JP3956402B2 - アンホテリシンｂ運搬体 - Google Patents
アンホテリシンｂ運搬体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3956402B2 JP3956402B2 JP04615596A JP4615596A JP3956402B2 JP 3956402 B2 JP3956402 B2 JP 3956402B2 JP 04615596 A JP04615596 A JP 04615596A JP 4615596 A JP4615596 A JP 4615596A JP 3956402 B2 JP3956402 B2 JP 3956402B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amphotericin
- group
- liposome
- antibody
- carrier
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リポソームからなるアンホテリシンＢ運搬体、さらに詳しくは抗真菌剤であるアンホテリシンＢを効率よく投与するための薬物運搬体として利用されるアンホテリシンＢ運搬体である。
【０００２】
【従来の技術】
アンホテリシンＢは、免疫能が低下した肺疾患患者に対する優れた抗真菌剤であるが、腎障害、発熱、嘔吐、けいれん、過敏症、貧血などの副作用が強く、臨床的な使用に制限がある（Ｄｒｕｇｓ，４４，９−３５（１９９４））。そこで毒性の低減を目的に、アンホテリシンＢをリポソームの二分子膜中に担持したリポソーム製剤の製造法などが多く開示されている（特開昭５９−１７３１３３号、ＵＳ４７６６０４６、ＵＳ４６６３１６７）。
【０００３】
しかしながら、アンホテリシンＢは水には不溶の薬物であり、リポソームにカプセル化する際には、脂質二分子膜中に担持される。しかし、単にリポソームにカプセル化しただけでは担持量は少なく、また毒性は低下するものの血中滞留性が低く、十分な効果が得られないことが問題点として指摘されている。
【０００４】
一方、ポリエチレングリコール修飾リポソームにアンホテリシンＢを担持することにより良好な血中滞留性および毒性の低下が達成できることが報告されている。（ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, 39, 1954(1995))。しかし、このようなポリエチレングリコール修飾リポソームでもアンホテリシンＢの担持量は依然少なく、十分な効果を得るには至っていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、アンホテリシンＢの毒性を低減することができるほか、アンホテリシンＢの担持量（含有量）を幅広く調節することができ、しかも血中滞留性が高いアンホテリシンＢ運搬体を提供することである。
本発明の他の目的は、アンホテリシンＢの毒性を低減することができるほか、アンホテリシンＢの担持量を幅広く調節することができ、しかも血中滞留性が高く、かつ標的指向性をも有するアンホテリシンＢ運搬体を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は次のアンホテリシンＢ運搬体である。
（１）リポソーム中にアンホテリシンＢを担持したアンホテリシンＢ運搬体であって、リポソーム膜形成成分として下記一般式（１）で表される化合物を、オキシアルキレン部の含有量が全リポソーム膜形成成分に対して２０重量％以上の含有量となる量で含有することを特徴とするアンホテリシンＢ運搬体（第１のアンホテリシンＢ運搬体）。
【化６】
〔式中、Ｘは
【化７】
から選ばれる２価の残基、
ｐは１を示す。
ＯＡは炭素数２〜４のオキシアルキレン基、
ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で１０〜３００の正数を示す。
Ｒ1およびＲ2はそれぞれ炭素数８〜３０の脂肪酸残基を示す。
Ｒ3は水酸基、メトキシ基またはエトキシ基を示す。〕
（２） リポソーム中にアンホテリシンＢを担持したアンホテリシンＢ運搬体であって、リポソーム膜形成成分として下記一般式（２）で表される化合物を含むことを特徴とするアンホテリシンＢ運搬体（第２のアンホテリシンＢ運搬体）。
【化８】
〔式中、Ｘは
【化９】
から選ばれる２価の残基、
ｐは１を示す。
ＯＡは炭素数２〜４のオキシアルキレン基、
ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で１０〜３００の正数を示す。
Ｒ1およびＲ2はそれぞれ炭素数８〜３０の脂肪酸残基を示す。
−Ｙ 1 〜Ｎ(Ｈ)q−Ｉｍは
【化１０】
から選ばれるリジン残基を含む抗体または抗体フラグメント、
ｑは０または１を示す。〕
【０００７】
一般式（１）および（２）において、Ｒ1およびＲ2で示される炭素数８〜３０の脂肪酸残基としては、好ましくは炭素数８〜２０の脂肪酸残基が望ましい。このような脂肪酸残基の具体的なものとしては、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ソロチン酸、モンタン酸、メリシン酸、２−エチルヘキサン酸等の飽和脂肪酸の脂肪酸残基；オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、エルカ酸、２，４−オクタデカジエン酸等の不飽和脂肪酸の脂肪酸残基；イソステアリン酸等の分岐脂肪酸の脂肪酸残基；リシノール酸、１２−ヒドロキシステアリン酸等のアルキル基中に水酸基を有する脂肪酸の脂肪酸残基などがあげられる。これらの中では、安定なリポソームが形成できるという理由から、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、２，４−オクタデカジエン酸の脂肪酸残基が好ましく、特にミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸の脂肪酸残基が好ましい。また、Ｒ1およびＲ2の２つの脂肪酸残基はそれぞれ異なる残基であってもよい。
【０００８】
一般式（１）および（２）において、ＯＡで表されるオキシアルキレン基は、炭素数２〜４のオキシアルキレン基であり、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシトリメチレン基、オキシ−１−エチルエチレン基、オキシ−１，２−ジメチルエチレン基、オキシテトラメチレン基などがあげられる。これらのオキシアルキレン基は、エチレンオキシド、プロピレンオキシド、オキセタン、１−ブテンオキシド、２−ブテンオキシド、テトラヒドロフランなどのアルキレンオキシドを付加重合させた基である。
【０００９】
一般式（１）および（２）におけるｎは１０〜３００、好ましくは２０〜１２０の正数である。ＯＡで示されるオキシアルキレン基の種類は同一のものでも、異なるものでもよい。後者の場合、ランダム状に付加していても、ブロック状に付加していてもよい。親水性を付与する場合には、ＯＡとしてはエチレンオキシドが単独で付加したものが最も好ましい。また種類の異なるアルキレンオキシドが付加している場合、エチレンオキシドが２０モル％以上、好ましくは５０モル％以上付加しているのが望ましい。
【００１０】
一般式（１）および（２）において、Ｘで表される２価の残基としては、次の基から選ばれる基があげられる。
【化１１】
【００１１】
一般式（２）において、−Ｙ1〜Ｎ(Ｈ)ｑ−Ｉｍで表される基としては、次の基から選ばれる基があげられる。
【化１２】
【００１２】
ここで、Ｉｍで表される抗体または抗体フラグメントは、アンホテリシンＢを集中的に投与したい部位に特異的に結合する抗体または抗体フラグメントであり、アンホテリシンＢ運搬体に標的指向性を付与するためのものである。
このような抗体または抗体フラグメントとしては、ＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＥなどの抗体またはこれらをペプシンなどの酵素で消化して得られる抗体フラグメントなどがあげられる。これらの抗体はヒト、マウス、ウサギ、ラット、豚、牛、ヒツジ、トリなどいかなる動物種に由来するものであってもよく、またモノクローナル抗体の場合、いかなるハイブリドーマ細胞から得られたものであってもよい。
【００１３】
本発明の第１および第２のアンホテリシンＢ運搬体において、一般式（１）または（２）以外のリポソーム膜形成成分としては、従来からリポソームの膜形成成分として使用されているものが制限なく使用できる。具体的には、ジホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、大豆レシチン、卵黄レシチン、ホスファチジルコリン等のリン脂質および脂肪酸部に不飽和基を有する重合性リン脂質；スルホキシリボシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ラクトシルジグリセリド等の糖脂質類；コレステロール等の非極性脂質；非イオン性界面活性剤、ホスファチジルポリエチレングリコール、「Biochem. Biophys. Acta, 1066,29-36(1991)」に記載されているホスファチジルエタノールアミンとポリエチレングリコールとの反応物、およびこれらの混合物などがあげられる。
【００１４】
本発明の第１のアンホテリシンＢ運搬体において、一般式（１）で表される化合物の含有量は、リポソームの全膜形成成分に対して、一般式（１）で表される化合物中のオキシアルキレン部の含有量が２０重量％以上となる量である。この含有量未満ではアンホテリシンＢの担持量が低くなり十分な効果が得られないため好ましくない。
【００１５】
本発明の第１のアンホテリシンＢ運搬体は、一般式（１）で表される化合物を含む膜形成成分にアンホテリシンＢを混合し、このような混合物から公知の方法によりリポソームを形成することにより製造することができるが、次のような方法が好ましい。
まず一般式（１）で表される化合物、前記その他の膜形成成分およびアンホテリシンＢをクロロホルム等の有機溶剤に溶解した後、有機溶剤を除去し、乾燥脂質を形成する。
【００１６】
次に、上記乾燥脂質に、１〜３０重量％、好ましくは５〜１５重量％のサッカロース水溶液を加えて水和を行う。これによりアンホテリシンＢ担持リポソームが得られる。水和を行う際の方法は特に制限されず、従来からリポソームの製造に採用されている方法が採用できる。具体的な方法としては、エクスツルージョン法、ボルテックスミキサー法、超音波法、界面活性剤除去法、逆相蒸発法、エタノール注入法、プレベシクル法、フレンチプレス法、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルジョン法、アニーリング法、凍結融解法等があげられる。これらの方法を選択することにより、多重層リポソーム、小さな一枚膜リポソーム、大きな一枚膜リポソームなど、種々の大きさや形態を有するリポソームを製造することができ、本発明の第１のアンホテリシンＢ運搬体が得られる。本発明では、リポソームの大きさや形態に特に制限はない。
【００１７】
なお、一般式（１）で表される化合物を製造するには、例えば次のような方法などがあげられる。
１）ホスファチジルコリンと、一方の末端に水酸基、他方の末端にＲ3基を有する（ポリ）オキシアルキレン誘導体とを、ホスホリパーゼＤの存在下でエステル交換反応を行う方法。
２）ホスファチジルエタノールアミンと、一方の末端にカルボキシル基、他方の末端にＲ3基を有する（ポリ）オキシアルキレン誘導体とを、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ′−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド＝メソ−ｐ−トルエンスルホネート、ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、Ｎ，Ｎ′−カルボニルジイミダゾールなどの脱水縮合剤の存在下に脱水縮合する方法。
一般式（１）で表される化合物の製造方法の詳細は、特開平７−１５７４９３号、特開平７−２９１８５３号などに記載されている。
【００１８】
本発明の第２のアンホテリシンＢ運搬体において、一般式（２）で表される化合物のリポソームの全膜形成成分に対する含有量は０．１〜３０モル％、好ましくは１〜２０モル％が適当である。この場合、オキシアルキレン部の含有量が、リポソームの全膜形成成分に対して２０重量％以上となるのが好ましいが、２０重量％未満であってもよい。すなわち、オキシアルキレン基の含有量が２０重量％以上の場合、アンホテリシンＢの担持量が多くなり好ましいが、本発明の第２のアンホテリシンＢ運搬体は標的指向性を有しているので、必ずしも担持量を多くする必要はなく、オキシアルキレン部の含有量が２０重量％未満の場合でも十分な薬効が得られる。なお、一般式（２）においては、Ｉｍで示される抗体または抗体フラグメントはその種類により式量が大きく変動するため、オキシアルキレン部の上記含有量の算出には、Ｉｍで示される抗体または抗体フラグメントの式量を除いた一般式（２）の式量を採用する。
一般式（２）で表される化合物の含有量が０．１モル％未満では、標的指向性の十分な効果が得られないほか、アンホテリシンＢの担持量を多くすることが難しくなる。一方、３０モル％を超えるとリポソームの安定性が低下する。
【００１９】
本発明の第２のアンホテリシンＢ運搬体は抗原または抗原フラグメントに起因する標的指向性を有しているので、従来のリポソームに比べて標的組織または細胞などへの集積性が高く、このためアンホテリシンＢの投与量を少なくしても十分な薬効を得ることができる。また従来と同量のアンホテリシンＢを投与する場合は、アンホテリシンＢの担持量は少なくてもよい。
【００２０】
本発明の第２のアンホテリシンＢ運搬体は、例えば次の方法などにより容易に製造することができる。
１）：下記一般式（３）で表されるオキシアルキレン基末端に抗体と反応可能な基を有する化合物を膜形成成分として含有するリポソームを調製した後、このリポソームと抗体とを反応させる方法。
２）：下記一般式（３）で表されるオキシアルキレン基末端に抗体と反応可能な基を有する化合物と抗体とを反応させて一般式（２）で表される化合物を製造した後、この化合物を膜形成成分として用いてリポソームを調製する方法。
いずれの方法においても、リポソームは前記第１のアンホテリシンＢ運搬体の場合と同様にして製造することができる。
【００２１】
【化７】
などを示す。Ｘ、ｐ、ＯＡ、ｎ、Ｒ1およびＲ2は前記と同じものを示す。〕
【００２２】
上記製法１）において、一般式（３）のＹ2で示される抗体または抗体フラグメントと反応可能な基がオキシカルボニルイミダゾール基の場合、このような化合物を膜形成成分として含むリポソームと抗体または抗体フラグメントとを適当な緩衝液中で混合して反応させることにより製造することができる。この場合、オキシカルボニルイミダゾール基（Ｙ2）と抗体または抗体フラグメント中のリジン残基とが反応してカルバミン酸結合が形成されて抗体または抗体フラグメントがリポソームに結合される。
【００２３】
また上記製法１）において、一般式（３）のＹ2で示される抗体または抗体フラグメントと反応可能な基がカルボキシル基の場合、このような化合物を膜形成成分として含むリポソームと抗体または抗体フラグメントとを、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液などの適当な緩衝液中で、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩などの水溶性脱水縮合剤を用いて、好ましくはｐＨ＝４〜１２、温度０〜６０℃で反応させることにより製造することができる。この場合、カルボキシル基（Ｙ2）と抗体または抗体フラグメント中のリジン残基とが反応し、アミド結合を介して抗体または抗体フラグメントがリポソームに結合される。
【００２４】
また上記製法１）において、一般式（３）のＹ2で示される抗体または抗体フラグメントと反応可能な基がアルデヒド基の場合、このような化合物を膜形成成分として含むリポソームと抗体または抗体フラグメントとを適当な緩衝液中で混合して反応させることにより製造することができる。この場合、シッフ塩基が形成されることにより抗体または抗体フラグメントがリポソームに結合される。さらに上記反応を、水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤を用いて行うことにより、Ｎ−アルキル結合を形成させて結合させることもできる。
【００２５】
前記製法２）において、一般式（３）のＹ2で示される抗体または抗体フラグメントと反応可能な基がオキシカルボニルイミダゾール基の場合、このような化合物と抗体または抗体フラグメントとを適当な緩衝液中で混合して反応させ、カルバミン酸結合を形成させて結合させることにより、一般式（２）で表される化合物を製造することができる。次に得られた化合物を膜形成成分として用いてリポソームを調製する。
【００２６】
また前記製法２）において、一般式（３）のＹ2で示される抗体または抗体フラグメントと反応可能な基がカルボキシル基の場合、このような化合物と抗体または抗体フラグメントとを適当な緩衝液中で、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩などの水溶性脱水縮合剤を用いて、好ましくはｐＨ＝４〜１２、温度０〜６０℃で反応させることにより、一般式（２）で表される化合物を製造することができる。この場合、カルボキシル基（Ｙ2）と抗体または抗体フラグメント中のリジン残基とが反応し、アミド結合が形成されて結合され、一般式（２）で表される化合物が得られる。他の方法としては、クロロホルム、メタノール、エタノールなどの有機溶媒中で一般式（３）で表される化合物と、Ｎ−ヒドロキシスクシイミド、４−ヒドロキシフェニルジメチルスルホニウムメチルサルフェートなどとをＢＯＰ試薬、１，１′−カルボニルジイミダゾール、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ′−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド メソ−ｐ−トルエン＝スルホネート、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジエチルホスホロシアニデート、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリンなどの脱水縮合剤を用いて反応させた後、これと抗体または抗体フラグメントとを適当な緩衝液中で反応させることにより製造することもできる。次に得られた化合物を膜形成成分として用いてリポソームを調製する。
【００２７】
また前記製法２）において、一般式（３）のＹ2で示される抗体または抗体フラグメントと反応可能な基がアルデヒド基の場合、このような化合物と抗体または抗体フラグメントとを適当な緩衝液中で混合し、シッフ塩基を形成させて結合させることにより、一般式（２）で表わされる化合物を製造することができる。さらにこの反応を、水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤を用いて行うことにより、Ｎ−アルキル結合を形成させて結合させることもできる。次に得られた化合物を膜形成成分として用いてリポソームを調製する。
【００２８】
なお、一般式（３）で表される化合物を製造するには、例えば次のような方法などがあげられる。
１）ホスファチジルエタノールアミンと、両末端にカルボン酸ハライド基を有する（ポリ）オキシアルキレン誘導体とを第３級アミンの存在下で反応させ、次に得られた化合物中に残存する活性エステル基を加水分解して得る方法。
２）ホスファチジルエタノールアミンと、両末端にカルボニル−Ｎ−オキシコハク酸イミド基、あるいはカルボニル−１−オキシベンゾトリアゾール基、カルボニル−Ｎ−オキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドなどの活性化エステル基を有する（ポリ）オキシアルキレン誘導体とを反応させ、次に得られた化合物中に残存する活性エステル基を加水分解して得る方法。
３）ホスファチジルコリンと両末端に水酸基を有する（ポリ）オキシアルキレンとをホスホリパーゼＤの存在下でエステル交換反応を行い、得られた化合物にさらに無水コハク酸、モノクロロ酢酸、またはＮ，Ｎ′−カルボニルジイミダゾールなどを作用させて得る方法。
一般式（３）で表される化合物の製造方法の詳細は、特開平７−１５７４９３号、特開平７−２４２６８０号、特開平７−２４２６８１号、特開平７−２９１８５３号などに記載されている。
【００２９】
【発明の効果】
本発明の請求項１のアンホテリシンＢ運搬体は、リポソーム膜形成成分として一般式（１）で表される化合物を特定量含有しているので、アンホテリシンＢの毒性を低減することができるほか、アンホテリシンＢの担持量（含有量）を幅広く調節することができ、しかも血中滞留性が高い。
本発明の請求項２のアンホテリシンＢ運搬体は、リポソーム膜形成成分として一般式（２）で表される化合物を含有しているので、アンホテリシンＢの毒性を低減することができるほか、アンホテリシンＢの担持量（含有量）を幅広く調節することができ、しかも血中滞留性が高く、かつ標的指向性を有している。
【００３０】
【発明の実施の形態】
以下具体的な実施例を用いてより詳細な説明を行うが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１−１
ジパルミトイルホスファチジルコリン３．９６ｍｇ（５．４μｍｏｌ）およびコレステロール１．０４ｍｇ（２．７μｍｏｌ）を３００μｌのクロロホルムに溶解した。これに、アンホテリシンＢ ０．７５ｍｇ（０．８μｍｏｌ）およびこれらに対して６ｍｏｌ％に相当する下式（４）で表される化合物（ポリエチレングリコール部の分子量約３０００）１．９５ｍｇ（ポリエチレングリコール部の含有量２６重量％）を加熱溶解させたクロロホルム３００μｌを加えてよく混合し、窒素ガス雰囲気下で溶媒を蒸発させた後、さらに減圧下で乾燥させた。
【化８】
【００３１】
ここに、９重量％サッカロース水溶液３００μｌを加え、凍結−解氷を４回繰返すことにより、リポソームを調製した。次に孔径０．４、０．２、０．１μｍのメンブランを順次通過させることにより、リポソームの粒径を調整した。次に遠心分離（１０００００ｒｐｍ、１０分間）により精製し、目的のアンホテリシンＢ含有リポソームを得た。
次に、上記で得られたリポソームをメタノールに加えて２ｍｌに調製し、４０５ｎｍの吸光度からリポソーム中のアンホテリシンＢの定量を行った。結果を表１に示す。
【００３２】
実施例１−２
実施例１−１と同様にして、ただし式（４）の化合物の代わりに下式（５）の化合物（ポリエチレングリコール部の分子量約２２００、ポリエチレングリコール部の含有量２０重量％）を用いてアンホテリシンＢ含有リポソームを調製し、リポソーム中のアンホテリシンＢの担持量を測定した。結果を表１に示す。
【化９】
【００３３】
比較例１
実施例１−１と同様にして、ただし式（４）の化合物の代わりに下式（６）の化合物（ポリエチレングリコール部の分子量約１０００）６ｍｏｌ％（ポリエチレングリコール部の含有量１０重量％）を用いてアンホテリシンＢ含有リポソームを調製し、リポソーム中のアンホテリシンＢの担持量を測定した。結果を表１に示す。
【化１０】
【００３４】
実施例１−３
実施例１−１と同様にして、ただし式（４）の化合物を８ｍｏｌ％（ポリエチレングリコール部の含有量３５重量％）用いてアンホテリシンＢ含有リポソームを調製し、リポソーム中のアンホテリシンＢの担持量を測定した。結果を表１に示す。
【００３５】
実施例１−４
実施例１−１と同様にして、ただし式（４）の化合物を１０ｍｏｌ％（ポリエチレングリコール部の含有量４３重量％）用いてアンホテリシンＢ含有リポソームを調製し、リポソーム中のアンホテリシンＢの担持量を測定した。結果を表１に示す。
【００３６】
実施例１−５
実施例１−１と同様にして、ただし式（４）の化合物を１２ｍｏｌ％（ポリエチレングリコール部の含有量５２重量％）用いてアンホテリシンＢ含有リポソームを調製し、リポソーム中のアンホテリシンＢの担持量を測定した。結果を表１に示す。
【００３７】
実施例１−６
実施例１−１と同様にして、ただし式（４）の化合物を１５ｍｏｌ％（ポリエチレングリコール部の含有量６５重量％）用いてアンホテリシンＢ含有リポソームを調製し、リポソーム中のアンホテリシンＢの担持量を測定した。結果を表１に示す。
【００３８】
比較例２
実施例１−１と同様にして、ただし式（４）の化合物を３ｍｏｌ％（ポリエチレングリコール部の含有量１３重量％）用いてアンホテリシンＢ含有リポソームを調製し、リポソーム中のアンホテリシンＢの担持量を測定した。結果を表１に示す。
【００３９】
【表１】
【００４０】
実施例２−１
ジパルミトイルホスファチジルコリン３．９６ｍｇ（５．４μｍｏｌ）およびコレステロール１．０４ｍｇ（２．７μｍｏｌ）を３００μｌのクロロホルムに溶解した。これに、アンホテリシンＢ ０．７５ｍｇ（０．８μｍｏｌ）およびこれらに対して６ｍｏｌ％の下式（７）の化合物（ポリエチレングリコール部の分子量約３０００）１．９５ｍｇ（ポリエチレングリコール部の含有量２６重量％）を加熱溶解させたクロロホルム３００μｌを加えてよく混合し、窒素ガス雰囲気下で溶媒を蒸発させた後、さらに減圧下で乾燥させた。
【化１１】
【００４１】
ここに、９重量％サッカロース水溶液３００μｌを加え、凍結−解氷を４回繰返すことにより、リポソームを調製した。次に孔径０．４、０．２、０．１μｍのメンブランを順次通過させることにより、リポソームの粒径を調整した後、遠心分離（１０００００ｒｐｍ、１０分間）により精製した。
【００４２】
次に、上記でリポソームを５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液−生理的食塩水の１ｍｌに分散させ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩２０ｍｇおよびＮ−ヒドロキシスルホスクシイミド２０ｍｇを加え、室温で１０分間攪拌した後、２００μｌのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．５）を加え、さらに１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ＝７．５に調整した。ここに、マウスの肺内皮細胞表面に存在するＧＰ１２０に特異的に結合するモノクローナル抗体３４Ａおよびこれをラジオアイソトープラベル化した125Ｉ−３４Ａを加え、室温で２時間攪拌した。その後、遠心分離（４℃、１０００００ｒｐｍ、１０分間）により精製し、標的指向性を有するアンホテリシンＢ含有リポソームを得た。
【００４３】
比較例３
実施例１−１において、式（４）で表される化合物を用いなかったこと以外は実施例１−１と同様にしてポリエチレングリコール部を持たないアンホテリシンＢ含有リポソームを得た。得られたリポソーム中のアンホテリシンＢの担持量は、脂質１ｍｇあたり１４．５８μｇであった。
【００４４】
実施例３−１
実施例１−１、２−１および比較例３で得られたリポソーム（アンホテリシンＢ運搬体）をマウスに静注し、１時間後および６時間後の組織中のアンホテリシンＢを高速液体クロマトグラフィーにて定量することにより評価し、表２、表３に示した。
【００４５】
【表２】
【００４６】
【表３】
【００４７】
実施例４−１
A.fumigatus：ＭＦ−１３を２．０×１０6分生子／マウスでＢＡＬＢ／ｃマウスに経鼻感染させたＢＡＬＢ／ｃマウス肺アスペルギルス症モデルによる治療実験を行った。実施例１−１、２−１および比較例３で得られたアンホテリシンＢ運搬体を５日間繰返し投与後、４週間１００％生存するための投与量は、
比較例３ １０．０ｍｇ／ｋｇ
実施例１−１ ３．０ｍｇ／ｋｇ
実施例２−１ ２．０ｍｇ／ｋｇ
であり、実施例のもの、特に３４Ａを担持したリポソームで優れた薬理効果が得られた。
【００４８】
また、同じ投与方法で、投与量２．０ｍｇ／ｋｇでの４週間後の生存率は、
比較例３ ２０％
実施例１−１ ８０％
実施例２−１ １００％
であり、実施例のもので優れた生存率が得られた。
【００４９】
実施例１−１〜１〜６の結果（表１）より、本発明のアンホテリシンＢ運搬体は一般式（１）で表される化合物のオキシアルキレン部の分子量および含有率に応じて、アンホテリシンＢのリポソーム中への担持量（含有量）を調節できることが明らかである。
さらに、実施例２−２の結果（表２）より、抗体を有する本発明のアンホテリシンＢ運搬体は、優れた血中滞留性と標的指向性を有することが明らかである。
また、毒性に関しては、実施例４−１の結果より、本発明によるポリエチレングリコール部を２０重量％以上含むアンホテリシンＢ担持リポソームは、ポリエチレングリコール部を持たないものに比べて毒性が低減され、また抗体を担持したものではさらに顕著に毒性が低減されることが明らかである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、リポソームからなるアンホテリシンＢ運搬体、さらに詳しくは抗真菌剤であるアンホテリシンＢを効率よく投与するための薬物運搬体として利用されるアンホテリシンＢ運搬体である。
【０００２】
【従来の技術】
アンホテリシンＢは、免疫能が低下した肺疾患患者に対する優れた抗真菌剤であるが、腎障害、発熱、嘔吐、けいれん、過敏症、貧血などの副作用が強く、臨床的な使用に制限がある（Ｄｒｕｇｓ，４４，９−３５（１９９４））。そこで毒性の低減を目的に、アンホテリシンＢをリポソームの二分子膜中に担持したリポソーム製剤の製造法などが多く開示されている（特開昭５９−１７３１３３号、ＵＳ４７６６０４６、ＵＳ４６６３１６７）。
【０００３】
しかしながら、アンホテリシンＢは水には不溶の薬物であり、リポソームにカプセル化する際には、脂質二分子膜中に担持される。しかし、単にリポソームにカプセル化しただけでは担持量は少なく、また毒性は低下するものの血中滞留性が低く、十分な効果が得られないことが問題点として指摘されている。
【０００４】
一方、ポリエチレングリコール修飾リポソームにアンホテリシンＢを担持することにより良好な血中滞留性および毒性の低下が達成できることが報告されている。（ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, 39, 1954(1995))。しかし、このようなポリエチレングリコール修飾リポソームでもアンホテリシンＢの担持量は依然少なく、十分な効果を得るには至っていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、アンホテリシンＢの毒性を低減することができるほか、アンホテリシンＢの担持量（含有量）を幅広く調節することができ、しかも血中滞留性が高いアンホテリシンＢ運搬体を提供することである。
本発明の他の目的は、アンホテリシンＢの毒性を低減することができるほか、アンホテリシンＢの担持量を幅広く調節することができ、しかも血中滞留性が高く、かつ標的指向性をも有するアンホテリシンＢ運搬体を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は次のアンホテリシンＢ運搬体である。
（１）リポソーム中にアンホテリシンＢを担持したアンホテリシンＢ運搬体であって、リポソーム膜形成成分として下記一般式（１）で表される化合物を、オキシアルキレン部の含有量が全リポソーム膜形成成分に対して２０重量％以上の含有量となる量で含有することを特徴とするアンホテリシンＢ運搬体（第１のアンホテリシンＢ運搬体）。
【化６】
【化７】
ｐは１を示す。
ＯＡは炭素数２〜４のオキシアルキレン基、
ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で１０〜３００の正数を示す。
Ｒ1およびＲ2はそれぞれ炭素数８〜３０の脂肪酸残基を示す。
Ｒ3は水酸基、メトキシ基またはエトキシ基を示す。〕
（２） リポソーム中にアンホテリシンＢを担持したアンホテリシンＢ運搬体であって、リポソーム膜形成成分として下記一般式（２）で表される化合物を含むことを特徴とするアンホテリシンＢ運搬体（第２のアンホテリシンＢ運搬体）。
【化８】
【化９】
ｐは１を示す。
ＯＡは炭素数２〜４のオキシアルキレン基、
ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で１０〜３００の正数を示す。
Ｒ1およびＲ2はそれぞれ炭素数８〜３０の脂肪酸残基を示す。
−Ｙ 1 〜Ｎ(Ｈ)q−Ｉｍは
【化１０】
ｑは０または１を示す。〕
【０００７】
一般式（１）および（２）において、Ｒ1およびＲ2で示される炭素数８〜３０の脂肪酸残基としては、好ましくは炭素数８〜２０の脂肪酸残基が望ましい。このような脂肪酸残基の具体的なものとしては、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ソロチン酸、モンタン酸、メリシン酸、２−エチルヘキサン酸等の飽和脂肪酸の脂肪酸残基；オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、エルカ酸、２，４−オクタデカジエン酸等の不飽和脂肪酸の脂肪酸残基；イソステアリン酸等の分岐脂肪酸の脂肪酸残基；リシノール酸、１２−ヒドロキシステアリン酸等のアルキル基中に水酸基を有する脂肪酸の脂肪酸残基などがあげられる。これらの中では、安定なリポソームが形成できるという理由から、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、２，４−オクタデカジエン酸の脂肪酸残基が好ましく、特にミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸の脂肪酸残基が好ましい。また、Ｒ1およびＲ2の２つの脂肪酸残基はそれぞれ異なる残基であってもよい。
【０００８】
一般式（１）および（２）において、ＯＡで表されるオキシアルキレン基は、炭素数２〜４のオキシアルキレン基であり、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシトリメチレン基、オキシ−１−エチルエチレン基、オキシ−１，２−ジメチルエチレン基、オキシテトラメチレン基などがあげられる。これらのオキシアルキレン基は、エチレンオキシド、プロピレンオキシド、オキセタン、１−ブテンオキシド、２−ブテンオキシド、テトラヒドロフランなどのアルキレンオキシドを付加重合させた基である。
【０００９】
一般式（１）および（２）におけるｎは１０〜３００、好ましくは２０〜１２０の正数である。ＯＡで示されるオキシアルキレン基の種類は同一のものでも、異なるものでもよい。後者の場合、ランダム状に付加していても、ブロック状に付加していてもよい。親水性を付与する場合には、ＯＡとしてはエチレンオキシドが単独で付加したものが最も好ましい。また種類の異なるアルキレンオキシドが付加している場合、エチレンオキシドが２０モル％以上、好ましくは５０モル％以上付加しているのが望ましい。
【００１０】
一般式（１）および（２）において、Ｘで表される２価の残基としては、次の基から選ばれる基があげられる。
【化１１】
一般式（２）において、−Ｙ1〜Ｎ(Ｈ)ｑ−Ｉｍで表される基としては、次の基から選ばれる基があげられる。
【化１２】
ここで、Ｉｍで表される抗体または抗体フラグメントは、アンホテリシンＢを集中的に投与したい部位に特異的に結合する抗体または抗体フラグメントであり、アンホテリシンＢ運搬体に標的指向性を付与するためのものである。
このような抗体または抗体フラグメントとしては、ＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＥなどの抗体またはこれらをペプシンなどの酵素で消化して得られる抗体フラグメントなどがあげられる。これらの抗体はヒト、マウス、ウサギ、ラット、豚、牛、ヒツジ、トリなどいかなる動物種に由来するものであってもよく、またモノクローナル抗体の場合、いかなるハイブリドーマ細胞から得られたものであってもよい。
【００１３】
本発明の第１および第２のアンホテリシンＢ運搬体において、一般式（１）または（２）以外のリポソーム膜形成成分としては、従来からリポソームの膜形成成分として使用されているものが制限なく使用できる。具体的には、ジホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、大豆レシチン、卵黄レシチン、ホスファチジルコリン等のリン脂質および脂肪酸部に不飽和基を有する重合性リン脂質；スルホキシリボシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ラクトシルジグリセリド等の糖脂質類；コレステロール等の非極性脂質；非イオン性界面活性剤、ホスファチジルポリエチレングリコール、「Biochem. Biophys. Acta, 1066,29-36(1991)」に記載されているホスファチジルエタノールアミンとポリエチレングリコールとの反応物、およびこれらの混合物などがあげられる。
【００１４】
本発明の第１のアンホテリシンＢ運搬体において、一般式（１）で表される化合物の含有量は、リポソームの全膜形成成分に対して、一般式（１）で表される化合物中のオキシアルキレン部の含有量が２０重量％以上となる量である。この含有量未満ではアンホテリシンＢの担持量が低くなり十分な効果が得られないため好ましくない。
【００１５】
本発明の第１のアンホテリシンＢ運搬体は、一般式（１）で表される化合物を含む膜形成成分にアンホテリシンＢを混合し、このような混合物から公知の方法によりリポソームを形成することにより製造することができるが、次のような方法が好ましい。
まず一般式（１）で表される化合物、前記その他の膜形成成分およびアンホテリシンＢをクロロホルム等の有機溶剤に溶解した後、有機溶剤を除去し、乾燥脂質を形成する。
【００１６】
次に、上記乾燥脂質に、１〜３０重量％、好ましくは５〜１５重量％のサッカロース水溶液を加えて水和を行う。これによりアンホテリシンＢ担持リポソームが得られる。水和を行う際の方法は特に制限されず、従来からリポソームの製造に採用されている方法が採用できる。具体的な方法としては、エクスツルージョン法、ボルテックスミキサー法、超音波法、界面活性剤除去法、逆相蒸発法、エタノール注入法、プレベシクル法、フレンチプレス法、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルジョン法、アニーリング法、凍結融解法等があげられる。これらの方法を選択することにより、多重層リポソーム、小さな一枚膜リポソーム、大きな一枚膜リポソームなど、種々の大きさや形態を有するリポソームを製造することができ、本発明の第１のアンホテリシンＢ運搬体が得られる。本発明では、リポソームの大きさや形態に特に制限はない。
【００１７】
なお、一般式（１）で表される化合物を製造するには、例えば次のような方法などがあげられる。
１）ホスファチジルコリンと、一方の末端に水酸基、他方の末端にＲ3基を有する（ポリ）オキシアルキレン誘導体とを、ホスホリパーゼＤの存在下でエステル交換反応を行う方法。
２）ホスファチジルエタノールアミンと、一方の末端にカルボキシル基、他方の末端にＲ3基を有する（ポリ）オキシアルキレン誘導体とを、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ′−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド＝メソ−ｐ−トルエンスルホネート、ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、Ｎ，Ｎ′−カルボニルジイミダゾールなどの脱水縮合剤の存在下に脱水縮合する方法。
一般式（１）で表される化合物の製造方法の詳細は、特開平７−１５７４９３号、特開平７−２９１８５３号などに記載されている。
【００１８】
本発明の第２のアンホテリシンＢ運搬体において、一般式（２）で表される化合物のリポソームの全膜形成成分に対する含有量は０．１〜３０モル％、好ましくは１〜２０モル％が適当である。この場合、オキシアルキレン部の含有量が、リポソームの全膜形成成分に対して２０重量％以上となるのが好ましいが、２０重量％未満であってもよい。すなわち、オキシアルキレン基の含有量が２０重量％以上の場合、アンホテリシンＢの担持量が多くなり好ましいが、本発明の第２のアンホテリシンＢ運搬体は標的指向性を有しているので、必ずしも担持量を多くする必要はなく、オキシアルキレン部の含有量が２０重量％未満の場合でも十分な薬効が得られる。なお、一般式（２）においては、Ｉｍで示される抗体または抗体フラグメントはその種類により式量が大きく変動するため、オキシアルキレン部の上記含有量の算出には、Ｉｍで示される抗体または抗体フラグメントの式量を除いた一般式（２）の式量を採用する。
一般式（２）で表される化合物の含有量が０．１モル％未満では、標的指向性の十分な効果が得られないほか、アンホテリシンＢの担持量を多くすることが難しくなる。一方、３０モル％を超えるとリポソームの安定性が低下する。
【００１９】
本発明の第２のアンホテリシンＢ運搬体は抗原または抗原フラグメントに起因する標的指向性を有しているので、従来のリポソームに比べて標的組織または細胞などへの集積性が高く、このためアンホテリシンＢの投与量を少なくしても十分な薬効を得ることができる。また従来と同量のアンホテリシンＢを投与する場合は、アンホテリシンＢの担持量は少なくてもよい。
【００２０】
本発明の第２のアンホテリシンＢ運搬体は、例えば次の方法などにより容易に製造することができる。
１）：下記一般式（３）で表されるオキシアルキレン基末端に抗体と反応可能な基を有する化合物を膜形成成分として含有するリポソームを調製した後、このリポソームと抗体とを反応させる方法。
２）：下記一般式（３）で表されるオキシアルキレン基末端に抗体と反応可能な基を有する化合物と抗体とを反応させて一般式（２）で表される化合物を製造した後、この化合物を膜形成成分として用いてリポソームを調製する方法。
いずれの方法においても、リポソームは前記第１のアンホテリシンＢ運搬体の場合と同様にして製造することができる。
【００２１】
【化７】
【００２２】
上記製法１）において、一般式（３）のＹ2で示される抗体または抗体フラグメントと反応可能な基がオキシカルボニルイミダゾール基の場合、このような化合物を膜形成成分として含むリポソームと抗体または抗体フラグメントとを適当な緩衝液中で混合して反応させることにより製造することができる。この場合、オキシカルボニルイミダゾール基（Ｙ2）と抗体または抗体フラグメント中のリジン残基とが反応してカルバミン酸結合が形成されて抗体または抗体フラグメントがリポソームに結合される。
【００２３】
また上記製法１）において、一般式（３）のＹ2で示される抗体または抗体フラグメントと反応可能な基がカルボキシル基の場合、このような化合物を膜形成成分として含むリポソームと抗体または抗体フラグメントとを、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液などの適当な緩衝液中で、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩などの水溶性脱水縮合剤を用いて、好ましくはｐＨ＝４〜１２、温度０〜６０℃で反応させることにより製造することができる。この場合、カルボキシル基（Ｙ2）と抗体または抗体フラグメント中のリジン残基とが反応し、アミド結合を介して抗体または抗体フラグメントがリポソームに結合される。
【００２４】
また上記製法１）において、一般式（３）のＹ2で示される抗体または抗体フラグメントと反応可能な基がアルデヒド基の場合、このような化合物を膜形成成分として含むリポソームと抗体または抗体フラグメントとを適当な緩衝液中で混合して反応させることにより製造することができる。この場合、シッフ塩基が形成されることにより抗体または抗体フラグメントがリポソームに結合される。さらに上記反応を、水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤を用いて行うことにより、Ｎ−アルキル結合を形成させて結合させることもできる。
【００２５】
前記製法２）において、一般式（３）のＹ2で示される抗体または抗体フラグメントと反応可能な基がオキシカルボニルイミダゾール基の場合、このような化合物と抗体または抗体フラグメントとを適当な緩衝液中で混合して反応させ、カルバミン酸結合を形成させて結合させることにより、一般式（２）で表される化合物を製造することができる。次に得られた化合物を膜形成成分として用いてリポソームを調製する。
【００２６】
また前記製法２）において、一般式（３）のＹ2で示される抗体または抗体フラグメントと反応可能な基がカルボキシル基の場合、このような化合物と抗体または抗体フラグメントとを適当な緩衝液中で、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩などの水溶性脱水縮合剤を用いて、好ましくはｐＨ＝４〜１２、温度０〜６０℃で反応させることにより、一般式（２）で表される化合物を製造することができる。この場合、カルボキシル基（Ｙ2）と抗体または抗体フラグメント中のリジン残基とが反応し、アミド結合が形成されて結合され、一般式（２）で表される化合物が得られる。他の方法としては、クロロホルム、メタノール、エタノールなどの有機溶媒中で一般式（３）で表される化合物と、Ｎ−ヒドロキシスクシイミド、４−ヒドロキシフェニルジメチルスルホニウムメチルサルフェートなどとをＢＯＰ試薬、１，１′−カルボニルジイミダゾール、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ′−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド メソ−ｐ−トルエン＝スルホネート、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジエチルホスホロシアニデート、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリンなどの脱水縮合剤を用いて反応させた後、これと抗体または抗体フラグメントとを適当な緩衝液中で反応させることにより製造することもできる。次に得られた化合物を膜形成成分として用いてリポソームを調製する。
【００２７】
また前記製法２）において、一般式（３）のＹ2で示される抗体または抗体フラグメントと反応可能な基がアルデヒド基の場合、このような化合物と抗体または抗体フラグメントとを適当な緩衝液中で混合し、シッフ塩基を形成させて結合させることにより、一般式（２）で表わされる化合物を製造することができる。さらにこの反応を、水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤を用いて行うことにより、Ｎ−アルキル結合を形成させて結合させることもできる。次に得られた化合物を膜形成成分として用いてリポソームを調製する。
【００２８】
なお、一般式（３）で表される化合物を製造するには、例えば次のような方法などがあげられる。
１）ホスファチジルエタノールアミンと、両末端にカルボン酸ハライド基を有する（ポリ）オキシアルキレン誘導体とを第３級アミンの存在下で反応させ、次に得られた化合物中に残存する活性エステル基を加水分解して得る方法。
２）ホスファチジルエタノールアミンと、両末端にカルボニル−Ｎ−オキシコハク酸イミド基、あるいはカルボニル−１−オキシベンゾトリアゾール基、カルボニル−Ｎ−オキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドなどの活性化エステル基を有する（ポリ）オキシアルキレン誘導体とを反応させ、次に得られた化合物中に残存する活性エステル基を加水分解して得る方法。
３）ホスファチジルコリンと両末端に水酸基を有する（ポリ）オキシアルキレンとをホスホリパーゼＤの存在下でエステル交換反応を行い、得られた化合物にさらに無水コハク酸、モノクロロ酢酸、またはＮ，Ｎ′−カルボニルジイミダゾールなどを作用させて得る方法。
一般式（３）で表される化合物の製造方法の詳細は、特開平７−１５７４９３号、特開平７−２４２６８０号、特開平７−２４２６８１号、特開平７−２９１８５３号などに記載されている。
【００２９】
【発明の効果】
本発明の請求項１のアンホテリシンＢ運搬体は、リポソーム膜形成成分として一般式（１）で表される化合物を特定量含有しているので、アンホテリシンＢの毒性を低減することができるほか、アンホテリシンＢの担持量（含有量）を幅広く調節することができ、しかも血中滞留性が高い。
本発明の請求項２のアンホテリシンＢ運搬体は、リポソーム膜形成成分として一般式（２）で表される化合物を含有しているので、アンホテリシンＢの毒性を低減することができるほか、アンホテリシンＢの担持量（含有量）を幅広く調節することができ、しかも血中滞留性が高く、かつ標的指向性を有している。
【００３０】
【発明の実施の形態】
以下具体的な実施例を用いてより詳細な説明を行うが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１−１
ジパルミトイルホスファチジルコリン３．９６ｍｇ（５．４μｍｏｌ）およびコレステロール１．０４ｍｇ（２．７μｍｏｌ）を３００μｌのクロロホルムに溶解した。これに、アンホテリシンＢ ０．７５ｍｇ（０．８μｍｏｌ）およびこれらに対して６ｍｏｌ％に相当する下式（４）で表される化合物（ポリエチレングリコール部の分子量約３０００）１．９５ｍｇ（ポリエチレングリコール部の含有量２６重量％）を加熱溶解させたクロロホルム３００μｌを加えてよく混合し、窒素ガス雰囲気下で溶媒を蒸発させた後、さらに減圧下で乾燥させた。
【化８】
ここに、９重量％サッカロース水溶液３００μｌを加え、凍結−解氷を４回繰返すことにより、リポソームを調製した。次に孔径０．４、０．２、０．１μｍのメンブランを順次通過させることにより、リポソームの粒径を調整した。次に遠心分離（１０００００ｒｐｍ、１０分間）により精製し、目的のアンホテリシンＢ含有リポソームを得た。
次に、上記で得られたリポソームをメタノールに加えて２ｍｌに調製し、４０５ｎｍの吸光度からリポソーム中のアンホテリシンＢの定量を行った。結果を表１に示す。
【００３２】
実施例１−２
実施例１−１と同様にして、ただし式（４）の化合物の代わりに下式（５）の化合物（ポリエチレングリコール部の分子量約２２００、ポリエチレングリコール部の含有量２０重量％）を用いてアンホテリシンＢ含有リポソームを調製し、リポソーム中のアンホテリシンＢの担持量を測定した。結果を表１に示す。
【化９】
比較例１
実施例１−１と同様にして、ただし式（４）の化合物の代わりに下式（６）の化合物（ポリエチレングリコール部の分子量約１０００）６ｍｏｌ％（ポリエチレングリコール部の含有量１０重量％）を用いてアンホテリシンＢ含有リポソームを調製し、リポソーム中のアンホテリシンＢの担持量を測定した。結果を表１に示す。
【化１０】
実施例１−３
実施例１−１と同様にして、ただし式（４）の化合物を８ｍｏｌ％（ポリエチレングリコール部の含有量３５重量％）用いてアンホテリシンＢ含有リポソームを調製し、リポソーム中のアンホテリシンＢの担持量を測定した。結果を表１に示す。
【００３５】
実施例１−４
実施例１−１と同様にして、ただし式（４）の化合物を１０ｍｏｌ％（ポリエチレングリコール部の含有量４３重量％）用いてアンホテリシンＢ含有リポソームを調製し、リポソーム中のアンホテリシンＢの担持量を測定した。結果を表１に示す。
【００３６】
実施例１−５
実施例１−１と同様にして、ただし式（４）の化合物を１２ｍｏｌ％（ポリエチレングリコール部の含有量５２重量％）用いてアンホテリシンＢ含有リポソームを調製し、リポソーム中のアンホテリシンＢの担持量を測定した。結果を表１に示す。
【００３７】
実施例１−６
実施例１−１と同様にして、ただし式（４）の化合物を１５ｍｏｌ％（ポリエチレングリコール部の含有量６５重量％）用いてアンホテリシンＢ含有リポソームを調製し、リポソーム中のアンホテリシンＢの担持量を測定した。結果を表１に示す。
【００３８】
比較例２
実施例１−１と同様にして、ただし式（４）の化合物を３ｍｏｌ％（ポリエチレングリコール部の含有量１３重量％）用いてアンホテリシンＢ含有リポソームを調製し、リポソーム中のアンホテリシンＢの担持量を測定した。結果を表１に示す。
【００３９】
【表１】
実施例２−１
ジパルミトイルホスファチジルコリン３．９６ｍｇ（５．４μｍｏｌ）およびコレステロール１．０４ｍｇ（２．７μｍｏｌ）を３００μｌのクロロホルムに溶解した。これに、アンホテリシンＢ ０．７５ｍｇ（０．８μｍｏｌ）およびこれらに対して６ｍｏｌ％の下式（７）の化合物（ポリエチレングリコール部の分子量約３０００）１．９５ｍｇ（ポリエチレングリコール部の含有量２６重量％）を加熱溶解させたクロロホルム３００μｌを加えてよく混合し、窒素ガス雰囲気下で溶媒を蒸発させた後、さらに減圧下で乾燥させた。
【化１１】
ここに、９重量％サッカロース水溶液３００μｌを加え、凍結−解氷を４回繰返すことにより、リポソームを調製した。次に孔径０．４、０．２、０．１μｍのメンブランを順次通過させることにより、リポソームの粒径を調整した後、遠心分離（１０００００ｒｐｍ、１０分間）により精製した。
【００４２】
次に、上記でリポソームを５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液−生理的食塩水の１ｍｌに分散させ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩２０ｍｇおよびＮ−ヒドロキシスルホスクシイミド２０ｍｇを加え、室温で１０分間攪拌した後、２００μｌのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．５）を加え、さらに１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ＝７．５に調整した。ここに、マウスの肺内皮細胞表面に存在するＧＰ１２０に特異的に結合するモノクローナル抗体３４Ａおよびこれをラジオアイソトープラベル化した125Ｉ−３４Ａを加え、室温で２時間攪拌した。その後、遠心分離（４℃、１０００００ｒｐｍ、１０分間）により精製し、標的指向性を有するアンホテリシンＢ含有リポソームを得た。
【００４３】
比較例３
実施例１−１において、式（４）で表される化合物を用いなかったこと以外は実施例１−１と同様にしてポリエチレングリコール部を持たないアンホテリシンＢ含有リポソームを得た。得られたリポソーム中のアンホテリシンＢの担持量は、脂質１ｍｇあたり１４．５８μｇであった。
【００４４】
実施例３−１
実施例１−１、２−１および比較例３で得られたリポソーム（アンホテリシンＢ運搬体）をマウスに静注し、１時間後および６時間後の組織中のアンホテリシンＢを高速液体クロマトグラフィーにて定量することにより評価し、表２、表３に示した。
【００４５】
【表２】
【表３】
実施例４−１
A.fumigatus：ＭＦ−１３を２．０×１０6分生子／マウスでＢＡＬＢ／ｃマウスに経鼻感染させたＢＡＬＢ／ｃマウス肺アスペルギルス症モデルによる治療実験を行った。実施例１−１、２−１および比較例３で得られたアンホテリシンＢ運搬体を５日間繰返し投与後、４週間１００％生存するための投与量は、
比較例３ １０．０ｍｇ／ｋｇ
実施例１−１ ３．０ｍｇ／ｋｇ
実施例２−１ ２．０ｍｇ／ｋｇ
であり、実施例のもの、特に３４Ａを担持したリポソームで優れた薬理効果が得られた。
【００４８】
また、同じ投与方法で、投与量２．０ｍｇ／ｋｇでの４週間後の生存率は、
比較例３ ２０％
実施例１−１ ８０％
実施例２−１ １００％
であり、実施例のもので優れた生存率が得られた。
【００４９】
実施例１−１〜１〜６の結果（表１）より、本発明のアンホテリシンＢ運搬体は一般式（１）で表される化合物のオキシアルキレン部の分子量および含有率に応じて、アンホテリシンＢのリポソーム中への担持量（含有量）を調節できることが明らかである。
さらに、実施例２−２の結果（表２）より、抗体を有する本発明のアンホテリシンＢ運搬体は、優れた血中滞留性と標的指向性を有することが明らかである。
また、毒性に関しては、実施例４−１の結果より、本発明によるポリエチレングリコール部を２０重量％以上含むアンホテリシンＢ担持リポソームは、ポリエチレングリコール部を持たないものに比べて毒性が低減され、また抗体を担持したものではさらに顕著に毒性が低減されることが明らかである。
Claims (2)
- リポソーム中にアンホテリシンＢを担持したアンホテリシンＢ運搬体であって、リポソーム膜形成成分として下記一般式（１）で表される化合物を、オキシアルキレン部の含有量が全リポソーム膜形成成分に対して２０重量％以上の含有量となる量で含有することを特徴とするアンホテリシンＢ運搬体。
ｐは１を示す。
ＯＡは炭素数２〜４のオキシアルキレン基、
ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で１０〜３００の正数を示す。
Ｒ1およびＲ2はそれぞれ炭素数８〜３０の脂肪酸残基を示す。
Ｒ3は水酸基、メトキシ基またはエトキシ基を示す。〕 - リポソーム中にアンホテリシンＢを担持したアンホテリシンＢ運搬体であって、リポソーム膜形成成分として下記一般式（２）で表される化合物を含むことを特徴とするアンホテリシンＢ運搬体。
ｐは１を示す。
ＯＡは炭素数２〜４のオキシアルキレン基、
ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で１０〜３００の正数を示す。
Ｒ1およびＲ2はそれぞれ炭素数８〜３０の脂肪酸残基を示す。
Ｙ 1 〜Ｎ(Ｈ)q−Ｉｍは
ｑは０または１を示す。〕
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04615596A JP3956402B2 (ja) | 1996-03-04 | 1996-03-04 | アンホテリシンｂ運搬体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04615596A JP3956402B2 (ja) | 1996-03-04 | 1996-03-04 | アンホテリシンｂ運搬体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09241168A JPH09241168A (ja) | 1997-09-16 |
| JP3956402B2 true JP3956402B2 (ja) | 2007-08-08 |
Family
ID=12739111
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP04615596A Expired - Fee Related JP3956402B2 (ja) | 1996-03-04 | 1996-03-04 | アンホテリシンｂ運搬体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3956402B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1166775B1 (en) * | 1997-11-19 | 2010-03-03 | Georgetown University | Targeted liposome gene delivery |
| IN188924B (ja) * | 2001-03-01 | 2002-11-23 | Bharat Serums & Vaccines Ltd |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0720857B2 (ja) * | 1988-08-11 | 1995-03-08 | テルモ株式会社 | リポソームおよびその製法 |
| US5585112A (en) * | 1989-12-22 | 1996-12-17 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Method of preparing gas and gaseous precursor-filled microspheres |
| DE69107844T2 (de) * | 1990-04-18 | 1995-08-10 | Takeda Chemical Industries, Ltd., Osaka | Liposomenzusammensetzung. |
-
1996
- 1996-03-04 JP JP04615596A patent/JP3956402B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH09241168A (ja) | 1997-09-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5540935A (en) | Reactive vesicle and functional substance-fixed vesicle | |
| AU737980B2 (en) | Novel polymerizable fatty acids, phospholipids and polymerized liposomes therefrom | |
| CA2157410C (en) | Enhanced circulation effector composition and method | |
| KR20040029359A (ko) | 약물 전달을 위한 양친매성 별모양 거대분자 | |
| JP4147328B2 (ja) | 免疫刺激するリピド製剤 | |
| JP3956402B2 (ja) | アンホテリシンｂ運搬体 | |
| US20080226709A1 (en) | Phospholipid membrane preparation | |
| JP3759759B2 (ja) | リポソームおよび薬物運搬体 | |
| WO2006088245A1 (ja) | ポリオキシアルキレン鎖含有脂質誘導体及び該誘導体を含有する脂質膜構造体 | |
| JP3620059B2 (ja) | 反応性小胞体、形成剤および機能性物質固定化小胞体 | |
| JP3498339B2 (ja) | リン脂質誘導体 | |
| JPH03218309A (ja) | リポソーム表面への蛋白質吸着抑制剤 | |
| JP3509142B2 (ja) | 反応性リポソームおよび形成剤 | |
| JP3590983B2 (ja) | リン脂質誘導体 | |
| JP3498336B2 (ja) | リン脂質誘導体 | |
| JP4928689B2 (ja) | 脂質ベシクルおよび脂質ベシクルの製造方法 | |
| JP3428044B2 (ja) | 反応性リポソームおよび形成剤 | |
| JP3610602B2 (ja) | 反応性小胞体および製造方法 | |
| JP3575037B2 (ja) | 反応性小胞体および形成剤 | |
| JP3572724B2 (ja) | 反応性小胞体形成剤および反応性小胞体 | |
| JP3303481B2 (ja) | 反応性小胞体および形成剤 | |
| JP3427458B2 (ja) | 反応性小胞体、小胞体修飾剤および製造方法 | |
| JP2006241107A (ja) | 目的物質の脳毛細血管内皮細胞への取り込みを亢進させるための組成物 | |
| MXPA00006531A (en) | Novel polymerizable fatty acids, phospholipids and polymerized liposomes therefrom | |
| KR20050024317A (ko) | 미셀 조립체 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070109 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070312 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20070417 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20070430 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100518 Year of fee payment: 3 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100518 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110518 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130518 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140518 Year of fee payment: 7 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |