JP2007210953A - pH応答性分子集合体 - Google Patents
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Abstract
本発明は低分子量だけでなく、薬剤または遺伝子などの高分子量の分子をも担持し、かつ、その放出挙動を制御することができるpH応答性分子集合体を提供することを課題とする。
【解決手段】
本発明は特定構造を有する両イオン性アミノ酸型脂質を含み、目的物質を担持している分子集合体であって、分散水性媒体のpHが生理的な値から酸性の値になる際に前記物質を放出するものである、pH応答性分子集合体を提供することにより上記課題を解決する。
【選択図】なし
Description
一方、本発明者らは先に、下記式
で表される両イオン性脂質を含み、目的物質を担持している分子集合体であって、分散水性媒体のpHが生理的な値から酸性の値になる際に前記物質を放出するものである、pH応答性分子集合体。
で表される両イオン性脂質を含む分子集合体であって、分散水性媒体のpHが生理的な値から酸性の値になる際に、別の分子集合体に担持されている目的物質の放出を促すものである、pH応答性分子集合体。
(4) 式(I)中、mが3であり、nが3であり、末端カルボキシル炭素から数えて4番目の炭素のRaがNH3 +であり、その他のRaがHである、(1)〜(3)のいずれか1項記載のpH応答性分子集合体。
(5) 式(I)中、mが2であり、nが3であり、末端カルボキシル炭素から数えて3番目の炭素のRaがNH3 +であり、その他のRがHである、(1)〜(3)のいずれか1項記載のpH応答性分子集合体。
(6) 式(I)中、mが3であり、nが2であり、末端カルボキシル炭素から数えて4番目の炭素のRaがNH3 +であり、その他のRaがHである、(1)〜(3)のいずれか1項記載のpH応答性分子集合体。
(7) 式(I)中、mが2であり、nが2であり、末端カルボキシル炭素から数えて3番目の炭素のRaがNH3 +であり、その他のRaがHである、(1)〜(3)のいずれか1項記載のpH応答性分子集合体。
(9) 式(I)で表される両イオン性脂質以外の両イオン性脂質、カチオン性脂質、およびアニオン性脂質からなる群から選ばれる少なくとも1種を、式(I)で表される両イオン性脂質に対して合計で10〜300モル%含むものである、(1)〜(8)のいずれか1項記載のpH応答性分子集合体。
(11)分子集合体が、二分子膜小胞体である、(1)〜(10)のいずれか1項記載のpH応答性分子集合体。
(12) 分子集合体に担持されている物質が、二分子膜小胞体の内水相に溶解または分散しているか、二分子膜内に局在するものか、あるいは二分子膜の外側表面に局在するものである、(11)記載のpH応答性分子集合体。
(14) 式(I)で表される両イオン性脂質を含む分子集合体が目的物質を担持している別の分子集合体と共に細胞内にエンドサイトーシスによって取り込まれた際に、エンドソーム内の酸性pHによって前記別の分子集合体が担持している物質のエンドソーム内への放出を促し、さらにエンドソーム内に放出された物質の細胞質への放出を促すものである、(1)〜(12)のいずれか1項記載のpH応答性分子集合体。
(15) pH応答性分子集合体または別の分子集合体が担持している物質が、薬物、プローブ、核酸、およびタンパク質からなる群から選択される少なくとも1種である、(1)〜(14)のいずれか1項記載のpH応答性分子集合体。
(17) プローブを担持した(1)〜(15)のいずれか1項記載のpH応答性分子集合体を含む試薬。
(18) 核酸を担持した(1)〜(15)のいずれか1項記載のpH応答性分子集合体を含む核酸導入剤。
(19) タンパク質を担持した(1)〜(15)のいずれか1項記載のpH応答性分子集合体を含む酵素補充治療用タンパク質製剤。
(21) (1)〜(15)のいずれか1項記載のpH応答性分子集合体と別の分子集合体とを含むpH応答性分子集合体組成物であって、前記別の分子集合体は目的物質を担持していてもよく、pH応答性分子集合体は別の分子集合体に担持されており、分散水性媒体のpHが生理的な値から酸性の値になる際に、pH応答性分子集合体または別の集合体に担持されている物質を放出するものである、pH応答性分子集合体組成物。
(22) pH応答性分子集合体または別の分子集合体が担持している物質が、薬物、プローブ、核酸、およびタンパク質からなる群から選択される少なくとも1種である、(20)または(21)記載のpH応答性分子集合体組成物。
(24) 別の分子集合体が細胞膜または膜構造を有する細胞小器官である、(23)記載のpH応答性放出促進剤。
また、本発明のpH応答性分子集合体は、安全性が高く、単独でpH応答性を示すことができる両イオン性脂質を用いるものであるので、生体適合性に優れており、目的に応じたpH応答性の調整も容易であることから、in vivoでの実用性にも優れている。この両イオン性脂質はアミノ酸と長鎖アルコールのみから簡便で大量に合成することができるので、pH応答性分子集合体の調製を低コストかつ簡便な方法で行うことができるといった利点もある。
本発明を利用することにより、高機能の薬物運搬体、核酸運搬体の創製に道筋を付けることができる。
[1]pH応答性分子集合体
本発明のpH応答性分子集合体は、分散水性媒体のpHが生理的な値から酸性の値になる際に分子集合体に担持されている物質を放出することができるものである。本発明のpH応答性分子集合体は、自己の分子集合体が担持している目的物質を放出する第1の態様と、別の分子集合体が担持している目的物質の放出を促す第2の態様に分けられる。以下、各態様について述べる。
まず、第1の態様について説明する。第1の態様のpH応答性分子集合体は、
式(I)
で表される両イオン性脂質を含み、目的物質を担持している分子集合体であって、分散水性媒体のpHが生理的な値から酸性の値になる際に前記分子集合体に担持されている物質を放出することができるものである。第1の態様におけるこのような目的物質の放出挙動は、分散水性媒体のpHに応答して上記式(I)で表される両イオン性脂質の極性頭部の電荷バランスが変化し、それが分子集合体の分子充填状態に影響して分子集合体の構造が破壊されることによって生じるものと考えられる。これによりpH応答性分子集合体が担持している物質を目的患部に効率良く送達することができる。
このように、第1の態様においては、pH応答性分子集合体の分散水性媒体のpHが生理的な値から酸性の値に変化する際にpH応答性分子集合体に担持されている目的物質を放出することができる。一般に異物は、通常細胞内にエンドサイトーシスという経路を通って導入される際、ライソゾームという分解酵素を含むライソソームと融合して消化されてしまう。これに対し、本発明においては、目的物質を分子集合体に担持させてライソゾームによる分解を回避しながら、目的物質を細胞内、ないしは核内に効率良く送達することができるのである。なお、図13は本発明の第1の態様の一例を示したものであり、pH応答性分子集合体の形状、目的物質の担持方法、目的物質の放出挙動などは、図13に何ら制限されない。
ステロイド類の含有量に制限はないが、式(I)で表される両イオン性脂質に対して合計で20〜200モル%であることが好ましく、より好ましくは40〜100モル%である。ステロイド類は、分子集合体の安定化剤として作用することができ、目的の放出速度および放出率などに応じて適宜調整することができる。これらのステロイド類は1種単独でも2種以上を組み合わせて使用することもできる。
式(I)で表される両イオン性脂質以外の両イオン性脂質としては、両親媒性のブロック共重合体または多糖類などの親水性の主鎖に疎水性の置換基を持つくし型高分子、あるいは両親媒性の膜タンパク質などが挙げられる。両イオン性脂質を含有させることにより、脂質二分子膜などの分子集合体構造を安定に保たせ、生理pH下でこの集合体の表面電荷を中性にすることができる。
また、カチオン性脂質としては、DOTAP、DMRIEなどが挙げられる。カチオン性脂質を含有させることにより、核酸(任意のDNAおよびRNA)などの目的物質の核内への送達能、つまり核酸導入能を付与することができる。例えば遺伝子などの目的物質を担持している場合には、遺伝子導入能を付与することができる。
アニオン性脂質としては、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、ジアシルホスファチジルイノシトール、ジアシルホスファチジルセリン、脂肪酸、カルボン酸型脂質、アニオン性アミノ酸型脂質などが挙げられる。アニオン性脂質を含有させることにより分子集合体の凝集が抑制され、目的物質の内包効率を増大させることができる。
これらの脂質は1種単独でも2種以上を組み合わせて使用することもできる。
その他、本発明のpH応答性分子集合体は、卵黄レシチン、大豆レシチン、水添卵黄レシチン、水添大豆レシチン、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、多種の糖脂質など分子集合体の構成成分として知られているリン脂質を1種または2種以上含有することができる。
目的物質としては、本発明のpH応答性分子集合体に担持することができるものであれば特に限定されないが、少なくとも標的となる臓器または組織の一つに作用するものであることが好ましい。例えば、薬物、プローブ、核酸(任意のDNA、RNA、siRNA などを含む)、およびタンパク質からなる群から選択される少なくとも1種であることが好ましい。本態様においてpH応答性分子集合体に担持されていたこれらの物質は、細胞内のエンドソーム内に放出され、さらには細胞質内に放出され、これにより、目的物質を効率良く細胞内に送達することができる。本発明のpH応答性分子集合体に担持させる目的物質の分子量は、通常100〜1,000,000であり、200〜500,000が好ましく、300〜100,000がより好ましい。
本発明のpH応答性分子集合体が二分子膜小胞体である場合、二分子膜小胞体を水性媒体中に分散させると、二分子膜小胞体は内水相を含むことができる。このとき、分子集合体に担持されている物質は二分子膜小胞体の内水相に溶解または分散しているものであることが好ましい。あるいは、二分子膜の疎水性領域内に目的物質を担持させるなど、担持されている物質が二分子膜内に局在したものであることが好ましい。
なお、pH応答性分子集合体の構成成分の含有量を規定する場合、内水相は考慮しないこととする。
次に、第2の態様のpH応答性分子集合体について述べる。
第2の態様のpH応答性分子集合体は、
式(I)
で表される両イオン性脂質を含む分子集合体であって、分散水性媒体のpHが生理的な値から酸性の値になる際に、別の分子集合体に担持されている目的物質の放出を促すことができるものである。
このように、第2の態様においては、pH応答性分子集合体が分散している分散水性媒体のpH変化に応答して分子集合体の形状が変化し、それによって別の分子集合体に作用し、別の分子集合体が担持している物質の放出を促すことができる。
なお、図14は本発明の第2の態様の一例を示したものであり、pH応答性分子集合体の形状、目的物質の担持方法、目的物質の放出挙動などは、図14に何ら制限されない。例えば、本態様に用いられるpH応答性分子集合体は、物質を担持していても、担持していなくてもよい。また、本態様において、pH応答性分子集合体は別の分子集合体に作用できる程度に別の分子集合体と共存していればよく、例えば、pH応答性分子集合体が別の分子集合体に担持されていてもよい。例えば、別の分子集合体が小胞体構造を有する場合に、pH応答性分子集合体は、別の分子集合体に内包されていてもよい。別の分子集合体に内包されたpH応答性分子集合体は、エンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれ、エンドソーム内の酸性pH環境下においてその形状が変化する。そしてその挙動が別の分子集合体に作用し、別の分子集合体に担持されていた目的物質の放出を促すことができる。さらにpH応答性分子集合体はエンドソームにも作用することができ、エンドソームの形状が変化することによって、目的物質を細胞質側に放出することを促すこともできる。
次に本発明のpH応答性分子集合体組成物について説明する。
本発明のpH応答性分子集合体組成物は、前述したpH応答性分子集合体を含むものであれば特に限定されない。
例えば、本発明のpH応答性分子集合体組成物は、本発明のpH応答性分子集合体と、目的物質を担持している別の分子集合体とを含むものであることが好ましい。ここで、本発明のpH応答性分子集合体は、薬物等の物質を担持していてもよく、担持していなくてもよい。また、別の分子集合体とは、式(I)で表される両イオン性脂質を含まない分子集合体であって、この分子集合体に薬物などの物質を担持したものであれば特に限定されない。
このようなpH応答性分子集合体組成物は、例えば生体内に投与された場合に、目的患部に到達するまでは別の分子集合体によって薬物などの目的物質が安定に保持されている。そして、目的患部に到達した際に組成物はエンドサイトーシスによって細胞内のエンドソーム内に取り込まれる。取り込まれた組成物はエンドソーム内の酸性pH環境下で組成物中のpH応答性分子集合体の形状が変化する。そして、それが別の分子集合体に作用し、別の分子集合体が担持している物質を放出させることができる。こうして本発明の組成物は、薬物等の目的物質を目的の患部に効率的に送達することができる。
本発明のpH応答性分子集合体組成物は、さらに水性媒体を含有させて分子集合体の分散液とすることもできる。分散液中のpH応答性分子集合体および別の分子集合体の濃度は、これらの分子集合体の構成脂質成分の合計含有量が、分散液の全重量に対し、0.01〜20重量%の範囲であることが好ましく、0.05〜15重量%がより好ましく、0.1〜10重量%がさらに好ましい。分散液中のpH応答性分子集合体と別の分子集合体の含有量比は、pH応答性分子集合体の含有量が、別の分子集合体の含有量に対し、5〜500重量%の範囲になるように調整されることが好ましく、20〜300重量%がより好ましく、50〜150重量%がさらに好ましい。なお、この分散液は凍結乾燥状態にして保存することもできる。
本発明のpH応答性分子集合体は、低毒性とされるアミノ酸型脂質を膜構成成分としているので生体適合性が高く、生体内の目的患部に目的物質を効率良く送達することができる。
プローブの含有量は種類または目的に応じて適宜決定することができるが、pH応答性分子集合体の構成成分の全重量に対して0.001〜1000重量%が好ましく、0.01〜100重量%がより好ましく、0.1〜10重量%がさらに好ましい。例えば、本発明のpH応答性分子集合体を含む試薬は、siRNAによる特定遺伝子のノックダウンを促すRNA干渉用試薬等に有用である。
例えば、本発明のpH応答性放出促進剤は、目的物質を担持している別の分子集合体と共に生体内に投与することによって、あるいは、目的物質を担持している細胞膜または膜構造を有する細胞小器官に投与することによって、分散水性媒体のpH変化によって別の集合体に作用し、その集合体が担持している物質の放出を促すことができる。
本発明のpH応答性放出促進剤の使用量は、目的物質を担持している別の分子集合体の合計量に対して、0.001〜1000重量%が好ましく、0.01〜200重量%がより好ましく、0.1〜50重量%がさらに好ましい。本発明のpH応答性放出促進剤は、例えば、経口、非経口、静脈、口内、直腸、膣、経皮、鼻腔経路経由または吸入経由さらには疾患部位に対して直接生体内に投与することができる。
さらにアミノ基をブトキシカルボニル(Boc)基にてカルボキシル基をブチルエステル(OBut)基で保護したグルタミン酸Boc-Glu(OtBu)-OH(200 mg、0.66 mmol)をジクロロメタンに溶解し、トリエチルアミン(80.7 mg、0.79 mmol)とジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)(162 mg、0.79 mg)を溶解し、4℃で1時間撹拌した後、(A')を470 mg(0.79 mmol)混合し12時間撹拌し、メタノールにて再結晶し(B')を得た。次に(B')をトリフルオロ酢酸30 mLに溶解させ脱保護(4℃、2時間撹拌)後、クロロホルム100 mLを加え炭酸ナトリウム飽和水溶液100 mLで2回、水100 mLで1回洗浄した。クロロホルム層を回収し、硫酸ナトリウム3 gで脱水後、溶媒を減圧除去した。残分を60℃でメタノール40 mLに溶解させ不溶成分があれば濾過し、4℃で再結晶、濾過後乾燥して白色粉末(1)(352 mg、収率72%)として得た。
(1) 実験方法
両イオン性脂質(1)10 mgを純水1 mLで2 時間水和し、高圧押出法にて粒径約250 nmの分子集合体を調製した。その小胞体分散液に0.1N-HClで滴下し分散液のpHを測定した。測定結果を図1に示す。
(2) 結果
両イオン性脂質(1)は、pH 9以上で親水部のアミノ基が脱プロトン化(-NH3 +→ -NH2)しカルボキシイオンだけが残りアニオン性脂質になった。一方、約pH 4.5以下で親水部のカルボキシル基がプロトン化(COO- → COOH)するためカチオン性の分子集合体になった。
(1) 実験方法
調製した両イオン性脂質分散液(脂質濃度1 mg/mL)のζ電位測定を行った。測定結果を図2に示す。
(2) 結果
両イオン性脂質(1)単独での分子集合体は、分散水性媒体のpHが生理的な値から酸性の値となる際に、その集合体のζ電位が変化した。pH応答性リポソームは、親水部の電荷の変化により小胞体表面の電位も同様に変化していることが確認できた。pH 7.4で電位がマイナスであるのは、親水部のγ位グルタミン酸がアミノ基よりも表面に突出しているためと思われる。
(1) 実験方法
両イオン性脂質分散液のpHによる分子集合体の粒径測定を行った。結果を図3に示す。さらには電子顕微鏡よりその分子集合形態の観察を行った。透過型電子顕微鏡は、脂質分散液を銅メッシュグリッドに滴下(脂質濃度1 mg/mL)し、2分静置後に余分な水滴をろ紙で吸い取り、さらにリンタングステン酸ナトリウム水溶液(pH 7.4)を滴下、2分静置後水滴をろ紙で吸い取り、デシケーター中で12時間乾燥させ観察した。走査型電子顕微鏡は、脂質分散液(脂質濃度1 mg/mL)をニトロセルロースフィルター上に滴下後、凍結乾燥し、スパッタコーティングし観察した。図4に分子集合体の電顕写真を示す。
(2) 結果
調製した両イオン性脂質(1)単独の分子集合体(粒径約250 nm)をpHの異なるリン酸緩衝液に添加すると、pHの低下に伴いその粒子径が増大した。
電子顕微鏡観察により両イオン性脂質(1)単独では、図4 (a)のように二分子膜小胞体構造をとっているがpHの低下に伴い図4 (b)のような凝集体が観察された。両イオン性脂質(1)単独の分子集合体は、pH変化に伴う集合形態変化が観察された。
[1] カルセイン内包リポソームの調製
両イオン性脂質(1) (126 mg、0.173 mmol)、Cholesterol (67 mg、0.173 mmol)、PEG-Glu2C18 (6 mg、1μmol)をt-ブチルアルコールに溶解させ、凍結乾燥し混合脂質を調製した。この混合脂質20 mgを100 mMカルセイン(Mw:622)溶液1 mLで2時間水和し、高圧押出法により粒子径259±96 nmのカルセイン内包リポソームを調製した。未内包カルセインはゲルカラム(sephadex G-75)にて除去した。
両イオン性脂質(1)単独では内水相に低分子化合物を内包することが困難であったが、コレステロール等と混合することで可能となった。但し、高分子量化合物では、両イオン性脂質(1)単独でも内水相に内包させることができる。
(1) 実験方法
上記[1]で調製したカルセイン内包リポソームをpHの異なる酢酸バッファーに添加しカルセインの放出を測定した。調製したリポソームをpH 3.5、4.5、5.5、6.5、7.4の酢酸緩衝液に添加し、10分後にそれぞれpH 7.4に戻し蛍光測定を行った。リポソームからカルセインの放出率は以下の式を用いて算出した。リポソームからの測定結果を図5に示す。
リポソーム膜成分として両イオン性脂質(1)の他にステロイド類が50 mol%含まれても両イオン性脂質のpH応答性は維持され、低pHにおいて内包物を放出することができた。生理的pH 7.4では内包カルセインのリポソームからの放出はないが、酸性pHではカルセイン放出がドラスチックに起こることが示された。
(1) 実験方法
両イオン性脂質(1) (126 mg、0.173 mmol)、cholesterol (67 mg、0.173 mmol)、PEG-Glu2C18 (6 mg、1μmol)の混合脂質を酢酸緩衝液(pH7.4)で2時間水和し、その後高圧押出法にて粒径249±87 nmの小胞体を調製した。調製した小胞体(脂質濃度1 mg/mL)の各pHにおけるζ電位を測定した。測定結果を図6に示す。
(2) 結果
両イオン性脂質単独の電位変化は膜成分にコレステロールを混合した小胞体の形態にしても維持されていた。このことによりこの小胞体は両イオン性脂質のpH応答性を保持したまま内水相に薬物等を内包し、低pHで内包物を放出することが可能な運搬体であることが明らかとなった。
両イオン性脂質(1)(178 mg、0.245 mmol)、DPPC(180 mg、0.245 mmol)、Cholesterol(127 mg、0.328 mmol)、PEG-Glu2C18(14 mg、2.4μmol)をt-ブチルアルコールに溶解させ、凍結乾燥し混合脂質を調製した。この混合脂質20 mgを100 mMカルセイン溶液1 mLで2時間水和し、高圧押出法により粒子径305±134 nmのカルセイン内包リポソームを調製した。未内包カルセインはゲルカラム(sephadex G-75)にて除去した。調製したカルセイン内包リポソームをpHの異なる酢酸バッファーに添加しカルセインの放出を測定した。結果を図7に示す。
DPPCなどのリン脂質を混合しても両イオン性脂質(1)のpH応答性は維持され、pHの低下に伴い分子集合体の粒径が大きくなると共に、リポソームに内包されたカルセインの放出量が増大した。
(1) 実験方法
DPPC (69 mg、0.094 mmol)、DOPC (74 mg、0.094 mmol)、Cholesterol (36 mg、0.094 mmol)、DPPG (20 mg、0.028 mmol)をt-ブチルアルコールに溶解させ、凍結乾燥し混合脂質を調製した。この混合脂質20 mgを100 mMカルセイン溶液1 mLで2時間水和し、高圧押出法により粒子径426±174 nmのカルセイン内包リポソームを調製した。未内包カルセインはゲルカラム(sephadex G-75)にて除去した。調製したカルセイン内包リポソーム分散液(脂質濃度1 mg/mL)に両イオン性脂質単独の分散液(脂質濃度1 mg/mL)を混合し、各pHにおけるカルセインの放出挙動を測定した。その結果を図8に示す。
両イオン性脂質(1)の分子集合体を混合した系でのみカルセインを内包したリポソームからの内包物の放出が見られた。これは、低pHでは両イオン性脂質(1)からなる分子集合体がカチオン性となるために、カルセイン内包アニオン性リポソームと静電的な相互作用を及ぼし、その際にカルセインがリポソームから放出されたものと考察される。よって両イオン性脂質(1)を含むpH応答性分子集合体は、別の分子集合体に担持されている物質の放出を促す作用を持つことが認められた。
さらにこのことは、エンドソーム内の低pH環境下でカチオン化したリポソームが、エンドソーム膜に何らかの影響を及ぼし、その際にリポソームの内包物がエンドソーム内から細胞質へ放出されたことを示している。
(1) 実験方法
FITC-rHSA(FITC:rHSA=20:1) 10 g/dL 2 mLにDPPC/Cholesterol/両イオン性脂質(1)/PEG-Glu2C18、両イオン性脂質(1)/Cholesterol/PEG-Glu2C18の2種類の混合脂質をそれぞれ20 mgを混合し6時間水和後、高圧押出法にてアルブミン(Mw : 64500)内包リポソームを調製した。このリポソームからのFITC-rHSAの放出を測定した。測定結果を図9に示す。
(2) 結果
DPPC/Cholesterol/両イオン性脂質(1)/PEG-Glu2C18も、両イオン性脂質(1)/Cholesterol/PEG-Glu2C18も内包させたアルブミンの放出が低pHで促進されることを確認した。但し、放出量は両イオン性脂質の含量が高い後者の方が大きかった。また、後者の方が、低pHでの粒子径の増大が顕著であった。イオン性脂質(1)を膜成分としたリポソームは、低pHで低分子化合物だけではなく高分子量内包物であるアルブミンも放出できることがわかった。
[1] カルセイン内包リポソーム
コントロールとしてDPPC/chol/PEG-Glu2C18、pH応答性リポソームDPPC/Cholesterol/両イオン性脂質(1)/PEG-Glu2C18、両イオン性脂質(1)/Cholesterol/PEG-Glu2C18の3種類の混合脂質それぞれ30 mgに2mL 100 mMカルセイン溶液を混合し水和し、高圧押出法によりカルセイン内包リポソームを調製した。
COS-7(サル腎臓由来細胞)を2×104 cellsガラスディッシュに播種し、24時間後にリポソームを脂質濃度2μg/mL 1mL添加した。2時間インキュベート後、PBSにて洗浄し共焦点顕微鏡にて観察した。観察結果を図10に示す。
両イオン性脂質(1)が主成分であるpH応答性リポソーム添加時にのみ細胞質内にカルセインの拡散が見られた。よって両イオン性脂質(1)を膜成分とすることで内包物を細胞質へ放出できる。
TetramethylrhodamIne-5(and -6)-Isothiocyanate(5(6))-TRITC 2 mgを0.1N-NaOH aqに溶解しpHを7.4に調製した。その水溶液を25 g/dL rHSA 1 mLと混合し6時間撹拌後、ゲルカラム(sephadex G-25)にて未結合ローダミンを除去し、ローダミン標識アルブミンを調製した。DPPC/Cholesterol/DHSG/PEG-DSPE、DPPC/Cholesterol/両イオン性脂質(1)/PEG-Glu2C18、両イオン性脂質(1)/Cholesterol/PEG-Glu2C18からなる3種類の混合脂質をそれぞれ30 mgに1 mLの3 g/dLのローダミン標識アルブミンを混合し6時間水和後、高圧押出法にてアルブミン内包リポソームを調製した。調製結果を表1に示す。
COS-7をガラスディッシュに播種し24時間インキュベート(37℃、5%CO2)した。その後血清入り培地で各リポソームを希釈し脂質濃度2μg/mL 1 mL添加し、2時間インキュベートし、PBSにて洗浄後FM-43にてエンドソームを染色し、共焦点顕微鏡にて観察した。CCD-32SKは添加したリポソームの脂質濃度を100μg/mLとした。観察結果を図11に示す。
両イオン性脂質(1)が主成分であるpH応答性リポソーム添加時にのみ細胞質全体にアルブミンの拡散が見られた。さらにFM1-43にて染色したエンドソームとローダミン標識したアルブミンの細胞内での位置が異なることから、アルブミンがエンドソームから脱出し、細胞質へ拡散していることがわかる。よって両イオン性脂質(1)を膜成分とするリポソームは内包物をエンドソーム外へ放出する運搬体として有用であることが示された。
(1) 実験方法
両イオン性脂質(1)の細胞毒性評価を行った。96 wellプレートにCOS-7を1×104 cells/well播種し24時間後に各脂質濃度のリポソームを添加した。リポソーム添加し24時間にMTT assayを行った。測定結果を図12に示す。
(2) 結果
両イオン性脂質(1)を膜成分としたリポソームは、5μgを添加しても細胞毒性は見られなかった。よって両イオン性脂質(1)は低毒性のpH応答性脂質であり、リポソーム膜成分として有用であることが示された。
Claims (25)
- pHの生理的な値が7.0〜8.0であり、酸性の値が6.5以下である、請求項1または2記載のpH応答性分子集合体。
- 式(I)中、mが3であり、nが3であり、末端カルボキシル炭素から数えて4番目の炭素のRaがNH3 +であり、その他のRaがHである、請求項1〜3のいずれか1項記載のpH応答性分子集合体。
- 式(I)中、mが2であり、nが3であり、末端カルボキシル炭素から数えて3番目の炭素のRaがNH3 +であり、その他のRがHである、請求項1〜3のいずれか1項記載のpH応答性分子集合体。
- 式(I)中、mが3であり、nが2であり、末端カルボキシル炭素から数えて4番目の炭素のRaがNH3 +であり、その他のRaがHである、請求項1〜3のいずれか1項記載のpH応答性分子集合体。
- 式(I)中、mが2であり、nが2であり、末端カルボキシル炭素から数えて3番目の炭素のRaがNH3 +であり、その他のRaがHである、請求項1〜3のいずれか1項記載のpH応答性分子集合体。
- ステロイド類を式(I)で表される両イオン性脂質に対して20〜200モル%含むものである、請求項1〜7のいずれか1項記載のpH応答性分子集合体。
- 式(I)で表される両イオン性脂質以外の両イオン性脂質、カチオン性脂質、およびアニオン性脂質からなる群から選ばれる少なくとも1種を、式(I)で表される両イオン性脂質に対して合計で10〜300モル%含むものである、請求項1〜8のいずれか1項記載のpH応答性分子集合体。
- 別の分子集合体が、細胞膜または膜構造を有する細胞小器官である、請求項2〜9のいずれか1項記載のpH応答性分子集合体。
- 分子集合体が、二分子膜小胞体である、請求項1〜10のいずれか1項記載のpH応答性分子集合体。
- 分子集合体に担持されている物質が、二分子膜小胞体の内水相に溶解または分散しているか、二分子膜内に局在するものか、あるいは二分子膜の外側表面に局在するものである、請求項11記載のpH応答性分子集合体。
- 式(I)で表される両イオン性脂質を含む分子集合体が細胞内にエンドサイトーシスによって取り込まれた際に、エンドソーム内の酸性pHによって前記集合体が担持している物質をエンドソーム内に放出し、さらにエンドソーム内に放出された物質の細胞質への放出を促すものである、請求項1〜12のいずれか1項記載のpH応答性分子集合体。
- 式(I)で表される両イオン性脂質を含む分子集合体が目的物質を担持している別の分子集合体と共に細胞内にエンドサイトーシスによって取り込まれた際に、エンドソーム内の酸性pHによって前記別の分子集合体が担持している物質のエンドソーム内への放出を促し、さらにエンドソーム内に放出された物質の細胞質への放出を促すものである、請求項1〜12のいずれか1項記載のpH応答性分子集合体。
- pH応答性分子集合体または別の分子集合体が担持している物質が、薬物、プローブ、核酸、およびタンパク質からなる群から選択される少なくとも1種である、請求項1〜14のいずれか1項記載のpH応答性分子集合体。
- 薬物を担持した請求項1〜15のいずれか1項記載のpH応答性分子集合体を含む薬剤。
- プローブを担持した請求項1〜15のいずれか1項記載のpH応答性分子集合体を含む試薬。
- 核酸を担持した請求項1〜15のいずれか1項記載のpH応答性分子集合体を含む核酸導入剤。
- タンパク質を担持した請求項1〜15のいずれか1項記載のpH応答性分子集合体を含む酵素補充治療用タンパク質製剤。
- 請求項1〜15のいずれか1項記載のpH応答性分子集合体と、目的物質を担持している別の分子集合体とを含むことを特徴とするpH応答性分子集合体組成物。
- 請求項1〜15のいずれか1項記載のpH応答性分子集合体と別の分子集合体とを含むpH応答性分子集合体組成物であって、前記別の分子集合体は目的物質を担持していてもよく、pH応答性分子集合体は別の分子集合体に担持されており、分散水性媒体のpHが生理的な値から酸性の値になる際に、pH応答性分子集合体または別の集合体に担持されている物質を放出するものである、pH応答性分子集合体組成物。
- pH応答性分子集合体または別の分子集合体が担持している物質が、薬物、プローブ、核酸、およびタンパク質からなる群から選択される少なくとも1種である、請求項20または21記載のpH応答性分子集合体組成物。
- 請求項1〜15のいずれか1項記載のpH応答性分子集合体を含み、分散水性媒体のpHが生理的な値から酸性の値になる際に、別の分子集合体に担持されている物質の放出を促すものであるpH応答性放出促進剤。
- 別の分子集合体が細胞膜または膜構造を有する細胞小器官である、請求項23記載のpH応答性放出促進剤。
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