JPH07291853A - リポソームおよび薬物運搬体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 標的部位に対する標的指向性および長期間の
保存安定性に優れ、しかも長期間にわたって血中濃度を
維持することが可能な薬物運搬体得る。 【構成】 下式のリン脂質誘導体を膜成分として含むリ
ポソームからなる薬物運搬体。 【化１】 〔Ｒ¹、Ｒ²は脂肪酸のアシル残基；ＡＯはオキシアルキ
レン基；ｎは１〜1000；Ｉｍｍｎｏは抗体または抗原；
Ｘ、Ｙは２価の有機基；ＺはＮＨ、ＯまたはＳ；ｐ、ｔ
は０または１；Ｍ¹はＨまたはアルカリ金属〕

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、リポソーム表面に（ポ
リ）オキシアルキレン鎖からなるスペーサーを介して抗
原または抗体が結合した標的指向性リポソーム、および
このリポソームからなる標的指向性薬物運搬体に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】リポソームはリン脂質の二分子膜からな
る小胞体であり、多分野での応用が試みられている。特
に、医薬運搬体、診断・検出用のセンサーなどへの応用
が注目されているが、リポソーム表面上または膜中に機
能性物質を固定して各種機能をもたせること、およびリ
ポソームの血中濃度を維持することなどが大きな課題と
なっている。

【０００３】従来、リポソーム表面上または膜中への機
能性物質の固定化に関しては、プルラン誘導体で被覆し
たリポソームの表面上の多糖上に置換したアミノエチル
カルバミルメチル基にγ−マレイミドブチルオキシサク
シニミジルを介して抗体フラグメントを結合させる方法
（Biochem. Biophys. Acta., 898, 323(1987)）、ある
いはあらかじめリポソーム膜形成成分中に糖脂質を加え
ておき、リポソーム形成後過よう素酸酸化を行い、生じ
たアルデヒド基と抗体とを反応させて固定化する方法
（J. Biol. Chem., 255, 10509(1980)）などがある。

【０００４】しかし、これらの従来法では、リポソーム
調製後にリポソーム膜表面上での多段階の化学反応を行
う必要があり、このため目的とする機能性物質の導入量
が低く制限され、また反応による副生成物や不純物が混
入し、リポソーム膜へのダメージが大きいなどの問題点
がある。

【０００５】一方、リポソームを生体内へ投与したと
き、その多くは肝臓、脾臓などの網内系器官で捕捉され
るため、十分な効果が得られないことが指摘されている
（Cancer Res., 43, 5328(1983)）。そこで、この網内
系器官で捕捉されてしまう問題点や、あるいはリポソー
ム自身の崩壊性・凝集性など安定性の低さに関する問題
点を改善する方法として、リポソームの表面にポリエチ
レングリコール鎖を導入することが試みられている（例
えば、特開平１−２４９７１７号公報、FEBS letters,
268, 235(1990)）。また、ポリエチレングリコールで修
飾されたリポソームは、長期間にわたり血液中濃度を維
持できることが明らかになっている（Biochem. Biophy
s. Acta., 1066, 29-36(1991)）。しかし、このような
方法により得られるポリエチレングリコール鎖の導入さ
れたリポソームは機能性物質と反応しないので、リポソ
ーム表面上に機能性物質を固定化することはできない。

【０００６】さらに、特開平４−３４６９１８号公報に
は、マレイミド基を有するリポソームにまずチオール基
を付与したタンパク質（チオール化タンパク質）を反応
させ、次いで残存マレイミド基にチオール基を付与した
ポリアルキレングリコール（チオール化ポリアルキレン
グリコール）部分を含む化合物を反応させることによ
り、網内系器官での取込の改善された薬剤含有抗体結合
リポソームが得られることが記載されている。しかし、
このリポソームでは、抗体がポリアルキレングリコール
層の下部に隠蔽され、標的部位の抗原との反応が妨げら
れるため、期待される効果が十分には得られないという
問題点がある。

【０００７】また特表平５−５０８３８８号公報には、
α−ステアリル−ω−プロピオン酸−ポリオキシエチレ
ンに代表されるようなアニオン基を有するポリエチレン
グリコール誘導体からなるリポソーム製剤が開示されて
いる。しかし、このポリエチレングリコール誘導体は、
疎水部がモノアルキル基であるためリポソーム膜から脱
離しやすく、このためこのようなポリエチレングリコー
ル誘導体を膜形成成分として含むリポソームは長期間の
安定性に劣るという問題点がある。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、標的
部位に対する標的指向性および長期間の保存安定性に優
れ、しかも長期間にわたって血中濃度を維持することが
可能なリポソーム、およびこれからなる標的指向性薬物
運搬体を提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、次のリポソー
ムおよび標的指向性薬物運搬体である。 （１）下記一般式〔１〕で表わされる抗体または抗原結
合リン脂質誘導体を膜形成成分として含むことを特徴と
するリポソーム。

【化２】 〔式中、Ｒ¹およびＲ²は炭素数３〜３０の脂肪酸のアシ
ル残基を表わし、同一でも異なっていてもよい。ＡＯは
炭素数２〜４のオキシアルキレン基、ｎはオキシアルキ
レン基の平均付加モル数で、１〜１０００の正数を表わ
す。ｎが２以上の場合、オキシアルキレン基は同一でも
異なっていてもよく、またランダム状に付加していて
も、ブロック状に付加していてもよい。Ｉｍｍｎｏは抗
体または抗原の残基、ＸおよびＹは２価の有機残基、Ｚ
はＮＨ、ＯまたはＳ、ｐは０または１、ｔは０または
１、Ｍ¹は水素原子またはアルカリ金属原子を表わ
す。〕 （２）内水相に薬物を内包することを特徴とする上記
（１）記載のリポソーム。 （３）上記（１）または（２）記載のリポソームからな
ることを特徴とする標的指向性薬物運搬体。

【００１０】本発明において、「（ポリ）オキシアルキ
レン」はオキシアルキレンまたはポリオキシアルキレン
を意味する。また「（ポリ）アルキレン」も上記と同様
にアルキレンまたはポリアルキレンを意味する。

【００１１】一般式〔１〕においてＲ¹またはＲ²で表わ
される脂肪酸のアシル残基は、炭素数３〜３０、好まし
くは８〜２０のアシル残基である。このようなアシル残
基の具体的なものとしては、プロピオン酸、酪酸、カプ
ロン酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウン
デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、
ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、リグノセリン
酸、ソロチン酸、モンタン酸、メリシン酸、２−エチル
ヘキサン酸等の飽和脂肪酸のアシル残基；オレイン酸、
リノール酸、リノレン酸、エルカ酸、２，４−オクタデ
カジエン酸等の不飽和脂肪酸のアシル残基；イソステア
リン酸等の分岐脂肪酸のアシル残基；リシノール酸、１
２−ヒドロキシステアリン酸等のアルキル基中に水酸基
を有する脂肪酸のアシル残基などがあげられる。

【００１２】これらの中では、安定なリポソームが形成
できるという理由から、ミリスチン酸、パルミチン酸、
ステアリン酸、オレイン酸、２，４−オクタデカジエン
酸のアシル残基が好ましく、特にパルミチン酸、ステア
リン酸、オレイン酸のアシル残基が好ましい。Ｒ¹とＲ²
とは同一であってもよいし、異なっていてもよい。

【００１３】一般式〔１〕のＡＯで表わされるオキシア
ルキレン基は、炭素数２〜４のオキシアルキレン基であ
り、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシト
リメチレン基、オキシ−１−エチルエチレン基、オキシ
−１，２−ジメチルエチレン基、オキシテトラメチレン
基などがあげられる。これらのオキシアルキレン基は、
エチレンオキシド、プロピレンオキシド、オキセタン、
１−ブテンオキシド、２−ブテンオキシド、テトラヒド
ロフランなどのアルキレンオキシドを付加重合させた基
である。一般式〔１〕のｎはオキシアルキレン基の平均
付加モル数であり、１〜１０００、好ましくは１０〜５
００、さらに好ましくは２０〜３００の正数である。

【００１４】ｎが２以上の場合、オキシアルキレン基の
種類は同一のものでも、異なるものでもよい。後者の場
合、ランダム状に付加していても、ブロック状に付加し
ていてもよい。親水性を付与する場合、ＡＯとしてはエ
チレンオキシドが単独で付加したものが好ましく、この
場合、ｎが１０以上のものが好ましい。また種類の異な
るアルキレンオキシドが付加している場合、エチレンオ
キシドが２０モル％以上、好ましくは５０モル％以上付
加しているのが望ましい。（ポリ）オキシアルキレン鎖
に親油性を付与する場合はエチレンオキシド以外の付加
モル数を多くする。

【００１５】一般式〔１〕のＩｍｍｎｏは抗体または抗
原の残基を表わす。この抗体としては、疾患部位の組織
または細胞に特異的に存在するエピトープに対して反応
性を有するものであり、ポリクローナル抗体、モノクロ
ーナル抗体、またはこれらの一部ユニットなどがあげら
れる。これらの抗体はヒト、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ニ
ワトリなどいかなる動物種由来のものであっても、また
いかなるハイブリドーマに由来するものであっても良
い。

【００１６】また抗原としては、疾患部位の組織または
細胞に特異的に存在する抗体に対して抗原となりうるも
のであれば制限されず、例えばタンパク質、オリゴ糖、
高分子糖、低分子ハプテン、コレステロールなどがあげ
られる。ただし、低分子ハプテンの場合には、固定化の
ために、その分子内にアミノ基、水酸基またはチオール
基のいずれかの官能基を有することが必要である。

【００１７】一般式〔１〕においてｐまたはｔはそれぞ
れ０または１であり、ｐまたはｔが１の場合、Ｘまたは
Ｙは２価の有機残基である。Ｘの具体的なものとして
は、次のような基などがあげられる。式中、ｑは１〜４
の整数を表わす。

【化３】 またＹの具体的なものとしては、次のような基などがあ
げられる。式中、ｕは１〜４の整数を表わす。

【化４】

【００１８】一般式〔１〕のＺはＮＨ、ＯまたはＳを表
わす。すなわちｔ＝１の場合は、Ｙで表わされる有機残
基とＩｍｍｎｏで表わされる抗体または抗原とはアミド
結合、エステル結合またはチオールエステル結合により
結合している。またｔ＝０の場合は、オキシアルキレン
基と抗体または抗原とはウレタン結合、カーボネート結
合またはチオカーボネート結合により結合している。一
般式〔１〕のＭ¹は水素原子またはナトリウムもしくは
カリウム等のアルカリ金属原子である。

【００１９】一般式〔１〕で表わされる抗体または抗原
結合リン脂質誘導体において、ｔが１のリン脂質誘導体
は、例えば下記一般式〔２ａ〕で表わされる末端にカル
ボキシル基を有するリン脂質誘導体と、前記抗体または
抗原とを反応させることにより、容易に製造することが
できる。

【００２０】

【化５】 〔式中、Ｒ¹、Ｒ²、ＡＯ、ｎ、Ｘ、Ｙ、ｐおよびＭ¹は
一般式〔１〕と同じである。Ｍ²は水素原子またはアル
カリ金属原子を表わす。〕 一般式〔２ａ〕のＭ²は水素原子またはナトリウムもし
くはカリウム等のアルカリ金属原子である。Ｍ¹とＭ²と
は同一でも異なっていてもよい。

【００２１】まず、一般式〔２ａ〕で表わされるリン脂
質誘導体の製造方法について説明する。一般式〔２ａ〕
で表わされるリン脂質誘導体は、例えば次のような方法
により製造することができる。 １）ホスファチジルエタノールアミンと、両末端にカル
ボン酸ハライド基を有する（ポリ）アルキレンオキシド
誘導体（以下、（ポリ）オキシアルキレン誘導体という
場合もある）とをトリエチルアミン、ピリジンなどの第
３級アミンの存在下で、１：１〜１：１０００の仕込み
モル比で反応させ、次に得られた化合物中に残存する活
性エステル基を加水分解して得る方法。 ２）ホスファチジルエタノールアミンと、両末端にカル
ボニル−Ｎ−オキシコハク酸イミド基、あるいはカルボ
ニル−１−オキシベンゾトリアゾール基、カルボニル−
Ｎ−オキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシ
イミド、カルボニル−Ｎ−オキシフタルイミド、カルボ
ニル−４−オキシフェニルジメチルスルホニウム＝メチ
ルサルフェートなどの活性化エステル基を有する（ポ
リ）アルキレンオキシド誘導体とを、１：１〜１：１０
００の仕込みモル比で反応させ、次に得られた化合物中
に残存する活性エステル基を加水分解して得る方法。

【００２２】３）ホスファチジルエタノールアミンと、
両末端にオキシカルボニルイミダゾール基を有する（ポ
リ）アルキレンオキシド誘導体とを、１：１〜１：１０
００の仕込みモル比で反応させ、次に得られた化合物中
に残存するオキシカルボニルイミダゾール基を加水分解
し、次に得られた化合物にさらに無水コハク酸、または
モノクロロ酢酸などを作用させて得る方法。 ４）ホスファチジルコリンと両末端に水酸基を有する
（ポリ）アルキレンオキシドとを、１：１〜１：１００
０の仕込みモル比で、ホスホリパーゼＤの存在下でエス
テル交換反応を行い、得られた化合物にさらに無水コハ
ク酸、またはモノクロロ酢酸などを作用させて得る方
法。

【００２３】これらの反応は、無溶媒で、または水、生
理的食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、炭酸緩衝液
などの水系溶媒中で、あるいはクロロホルム、塩化メチ
レン、ベンゼン、ジエチルエーテル、メタノール、エタ
ノール、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン、ア
セトニトリルなどの有機溶媒中で、−１００〜＋１００
℃、好ましくは０〜４０℃で、１０分間〜５００時間、
好ましくは３０分間〜１２時間行うのが望ましい。反応
終了後は、蒸留、再結晶、再沈澱、吸着剤処理、カラム
処理、イオン交換、ゲル濾過、限外濾過、透析、薄層ク
ロマトグラフィーなどの方法により単離・精製すること
ができる。

【００２４】上記のような方法により得られた一般式
〔２ａ〕で表わされる末端にカルボキシル基を有するリ
ン脂質誘導体に抗体または抗原を結合させるには、リン
脂質誘導体と抗体または抗原とを、水、生理的食塩水、
リン酸緩衝液、トリス緩衝液または炭酸緩衝液などの水
系溶媒中で、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ′−（２−モルホ
リノエチル）カルボジイミド＝メソ−ｐ−トルエンスル
ホネート、ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチ
ル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ド塩酸塩、１，１′−カルボニルジイミダゾールなどの
脱水縮合剤を用いて、０〜１００℃、アミド結合を形成
させる場合は好ましくは０〜６０℃、エステル結合また
はチオールエステル結合を形成させる場合は好ましくは
３０〜８０℃で、３０分間〜２００時間、好ましくは１
時間〜２４時間反応させることにより容易に行うことが
できる。

【００２５】また一般式〔１〕で表わされる抗体または
抗原結合リン脂質誘導体において、ｔが０のリン脂質誘
導体は、例えば下記一般式〔２ｂ〕で表わされる末端に
オキシカルボニルイミダゾール基を有するリン脂質誘導
体と、前記抗体または抗原とを反応させることにより、
容易に製造することができる。

【００２６】

【化６】 〔式中、Ｒ¹、Ｒ²、ＡＯ、ｎ、Ｘ、ｐおよびＭ¹は一般
式〔１〕と同じである。Ｒ³は水素原子またはメチル基
を表わす。〕

【００２７】一般式〔２ｂ〕で表わされるリン脂質誘導
体は、例えば次のような方法により製造することができ
る。 １）ホスファチジルコリンと両末端に水酸基を有する
（ポリ）オキシアルキレンとを、ホスホリパーゼＤの存
在下でエステル交換反応を行い、得られた化合物にさら
にＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールを反応させて得
る方法。 ２）ホスファチジルエタノールアミンと、片末端にカル
ボキシル基を有する（ポリ）オキシアルキレン誘導体と
を、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−（２−モルホリノエチ
ル）カルボジイミド＝メソ−ｐ−トルエンスルホネー
ト、ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸
塩、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールなどの脱水縮
合剤の存在下に脱水縮合した後、得られた化合物にさら
にＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールを反応させて得
る方法。 ３）ホスファチジルエタノールアミンと、両末端にオキ
シカルボニルイミダゾール基を有する（ポリ）オキシア
ルキレン誘導体とを、１：１〜１：１０００の仕込みモ
ル比で反応させて得る方法。

【００２８】これらの反応は、無溶媒で、または水、生
理的食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、炭酸緩衝
液、ホウ酸緩衝液などの水系溶媒中で、あるいはクロロ
ホルム、塩化メチレン、ベンゼン、ジエチルエーテル、
メタノール、エタノール、１，４−ジオキサン、テトラ
ヒドロフラン、アセトニトリルなどの有機溶媒中で、−
１００〜＋１００℃、好ましくは０〜４０℃で、１０分
間〜５００時間、好ましくは３０分間〜４８時間行うの
が望ましい。反応終了後は、蒸留、再結晶、再沈澱、吸
着剤処理、カラム処理、イオン交換、ゲル濾過、限外濾
過、透析、薄層クロマトグラフィーなどの方法により単
離・精製することができる。

【００２９】上記のような方法により得られた一般式
〔２ｂ〕で表わされる末端にオキシカルボニルイミダゾ
ール基を有するリン脂質誘導体に抗体または抗原を結合
させるには、リン脂質誘導体と抗体または抗原とを、
水、生理的食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液または
炭酸緩衝液などの水系溶媒中で、０〜１００℃、ウレタ
ン結合を形成させる場合は好ましくは０〜６０℃、カー
ボネート結合またはチオカーボネート結合を形成させる
場合は好ましくは５０〜８０℃で、３０分間〜２００時
間、好ましくは１時間〜４８時間反応させることにより
容易に行うことができる。

【００３０】本発明のリポソームは、このようにして得
られた一般式〔１〕で表わされるリン脂質誘導体を膜形
成成分として含むリポソームである。膜形成成分中に含
まれる一般式〔１〕で表わされるリン脂質誘導体の含有
量は、リン脂質誘導体および他の膜形成成分の合計量に
対して０．１〜５０モル％、好ましくは０．５〜３０モ
ル％であるのが望ましい。０．１モル％未満では期待さ
れる効果が小さくなるため、一般的には使用されない。
また５０モル％を超えるとリポソームの安定性が低下す
るので、一般的には使用されない。一般式〔１〕で表わ
されるリン脂質誘導体は、一種単独で使用することもで
きるし、二種以上のものを組合せて使用することもでき
る。

【００３１】一般式〔１〕で表わされるリン脂質誘導体
と混合して用いられる他の膜形成成分としては、従来か
らリポソームの膜形成成分として用いられているものが
制限なく使用できる。具体的には、ジホスファチジルグ
リセロール、カルジオリピン、ホスファチジルイノシト
ール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノー
ルアミン、大豆レシチン、卵黄レシチン、ホスファチジ
ルコリン、ホスファチジルグリセロール等のリン脂質お
よび脂肪酸部に不飽和基を有する重合性リン脂質；スル
ホキシリボシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセ
リド、ラクトシルジグリセリド等の糖脂質類；コレステ
ロール等の非極性脂質；その他には、非イオン性界面活
性剤、ホスファチジルポリエチレングリコール、「Bioc
hem. Biophys. Acta., 1066, 29-36(1991)」に記載され
ているホスファチジルエタノールアミンとポリエチレン
グリコールとの反応物、およびこれらの混合物などがあ
げられる。

【００３２】本発明のリポソームは、一般式〔１〕で表
わされるリン脂質誘導体およびレシチン、コレステロー
ル、リン脂質等の他の膜形成成分を、有機溶媒等の適当
な溶媒に溶解し、エクスツルージョン法、ボルテックス
ミキサー法、超音波法、界面活性剤除去法、逆層蒸発
法、エタノール注入法、プレベシクル法、フレンチプレ
ス法、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルジョン法、アニーリング法、凍
結融解法など、種々の公知の方法によりリポソーム化す
ることにより製造することができる。また、これらの製
造法を選択することにより、多重層リポソーム、小さな
一枚膜リポソーム、大きな一枚膜リポソームなど、種々
の大きさや形態を有するリポソームを製造することがで
きる。

【００３３】本発明のリポソームは、上記のように一般
式〔１〕で表わされる抗体または抗原結合リン脂質誘導
体を膜形成成分として用いて製造するほかに、一般式
〔２ａ〕または〔２ｂ〕で表わされるリン脂質誘導体を
膜形成成分として用いてリポソームを調製した後、抗体
または抗原を固定化することにより製造することもでき
る。

【００３４】一般式〔２ａ〕で表わされるリン脂質誘導
体を用いた場合のリポソーム上への抗体または抗原の固
定化反応は、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ′−（２−モルホ
リノエチル）カルボジイミド＝メソ−ｐ−トルエンスル
ホネート、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）カルボジイミド塩酸塩などの水溶性の脱水縮合剤
の存在下、またはこれらの水溶性脱水縮合剤により（ポ
リ）オキシアルキレン鎖の末端を活性化エステルにした
後、水系溶媒、例えば生理的食塩水またはｐＨ＝３〜１
０、好ましくは４〜８のリン酸緩衝液、炭酸緩衝液、ト
リス緩衝液もしくは酢酸緩衝液等の緩衝液など、あるい
はこれらの水系溶媒とメタノール、エタノール、アセト
ン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、１，４−ジ
オキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセタミ
ド、ジメチルスルホキシド、ピロリドン等の有機溶媒と
の混合溶媒中で、−１０〜＋１００℃、アミノ基との反
応の場合は好ましくは０〜５０℃、水酸基またはチオー
ル基との反応の場合は好ましくは３０〜８０℃で、１０
分間〜３００時間、好ましくは３０分間〜２４時間攪拌
下に反応させる方法などにより、容易に行うことができ
る。これらの条件外では、リポソームの安定性が悪くな
るため好ましくない。

【００３５】また、一般式〔２ｂ〕で表わされるリン脂
質誘導体を用いた場合のリポソーム上への抗体または抗
原の固定化反応は、水系溶媒、例えば生理的食塩水また
はｐＨ＝３〜１０、好ましくは５〜９のリン酸緩衝液、
炭酸緩衝液、トリス緩衝液，酢酸緩衝液もしくはホウ酸
緩衝液等の緩衝液など、あるいはこれらの水系溶媒とメ
タノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、テ
トラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、ジメチルホル
ムアミド、ジメチルアセタミド、ジメチルスルホキシ
ド、ピロリドン等の有機溶媒との混合溶媒中で、−１０
〜＋１００℃、アミノ基との反応の場合は好ましくは０
〜６０℃、水酸基またはチオール基との反応の場合は好
ましくは５０〜８０℃で、３０分間〜２００時間、好ま
しくは１時間〜４８時間攪拌下に反応させる方法などに
より、容易に行うことができる。

【００３６】リポソーム表面上での抗体または抗原のア
ミド結合による固定化反応を模式的に示すと次式〔３
ａ〕または〔３ｂ〕のようになる。式中、ＡＯ、ｎ、
Ｙ、Ｍ²、ＩｍｍｎｏおよびＲ³は前記と同じものを示
す。

【化７】

【００３７】さらに別の方法として、一般式〔１〕、
〔２ａ〕または〔２ｂ〕で表わされるリン脂質誘導体が
膜形成成分として含まれないリポソームを調製した後、
リポソームの２分子膜の相転移温度以上に保持し、ここ
に一般式〔１〕、〔２ａ〕または〔２ｂ〕で表わされる
リン脂質誘導体を混合し、３０分間〜４８時間インキュ
ベートし、一般式〔２ａ〕または〔２ｂ〕のリン脂質誘
導体を用いた場合はさらに上記方法により抗体または抗
原を固定化することにより、本発明のリポソームを製造
することもできる。

【００３８】またさらに別な方法として、次のような方
法によっても本発明のリポソームを製造することができ
る。すなわち、ホスファチジルエタノールアミンなどの
リン脂質を膜形成成分として含むリポソームを調製した
後、このリポソームに、両末端にオキシカルボニルイミ
ダゾールを有する（ポリ）オキシアルキレン誘導体、す
なわちα−オキシカルボニルイミダゾール−ω−カルボ
ニルイミダゾール＝（ポリ）オキシアルキレン誘導体を
反応させて、一般式〔２ｂ〕のリン脂質誘導体を膜形成
成分として含むリポソームを調製する。その後は上記と
同様にして、抗体または抗原を固定化する。

【００３９】上記反応において、（ポリ）オキシアルキ
レン誘導体を反応させる際の全反応液中のリポソームの
濃度は、固形分量として０．００１ｍｇ／ｍｌ〜１ｇ／
ｍｌ、好ましくは０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍ
ｌ、また（ポリ）オキシアルキレン誘導体の濃度は特に
制限されないが、０．００１ｍｇ／ｍｌ〜１ｇ／ｍｌ、
好ましくは０．０１ｍｇ／ｍｌ〜５００ｍｇ／ｍｌとす
るのが望ましい。反応は水系溶媒、例えば蒸留水、生理
的食塩水、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液も
しくは酢酸緩衝液等の緩衝液など、あるいはこれらの水
系溶媒とメタノール、エタノール、１，４−ジオキサン
等の有機溶媒との混合溶媒中で、ｐＨ３〜１１、好まし
くは７〜９、温度０〜１００℃、好ましくは０〜６０
℃、反応時間１０分間〜２００時間、好ましくは３０分
間〜２４時間の条件で、容易に行うことができる。

【００４０】反応終了後は、蒸留、再結晶、再沈澱、吸
着剤処理、カラム処理、イオン交換、ゲル濾過、限外濾
過、透析、薄層クロマトグラフィーなどの方法により単
離・精製することができる。なお、反応条件によって
は、２個以上が架橋されたリポソームが生成する場合も
あるが、この場合はゲル濾過または適当なポアサイズを
有するメンブランフィルターを用いて濾過を行うことに
より、目的とするリポソームを容易に分別することがで
きる。

【００４１】本発明のリポソームの内水相には、種々の
物質を封入することができるが、薬物が好ましい。薬物
としては特に限定されないが、抗ガン剤、抗生物質、抗
喘息薬、抗ウイルス薬など、長期間血中濃度が維持され
ることが望まれる薬物または特定の疾患部位や細胞への
標的指向性を意図した投与が必要な薬物などが好まし
い。

【００４２】上記抗ガン剤としては、例えば「がん化学
療法」（久保明良著、（株）南江堂発刊（１９８５
年））に記載されている抗ガン剤、中でもドクソルビシ
ン、アドリアマイシン、シスプラチン、マイトマイシ
ン、ブレオマイシン、５−フルオロウラシル、メソトレ
キサート、ナイトロジェンマスタード、ブスルファンな
どがあげられる。

【００４３】また、その他の薬物として、天然型または
遺伝子組み換え型のα、β、γ−インターフェロン、イ
ンターロイキン、スーパーオキシドデスムターゼ等のよ
うなペプチド系薬物；スルファゼン、ゲンタマイシン、
ストレプトマイシン等の抗生物質；アンチモン酸メグル
ミン等の抗原虫薬；ヘパリン、低分子量ヘパリン、ウロ
キナーゼ、トロンボモジュリン等の抗血栓剤；ムラミル
ペプチド類等の免疫賦活剤；テオフィリン等の抗喘息薬
などがあげられる。

【００４４】これら薬物のリポソーム内水相への封入
は、リポソーム調製時に予め薬物を溶解させた水溶液を
用いることによる方法、またはリポソーム調製後に、ｐ
Ｈ勾配法、浸透圧勾配法などを用いて封入する方法など
の方法により容易に行うことができる。このようにして
得られた薬物内包リポソームは、ゲル濾過、透析、限外
濾過、遠心分離などの方法により容易に精製することが
でき、薬物運搬体、リポソーム製剤などとして利用でき
る。

【００４５】本発明のリポソームは一般式〔１〕で表わ
されるリン脂質誘導体がＲ¹およびＲ²の２本の脂肪酸ア
シル残基を有しているため、直鎖状のポリアルキレング
リコール誘導体などと比べて、リポソーム膜中から脱離
しにくい。このため本発明のリポソームは長期間の保存
安定性に優れている。また本発明のリポソームは（ポ
リ）オキシアルキレン鎖の先端に抗体または抗原が結合
しているので、この抗体または抗原の作用が十分に発揮
され、このため特定物質に対する特異的反応性に優れ、
また標的部位に対する標的指向性（集積性）に優れてい
る。

【００４６】なお、本発明のリポソームを製造する際、
他の膜形成成分として重合性リン脂質を配合することに
より、重合性のリポソームとすることができる。重合性
のリン脂質としては、公知の重合性リン脂質を使用する
ことができるが、例えば１，２−ジ（２，４−オクタデ
カジエノイル）−３−ホスファチジルコリンの他、野島
庄七、砂本順三、井上圭三編集、１９８８年南江堂発行
の「リポソーム」ｐ３１３〜３１５に記載のものなどが
あげられる。これらの中では、１，２−ジ（２，４−オ
クタデカジエノイル）−３−ホスファチジルコリンが好
ましい。

【００４７】重合性リポソームは、リポソーム調製後
に、光重合開始剤の存在下または非存在下でＵＶ、γ
線、電子線などの光照射を行うことにより、あるいはレ
ドックス開始剤系により、あるいはアゾ系開始剤または
有機過酸化物などの存在下で加熱を行うことにより、容
易に重合を行うことができる。このようにして得られた
重合後のリポソームは、優れた安定性を有しているの
で、水溶液に分散させたままで、あるいは凍結乾燥等に
より粉末状に調製し、安定して使用することができる。

【００４８】本発明の標的指向性薬物運搬体は、前記の
ようなリポソームからなるものであり、リポソームの内
水相に薬物を内包させることにより、あるいはリポソー
ム膜に薬物を取り込むことにより、この薬物を運搬する
ものである。本発明の薬物運搬体を構成する前記リポソ
ームは、（ポリ）オキシアルキレン鎖の先端に結合した
抗体または抗原の作用が十分に発揮されるので、本発明
の薬物運搬体は、標的部位に対する標的指向性（集積
性）に優れたものとなり、このため薬物を標的部位に効
率よく運搬することができる。また本発明の薬物運搬体
はリポソームに（ポリ）オキシアルキレン鎖が導入され
ているので、肝臓や網内系器官で捕捉されにくくなり長
期間にわたって血中濃度を維持できるほか、凝集なども
防止され、これにより薬物を効率よく運搬することがで
きる。

【００４９】

【発明の効果】本発明のリポソームは、抗体または抗原
が結合した特定の構造を有する一般式〔１〕のリン脂質
誘導体を膜形成成分として含有しているので、標的指向
性および長期間の保存安定性に優れ、しかも長期間にわ
たって血中濃度を維持することができる。

【００５０】本発明の標的指向性薬物運搬体は、上記リ
ポソームからなっているので、種々の薬物を標的部位に
効率よく運搬することができる。

【００５１】

【実施例】以下、実施例により、さらに詳細な説明を行
うが、本発明はこれらに限定されるものではない。 合成例１ ジパルミトイルホスファチジルコリン０．５ｇ（０．６
８ｍｍｏｌ）およびポリエチレングリコール（Ｍｗ≒２
０００、ｎ≒４６）５ｇ（２．５ｍｍｏｌ）を溶解させ
たクロロホルム溶液４０ｍｌに、ホスホリパーゼＤ（旭
化成（株）製）４０単位を溶解させた１Ｍ酢酸緩衝液
（ｐＨ５．６）２０ｍｌを加え、４０℃で１２時間攪拌
して反応させた。次に、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶
液で中和した後、有機層を減圧下で濃縮した。得られた
反応混合物をシリカゲルカラム（２０％メタノール／ク
ロロホルム）を用いて分画し、濃縮した後、少量のクロ
ロホルムに溶解させ、これをヘキサンに再沈殿すること
により、ジパルミトイルホスファチジル＝ポリエチレン
グリコールを得た（収率３０％）。

【００５２】次に、乾燥させたクロロホルム１０ｍｌ中
に、上記ジパルミトイルホスファチジル＝ポリエチレン
グリコール１００ｍｇ（０．３７ｍｍｏｌ）、無水コハ
ク酸０．４ｍｇ（０．４ｍｍｏｌ）および触媒量のピリ
ジンを加え、６０℃で６時間攪拌した。得られた反応混
合物をヘキサン中に再沈殿させ、さらに限外濾過（分画
分子量５００）したのち凍結乾燥し、下記反応性リン脂
質誘導体を得た（収率８９％）。

【００５３】

【化８】

【００５４】合成例２ クロロホルム１０ｍｌ中に、合成例１の１段目の反応で
得られたジパルミトイルホスファチジル＝ポリエチレン
グリコール１００ｍｇ（０．３７ｍｍｏｌ）およびＮ，
Ｎ’−カルボニルジイミダゾール６４ｍｇ（０．４ｍｍ
ｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した後、ヘキサン中に
再沈殿し、次に限外濾過（分画分子量５００）した後凍
結乾燥し、下記反応性リン脂質誘導体を得た。

【００５５】

【化９】

【００５６】合成例３ １，４−ジオキサン１０ｍｌ中に、ポリエチレングリコ
ール（分子量約２０００）１ｇ（０．５ｍｍｏｌ）およ
びＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール１６２ｍｇ（１
ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌し、次に凍結乾燥
してα−オキシカルボニルイミダゾール−ω−カルボニ
ルイミダゾール＝ポリオキシエチレン（ｎ≒４６）を得
た（収率９４％）。

【００５７】合成例４ 合成例３において、ポリエチレングリコールの代わり
に、エチレンオキシド約９０モル％、プロピレンオキシ
ド１０モル％のランダム共重合ポリオキシアルキレン
（分子量約２５００）を用いた以外は、合成例３と同様
にしてα−オキシカルボニルイミダゾール−ω−カルボ
ニルイミダゾール＝ポリ（オキシエチレン＝オキシプロ
ピレン）ブロックポリマー（エチレンオキシドの平均付
加モル数約５０、プロピレンオキシドの平均付加モル数
約５、分子量約２５００）を得た（収率９１％）。

【００５８】実施例１−１ 卵黄ホスファチジルコリン２ｍｇ（２．６μｍｏｌ）、
コレステロール１ｍｇ（２．６μｍｏｌ）および合成例
１で得られたリン脂質誘導体８４０μｇ（前記二者に対
して６ｍｏｌ％）を含むリン脂質組成物をイソプロピル
エーテル／クロロホルム（１：１、Ｖ／Ｖ）６００μｌ
に溶解させ、これに１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１
０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝
液（以下ＭＥＳ緩衝液と略す）（ｐＨ５．５）３００μ
ｌを加えた。これを１分間、超音波照射し、Ｗ／Ｏエマ
ルジョンとした後、６０℃でゆっくりと有機溶媒を留去
した。さらに０．２μｍのポリカーボネートメンブラン
を通過させることにより、大きな一枚膜リポソームを得
た。

【００５９】次に、得られたリポソームにｐＨ勾配法を
用いて抗ガン剤であるドクソルビシン（以下ＤＸＲと略
す）を封入した。すなわち、上記のリポソーム分散液
に、ＤＸＲ １ｍｇを溶解させ、水酸化ナトリウムでｐ
Ｈ７．８に調整し、これを６０℃で１０分間インキュベ
ートした。さらに、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０を用い
てゲル濾過を行い、含リポソーム分画を分取し、ＤＸＲ
封入リポソームを得た。

【００６０】得られたリポソーム懸濁液に、０．２５Ｍ
の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド塩酸塩５８μｌおよび０．１ＭのＮ−ヒド
ロキシコハク酸イミド５８μｌを加え、室温で１０分間
静かに振とうすることによりポリオキシアルキレン鎖末
端に活性化エステル基を有するリポソームを得た。さら
に、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）５０μｌお
よび１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．５に調整
し、ここにマウスの肺内皮細胞表面にあるｇｐ１１２に
対するモノクローナル抗体（以下、３４Ａまたはモノク
ローナル抗体３４Ａと略す場合がある）５００μｇを加
え、４℃で８時間静かに振とうした後、ゲル濾過（Ｓｅ
ｐｈａｄｅｃ Ｇ−５０）により精製し、ＤＸＲ封入３
４Ａ担持リポソームを得た。

【００６１】このリポソームの平均粒径をレーザー散乱
粒度分布計（ＮＩＣＯＭＰ社製、ＮＩＣＯＭＰ３７０Ｈ
ＰＬ、商標）を用いて測定したところ、平均粒径１９２
ｎｍ（ＣＶ値１５％）であった。上記ＤＸＲ封入３４Ａ
担持リポソームを５℃で１か月間静置した後平均粒径を
測定したところ、平均粒径１９４ｎｍ、ＣＶ値１７％で
あり、安定性に優れていた。

【００６２】実施例１−２ 実施例１−１と同様にして、ただし下記のリン脂質誘導
体を用いてＤＸＲ封入３４Ａ担持リポソームを調製した
（平均粒径１８８ｎｍ，ＣＶ値１８％）。さらに、５℃
で一か月間静置した後平均粒径を測定したところ、平均
粒径１９１ｎｍ、ＣＶ値１９％であり、安定性に優れて
いた。

【化１０】

【００６３】実施例１−３ 実施例１−１と同様にして、ただし下記のリン脂質誘導
体を他の二成分に対して３０ｍｏｌ％用いて、またＤＸ
Ｒの代わりにアドリアマイシンを用いて、アドリアマイ
シン封入３４Ａ担持リポソームを得た（平均粒径２１１
ｎｍ，ＣＶ値２５％）。さらに、５℃で一か月間静置し
た後平均粒径を測定したところ、平均粒径２２０ｎｍ、
ＣＶ値２７％であり、安定性に優れていた。

【化１１】

【００６４】実施例１−４ 卵黄ホスファチジルコリン２ｍｇ（２．６μｍｏｌ）、
コレステロール１ｍｇ（２．６μｍｏｌ）および合成例
１で得られたリン脂質誘導体８４０μｇ（前記二者に対
して６ｍｏｌ％）からなるリン脂質組成物をナス型フラ
スコに入れ、２ｍｌのベンゼンで溶解させた後、凍結乾
燥を行った。これに５ｗｔ％の５−フルオロウラシルを
含む０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍｌを加
え、バス型超音波照射およびボルテックスミキサーによ
り、多重層リポソームを得た。さらにエクスツルーダー
により３．０→１．０→０．２μｍのポリカーボネート
メンブランを順次通過させ、大きな一枚膜リポソームを
得た。

【００６５】次にＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０を用いて
ゲル濾過して精製し、以下、実施例１−１と同様の方法
により、３４Ａを担持させ、５−フルオロウラシル封入
３４Ａ担持リポソームを得た。このリポソームの平均粒
径を測定したところ、平均粒径１９６ｎｍ（ＣＶ値１１
％）であった。さらに、５℃で一か月間静置した後平均
粒径を測定したところ、平均粒径２００ｎｍ、ＣＶ値１
４％であり、安定性に優れていた。

【００６６】実施例１−５ 実施例１−１と同様にして、ただし下記のリン脂質誘導
体を他の二成分に対して１ｍｏｌ％用いて、ＤＸＲ封入
３４Ａ担持リポソームを得た（平均粒径１４８ｎｍ，Ｃ
Ｖ値１９％）。さらに、５℃で一か月間静置した後平均
粒径を測定したところ、平均粒径１５２ｎｍ、ＣＶ値２
１％であり、安定性に優れていた。

【化１２】

【００６７】実施例１−６ 実施例１−１と同様にして、ただし下記のリン脂質誘導
体を他の二成分に対して１ｍｏｌ％用いてＤＸＲ封入３
４Ａ担持リポソームを得た（平均粒径１７３ｎｍ，ＣＶ
値１８％）。さらに、５℃で一か月間静置した後平均粒
径を測定したところ、平均粒径１８２ｎｍ、ＣＶ値２３
％であり、安定性に優れていた。

【化１３】

【００６８】実施例１−７ 実施例１−１と同様に、ただし下記のリン脂質誘導体を
他の二成分に対して１ｍｏｌ％用いて、平均粒径１８５
ｎｍ（ＣＶ値２３％）のＤＸＲ封入３４Ａ担持リポソー
ムを得た。さらに、５℃で一か月間静置した後平均粒径
を測定したところ、平均粒径１９６ｎｍ、ＣＶ値２７％
であり、安定性に優れていた。

【化１４】

【００６９】実施例１−８ 卵黄ホスファチジルコリン２ｍｇ（２．６μｍｏｌ）、
コレステロール１ｍｇ（２．６μｍｏｌ）および合成例
２で得られたリン脂質誘導体８４０μｇ（前記二者に対
して６ｍｏｌ％）を含むリン脂質組成物を、イソプロピ
ルエーテル／クロロホルム（１：１、Ｖ／Ｖ）６００μ
ｌに溶解させ、これに０．０５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ
９．０）３００μｌを加えた。これを１分間、超音波照
射し、Ｗ／Ｏエマルジョンとした後、６０℃でゆっくり
と有機溶媒を留去した。さらに粒径をそろえるために、
０．２μｍのポリカーボネートメンブランを通過させる
ことにより、大きな一枚膜リポソームを得た。

【００７０】次に実施例１−１と同様にしてＤＸＲを封
入した。得られたリポソーム懸濁液にモノクローナル抗
体３４Ａを５００μｇ加え、４℃で８時間静かに振とう
した後、ゲル濾過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０）によ
り精製し、ＤＸＲ封入３４Ａ担持リポソームを調製した
（平均粒径１７５ｎｍ、ＣＶ値１６％）。さらに、５℃
で一か月間静置した後平均粒径を測定したところ、平均
粒径１７９ｎｍ、ＣＶ値１８％であり、安定性に優れて
いた。

【００７１】実施例１−９ 卵黄ホスファチジルコリン２０ｍｇ（２６μｍｏｌ）、
コレステロール３．９ｍｇ（１０μｍｏｌ）およびジパ
ルミトイルホスファチジルエタノールアミン２．８ｍｇ
（４μｍｏｌ）をナス型フラスコに入れ、２ｍｌのベン
ゼンで溶解させた後、凍結乾燥を行った。これに、ＤＸ
Ｒ ０．２ｍｇを溶解させた生理的食塩水１ｍｌを加
え、バス型超音波照射およびボルテックスミキサーによ
り、多重層リポソームを得た。さらにエクスツルーダー
により３．０→１．０→０．２μｍのポリカーボネート
メンブランを順次通過させることにより、ＤＸＲを封入
した大きな一枚膜リポソームを得た。

【００７２】次に、得られたリポソーム分散液の５００
μｌに、合成例３で得られたα−オキシカルボニルイミ
ダゾール−ω−カルボニルイミダゾール＝ポリオキシエ
チレンを１０ｗｔ％の濃度で含む生理的食塩水１ｍｌを
加え、室温で２４時間反応させた。反応終了後、Ｓｅｐ
ｈａｄｅｘ Ｇ−５０を用いてゲル濾過を行い、含リポ
ソーム分画を分取し、反応性リポソームを得た。次に、
モノクローナル抗体３４Ａを５００μｇ加え、４℃で８
時間静かに振とうした後、ゲル濾過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ−５０）により精製し、ＤＸＲ封入３４Ａ担持リポ
ソームを得た（平均粒径１６６ｎｍ、ＣＶ値１６％）。
さらに、５℃で一か月間静置した後平均粒径を測定した
ところ、平均粒径１７２ｎｍ、ＣＶ値１８％であり、安
定性に優れていた。

【００７３】実施例１−１０ 実施例１−９と同様にして、だたしα−オキシカルボニ
ルイミダゾール−ω−カルボニルイミダゾール＝ポリオ
キシエチレンの代わりに合成例４で得られたα−オキシ
カルボニルイミダゾール−ω−カルボニルイミダゾール
＝ポリ（オキシエチレン＝オキシプロピレン）ブロック
ポリマーを用いて、ＤＸＲ封入３４Ａ担持リポソームを
得た（平均粒径１８２ｎｍ、ＣＶ値１９％）。さらに、
５℃で一か月間静置した後平均粒径を測定したところ、
平均粒径１９２ｎｍ、ＣＶ値２０％であり、安定性に優
れていた。

【００７４】比較例１ 卵黄ホスファチジルコリン２ｍｇ（２．６μｍｏｌ）、
コレステロール１ｍｇ（２．６μｍｏｌ）およびα−ス
テアリル−ポリエチレングリコールエーテル（平均付加
モル数約１０）３３０μｇ（０．５２μｍｏｌ、前記二
者に対して１０ｍｏｌ％）をナス型フラスコに入れ、２
ｍｌのベンゼンで溶解させた後、凍結乾燥を行った。こ
れに生理的食塩水１ｍｌを加え、バス型超音波照射およ
びボルテックスミキサーによりリポソーム化して多重層
リポソームを得た。さらにエクスツルーダーにより３．
０→１．０→０．２μｍのポリカーボネートメンブラン
を順次通過させ、大きな一枚膜リポソームを得た。

【００７５】得られたリポソームの平均粒径を実施例１
−１と同様にして測定したところ、粒径１９６ｎｍ（Ｃ
Ｖ値１１％）であった。さらに、５℃で一週間静置後、
再び平均粒径を測定したところ、２８８ｎｍ（ＣＶ値６
５％）と、平均粒径、ＣＶ値ともに大きく変化してお
り、リポソームが安定に存在していないことが分かっ
た。

【００７６】実施例２−１ １）抗体担持リポソームの調製 卵黄ホスファチジルコリン２ｍｇ（２．６μｍｏｌ）、
コレステロール１ｍｇ（２．６μｍｏｌ）および合成例
１で得られたリン脂質誘導体８４０μｇ（前記二者に対
して６ｍｏｌ％）を含むリン脂質組成物を、⁶⁷ガリウム
−デフェロキサミン約３０ＫＢｑを含むイソプロピルエ
ーテル／クロロホルム（１：１、Ｖ／Ｖ）６００μｌに
溶解させ、これに１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０
ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液
（ｐＨ５．５）３００μｌを加えた。これを１分間、超
音波照射し、Ｗ／Ｏエマルジョンとした後、６０℃でゆ
っくりと有機溶媒を留去した。さらに粒径をそろえるた
めに、０．２μｍのポリカーボネートメンブランを通過
させることにより、大きな一枚膜リポソームを得た（平
均粒径１８６ｎｍ、ＣＶ値１４％）。

【００７７】得られたリポソーム懸濁液に０．２５Ｍの
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド塩酸塩５８μｌおよび０．１ＭのＮ−ヒドロ
キシコハク酸イミド５８μｌを加え、室温で１０分間静
かに振とうすることによりポリオキシアルキレン鎖（Ｐ
ＥＧ）末端に活性化エステル基を有するリポソームを得
た。さらに、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）５
０μｌおよび１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．
５に調整し、ここにマウスの肺内皮細胞表面にあるｇｐ
１１２に対するモノクローナル抗体３４Ａを５００μｇ
加え、４℃で８時間静かに振とうした後、ゲル濾過（Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０）により精製し、 ⁶⁷Ｇａでラ
ベルされた３４Ａ担持−ＰＥＧ修飾リポソームを得た。

【００７８】２）３４Ａ担持リポソームのマウス静脈注
射１時間後の各臓器中における滞留割合の評価 上記１）で得られた⁶⁷Ｇａラベル−３４Ａ担持リポソー
ムをＢａｌｂ／ｃマウス（７週齢、体重２０〜２３ｇ、
雄）の尾静脈に５００μｇ／マウス（ｎ＝３）となるよ
う注射し、１時間後に屠殺した。各臓器中の⁶⁷Ｇａ量を
カウントし、投与時の全カウント数に対する割合を求
め、滞留割合とした。結果を表１に示す。

【００７９】比較例２−１ 卵黄ホスファチジルコリン２ｍｇ（２．６μｍｏｌ）お
よびコレステロール１ｍｇ（２．６μｍｏｌ）およびＮ
−グルタリル−ジステアリルエタノールアミン２３０μ
ｇ（前記二者に対して６ｍｏｌ％）を含むリン脂質組成
物を用い、実施例２−１と同様にしてポリカーボネート
メンブランを通過させるまでの操作を行い、⁶⁷Ｇａラベ
ル−リポソームを得た。次に実施例１−１と同様の方法
により、３４Ａを担持させ、⁶⁷Ｇａでラベルされた３４
Ａ担持リポソームを得た（平均粒径１８８ｎｍ、ＣＶ値
２３％）。このリポソームを用いて、実施例２−１と同
様にしてマウス各臓器中の滞留割合を求めた。結果を表
１に示す。

【００８０】比較例２−２ 卵黄ホスファチジルコリン２ｍｇ（２．６μｍｏｌ）、
コレステロール１ｍｇ（２．６μｍｏｌ）および合成例
１で得られた化合物８４０μｇ（前記二者に対して６ｍ
ｏｌ％）を含むリン脂質組成物を用い、実施例２−１と
同様にしてポリカーボネートメンブランを通過させるま
での操作を行い、⁶⁷ＧａでラベルされたＰＥＧ修飾リポ
ソームを得た（平均粒径１８６ｎｍ、ＣＶ値１４％）。
このリポソームを用いて、実施例２−１と同様にしてマ
ウス各臓器中の滞留割合を求めた。結果を表１に示す。

【００８１】比較例２−３ 卵黄ホスファチジルコリン２ｍｇ（２．６μｍｏｌ）お
よびコレステロール１ｍｇ（２．６μｍｏｌ）のみを含
むリン脂質組成物を用い、実施例２−１と同様にしてポ
リカーボネートメンブランを通過させるまでの操作を行
い、⁶⁷Ｇａでラベルされたリポソームを得た。このリポ
ソームを用いて、実施例２−１と同様にしてマウス各臓
器中の滞留割合を求めた。結果を表１に示す。

【００８２】

【表１】 注１：数値は３頭の平均値±標準誤差を示す。

【００８３】表１の結果から、肺の内皮細胞表面に対し
て特異的反応性を有する抗体３４Ａを担持した実施例２
−１のリポソーム製剤は、ＰＥＧ鎖を介さずに３４Ａを
担持したリポソーム（比較例２−１）、ＰＥＧ修飾リポ
ソーム（比較例２−２）および一般のリポソーム（比較
例２−３）と比較して、肺に対する優れた集積性（標的
指向性）を有していることが明らかとなった。なお、実
施例２−１のリポソーム製剤は、血液での滞留割合が比
較例２−２などに比べて小さいが、これは肺に集積した
ことによる結果であり、血液中で長時間にわたって血中
濃度が維持されないことを示すものではない。

【００８４】実施例２−２ 卵黄ホスファチジルコリン２ｍｇ（２．６μｍｏｌ）、
コレステロール１ｍｇ（２．６μｍｏｌ）および合成例
２で得られたリン脂質誘導体８４０μｇ（前記二者に対
して６ｍｏｌ％）を含むリン脂質組成物を、⁶⁷Ｇａ−デ
フェロキサミン約３０ＫＢｑを含むイソプロピルエーテ
ル／クロロホルム（１：１、Ｖ／Ｖ）６００μｌに溶解
させ、これに０．０５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）３
００μｌを加えた。これを１分間、超音波照射し、Ｗ／
Ｏエマルジョンとした後、６０℃でゆっくりと有機溶媒
を留去した。さらに粒径をそろえるために、０．２μｍ
のポリカーボネートメンブランを通過させることによ
り、大きな一枚膜リポソームを得た。

【００８５】得られたリポソーム懸濁液にモノクローナ
ル抗体３４Ａを５００μｇ加え、４℃で８時間静かに振
とうした後、ゲル濾過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０）
により精製し、⁶⁷Ｇａでラベル化された３４Ａ担持−Ｐ
ＥＧ修飾リポソームを得た（平均粒径１８４ｎｍ、ＣＶ
値１５％）。次に実施例２−１の２）と同様にして、３
４Ａ担持−ＰＥＧ修飾リポソームのマウス静脈注射１時
間後の各臓器における滞留割合の評価を行った。結果を
表２に示す。

【００８６】実施例２−３ 卵黄ホスファチジルコリン１．８ｍｇ（２．３μｍｏ
ｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン
０．１３ｍｇ（０．２３μｍｏｌ）およびコレステロー
ル１ｍｇ（２．６μｍｏｌ）を含むリン脂質組成物を、
⁶⁷Ｇａ−デフェロキサミン約３０ＫＢｑを含むイソプロ
ピルエーテル／クロロホルム（１：１、Ｖ／Ｖ）６００
μｌに溶解させ、これに１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含
む１０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸
緩衝液（ｐＨ５．５）３００μｌを加えた。これを１分
間、超音波照射し、Ｗ／Ｏエマルジョンとした後、６０
℃でゆっくりと有機溶媒を留去した。さらに粒径をそろ
えるために、０．２μｍのポリカーボネートメンブラン
を通過させることにより、大きな一枚膜リポソームを得
た。

【００８７】次に、得られたリポソーム分散液の５００
μｌに、合成例３により得られたα−オキシカルボニル
イミダゾール−ω−カルボニルイミダゾール＝ポリオキ
シエチレンを１０ｗｔ％の濃度で含む生理的食塩水１ｍ
ｌを加え、室温で２４時間反応させた。反応終了後、Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０を用いてゲル濾過を行い、含
リポソーム分画を分取し、反応性リポソームを得た。次
に、モノクローナル抗体３４Ａを５００μｇ加え、４℃
で８時間静かに振とうした後、ゲル濾過（Ｓｅｐｈａｄ
ｅｘ Ｇ−５０）により精製し、⁶⁷Ｇａでラベル化され
た３４Ａ担持−ＰＥＧ修飾リポソームを得た（平均粒径
１６６ｎｍ、ＣＶ値１６％）。次に実施例２−１の２）
と同様にして、３４Ａ担持−ＰＥＧ修飾リポソームのマ
ウス静脈注射１時間後の各臓器における滞留割合の評価
を行った。結果を表２に示す。

【００８８】比較例２−４ 卵黄ホスファチジルコリン２ｍｇ（２．６μｍｏｌ）、
コレステロール１ｍｇ（２．６μｍｏｌ）および合成例
２で得られたリン脂質誘導体８４０μｇ（前記二者に対
して６ｍｏｌ％）を含むリン脂質組成物を用い、実施例
２−２と同様にしてポリカーボネートメンブランを通過
させるまでの操作を行い、⁶⁷Ｇａでラベル化されたＰＥ
Ｇ修飾リポソームを得た（平均粒径１８８ｎｍ、ＣＶ値
１５％）。このリポソームを用いて、実施例２−１と同
様にしてマウス各臓器における滞留割合を求めた。結果
を表２に示す。

【００８９】

【表２】 注１：数値は３頭の平均値±標準誤差を示す。

【００９０】表２の結果から、肺の内皮細胞表面に対し
て特異的反応性を有する抗体３４Ａを担持した実施例２
−２および実施例２−３のリポソーム製剤は、ＰＥＧ修
飾リポソーム（比較例２−４）と比較して、肺に対する
優れた集積性（標的指向性）を有していることが明らか
となった。なお、実施例２−２および実施例２−３のリ
ポソーム製剤は、血液での滞留割合が比較例２−４に比
べて小さいが、これは肺に集積したことによる結果であ
り、血液中で長時間にわたって血中濃度が維持されない
ことを示すものではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 31/70 38/00

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記一般式〔１〕で表わされる抗体また
   は抗原結合リン脂質誘導体を膜形成成分として含むこと
   を特徴とするリポソーム。 【化１】 〔式中、Ｒ¹およびＲ²は炭素数３〜３０の脂肪酸のアシ
   ル残基を表わし、同一でも異なっていてもよい。ＡＯは
   炭素数２〜４のオキシアルキレン基、 ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で、１〜１０
   ００の正数を表わす。ｎが２以上の場合、オキシアルキ
   レン基は同一でも異なっていてもよく、またランダム状
   に付加していても、ブロック状に付加していてもよい。
   Ｉｍｍｎｏは抗体または抗原の残基、 ＸおよびＹは２価の有機残基、 ＺはＮＨ、ＯまたはＳ、 ｐは０または１、ｔは０または１、 Ｍ¹は水素原子またはアルカリ金属原子を表わす。〕
2. 【請求項２】 内水相に薬物を内包することを特徴とす
   る請求項１記載のリポソーム。
3. 【請求項３】 請求項１または２記載のリポソームから
   なることを特徴とする標的指向性薬物運搬体。