JP2003064037A - 両イオン性脂質およびその用途 - Google Patents
両イオン性脂質およびその用途Info
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- C07C237/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
- C07C237/04—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
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- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
- A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
- A61K47/186—Quaternary ammonium compounds, e.g. benzalkonium chloride or cetrimide
Abstract
(57)【要約】
【課題】簡便な方法で安価に大量合成できる二本鎖の両
イオン性脂質を提供する。 【解決手段】式（Ｉ）： 【化１】 （但し、ｍとｎは各々独立に１ないし４の整数、ｐは７
ないし２１の整数、Ｒは一つがＮＨ3 +であり、その他の
Ｒは全てＨである）で表される両イオン性脂質。
イオン性脂質を提供する。 【解決手段】式（Ｉ）： 【化１】 （但し、ｍとｎは各々独立に１ないし４の整数、ｐは７
ないし２１の整数、Ｒは一つがＮＨ3 +であり、その他の
Ｒは全てＨである）で表される両イオン性脂質。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、簡便に合成され、
生体適合性、生分解性の高い両イオン性脂質、並びにそ
の優れた分子集合特性を利用した表面改質剤、分散安定
化剤、薬物運搬体、酸素運搬体としての用途に関する。
生体適合性、生分解性の高い両イオン性脂質、並びにそ
の優れた分子集合特性を利用した表面改質剤、分散安定
化剤、薬物運搬体、酸素運搬体としての用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】小胞体を形成する両イオン性脂質として
は、例えばジアシルグリセロホスフォコリンなどのコリ
ン型リン脂質が広く用いられている。両イオン性脂質
は、極性頭部間での静電的相互作用により安定な二分子
膜を形成することが知られており、小胞体膜の主成分と
して利用されている。
は、例えばジアシルグリセロホスフォコリンなどのコリ
ン型リン脂質が広く用いられている。両イオン性脂質
は、極性頭部間での静電的相互作用により安定な二分子
膜を形成することが知られており、小胞体膜の主成分と
して利用されている。
【０００３】小胞体の物理化学的、生理学的性質は、膜
構成脂質の親水基の性質が反映される。このため、ポリ
エチレングリコールや糖質を親水部に有する脂質を任意
の割合で混合すると血中滞留時間が変動し、また、各種
糖質、抗体、蛋白質、オリゴペプチドなどを小胞体表面
に担持させ、特定部位への集積能を高めることもでき
る。しかし、何れもコリン型リン脂質を主成分とする小
胞体が用いられており、適当な代替脂質は実用されてい
ない。
構成脂質の親水基の性質が反映される。このため、ポリ
エチレングリコールや糖質を親水部に有する脂質を任意
の割合で混合すると血中滞留時間が変動し、また、各種
糖質、抗体、蛋白質、オリゴペプチドなどを小胞体表面
に担持させ、特定部位への集積能を高めることもでき
る。しかし、何れもコリン型リン脂質を主成分とする小
胞体が用いられており、適当な代替脂質は実用されてい
ない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】飽和型リン脂質は、原
料が高価、合成が煩雑、しかもカラムを用いる精製が不
可欠であるため、非常に高価であり、これを生体投与を
目的とする小胞体の膜主成分として用いる場合、抗がん
剤など僅かな投与量で高価な薬物の運搬体の使用に限定
されている。しかし、コリン型リン脂質の様な二本鎖の
両イオン性脂質は安定な分子集合体を形成するので、簡
便な方法で安価に大量合成できる様になれば、酸素運搬
体などの大量生体投与剤に留まらず、食品、香粧品、ト
イレタリー、染料などの多種領域への用途が期待でき
る。
料が高価、合成が煩雑、しかもカラムを用いる精製が不
可欠であるため、非常に高価であり、これを生体投与を
目的とする小胞体の膜主成分として用いる場合、抗がん
剤など僅かな投与量で高価な薬物の運搬体の使用に限定
されている。しかし、コリン型リン脂質の様な二本鎖の
両イオン性脂質は安定な分子集合体を形成するので、簡
便な方法で安価に大量合成できる様になれば、酸素運搬
体などの大量生体投与剤に留まらず、食品、香粧品、ト
イレタリー、染料などの多種領域への用途が期待でき
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記実状に
鑑み鋭意研究を行った結果、アミノ基およびカルボキシ
ル基を親水部に有する二本鎖の両イオン性脂質の合成に
成功した。合成は極めて簡便であり、精製工程は溶解性
の相違を利用するため、カラム精製を用いる必要はな
く、収率高く大量に供給できる。この両イオン性脂質が
水性媒体中で安定な二分子膜小胞体を形成し、また内相
に水溶性物質を高効率で内包できる。
鑑み鋭意研究を行った結果、アミノ基およびカルボキシ
ル基を親水部に有する二本鎖の両イオン性脂質の合成に
成功した。合成は極めて簡便であり、精製工程は溶解性
の相違を利用するため、カラム精製を用いる必要はな
く、収率高く大量に供給できる。この両イオン性脂質が
水性媒体中で安定な二分子膜小胞体を形成し、また内相
に水溶性物質を高効率で内包できる。
【０００６】すなわち、本発明によれば、下記式
【化２】
（但し、ｍとｎは各々独立に１ないし４の整数、ｐは７
ないし２１の整数、Ｒは一つがＮＨ3 +であり、その他の
Ｒは全てＨ）で表される両イオン性脂質が提供される。
ないし２１の整数、Ｒは一つがＮＨ3 +であり、その他の
Ｒは全てＨ）で表される両イオン性脂質が提供される。
【０００７】
【発明の実施の形態】以下に本発明を詳細に説明する。
【０００８】式（Ｉ）で示される本発明の両イオン性脂
質は、以下のようにして合成することができる。
質は、以下のようにして合成することができる。
【０００９】まず、式（Ａ）：
【化３】
【００１０】（ここで、ｎは、式（Ｉ）と同じ）で示さ
れるアミノ酸を式（Ｂ）：
れるアミノ酸を式（Ｂ）：
【化４】
【００１１】（ここで、各ｐは、式（Ｉ）と同じ）で示
される長鎖アルコールと反応させて、式（Ｃ）：
される長鎖アルコールと反応させて、式（Ｃ）：
【化５】
で示されるアミノ酸の長鎖アルキルエステルを合成す
る。
る。
【００１２】式（Ａ）で示されるアミノ酸と式（Ｂ）で
示される長鎖アルコールとの反応は、酸触媒による脱水
縮合、活性エステル法、酸無水物法、混合酸無水物法等
を用いて行うことができる。その中でも、酸触媒による
脱水縮合が最も簡便であり、精製も容易であるので好ま
しい。但し、酸触媒による脱水縮合では加熱を必要とす
るため、原料が加熱に対して不安定な場合は、他の方法
を選択する。
示される長鎖アルコールとの反応は、酸触媒による脱水
縮合、活性エステル法、酸無水物法、混合酸無水物法等
を用いて行うことができる。その中でも、酸触媒による
脱水縮合が最も簡便であり、精製も容易であるので好ま
しい。但し、酸触媒による脱水縮合では加熱を必要とす
るため、原料が加熱に対して不安定な場合は、他の方法
を選択する。
【００１３】他方、式（Ｄ）
【化６】
【００１４】（ここで、ｍおよびＲは、式（Ｉ）と同
じ）で示されるアミノ酸を準備し、そのアミノ基と一方
のカルボキシル基を常法により保護する。次に、このア
ミノ基およびカルボキシル基保護アミノ酸を式（Ｃ）で
示されるアミノ酸長鎖アルキルエステルと反応（アミド
結合生成反応）させた後、アミノ基およびカルボキシル
基の保護基を除去することによって、式（Ｉ）で示され
る本発明の両イオン性脂質を得ることができる。
じ）で示されるアミノ酸を準備し、そのアミノ基と一方
のカルボキシル基を常法により保護する。次に、このア
ミノ基およびカルボキシル基保護アミノ酸を式（Ｃ）で
示されるアミノ酸長鎖アルキルエステルと反応（アミド
結合生成反応）させた後、アミノ基およびカルボキシル
基の保護基を除去することによって、式（Ｉ）で示され
る本発明の両イオン性脂質を得ることができる。
【００１５】上記アミノ基およびカルボキシル基保護ア
ミノ酸と式（Ｃ）で示されるアミノ酸長鎖アルキルエス
テルとの反応は、活性エステル法、酸無水物法、混合酸
無水物法等を用いて行うことができる。また、通常のペ
プチド合成と同様の方法で固相合成を行うこともでき
る。
ミノ酸と式（Ｃ）で示されるアミノ酸長鎖アルキルエス
テルとの反応は、活性エステル法、酸無水物法、混合酸
無水物法等を用いて行うことができる。また、通常のペ
プチド合成と同様の方法で固相合成を行うこともでき
る。
【００１６】本発明の両イオン性脂質の上記合成方法
は、簡便であり、収率高く目的の両イオン性脂質を供給
することができる。また、合成された両イオン性脂質の
精製も溶媒に対する溶解度の差を利用して行うことがで
き、カラム精製を用いる必要はない。
は、簡便であり、収率高く目的の両イオン性脂質を供給
することができる。また、合成された両イオン性脂質の
精製も溶媒に対する溶解度の差を利用して行うことがで
き、カラム精製を用いる必要はない。
【００１７】なお、原料としてのアミノ酸が不斉炭素を
有する場合、Ｄ体、Ｌ体、およびＤ体とＬ体を任意の割
合で含む混合物の何れを用いても合成は同様の方法で実
施できる。用途に応じて光学異性体純度の高い両イオン
性脂質が要求される場合は、光学異性体純度の高いＤ体
かＬ体が原料として好ましい。また、生成物を光学異性
体分離カラムなどで分離してもよい。
有する場合、Ｄ体、Ｌ体、およびＤ体とＬ体を任意の割
合で含む混合物の何れを用いても合成は同様の方法で実
施できる。用途に応じて光学異性体純度の高い両イオン
性脂質が要求される場合は、光学異性体純度の高いＤ体
かＬ体が原料として好ましい。また、生成物を光学異性
体分離カラムなどで分離してもよい。
【００１８】本発明の両イオン性脂質は親疎水界面に接
触するとその疎水基を疎水性表面に、両イオン性基を水
性媒体に向けて配向するため、疎水性表面を親水性表面
に改質させることができ、分離用充填剤、各種センサ
ー、細胞培養基板等の表面改質剤として利用できる。ま
た、医薬品、食品、香粧品、トイレタリー、染料等に使
用される薬剤の乳化剤、安定剤、分散剤、可溶化剤、混
和剤、湿潤剤、浸透剤、粘度調整剤などとして利用でき
る。
触するとその疎水基を疎水性表面に、両イオン性基を水
性媒体に向けて配向するため、疎水性表面を親水性表面
に改質させることができ、分離用充填剤、各種センサ
ー、細胞培養基板等の表面改質剤として利用できる。ま
た、医薬品、食品、香粧品、トイレタリー、染料等に使
用される薬剤の乳化剤、安定剤、分散剤、可溶化剤、混
和剤、湿潤剤、浸透剤、粘度調整剤などとして利用でき
る。
【００１９】本発明の両イオン性脂質は、水性媒体に単
独、あるいはコレステロールやその他の両親媒性分子と
混合させて分散させることにより、疎水部間の疎水性相
互作用、両イオン性基間の静電的相互作用により分子充
填状態が高く、安定な分子集合体（ミセル状、繊維状、
平板状、ロール状、小胞体など）を形成する。安定な二
分子膜小胞体（リポソーム）を形成する場合、例えば内
水相に水溶性薬剤を内包させることができ、あるいは膜
表面に認識部位を担持させることができるので、薬物輸
送システムに利用できる。特に、ヘモグロビンを内包さ
せる場合、酸素運搬体として利用できる。
独、あるいはコレステロールやその他の両親媒性分子と
混合させて分散させることにより、疎水部間の疎水性相
互作用、両イオン性基間の静電的相互作用により分子充
填状態が高く、安定な分子集合体（ミセル状、繊維状、
平板状、ロール状、小胞体など）を形成する。安定な二
分子膜小胞体（リポソーム）を形成する場合、例えば内
水相に水溶性薬剤を内包させることができ、あるいは膜
表面に認識部位を担持させることができるので、薬物輸
送システムに利用できる。特に、ヘモグロビンを内包さ
せる場合、酸素運搬体として利用できる。
【００２０】本発明の両イオン性脂質を小胞体の膜主成
分として利用する場合、その他の膜成分としてはステロ
ール類を安定化剤として添加してもよい。このようなス
テロール類としては例えば、エルゴステロール、コレス
テロール等が挙げられるが、好ましくはコレステロール
である。コレステロールの含有量に制限はないが、小胞
体膜の安定度を考慮すれば５〜５０モル％、好ましくは
２０〜５０モル%である。膜成分中に負電荷脂質を混合
させることで小胞体凝集が抑制され被覆層数が減少して
内包効率が増大するので、負電荷脂質を成分として添加
してもよい。負電荷脂質としてはジアシルホスファチジ
ルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、ジアシル
ホスファチジルイノシトール、ジアシルホスファチジル
セリン、脂肪酸、カルボン酸型脂質が使用でき、含有量
は１〜５０モル％であり、特に５〜２０モル％が望まし
い。ポリエチレングリコール型脂質の導入により小胞体
凝集が大幅に抑制され、投与後の血中滞留時間が増大す
るので、これを膜成分として添加してもよい。混合脂質
中に０．０１〜５モル％のポリエチレングリコール型脂
質を混合させる場合が有効であるが、好ましくは０．１
〜１モル％である。０．１モル％より少ない場合は凝集
抑制効果が弱くなり、また１モル％より多い場合は小胞
体内相に伸びたポリエチレングリコール鎖の排除体積効
果により封入効率が低下する。ポリエチレングリコール
の分子量は２，０００〜１２，０００程度が好ましい。
分として利用する場合、その他の膜成分としてはステロ
ール類を安定化剤として添加してもよい。このようなス
テロール類としては例えば、エルゴステロール、コレス
テロール等が挙げられるが、好ましくはコレステロール
である。コレステロールの含有量に制限はないが、小胞
体膜の安定度を考慮すれば５〜５０モル％、好ましくは
２０〜５０モル%である。膜成分中に負電荷脂質を混合
させることで小胞体凝集が抑制され被覆層数が減少して
内包効率が増大するので、負電荷脂質を成分として添加
してもよい。負電荷脂質としてはジアシルホスファチジ
ルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、ジアシル
ホスファチジルイノシトール、ジアシルホスファチジル
セリン、脂肪酸、カルボン酸型脂質が使用でき、含有量
は１〜５０モル％であり、特に５〜２０モル％が望まし
い。ポリエチレングリコール型脂質の導入により小胞体
凝集が大幅に抑制され、投与後の血中滞留時間が増大す
るので、これを膜成分として添加してもよい。混合脂質
中に０．０１〜５モル％のポリエチレングリコール型脂
質を混合させる場合が有効であるが、好ましくは０．１
〜１モル％である。０．１モル％より少ない場合は凝集
抑制効果が弱くなり、また１モル％より多い場合は小胞
体内相に伸びたポリエチレングリコール鎖の排除体積効
果により封入効率が低下する。ポリエチレングリコール
の分子量は２，０００〜１２，０００程度が好ましい。
【００２１】水性媒体としては純水、生理食塩水、各種
緩衝液、あるいはこれらの水性媒体に水溶性薬剤を溶解
させた溶液を用いる。水性媒体のｐＨは酸性ではカルボ
ン酸アニオンはカルボン酸となり、アルカリ性ではアン
モニウムがアミンとなって両イオン性ではなくなるが、
表面電荷を制御する必要がある場合やそれによって特に
安定性の低下や集合形態の変化などに支障が無い場合は
ｐＨの制限はない。また、ｐＨの変化による集合形態の
変化を逆に利用して内包物の放出や凝集による分離を目
的とする場合には、目的に応じたｐＨであれば良い。小
胞体の粒子径は、例えば混合脂質粉末に水性媒体を加え
て水和、膨潤させ、静置水和法、ボルテックスミキサ
ー、強制撹拌機、超音波照射機、ホモジナイザー、マイ
クロフルイダイザー、高圧押出機（エクストルーダ
ー）、凍結融解などにより行うことができる。特に、凍
結融解と高圧押出機を組み合わせることにより、フィル
ターの透過性が著しく向上するため、処理時間が短縮、
収率が向上する。内包されなかった水溶性薬剤はゲルろ
過や超遠心分離や限外ろ過膜処理により内包小胞体と分
離できる。
緩衝液、あるいはこれらの水性媒体に水溶性薬剤を溶解
させた溶液を用いる。水性媒体のｐＨは酸性ではカルボ
ン酸アニオンはカルボン酸となり、アルカリ性ではアン
モニウムがアミンとなって両イオン性ではなくなるが、
表面電荷を制御する必要がある場合やそれによって特に
安定性の低下や集合形態の変化などに支障が無い場合は
ｐＨの制限はない。また、ｐＨの変化による集合形態の
変化を逆に利用して内包物の放出や凝集による分離を目
的とする場合には、目的に応じたｐＨであれば良い。小
胞体の粒子径は、例えば混合脂質粉末に水性媒体を加え
て水和、膨潤させ、静置水和法、ボルテックスミキサ
ー、強制撹拌機、超音波照射機、ホモジナイザー、マイ
クロフルイダイザー、高圧押出機（エクストルーダ
ー）、凍結融解などにより行うことができる。特に、凍
結融解と高圧押出機を組み合わせることにより、フィル
ターの透過性が著しく向上するため、処理時間が短縮、
収率が向上する。内包されなかった水溶性薬剤はゲルろ
過や超遠心分離や限外ろ過膜処理により内包小胞体と分
離できる。
【００２２】ヘモグロビン溶液を使用する場合、ヒト由
来、ウシ由来の赤血球を常法によって溶血させ、遠心分
離や限外ろ過によりストローマ成分のみを除去したスト
ローマフリーヘモグロビン溶液、ヘモグロビンを単離し
た精製ヘモグロビン溶液、あるいはリコンビナントヘモ
グロビン溶液で、限外ろ過により１０ｇ／ｄＬ以上に濃
縮したものが使用される。酸素運搬体として充分量の酸
素を生体組織に供給するためにはヘモグロビン濃度２０
〜５０ｇ／ｄＬが好ましい。
来、ウシ由来の赤血球を常法によって溶血させ、遠心分
離や限外ろ過によりストローマ成分のみを除去したスト
ローマフリーヘモグロビン溶液、ヘモグロビンを単離し
た精製ヘモグロビン溶液、あるいはリコンビナントヘモ
グロビン溶液で、限外ろ過により１０ｇ／ｄＬ以上に濃
縮したものが使用される。酸素運搬体として充分量の酸
素を生体組織に供給するためにはヘモグロビン濃度２０
〜５０ｇ／ｄＬが好ましい。
【００２３】本発明において、イノシシトールリン酸、
ピリドキサ−ル５’リン酸（ＰＬＰ）などの有機リン化
合物をヘモグロビンの酸素親和度調節のために加えても
よい。また、ヘモグロビンの還元剤としてはホモシステ
イン、グルタチオンなどのチオール類、水溶性ビタミン
類などを加えてもよい。活性酸素除去剤としてはカタラ
ーゼ、スーパーオキシドジスムターゼを加えてもよい。
ピリドキサ−ル５’リン酸（ＰＬＰ）などの有機リン化
合物をヘモグロビンの酸素親和度調節のために加えても
よい。また、ヘモグロビンの還元剤としてはホモシステ
イン、グルタチオンなどのチオール類、水溶性ビタミン
類などを加えてもよい。活性酸素除去剤としてはカタラ
ーゼ、スーパーオキシドジスムターゼを加えてもよい。
【００２４】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説
明するが、本発明はこれらにより限定されるものではな
い。なお、以下の実施例における化合物（誘導体）１〜
５の構造は、最後にまとめて示してある。
明するが、本発明はこれらにより限定されるものではな
い。なお、以下の実施例における化合物（誘導体）１〜
５の構造は、最後にまとめて示してある。
【００２５】実施例１
本実施例では、親水部としてグルタミン酸をα位のカル
ボキシル基で化合物１に結合させた両イオン性脂質３を
以下のようにして合成した。
ボキシル基で化合物１に結合させた両イオン性脂質３を
以下のようにして合成した。
【００２６】（Ａ）Ｌ−グルタミン酸（２．９６グラ
ム、２０ｍｍｏｌ）、p−トルエンスルホン酸一水和物
（４．５６ｇ，２４ｍｍｏｌ）を溶媒ベンゼン（１５０
ｍＬ）に溶解させ、生成水を除去しながら１時間還流し
た。ヘキサデシルアルコール（１０．６５ｇ、４４ｍｍ
ｏｌ）を加え、１０５℃で生成水を除去しながらさらに
14時間還流させた。溶媒を減圧除去した後、残分をクロ
ロホルム（１５０ｍＬ）に溶解させ、炭酸ナトリウム飽
和水溶液（１５０ｍＬ）で２回、水（１５０ｍＬ）で２
回洗浄した。クロロホルム層を回収し、硫酸ナトリウム
で脱水後、溶媒を減圧除去した。残渣をメタノールから
４℃で再結晶、ろ過後乾燥して白色粉末の化合物１
（９．５ｇ、収率８０％）を得た。
ム、２０ｍｍｏｌ）、p−トルエンスルホン酸一水和物
（４．５６ｇ，２４ｍｍｏｌ）を溶媒ベンゼン（１５０
ｍＬ）に溶解させ、生成水を除去しながら１時間還流し
た。ヘキサデシルアルコール（１０．６５ｇ、４４ｍｍ
ｏｌ）を加え、１０５℃で生成水を除去しながらさらに
14時間還流させた。溶媒を減圧除去した後、残分をクロ
ロホルム（１５０ｍＬ）に溶解させ、炭酸ナトリウム飽
和水溶液（１５０ｍＬ）で２回、水（１５０ｍＬ）で２
回洗浄した。クロロホルム層を回収し、硫酸ナトリウム
で脱水後、溶媒を減圧除去した。残渣をメタノールから
４℃で再結晶、ろ過後乾燥して白色粉末の化合物１
（９．５ｇ、収率８０％）を得た。
【００２７】化合物１の分析結果：薄層クロマトグラフ
ィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール
（4／1）（容量／容量）：Ｒｆ：0.79（モノスポッ
ト）。
ィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール
（4／1）（容量／容量）：Ｒｆ：0.79（モノスポッ
ト）。
【００２８】赤外吸収スペクトル（cm−1）：3385 [ν
N―H（NH2）]；1738 [νC＝O（エステル）]。
N―H（NH2）]；1738 [νC＝O（エステル）]。
【００２９】1H−NMRスペクトル（CDCl3，500 MHz，δ
（ppm））：0.88（t，6H，−CH3）；1.26（s，52H，−C
H2−CH2−）；1.62（m，4H，−CO−O−C−CH2）；1.8
5，2.08（m，2H，glu β−CH2）；2.46（m，2H，glu γ
−CH2）；3.46（m，1H，glu α−CH）；4.08，4.12 (t
t，4H，−CO−O−CH2−)。
（ppm））：0.88（t，6H，−CH3）；1.26（s，52H，−C
H2−CH2−）；1.62（m，4H，−CO−O−C−CH2）；1.8
5，2.08（m，2H，glu β−CH2）；2.46（m，2H，glu γ
−CH2）；3.46（m，1H，glu α−CH）；4.08，4.12 (t
t，4H，−CO−O−CH2−)。
【００３０】（Ｂ）化合物１をアミノ基およびカルボキ
シル基保護グルタミン酸と以下のようにして結合させ
た。すなわち、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−グルタミン酸α−
ｔ−ブチルエステル（７６４ｍｇ、２．５２ｍｍｏｌ）
とＤＣＣ（５１３ｍｇ、２．５２ｍｍｏｌ）をジクロロ
メタンに溶解し、４℃で３０分撹拌した後、化合物１
（１ｇ、１．６８ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１７
０ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ）を溶解したジクロロメタン
溶液に滴下する。反応混合溶液を２５℃で５時間撹拌し
た後、グラスフィルター（Ｇ４）で反応液を濾過し、溶
媒を減圧除去する。メタノール（３００ｍＬ）から４℃
で再結晶してろ過後、乾燥して、化合物1に親水部とし
てアミノ基およびカルボキシル基保護グルタミン酸を結
合させた化合物２を白色固体として得た（１．１５ｇ、
収率７８％）。
シル基保護グルタミン酸と以下のようにして結合させ
た。すなわち、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−グルタミン酸α−
ｔ−ブチルエステル（７６４ｍｇ、２．５２ｍｍｏｌ）
とＤＣＣ（５１３ｍｇ、２．５２ｍｍｏｌ）をジクロロ
メタンに溶解し、４℃で３０分撹拌した後、化合物１
（１ｇ、１．６８ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１７
０ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ）を溶解したジクロロメタン
溶液に滴下する。反応混合溶液を２５℃で５時間撹拌し
た後、グラスフィルター（Ｇ４）で反応液を濾過し、溶
媒を減圧除去する。メタノール（３００ｍＬ）から４℃
で再結晶してろ過後、乾燥して、化合物1に親水部とし
てアミノ基およびカルボキシル基保護グルタミン酸を結
合させた化合物２を白色固体として得た（１．１５ｇ、
収率７８％）。
【００３１】化合物２の分析結果：薄層クロマトグラフ
ィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール
（4／1）（容量／容量）：Ｒｆ：0.81（モノスポッ
ト）。
ィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール
（4／1）（容量／容量）：Ｒｆ：0.81（モノスポッ
ト）。
【００３２】赤外吸収スペクトル（cm−1）： 1737（ν
C＝O（エステル））； 1665（νC＝ O（アミド））；157
0（δN-H（アミド））。
C＝O（エステル））； 1665（νC＝ O（アミド））；157
0（δN-H（アミド））。
【００３３】1H−NMRスペクトル（CDCl3，500MHz，δ
（ppm））：0.88（t，6H，−CH3）；1.26（s，52H，−C
H2−CH2−）；1.44、1.46（s，18H，CH3−C−）；1.62
（m，4H，−CO−O−C−CH2）；1.88-2.25（m，4H，glu
β−CH2）；2.31-2.44（m，4H，glu γ−CH2）；4.06，
4.14 (t，4H，−CO−O−CH2−) ；4.13（br，1H，−CH
−CONH−）；4.57（m，1H，−CH−CO−O−）；5.25（b
r，1H，−O−CO−NH−）；6.90（d，1H，amide）。
（ppm））：0.88（t，6H，−CH3）；1.26（s，52H，−C
H2−CH2−）；1.44、1.46（s，18H，CH3−C−）；1.62
（m，4H，−CO−O−C−CH2）；1.88-2.25（m，4H，glu
β−CH2）；2.31-2.44（m，4H，glu γ−CH2）；4.06，
4.14 (t，4H，−CO−O−CH2−) ；4.13（br，1H，−CH
−CONH−）；4.57（m，1H，−CH−CO−O−）；5.25（b
r，1H，−O−CO−NH−）；6.90（d，1H，amide）。
【００３４】（Ｃ）化合物２（１．１５ｇ、１．３０ｍ
ｍｏｌ）をＴＦＡ（１０ｍＬ）に溶解し、４℃で３時間
撹拌した後、クロロホルム（５０ｍＬ）を加え、炭酸ナ
トリウム飽和水溶液で２回、水で２回洗浄した。クロロ
ホルム層を無水硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒を減
圧除去した。ベンゼン（１０ｍＬ）に溶解後、未溶解成
分を濾過して濾液を凍結乾燥し、両イオン性脂質３を白
色固体として得た（０．８９ｇ、収率９２％）。
ｍｏｌ）をＴＦＡ（１０ｍＬ）に溶解し、４℃で３時間
撹拌した後、クロロホルム（５０ｍＬ）を加え、炭酸ナ
トリウム飽和水溶液で２回、水で２回洗浄した。クロロ
ホルム層を無水硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒を減
圧除去した。ベンゼン（１０ｍＬ）に溶解後、未溶解成
分を濾過して濾液を凍結乾燥し、両イオン性脂質３を白
色固体として得た（０．８９ｇ、収率９２％）。
【００３５】化合物３の分析結果：薄層クロマトグラフ
ィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール
（4／1）（容量／容量）：Ｒｆ：0.24（モノスポッ
ト）。
ィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール
（4／1）（容量／容量）：Ｒｆ：0.24（モノスポッ
ト）。
【００３６】赤外吸収スペクトル（cm−1）： 1739
（νC＝O（エステル））； 1661（νC ＝O（アミ
ド））；1567（δN-H（アミド））。
（νC＝O（エステル））； 1661（νC ＝O（アミ
ド））；1567（δN-H（アミド））。
【００３７】1H−NMRスペクトル（CDCl3，500MHz，δ
（ppm））：0.88（t，6H，−CH3）；1.26（s，52H，−C
H2−CH2−）； 1.61（m，4H，−CO−O−C−CH2）；1.70
-2.20（m，4H，glu β−CH2）；2.32、2.41（m，4H，gl
u γ−CH2）；3.40（m，1H，−CH−CO−O−）4.07，4.1
2 (t，4H，−CO−O−CH2−) ；4.51（m，1H，−CH−CON
H−）。
（ppm））：0.88（t，6H，−CH3）；1.26（s，52H，−C
H2−CH2−）； 1.61（m，4H，−CO−O−C−CH2）；1.70
-2.20（m，4H，glu β−CH2）；2.32、2.41（m，4H，gl
u γ−CH2）；3.40（m，1H，−CH−CO−O−）4.07，4.1
2 (t，4H，−CO−O−CH2−) ；4.51（m，1H，−CH−CON
H−）。
【００３８】MS（FAB）C42H79O7N2Naについての計算
値：746.6；実測値：747.7（M＋H）＋。
値：746.6；実測値：747.7（M＋H）＋。
【００３９】実施例２
本実施例では、親水部としてグルタミン酸をγ位のカル
ボキシル基で化合物１に結合させた両イオン性脂質５を
以下のようにして合成した。
ボキシル基で化合物１に結合させた両イオン性脂質５を
以下のようにして合成した。
【００４０】（Ａ）化合物１をアミノ基およびカルボキ
シル基保護グルタミン酸とを以下のようにして結合させ
た。すなわち、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−グルタミン酸γ−
ｔ−ブチルエステル（３８２ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ）
とＤＣＣ（２５６ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ）をジクロロ
メタンに溶解し、４℃で３０分撹拌した後、化合物１
（５００ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン
（８５ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）を溶解したジクロロメ
タン溶液に滴下した。反応混合溶液を２５℃で５時間撹
拌した後、グラスフィルター（Ｇ４）で反応液を濾過
し、溶媒を減圧除去した。メタノール（３００ｍＬ）か
ら４℃で再結晶してろ過後、乾燥して、化合物1に親水
部としてアミノ基およびカルボキシル基保護グルタミン
酸を結合させた化合物４を白色固体として得た（６２９
ｍｇ、収率８５％）。
シル基保護グルタミン酸とを以下のようにして結合させ
た。すなわち、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−グルタミン酸γ−
ｔ−ブチルエステル（３８２ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ）
とＤＣＣ（２５６ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ）をジクロロ
メタンに溶解し、４℃で３０分撹拌した後、化合物１
（５００ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン
（８５ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）を溶解したジクロロメ
タン溶液に滴下した。反応混合溶液を２５℃で５時間撹
拌した後、グラスフィルター（Ｇ４）で反応液を濾過
し、溶媒を減圧除去した。メタノール（３００ｍＬ）か
ら４℃で再結晶してろ過後、乾燥して、化合物1に親水
部としてアミノ基およびカルボキシル基保護グルタミン
酸を結合させた化合物４を白色固体として得た（６２９
ｍｇ、収率８５％）。
【００４１】化合物４の分析結果：薄層クロマトグラフ
ィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール
（4／1）（容量／容量）：Ｒｆ：０．８４（モノスポッ
ト）。
ィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール
（4／1）（容量／容量）：Ｒｆ：０．８４（モノスポッ
ト）。
【００４２】赤外吸収スペクトル（cm−1）： 1737（ν
C＝O（エステル））； 1661（νC＝ O（アミド））；158
0（δN-H（アミド））。
C＝O（エステル））； 1661（νC＝ O（アミド））；158
0（δN-H（アミド））。
【００４３】1H−NMRスペクトル（CDCl3，500MHz，δ
（ppm））：0.88（t，6H，−CH3）；1.26（s，52H，−C
H2−CH2−）；1.44、1.47（s，18H，CH3−C−）；1.62
（m，4H，−CO−O−C−CH2）；1.86-2.22（m，4H，glu
β−CH2）；2.28-2.45（m，4H，glu γ−CH2）；4.05，
4.08 (t，4H，−CO−O−CH2−) ；4.16（br，1H，−O−
CO−NH−CH−）；4.59（m，1H，−CH−CO−O−）；5.20
（br，1H，−O−CO−NH−）；6.60（d，1H，amide） （Ｂ）化合物４（６２９ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ）をＴ
ＦＡ（１０ｍＬ）に溶解し、４℃で３時間撹拌した後、
クロロホルム（３０ｍＬ）を加え、炭酸ナトリウム飽和
水溶液で2回、水で2回洗浄した。クロロホルム層を無水
硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒を減圧除去した。ベ
ンゼン（１０ｍＬ）に溶解後、未溶解成分を濾過して、
濾液を凍結乾燥し、両イオン性脂質５を白色固体として
得た（４８８ｍｇ、収率９２％）。
（ppm））：0.88（t，6H，−CH3）；1.26（s，52H，−C
H2−CH2−）；1.44、1.47（s，18H，CH3−C−）；1.62
（m，4H，−CO−O−C−CH2）；1.86-2.22（m，4H，glu
β−CH2）；2.28-2.45（m，4H，glu γ−CH2）；4.05，
4.08 (t，4H，−CO−O−CH2−) ；4.16（br，1H，−O−
CO−NH−CH−）；4.59（m，1H，−CH−CO−O−）；5.20
（br，1H，−O−CO−NH−）；6.60（d，1H，amide） （Ｂ）化合物４（６２９ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ）をＴ
ＦＡ（１０ｍＬ）に溶解し、４℃で３時間撹拌した後、
クロロホルム（３０ｍＬ）を加え、炭酸ナトリウム飽和
水溶液で2回、水で2回洗浄した。クロロホルム層を無水
硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒を減圧除去した。ベ
ンゼン（１０ｍＬ）に溶解後、未溶解成分を濾過して、
濾液を凍結乾燥し、両イオン性脂質５を白色固体として
得た（４８８ｍｇ、収率９２％）。
【００４４】化合物５の分析結果：薄層クロマトグラフ
ィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール
（4／1）（容量／容量）：Ｒｆ：0.25（モノスポッ
ト）。
ィー（シリカゲルプレート、クロロホルム／メタノール
（4／1）（容量／容量）：Ｒｆ：0.25（モノスポッ
ト）。
【００４５】赤外吸収スペクトル（cm−1）： 1736
（νC＝O（エステル））； 1650（νC ＝O（アミ
ド））；1588（δN-H（アミド））。
（νC＝O（エステル））； 1650（νC ＝O（アミ
ド））；1588（δN-H（アミド））。
【００４６】1H−NMRスペクトル（CDCl3，500MHz，δ
（ppm））：0.88（t，6H，−CH3）；1.26（s，52H，−C
H2−CH2−）； 1.62（m，4H，−CO−O−C−CH2）；1.94
-2.20（m，4H，glu β−CH2）；2.40、2.41（m，4H，gl
u γ−CH2）；3.44（br，1H，−CH−CO−O−）4.06，4.
10 (t，4H，−CO−O−CH2−) ；4.47（br，1H， NH2−C
H−CH2−）。
（ppm））：0.88（t，6H，−CH3）；1.26（s，52H，−C
H2−CH2−）； 1.62（m，4H，−CO−O−C−CH2）；1.94
-2.20（m，4H，glu β−CH2）；2.40、2.41（m，4H，gl
u γ−CH2）；3.44（br，1H，−CH−CO−O−）4.06，4.
10 (t，4H，−CO−O−CH2−) ；4.47（br，1H， NH2−C
H−CH2−）。
【００４７】MS（FAB）C42H79O7N2Naについての計算
値：746.6；実測値：747.7（M＋H）＋。
値：746.6；実測値：747.7（M＋H）＋。
【００４８】実施例３
化合物３（１５０ｍｇ、０．２０７ｍｍｏｌ）、コレス
テロール（８０ｍｇ、０．２０７ｍｍｍｏｌ）、ジパル
ミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）（２
９ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）、ポリエチレングリコー
ル結合ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン
（ＰＥＧ−ＤＰＰＥＡ）（８ｍｇ、０．００１４ｍｍｏ
ｌ)を秤量し、１００ｍＬのナス型フラスコに加えた。
ここにベンゼン（１０ｍＬ）を加え加温しながら完全溶
解させた。このものをドライアイス−メタノールで凍結
して凍結乾燥機に装着し、１０時間凍結乾燥した。この
ものに、ＤＰＰＧと等モルのＮａＯＨを含む注射用水
（２５ｍＬ）を添加してマグネットスターラーを用いて
撹拌し、均一に水相に分散させた。このものを液体窒素
で３分間凍結した後、４０℃の恒温槽中に１０分間静置
して融解させた。この操作を３回繰り返した後、液体窒
素で凍結させ凍結乾燥機に装着し、３０時間凍結乾燥し
て白色粉末状の混合脂質粉末を得た。この混合脂質粉末
（５０ｍｇ）を１０ｍＬのナス型フラスコに投入し、濃
度４０ｇ／ｄＬの一酸化炭素化したヘモグロビン溶液
（５ｍＬ）を加えた後、マグネットスターラーを用いて
室温で２時間撹拌した。これを口径２５φのEXTRUDER
（商品名、日油リポソーム製）に加え、加圧（２０ｋｇ
／ｃｍ2）しながら孔径３．０μｍ、０．４５μｍ、
０．３０μｍ、０．２２μｍのアセチルセルロースフィ
ルター（富士写真フイルム製）まで順に通過させた。作
成したサンプルについて超遠心分離（１０万ｇ、６０
分）を３回繰り返し、未内包ヘモグロビンを除去した。
人工肺（Capiox-II）を用いてこれに高圧ナトリウムラ
ンプからの白色光を照射して酸素をガスポートに通過さ
せることにより酸素に配位子交換することが出来る。こ
うして得たヘモグロビン内包小胞体について市販のコレ
ステロール定量キット及びヘモグロビン定量キットを用
いてコレステロール定量、ヘモグロビン（Ｈｂ）定量を
行った。コレステロール定量から総脂質重量を求め、ヘ
モグロビン重量を総脂質重量で除してヘモグロビン／総
脂質比を算出した。また、酸素結合解離平衡曲線はHEMO
X-ANALYZER（商品名、ＴＣＳ製）にて測定を行った。得
られた値を表１にまとめた。比較として化合物３の代わ
りにジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）
を用いて同様に調製したヘモグロビン小胞体の値を表１
に示すが、物性の大きな相違は無く、コリン型リン脂質
成分を代替できることが明らかである。
テロール（８０ｍｇ、０．２０７ｍｍｍｏｌ）、ジパル
ミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）（２
９ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）、ポリエチレングリコー
ル結合ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン
（ＰＥＧ−ＤＰＰＥＡ）（８ｍｇ、０．００１４ｍｍｏ
ｌ)を秤量し、１００ｍＬのナス型フラスコに加えた。
ここにベンゼン（１０ｍＬ）を加え加温しながら完全溶
解させた。このものをドライアイス−メタノールで凍結
して凍結乾燥機に装着し、１０時間凍結乾燥した。この
ものに、ＤＰＰＧと等モルのＮａＯＨを含む注射用水
（２５ｍＬ）を添加してマグネットスターラーを用いて
撹拌し、均一に水相に分散させた。このものを液体窒素
で３分間凍結した後、４０℃の恒温槽中に１０分間静置
して融解させた。この操作を３回繰り返した後、液体窒
素で凍結させ凍結乾燥機に装着し、３０時間凍結乾燥し
て白色粉末状の混合脂質粉末を得た。この混合脂質粉末
（５０ｍｇ）を１０ｍＬのナス型フラスコに投入し、濃
度４０ｇ／ｄＬの一酸化炭素化したヘモグロビン溶液
（５ｍＬ）を加えた後、マグネットスターラーを用いて
室温で２時間撹拌した。これを口径２５φのEXTRUDER
（商品名、日油リポソーム製）に加え、加圧（２０ｋｇ
／ｃｍ2）しながら孔径３．０μｍ、０．４５μｍ、
０．３０μｍ、０．２２μｍのアセチルセルロースフィ
ルター（富士写真フイルム製）まで順に通過させた。作
成したサンプルについて超遠心分離（１０万ｇ、６０
分）を３回繰り返し、未内包ヘモグロビンを除去した。
人工肺（Capiox-II）を用いてこれに高圧ナトリウムラ
ンプからの白色光を照射して酸素をガスポートに通過さ
せることにより酸素に配位子交換することが出来る。こ
うして得たヘモグロビン内包小胞体について市販のコレ
ステロール定量キット及びヘモグロビン定量キットを用
いてコレステロール定量、ヘモグロビン（Ｈｂ）定量を
行った。コレステロール定量から総脂質重量を求め、ヘ
モグロビン重量を総脂質重量で除してヘモグロビン／総
脂質比を算出した。また、酸素結合解離平衡曲線はHEMO
X-ANALYZER（商品名、ＴＣＳ製）にて測定を行った。得
られた値を表１にまとめた。比較として化合物３の代わ
りにジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）
を用いて同様に調製したヘモグロビン小胞体の値を表１
に示すが、物性の大きな相違は無く、コリン型リン脂質
成分を代替できることが明らかである。
【００４９】
【表１】
【００５０】実施例４
化合物５をクロロホルムに溶解させ（０．５ｍＭ）、マ
イクロシリンジにて２０μＬをＬＢ膜作成装置に充填し
た水面（純水）に展開した。バリヤーを移動させ、水面
圧が２５ｍＮ／ｍになるまで水面を圧縮し（２８ｃｍ2
／min）、単分子膜を作成した。グラファイト基板
（１．５ｃｍ×１．５ｃｍ）をこの水面に接触させ、単
分子膜をグラファイト基板表面に吸着させた。シリカゲ
ルを充填したデシケータ内に２４時間放置し乾燥させた
後、水滴の接触角を測定した。グラファイト基板の接触
角が１５２°であるのに対し、化合物５の単分子膜を吸
着させた表面では３２°となり、化合物５は疎水基をグ
ラファイト側に、両イオン性の親水基を表面側に向け配
向し、疎水性グラファイト表面が親水性表面に改質され
ていることを確認した。
イクロシリンジにて２０μＬをＬＢ膜作成装置に充填し
た水面（純水）に展開した。バリヤーを移動させ、水面
圧が２５ｍＮ／ｍになるまで水面を圧縮し（２８ｃｍ2
／min）、単分子膜を作成した。グラファイト基板
（１．５ｃｍ×１．５ｃｍ）をこの水面に接触させ、単
分子膜をグラファイト基板表面に吸着させた。シリカゲ
ルを充填したデシケータ内に２４時間放置し乾燥させた
後、水滴の接触角を測定した。グラファイト基板の接触
角が１５２°であるのに対し、化合物５の単分子膜を吸
着させた表面では３２°となり、化合物５は疎水基をグ
ラファイト側に、両イオン性の親水基を表面側に向け配
向し、疎水性グラファイト表面が親水性表面に改質され
ていることを確認した。
【００５１】
【化７】
【００５２】
【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
簡便な方法で安価に大量合成できる二本鎖の両イオン性
脂質が提供される。
簡便な方法で安価に大量合成できる二本鎖の両イオン性
脂質が提供される。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 森 かつら
神奈川県横浜市青葉区すすき野２丁目３番
４号 301号室
Ｆターム(参考） 4C076 AA11 BB11 DD52 FF68 GG45
4C084 AA02 CA26 MA05 MA66 NA10
ZA521
4H006 AA01 AB68 BS10 BT12 BU30
Claims (7)
- 【請求項１】 下記式 【化１】 （但し、ｍとｎは各々独立に１ないし４の整数、ｐは７
ないし２１の整数、Ｒは一つがＮＨ3 +であり、その他の
Ｒは全てＨである）で表される両イオン性脂質。 - 【請求項２】 ｍが３、ｎが２である請求項１に記載の
両イオン性脂質。 - 【請求項３】 ｍが３、ｎが２であり、末端カルボキシ
ル炭素から数えて４番目の炭素のＲがＮＨ3 +であり、そ
の他のＲがＨである請求項１に記載の両イオン性脂質。 - 【請求項４】 請求項１ないし３のいずれか１項に記載
の両イオン性脂質を、疎水性物質と水性媒体が接触する
界面に配向させて、該疎水性物質の表面を親水性表面に
改質することを特徴とする表面改質方法。 - 【請求項５】 請求項１ないし３のいずれか１項に記載
の両イオン性脂質を水溶性薬物と共に水性媒体に分散さ
せて形成される小胞体からなる水溶性薬剤の運搬体。 - 【請求項６】 請求項１ないし３のいずれか１項に記載
の両イオン性脂質を４０〜１００モル％含有する脂質の
膜で構成されており、内水相に水溶性薬剤が内包され、
水性媒体に分散している粒子径１００〜３００ｎｍの小
胞体からなる水溶性薬剤の運搬体。 - 【請求項７】 内水相に１０〜４０ｇ／ｄＬのヘモグロ
ビンが内包された請求項６に記載の運搬体。
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