WO2006080452A1 - 水溶性物質で表面修飾された微粒子の製造方法 - Google Patents

水溶性物質で表面修飾された微粒子の製造方法 Download PDF

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WO2006080452A1
WO2006080452A1 PCT/JP2006/301343 JP2006301343W WO2006080452A1 WO 2006080452 A1 WO2006080452 A1 WO 2006080452A1 JP 2006301343 W JP2006301343 W JP 2006301343W WO 2006080452 A1 WO2006080452 A1 WO 2006080452A1
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fine particles
water
lipid
lipids
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PCT/JP2006/301343
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Inventor
Nobuhiro Yagi
Hiroko Sugishita
Masashi Nakakura
Hiroko Kusano
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Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
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    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
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    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing fine particles in which fine particles containing lipids, fatty acids, or derivatives thereof are surface-modified with water-soluble substances.
  • ribosomes are prepared by coexisting polyethylene glycol derivatives with phospholipids
  • the content of polyethylene glycol derivatives is high and micelles are formed without taking the form of lipid membranes ["bio Physical, Journal, Biophysical Journal, 1997, 73, p.258-266, “Biophysical Journal”, 2002, 83, p.2419-2 439].
  • the surface modification with a water-soluble substance may be performed only on the outer side of the fine particles in view of the above-mentioned objective power.
  • the surface modifier is disposed on the inner side of the fine particles. Will also exist.
  • Patent Document 1 describes a method in which polyethylene glycol-linked phospholipid is added to ribosome in water at room temperature and the surface of the ribosome is modified with polyethylene glycol.
  • Patent Document 1 JP-A-2-149512
  • Patent Document 2 Japanese Patent Publication No. 5-501264
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 3-181415
  • An object of the present invention is to provide a method for producing fine particles containing lipids or fatty acids whose surface is modified with a water-soluble substance or derivatives thereof by a simpler method. Means for solving the problem
  • the present invention relates to the following (1) to (17).
  • Step A Surface modification consisting of lipid derivatives, fatty acid derivatives or aliphatic hydrocarbon derivatives of water-soluble substances, in the presence of dispersed particles containing lipids or fatty acids or their derivatives in a liquid containing a polar organic solvent
  • Step A A method for producing the fine particles whose surface is modified with the water-soluble substance, comprising a step (Step A) in which an agent is present in a dissolved or dispersed state.
  • a polar organic solvent in which the surface modifier is soluble is used as the polar organic solvent.
  • the liquid containing the polar organic solvent is a liquid containing the polar organic solvent having a concentration of the polar organic solvent of 80 vol% or less, and any one of the above (1) to (3) Production method.
  • step A an amphiphilic substance is further present in a dissolved or dispersed state in the liquid containing the polar organic solvent.
  • Amphiphiles are selected from phospholipids, glyceglycoglycolipids, glycosphingolipids, cholesterol, strength thionic lipids, anionic lipids, surfactants, and water-soluble polymer lipids or fatty acid derivatives.
  • the fine particles containing lipids or fatty acids or derivatives thereof are fine particles comprising one or more selected from lipid aggregates, liposomes and emulsion particles as described in (1) to (8) above. Any manufacturing method.
  • the surface modifier is one or more selected from polyethylene glycol phospholipid, polyglycerin phospholipid, polyethylene glycol alkyl ether, polyethylene glycol sorbitan fatty acid ester, polyethylene glycol fatty acid ester, and polyglycerin fatty acid ester power.
  • the manufacturing method in any one of (1)-(9).
  • microparticles containing lipids or fatty acids or their derivatives are ribosomes
  • the polar organic solvent is ethanol
  • the amphiphile is phospholipids
  • the surface modifier is polyethylene glycol lipids.
  • Fine particles containing lipids or fatty acids or their derivatives are ribosomes, (6) or (7), wherein the organic solvent is ethanol, the amphiphile is phospholipid, and the surface modifier is polyethylene glycol fatty acid ester.
  • At least a lipid or a fatty acid or a derivative thereof for preparing fine particles containing a lipid or a fatty acid or a derivative thereof surface-modified by the production method of any one of (1) to (12) above A kit comprising a liquid containing fine particles, a lipid derivative of a water-soluble substance, a surface modifier made of a fatty acid derivative or an aliphatic hydrocarbon derivative, and a polar organic solvent.
  • a fine particle comprising a lipid or fatty acid or a derivative thereof surface-modified with a water-soluble substance that can be produced using the production method of any one of (1) to (12).
  • fine particles containing a lipid or fatty acid or a derivative thereof surface-modified with a water-soluble substance that can be produced using the production method of any one of (1) to (12), the fine particles containing a drug A drug-containing carrier to the tumor or inflammatory site that is also powerful.
  • the present invention there is provided a simple method for producing fine particles containing lipids or fatty acids surface-modified with water-soluble substances or derivatives thereof.
  • the production of fine particles containing lipids or fatty acids or derivatives thereof surface-modified with a water-soluble substance capable of modifying a wide variety of modified particles without the step of heating substantially. Methods etc. are provided.
  • FIG. 1 shows the blood dynamics after administration to rats for each of the preparations obtained in Examples 1 to 5 and Comparative Examples 1 to 3.
  • Example 1 for X ⁇ for Comparative Example 2
  • ⁇ for Comparative Example 2 ⁇ for Comparative Example 3.
  • FIG. 2 shows changes in blood kinetics after administration to rats for each of the preparations obtained in Examples 6 to 9 and Comparative Examples 2 and 3.
  • the country represents Example 6, the mouth represents Example 7, ⁇ represents Example 8, ⁇ represents Example 9, ⁇ represents Comparative Example 2, and ⁇ represents the administration group of the preparation obtained in Comparative Example 3.
  • FIG. 3 shows the blood kinetics after administration to rats for each of the preparations obtained in Examples 10 and 11.
  • the country represents the administration group of the preparation obtained in Example 10 and the mouth represents the preparation obtained in Example 11, respectively.
  • FIG. 4 shows changes in blood kinetics after administration to rats for each of the preparations obtained in Examples 12 to 15.
  • the country represents Example 12, the mouth represents Example 13, ⁇ represents Example 14, and ⁇ represents the administration group of the preparation obtained in Example 15!
  • the fine particles containing lipids or fatty acids or derivatives thereof surface-modified with a water-soluble substance, the fine particles containing lipids or fatty acids or derivatives thereof as modified particles are used as surface modifiers.
  • the surface modification means that a part of the surface modifier (mainly lipid, fatty acid or aliphatic hydrocarbon part) enters inside the surface of the particle to be modified, and the rest (mainly part of the water-soluble substance). ) Is included in the modified particle so that it protrudes outward from the surface.
  • the lipid in the present invention may be any of simple lipids, complex lipids or derived lipids, such as phospholipids, glyceglycoglycolipids, sphingoglycolipids, sphingoids, sterols, and cationic lipids.
  • phospholipids, cationic lipids and the like are listed.
  • lipid derivatives examples include surfactants (synonymous with surfactants described later), polymers (synonymous with polymers described later, specifically dextran, etc.), polyoxyethylenes or derivatives thereof (specifically, Polyethylene glycol, etc.), oligoglycerin or a lipid derivative such as a derivative thereof, preferably polyethylene glycolated phospholipid.
  • Examples of phospholipids include phosphatidylcholine (specifically, soybean phosphatidylcholine). , Egg yolk phosphatidylcholine (EPC), distearoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, dimyristoylphosphatidylcholine, dioleoylphosphatidylcholine, etc., phosphatidylethanolamine (specifically distearoylphosphatidylethanolamine (DSPE)) ), Dipalmitoylphosphatidylethanolamine, dioleoylphosphatidylethanolamine, etc., glyce mouth phospholipids (specifically phosphatidylserine, phosphatidic acid, phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol, lysophosphatidylcholine, etc.), sphingophospholipids (specifically Sphingomyelin, ceramide
  • Examples of the glyceglycoglycolipid include sulfoxyribosyl glyceride, diglycosyl diglyceride, digalatatosyl diglyceride, galactosyl diglyceride, glycosyl diglyceride and the like.
  • glycosphingolipid examples include galactosyl celeb mouth side, latatosyl cerebroside, gandarioside and the like.
  • sphingoids include sphingan, icosasfingan, sphingosin, and derivatives thereof.
  • derivatives include -NH, NHCO (CH) CH (wherein x is an integer of 0, such as sphingan, icosasfingan, sphingosine, etc.
  • sterols include cholesterol, dihydrocholesterol, lanosterol, ⁇ -sitosterone, campesterono, stigmastello, brass castello, ergocasterol, fucostosterol, 3 j8-[ ⁇ - ( ⁇ ', Tanned dimethylaminoethyl) carbamoyl] cholesterol (DC-Choi) and the like.
  • Examples of the cationic lipid include N- [l- (2,3-dioleoylpropyl)]- ⁇ , ⁇ , ⁇ -trimethylammonium chloride (DOTAP), N- [1 -(2,3-dioleoylpropyl)]- ⁇ , ⁇ -dimethylamine (DODAP), N- [1- (2,3-dioleopropyl)]- ⁇ , ⁇ , ⁇ -trimethyl Ammonium chloride (DOTMA), 2,3-dioleoyloxy-N- [2- (sperminecarboxamido) ethyl ]- ⁇ , ⁇ -Dimethyl-1-propanamium trifluoroacetic acid (DOSPA), N- [1- (2,3-ditetradecyloxypropyl)] - ⁇ , ⁇ -dimethyl-N-hydroxyethyl bromide -Um (DMRIE), N- [l- (2,3-dioleoxypropyl)
  • fatty acids or derivatives thereof in the present invention include fatty acids such as stearic acid, palmitic acid, and lauric acid, and surfactants in which fatty acids and other substances are chemically bonded.
  • Examples of the surfactant include polyoxyethylene sorbitan monooleate (specifically polysorbate 80, etc.), sorbitan fatty acid (specifically sorbitan monolaurate, sorbitan monooleate, etc.), polyoxy Examples thereof include ethylene derivatives (specifically polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60 and the like), glycerin fatty acid esters and the like.
  • the fine particles containing lipids or fatty acids or derivatives thereof in the present invention are, for example, fine particles containing lipid aggregates, ribosomes, emulsion particles, etc., or drugs, polymers, metal colloids, fine particles.
  • Fine particles comprising a preparation or the like, which are fine particles containing the aforementioned lipid or fatty acid or derivatives thereof, preferably fine particles containing lipid aggregates, ribosomes, emulsions, etc. More preferred are fine particles containing ribosome as a constituent component.
  • the fine particles containing these derivatives may be selected from, for example, drugs, lipid aggregates, ribosomes, emulsion particles, polymers, metal colloids, and fine particle formulations as long as they contain the aforementioned lipids or fatty acids or their derivatives.
  • microparticles are composed of one or more combined complexes, one or more selected from drugs, lipid aggregates, ribosomes, emulsion particles, polymers, metal colloids, and microparticle formulations and other compounds (for example, Including fine particles having a complex of a combination of sugar, lipid, inorganic compound, etc.), preferably a drug and a lipid aggregate
  • a fine particle having a complex with one or more selected from ribosome and emulsion particles and more preferably a fine particle having a complex of a drug and ribosome as a component.
  • the fine particles containing these derivatives may be fine particles coated with lipids or fatty acids or their derivatives, such as drugs, lipid aggregates, ribosomes, emulsion particles, polymers, metal colloids, fine particle formulations, etc.
  • Particulate fine particles coated with lipids, fatty acids, or derivatives thereof are listed. Fine particles composed of lipid aggregates, ribosomes, or emulsion particles. Particles coated with lipids, fatty acids, or derivatives thereof. It is more preferable that The fine particles coated with lipids or fatty acids or derivatives thereof include fine particles coated with lipids or fatty acids or derivatives thereof, as any of the fine particles containing the above complex as a constituent component.
  • the lipids or fatty acids or derivatives thereof used for coating are preferably lipids forming a lipid film or fatty acids or derivatives thereof.
  • the above-mentioned lipids, surfactants and the like can be mentioned, more preferably neutral lipids among the above-mentioned lipids and surfactants, more preferably phospholipids, and most preferably EPC. It is done.
  • the lipid or fatty acid used for coating or a derivative thereof can disperse components of the lipid membrane in a liquid containing the polar organic solvent, which is preferably soluble in the polar organic solvent, It is preferable that a liquid containing the polar organic solvent is present at a concentration at which the composite particles can be dispersed.
  • the neutral lipid refers to the lipid and surfactant excluding the above-mentioned cationic lipid, the cationic surfactant described later, the eron lipid, and the eron surfactant. More preferred neutral lipids include phospholipids, glyceglycoglycolipids, and sphingoglycolipids.
  • the drug in the present invention is combined with other components constituting the fine particles containing the drug, lipid or fatty acid or derivatives thereof in the form of fine particles in the solvent of the liquid containing the polar organic solvent in Step A.
  • a drug that forms a body and takes the form of fine particles in the solvent such as proteins, peptides, nucleic acids, low molecular compounds, saccharides, high molecular compounds, lipid compounds, metal compounds, etc.
  • a substance having activity, and preferably Examples include nucleic acids, and more preferably one or more substances selected from genes, DNA, RNA, oligonucleotides (ODN), plasmids, and siRNA.
  • Examples of the protein or peptide include bradycun, angiotensin, oxytocin, vasopressin, adrenocorticotropin, calcitonin, insulin, glucagon, cholestocun, ⁇ -endorphin, melanocyte inhibitory factor, melanocyte stimulating hormone, gastrin antagonist, neuron Tensin, somatostatin, bunoresin, cyclosporine, enkephalin, transferrin, arginine-glycine-aspartate (RGD) peptide, thyroid hormone, growth hormone, gonadotropin, luteinizing hormone, asparaginase, anoleginase, uricase, canolexoxypeptidase, Superoxide dismutase, yarn and weave plasminogen vector, streptkinase , Interleukin, interferon, muramyl dipeptide, thymopoietin, granulocyte colony stimulating factor, gran
  • nucleic acids examples include ODNs such as antisense oligonucleotides and sense oligonucleotides, genes, DNA, RNA, plasmids, siRNA, and the like, and the nucleic acids include phosphate portions, ester portions, etc. in the structure of nucleic acids. Including derivatives in which the oxygen atom and the like contained in is substituted with another atom such as a sulfur atom.
  • the siRNA is a short double-stranded RNA.
  • low molecular weight compounds include epsilon-aminocaproic acid, arginine hydrochloride, potassium L-aspartate, tranexamic acid, bleomycin sulfate, vincristine sulfate, sodium cefazolin, cephalothin sodium, citicoline, cytarabine, gentamicin sulfate, Examples thereof include vancomycin hydrochloride, kanamycin sulfate, amikacin sulfate and the like.
  • saccharide examples include sodium chondroitin sulfate, heno ⁇ sodium phosphate, dextran fluorescein and the like.
  • polymer compound examples include sodium polyethylene sulfonate, dibule ether-maleic anhydride copolymer (DIVEMA), and styrene maleic anhydride copolymer-neocarbon. Examples thereof include chinostatin conjugate (SMANCS).
  • DIVEMA dibule ether-maleic anhydride copolymer
  • SMANCS chinostatin conjugate
  • Examples of lipidic compounds include vitamin D and vitamin E.
  • Examples of the metal compound include cisbratin.
  • the lipid aggregate or ribosome in the present invention is composed of the above-mentioned lipid or fatty acid or derivatives thereof, and these lipid or fatty acid or derivatives thereof are used alone or in combination, preferably in combination. Used.
  • hydrogenated soybean soy phosphatidylcholine, polyethyleneglycolized phospholipid and cholesterol power are also selected, a combination of two or more components, distearoyl phosphatidylcholine, polyethyleneglycolized phospholipid and cholesterol power selected
  • a combination of two or more components selected from the combination of EPC and DOTAP, a combination of two or more components selected from EPC, DOTAP and polyethylene glycolated phospholipids, a combination of two or more components selected from EPC, DOTAP, cholesterol and polyethylene glycolated phospholipids Combinations are listed.
  • the ribosome may optionally contain a membrane stabilizing agent such as sterol such as cholesterol, an antioxidant such as tocopherol, and the like.
  • a membrane stabilizing agent such as sterol such as cholesterol, an antioxidant such as tocopherol, and the like.
  • lipid aggregates in the present invention include spherical micelles, spherical reverse micelles, sausage-like micelles, sausage-like reverse micelles, plate-like micelles, plate-like reverse micelles, hexagonal I, hexagonal II and lipids.
  • examples include aggregates having a force of 2 or more molecules.
  • the emulsion particles in the present invention include, for example, fat emulsion, nonionic surfactant and emulsion oil-in-water (0 / W) emulsion or oil-in-water such as emulsion emulsion, lipid emulsion, and lipid nanosphere, which also have soybean oil power.
  • Water type (W / 0 / W) emulsion particles include, for example, fat emulsion, nonionic surfactant and emulsion oil-in-water (0 / W) emulsion or oil-in-water such as emulsion emulsion, lipid emulsion, and lipid nanosphere, which also have soybean oil power.
  • Water type (W / 0 / W) emulsion particles Water type (W / 0 / W) emulsion particles.
  • Examples of the polymer in the present invention include natural polymers such as albumin, dextran, chitosan, dextran sulfate, and DNA, such as poly-L-lysine, polyethyleneimine, polyaspartic acid, and styrene maleic acid copolymer. And synthetic polymers such as isopropylacrylamide-acryl pyrrolidone copolymer, polyethylene glycol-modified dendrimer, polylactic acid, polylactic acid polyglycolic acid, polyethylene glycol-polylactic acid, or salts thereof.
  • the salt in the polymer includes, for example, metal salts, ammonium salts, acid addition salts, organic amine addition salts, amino acid addition salts and the like.
  • Examples of the metal salt include alkali metal salts such as lithium salt, sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as magnesium salt and calcium salt, aluminum salt and zinc salt. Examples include salts such as ammonia and tetramethylammonium.
  • Examples of acid addition salts include inorganic acid salts such as hydrochloride, sulfate, nitrate, and phosphate, and acetates, Examples include organic acid salts such as maleate, fumarate and citrate.
  • Examples of organic amine addition salts include addition salts such as morpholine and piperidine.
  • Examples of amino acid addition salts include glycine. And addition salts such as phospharanin, aspartic acid, glutamic acid and lysine
  • Examples of the metal colloid in the present invention include metal colloids containing gold, silver, platinum, copper, rhodium, silica, strength, aluminum, iron, indium, cadmium, barium, lead and the like.
  • Examples of the fine particle preparation in the present invention include microspheres, microcapsenoles, nanocrystals, lipid nanoparticles, polymer micelles, and the like.
  • the fine particles containing lipids or fatty acids or derivatives thereof in the present invention are a complex of a drug and one or more selected from lipid aggregates, ribosomes, emulsion particles, polymers, metal colloids, and fine particle agents.
  • the lipid aggregate, ribosome, emulsion particles, polymer, metal colloid or fine particle preparation is more preferably one having electrostatic charge opposite to that of the drug.
  • the electrostatic charge opposite to the drug includes a charge in the drug molecule, a charge that generates an electrostatic attraction with respect to the intramolecular polarization, a surface polarization, and the like.
  • Lipid aggregates, ribosomes, emulsion particles, polymers, metals Colloidal or particulate formulations preferably have lipid aggregates, ribosomes, emulsion particles, polymers, metals in order to have a charge opposite to that of the drug.
  • the colloidal or fine particle preparation contains a charged substance having an electrostatic charge opposite to that of the drug. More preferably, the lipid aggregate, the liposome, the emulsion particle, the polymer, the metal colloid or the fine particle preparation has a static charge with the drug. It contains a lipid having the opposite electrical charge (the aforementioned cationic lipid or the later-described cation lipid).
  • Charged substances contained in lipid aggregates, ribosomes, emulsion particles, polymers, metal colloids, or microparticle preparations that have electrostatic charges opposite to those of the drug are cationic powers.
  • a ionic substance exhibiting on-state, even if it is an amphoteric substance having both a cationic group and a ionic group, pH, binding to other substances, etc. Since the relative negative degree changes depending on the situation, it can be classified as a cationic substance or a cation substance depending on the situation.
  • These charged substances may be used in addition to the constituents of the fine particles, which may be contained as constituents of the fine particles.
  • Examples of the cationic substance include a cationic substance (specifically, a cationic lipid (as defined above), a cationic sterol, a cationic polymer, etc. among those exemplified in the definition of the fine particles. ), Cationic surfactants, and proteins or peptides capable of forming a complex at a pH below the isoelectric point.
  • a cationic substance specifically, a cationic lipid (as defined above), a cationic sterol, a cationic polymer, etc. among those exemplified in the definition of the fine particles.
  • Cationic surfactants and proteins or peptides capable of forming a complex at a pH below the isoelectric point.
  • Examples of the cationic sterol include DC-Choi.
  • Examples of the cationic polymer include poly-L-lysine, polyethyleneimine, polyphenol (Kpolyfect), and chitosan.
  • Examples of the cationic surfactant include alkylamine salts, acylamine salts, quaternary ammonium salts, and amine derivatives. Specific examples include salts of benzalkonium, acylaminoethyljetylamine, N-alkylpolyalkylpolyamine salts, fatty acid polyethylene polyamide, cetyltrimethylammonium bromide, dodecyltrimethylammonium bromide, alkylpolyoxyethylene. Amines, N-alkylaminopropylamines, fatty acid triethanolamine esters and the like.
  • a protein or peptide capable of forming a complex at a pH lower than the isoelectric point is any protein or peptide capable of forming a complex at a pH lower than the isoelectric point of the substance.
  • albumin, orosomucoid, globulin, fibrinogen, pepsin, ribonuclease T1 and the like can be mentioned.
  • Examples of the ionic substance include ionic substances (specifically, anionic lipids, anionic polymers, etc.), anionic surfactants, among those exemplified in the definition of fine particles. Examples thereof include a protein or peptide that can form a complex at a pH equal to or higher than the isoelectric point, and a nucleic acid.
  • Examples of the ergonal lipid include phosphatidylserine, phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol, phosphatidic acid and the like.
  • Examples of the cationic polymer include polyaspartic acid, styrene maleic acid copolymer, isopropylacrylamide-acryl pyrrolidone copolymer, polyethylene glycol-modified dendrimer, polylactic acid, polylactic acid polydalicolic acid, polyethylene glycol acid. ⁇ Polylactic acid, dextran sulfate, dextran sulfate sodium, chondroitin sulfate, chondroitin sulfate sodium, hyaluronic acid, chondroitin, deltaman sulfate, heparan sulfate, heparin, ketalan sulfate, dextran fluoride resin, etc. .
  • Examples of the cationic surfactant include: acyl sarcosine, sodium alkyl sulfate, alkyl benzene sulfonate, carbon number? ⁇ 22 fatty acid sodium and the like. Specific examples include sodium dodecyl sulfate, sodium lauryl sulfate, sodium cholate, sodium deoxycholate, and sodium taurodeoxycholate.
  • any protein or peptide capable of forming a complex at a pH higher than the isoelectric point of the substance may be used.
  • albumin, orosomucoid, globulin, fibrinogen, histone, protamine, ribonuclease, lysozyme and the like can be mentioned.
  • nucleic acid as the eron substance examples include DNA, RNA, plasmid, siRNA, ODN and the like. May be.
  • the fine particles containing lipids or fatty acids or derivatives thereof in the present invention can be produced according to a known production method or a modification thereof, and may be produced by V or any other production method.
  • known ribosome preparation methods can be applied to the production of microparticles containing ribosome, which is one of microparticles, as a constituent component.
  • Known ribosome preparation methods include, for example, Bangham et al.'S ribosome preparation method ["J. Mol. Biol.”, 1965, Vol. 13, p. .238-252], ethanol injection method ["Journal 'Ob' Cell 'Biology 0.
  • Examples of the solution for dispersing ribosome in the production of ribosome include water, acid, alkali, various buffers, physiological saline, amino acid infusion solution.
  • antioxidants such as citrate, ascorbic acid, cysteine, and ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), such as glycerin, glucose, and sodium chloride sodium salt are used.
  • EDTA ethylenediamine tetraacetic acid
  • glycerin glycerin
  • glucose glucose
  • sodium chloride sodium salt ethylenediamine tetraacetic acid
  • Dissolved in an organic solvent such as ethanol
  • physiological saline and stirred shaking even cowpea to the formation of ribosomes can be produced ribosomes.
  • the average particle size of the ribosome can be freely selected as desired.
  • Methods for adjusting the average particle size include, for example, the elastolysis method, and mechanically crushing large multilamellar ribosomes (MLV) (specifically using Manton Gourin, a microfluidizer, etc.) [Muller (RH Muller), S. Benita, Bohm), "Emarzillon 'and' Nanosuspensions' Fo ⁇ The 'Formulation' Ob Poari ⁇ Solab Nore Drags (See Emulsion ana Nanosuspensions for tonne Formulation of Poorly soluble Drugs, Germany, Scientific Publishers Stuttgart, 1998, ⁇ .267-294).
  • MMV multilamellar ribosomes
  • a fine particle containing a lipid, a fatty acid, or a derivative thereof is selected, for example, a drug, a lipid aggregate, a ribosome, a spherical particle, a polymer, a metal colloid, a fine particle preparation, etc.
  • Complex specifically, for example, complex of ribosome or lipid aggregate containing cationic lipid and nucleic acid, complex of polymer containing nucleic acid such as poly-L-lysine and nucleic acid and nucleic acid
  • anionic lipid such as phosphatidic acid and a protein
  • polymer containing an anionic polymer such as styrene maleic acid and a protein
  • a cationic lipid There are complex of ribosome or lipid aggregate containing and protein, complex of polymer containing thione polymer such as poly-L-lysine and protein, etc.
  • Method of manufacturing is) For example, it may be a production method in which a drug is mixed with a lipid aggregate, ribosome, polymer, etc. in water. At this time, if necessary, a sizing step, a sterilization step and the like can be further added. It is also possible to form the complex in various solvents such as acetone and ether.
  • a nucleic acid complex can be formed by dissolving nucleic acid and lipid in an organic solvent such as ethanol and distilling off the solvent, and then adding physiological saline or the like and stirring with shaking.
  • a cationic substance and polyethylene glycolated phospholipid specifically, polyethylene glycol-phosphatidylethanolamine (more specifically, 1,2-distearoyl- sn-glyce mouth 3-phosphoethanolamine-N-[ ⁇ toxyl (polyethylene glycol) -2000] (PEG-DSPE), etc.), polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, Cremophor EL, etc. ) And the like, and then, for example, a nucleic acid may be added, and for example, a key polymer may be added to form a multiple complex.
  • polyethylene glycol-phosphatidylethanolamine more specifically, 1,2-distearoyl- sn-glyce mouth 3-phosphoethanolamine-N-[ ⁇ toxyl (polyethylene glycol) -2000] (PEG-DSPE), etc.
  • PEG-DSPE polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60
  • Cremophor EL Cremophor EL
  • fine particles coated with fats or fatty acids or derivatives thereof can be produced according to a known production method or a method equivalent thereto, V, may be manufactured by any manufacturing method.
  • V a method of coating fine particles comprising the above-mentioned drugs, lipid aggregates, ribosomes, emulsion particles, polymers, metal colloids, fine particle preparations, etc. with lipids or fatty acids or derivatives thereof.
  • Examples include the method described in WO 02/28367 pamphlet.
  • the size of the fine particles containing lipids or fatty acids or derivatives thereof in the present invention is preferably an average particle size of 300 nm or less, more preferably 200 nm or less.
  • the size is preferably injectable.
  • the polar organic solvent in the present invention is not particularly limited, but a polar organic solvent in which the surface modifier is soluble is preferable.
  • a polar organic solvent in which the surface modifier is soluble is preferable.
  • alcohol such as methanol, ethanol, n -propanol, 2-propanol, n-butanol, 2-butanol, tert-butanol, glycols such as glycerin, ethylene glycol, propylene glycol, polyethylene glycol, polyoxyethylene hardened castor Oil, polyalkylene glycol such as polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester or ether, etc., preferably ethanol Le.
  • Examples of the lipid derivative, fatty acid derivative or aliphatic hydrocarbon derivative of the water-soluble substance in the present invention include, for example, sugar, peptide, nucleic acid, and one or more lipid derivatives and fatty acid derivatives of the substance selected from water-soluble polymer power.
  • an aliphatic hydrocarbon derivative preferably a glycolipid, a lipid derivative or a fatty acid derivative of a water-soluble polymer, and more preferably a lipid derivative or a fatty acid derivative of a water-soluble polymer.
  • polyethylene glycol phospholipids More preferred are polyethylene glycol phospholipids, polyglycerin phospholipids, polyethylene glycol alkyl ethers, polyethylene glycol sorbitan fatty acid esters, polyethylene glycol fatty acid esters and polyglycerin fatty acid esters.
  • the lipid derivative, fatty acid derivative or aliphatic hydrocarbon derivative of the water-soluble substance in the present invention is a component of fine particles containing part of the molecule containing lipid or fatty acid or a derivative thereof, for example, hydrophobic affinity, electrostatic It is more preferable to have the property of binding to lipids or fatty acids or their derivatives contained in the microparticles, which are preferably bonded by, for example, hydrophobic affinity, electrostatic interaction, etc.
  • Examples of the lipid derivative of the water-soluble substance include those obtained by binding a water-soluble substance and, for example, the above-described lipid or a derivative thereof.
  • Examples of the fatty acid derivative of the water-soluble substance include those obtained by binding a water-soluble substance and a fatty acid such as stearic acid, palmitic acid, myristic acid, and lauric acid.
  • Examples of the aliphatic hydrocarbon derivative of a water-soluble substance include those obtained by binding a water-soluble substance to an alcoholic residue of, for example, a long-chain aliphatic alcohol, polyoxypropylene alkyl, or glycerin fatty acid ester. It is done.
  • Lipid derivatives, fatty acid derivatives or aliphatic hydrocarbon derivatives of sugars, peptides or nucleic acids include, for example, lipid derivatives, fatty acid derivatives or aliphatic hydrocarbon derivatives of the aforementioned water-soluble substances, for example, Sugars such as sucrose, sorbitol, and lactose, such as peptides such as strength zein-derived peptides, egg white-derived peptides, soybean-derived peptides, and dalutathione, or nucleic acid lipid derivatives such as DNA, RNA, plasmid, siRNA, and ODN, fat A fatty acid derivative or an aliphatic hydrocarbon derivative, and more specifically a lipid-derived sugar.
  • the body include glycolipids such as the above-mentioned glyce oral glycolipid and the above-mentioned glycosphingolipid.
  • the water-soluble substance part of the aforementioned water-soluble substance lipid derivative, fatty acid derivative or aliphatic hydrocarbon derivative is, for example, polyethylene glycol, Polyglycerin, Polyethyleneimine, Polybulal alcohol, Polyacrylic acid, Polyacrylamide, Oligosaccharide, Dextrin, Water-soluble cellulose, Dextran, Chondroitin sulfate, Polyglycerin, Chitosan, Polybulolidone, Polyaspartic acid amide, Poly-L- Examples include lysine, mannan, pullulan, oligoglycerol, etc., or derivatives thereof, more preferably polyethylene glycol derivatives, polyglycerol derivatives, and the like, and more preferably polyethylene glycol derivatives. What is the body.
  • the lipid derivative, fatty acid derivative or aliphatic hydrocarbon derivative of the polyethylene glycol derivative includes, for example, polyethylene glycol phospholipid (specifically, polyethylene glycol-phosphatidylethanolamine (more specifically, PEG-DSPE Etc.), polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, Cremophor, etc.), polyethylene glycol alkyl ether, polyethylene glycol sorbitan fatty acid ester (specifically, polyoxyethylene sorbitan monooleate), polyethylene glycol fatty acid ester, etc. More preferably, polyethylene glycol phospholipid is used.
  • polyethylene glycol phospholipid specifically, polyethylene glycol-phosphatidylethanolamine (more specifically, PEG-DSPE Etc.), polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, Cremophor, etc.
  • polyethylene glycol alkyl ether specifically, polyethylene glycol sorbitan fatty acid ester (specifically, polyoxyethylene sorbitan monooleate), polyethylene glycol fatty acid ester, etc
  • Examples of the lipid derivative, fatty acid derivative or aliphatic hydrocarbon derivative of the polyglycerol derivative include polyglycerol phospholipid (specifically, polyglycerol-phosphatidylethanolamine), polyglycerol fatty acid ester, and the like. More preferably, polydallyserine lipids are mentioned.
  • the amphiphilic substance in the present invention is more hydrophilic than the lipid part, fatty acid derivative or aliphatic hydrocarbon derivative of the water-soluble substance to be used. Differences in electrical interaction, etc. are small.
  • phospholipid as defined above
  • glyceglycoglycolipid as defined above
  • glycosphingolipid as defined above
  • cholesterol as defined above
  • Cationic lipid as defined above
  • anionic lipid as defined above
  • surfactant as defined above
  • lipid derivative of water-soluble polymer, fatty acid derivative or aliphatic hydrocarbon Derivatives are preferable, and phospholipids, cholesterol, and surfactants are more preferable.
  • microparticles containing lipids or fatty acids or derivatives thereof surface-modified with the water-soluble substance of the present invention comprises microparticles containing lipids or fatty acids or derivatives thereof in a liquid containing a polar organic solvent. It can be produced by a production method including a step (Step A) in which a surface modifier comprising a water-soluble substance, a lipid derivative, a fatty acid derivative or an aliphatic hydrocarbon derivative, is present in a dispersed state. The fine particles are obtained in the state of a dispersion.
  • a surface modifier comprising a water-soluble substance, a lipid derivative, a fatty acid derivative or an aliphatic hydrocarbon derivative
  • an amphiphilic substance be further present in a dissolved or dispersed state in the liquid containing the polar organic solvent.
  • the dispersion of fine particles containing lipids or fatty acids or their derivatives means suspension, emulsion or emulsion formation, preferably in a suspended state, and most of them are dispersed. In addition, it includes a state in which the remaining portion is dissolved or a portion in which the remaining portion is precipitated, but it is preferable that the entire portion is dispersed as much as possible.
  • the dispersion of the surface modifier or amphiphile means a state in which aggregates or micelles are formed and suspended, emulsified or emulsified, preferably emulsified or emulsified.
  • Step A when mixing for dispersion, no special equipment is required, but various industrially acceptable mixing methods may be used. Examples of the mixing method include mixing in storage containers such as tanks and vials, and mixing in transport pipes and channels.
  • the ratio of the polar organic solvent in step A is particularly limited as long as V or the fine particles containing lipids or fatty acids or derivatives thereof are dispersed and the surface modifier is dissolved or dispersed.
  • a solvent, lipid, fatty acid, or derivative thereof that is preferably used under conditions where fine particles containing lipid, fatty acid, or a derivative thereof are dispersed, and the surface modifier is dissolved or emulsified or emulsified.
  • the combination of the polar organic solvent and the fine particles containing lipid or fatty acid or derivatives thereof, the surface modifier and the amphiphile in the present invention is not particularly limited, but a liquid containing the polar organic solvent
  • the fine particles are dispersed and the surface modifier and the amphiphilic substance are soluble in the polar organic solvent.
  • the surface modifier and the amphiphile are soluble in the polar organic solvent means that the surface modifier and the amphiphile are soluble in the polar organic solvent.
  • the surface modifier and amphiphile have the property of being dissolved in the polar organic solvent, the surface modifier and amphiphile form aggregates or micelles in the polar organic solvent and It is preferable that the surface modifier and the amphiphile have a property of being dissolved in a polar organic solvent, including a case where the surface modifier and the amphiphilic substance have a property of being turbid or emulsifying.
  • the concentration of fine particles containing lipids or fatty acids or their derivatives in the aqueous solution containing a polar organic solvent in Step A is 1 ⁇ g / mL. It is preferable to set it to -lg / mL, and it is more preferable to set it to 0.1-500 mg / mL.
  • the concentration of the surface modifier used is preferably 1 g / mL to lg / mL, more preferably 0.1 to 400 mg / mL.
  • the ratio of the surface modifying agent to the fine particles containing lipids or fatty acids or derivatives thereof surface-modified with the water-soluble substance of the present invention is preferably 1000: 1 to 1:10. More preferably, it is 100: 1 to 1: 1, and more preferably 10: 1 to 2: 1. Further, the weight ratio of the amphiphile of the present invention to the surface modifier is preferably 10: 1 to 1: 100, more preferably 5: 1 to 1:10. The ratio of fine particles containing lipid or fatty acid or their derivatives surface-modified with a water-soluble substance and the surface modifier is 100: 1 to 10 by weight because of the safety and cost of the surface modifier. : 1 may be preferred, in which case the weight ratio of amphiphile to surface modifier is preferably 1: 2 to 1:10.
  • the size of the fine particles containing a lipid or a fatty acid or a derivative thereof surface-modified with a water-soluble substance obtained by the production method of the present invention has an average particle size of 300 nm or less. More specifically, it is preferable that the size is 200 or less. Specifically, for example, the size is preferably injectable.
  • Fine particles containing lipids or fatty acids or derivatives thereof surface-modified with a water-soluble substance that can be produced using the production method of the present invention are contained in biological components such as blood components (for example, blood, digestive fluid, etc.). It can be used as a preparation for the purpose of stabilizing drugs, reducing side effects, increasing the accumulation of drugs in target organs such as tumors, and improving the absorption of drugs by the oral and transmucosal layers.
  • biological components such as blood components (for example, blood, digestive fluid, etc.). It can be used as a preparation for the purpose of stabilizing drugs, reducing side effects, increasing the accumulation of drugs in target organs such as tumors, and improving the absorption of drugs by the oral and transmucosal layers.
  • administration of the microparticles as a drug-containing carrier to a tumor or inflammation site allows the drug to be delivered to the tumor or inflammation site, and when the drug is an antitumor drug, for example, as a tumor therapeutic agent
  • Tumors can be treated by administering the microparticles, and when the drug is an anti-inflammatory drug, for example, by administering the microparticles as a therapeutic agent for inflammation, the inflammation can be treated.
  • Tumors can be treated by administering the microparticles, and when the drug is an anti-inflammatory drug, for example, by administering the microparticles as a therapeutic agent for inflammation, the inflammation can be treated.
  • a tissue or an organ in which angiogenesis is enhanced is a site where fine particles containing lipids or fatty acids or derivatives thereof surface-modified with a water-soluble substance that can be produced using the production method of the present invention can be satisfactorily delivered.
  • the microparticle is administered as a therapeutic agent for the disease to treat the disease be able to.
  • the particles are surface-modified with a water-soluble substance prepared by the above-described method.
  • a dispersion of fine particles containing lipids or fatty acids or their derivatives as they are, for example, in the form of injections, etc., but it is also possible to use the dispersion after removing the solvent by, for example, filtration or centrifugation.
  • the dispersion or the dispersion to which an excipient such as mannitol, latatose, trehalose, maltose, glycine or the like is added may be lyophilized for use.
  • an injection a dispersion of fine particles containing a lipid or fatty acid or a derivative thereof surface-modified with the water-soluble substance of the present invention, or a solvent thereof removed, or It is preferable to prepare an injection by mixing lyophilized with water, acid, alkali, various buffers, physiological saline, amino acid infusion, and the like.
  • an injection can be prepared by adding an anti-oxidant such as citrate, ascorbic acid, cysteine, or EDTA, an isotonic agent such as glycerin, glucose, or sodium chloride salt. Further, it can be cryopreserved by adding a cryopreservative such as glycerin.
  • the fine particles containing lipids or fatty acids or derivatives thereof surface-modified with the water-soluble substance of the present invention are granulated and dried together with suitable excipients, for example, capsules, tablets, You may process into oral preparations, such as a granule.
  • a kit may be used in the production method of the present invention.
  • the configuration of the kit include, for example, fine particles containing lipids or fatty acids or derivatives thereof, surface modifiers made of water-soluble fatty acid derivatives or aliphatic hydrocarbon derivatives, and fluid configurations containing polar organic solvents. Can be given.
  • fine particles containing lipids or fatty acids or derivatives thereof for preparing fine particles containing lipids or fatty acids or derivatives thereof surface-modified with a water-soluble substance by the production method of the present invention It is surface-modified with a water-soluble substance by filling and mixing a surface modifier made of a water-soluble substance fatty acid derivative or aliphatic hydrocarbon derivative, a liquid containing a polar organic solvent, preferably an amphiphilic substance, etc. Fine particles containing lipids or fatty acids or their derivatives can be prepared.
  • the kit is advantageous in that it is easy to use as a kit because there are no restrictions such as heating during the process of mixing the components.
  • kits may be supplied in any form such as a solution state or a lyophilized state.
  • the surface modifying agent composed of fine particles containing lipids or fatty acids or their derivatives, which may be supplied in combination in advance, and fatty acid derivatives or aliphatic hydrocarbon derivatives of water-soluble substances are separately provided, and the surface It is preferable to combine an amphiphile with the modifier.
  • the production method of the present invention may include a heating step.
  • a heating step for example, in a preparation comprising a drug such as a protein or nucleic acid as a constituent component, there is a possibility that the activity of the drug or the like will not be affected, even if heating for a short period of time may have a significant effect on the activity. It is preferable to heat at a temperature below or shortly.
  • Short strands of RNA complementarily The siRNA present in the formed state dissociates into single strands when heated to 60 ° C or higher, and even after cooling, single-stranded RNA or nonspecifically formed double strands Perfectly complementary RNA may exist, and such RNA is susceptible to degradation by degrading enzymes. In addition, it is thought that single-stranded siRNA cannot form a RISC complex that recognizes mRNA.
  • fine particles containing lipids or fatty acids or their derivatives surface-modified with a water-soluble substance can be prepared without including a heating step, such as proteins and nucleic acids. Even in a preparation containing a drug or the like that is easily affected by heat, there is an advantage that the fine particles can be produced at a temperature or lower that does not affect the activity of the drug or the like.
  • the coexistence of polar organic solvents makes it easy for phase transitions such as ribosome film-forming substances to occur even at low temperatures, and particles containing lipids or fatty acids with high phase transition temperatures or their derivatives, and low critical micelle concentrations. !
  • the amphiphile is present in a dissolved or dispersed state together with a surface modifier comprising a water-soluble substance lipid derivative, fatty acid derivative or aliphatic hydrocarbon derivative.
  • Amphiphilic substances have the effect of further improving the productivity such as the yield of fine particles containing lipids or fatty acids or their derivatives modified with water-soluble substances, or lipids or fatty acids modified with water-soluble substances or those It also has the effect of improving the functionality and stability, such as the retention in blood, of microparticles containing other derivatives.
  • microparticles containing lipids or fatty acids or their derivatives are ribosomes
  • polar organic solvents are ethanol
  • amphiphile candy lipids and surface modifiers are polyethylene glycol lipids.
  • a method for producing microparticles surface-modified with a water-soluble substance, and microparticles containing lipids or fatty acids or their derivatives are ribosomes
  • polar organic solvents are ethanol
  • amphiphilic substance phospholipids The method for producing fine particles surface-modified with a water-soluble substance, wherein the surface modifier is polyethylene glycol fatty acid ester, is shown, but the present invention is not limited to these examples.
  • Dextran Fluoresceonic (FD, manufactured by Molecular Probes) 5 mg, D OTAP (Avanti Polar Lipids, same below) 30 mg and PEG-DSPE (Nippon Yushi Co., Ltd.) 12 mg, It was dispersed in water ImL (water for injection, manufactured by Otsuka Pharmaceutical, the same applies hereinafter).
  • the obtained dispersion was passed 10 times through a polycarbonate membrane having a pore size of 0.4 m (manufactured by Whatman, the same applies below) and 10 times through a polycarbonate membrane having a pore size of 0.1 m (manufactured by Whatman, the same applies hereinafter).
  • Dispersion of modified fine particles by mixing 500 L of the obtained dispersion, 60 mg of EPC (manufactured by NOF Corporation, the same applies below), 2.5 L of PEG-DSPE 1 and 2000 L of ethanol / water mixture (8: 5) A liquid was obtained.
  • Example 1 The surface modifier in Example 1 was changed to PEG-DSPE 25 mg, and a preparation was obtained in the same manner.
  • Example 1 The surface modifier in Example 1 was PEG-DSPE 7.5 mg, and the amphiphile was EPC 7. A formulation was similarly obtained using 5 mg with a surface modifier.
  • a preparation was similarly obtained using PEG-DSPE 25 mg as the surface modifier in Example 1 and EPC 25 mg as the amphiphilic substance together with the surface modifier.
  • Example 1 The surface modifier in Example 1 was 7.5 mg PEG-DSPE, and EPC 22 was used as the amphiphile.
  • the average particle size of fine particles whose surface was modified with a water-soluble substance in the preparation was measured by a dynamic light scattering method (DLSX equipment: A model ELS-800, Otsuka Electronics, the same applies hereinafter).
  • the FD recovery rate and EPC recovery rate for each formulation were calculated using the following formulas (1) and (2).
  • EPC recovery rate (%) Aj / (A Z + B z ) X 100 (2)
  • Each preparation was diluted with PBS so that the total lipid concentration was 5 mg / mL, and was administered to rats at a lipid amount / rat weight ratio of 10 mg / kg.
  • Blood was collected at 1 minute, 10 minutes, 30 minutes, 1 hour, 3 hours, 6 hours and 24 hours after administration, and plasma was collected by centrifugation.
  • 50 ⁇ L of plasma 50 ⁇ L of 10 w / v% TritonX-100 and PBS 400 ⁇ L was added and stirred with a vortex mixer. 100 L of this was taken in a 96-well microplate, and the fluorescence intensity at an excitation wavelength of 485 nm and a fluorescence wavelength of 530 nm was measured using ARVOsx-4.
  • the fluorescence intensity of each FD-PBS at 1, 0.5 and 0.25 g / mL was measured to obtain a calibration curve.
  • the calibration curve force was also determined for the FD concentration in each sample. Calculate the plasma volume per 100 g of rat body weight as 7.8 mL, calculate the residual ratio (%) in the blood with respect to the dose, and calculate the AUC by the trapezoidal method.
  • the preparations obtained in Examples 1 to 5 were compared with the preparations obtained in Comparative Examples 1 and 2, depending on the amount of surface modifier (PEG-DSPE) added. In comparison with the preparation obtained in Comparative Example 3, the blood retention was comparable.
  • the preparations obtained in Examples 3 and 4 in which an amphiphilic substance (EPC) coexists with the surface modifier are compared with the preparations obtained in Examples 1 and 2 that do not use an amphiphilic substance, respectively. However, it showed higher blood retention.
  • the manufacturing method of the present invention is superior to the conventional method of manufacturing at room temperature in water, despite being a simple manufacturing method that does not have restrictions such as having to be heated, and is equal to or better than the conventional method of heating in water. It was revealed that fine particles containing lipids or fatty acids or their derivatives surface-modified with water-soluble substances can be obtained.
  • DOTAP and PEG-DSPE were dispersed in water at concentrations of 30 and 12 mg / mL, respectively.
  • the obtained liquid was passed 10 times through a polycarbonate membrane having a pore size of 0.4 ⁇ m and 10 times through a polycarbonate membrane having a pore size of 0.1 ⁇ m.
  • Example 11 The surface modifier in Example 10 was PEG-DSPE 12.5 mg, and the amphiphile was EPC 12.
  • the formulation was obtained in the same manner at 5 mg.
  • the average particle size of fine particles whose surface was modified with a water-soluble substance in the preparation was measured by DLS.
  • Each formulation was diluted with PBS to a total lipid concentration of 30 mg / mL. Further, diluted 1000 times with PBS, 50 ⁇ L of 10w / v% TritonX-100 and 400 ⁇ L of PBS were added to 50 ⁇ L of each diluted solution, and stirred with a vortex mixer. In addition, the ultracentrifugation supernatant obtained in each example was diluted 10-fold with PBS, and 50 ⁇ L of 10w / v% TritonX-100 and 400 L of PBS were added to each 50 ⁇ L of each diluted vortex mixer. And stirred.
  • ODN recovery rate and EPC recovery rate for each formulation were calculated using the following formulas (3) and (4).
  • Each preparation was diluted with PBS to a total lipid concentration of 5 mg / mL, and administered to rats at a dose of 10 mg / kg in the ratio of lipid amount / rat body weight.
  • Blood was collected at 1 minute, 10 minutes, 30 minutes, 1 hour, 3 hours, 6 hours and 24 hours after administration, and plasma was collected by centrifugation.
  • 50 ⁇ L of 10 w / v% TritonX-100 and 400 ⁇ L of PBS were added to 50 ⁇ L of each plasma, and stirred with a vortex mixer.
  • Example 10 50 12. 5 2. 5 118 91 39 460
  • Example 11 50 12. 5 12. 5 113 97 74 533
  • Dextran fluorescein ionic (FD) 10 mg, DOTAP 60 mg and PEG-DSPE 24 mg were dispersed in 2 mL of water.
  • the obtained dispersion was added to a polycarbonate membrane having a pore diameter of 0.4 m.
  • the membrane was passed 10 times through a membrane and 10 times through a polycarbonate membrane having a pore diameter of 0.1 m.
  • 240 mg of EPC and 50 mg of PEG-DSPE were dissolved in 8000 ⁇ L of an ethanol / water mixture (5: 3). 500 ⁇ L of the obtained dispersion was mixed with 2000 ⁇ L of the obtained EPC and PEG-DSPE solution to obtain a dispersion of modified fine particles.
  • the surface modifier in Example 12 was 7.5 mg of polyethylene glycol monostearate (40E.OX PEG (40) -St, manufactured by Nikko Chemicals, the same applies hereinafter), and 7.5 mg of EPC was used as the amphiphile on the surface.
  • a formulation was obtained in the same manner using the modifier.
  • a preparation was obtained in the same manner by using 7.5 mg of the surface modifying agent in Example 12 and 7.5 mg of EPC as the amphiphilic substance together with the surface modifying agent.
  • Example 15 [0119] After preparing a dispersion of fine particles to be modified in Reference Example 3, 750 L of the dispersion was added 7.5 mg of PEG (40) -St as a surface modifier and 7.5 mg of EPC as an amphiphile in ethanol / water. Mixture (1: 1) Dispersed in 60 L was mixed. Further, an appropriate amount of water was added dropwise to adjust the ethanol concentration to about 5 vol%, ultracentrifugation (1 hour, 110,000 Xg, 25 ° C) was performed to remove the supernatant, and PBS was added to obtain a preparation.
  • Example 14 40 7. 5 3. 75 123 90 76 164
  • Example 15 50 7. 5 7. 5 111 73 64 195
  • the present invention there is provided a simple method for producing fine particles containing lipids or fatty acids surface-modified with water-soluble substances or derivatives thereof.
  • the production of fine particles containing lipids or fatty acids or derivatives thereof surface-modified with a water-soluble substance capable of modifying a wide variety of modified particles without the step of heating substantially. Methods etc. are provided.

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Abstract

　本発明は、より簡便な方法による水溶性物質で表面修飾された脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子の製造方法等を提供することを目的とし、極性有機溶媒を含有する液中に、脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子を分散状態で存在させ、水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体からなる表面修飾剤を溶解または分散状態で存在させる工程を含む、該水溶性物質で表面修飾された該微粒子の製造方法等を提供する。

Description

明 細 書
水溶性物質で表面修飾された微粒子の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子が、水溶性物 質によって表面修飾された微粒子の製造方法に関する。
背景技術
[0002] 従来から、医薬品、農薬、食品等の分野において、活性成分を含有する微粒子を 水溶性物質で表面修飾したり、活性成分を水溶性物質でィ匕学修飾したりすること〖こ より、生体内での活性成分への蛋白質等の接近や認識が抑えられ、血中半減期の 延長や抗原性の低下等の効果が得られることが知られている。リボソーム、ェマルジ ヨン粒子等の脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子においても、該 微粒子を水溶性物質で表面修飾することで、血中半減期の延長や抗原性の低下等 の効果が得られることが知られている (特許文献 1および 2参照)。
[0003] 脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子の水溶性物質による表面 修飾は、一般的に該微粒子の製造工程において、構成成分のうち少なくとも粒子化 する作用をもつ構成成分と、水溶性物質の誘導体からなる表面修飾剤とを共存させ 、粒子化する作用をもつ構成成分と該表面修飾剤とで一緒に微粒子を形成させるこ とで行われる (特許文献 2参照)。しカゝしながら、上記工程において多量の表面修飾剤 で該微粒子を修飾することが必要な場合には、該微粒子の物理ィ匕学的な性質の変 化を引き起こして、好ましい表面修飾ができないことがある。例えばリン脂質にポリエ チレングリコール誘導体を共存させてリボソームを調製する場合、ポリエチレングリコ ール誘導体の含量が高 、と脂質膜の形態を取らずにミセルイ匕することが知られて ヽ る ["バイオフィジカル 'ジャーナル (Biophysical Journal)", 1997年、第 73卷、 p.258- 26 6、 "バイオフィジカル 'ジャーナル (Biophysical Journal)", 2002年、第 83卷、 p.2419-2 439参照]。また、水溶性物質による表面修飾は前述した目的力 考えて微粒子の外 側のみでよいが、微粒子の形成時にあらかじめ表面修飾剤を共存させておく製造方 法では該表面修飾剤が、微粒子の内側にも存在してしまう。 [0004] 一方で、脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子の構成成分のう ち、少なくとも粒子化する作用をもつ構成成分で微粒子を形成させた後に、水溶性 物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体からなる表面修飾 剤を添加する方法による、該微粒子の外側のみ水溶性物質で表面修飾された該微 粒子の製造方法が知られている (特許文献 1および 3参照)。し力しながら、特許文献 1 では、室温において、水中でリボソームにポリエチレングリコール結合リン脂質を添カロ して、該リボソームをポリエチレングリコールで表面修飾する方法が記載されて 、るが 、特許文献 3にも記載されているように、この方法で室温以下の温度で十分表面修飾 できるのは、リボソームにおける粒子化する作用をもつ構成成分として相転移温度の 低 、リン脂質を用い、表面修飾剤として臨界ミセル濃度の高 、ものを用いる場合に限 られる。また、特許文献 3では、水中でリボソームに、分子の一端に疎水性部を有し他 端に親水性部を有する化合物からなる表面修飾剤を添加し、粒子化する作用をもつ 構成成分の相転移温度以上になるように加熱する工程を経て、該リボソームを表面 修飾する方法が記載されて 、る。
特許文献 1：特開平 2-149512号公報
特許文献 2：特表平 5-501264号公報
特許文献 3：特開平 3-181415号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明の目的は、より簡便な方法による水溶性物質で表面修飾された脂質もしくは 脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子の製造方法等を提供することにある。 課題を解決するための手段
[0006] 本発明は以下の (1)〜(17)に関する。
(1)極性有機溶媒を含有する液中に、脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を 含む微粒子を分散状態で存在させ、水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体また は脂肪族炭化水素誘導体からなる表面修飾剤を溶解または分散状態で存在させる 工程 (工程 A)を含む、該水溶性物質で表面修飾された該微粒子の製造方法。
(2)極性有機溶媒として、該表面修飾剤が可溶な極性有機溶媒を使用することを特 徴とする前記 (1)の微粒子の製造方法。
(3)極性有機溶媒として、アルコール、グリコールおよびポリアルキレングリコールから 選ばれる一つ以上を使用することを特徴とする前記 (1)の製造方法。
(4)極性有機溶媒を含有する液として、極性有機溶媒の濃度が 80vol%以下の該極性 有機溶媒を含有する液を使用することを特徴とする前記 (1)〜(3)のいずれかの製造 方法。
(5)脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子が、脂質もしくは脂肪酸 またはそれらの誘導体で被覆された微粒子である前記 (1)〜(4)のいずれかの製造方 法。
(6)工程 Aにおいて、該極性有機溶媒を含有する液中に、さらに両親媒性物質を溶 解または分散状態で存在させることを特徴とする前記 (1)〜(5)のいずれ力の製造方 法。
(7)両親媒性物質と表面修飾剤の重量比を、 10:1〜1:100とすることを特徴とする前 記（6)の製造方法。
(8)両親媒性物質がリン脂質、グリセ口糖脂質、スフインゴ糖脂質、コレステロール、力 チオン性脂質、ァニオン性脂質、界面活性剤、および水溶性高分子の脂質または脂 肪酸誘導体力 選ばれる一つ以上である、前記 (6)または (7)の製造方法。
(9)脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子が、脂質集合体、リポソ ームおよびェマルジヨン粒子カゝら選ばれる一つ以上を構成成分とする微粒子である 前記 (1)〜(8)の 、ずれかの製造方法。
(10)表面修飾剤が、ポリエチレングリコールイ匕脂質、ポリグリセリンィ匕脂質、ポリエチレ ングリコールアルキルエーテル、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、 ポリエチレングリコール脂肪酸エステルおよびポリグリセリン脂肪酸エステル力 選ば れる一つ以上である前記 (1)〜(9)のいずれかの製造方法。
(11)脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子がリボソームであり、極 性有機溶媒がエタノールであり、両親媒性物質がリン脂質であり、表面修飾剤がポリ エチレングリコールイ匕脂質である、前記 (6)または (7)の製造方法。
(12)脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子がリボソームであり、極 性有機溶媒がエタノールであり、両親媒性物質がリン脂質であり、表面修飾剤がポリ エチレングリコール脂肪酸エステルである、前記 (6)または (7)の製造方法。
(13)前記 (1)〜(12)のいずれかの製造方法によって表面修飾される脂質もしくは脂肪 酸またはそれらの誘導体を含む微粒子を調製するための、少なくとも脂質もしくは脂 肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子、水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導 体または脂肪族炭化水素誘導体からなる表面修飾剤、および極性有機溶媒を含有 する液から構成されるキット。
(14)前記 (1)〜(12)のいずれかの製造方法を用いて製造できる水溶性物質で表面修 飾された脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子。
(15)前記 (1)〜(12)のいずれかの製造方法を用いて製造できる水溶性物質で表面修 飾された脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子のうち、抗腫瘍薬を 含有する該微粒子を含有する腫瘍の治療剤。
(16)前記 (1)〜(12)のいずれかの製造方法を用いて製造できる水溶性物質で表面修 飾された脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子のうち、抗炎症薬を 含有する該微粒子を含有する炎症の治療剤。
(17)前記 (1)〜(12)のいずれかの製造方法を用いて製造できる水溶性物質で表面修 飾された脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子のうち、薬物を含有 する該微粒子力もなる、腫瘍または炎症部位への薬物含有キャリアー。
発明の効果
[0007] 本発明により、水溶性物質で表面修飾された脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘 導体を含む微粒子の簡便な製造方法等が提供される。また、本発明によって、実質 上加熱する工程を含まずに、幅広 ヽ種類の被修飾粒子を修飾することが可能な水溶 性物質で表面修飾された脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子の 製造方法等が提供される。
図面の簡単な説明
[0008] [図 1]実施例 1〜5および比較例 1〜3で得られた各製剤について、ラットに投与後の 血中動態推移を表わしている。國は実施例 1、口は実施例 2、參は実施例 3、〇は実 施例 4、♦は実施例 5、 Xは比較例 1、△は比較例 2、◊は比較例 3で得られた製剤の 投与群をそれぞれ表わして 、る。
[図 2]実施例 6〜9、比較例 2および 3で得られた各製剤について、ラットに投与後の血 中動態推移を表わしている。國は実施例 6、口は実施例 7、參は実施例 8、〇は実施 例 9、△は比較例 2、◊は比較例 3で得られた製剤の投与群をそれぞれ表わしている
[図 3]実施例 10および 11で得られた各製剤について、ラットに投与後の血中動態推 移を表わしている。國は実施例 10、口は実施例 11で得られた製剤の投与群をそれぞ れ表わしている。
[図 4]実施例 12〜15で得られた各製剤について、ラットに投与後の血中動態推移をを 表わしている。國は実施例 12、口は実施例 13、參は実施例 14、〇は実施例 15で得ら れた製剤の投与群をそれぞれ表わして!/ヽる。
発明を実施するための最良の形態
[0009] 本発明における水溶性物質で表面修飾された脂質もしくは脂肪酸またはそれらの 誘導体を含む微粒子とは、被修飾粒子としての、脂質もしくは脂肪酸またはそれらの 誘導体を含む微粒子が、表面修飾剤としての、水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸 誘導体または脂肪族炭化水素誘導体によって修飾された微粒子のことである。本発 明における表面修飾とは、表面修飾剤の一部 (主に脂質、脂肪酸または脂肪族炭化 水素の部分)が、被修飾粒子の表面より内側に入り、残部 (主に水溶性物質の部分)が 表面より外側に突き出るように、表面修飾剤を被修飾粒子に含有させることである。
[0010] 本発明における脂質としては、単純脂質、複合脂質または誘導脂質のいかなるもの であってもよぐ例えばリン脂質、グリセ口糖脂質、スフインゴ糖脂質、スフインゴイド、 ステロール、カチオン性脂質等があげられ、好ましくはリン脂質、カチオン性脂質等 力 Sあげられる。また、脂質の誘導体としては、例えば界面活性剤 (後記の界面活性剤 と同義)、高分子 (後記の高分子と同義、具体的にはデキストラン等)、ポリオキシェチ レンまたはその誘導体 (具体的にはポリエチレングリコール等)、オリゴグリセリンまたは その誘導体等の脂質誘導体があげられ、好ましくはポリエチレングリコール化リン脂 質があげられる。
[0011] リン脂質としては、例えばホスファチジルコリン (具体的には大豆ホスファチジルコリ ン、卵黄ホスファチジルコリン (EPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミト ィルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジォレオイルホスファチ ジルコリン等)、ホスファチジルエタノールァミン (具体的にはジステアロイルホスファチ ジルエタノールァミン (DSPE)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミン、ジォレ オイルホスファチジルエタノールァミン等)、グリセ口リン脂質 (具体的にはホスファチジ ルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール 、リゾホスファチジルコリン等)、スフインゴリン脂質 (具体的にはスフインゴミエリン、セラ ミドホスホエタノールァミン、セラミドホスホグリセロール、セラミドホスホグリセ口リン酸 等)、グリセ口ホスホノ脂質、スフインゴホスホノ脂質、天然レシチン (具体的には卵黄レ シチン、大豆レシチン等)、水素添加リン脂質 (具体的には水素添加大豆ホスファチジ ルコリン等)等の天然または合成のリン脂質があげられる。
[0012] グリセ口糖脂質としては、例えばスルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセ リド、ジガラタトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド等があ げられる。
[0013] スフインゴ糖脂質としては、例えばガラクトシルセレブ口シド、ラタトシルセレブロシド 、ガンダリオシド等があげられる。
[0014] スフインゴイドとしては、例えばスフインガン、ィコサスフインガン、スフインゴシン、そ れらの誘導体等があげられる。誘導体としては、例えばスフインガン、ィコサスフインガ ン、スフインゴシン等の- NHを- NHCO(CH ) CH (式中、 xは 0 の整
2 2 3 〜18 数を表し、中 でも 6、 12または 18が好ましい)に変換したもの等があげられる。
[0015] ステロールとしては、例えばコレステロール、ジヒドロコレステロール、ラノステロール 、 β -シトステロ一ノレ、カンペステローノレ、スチグマステロ一ノレ、ブラシカステロ一ノレ、 ェルゴカステロール、フコステロール、 3 j8 - [Ν- (Ν',Νしジメチルアミノエチル)カルバモ ィル]コレステロール (DC- Choi)等があげられる。
[0016] カチオン性脂質としては、例えば、 N-[l-(2,3-ジォレオイルプロピル)] -Ν,Ν,Ν-トリメ チル塩化アンモ-ゥム (DOTAP)、 N- [1- (2,3-ジォレオイルプロピル)]- Ν,Ν-ジメチル ァミン (DODAP)、 N- [1- (2,3-ジォレイルォキシプロピル)]- Ν,Ν,Ν-トリメチル塩化アン モ -ゥム (DOTMA)、 2,3-ジォレイルォキシ- N-[2- (スペルミンカルボキシアミド)ェチル ]- Ν,Ν-ジメチル- 1-プロパナミ-ゥムトリフルォロ酢酸 (DOSPA)、 N- [1- (2,3-ジテトラデ シルォキシプロピル)] -Ν,Ν-ジメチル- N-ヒドロキシェチル臭化アンモ-ゥム (DMRIE)、 N-[l-(2,3-ジォレイルォキシプロピル)] -Ν,Ν-ジメチル- N-ヒドロキシェチル臭化アン モニゥム (DORIE)等もあげられる。
[0017] 本発明における脂肪酸またはその誘導体としては、例えばステアリン酸、パルミチン 酸、ラウリン酸等の脂肪酸、脂肪酸と他の物質が化学結合した界面活性剤等があげ られる。
[0018] 界面活性剤としては、例えばモノォレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン (具体的 にはポリソルベート 80等)、ソルビタン脂肪酸 (具体的にはソルビタンモノラウレート、ソ ルビタンモノォレエート等)、ポリオキシエチレン誘導体 (具体的にはポリオキシェチレ ン硬化ヒマシ油 60等)、グリセリン脂肪酸エステル等があげられる。
[0019] 本発明における脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子とは、例え ば、脂質集合体、リボソーム、ェマルジヨン粒子等を構成成分とする微粒子のことまた は薬物、高分子、金属コロイド、微粒子製剤等を構成成分とする微粒子であって、前 記の脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子のことであり、好ましく は脂質集合体、リボソーム、ェマルジヨン等を構成成分とする微粒子があげられ、さら に好ましくはリボソームを構成成分とする微粒子があげられる。ここで、脂質集合体、 リボソーム、ェマルジヨン粒子等を構成成分とする微粒子、または薬物、高分子、金 属コロイド、微粒子製剤等を構成成分とする微粒子であって、前記の脂質もしくは脂 肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子は、前記の脂質もしくは脂肪酸またはそれ らの誘導体を含んでいれば、例えば薬物、脂質集合体、リボソーム、ェマルジヨン粒 子、高分子、金属コロイドおよび微粒子製剤力 選ばれた 2つ以上組み合わせた複 合体を構成成分とする微粒子であっても、薬物、脂質集合体、リボソーム、ェマルジョ ン粒子、高分子、金属コロイドおよび微粒子製剤から選ばれた 1つ以上と他の化合物 (例えば糖、脂質、無機化合物等)とを組み合わせた複合体を構成成分とする微粒子 等を包含し、好ましくは薬物と、脂質集合体、リボソームおよびェマルジヨン粒子から 選ばれる 1つ以上との複合体を構成成分とする微粒子があげられ、より好ましくは薬 物とリボソームとの複合体を構成成分とする微粒子があげられる。 [0020] また、脂質集合体、リボソーム、ェマルジヨン粒子等を構成成分とする微粒子、また は薬物、高分子、金属コロイド、微粒子製剤等を構成成分とする微粒子であって、前 記の脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子は、脂質もしくは脂肪 酸またはそれらの誘導体で被覆された微粒子であってもよぐ例えば薬物、脂質集合 体、リボソーム、ェマルジヨン粒子、高分子、金属コロイド、微粒子製剤等を構成成分 とする微粒子が、脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体で被覆された微粒子が あげられ、脂質集合体、リボソームまたはェマルジヨン粒子を構成成分とする微粒子 力 脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体で被覆された微粒子であることがより 好ましい。脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体で被覆された微粒子には、前記 の複合体を構成成分とする微粒子のいずれかが、脂質もしくは脂肪酸またはそれら の誘導体で被覆された微粒子を包含する。
[0021] 脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体で被覆された微粒子における、被覆に 用いる脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体としては、脂質膜を形成する脂質も しくは脂肪酸またはそれらの誘導体であることが好ましぐ例えば前記の脂質、界面 活性剤等があげられ、より好ましくは、前記の脂質、界面活性剤のうちの中性脂質が あげられ、さらに好ましくはリン脂質があげられ、最も好ましくは EPCがあげられる。ま た、被覆に用いる脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体は、極性有機溶媒に可 溶であることが好ましぐ該極性有機溶媒を含む液中に、該脂質膜の構成成分が分 散可能で、該複合粒子も分散可能な濃度で該極性有機溶媒を含む液が存在するこ とが好ましい。ここで、中性脂質とは、脂質、界面活性剤のうちの、前記のカチオン性 脂質と後記のカチオン性界面活性剤、ァ-オン性脂質およびァ-オン性界面活性剤 を除いたもののことであり、中性脂質としてより好ましくは、リン脂質、グリセ口糖脂質、 スフインゴ糖脂質等があげられる。
[0022] 本発明における薬物は、工程 Aにおける極性有機溶媒を含有する液の溶媒中で微 粒子の形態をとる薬物、脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子を 構成する他の構成成分と複合体を形成して該溶媒中で微粒子の形態をとる薬物等 を包含し、例えば蛋白質、ペプチド、核酸、低分子化合物、糖類、高分子化合物、脂 質性化合物、金属化合物等のうち薬理学的活性を有する物質があげられ、好ましく は、核酸があげられ、より好ましくは、遺伝子、 DNA、 RNA、オリゴヌクレオチド (ODN)、 プラスミドおよび siRNAから選ばれる 1つ以上の物質があげられる。
[0023] 蛋白質またはペプチドとしては、例えばブラジキュン、アンジォテンシン、ォキシトシ ン、バソプレシン、アドレノコルチコトロピン、カルシトニン、インスリン、グルカゴン、コ レシストキュン、 β -エンドルフィン、メラノサイト阻害因子、メラノサイト刺激ホルモン、 ガストリンアンタゴニスト、ニューロテンシン、ソマトスタチン、ブノレシン、シクロスポリン、 エンケフアリン、トランスフェリン、アルギニン-グリシン-ァスパラギン酸 (RGD)ペプチド 、甲状腺ホルモン、成長ホルモン、性腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、ァスパラ ギナーゼ、ァノレギナーゼ、ゥリカーゼ、カノレボキシぺプチダーゼ、グノレタミナーゼ、ス 一パーォキシドジスムターゼ、糸且織プラスミノーゲンァクチべ一ター、ストレプトキナー ゼ、インターロイキン、インターフェロン、ムラミルジペプチド、サイモポェチン、顆粒球 コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、トロ ンボポェチン、トリプシンインヒビター、リゾチーム、表皮成長因子 (EGF)、インスリン様 成長因子、神経成長因子、血小板由来成長因子、形質転換成長因子、内皮細胞成 長因子、フイブロブラスト (繊維芽細胞)成長因子、グリア細胞成長因子、サイモシン、 特異抗体 (例えば、抗 EGF受容体抗体等があげられる)等があげられる。
[0024] 核酸としては、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、センスオリゴヌクレオチド等の ODN、遺伝子、 DNA、 RNA、プラスミド、 siRNA等があげられ、該核酸は、核酸の構造 中のリン酸部、エステル部等に含まれる酸素原子等が、例えば硫黄原子等の他の原 子に置換された誘導体を包含する。なお、 siRNAとは、短い二本鎖 RNAのことである。
[0025] 低分子化合物としては、例えばィプシロン-アミノカプロン酸、塩酸アルギニン、 L-ァ スパラギン酸カリウム、トラネキサム酸、硫酸ブレオマイシン、硫酸ビンクリスチン、セフ ァゾリンナトリウム、セファロチンナトリウム、シチコリン、シタラビン、硫酸ゲンタマイシン 、塩酸バンコマイシン、硫酸カナマイシン、硫酸アミカシン等があげられる。
[0026] 糖類としては、例えばコンドロイチン硫酸ナトリウム、へノ《リンナトリウム、デキストラン フルォレセイン等があげられる。
[0027] 高分子化合物としては、例えばポリエチレンスルホン酸ナトリウム、ジビュルエーテ ル-無水マレイン酸共重合体 (DIVEMA)、スチレン無水マレイン酸共重合体-ネオカル チノスタチン結合体 (SMANCS)等があげられる。
[0028] 脂質性ィ匕合物としては、例えばビタミン D、ビタミン E等があげられる。
金属化合物としては、例えばシスブラチン等があげられる。
[0029] 本発明における脂質集合体またはリボソームは、前記の脂質もしくは脂肪酸または それらの誘導体等によって構成され、これら脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導 体は、単独でまたは組み合わせて用いられ、好ましくは組み合わせて用いられる。組 み合わせて用いる場合の組み合わせとしては、例えば水素添カ卩大豆ホスファチジル コリン、ポリエチレングリコール化リン脂質およびコレステロール力も選ばれる 2成分以 上の組み合わせ、ジステアロイルホスファチジルコリン、ポリエチレングリコール化リン 脂質およびコレステロール力 選ばれる 2成分以上の組み合わせ、 EPCと DOTAPの 組み合わせ、 EPC、 DOTAPおよびポリエチレングリコール化リン脂質から選ばれる 2 成分以上の組み合わせ、 EPC、 DOTAP,コレステロールおよびポリエチレングリコー ル化リン脂質力 選ばれる 2成分以上の組み合わせ等があげられる。
[0030] また、リボソームは、必要に応じて、例えばコレステロール等のステロール等の膜安 定化剤、例えばトコフエロール等の抗酸化剤等を含有して 、てもよ 、。
[0031] 本発明における脂質集合体としては、例えば球状ミセル、球状逆ミセル、ソーセ一 ジ状ミセル、ソーセージ状逆ミセル、板状ミセル、板状逆ミセル、へキサゴナル I、へキ サゴナル IIおよび脂質 2分子以上力もなる会合体等があげられる。
[0032] 本発明におけるェマルジヨン粒子としては、例えば脂肪乳剤、非イオン性界面活性 剤と大豆油力もなるェマルジヨン、リピッドエマルジヨン、リピッドナノスフェアー等の水 中油型 (0/W)ェマルジヨンや水中油中水型 (W/0/W)ェマルジヨン粒子等があげられ る。
[0033] 本発明における高分子としては、例えばアルブミン、デキストラン、キトサン、デキス トラン硫酸、 DNA等の天然高分子、例えばポリ- L-リジン、ポリエチレンィミン、ポリアス パラギン酸、スチレンマレイン酸共重合体、イソプロピルアクリルアミド-アクリルピロリド ン共重合体、ポリエチレングリコール修飾デンドリマー、ポリ乳酸、ポリ乳酸ポリグリコ ール酸、ポリエチレングリコールイ匕ポリ乳酸等の合成高分子、またはそれらの塩等が あげられる。 [0034] ここで、高分子における塩は、例えば金属塩、アンモ-ゥム塩、酸付加塩、有機アミ ン付加塩、アミノ酸付加塩等を包含する。金属塩としては、例えばリチウム塩、ナトリウ ム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土 類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等があげられ、アンモ-ゥム塩としては、例えばァ ンモ-ゥム、テトラメチルアンモ -ゥム等の塩があげられ、酸付加塩としては、例えば 塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、および酢酸塩、マレイン酸塩、フ マル酸塩、クェン酸塩等の有機酸塩があげられ、有機アミン付加塩としては、例えば モルホリン、ピぺリジン等の付加塩があげられ、アミノ酸付加塩としては、例えばグリシ ン、フエ-ルァラニン、ァスパラギン酸、グルタミン酸、リジン等の付加塩があげられる
[0035] 本発明における金属コロイドとしては、例えば金、銀、白金、銅、ロジウム、シリカ、力 ルシゥム、アルミニウム、鉄、インジウム、カドミウム、バリウム、鉛等を含む金属コロイド があげられる。
[0036] 本発明における微粒子製剤としては、例えばマイクロスフェアー、マイクロカプセノレ 、ナノクリスタル、リピッドナノパーティクル、高分子ミセル等があげられる。
[0037] 本発明における脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子が、薬物と 、脂質集合体、リボソーム、ェマルジヨン粒子、高分子、金属コロイドおよび微粒子製 剤から選ばれる 1つ以上との複合体を構成成分とする微粒子である場合、該脂質集 合体、リボソーム、ェマルジヨン粒子、高分子、金属コロイドまたは微粒子製剤は、薬 物と静電的に逆の電荷をもつものであるのがより好ましい。ここで、薬物と静電的に逆 の電荷とは、薬物分子内の電荷、分子内分極等に対して静電的引力を生じる電荷、 表面分極等を包含する。脂質集合体、リボソーム、ェマルジヨン粒子、高分子、金属 コロイドまたは微粒子製剤が、薬物と静電的に逆の電荷をもつには、好ましくは、脂 質集合体、リボソーム、ェマルジヨン粒子、高分子、金属コロイドまたは微粒子製剤は 、薬物と静電的に逆の電荷をもつ荷電物質を含有し、より好ましくは、脂質集合体、リ ポソーム、ェマルジヨン粒子、高分子、金属コロイドまたは微粒子製剤は、薬物と静電 的に逆の電荷をもつ脂質 (前記のカチオン性脂質または後記のァ-オン性脂質)を含 有する。 [0038] 薬物と静電的に逆の電荷をもつ脂質集合体、リボソーム、ェマルジヨン粒子、高分 子、金属コロイドまたは微粒子製剤に含有される荷電物質は、カチオン性を呈する力 チオン性物質とァ-オン性を呈するァ-オン性物質とに分類されるが、カチオン性の 基とァ-オン性の基の両方をもつ両性の物質であっても、 pHや、他の物質との結合 等により相対的な陰性度が変化するので、その時々に応じてカチオン性物質または ァ-オン性物質に分類され得る。これら荷電物質は、前記の微粒子の構成成分とし て含有させてもよぐ前記の微粒子の構成成分に加えて用いても構わな 、。
[0039] カチオン性物質としては、例えば前記の微粒子の定義で例示したもののうちのカチ オン性物質 (具体的には、カチオン性脂質 (前記と同義)、カチオン性ステロール、カチ オン性高分子等)、カチオン性界面活性剤、等電点以下の値の pHで、複合体の形成 を行える蛋白質またはペプチド等があげられる。
[0040] カチオン性ステロールとしては、例えば DC- Choi等があげられる。
[0041] カチオン性高分子としては、例えばポリ- L-リジン、ポリエチレンィミン、ポリフエク Kp olyfect),キトサン等があげられる。
[0042] カチオン性界面活性剤としては、例えばアルキルアミン塩、ァシルァミン塩、第四級 アンモニゥム塩、ァミン誘導体等があげられる。具体的には塩ィ匕ベンザルコ-ゥム、ァ シルアミノエチルジェチルァミン塩、 N-アルキルポリアルキルポリアミン塩、脂肪酸ポ リエチレンポリアミド、セチルトリメチルアンモ-ゥムブロミド、ドデシルトリメチルアンモ ユウムブロミド、アルキルポリオキシエチレンァミン、 N-アルキルアミノプロピルァミン、 脂肪酸トリエタノールァミンエステル等があげられる。
[0043] 等電点以下の値の pHで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチドとしては、 その物質の等電点以下の値の pHで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチド であれば、特に限定されない。例えば、アルブミン、ォロソムコイド、グロブリン、フイブ リノ一ゲン、ペプシン、リボヌクレアーゼ T1等があげられる。
[0044] ァ-オン性物質としては、例えば前記の微粒子の定義で例示したもののうちのァ- オン性物質 (具体的には、ァニオン性脂質、ァニオン性高分子等)、ァニオン性界面 活性剤、等電点以上の値の pHで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチド、核 酸等があげられる。 [0045] ァ-オン性脂質としては、例えばホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール 、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸等があげられる。
[0046] ァ-オン性高分子としては、例えばポリアスパラギン酸、スチレンマレイン酸共重合 体、イソプロピルアクリルアミド-アクリルピロリドン共重合体、ポリエチレングリコール修 飾デンドリマー、ポリ乳酸、ポリ乳酸ポリダリコール酸、ポリエチレングリコールイ匕ポリ乳 酸、デキストラン硫酸、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン 硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸、コンドロイチン、デルタマン硫酸、へパラン硫酸、へパリ ン、ケタラン硫酸、デキストランフルォレセインァ-ォニック等があげられる。
[0047] ァ-オン性界面活性剤としては、例えばァシルサルコシン、アルキル硫酸ナトリウム 、アルキルベンゼンスルホン酸塩、炭素数？〜 22の脂肪酸ナトリウム等があげられる。 具体的にはドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デォ キシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム等があげられる。
[0048] 等電点以上の値の pHで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチドとしては、 その物質の等電点以上の値の pHで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチド であれば、特に限定されない。例えば、アルブミン、ォロソムコイド、グロブリン、フイブ リノ一ゲン、ヒストン、プロタミン、リボヌクレアーゼ、リゾチーム等があげられる。
[0049] ァ-オン性物質としての核酸としては、例えば DNA、 RNA、プラスミド、 siRNA、 ODN 等があげられ、生理活性を示さないものであれば、どのような長さ、配列のものであつ てもよい。
[0050] 本発明における脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子は、公知 の製造方法またはそれに準じて製造することができ、 V、かなる製造方法で製造された ものであってよい。例えば、微粒子の 1つであるリボソームを構成成分とする微粒子の 製造には、公知のリボソームの調製方法が適用できる。公知のリボソームの調製方法 としては、例えばバンガム (Bangham)らのリボソーム調製法 ["ジャーナル ·ォブ ·モレキ ユラ一'バイオロジー (J. Mol. Biol.)", 1965年，第 13卷， p.238- 252参照]、エタノール 注入法 ["ジャーナル'ォブ'セル'バイオロジー 0. Cell Biol.)", 1975年，第 66卷， p.62 1-634参照]、フレンチプレス法 ["エフィービーエス'レターズ（FEBS Lett.)", 1979年 ,第 99卷， P.210- 214参照]、凍結融解法 ["アーカイブス'ォブ 'バイオケミストリー 'ァ ンド 'バイオフィジックス (Arch. Biochem. Biophys.)", 1981年，第 212卷， p.186- 194参 照]、逆相蒸発法 ["プロシーディングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイ エンス.ユナイテッド.ステイツ.ォブ.アメリカ (proc. Natl. Acad. Sci. USA)", 1978年， 第 75卷， p.4194-4198参照]、 pH勾配法 (例えば特許第 2572554号公報、特許第 2659 136号公報等参照)等があげられる。リボソームの製造の際にリボソームを分散させる 溶液としては、例えば水、酸、アルカリ、種々の緩衝液、生理的食塩液、アミノ酸輸液 等を用いることができる。また、リボソームの製造の際には、例えばクェン酸、ァスコル ビン酸、システィン、エチレンジァミン四酢酸 (EDTA)等の抗酸化剤、例えばグリセリン 、ブドウ糖、塩ィ匕ナトリウム等の等張化剤等の添加も可能である。また、脂質等を例え ばエタノール等の有機溶媒に溶解し、溶媒留去した後、生理食塩水等を添加、振とう 撹拌し、リボソームを形成させることによつてもリボソームを製造することができる。
[0051] リボソームの平均粒子径は、所望により自由に選択できる。平均粒子径を調節する 方法としては、例えばエタストルージョン法、大きな多重膜リボソーム (MLV)を機械的 に粉砕 (具体的にはマントンゴゥリン、マイクロフルイダィザ一等を使用)する方法 [ミュ ラー (R. H. Muller)、ベ-タ (S. Benita)、ボーム . Bohm)編著,"ェマルジヨン 'アンド' ナノサスペンジョンズ 'フォ^ ~ ·ザ'フォーミュレーシヨン'ォブ ·ポアリ ~ ·ソラブノレ ·ドラッ グズ (Emulsion ana Nanosuspensions for tne Formulation of Poorly soluble Drugsノ , ドイツ,サイエンティフィック 'パブリツシヤーズ 'スチュットガルト (Scientific Publishers St uttgart),1998年 ,ρ.267-294参照]等があげられる。
[0052] また、脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子を構成する、例えば 薬物、脂質集合体、リボソーム、ヱマルジヨン粒子、高分子、金属コロイド、微粒子製 剤等力も選ばれる 2つ以上を組み合わせた複合体 (具体的には、例えばカチオン性 脂質を含有するリボソームまたは脂質集合体と核酸との複合体、ポリ- L-リジン等の力 チオン性高分子を含有する高分子と核酸との複合体、ホスファチジン酸等のァニォ ン性脂質を含有するリボソームまたは脂質集合体と蛋白質との複合体、スチレンマレ イン酸等のァニオン性高分子を含有する高分子と蛋白質との複合体、カチオン性脂 質を含有するリボソームまたは脂質集合体と蛋白質との複合体、ポリ- L-リジン等の力 チオン性高分子を含有する高分子と蛋白質との複合体等があげられる)の製造方法 は例えば水中で薬物と脂質集合体、リボソーム、高分子等とを混合するだけの製造 方法でもよく、この際、必要であればさらに整粒工程や無菌化工程等を加えることも できる。また、複合体形成を例えばアセトン、エーテル等種々の溶媒中で行うことも可 能である。例えば、核酸と脂質とをエタノール等の有機溶媒に溶解し、溶媒留去した 後、生理食塩水等を添加、振とう撹拌し、核酸複合体を形成させることもできる。別の 複合体の形成方法としては、例えば、水中でカチオン性物質とポリエチレングリコー ル化リン脂質 (具体的にはポリエチレングリコール-ホスファチジルエタノールァミン (よ り具体的には 1,2-ジステアロイル -sn-グリセ口- 3-ホスホエタノールァミン- N -[^トキシ（ ポリエチレングリコール)- 2000](PEG- DSPE)等)、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 60、 クレモフォアィーエル (CREMOPHOR EL)等)等でリボソームを調製し、その後、例え ば核酸を添加し、さらに例えばァ-オン性高分子を添加して、多重複合体とすること も可能である。
[0053] 本発明における脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子のうち、脂 質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体で被覆された微粒子は、公知の製造方法ま たはそれに準じて製造することができ、 V、かなる製造方法で製造されたものであって よい。例えば、前記の薬物、脂質集合体、リボソーム、ェマルジヨン粒子、高分子、金 属コロイド、微粒子製剤等を構成成分とする微粒子を、脂質もしくは脂肪酸またはそ れらの誘導体で被覆する方法としては、例えば国際公開第 02/28367号パンフレット に記載の方法等があげられる。
[0054] また、本発明における脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子の 大きさは、平均粒子径が 300nm以下であるのが好ましぐ 200nm以下であるのがより好 ましぐ具体的には、例えば注射可能な大きさであるのが好ましい。
[0055] 本発明における極性有機溶媒としては、特に制限はないが、好ましくは表面修飾剤 が可溶な極性有機溶媒があげられる。例えばメタノール、エタノール、 n-プロパノー ル、 2-プロパノール、 n-ブタノール、 2-ブタノール、 tert-ブタノール等のアルコール、 グリセリン、エチレングリコーノレ、プロピレングリコール等のグリコール、ポリエチレング リコール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エス テルまたはエーテル等のポリアルキレングリコール等があげられ、好ましくはエタノー ルがあげられる。
[0056] 本発明における水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素 誘導体としては、例えば糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子力 選ばれる 1っ以 上の物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体等があげられ 、好ましくは、糖脂質、または水溶性高分子の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体があ げられ、より好ましくは、水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体があげられ 、さらに好ましくはポリエチレングリコールイ匕脂質、ポリグリセリンィ匕脂質、ポリエチレン グリコールアルキルエーテル、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、ポリ エチレングリコール脂肪酸エステルおよびポリグリセリン脂肪酸エステルがあげられる
[0057] 本発明における水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素 誘導体は、分子の一部が、脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子 の構成成分と例えば疎水性親和力、静電的相互作用等で結合する性質をもつこと が好ましぐ該微粒子に含まれる脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体と例えば 疎水性親和力、静電的相互作用等で結合する性質をもつことがより好ましい。
[0058] 水溶性物質の脂質誘導体としては、水溶性物質と、例えば前記の脂質またはその 誘導体とが結合してなるもの等があげられる。また、水溶性物質の脂肪酸誘導体とし ては、水溶性物質と、例えばステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸等 の脂肪酸とが結合してなるものがあげられる。また、水溶性物質の脂肪族炭化水素 誘導体としては、水溶性物質と、例えば長鎖脂肪族アルコール、ポリオキシプロピレ ンアルキル、グリセリン脂肪酸エステルのアルコール性残基等とが結合してなるもの があげられる。
[0059] 糖、ペプチドまたは核酸の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導 体としては、前記の水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水 素誘導体の水溶性物質部分が、例えばショ糖、ソルビトール、乳糖等の糖、例えば力 ゼイン由来ペプチド、卵白由来ペプチド、大豆由来ペプチド、ダルタチオン等のぺプ チド、または例えば DNA、 RNA、プラスミド、 siRNA、 ODN等の核酸の脂質誘導体、脂 肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体があげられ、より具体的に糖の脂質誘導 体としては、例えば前記のグリセ口糖脂質、前記のスフインゴ糖脂質等の糖脂質等が あげられる。
[0060] 水溶性高分子の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体として は、前記の水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体 の水溶性物質部分が、例えばポリエチレングリコール、ポリグリセリン、ポリエチレンィ ミン、ポリビュルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、オリゴ糖、デキストリン 、水溶性セルロース、デキストラン、コンドロイチン硫酸、ポリグリセリン、キトサン、ポリ ビュルピロリドン、ポリアスパラギン酸アミド、ポリ- L-リジン、マンナン、プルラン、オリゴ グリセロール等またはそれらの誘導体であるものがあげられ、より好ましくは、ポリェチ レンダリコール誘導体、ポリグリセリン誘導体等があげられ、さらに好ましくは、ポリエ チレングリコール誘導体であるものがあげられる。
[0061] ポリエチレングリコール誘導体の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水 素誘導体としては、例えばポリエチレングリコールイ匕脂質 (具体的にはポリエチレング リコール-ホスファチジルエタノールァミン (より具体的には PEG- DSPE等)、ポリオキシ エチレン硬化ヒマシ油 60、クレモフォアィーエル等)、ポリエチレングリコールアルキル エーテル、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル (具体的にはモノォレイ ン酸ポリオキシエチレンソルビタン等)、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル等があ げられ、より好ましくは、ポリエチレングリコールイ匕脂質があげられる。
[0062] ポリグリセリン誘導体の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体 としては、例えばポリグリセリンィ匕脂質 (具体的にはポリグリセリン-ホスファチジルエタ ノールァミン等)、ポリグリセリン脂肪酸エステル等があげられ、より好ましくは、ポリダリ セリン化脂質があげられる。
[0063] 本発明における両親媒性物質は、用いる水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導 体または脂肪族炭化水素誘導体よりも、分子内の親水性部と疎水性部の、例えば疎 水性親和力、静電的相互作用等の差が小さいものであり、例えばリン脂質 (前記と同 義)、グリセ口糖脂質 (前記と同義)、スフインゴ糖脂質 (前記と同義)、コレステロール (前 記と同義)、カチオン性脂質 (前記と同義)、ァニオン性脂質 (前記と同義)、界面活性剤 (前記と同義)、水溶性高分子の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素 誘導体 (前記と同義)があげられ、さらに好ましくはリン脂質、コレステロール、界面活 性剤があげられる。
[0064] 本発明の水溶性物質で表面修飾された脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体 を含む微粒子の製造は、極性有機溶媒を含有する液中に、脂質もしくは脂肪酸また はそれらの誘導体を含む微粒子を分散状態で存在させ、水溶性物質の脂質誘導体 、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体からなる表面修飾剤を溶解または分 散状態で存在させる工程 (工程 A)を含む製造方法で製造することができ、該微粒子 は分散液の状態で得られる。また、工程 Aにおいて、該極性有機溶媒を含有する液 中に、さらに両親媒性物質を溶解または分散状態で存在させることが好ましい。本発 明にお 、て、脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子が分散すると は、懸濁、乳濁またはェマルジヨン化、好ましくは懸濁している状態のことであり、大 部分が分散して、残りの部分が溶解している状態または一部が沈殿している状態も 包含するが、できるだけ全部が分散していることが好ましい。また、表面修飾剤または 両親媒性物質が分散するとは、凝集体またはミセル等を形成して懸濁、乳濁もしくは ェマルジヨン化、好ましくは乳濁もしくはェマルジヨン化している状態のことであり、大 部分が凝集体またはミセル等を形成して乳濁もしくはェマルジヨンィ匕し、残りの部分 が溶解している状態、大部分が凝集体またはミセル等を形成して懸濁、乳濁もしくは ェマルジヨン化、好ましくは乳濁もしくはェマルジヨンィ匕し、残りの部分が沈殿している 状態等を包含する。工程 Aにおいて、分散させるために混合する場合には、特段の 装置を必要としないが、種々の工業的に許容しうる混合方法を用いてもよい。混合方 法としては、タンクやバイアル等の貯蔵容器内での混合、輸送管ゃ流路内での混合 等があげられる。
[0065] 工程 Aにおける極性有機溶媒の割合は、脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導 体を含む微粒子が分散され、表面修飾剤が溶解または分散される条件さえ満たして V、れば特に限定されるものではな 、が、脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を 含む微粒子が分散され、表面修飾剤が溶解または乳濁もしくはェマルジヨン化して 分散される条件が好ましぐ用いる溶媒や脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体 を含む微粒子、表面修飾剤の種類等により異なるが 80vol%以下であるのが好ましぐ より好ましくは l〜60vol%、さらに好ましくは 5〜55vol%、最も好ましくは 30〜40vol%であ る。
[0066] 本発明における極性有機溶媒と、脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含 む微粒子、表面修飾剤および両親媒性物質との組み合わせは特に限定されるもの ではないが、極性有機溶媒を含む液に対して、該微粒子が分散し、かつ極性有機溶 媒に対して、表面修飾剤および両親媒性物質が可溶であることが好ましい。本発明 において、表面修飾剤および両親媒性物質が極性有機溶媒に対して可溶とは、表 面修飾剤および両親媒性物質が極性有機溶媒に溶解する性質をもつ場合、可溶ィ匕 剤等を用いることにより表面修飾剤および両親媒性物質が極性有機溶媒に溶解する 性質をもつ場合、表面修飾剤および両親媒性物質が極性有機溶媒中で凝集体また はミセル等を形成して乳濁もしくはェマルジヨンィ匕し得る性質をもつ場合等を包含し、 表面修飾剤および両親媒性物質が極性有機溶媒に溶解する性質をもつ場合である ことが好ましい。
[0067] それぞれの成分の使用量によらず本方法を用いることができる力 工程 Aにおける 極性有機溶媒含有水溶液中の脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微 粒子の濃度は、 1 μ g/mL〜lg/mLとすることが好ましぐ 0.1〜500mg/mLとすることが より好ましい。また、用いられる表面修飾剤の濃度は、 1 g/mL〜lg/mLとすることが 好ましぐ 0.1〜400mg/mLとすることがより好ましい。また、本発明の水溶性物質で表 面修飾された脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子と該表面修飾 剤の割合は、重量比で 1000:1〜1:10であるのが好ましぐ 100:1〜1:1であるのがより 好ましぐ 10:1〜2:1であるのがさらに好ましい。また、本発明の両親媒性物質と表面 修飾剤の重量比が、 10:1〜1:100であるのが好ましぐ 5:1〜1:10であるのがより好まし い。なお、水溶性物質で表面修飾された脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体 を含む微粒子と該表面修飾剤の割合が、表面修飾剤の安全性やコスト等の理由で、 重量比で 100:1〜10:1が好ましいことがあり、その場合、両親媒性物質と表面修飾剤 の重量比が、 1:2〜1:10であるのが好ましい。
[0068] 本発明の製造方法によって得られる水溶性物質で表面修飾された脂質もしくは脂 肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子の大きさは、平均粒子径が 300nm以下であ るのが好ましぐ 200應以下であるのがより好ましぐ具体的には、例えば注射可能な 大きさであるのが好ましい。
[0069] 本発明の製造方法を用いて製造できる水溶性物質で表面修飾された脂質もしくは 脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子は、例えば血液成分等の生体成分 (例え ば血液、消化液等)中での薬剤の安定化、副作用の低減、腫瘍等の標的臓器への 薬剤集積性の増大、経口や経粘膜での薬剤の吸収の改善等を目的とする製剤とし て使用できる。
[0070] 本発明の製造方法を用いて製造できる水溶性物質で表面修飾された脂質もしくは 脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子は、被修飾微粒子の構成成分の少なくと も 1つが薬物である場合、例えば、腫瘍または炎症部位への薬物含有キャリア一とし て該微粒子を投与することで、薬物の腫瘍または炎症部位への送達ができ、薬物が 抗腫瘍薬である場合、例えば、腫瘍の治療剤として該微粒子を投与することで、腫瘍 の治療を行うことができ、また薬物が抗炎症薬である場合、例えば、炎症の治療剤と して該微粒子を投与することで、炎症の治療を行うことができる。また、血管新生が亢 進する組織または臓器は、本発明の製造方法を用いて製造できる水溶性物質で表 面修飾された脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子が良好に送達 ができる部位の 1つとしてあげられ、被修飾微粒子の構成成分の少なくとも 1つが該組 織または臓器における疾患の治療薬である場合、該微粒子を該疾患の治療薬として 投与することで、該疾患の治療を行うことができる。
[0071] 本発明の製造方法を用いて製造できる水溶性物質で表面修飾された脂質もしくは 脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子を使用する場合、上述の方法により調製 した水溶性物質で表面修飾された脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む 微粒子の分散液をそのまま例えば注射剤等の形態として用いることも可能であるが、 該分散液から例えば濾過、遠心分離等によって溶媒を除去して使用することも、該 分散液、または例えばマン-トール、ラタトース、トレハロース、マルトース、グリシン等 の賦形剤を加えた該分散液を凍結乾燥して使用することもできる。
[0072] 注射剤の場合、本発明の水溶性物質で表面修飾された脂質もしくは脂肪酸または それらの誘導体を含む微粒子の分散液またはその溶媒を除去したものもしくはそれ を凍結乾燥したものに、例えば水、酸、アルカリ、種々の緩衝液、生理的食塩液、アミ ノ酸輸液等を混合して注射剤を調製することが好ましい。また、例えばクェン酸、ァス コルビン酸、システィン、 EDTA等の抗酸化剤、グリセリン、ブドウ糖、塩ィ匕ナトリウム等 の等張化剤等を添加して注射剤を調製することも可能である。また、例えばグリセリン 等の凍結保存剤を加えて凍結保存することもできる。
[0073] また、本発明の水溶性物質で表面修飾された脂質もしくは脂肪酸またはそれらの 誘導体を含む微粒子は、適当な賦形剤等と共に造粒、乾燥する等して例えばカプセ ル剤、錠剤、顆粒剤等の経口用製剤に加工してもよい。
[0074] 本発明の製造方法には、キットを用いることも可能である。キットの構成としては、例 えば、脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子、水溶性物質の脂肪 酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体からなる表面修飾剤、極性有機溶媒を含有 する液力 なる構成等があげられる。例えば、少容量の容器に、本発明の製造方法 によって水溶性物質で表面修飾された脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を 含む微粒子を調製するための、脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微 粒子、水溶性物質の脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体からなる表面修飾 剤、極性有機溶媒を含有する液、好ましくはさらに両親媒性物質等をそれぞれ充填 し、混合することにより水溶性物質で表面修飾された脂質もしくは脂肪酸またはそれ らの誘導体を含む微粒子を調製することができる。該キットは、その構成成分を混合 する工程にぉ 、て例えば加熱しなければならな 、等の制約がな 、ので、キットとして の簡便性が高いという利点もある。キットの各構成成分は溶液状態、凍結乾燥状態 等のいずれの形態で供給されてもよい。また、各構成成分はあらかじめ組み合わせ て供給されてもよぐ脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子と水溶 性物質の脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体からなる表面修飾剤は別々 にあり、該表面修飾剤に両親媒性物質が組み合わされて 、ることが好ま 、。
[0075] また、本発明の製造方法は、加熱する工程を含んで 、てもよ 、。ただし、例えば蛋 白質、核酸等の薬物等を構成成分とする製剤においては、短時間の加熱でもその活 性に大きな影響を及ぼす可能性があるので、該薬物等の活性に影響を及ぼさな 、 温度以下で、かつ短時間加熱するのが好ましい。短鎖の RNAが相補的に二本鎖を 形成した状態で存在している siRNAは、 60度以上に加熱すると一本鎖に解離し、そ の後冷却しても、一本鎖の RNAや、非特異的に 2本鎖を形成した不完全な相補性の RNAが存在してしまうことがあり、そのような RNAは分解酵素による分解を受けやすい 。また、一本鎖となった siRNAは mRNAを認識する RISC複合体を形成できないと考え られている。
[0076] 本発明の製造方法では、加熱する工程を含まなくても水溶性物質で表面修飾され た脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子を調製することができ、例 えば蛋白質や核酸等の熱によって影響を受けやすい薬物等を含有する製剤におい ても、該薬物等の活性に影響を及ぼさない温度以下で、該微粒子を製造できるという 利点がある。また、極性有機溶媒が共存することで、例えばリボソームの膜形成物質 等の相転移が低温でも起こり易くなり、相転移温度の高い脂質もしくは脂肪酸または それらの誘導体を含む微粒子や、臨界ミセル濃度の低!、表面修飾剤を用いる場合 であっても、加熱する工程を経ずに水溶性物質で表面修飾された脂質もしくは脂肪 酸またはそれらの誘導体を含む微粒子を製造できるという利点もある。また、本発明 の製造方法においては、水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭 化水素誘導体からなる表面修飾剤とともに両親媒性物質を溶解または分散状態で 存在させることが好ましいが、両親媒性物質は、水溶性物質で表面修飾された脂質 もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子の収率等の製造性をさらに向上 させる作用や、水溶性物質で表面修飾された脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘 導体を含む微粒子の血中滞留性等の機能性や安定性を向上させる作用もある。
[0077] 次に、実施例により、本発明を具体的に説明する。実施例として、脂質もしくは脂肪 酸またはそれらの誘導体を含む微粒子がリボソームであり、極性有機溶媒がエタノー ルであり、両親媒性物質カ^ン脂質であり、表面修飾剤がポリエチレングリコールイ匕 脂質である、水溶性物質で表面修飾された微粒子の製造方法および脂質もしくは脂 肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子がリボソームであり、極性有機溶媒がェタノ ールであり、両親媒性物質カ^ン脂質であり、表面修飾剤がポリエチレングリコール 脂肪酸エステルである、水溶性物質で表面修飾された微粒子の製造方法を示すが、 本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 [0078] 参考例 1
被修飾微粒子の調製
デキストランフルォレセインァ-ォニック (FD、モレキュラープローブス社製） 5mg、 D OTAP (アバンチポーラルリピッズ社製、以下同様） 30mgおよび PEG- DSPE (日本油脂 製、以下同様) 12mgを、水 ImL (注射用水、大塚製薬製、以下同様)に分散させた。得 られた分散液を、孔径 0.4 mのポリカーボネートメンブレン (ワットマン製、以下同様） に 10回、孔径 0.1 mのポリカーボネートメンブレン (ワットマン製、以下同様)に 10回通 した。得られた分散液の 500 Lと、 EPC (日本油脂製、以下同様) 60mg、 PEG- DSPE 1 2.5mgおよびエタノール/水混液 (8:5) 2000 Lとを混合して、被修飾微粒子の分散液 を得た。
[0079] [表 1] 第 1表
被修飾微粒子の組成
FD 2. 5 mg
D0TAP 15 mg
PEG- DSPE 18. 5 mg
EPC 60 mg
エタノール/水混液（およそ 2500 M L 実施例 1
[0080] 参考例 1での被修飾微粒子の分散液を調製した後、水を滴下してエタノール濃度 をおよそ 40vol%とした。得られた液に、表面修飾剤として PEG- DSPE 7.5mgをエタノー ル /水混液 (2:3) 150 Lに分散させたものを混合した。さらに適量の水を滴下してェ タノール濃度をおよそ 5vol%とし、超遠心分離 (1時間、 110,000 X g、 25°C)を行って上 清を除き、リン酸緩衝食塩水 (PBS)を加えて製剤を得た。
実施例 2
[0081] 実施例 1における表面修飾剤を PEG-DSPE 25mgとし、同様に製剤を得た。
実施例 3
[0082] 実施例 1における表面修飾剤を PEG- DSPE 7.5mgとし、両親媒性物質として EPC 7. 5mgを表面修飾剤とともに用いて、同様に製剤を得た。
実施例 4
[0083] 実施例 1における表面修飾剤を PEG- DSPE 25mgとし、両親媒性物質として EPC 25 mgを表面修飾剤とともに用いて、同様に製剤を得た。
実施例 5
[0084] 実施例 1における表面修飾剤を PEG- DSPE 7.5mgとし、両親媒性物質として EPC 22
.5mgを表面修飾剤とともに用いて、同様に製剤を得た。
[0085] 比較例 1
参考例 1の被修飾微粒子の分散液を調製した後、水を滴下してエタノール濃度を およそ 5vol%とし、超遠心分離 (1時間、 110,000 X g、 25°C)を行って上清を除き、 PBSを 加えて製剤とした。
[0086] 比較例 2
参考例 1の被修飾微粒子の分散液を調製した後、水を滴下してエタノール濃度を およそ 5vol%とし、超遠心分離 (1時間、 110,000 X g、 25°C)を行って上清を除き、 PEG- DSPE 12.5mgおよび EPC 12.5mgを含む PBS 1440 μ Lを加えて製剤とした。
[0087] 比較例 3
参考例 1の被修飾微粒子の分散液を調製した後、水を滴下してエタノール濃度を およそ 5vol%とし、超遠心分離 (1時間、 110,000 X g、 25°C)を行って上清を除き、 PBSを 加えて EPC濃度を 24mg/mLに調整し、 70°Cで 1分間加熱した。得られた液の lmLに、 PEG- DSPE 5mgを加えて 70°Cで 2分間加熱し製剤とした。
[0088] 試験例 1
実施例 1〜5および比較例 1〜3で得られた各製剤について、以下の方法に従って、 平均粒子径、 FDおよび EPCの回収率、ならびに血中動態について検討を行った。結 果を第 2表および第 1図に示す。
[0089] 平均粒子径
動的光散乱法 (DLSX使用機器: A model ELS-800、大塚電子、以下同様)で、製 剤中の水溶性物質で表面修飾された微粒子の平均粒子径を測定した。
[0090] FDおよび EPCの回収率 各製剤を PBSで、総脂質濃度が 30mg/mLになるように希釈した。さらに PBSで 1000 倍希釈し、希釈後の各 50 μ Lに、 10w/v%トライトンエックス -100(TritonX- 100、和光純 薬製、以下同様) 50 Lおよび PBS 400 Lをそれぞれ加え、ボルテックスミキサーで 攪拌した。また、各実施例および各比較例で得られた超遠心上清を PBSで 10倍希釈 し、希釈後の各 50 μ Lに、 10w/v%TritonX- 100 50 μ Lおよび PBS 400 μ Lをそれぞれ 加え、ボルテックスミキサーで攪拌した。それぞれ 100 /z Lを 96穴マイクロプレートにと り、蛍光プレートリーダー (アルボエスエックス- 4(ARVOsx- 4)、ヮラック (Wallac)社製、 以下同様)を使用して励起波長 485nmおよび蛍光波長 530nmでの蛍光強度を測定し た。一方、 1、 0.5および 0.25 g/mLの各 FD- PBSの蛍光強度を測定し、検量線を得 た。検量線力も各製剤中の FD濃度を求めた。一方、各製剤中の EPC濃度は、リン脂 質 C-テストヮコー (和光純薬製)を用いて測定することにより求めた。
各製剤における FD回収率および EPC回収率は、下記式 (1)および (2)で算出した。
[0091] [数 1]
FDの回収率（！） = Α,/ ίΑ, + Β!) X 100 (1)
Α!： 製剤中の FD含量 g)
= 製剤中の FD濃度（ μ g/mL) X製剤の体積（ ）
Bj：上淸中の FD含量 g)
= 上清中の FD濃度（ii g/niL) X上清の体積（ ）
[0092] [数 2]
EPCの回収率（％) = Aj/ (AZ + Bz) X 100 (2)
A2： 製剤中の EPC含量 g)
= 製剤中の EPC濃度 g/mL) X製剤の体積 (niL)
B2：上淸中の EPC含量 g)
= 上清中の EPC濃度 g/mL) X上清の体積 (niL)
[0093] 血中動態評価
各製剤を、 PBSで総脂質濃度が 5mg/mLになるように希釈し、ラットに対して、投与 量は脂質量/ラット体重比で 10mg/kgとして投与した。投与後 1分、 10分、 30分、 1時間 、 3時間、 6時間および 24時間に採血し、遠心操作を行って血漿を採取した。血漿中 の FDを定量するため、血漿各 50 μ Lに、 10w/v%TritonX- 100 50 μ Lおよび PBS 400 μ Lを加え、ボルテックスミキサーで攪拌した。その 100 Lを 96穴マイクロプレートにと り、 ARVOsx-4を使用して励起波長 485nmおよび蛍光波長 530nmでの蛍光強度を測 定した。一方、 1、 0.5および 0.25 g/mLの各 FD- PBSの蛍光強度を測定し、検量線を 得た。検量線力も各サンプル中の FD濃度を求めた。ラット体重 100gあたりの血漿量を 7.8mLと計算し、投与量に対する血中残存率 (%)を算出するとともに、台形法で AUC
0-2 μ g'min/dose) 算出した。
4h
[0094] [表 2]
第 2表
PEG-DSPE EPC 平均粒子径 回収率 «) AUC
vmg) (mg) FD EPC g -： min/dose
実施例 1 7. 5 0 122 95 90 195
実施例 Z 25 0 144 76 82 385
実施例 3 7. 5 7. 5 133 87 90 363
実施例 4 25 25 146 87 87 464
実施例 5 7. 5 22. 5 177 94 94 315
比較例 1 0 0 138 93 93 74
比較例 2 12. 5 12. 5 141 93 92 90
比較例 3 12. 5 0 194 94 90 355
[0095] 第 2表によると、実施例 1〜5で得られた製剤は、比較例 1および比較例 2で得られた 製剤と比較し、表面修飾剤 (PEG-DSPE)の添加量に応じて高 ヽ血中滞留性を示し、 比較例 3で得られた製剤と比較し、同等の血中滞留性を示した。また、表面修飾剤に 両親媒性物質 (EPC)を共存させた実施例 3および 4で得られた製剤は、それぞれ両親 媒性物質を用いていない実施例 1および 2で得られた製剤と比較し、より高い血中滞 留性を示した。本発明の製造方法は、加熱しなければならない等の制約がない簡便 な製造方法であるにも関わらず、水中で室温で製造する従来法よりも優れ、水中で 加熱する従来法と同等以上の水溶性物質で表面修飾された脂質もしくは脂肪酸また はそれらの誘導体を含む微粒子が得られることが明らかとなった。
実施例 6
[0096] 参考例 1で被修飾微粒子の分散液を調製した後、水を滴下してエタノール濃度を およそ 2.5vol%とした。得られた液に、表面修飾剤として PEG- DSPE 12.5 mgおよび両 親媒性物質として EPC 12.5 mgをエタノール/水混液 (1:39) 2400 Lに分散させたも のを混合した。得られた液の超遠心分離 (1時間、 110,000 X g、 25°C)を行って上清を 除き、 PBSを加えて製剤を得た。
実施例 7
[0097] 参考例 1で被修飾微粒子の分散液を調製した後、水を滴下してエタノール濃度を およそ 5vol%とした。得られた液に、表面修飾剤として PEG- DSPE 12.5 mgおよび両 親媒性物質として EPC 12.5 mgをエタノール/水混液 (1:19) 400 に分散させたも のを混合した。得られた液の超遠心分離 (1時間、 110,000 X g、 25°C)を行って上清を 除き、 PBSを加えて製剤を得た。
実施例 8
[0098] 参考例 1で被修飾微粒子の分散液を調製した後、水を滴下してエタノール濃度を およそ 30vol%とした。得られた液に、表面修飾剤として PEG- DSPE 12.5 mgおよび両 親媒性物質として EPC 12.5 mgをエタノール/水混液 (3 :7) 200 に分散させたもの を混合した。さらに適量の水を滴下してエタノール濃度をおよそ 5vol%とし、超遠心分 離 (1時間、 110,000 X g、 25°C)を行って上清を除き、 PBSを加えて製剤を得た。
実施例 9
[0099] 参考例 1で被修飾微粒子の分散液を調製した後、 PEG- DSPE 12.5 mgおよび両親 媒性物質として EPC 12.5 mgをエタノール/水混液 (1:1)200 Lに分散させたものを 混合した。さらに適量の水を滴下してエタノール濃度をおよそ 5vol%とし、超遠心分離 (1時間、 110,000 X g、 25°C)を行って上清を除き、 PBSをカ卩えて製剤を得た。
[0100] 試験例 2
実施例 6〜9で得られた製剤について、試験例 1と同様に、平均粒子径、 FDおよび E PCの回収率、ならびに血中動態について検討を行った。結果を第 3表および第 2図 に示す。
[0101] [表 3] 第 3表
エタノール濃度 平均粒子径 回収率 (» AUC
(およその vol%) (皿) FD EPC
実施例 6 2. 5 159 91 80 304
実施例 7 5 137 94 94 273
実施例 S 30 156 91 87 324
実施例 9 50 147 94 95 349
比較例 2 0 141 93 92 90
比較例 3 0 194 94 90 355
[0102] 第 3表によると、実施例 6〜9で得られた製剤は、比較例 2で得られた製剤と比較し、 高い血中滞留性を示し、比較例 3で得られた製剤と比較し、同等の血中滞留性を示 した。
[0103] 参考例 2
被修飾微粒子の調製
DOTAPおよび PEG- DSPEをそれぞれ 30、 12 mg/mLの濃度で水に分散させた。得 られた液を、孔径 0.4 μ mのポリカーボネートメンブレンに 10回、孔径 0.1 μ mのポリ力 ーボネートメンブレンに 10回通した。得られた分散液 500 Lと、 15mg/mL ODN (フル ォレセインイソチオシァネートラベル化ホスフォロチォエート型オリゴデォキシリボヌク レオチド (配列： (5')CCT CTT ACC TCA G(3')、塩基数 13、分子量 4573.57、サイメデ ィァ社製)水溶液 250 μ Lを混合し、さらにエタノール 1000 μ L、ならびに EPCおよび PE G- DSPEをそれぞれ 120、 25mg/mLの濃度で含むエタノール溶液 50 μ Lを混合して、 被修飾微粒子の分散液を得た。
実施例 10
[0104] 参考例 2で被修飾微粒子の分散液を調製した後、水を滴下してエタノール濃度を およそ 50%とした。得られた液に、表面修飾剤として PEG- DSPE 12.5 mgおよび両親 媒性物質として EPC 2.5 mgを含む 50%エタノール水分散液 1000 Lを加え、さらに適 量の水を滴下してエタノール濃度を 5%とし、超遠心分離 (1時間、 110,000 X g、 25°C) を行って上清を除き、 PBSを加えて製剤を得た。
実施例 11 [0105] 実施例 10における表面修飾剤を PEG- DSPE 12.5 mgとし、両親媒性物質を EPC 12.
5 mgとし、同様に製剤を得た。
[0106] 試験例 3
実施例 10および 11で得られた各製剤について、以下の方法に従って、平均粒子径 、 ODNおよび EPCの回収率、ならびに血中動態について検討を行った。結果を第 4 表および第 3図に示す。
[0107] 平均粒子径
DLSで、製剤中の水溶性物質で表面修飾された微粒子の平均粒子径を測定した。
[0108] ODNおよび EPCの回収率
各製剤を PBSで、総脂質濃度が 30mg/mLになるように希釈した。さらに PBSで 1000 倍希釈し、希釈後の各 50 μ Lに、 10w/v%TritonX- 100 50 μ Lおよび PBS 400 μ Lをそ れぞれ加え、ボルテックスミキサーで攪拌した。また、各実施例で得られた超遠心上 清を PBSで 10倍希釈し、希釈後の各 50 μ Lに、 10w/v%TritonX-100 50 μ Lおよび PBS 400 Lをそれぞれ加え、ボルテックスミキサーで攪拌した。それぞれ 100 Lを 96穴 マイクロプレートにとり、 ARVOsx-4を使用して励起波長 485nmおよび蛍光波長 530nm での蛍光強度を測定した。一方、 1.5、 1.5/4、 1.5/42、 1.5/43、 1.5/44および 1.5/45 /z g /mLの各 ODN-PBSの蛍光強度を測定し、検量線を得た。検量線力も各製剤中の OD N濃度を求めた。一方、各製剤中の EPC濃度は、リン脂質 C-テストヮコーを用いて測 定することにより求めた。
各製剤における ODN回収率および EPC回収率は、下記式 (3)および (4)で算出した
[0109] [数 3]
0DNの回収率（¾) = A3/ (A3 + B3) X 100 (3)
A3： 製剤中の ODN含量 g)
= 製剤中の ODN濃度 g/mL) X製剤の体積 ( ）
B3：上情中の 0DN含量 §)
= 上淸中の ODN濃度 g/mL) X上清の体積 ( ）
[0110] [数 4] EPCの回収率（％) = A4/ (A4 + B4) X 100 (4)
A4： 製剤中の EPC含量 g)
= 製剤中の EPC濃度 g/mL) X製剤の体積 (niL)
B4：上淸中の EPC含量（ g)
= 上清中の EPC濃度 g/mL) X上清の体積 (niL)
[0111] 血中動態評価
各製剤を、 PBSで総脂質濃度が 5mg/mLになるように希釈し、ラットに対して、投与 量を脂質量/ラット体重比で 10mg/kgとして投与した。投与後 1分、 10分、 30分、 1時間 、 3時間、 6時間および 24時間に採血し、遠心操作を行って血漿を採取した。血漿中 の ODNを定量するため、血漿各 50 μ Lに、 10w/v%TritonX- 100 50 μ Lおよび PBS 400 μ Lをそれぞれ加え、ボルテックスミキサーで攪拌した。その 100 Lを 96穴マイクロプ レートにとり、 ARVOsx-4を使用して励起波長 485nmおよび蛍光波長 530nmでの蛍光 強度を測定した。一方、 1.5、 1.5/4、 1.5/42、 1.5/43、 1.5/44および 1.5/45 /ζ g/mLの各 ODN-PBSの蛍光強度を測定し、検量線を得た。検量線から各血漿中の ODN濃度を 求めた。ラット体重 100gあたりの血漿量を 7.8mLと計算し、投与量に対する血中残存 率 (%)を算出するとともに、台形法で AUC ( μ g'min/dose)を算出した。
0'24h
[0112] [表 4]
第 4表
エタノール濃度 PEG-DSPE EPC 平均粒子径 回収率 (» AUC
(およその voltt vmg) (mg) (nm) ODN EPC ( i g - min/ dose)
実施例 10 50 12. 5 2. 5 118 91 39 460
実施例 11 50 12. 5 12. 5 113 97 74 533
[0113] 第 4表によると、実施例 10および 11で得られた製剤は、比較的分子量が大きな薬物 である ODNを含有する被修飾微粒子であっても、優れた持続性のある血中滞留性を 示した。
[0114] 参考例 3
被修飾微粒子の調製
デキストランフルォレセインァ-ォニック (FD)10mg、 DOTAP 60mgおよび PEG- DSPE 24mgを、水 2mLに分散させた。得られた分散液を、孔径 0.4 mのポリカーボネートメ ンブレンに 10回、孔径 0.1 mのポリカーボネートメンブレンに 10回通した。別に、 EPC 240mgおよび PEG- DSPE 50mgをエタノール/水混液 (5 :3) 8000 μ Lに溶解させた。得 られた分散液の 500 μ Lと、得られた EPCおよび PEG- DSPEの溶液 2000 μ Lとを混合し て、被修飾微粒子の分散液を得た。
[0115] [表 5] 第 5表
被修飾微粒子の組成
Figure imgf000033_0001
PEG- DSPE 5. 55 mg
EPC 18 mg
エタノール/水混液（およそ L) 750 μ ΐ 実施例 12
[0116] 参考例 3で被修飾微粒子の分散液を調製した後、その分散液 750 Lに、水を滴下 してエタノール濃度をおよそ 40vol%とした。得られた液に、表面修飾剤としてモノステ アリン酸ポリエチレングリコール (25E.O.)(PEG(25)-St、 日光ケミカルズ社製、以下同 様) 7.5mgおよび両親媒性物質として EPC 7.5mgをエタノール/水混液 (2:3) に 分散させたものを混合した。さらに適量の水を滴下してエタノール濃度をおよそ 5vol% とし、超遠心分離 (1時間、 110,000 X g、 25°C)を行って上清を除き、 PBSを加えて製剤 を得た。
実施例 13
[0117] 実施例 12における表面修飾剤をモノステアリン酸ポリエチレングリコール (40E.O.X PEG(40)- St、 日光ケミカルズ社製、以下同様) 7.5mgとし、両親媒性物質として EPC 7. 5mgを表面修飾剤とともに用いて、同様に製剤を得た。
実施例 14
[0118] 実施例 12における表面修飾剤を PEG(40)- St 7.5mgとし、両親媒性物質として EPC 3.75mgを表面修飾剤とともに用いて、同様に製剤を得た。
実施例 15 [0119] 参考例 3で被修飾微粒子の分散液を調製した後、その分散液 750 Lに、表面修飾 剤として PEG(40)- St 7.5mgおよび両親媒性物質として EPC 7.5mgをエタノール/水混 液 (1:1) 60 Lに分散させたものを混合した。さらに適量の水を滴下してエタノール 濃度をおよそ 5vol%とし、超遠心分離 (1時間、 110,000 X g、 25°C)を行って上清を除き 、 PBSを加えて製剤を得た。
[0120] 試験例 4
実施例 12〜15で得られた各製剤について、試験例 1と同様に、平均粒子径、 FDお よび EPCの回収率、ならびに血中動態について検討を行った。結果を第 6表および 第 4図に示す。
[0121] [表 6]
【表 6】
第 6表
エタノール濃度 PEG- St EPC 平均粒子径 回収率 (¾) AUC
(およその vol¾) ling) ling) (urn) FD EPC ( f. i g · min/ dose)
表面修飾剤： PEG (25) - St
実施例 12 40 7. 5 7. 5 125 88 77 214
表面修飾剤： PEG (40) -St
実施例 13 40 7. 5 7. 5 135 93 85 219
実施例 14 40 7. 5 3. 75 123 90 76 164
実施例 15 50 7. 5 7. 5 111 73 64 195
[0122] 第 6表によると、実施例 12〜15で得られた製剤は、表面修飾剤としてポリエチレング リコール脂肪酸エステルを用いた場合も、高 ヽ血中滞留性を示した。
産業上の利用可能性
[0123] 本発明により、水溶性物質で表面修飾された脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘 導体を含む微粒子の簡便な製造方法等が提供される。また、本発明によって、実質 上加熱する工程を含まずに、幅広 ヽ種類の被修飾粒子を修飾することが可能な水溶 性物質で表面修飾された脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子の 製造方法等が提供される。

Claims

請求の範囲
[1] 極性有機溶媒を含有する液中に、脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含 む微粒子を分散状態で存在させ、水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または 脂肪族炭化水素誘導体からなる表面修飾剤を溶解または分散状態で存在させるェ 程 (工程 A)を含む、該水溶性物質で表面修飾された該微粒子の製造方法。
[2] 極性有機溶媒として、該表面修飾剤が可溶な極性有機溶媒を使用することを特徴 とする請求項 1記載の製造方法。
[3] 極性有機溶媒として、アルコール、グリコールおよびポリアルキレングリコールから 選ばれる一つ以上を使用することを特徴とする請求項 1記載の製造方法。
[4] 極性有機溶媒を含有する液として、極性有機溶媒の濃度が 80vol%以下の該極性有 機溶媒を含有する液を使用することを特徴とする請求項 1〜3のいずれかに記載の製 造方法。
[5] 脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子が、脂質もしくは脂肪酸ま たはそれらの誘導体で被覆された微粒子である請求項 1〜4のいずれかに記載の製 造方法。
[6] 工程 Aにお ヽて、該極性有機溶媒を含有する液中に、さらに両親媒性物質を溶解 または分散状態で存在させることを特徴とする請求項 1〜5のいずれかに記載の製造 方法。
[7] 両親媒性物質と表面修飾剤の重量比を、 10:1〜1:100とすることを特徴とする請求 項 6記載の製造方法。
[8] 両親媒性物質がリン脂質、グリセ口糖脂質、スフインゴ糖脂質、コレステロール、カチ オン性脂質、ァニオン性脂質、界面活性剤、および水溶性高分子の脂質または脂肪 酸誘導体力も選ばれる一つ以上である、請求項 6または 7記載の製造方法。
[9] 脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子が、脂質集合体、リポソ一 ムおよびェマルジヨン粒子カゝら選ばれる一つ以上を構成成分とする微粒子である請 求項 1〜8のいずれかに記載の製造方法。
[10] 表面修飾剤が、ポリエチレングリコールイ匕脂質、ポリグリセリンィ匕脂質、ポリエチレン グリコールアルキルエーテル、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、ポリ エチレングリコール脂肪酸エステルおよびポリグリセリン脂肪酸エステル力 選ばれる 一つ以上である請求項 1〜9のいずれかに記載の製造方法。
[11] 脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子がリボソームであり、極性 有機溶媒がエタノールであり、両親媒性物質がリン脂質であり、表面修飾剤がポリェ チレングリコールイ匕脂質である、請求項 6または 7記載の製造方法。
[12] 脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子がリボソームであり、極性 有機溶媒がエタノールであり、両親媒性物質がリン脂質であり、表面修飾剤がポリェ チレングリコール脂肪酸エステルである、請求項 6または 7記載の製造方法。
[13] 請求項 1〜12のいずれかに記載の製造方法によって表面修飾される脂質もしくは脂 肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子を調製するための、少なくとも脂質もしくは 脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子、水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘 導体または脂肪族炭化水素誘導体からなる表面修飾剤、および極性有機溶媒を含 有する液から構成されるキット。
[14] 請求項 1〜12のいずれかに記載の製造方法を用いて製造できる水溶性物質で表 面修飾された脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子。
[15] 請求項 1〜12のいずれかに記載の製造方法を用いて製造できる水溶性物質で表 面修飾された脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子のうち、抗腫 瘍薬を含有する該微粒子を含有する腫瘍の治療剤。
[16] 請求項 1〜12のいずれかに記載の製造方法を用いて製造できる水溶性物質で表 面修飾された脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子のうち、抗炎 症薬を含有する該微粒子を含有する炎症の治療剤。
[17] 請求項 1〜12のいずれかに記載の製造方法を用いて製造できる水溶性物質で表 面修飾された脂質もしくは脂肪酸またはそれらの誘導体を含む微粒子のうち、薬物を 含有する該微粒子力もなる、腫瘍または炎症部位への薬物含有キャリアー。
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