または所望の放出速度などによって適宜調整することができる。本発明の分子集合体はまた、本発明の両親媒性分子に加えて、他の構成成分を含むことができる。例えば、本発明の分子集合体はステロイド類を含むことができる。ステロイド類としては、ステロール類、胆汁酸、プロビタミン D、ステロィドホルモンなど、ペルヒドロシクロペンタノフエナントレンを有する全てのステロイドが挙げられる。中でもステロ一ル類を用いることが好ましい。ステロール類としては、例えば、エルゴステロール、コレステロール等が挙げられる。中でもコレステロールを用いることが好ましい。

本発明の分子集合体に用いられるステロイド類の含有量に特に制限はないが、分子集合体の構成成分の合計モル数に対して、 1 0〜6 0モル％が好ましく、 2 0〜5 0モル％がより好ましい。ステロイド類は、分子集合体の安定化剤として作用することができるので、所望の放出速度及び放出率などに応じて適宜調整すればよい。これらのステロイド類は 1種でも 2種以上を組み合わせて使用してもよい。

さらに、本発明の分子集合体は、本発明の目的を損なわない範囲、特に、本発明の分子集合体を血中投与する場合は血中滞留性に悪影響を及ぼさない範囲であれば、本発明の両親媒性分子以外の両イオン性脂質、カチオン性脂質及びァニォン性脂質からなる群から選ばれる少なくとも 1種のイオン性の脂質成分を含んでもよい。

これらのイオン性脂質は 1種単独でも 2種以上を組み合わせて使用することもできる。これらの脂質の含有量は特に制限されるものではないが、分子集合体の構成成分の合計モル数に対して、 0〜9 0モル％が好ましく、 0〜5 0モル％がより好ましい。但し、これらのカチオン性脂質は、血中滞留時の血管壁などに吸着されやすいことから、分子集合体の血中滞留性を低下させる場合があるので、カチオン性脂質の使用量は、分子集合体の構成成分の合計モル数に対して、 0〜 5 0モル％程度であることが好ましい。

さらに本発明の分子集合体には、ポリエチレングリコ一ル型脂質を含有することもできる。ポリエチレングリコール型脂質を構成成分として用いることにより、分子集合体の凝集が抑制され、生体内に投与された後の血中滞留時間を延長させることができる。ポリエチレングリコール型脂質は 1種単独でも 2種以上を組み合わせて使用することもできる。これらのポリエチレングリコール型脂質の含有量は特に制限されるものではないが、分子集合体の構成成分の合計モル数に対して、 0〜3 0モル％が好ましく、 0 . 1〜0 . 5モル％がより好ましい。本発明に用いることができるポリエチレングリコ一ル型脂質のポリエチレングリコール部の分子量は特に制限されないが、 2 0 0〜5万程度であることが好ましく、 5 0 0 0〜 2万程度であることがより好ましい。

その他、本発明の分子集合体は、卵黄レシチン、大豆レシチン、水添卵黄レシチン、水添大豆レシチン、ホスファチジルコリン類、ホスファチジルグリセ口一ル類、ホスファチジルェタノ一ルァミン類、スフインゴミエリン、多種の糖脂質など分子集合体の構成成分として知られているリン脂質を 1種または 2種以上含有することができる。これらの脂質の含有量は特に制限されるものではないが、分子集合体の構成成分の合計モル数に対して、 0〜8 0モル％が好ましく、 4 0 〜7 0モル％がより好ましい。

本発明の好ましい態様によれば、本発明の分子集合体は目的物質を保持している。ここで「分子集合体が目的物質を保持している」とは、分子集合体内部の親水領域（水相）あるいは脂質二分子膜内または分子膜の外側表面に目的物質が相互作用している状態のことをいう。例えば、（ i ) 水溶性もしくは疎水性の目的物質が分子集合体内部の水相に局在する状態、（ i i ) 水溶性もしくは疎水性の目的物質が親水性高分子により包括されている複合体が、分子集合体内部の水相に局在する状態、あるいは（ i i i ) 疎水性の目的物質が二分子膜内の疎水領域または二分子膜の外側表面に局在する状態などが挙げられる。

本発明の分子集合体に用いられる目的物質は、本発明の分子集合体に保持することができるものであれば特に限定されない。目的物質は、標的となる臓器または組織、細胞の少なくとも一つに作用するものであることが好ましい。例えば、薬物、プローブ、核酸（任意の D N A、 R NA、 s i R N Aなどを含む）、タンパク質、ペプチド、金属イオン（任意のリチウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシゥムイオン、カルシウムイオン、鉄イオン、銅イオン等を含む）及び金属錯体（任意の鉄錯体、銅錯体、白金錯体、ガドリニウム錯体、バナジウム錯体、亜鉛錯体、マンガン錯体を含む）からなる群から選択される少なくとも 1種であることが好ましい。本発明の好ましい態様によれば、本発明の分子集合体に保持されたこれらの物質は、エンドサイトーシスによって細胞内のエンドソーム内に取り込まれた後、細胞質内に放出されることにより、効率良く細胞内に送達することができる。本発明の分子集合体に保持させる目的物質の分子量は、通常 5〜 1 0 0 0 0 0 0、好ましくは 3 0〜： L 0 0 0 0 0 0、より好ましくは 2 0 0〜 5 0 0 0 0 0、さらに好ましくは 3 0 0〜 1 0 0 0 0 0である。

本発明に用いられる目的物質は、例えば、酵素、ペプチドまたはタンパク質、抗体（単鎖抗体含む）、受容体、リガンド、各種抗生物質、各種ペプチド性ホルモン、 D N A、 R N A、 s i R N A、プラスミド、プローブ、各種杭がん剤、中枢神経系用薬、末梢神経用剤、感覚器官用薬、循環器官用薬、呼吸器官用薬、消化器官用薬、ホルモン剤、泌尿生殖器官及び肛門用薬、外皮用薬、歯科口腔用剤、ビタミン剤、滋養強壮薬、血液および体液用薬、人工透析用薬、その他の代謝性医薬品、細胞賦活用剤、腫瘍用薬、放射性医薬品、アレルギー用薬、生薬および漢方処方に基づく医薬品、抗生物質製剤、化学療法剤、生物学的製剤、診断用薬などが挙げられる。ペプチドまたはタンパク質の一例としては、抗体、受容体、リガンド、イン夕一ロイキン等の各種サイト力イン、細胞伝達因子、細胞成長因子、フイブリノ一ゲン、コラーゲン、ケラチン、プロテオダリカン等細胞外マトリックス剤としてのポリペプチドまたはその構造の一部としてのオリゴ体、あるいはォキシトシン、ブラジキニン、チロトロビン放出因子、エンケファリン等の機能性ポリペプチドが挙げられる。酵素としては、力タラ一せ、キモトリブシン、チトクローム、アミラーゼなどが挙げられるが、これらに何ら限定されるものではない。プローブの一例としては、抗体、抗原、色素、あるいは蛍光色素など諸種の標識体や活性物質などが挙げられる。これらの物質は、 1種単独で用いてもよく、 2種以上を組み合わせて用いることもできる。

本発明の分子集合体に保持される目的物質の含有量は、目的物質の種類または目的等によって大きく異なるものではあるが、分子集合体の構成成分の全重量 (但し、目的物質の重量を除く）に対して、 0 . 0 0 1〜1 0 0 0重量％が好ましく、 0 . 0 1〜2 0 0重量％がより好ましく、 0 . 1〜5 0重量％がさらに好ましい。本発明の分子集合体の形状は特に制限されないが、例えば、高分子集合体（ポリマ一コンプレックス、高分子ミセル、高分子化リボソーム等）、ェマルジヨン、リピドマイクロスフィァ、二分子膜小胞体（リボソーム）、その他の分子集合体 (チューブ、ファイバ一、リボン、シート等）などが挙げられる。中でも、リポゾームであることが好ましい。

本発明の分子集合体がリボソームである場合、リボソームを水性媒体中に分散させると、リボソームは内水相を含むことができる。このとき、分子集合体に保持されている目的物質は、リボソーム内水相に溶解または分散しているものであることが好ましい。あるいは、リポソ一ムニ分子膜の疎水性領域内に目的物質を保持させるなど、目的物質が二分子膜内に局在したものであってもよい。

なお、本明細書において、分子集合体の構成成分の含有量をいう場合、内水相は考慮しないこととする。

本発明の分子集合体の粒径は、 2 5〜1 0 0 0 0 n mが好ましく、 1 0 0〜5 0 0 n mがより好ましく、 1 5 0〜3 0 0 n mがさらに好ましい。

本発明の分子集合体の製造方法は特に限定されるものではなく、公知の方法に準じて製造することができる。例えば、リボソームの製造の手法としては、単独または混合脂質の粉末もしくは薄膜を水和させ分散させた後、高圧押出し（ェクストル一ジョン）法、超音波照射法、撹拌（ポルテックスミキシング、ホモジナィザ一）法、高速攪拌法、フレンチプレス法、凍結融解法、マイクロフルイダィザ一法などを用いて製造する方法、単独または混合脂質を有機溶媒に溶解させた溶液を水相に注入した後、エタノールまたはエーテルなどの有機溶媒を減圧または透析で除去して形成する方法、あるいは、単独または混合脂質をコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、 T r i t o n X— 1 0 0、ォクチルダリコシドまたはラウリルエーテルなどの非イオン性界面活性剤と共に水相に分散させてェマルジヨンを形成させ、透析によって除去して形成する方法、その他、逆相蒸発法、インキュベーション法などを採用することができる。

本発明の分子集合体に目的物質を保持させる方法は、目的物質の種類等に応じて適宜選択すればよい。例えば目的物質が水溶性薬物である場合は、分子集合体の製造時に該薬物を水相に溶解し、前述した方法で分子集合体を形成する際に、分子集合体（例えばリボソームの内水相）に内包させることができる。あるいは膜透過性のある水溶性薬物の場合には、分子集合体（リボソーム）を形成させてから、外水相に薬物を溶解して、膜透過性を利用して内水相に内包させることができる。内包されなかった水溶性物質はゲルろ過、超遠心分離または限外ろ過膜処理などにより内包小胞体と分離できる。

あるいは、目的物質が脂溶性や両親媒性の薬物である場合は、単独または混合脂質が有機溶媒に溶けている状態で当該薬物を混合して、前述した方法で分子集合体を形成することにより、分子集合体の疎水部（例えばリボソームの二分子膜内）に薬物を保持させることができる。あるいは前述した方法で分子集合体の分散液を調製してからエタノールや D M S Oなど水と混ざる溶媒に薬物を溶解した溶液を添加して薬物を疎水部に保持させることができる。

目的物質がプローブ、核酸またはタンパク質などの場合は、上記と同様の方法で分子集合体に目的物質を保持させるか、あるいは分子集合体の外側表面に目的物質を局在させることにより目的物質を保持することができる。

[ 3 ] 分子集合体の用途

( 1 ) 薬剤

例えば、本発明の分子集合体に薬物を保持させた場合、本発明の分子集合体は薬剤として使用することができる。薬物の含有量は、薬物の種類または目的に応じて適宜決定することができるが、分子集合体の構成成分の全重量（但し、目的物質の重量を除く）に対して 0 . 0 0 1〜 1 0 0 0重量％が好ましく、 0 . 0 1 〜1 0 0重量％がより好ましく、 0 . 1〜 1 0重量％がさらに好ましい。本発明の薬剤の投与方法は特に限定されない。本発明の薬剤は、例えば、経口、非経口、静脈、口内、直腸、膣、経皮、鼻腔経路経由または吸入経由、さらには疾患部位に対して直接投与（局所投与）することができる。本発明の薬剤の投与量は、有効量の範囲内であれば良く、対象疾患、投与対象、投与方法、症状などによっても異なる力、通常、体重 1 k g当たり、 1日につき、約 0 . 0 0 1〜約 1 4 0 0 m g (分子集合体の構成成分（脂質）重量）である。

本発明の分子集合体に保持する薬物としては、各種杭がん剤、中枢神経系用薬、 9

末梢神経用剤、感覚器官用薬、循環器官用薬、呼吸器官用薬、消化器官用薬、ホルモン剤、泌尿生殖器官及び肛門用薬、外皮用薬、歯科口腔用剤、ビタミン剤、滋養強壮薬、血液および体液用薬、人工透析用薬、その他の代謝性医薬品、細胞賦活用剤、腫瘍用薬、放射性医薬品、アレルギー用薬、生薬および漢方処方に基づく医薬品、抗生物質製剤、化学療法剤、生物学的製剤などが含まれる。 ( 2 ) 試薬、診断薬及びキット

また、本発明の分子集合体にプローブ、抗体または核酸を保持させた場合、本発明の分子集合体は試薬または診断薬として使用することができる。例えば、本発明の分子集合体にプローブを保持させた場合、本発明の分子集合体は遺伝子等の生体物質検出用試薬 ·診断薬に、または細胞内物質の局在または機能を診断するための試薬として有用である。

本発明に用いられるプローブは、遺伝子、遺伝子産物等の特定の物質、部位、状態などを検出するための分子であれば特に制限されない。プローブの一例としては、抗体、抗原、色素あるいは蛍光色素など諸種の標識体または活性物質が挙げられる。このうち、生理活性物質（生体に対して作用する物質）として、例えば核酸、タンパク質、その他小分子を含む。例えば、プローブとして蛍光色素を保持させた場合、本発明の試薬は、生体内でのリボソームの局在部位を検出する際などに使用することができる。

本発明の分子集合体に保持させるプローブの含有量は、その種類または目的に応じて適宜決定することができるが、分子集合体の構成成分の全重量（但し、目的物質の重量を除く）に対して 0 . 0 0 1〜1 0 0 0重量％が好ましく、 0 . 0 1〜1 0 0重量％がより好ましく、 0 . 1〜 1 0重量％がさらに好ましい。また、例えば、本発明の分子集合体に核酸を保持させた場合、本発明の分子集合体は核酸導入剤として有用である。本発明の分子集合体を含む核酸導入剤は、ライソゾームによって消化されることなく、細胞質内あるいは細胞核内に効率良く目的遺伝子を送達することができるので遺伝子治療等に有用である。

例えば、本発明の分子集合体に、デコイ D N A、 s i R N Aまたはアンチセンス D N Aなどの遺伝子発現を制御する核酸を保持させることにより、特定遺伝子のノックダウンを促す試薬等として有用である。

本発明の試薬を遺伝子治療に用いるときは、例えば、経口、非経口、静脈、口内、直腸、膣、経皮、鼻腔経路経由または吸入経由さらには疾患部位に対して直接生体内に投与することができる。

本発明の試薬を核酸導入に用いるときは、その使用量は、細胞 1 X 1 0⁴個あたり 0. 00 1〜 1 00 pmo 1、好ましくは 0. 1〜： L O pmo l程度の量 (分子集合体の構成成分（脂質）モル数）であるが、従来の遺伝子導入試薬として用いられてきたリポフエクトァミン、トランソーム、 DOTAPおよび DMR I Eなどのカチオン性脂質を構成脂質にしたリボソーム試薬等の使用量を参考にして適宜設定することができる。この用量により、従来の遺伝子導入試薬（リポフエクトァミン）に比べて細胞毒性を伴うことなく同程度の導入効率が得られる。また、本発明は、上記試薬または診断薬を含む、生体物質検出用、細胞内物質の局在または機能診断用あるいは遺伝子治療用キットを提供する。本発明のキットには、緩衝液、 pH調整剤、細胞保護液などを単独で、または適宜組み合わせて含めることができる。必要に応じて、トランスフエクシヨンの対照として用いられる標準核酸を含んでもよい。このような核酸としては、レポーター又はマー力一タンパク質（例えばルシフェラーゼ、 3—ガラクトシダーゼ、 GFP等）をコードする核酸が挙げられる。核酸は、プラスミドベクタ一の形態であってもよレ^ さらに、本発明のキットには、必要に応じて例えば DEAEデキストラン等のトランスフエクシヨン増強試薬及び他の添加剤を含めることが可能である。さらに、本発明のキットには、遺伝子、遺伝子産物等の特定の物質、部位、状態などを検出するための使用説明書あるいは核酸を導入するための使用説明書を含めることができる。キットに含まれる各成分は、例えば、各成分を容器中に封入した包装形態としてもよい。

(3) 酵素補充治療用タンパク質製剤

本発明の分子集合体にタンパク質を保持させた場合、本発明の分子集合体は酵素補充治療用製剤として使用することができる。タンパク質としては、アデノシンデァミナ一ゼ、一酸化窒素合成酵素、スーパーォキシドデイスムターゼ、アルギノコハク酸合成酵素、フエ二ルァラニン水酸化酵素、 α -ガラクトシダーゼ、 )6 -ダルコシダーゼなどが挙げられる。本発明の酵素補充治療用製剤は、例えば、特定酵素の発現が全くあるいは十分に行われない患者に対して用いることができる。タンパク質の含有量は、種類または目的に応じて適宜決定することができるが、分子集合体の構成成分の全重量（但し、 '目的物質の重量を除く）に対して 0 0 1〜； L 0 0 0重量％が好ましく、 0 . 0 1〜2 0 0重量％がより好ましく、 0 . 1〜 5 0重量％がさらに好ましい。本製剤の投与方法は、特に限定されない。本製剤は、例えば、経口、非経口、静脈、口内、直腸、膣、経皮、鼻腔経路経由または吸入経由で投与することができる。製剤の使用量は、有効量の範囲内であれば良く、対象疾患、投与対象、投与方法、症状などによっても異なるが、通常、体重 l k g当たり、 1日につき、約 0 . 0 0 1〜約1 4 0 0 01 8 (分子集合体の構成成分（脂質）重量）である。実施例

以下、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら制限されない。

〔実施例 1〕

p H応答性両親媒性分子 (GGLG： la- 1)の合成

工程（A) ： P-トルエンスルホン酸一水和物 (4.56 g、 24 mmol)のベンゼン溶液 (100 mL)を 85 Cにて沸点還流し、 Dean-Stark を用いて反応前に水を除去した。反応液にグルタミン酸 (2.96 g、 20 mmol)とへキサデシルアルコール（10.7 _g、 44 mmol)を添加し、 10 時間かけて生成水を除去しながら沸点還流した。反応の進行に伴い、懸濁液は徐々に溶解し透明に変化した。

反応終了後、溶媒を減圧除去し、クロ口ホルムに溶解して、炭酸ナトリウム飽和水溶液で 3 回洗浄した。クロ口ホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧除去した。残留物はメタノールから 4°Cにて再結晶し、化合物 1 (収率 83%)を白色粉末で得た。

(1)化合物 1の分析結果は以下のとおりであつた。

薄層クロマトグラフィー (シリカゲルプレート、クロ口ホルム/メタノール（4 /1) (容量 Z容量）： R 0.83 (モノスポット））。

赤外吸収スぺクトル (cm ¹)： 1737 ( v c=o,ester).

¹H-NMR (CDCla , 500 MHz , δ ppm) ： 0.88 (t，6H，- CH₃) ； 1.25 (br， 52H， alkyl)； 1.62 (m,4H,-CO-0-C-CH₂-)； 1.84 (m，lH，glu β -CH₂-)； 2.08 (m，lH， glu j6 -CH2-)； 2.45 (t,2H， glu r -CH₂-)； 3.45 (t，lH, glu α -CH-)； 4.06,4.12 (t,4H, -CO-0-CH₂-)

MS(ESI) Calcd： 595.9 ； Found： 597.3 (MH)⁺. 工程（B ) ：工程（A) で得られた化合物 1 (1.0 g、 1.67 mmol) と、トリエチルァミン (202 mg、 2.0 mmol)をジクロロメタン 30 mLに溶解し、 1時間室温で撹拌した。その後、アミノ基を t-ブトキシ基で保護し、力ルポキシル基を N- ヒドロキシスクシンイミドにより活性化させたリジン (617 mg、 1.4 mmol)を添加し、さらに 6時間室温で撹拌した。

反応終了後、溶媒を減圧除去し、クロ口ホルムに溶解して、炭酸ナトリウム飽和水溶液で 3 回洗浄した。クロ口ホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧除去した。残留物はメタノールから 4°Cで再結晶し、グラスフィルター (G6)ろ過して、ァミノ基が保護されたリジン誘導体を得た。

得られた誘導体にトリフルォロ酢酸 (20 mL)を加え、 4 °Cで、 2 時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧除去し、クロ口ホルムに溶解して、炭酸ナトリウム飽和水溶液で 4 回洗浄した。クロ口ホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧除去した。残留物はメタノールから 4 で再結晶し、ろ過し、乾燥して、化合物 2 (80%)を白色粉末として得た。

化合物 2 化合物 2の分析結果は以下のとおりであつた。

(2): 薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、クロ口ホルム/メタノ一ル (4/1) (容量 /容量）：Rf： 0.63(モノスポット)）

赤外吸収スぺクトル (cm ¹)： 1737 ( V c=o,ester)； 1673 ( v c=o, amide)

iH-NMR(CDCl₃, 500 MHz, δ (ppm))： 0.83 (t, 6H, -CH₃)； 1.19 (br, 52H, -CH₂- )； 4.33 (d, 1H, glu -CH-)； 4.50 (br, 1H, lys -CH-); 7.8, 8.2 (br, 2H, -NH₂) 工程（C ) ：工程（B ) で得られた化合物 2 (500 mg, 691 mmol)とトリェチルァミン（107 1， 829 mmol) をジクロロメタン 30 mLに溶解し、 1時間室温で撹拌した。その後、ァミノ基が t-ブトキシ基、 r -力ルポキシル基がプチルェステル基で保護され、ひ-力ルポキシル基がヒドロキシスクシンイミドにより活性化されたグルタミン酸 (639 mg、 1.45 mmol)を添加し、さらに 6時間室温で撹拌した。

反応終了後、溶媒を減圧除去し、クロ口ホルムに溶解して、炭酸ナトリウム飽和水溶液で 3 回洗浄した。クロ口ホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧除去した。残留物はメタノールから 4 °Cで再結晶し、グラスフィル夕一 (G6)ろ過して、アミノ基を保護したリジン誘導体を得た。

得られたリジン誘導体にトリフルォロ酢酸 (20 mL)を加え、 4 で、 2 時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧除去し、クロ口ホルムに溶解して、炭酸ナトリゥム飽和水溶液で 2 回洗浄した。クロ口ホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧乾燥して、本発明の両親媒性分子である化合物 3 (GGLG： Ia-1) (65%)を白色粉末として得た _t

3

化合物 3の分析結果は以下のとおりであった。

(3)：薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、クロ口ホルム/メタノール (4/1) (容量 /容量）：： 0·05(モノスポット)）

赤外吸収スぺクトル (cm ¹)： 1737 ( V _c=o,ester)； 1673 ( v c=o, amide)

iH-NMR(CDCl₃、 500 MHz、 δ (ppm)) ： 0.84(t, 6H， -CH₃) ； 1.23 (br, 52H, alkyl)； 3.88, 3.93 (t, IH, glu α -CH-Lys-)； 4.34(q, IH, lys α -CH-)； 4.44 (q, IH, glu oi -CH-COO-)

合成された本発明の両親媒性分子は、三段階で合成でき、精製も再結晶のみで行うことができるため、短時間でかつ簡便な方法で 40 %超の高収率で大量合成できる利点を持つ。これは、現在までに報告されている D O P Eなどのリン脂質誘導体と比較しても格段に有利な点である。

〔実施例 2〕

リボソームの調製

化合物 3 (174 mg、 0.177 mmol)、コレステロール (69.3 mg、 0.179 mmol), iV-methoxypolythylene glyco-l,5-dioctadecyl-L-glutamate (PEG-Glu2Cis ： PEG, Mw 5000) (6.0 mg、 1.0 mol)をベンゼンに溶解させ、凍結乾燥して混合脂質を調製した。この混合脂質 20 mgを注射用水 1 mLに分散し、 6 時間攪拌後、高圧押出法 (最終孔径 0.22 ^ m)にて粒子径約 225 nm のリボソーム (以下、「pH応答性リボソーム」という場合がある。）を調製した。 (ゼ一夕電位測定）

調製したリボソーム（[lipid]=10 mg/ml)を pH 7.4, 7, 6, 5, 4の酢酸緩衝液 (30 mM)にそれぞれ添加し、最終濃度を [lipid]=l mg/mL として 37でにおけるゼ一夕電位を測定した。 Malvern社製の型式 Zetasizer4 を用いて、測定濃度に希釈したリボソーム分散液をキヤビラリ一セルに充填し、 37°Cにて 3 回測定した。その結果を図 2に示す。

図 2からわかるように、化合物 3を構成成分とするリボソームは、 pH の低下に伴ってゼ一夕電位が上昇し、マイナスからプラスへと変化した。これは、 pH 7.4 ではリボソームのゼ一夕電位がマイナスであり、親水部の Ύ 位のカルポキシル基がアミノ基よりも表面に突出しているためであると考えられる。すなわち、 pH の低下 (pH 5-6)に伴い、ゼ一夕電位がプラスとなるのはグルタミン酸のカルポキシル基が解離状態から非解離状態になったためであると考えられる。図 2において、（〇）は化合物 3 /cholesterol/PEG-Glu2Cl8(5/5/0.03(モル比)）のゼ一夕電位変化を示す。

(ァニオン性生体膜との相互作用の検討 1 )

エンドソ一ム膜はホスファチジルセリン (PS)，ホスファチジルグリセロール (PG)などのァニオン性脂質が多く含有することが知られている。そこで、ェンドソーム内における pH応答性リボソームの挙動解析として、ァニオン性生体膜への吸着作用を明らかとするために、ァニオン性リボソーム (c.a. 250 nm)と pH 応答性リボソーム (c.a. 250 nm)の各 pHでの凝集度（融合も含む）を粒径変化によって測定した。

ァニオン性リボソーム (ジパルミトイルホスファチジルコリン

(DPPC)ん holesterol/ジパルミトィルホスファチジルグリセ口一ル

(DPPG)=4/5/l(モル比)， [lipid] =1 mg/ml) と pH応答性リポソ一ム（[lipid]=l mg/ml)を、 30 mM酢酸緩衝液に各々 50 ^ L添加し、粒径を光散乱光度計により測定した。 Beckman社製の型式 N4 PLUS Submicron Particle Size Analyzerを用いて、測定濃度に希釈したリボソーム分散液 2 mLをセルに充填し、動的光散乱法により 3回見かけの粒子径を測定した。その結果を図 3に示す。図 3において、各 pH(4，5，6，7，7.4)における凝集度を示した (n=3)。

図 3からわかるように、ァニオン性リボソームまたは pH応答性リボソームは pH によらず粒子径は一定であつたが、 pH 応答性リボソームをァニオン性リポゾームと混合すると、分散媒の pH低下に伴い粒径が増大した。 pH 6で pH応答性リボソームの粒径は約 400 nmになり、さらに pHの低下とともに粒径は増大し、 pH 4でその粒径は約 650 nmとなった。これはリポソ一ム間での凝集を意味している。その凝集度は pH応答性リボソームのゼ一夕電位がプラスになるほど大きくなつた。これにより pH応答性リボソームがエンドゾーム内の pH環境下で、エンドゾーム膜との凝集と融合を促進させるのに必要な性質を有していることを示唆している。

(ァニオン性生体膜との相互作用の検討 2 )

さらに、エンドソ一ム内の pH環境下における pH応答性リボソームとエンドソ一ム膜を仮想したァニオン性生体膜との膜融合度を、 FRET (蛍光共鳴エネルギー移動)を利用した希釈法により測定した。

仮想エンドゾームとしてジォレオイルホスファチジルコリン (DOPC)/cholesterol/ジォレオイルホスファチジルセリン (DOPS)/ 1,2-Dioleoyl- sn-glycero-3-phosp oethanolamme-]Si-(7-nitro-2-l,3-benzoxadiazol-4-yi)(NBD- PE)/l,2-dioleoyl-sn-glycero-3-pliosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamme B sulfonyl)(R-PE)(=3/l/0.3/0.0022/0.0022, モル比）を構成成分とするァニオン性リボソームを調製した。まず、 pHの異なる酢酸緩衝液 200 1に対し、 500 M ァニオン性リボソーム 25 1 と 4.5 mM pH 応答性リボソーム（化合物 3 /cholesterol/PEG-Glu2Ci8=5/5/0.03, モル比) を添加し、インキュベート (37°C , 30分）した。続いて、この混合液 20 1を 150 mM生理食塩水 80 1に添加し、プレートリーダー（Perkin Elmer Japan Co., Ltd, ARVO Mx-3) にて 535nmにおける蛍光強度 (Fluorescent Intensity, F.L)を検出した (Ex： 485nm)。式（1.1) を用いて各 pH における膜融合度を算出し、さらに式（1.2) を用いて PH7.4における膜融合度に対する相対的な膜融合度の値を、各 pHについて算出した。膜融合度の測定結果を図 4に示す。

膜融合度 ⁼ Κοο)-ΐ(θ)

式（ι·υ

I (X) =ァ二オン性リボソーム及び ρΗ応答性リポソームの蛍光強度

I (0) =ァ二オン性リポソ一ムのみの蛍光強度

I (∞) =0. 5%SDSで処理されたァニオン性リボソームの蛍光強度

. ノ

D ^v (x)

相対的な膜融合度 = _{DF (74)}— 式 _{( 1 2)}

D. F. (X) =各 pHにおけるァニオン性リボソーム及び pH応答性リボソームの膜融合度 D. F. (X) =pH7. 4におけるァニオン性リポソーム及び pH応答性リポソ一ムの膜融合度

、図 4からわかるように、膜融合度は pH7.4-6.0 の範囲ではほぼ変化しなかつたが、 PH6.0-4.0 の範囲内で膜融合度の増大が認められた。そして ρΗ5·0 において、 ρΗ7.4 における膜融合度の約 3.7倍に達した。このことから、 pH応答性リボソームは ρΗ5-6 環境下において、ゼ一夕電位がマイナスからプラスへと変化し、ァニオン性生体膜と静電的吸着を経て、膜融合が促進されることが示された。オリジナルデータは表 1に示したとおりである。各 pHにおける蛍光強度

pH 1(0)ん Ι(χ) - !(∞)/-

7.4 1625±133 2038± 265 2757±68

7.0 1936±175 2194± 107 2655±1 19

6.5 1996±91 2241±345 2636±45

6.0 2059±171 2301±161 2614±63

5.5 2098±84 2618±207 2601 ±81

5.0 2131±141 2789±295 2623±43

4.5 2232±201 2587±159 2533±134

4.0 1646±104 2121±224 2726±47 〔実施例 3〕

pH 応答性リボソームの細胞内動態 (TRITC 標識アルブミン内包リボソームの調製）

Tetramethylrhodamine-5-(_>and-6)-isothiocyanate (TRITC) 2 mg -a 0.1N- NaOH aq. に溶解し、 pH を 7.4 に調整した。その水溶液をアルブミン 1 mL (25 g/dL)と混合し 3時間撹拌後、ゲルカラム (Sephadex G-25)にて未結合ローダミンを除去し、ローダミン標識アルブミンを調製した。

次に、 pH 応答性混合脂質（化合物 3 /cholesterol/PEG-Glu2C₁₈=5/5/0.03, モル比） 25 1ををローダミン標識アルブミン水溶液 (10 mg/mL)で水和し、高圧押出法 (最終孔径 0.22 m)にてアルブミン内包リボソーム（以下、ローダミン標識アルブミン内包 pH応答性リボソームともいう）を調製した。

(共焦点顕微鏡によるアルブミン内包リボソームの細胞内動態解析）

細胞に取込まれた後のリボソーム内包物の放出挙動を解析するために、細胞内の動態観察を共焦点顕微鏡を用いて行った。まず、 COS-7(アフリカミドリザル腎細胞） 1 X 105 _Cell_sを 35 mmガラスボトムディッシュに播種し、 24時間培養した (37。C、 5%C0₂)。続いてダルベッコ改変イーグルス培地（DMEM) (10%ゥシ血清）で希釈した各リボソームを細胞に添加 ([lipid]=50 z _g/di_Sh)し、 2 時間培養した。その後、 PBS (-)で 2 回洗浄後、ライソトラッカー (450 nM)にてエンドソ一ムまたはリソゾームを染色し、共焦点顕微鏡 (LSM5Pascal， Carl Zeiss Co.,Ltd.)にて内包ローダミン標識アルブミン（赤）とエンドゾーム (緑)の局在を観察した。また、 CCD-32SK細胞についても、 MEM 培地に置換し、同様に細胞に取り込まれたリボソームの動態観察を行った。観察結果を図 5に示した。

図 5からわかるように、ローダミン標識アルブミン内包 pH応答性リポソームは、アルブミン単独で局在している箇所が見られ、アルブミンがエンドゾームから脱出していることが示唆された。このことから pH応答性リボソームは、リポソ一ム内のアルブミンを細胞質へ送達できることが示された。

〔実施例 4〕 siRNA内包リポゾームの調製

実施例 1 で得られた化合物 3 ( 20 mg ) を 0.1%DEPC ( diethyl pyrocarbonate) 水溶液に分散させた 10 nmol/mL siRNA(21 bp)水溶液 500 β Lで 6 時間水和させた後、高圧押出法 (最終孔径 0.22 ii m)にて siRNA内包リポゾームを調製した。また、 siRNA を添加していないことを除いて、上記と同様の方法で siRNAを内包しないリボソームを調製した。

(siRNA内包 pH応答性リボソームによるルシフェラ一ゼ合成阻害評価）ルシフェラーゼ夕ンパク合成遺伝子が恒常的に発現する CHO細胞を作製し、 siRNA 内包リポソーム添加後の、 RNAi による合成阻害に関する評価を行った。ルシフェラーゼ発現 CHO細胞 5 X 10⁴ cellsを 12wellsプレートに播種し、 24 時間培養した (37。C、 5%C0₂)。その後、 siRNA 内包リボソームを血清存在下で細胞に添加（[lipid]=100 または 200 /2 g/well)し、 24 時間培養した（37。C、 5%C0₂)。 PBS (-)で 2 回洗浄後、細胞を可溶化し、基質添加後の発光強度を測定しルシフェラーゼ発現量を算出した。その結果を図 6に示した。なお、コント口ールは、培地のみを添加した場合とした。図 6中、 siRNA 内包リボソームを siRNA (+)、 siRNAを内包しないリポソ一ムを siRNA (-)と表記した。

図 6からわかるように、添加量の増大とともにルシフエラーゼの発現量が有意に減少し、 [Lipid]=100 ^ g/well で約 50%、 [Lipid]=200 n g/well で約 75%のルシフェラーゼ合成阻害が達成された。このことは、すなわち、 pH 応答性リポソームが siRNAをェンドソームから細胞質へ脱出させ、 siRNAによりルシフェラーゼの合成阻害が起こり、細胞に発現していたルシフェラ一ゼ量のノックダウンに寄与したことを意味する。この結果より、本発明の分子集合体が RNAi を利用した遺伝子治療に有用な運搬体であることが示された。

(pH応答性リポソームの毒性評価）

pH応答性リボソームの毒性評価を WST Assayを用いて行った。ルシフェラーゼ発現 CHO細胞 1 X 104 _Cell_sを 96 wellsプレー卜に播種し、 24時間培養した (37で、 5%C0₂)。その後、リボソームを血清存在下で細胞に添加 ([lipid]=5, 10， 20 または 40 11 g/well)し、 24 時間培養した（37 °C、 5%C0₂)。続いて DMEM(10%FBS)で 2 回洗浄後、 WST1/ECS 試薬 (ImmimoKontact社）を添加した。 1時間培養 (37で、 5%C0₂)した後、 450 nmにおける吸光度をプレートリ —ダ一にて測定した。細胞生存率 (Cell survival)は下記の式を用いて算出し、その結果を図 7に示した。

τ -I

Cell survival % = ~ ―

■Moo ¹o

Ιο : 細胞なし 1₁₀₀ '. リボソーム添加無し Ι_χ ·. リボソーム添加有り図 7からわかるように、 ρΗ 応答性リボソームでは、脂質添加量 [Lipid] x g/mL 力 S 20 a g/well以下では、細胞の生存率がほぼ 100%であり、 40 g/well 添加系における細胞生存率はほぼ 70%であった。細胞試験は 96 wellプレートで実験したが、ルシフェラーゼ活性測定は 12 wellプレートで実験した。よって毒性評価の結果を 12 wellで換算すると 200 / g/well添加時では細胞毒性は全く示されていないと類推できる。よって、細胞質でのルシフェラーゼの発現の減少はリボソーム膜脂質由来の毒性からではなく、 pH 応答性リボソームにより送達した siRNAに由来した結果であるといえる。

〔実施例 5〕

牛血清アルブミン (BSA)内包 pH応答性リボソームの in vivo体内動態試験 BSA 内包 pH 応答性リボソームのラッ卜血漿及び組織中における化合物 3の濃度測定を行った。 BSA 内包 pH 応答性リボソームのラッ卜血漿及び組織中における化合物 3の濃度を LC/MS/MSにより測定した。

なお、 pH 応答性リボソームの体内動態解析として以下の分析装置を利用した。遠心機： MX-301 (トミ一精ェ）

HPLC： LC-20A システム（島津製作所）

システムコントローラー； SCLlOAvp

ポンプ； LC-20AD

デガッサー； DGU-20A3 オードインジェクター； SIL-20AC

カラムオーブン； CTO-20AC

MS： API2000 (Applied Biosystems/MDS SCIEX)

イン夕一フエ一ス； Turbolon Spray

(投与実験）

混合脂質（化合物 (3)/cholesterol/PEG-Glu2C₁₈=5/5/0.03 (mol)) から高圧押出法にて pH応答性リボソームを調製した。粒子径は 200-250 nmになるように調製した。また内水相に BSAを内包した。調製した pH応答性リボソームをエーテル麻酔下、 SD系ラット（ォス、体重 300 g以下）の尾静脈から、 pH応答性リボソーム（[Lipid] = 20 mg/mL) を 2 ml/kgで投与した。ラット使用例数を N=3 とする。投与前、投与後 5分、 1、 2、 6、 24時間に採血（500 u h程度）を行い、遠心（2,000 x g、 20分）して血漿を得（リボソーム浮遊血漿）、これを- 80°Cで保存した。また、投与後 24 時間の採血を終えた後、肝、脾、肺、腎を摘出して湿重量を測定し、 -80°Cで保存した。その後、臓器湿重量の 4 倍量の生理食塩水でホモジネー卜した.

(測定用サンブルの調製方法）

•検量線および LC-MS分析用サンプル

10 Lの血漿及び肝臓ホモジネ一ト溶液に対して 100 x Lの GGLG標準溶液を添加するところまで行ったものを検量線測定用サンプルとした。

•試料測定用サンプル

10 i Lの血漿及び臓器ホモジネ一ト溶液に対して lOO Lのメタノールを添加するところまで行ったものを試料測定用サンプルとした。

上記測定用サンプルに内部標準物質（ l，5-dihexadecyl - glutamyl-L- glutamate ( a Glu-Glu2Ci₆)) 添加溶液（900 i L) を加え、ポルテックス攪拌した後、室温にて 10 分間以上静置させた。その後、再度ポルテックス攪拌し、 4で、 10,000 x gで 15分間遠心分離して、その上清を LCバイアルに移した。高速液体クロマトグラフ（HPLC ) —タンデム質量分析計（MS/MS )

(LC/MS/MS)

HPLC条件

カラムに CAPLCELLPAK Cis MG (株式会社資生堂）（3 m、 2.0 X 50mm) を用い、カラム温度は 40°Cに設定した。 0.1%酢酸水溶液 (A)— 0.1 %酢酸メ夕ノ —ル (B)でグラジェント溶出させた。流速は 0.25 mL/分でグラジェントプロダラムは表 2に示したとおりである。なお、オートインジェクター温度は 15°Cとし、ニードル洗浄液は洗浄ポンプをクロ口ホルム/メタノール（1 : 1) 洗浄ポートをメタノールで行った。表 2

MS/MS条件

HPLCで分離した溶離液を positive ESIイオン化し、 MRMモードで測定した。パラメ一夕は表 3に示したとおりである。

表 3

内部標準物質として化合物 3に構造が近似した次式で示される a GluGlu2Ci6 を用いた。

aGluGlu2Cl6 血漿及び製剤中の化合物 3 (GGLG)の濃度

血漿測定用検量線検体を測定し、 1/x²の重み付け， Quadratic で 1-300 g/mL血漿の検量線を作成した。得られた検量線の式に血漿測定用検体のピークエリア/ IS ピークエリアを代入して血漿中の化合物 3の濃度を算出した。その結果を表 4に示した。図 8は、この結果をグラフで示したものである。なお、図 8 中、（―◊一）は animal 1、（--□--) は animal 2、（— -△-— ) は animal 3 の結果をそれぞれ示す。 PKパラメ一夕は表 5に示したとおりである。 P T/JP2008/059499

表 4 化合物 3 (GGLG)の血漿中濃度

血漿中 GGLG濃度 ( 11 g/mL)

animal 1 animal 2 animal 3 平均値標準偏差

Pre N.D. N.D. N.D. -

5min 105.30 153.13 136.28 131.57 24.25

lhr 44.72 62.44 53.49 53.55 8.86

2hr 25.81 39.28 28.50 31.20 7.13

6hr 8.39 10.20 8.12 8.90 1.13

24hr 1.02 1.20 1.17 1.13 0.0940

N.D. ；定量下限未満

表 5 ： PKパラメータ

animal 1 animal 2 animai 3 平均

Tmax (hr) 0.083 0.083 0.083 0.083

Cmax (ug/mL) 105.31 153.13 136.30 131.57

AUC(hr*ug/mL) 266.21 364.43 296.59 309.08

tl/2(hr) 5.032 4.31 5.18 4.84

LC/MS/MS 測定における血漿中の化合物 3の濃度から、化合物 3の半減期は 4.8時間であることがわかった。以上の結果により、化合物 3を含有する pH応答性リポソームが良好な血中滞留性を示すことがわかつた。

(組織中の化合物 3 (GGLG)の濃度）

組織測定用検量線検体を測定し， 1/x²の重み付け， Quadratic で 1-100 g/ml の検量線を作成した。得られた検量線の式に組織測定用検体のピークエリァ /IS ピークエリアを代入して組織中の化合物 3の濃度を算出した（組織ホモジネートの比重を 1 g/mLとして計算）。結果を表 6に示した。なお、図 9は、この結果をグラフにしたものである。表 6 化合物 3の組織中濃度（ x g / g)

animal上 animal 2 animal 3 平均標準偏差腎臓 N.D. N.D. N.D. - - 肺 5.60 5.02 6.17 5.60 0.58 肝臓 110.32 64.38 55.62 76.78 29.38 脾臓 30.35 33.45 36.7 33.53 3.22

N.D.；定量下限未満

LC/MS/MS測定における投与 24時間後の臓器中の化合物 3の分布は主に肝臓、脾臓に局在していた。これは通常のリボソーム製剤の臓器分布と同じであった。化合物 3が腎臓あるいは肺にはほとんど局在していないことから、 pH 応答性リポソ一ムが血中滞留性を有することを示している。従って、 pH 応答性リポソ一ムは臓器を標的とした薬物、プローブ、核酸及びタンパク質の運搬体として有用であることがわかる。

〔実施例 6〕

p H応答性両親媒性分子の合成

実施例 1の工程（A) で得られた化合物 1 (1.0 g, 1.67 mmol) と、トリェチルァミン (202 mg, 2.0 mmol)をジクロロメタン 30 mLに溶解し、 1時間室温で撹拌した。その後、ァァミノ基を t-ブトキシカルボニル (Boc)基、 εアミノ基をべンジルォキシカルポニル (Ζ)基で保護し、力ルポキシル基を -ヒドロキシスクシンイミドにより活性化させたリジン (617 mg， 1.4 mmol)を添加し、さらに 6時間室温で撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧除去し、クロ口ホルムに溶解して、炭酸ナトリウム飽和水溶液で 3 回洗浄した。クロ口ホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧除去した。残留物はメタノールから 4 °Cで再結晶し、グラスフィルタ一 (G6)ろ過して凍結乾燥後、化合物 4を得た。

化合物 4

化合物 4を TFA処理して Boc基を脱保護し、クロ口ホルムに溶解し、炭酸ナトリウム飽和水溶液で 3 回洗浄した。純水にて洗浄後、クロ口ホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧除去し、化合物 5を得た。

化合物 5 化合物 5 (500 mg、 0.58 mmol) とトリエチルァミン（71 mg、 0.70 mmol)をジクロロメタン 30 mL に溶解し、 1 時間室温で撹拌した。その後、 αアミノ基を Boc基、ァカルポキシル基を OtBu基で保護し、力ルポキシル基を N—ヒドロキシスクシンイミドにより活性化させたグルタミン酸 Boc-Glu(OtBu)-OSu (310 mg、 0.7 mmol)を添加し、さらに 6時間室温で撹拌して反応させた。反応終了後、溶媒を減圧除去し、. クロ口ホルムに溶解して、炭酸ナトリウム飽和水溶液で 3 回洗浄した。クロ口ホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧除去した。残留物はメタノールから 4 でで再結晶し、グラスフィル夕一 (G6)ろ過して、凍結乾燥後化合物 6を得た。

化合物 6

化合物 6を H2 /Pd-Black存在下で、 Z基を脱保護し、アミノ基を Boc基、 jS力ルポキシル基を OtBu 基で保護し、 α力ルポキシル基を Ν- ヒドロキシスクシンイミドにより活性化させたァスパラギン酸 Boc-Asp(OtBu)-OSu を反応させ TFAにて脱保護し、化合物 7 (Ia-2)を得た。

化合物 7

化合物 7(Ia-2)の同定：

薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、クロ口ホルム/メタノール (5/1) (容量/容量）： Rf： 0·05(モノスポット)）

iH-NMR(CDCl₃, 500 MHz, δ (ppm))： 0.88 (t, 6H， -CH₃)； 1.30 (br, 52H, alkyl)； 1.62 (m， 4H， COO-CH2-CH2-); 4.28 (q, IH, lys α -CH-) ； 4.47 (q， IH, glu a - CH-COO-); 化合物 Ί を得る方法と同様にして、 Boc-Glu(OtBu)の代わりに Boc- Asp(OtBu)-OSu を用い、 Boc-Asp(OtBu)-OSu の代わりに Boc-Glu(OtBu)を用いて化合物 8 (Ia-4)を合成した。

化合物 8

化合物 8(Ia-4)の同定：

薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、クロ口ホルム/メタノール (5/1) (容量/容量）： : 0·07(モノスポット)）

!H-NMRCCDC^, 500 MHz, δ (ppm)) ： 0.84(t, 6H， -CH₃) ； 1.23 (br, 52H, alkyl)； 3.68, 3.94 (t， 1H， glu -CH-Lys-)； 4.34(q, 1H， lys α -CH-)； 4.60 (q, 1H， glu a -CH-COO-) 実施例 1の工程（B) で得られた化合物 2 (500 mg, 691 mmol)とトリェチルァミン（107 1, 829 mmol) をジクロロメタン 30 mLに溶解し、 1時間室温で撹拌した。その後、アミノ基を Boc 基、；6力ルポキシル基を t-ブチルエステル基で保護し、 -力ルポキシル基を -ヒドロキシスクシンイミドにより活性化させたァスパラギン酸 Boc-Asp(OtBu)-OSu (639 mg、 1.45 mmol)を添加し、さらに 6時間室温で撹拌して反応させた。

反応終了後、溶媒を減圧除去し、クロ口ホルムに溶解して、炭酸ナトリウム飽和水溶液で 3 回洗浄した。クロ口ホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧除去した。残留物はメタノールから 4 °Cで再結晶し、グラスフィルター (G6)ろ過して、アミノ基を保護したリジン誘導体を得た。得られたリジン誘導体にトリフルォロ酢酸 (20 mL)を加え、 4 で 2時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧除去し、クロ口ホルムに溶解して、炭酸ナトリウム飽和水溶液で 2 回洗浄した。クロ口ホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過後、溶媒を減圧乾燥して、本発明の両親媒性分子である化合物 9 (Ia-3) を白色粉末として得た。

化合物 9

化合物 9 (Ia-3)の同定：

薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、クロ口ホルム/メタノール (5/1) (容量/容量）：： f : 0.15(モノスポット)）

!H-NMRCCDCls, 500 ΜΗζ、 δ (ppm)) ： 0.83(t, 6H， -CH₃) ； 1.24 (br, 52H, alkyl)； 3.64, 3.88 (t， IH, Asp a -CH-Lys-)； 4.33 (q, IH, lys a -CH-)； 4.61 (q, IH, Asp Qi -CH-COO-)

〔実施例 7〕

リボソームの調製

化合物 7， 8または 9 (0.177 mmol)、コレステロール (0.179 mmol)、 PEG- Glu2Ci8 (l-0 mol)をベンゼンに溶解させ、凍結乾燥して混合脂質を調製した。この混合脂質 20 mgを注射用水 1 mLに分散し、 6 時間攪拌後、高圧押出法 (最終孔径 0.22 m)にて粒子径約 240 nmのリボソームを調製した。

調製したリボソーム（[lipid]=10 mg/ml)を pH 7.4, 7, 6, 5， 4の酢酸緩衝液 (20 mM)に添加し、最終濃度を [lipid]=l rag/mL として 37でにおけるゼ一タ電位を測定した。

化合物 9 (Ia-3) を主成分として用いた場合、この脂質組成の混合脂質を水に分散させた際に凝集し、高圧押出時にろ過されてしまったと考えられる。おそらく親水部にァスパラギン酸を用いた脂質は、水和しにくいと考察できる。

これに対して、化合物 7を主成分として用いた場合、及び化合物 8を主成分として用いた場合はリボソームを形成した。図 1 0中、（像）は化合物 7を主成分とするリボソーム (化合物 7 /cholesterol/PEG-Glu2Cl8(5/5/0.03 (モル比))のゼ一夕電位変化を示し、（〇）は化合物 8を主成分とするリボソーム (化合物 8 /choles terol/PEG-Glu2Cl8(5/5/0.03 (モル比))のゼ一夕電位変化を示す。化合物 7 (Ia-2 )を主成分としたリボソームでは、ゼ一夕電位がマイナスからプラスへの転じる p Hがおよそ 5.5程度であつたのに対し、化合物 8 (Ia-4)を主成分とするリボソームではその pHは 4.8程度であつた。この結果より親水部にグルタミン酸とァスパラギン酸とを用いた両親媒性分子はリボソームを形成し、 pH変化によりゼ一夕電位が変化する P H応答性を示すことが明らかとなつた。

〔実施例 8〕

アルキル鎖長の異なる両イオン性脂質の合成

実施例 1の工程（A) と同様の方法にて、グルタミン酸とテトラデシルアルコールまたはステアリルアルコールを用いて、アルキル鎖長が 14 または 18 である化合物 1 0 (l，5-tetradecyl-L-glutamate)及び化合物 1 1 (1,5-octadecyl-L- glutamate)をそれぞれ合成した。

化合物 1 0

化合物 1 1

化合物 1 0及び化合物 1 1を用いて、アルキル鎖の異なるグルタミン酸を 2 個親水部に持つ化合物 1 2及び 1 3をそれぞれ合成した。

化合物 1 2

化合物 1 3

化合物 1 2の同定：

薄層クロマトグラフィ一（シリカゲル、クロ口ホルム/メタノール (5/1) (容量/容量）： R_f： 0.05(モノスポット)）

!H-NMRCCDCls, 500 MHz、 <5 (ppm)) ： 0.88(t, 6H, -CH₃) ； 1.27 (br, 44H, alkyl)； 1.55 (br, 4H, COO-CH2-CH2-), 4.34(q, 1H, lys -CH-)； 4.44 (q， 1H, glu Q! -CH-COO-) 化合物 1 3の同定：

薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、クロ口ホルム/メタノール (5/1) (容量/容量）： Rf： 0.04(モノスポット)）

!H-NMRiCDCls, 500 ΜΗζ、 δ (ppm)) ： 0.88(t, 6H, -CH₃) ； 1.27 (br, 60H, alkyl)； 1.65 (br, 4H, COO-CH₂-CH₂-), 4.12 (t, 1H， glu -CH-Lys-)； 4.35 (q, 1H, glu -CH-COO-); 3.60 (t, 4H， COO-CH2-CH2-)

〔実施例 9〕

リボソームの調製ならびにゼー夕電位及び融合度の測定

化合物 3、 1 2または 1 3を構成成分とするリボソームをそれぞれ調製し、得られたリボソームを用いてゼ一夕電位及び融合度を測定し、物性を比較した。

(リボソームの調製）

化合物 3、 1 2または 1 3 (0.177 mmol)、コレステロール (0.179 mmol)、 PEG-Glu2Cis (1.0 ^ mol)をベンゼンに溶解させ、凍結乾燥して混合脂質を調製した。この混合脂質 20 mgを注射用水 1 mLに分散し、 6 時間攪拌後、高圧押出法 (最終孔径 0.22 ^ m)にて粒子径約 240 nmのリボソームを調製した。

(ゼ一夕電位測定）

調製した各リポソーム（[lipid]=10 mg/ml)を pH 7.4, 7， 6, 5， 4の酢酸緩衝液 (20 mM)にそれぞれ添加し、最終濃度を [lipid]=l mg/mLとして 37 °Cにおけるゼー夕電位を測定した。その結果を図 1 1に示す。図中、（參）は化合物 3を主成分とするリポソーム (化合物 3 /cliolesterol/PEG-Glu2Cl8(5/5/0.03 (モル比))のゼー夕電位変化を示し、（〇）は化合物 1 2を主成分とするリボソーム（化合物 7 /cholesterol/PEG-Glu2C18 (5/5/0.03 (モル比)）のゼ夕電位変化を示す。

化合物 1 3を主成分として用いた場合、混合脂質を調製した後、水に分散させた際に分散性が悪く、凝集し、高圧押出時にろ過されてしまった。疎水部の大きな化合物 1 3は、この脂質組成では親一疎水パランスが悪く、小胞体構造をとりにくいためであると考えられる。これに対して、化合物 3を主成分として用いた場合、及び化合物 1 2を主成分として用いた場合はリボソームを形成した。化合物 3を主成分としたリボソームでは、ゼ一タ電位がマイナスからプラスへの転じる pHがおよそ 5.7程度であつたのに対し、化合物 1 2を主成分とするリポソ一ムではその pHは 7.0程度であった。これによりリボソーム膜成分である両親媒性分子の親水部構造が同じ場合でも、疎水部のアルキル鎖長によってゼ一夕電位挙動が変わることが判明した。

(融合度測定）

実施例 2と同様の方法で、ァニオン性リボソーム (DOPC/DPPG, 5/1 (モル比)) に対する p H応答性リボソームの融合度を算出した。測定方法は以下のとおりである。 1 mMのァニオン性リボソームと 9 mM (混合脂質換算)の各 pH応答性リポゾームをそれぞれ 50 /i Lを 1.9 mLの各 pHの酢酸緩衝液に添加し、 37°Cで静置した。 30 min経過後、 100 mLを分注し 1.9mLの HEPES緩衝液 (pH7.4) に加え、石英セルに移し蛍光測定（A _ex: 460 nm， λ _era: 530 rnn)した。測定は、 Shimadzu社製の型式 RF-5300PCを用いて行った。結果を図 1 2に示す。

化合物 3を主成分としたリボソームでは、従来の報告どおり p H7.4では 15% 程度の融合度であつたが、 pH5.5で融合度が極大値をとり、その値は 60%程度であった。他方、アルキル鎖長が 14である化合物 1 2を主成分としたリボソームでは pH7.4でも融合度が 45%程度と高く、また融合の極大は pH6.5で 65%を超えていた。

ゼ一夕電位測定結果を考慮すると、化合物 1 2は中性領域でもゼ一夕電位がプラスとなり、さらには相転移温度が低いことから、ァニオン性のリボソームに融合しやすいものと考察される。〔実施例 1 0〕

siRNA内包リボソームのルシフェラーゼ合成阻害評価

( siRNA内包リボソームの調製）

従来用いられている脂質組成である、ジパルミトイルホスファチジルコリン (DPPC)/cholesterol/DHSG/PEG-Glu2C18 (5/5/1/0.033, モル比）力、ら成る siRNA 内包または未内包リボソーム群（リボソーム 1 )、 aGluGlu2 C 16/cholesterol/PEG- Glu2 C 18(5/5/0.03, モル比）から成る siRNA 内包または未内包リボソーム群（リボソーム 2 )をそれぞれ調製し、これらを本発明の化合物 3を主成分とする化合物 3 /cholesterol/PEG(5/5/0.03，モル比)から成る siRNA 内包または未内包リボソーム群（リボソーム 3 )と比較した。尚、 aGluGlu2Cl6(l，5-hexadecyl- - glutamyl-L-glutamate)は、実施例 5でも述べたとおり下記式で示される親水部に両イオン性官能基を一つ有する化合物である。

aGluGlu2C16 ここで用いた l，5-hexadecyl - succinyl-L-glutamate(DHSG)は負電荷脂質であり、ジパルミトイルホスファチジルコリン (DPPC)はリン脂質である。

以下のようにして、ルシフェラーゼ夕ンパク合成遺伝子が恒常的に発現する CHO細胞に、各 siRNA内包リボソーム添加した後の RNAi による合成阻害に関する評価を行った。まず、ルシフェラーゼ発現 CHO 細胞 5 X 104 _Cell_s を 12wells プレートに播種し、 24 時間培養した (37°C、 5%C0₂)。その後、 siRNA 内包リボソームを血清存在下で細胞に添加（[lipid]=200 ^ g/well)し、 24 時間培養した (37で、 5%C0₂)_o PBS (-)で 2 回洗浄後、細胞を可溶化し、基質添加後の発光強度を測定し、ルシフェラーゼ発現量を算出した。その結果を図 1 3に示した。なお、コントロールは、培地のみを添加した場合とした。図中、 siRNA 内包リボソームを siRNA (十)、 siRNA を内包しないリポソ一ムを siRNA (-)と表記した。

ルシフェラ一ゼ発現 CHO細胞のみでは、ルシフェラーゼ発現量が 4.2 X 104 RLU/ g-protein 程度であった。これに対し siRNA 内包リボソーム 1 (DPPC/cholesterol/DHSG/PEG-Glu2C18)ではやや発現量が低下したが、 siRNA 未内包リボソーム 1添加時の発現量とほぼ同等であった。よってリボソーム 1では内包した siRNAによる阻害は起きていないと判断した。

一方、 siRNA内包リボソーム 2 (otGluGlu2C16/cholesterol/PEG-Glu2C18)あるいはリボソーム 3 (GGLG/cholesterol/PEG-Glu2Cl8)では、コントロ一ル群と比較してそれぞれ 15、 70%程度のルシフェラーゼ合成阻害が確認された。 siRNA未内包リボソーム群では、この阻害が起きていないことから、この結果は、内包した siRNA によりルシフェラーゼの合成阻害が起こったことを意味している。さらに、 siRNAデリバリーの効率はリボソーム 2よりもリボソーム 3 の方が優れていた。産業上の利用可能性

本発明の分子集合体は、薬物、プローブ、核酸及びタンパク質等をエンドソ一ム内から細胞質側へ効率よく放出させる運搬体として有用であり、各種疾患治療用の製剤として利用価値が十分にあると考えられる。

Claims

請

[式中、 R aは、一つがカチオン性官能基であり、 R aが複数ある場合、その他の R aは水素原子であり、 R a' は、一つがカチ囲オン性官能基であり、 Ra' が複数ある場合、その他の R a' は水素原子であり、尺13及び1 13' は、それぞれ独立して、ァニオン性官能基であり、 Rc及び Rdは、それぞれ独立して、炭素数 8〜22の鎖状炭化水素基であり、 A^Q、 A¹, A²、 A³及び A⁴は、それぞれ独立して、 — C〇〇一、 —〇CO―、一 CONH—または一NHCO—であり、 k、し m及び nは、それぞれ独立して、 1〜4の整数である。 ]

で表される両親媒性分子。

2. 水溶液中、生理的な pH環境下でカチオン性官能基及びァニオン性官能基がそれぞれイオン化してカチオンまたはァニオンになり、酸性 pH環境下でァニオン性官能基のイオン化傾向が減少し、塩基性 pH環境下でカチオン性官能基のイオン化傾向が減少する、請求項 1記載の両親媒性分子。

3. カチオン性官能基は、第 1級ァミノ基、第 2級ァミノ基、第 3級ァミノ基及び第 4級アンモニゥム塩からなる群より選ばれるものである、請求項 1または 2記載の両親媒性分子。

4. ァニオン性官能基は、力ルポキシル基である、請求項 1〜3のいずれか 1 項に記載の両親媒性分子。

5. A^Q、 A¹及び A²は、それぞれ独立して、一 CONH—または一 NHCO 一であり、 A³及び A⁴は、それぞれ独立して、一 CO〇一または一〇CO—である、請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載の両親媒性分子。

6. 鎖状炭化水素基がミリスチル、パルミチル、ステアリル及びォレイル基からなる群から選ばれるものである、請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載の両親媒性分子。

7. 式（ l a— 1) 〜（： l a— 8) ：

[式中、 Rc及び Rdは、それぞれ独立して、炭素数 8〜 22の鎖状炭化水素基である。 ]

のいずれかで表される両親媒性分子。

8. 水溶液中、生理的な pH環境下で一 NH₂が— NH₃ +になり、かつ、 — C O O Hが— C O O -になつて両ィォン性を示すが、酸性 p H環境下で一 C O O H のイオン化傾向が減少し、塩基性 p H環境下で一 N H ₂のイオン化傾向が減少する、請求項 7記載の両親媒性分子。

9 . 請求項 1〜 8のいずれか 1項に記載の両親媒性分子を含む分子集合体。

1 0 . 生理的 p H環境下でゼ一夕電位が中性あるいはマイナスの小胞体構造を形成して目的物質を保持し、酸性 p H環境下でゼ一夕電位がプラスとなりァニォン性生体膜との相互作用により小胞体構造が変化して目的物質を小胞休の外側に放出させる、請求項 9記載の分子集合体。

1 1 . 細胞内にエンドサイトーシスによって取り込まれたときに目的物質をェンドソームの外側に放出させるものである、請求項 1 0記載の分子集合体。

1 2 . 薬物、プローブ、核酸、タンパク質、ペプチド、金属イオン及び金属錯体からなる群から選択される少なくとも 1種を保持するものである、請求項 9〜 1 1のいずれか 1項に記載の分子集合体。

1 3 . プローブまたは核酸を保持するものである請求項 9〜 1 1のいずれか 1 項に記載の分子集合体を含む試薬。

1 4 . 細胞内の遺伝子発現を制御するものである、請求項 1 3記載の試薬。

1 5 . 請求項 1 3または 1 4記載の試薬を含むキット。

1 6 . タンパク質を保持する請求項 9〜 1 1のいずれか 1項に記載の分子集合体を含む酵素補充治療用夕ンパク質製剤。