DE69830249T2

DE69830249T2 - Zielgerichtete liposomen zur verabreichung von genen

Info

Publication number: DE69830249T2
Application number: DE69830249T
Authority: DE
Inventors: Esther H. Chang; Liang Xu; Kathleen Pirollo
Original assignee: Georgetown University
Current assignee: Georgetown University
Priority date: 1997-11-19
Filing date: 1998-11-19
Publication date: 2006-05-04
Anticipated expiration: 2018-11-20
Also published as: HK1078608A1; DK1166775T3; CN1191094C; HK1035490A1; ATE459340T1; HK1045641B; EP1166775A2; HK1045641A1; WO1999025320A1; ES2339421T3; AU759164B2; CN1904055A; CN1286630A; CN1616665B; CA2308584A1; AU1464299A; DE69841536D1; EP1166775A3; EP1032369B1; DE69830249D1

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich allgemein auf die systematische Zufuhr eines therapeutischen Moleküls über einen Liposomenkomplex, der auf einen vorgewählten Zelltyp gerichtet ist. Genauer stellt die Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren für den zellgerichteten Gentransfer und die Gentherapie für menschliche Krebse bereit, wobei ein therapeutisches Molekül der zum Ziel genommenen Krebszelle über einen Liganden-/Liposomenkomplex zugeführt wird. Die Behandlung einer zellproliferierenden Erkrankung (z. B. Krebs) resultiert in einer wesentlichen Verbesserung der Wirksamkeit von Bestrahlungs- und chemotherapeutischen Eingriffen.
2. Beschreibung des verwandten Standes der Technik
Das ideale Therapeutikum für Krebs würde eines sein, das selektiv einen zellulären Weg zum Ziel nimmt, der für den Tumorphänotyp verantwortlich ist, und das für normale Zellen nichttoxisch wäre. Bis heute verbleibt das ideale Therapeutikum nur dies – ein Ideal. Während Krebsbehandlungen, die Gentherapie und Gegensinnmoleküle einschließen, beträchtliche Aussichten haben, gibt es viele Fragestellungen, die angegangen werden müssen, bevor diese Aussichten realisiert werden können. Die vielleicht zu vorderste unter all den mit makromolekularen Behandlungen für Krebs und andere Erkrankungen in Beziehung stehenden Fragestellungen ist die effiziente Zufuhr des/der therapeutischen Molekül(e) an die Stelle(n) in dem Körper, wo sie benötigt werden.
Es wurde eine Reihe an Nucleinsäurezufuhrsystemen ("Vektoren") zur Behandlung von Krebs von Anderen beurteilt, einschließlich Viren und Liposomen. Der ideale Vektor für die menschliche Krebsgentherapie würde einer sein, der systemisch verabreicht werden kann und dann spezifisch und wirksam Tumorzellen zum Ziel nimmt, wo immer sie in dem Körper vorkommen. Virale vektorgerichtete Verfahren zeigen eine hohe Gentransfereffizienz, sind jedoch in etlichen Bereichen mangelhaft. Die Beschränkungen des viralen Ansatzes stehen mit ihrem Fehlen an Targeting und mit der Anwesenheit der restlichen viralen Elemente, die immunogen, cytopathisch oder rekombinogen sein können, in Beziehung.
Ein hauptsächlicher Mangel viraler Vektoren ist das Fehlen für Krebszellspezifität. Bei fehlender Tumor-Targeting-Fähigkeit sind virale Vektoren in ihrer Verwendung auf die direkte, lokale Zufuhr beschränkt, die nicht die Fähigkeit hat, metastatische Erkrankung zu erreichen – die letztliche Todesursache für die Mehrzahl der Krebspatienten.
Die erreichbaren hohen Titer und der Zelltropismus, der Viren als Gentherapie- und Gentransferzufuhrvektoren attraktiv macht, stellen einige ihrer größten Mängel dar. Obwohl die Zubereitung neuer Viren mit neuen Zielen für die Infektion in der Literatur beschrieben worden ist, sind diese Vektoren wegen dem Bedarf des Wachsenlassens des Virus zu einem hohen Titer problematisch. Folglich wurde eine beträchtliche Aufmerksamkeit auf nicht-virale Vektoren für die Zufuhr molekularer Therapeutika gerichtet, einschließlich der Verwendung bei Gentransfer und Gentherapie.
Es wurde ein Fortschritt gemacht in Richtung zur Entwicklung nicht viraler, pharmazeutischer Formulierungen von Genen für die In-vivo-Therapie von Menschen, besonders kationischer, liposomenvermittelter Gentransfersysteme. Kationische Liposomen sind aus positiv geladenen Lipiddoppelschichten zusammengesetzt und können mit negativ geladener, nackter DNS durch einfaches Mischen von Lipiden und DNS komplexiert werden, so dass der resultierende Komplex eine positive Nettoladung hat. Der Komplex wird leicht gebunden und von Zellen aufgenommen, mit einer vergleichsweise hohen Transfektionseffizienz. Eigenschaften kationischer Liposomen, die sie für die DNS-Zufuhr vielseitig und attraktiv machen, schließen ein: die Einfachheit der Zubereitung, die Fähigkeit, große DNS-Mengen zu komplexieren, die Vielseitigkeit bei der Verwendung mit jedem Typ und jeder Größe an DNS oder RNS, die Fähigkeit, viele unterschiedliche Zelltypen zu transfizieren (einschließlich sich nicht teilender Zellen) und das Fehlen von Immunogenität oder Biogefährdungsaktivität. Der Liposomenansatz bietet eine Anzahl von Vorteilen gegenüber viralen Methoden für die Genzufuhr. Am signifikantesten ist, da Liposomen keine infektiösen Mittel sind, welche zur Selbstreplikation in der Lage sind, dass sie kein Risiko für die Entwicklung zu neuen Klassen infektiöser Humanpathogene darstellen. Ferner wurde von kationischen Liposomen gezeigt, dass sie sicher und etwas effizient für die In-vivo-Genzufuhr sind. Da Liposomen keine infektiösen Mittel sind, können sie durch einfaches Mischen formuliert werden. Ferner wurde von kationischen Liposomen gezeigt, dass sie sicher und etwas effizient sind für die In-vivo-Genzufuhr. Klinische Studien sind nun zugange, die kationische Liposomen für die Genzufuhr verwenden, und Liposomen für die Zufuhr von Small-Molecule-Therapeutika (z. B. chemotherapeutische und Antipilzmittel) sind bereits auf dem Markt.
Ein Nachteil kationischer Liposomen liegt darin, dass ihnen Tumorspezifität fehlt und dass sie eine vergleichsweise niedrige Transfektionseffizienz im Vergleich mit viralen Vektoren haben. Das Targeting von Krebszellen über Liposomen kann jedoch durch Modifizieren der Liposomen erreicht werden, so dass sie einen Liganden tragen, der von einem Zelloberflächenrezeptor erkannt wird. Rezeptorvermittelte Endocytose stellt einen hocheffizienten Verinnerlichungsweg in eukaryotischen Zellen dar. Die Anwesenheit eines Liganden auf einem Liposom erleichtert den Eintritt der DNS in Zellen durch das anfängliche Binden des Liganden über seinen Rezeptor auf der Zelloberfläche, gefolgt von der Aufnahme des gebundenen Komplexes. Wenn sie erst einmal verinnerlicht worden ist, kann ausreichend DNS dem endocytotischen Weg entweichen, um in dem Zellkern exprimiert zu werden.
Es gibt nun eine beträchtliche Wissensbasis hinsichtlich der Moleküle, die sich auf der äußeren Oberfläche von Krebszellen befinden. Oberflächenmoleküle können verwendet werden, um Liposomen selektiv auf Tumorzellen zu richten, da sich die Moleküle, die auf dem Äußeren von Tumorzellen gefunden werden, von jenen normaler Zellen unterscheiden. Zum Beispiel kann, falls ein Liposom das Protein Transferrin (TF) auf seiner Oberfläche hat, es Krebszellen zum Ziel nehmen, die hohe Spiegel des Transferrinrezeptors haben.
Es wurde eine Reihe von Liganden hinsichtlich ihrer Liposomentargetingfähigkeit untersucht, einschließlich Folsäure (Folat), ein für die DNS-Synthese notwendiges Vitamin, und Transferrin. Es wurde gefunden, dass sowohl die Folatrezeptor- als auch die Transferrinrezeptorspiegel in etlichen Krebszelltypen erhöht sind, einschließlich Eierstock-, Mund-, Brust-, Prostata- und Kolonkrebs. Die Anwesenheit solcher Rezeptoren kann mit dem aggressiven oder proliferierenden Zustand von Tumorzellen korrelieren. Von dem Folatrezeptor wurde ebenfalls gezeigt, dass er während der Aufnahme von Folgt in sich schnell teilenden Zellen, wie Krebszellen, recycelt wird. Weiterhin wurde von den mit Transferrin und Folgt konjugierten Makromolekülen und Liposomen gezeigt, dass sie spezifisch von Rezeptor tragenden Tumorzellen durch rezeptorvermittelte Endocytose aufgenommen werden. Folglich werden die Folat- und Transferrinrezeptoren als nützlich als prognostische Tumormarker für Krebs und als mögliche Ziele für die Arzneimittelzufuhr bei der Therapie malignen Zellwachstums erachtet.
Das Fehlschlagen, auf Radiotherapie und Chemotherapie anzusprechen, stellt ein medizinisches Bedürfnis bei der Behandlung vieler Krebstyparten dar, dem nicht entsprochen worden ist. Oftmals haben, wenn Krebs erneut auftritt, die Tumoren eine gesteigerte Resistenz gegen Bestrahlung oder gegen chemotherapeutische Mittel erworben. Der Einbau eines neuen Bestandteiles in Krebstherapien, der in der Sensitivierung für diese Therapien resultiert, würde eine immense klinische Relevanz haben. Ein Weg, auf dem solch eine Chemo-/Radiosensitivierung erreicht werden könnte, ist im Wege der gerichteten Gentherapie.
Eine wichtige Rolle für p53 bei der Kontrolle zellulärer Proliferation durch die Regulation von Zellzyklusereignissen und die Induktion des programmierten Zelltods (Apoptose) wurde etabliert. Da es scheint, dass die meisten Antikrebsmittel über das Induzieren von Apoptose arbeiten, könnte die Inhibition von oder Änderungen in diesem Weg zum Versagen therapeutischer Regimes führen. Es wurde deshalb eine direkte Beziehung zwischen Abnormalitäten bei p53 und der Resistenz gegen cytotoxische Krebsbehandlungen (sowohl Chemo- als auch Radiotherapie) vorgeschlagen. Es wurde ebenfalls vorgeschlagen, dass der Verlust der p53-Funktion zu der Kreuzresistenz gegen in einigen Tumorzellen beobachteten Antikrebsmitteln beitragen könnte. Zahlreiche Gruppen etablierten eine positive Beziehung zwischen der Anwesenheit von mutiertem p53 und Chemoresistenz in Mausfibrosarkomen und in primären Tumorkulturen aus Brustkarzinomen, menschlichen Magen- und Speiseröhrenkarzinomen, ebenso wie bei chronischer, lymphoblastischer B-Zell-Leukämie. Zusätzlich wurde Berichten zufolge Chemosensitivität im Wege der Apoptose durch die Expression von wt-p53 in nicht-kleinzelligen Maus-Fremdtransplantaten, die mutiertes p53 tragen, wieder hergestellt.
Es wurde eine Rolle für das Tumorsuppressorgen p53 in vielen entscheidenden zellulären Wegen, besonders in der zellulären Antwort auf DNS-Schädigung, festgestellt. Diese Wege schließen nicht nur Gentranskription, DNS-Reparatur, Genomstabilität, chromosomale Segregation und Seneszenz ein, sondern auch die Regulation von Zellzyklusereignissen und die Modulation des programmierten Zelltods (Apoptose). Für seine Rolle bei der Überwachung von DNS-Schädigung wurde p53 "Wächter des Genoms" getauft. Krebszellen sind durch genetische Instabilität charakterisiert und es wurde gefunden, dass Mutationen in p53 mit einer extrem hohen Häufigkeit in annähernd sämtlichen Arten menschlicher Krebse auftreten. In der Tat wird von quantitativen oder qualitativen Änderungen in dem p53-Gen vorgeschlagen, dass sie eine Rolle in über der Hälfte sämtlicher menschlicher Malignitäten spielen. Die Anwesenheit von p53-Mutationen in den häufigsten Typen menschlicher Tumoren wurde als mit einer schlechten klinischen Prognose verbunden befunden. Ferner wird mutiertes (mt) p53 selten in einigen der leichter heilbaren Krebsformen gefunden, z. B. Wilms-Tumor, Retinoblastom, Hodenkrebs, Neuroblastom und akute lymphoblastische Leukämie.
Zahlreiche Studien berichteten, dass die Expression von wt-p53 sowohl in-vitro als auch in Maus-Fremdtransplantatmodellen das Wachstum zahlreicher Malignitäten unterdrückt hat, z. B. Prostata-, Kopf- und Nacken-, Kolon-, Zervix- und Lungentumorzellen. Es wurde ebenfalls berichtet, dass ein p53-Liposomenkomplex teilweise das Wachstum von menschlichem Glioblastom und von menschlichen Brustkrebsfremdtransplantaten in Mäusen inhibierte. Zusätzlich verwendeten Seung et al. die liposomenvermittelte Intratumoreinführung eines durch Bestrahlung induzierbaren Konstruktes, das TNF-α exprimiert, um das Wachstum eines Mausfibrosarkomfremdtransplantates nach dem Aussetzen an ionisierende Bestrahlung zu inhibieren. Die p53-Expression alleine, während sie in der Lage ist, das Tumorwachstum teilweise zu inhibieren, war jedoch nicht in der Lage, etablierte Tumoren auf lange Sicht zu eliminieren.
Die normale Entwicklung von Mäusen, denen wt-p53 fehlt, und die Beobachtungen eines Nachbestrahlungs-G₁-Blocks in p53-exprimierenden Zellen legt nahe, dass wt-p53 bei der Regulation der Zelle nach DNS-Beschädigung oder Stress wirkt, eher als während Proliferation und Entwicklung. Da es scheint, dass viele konventionelle Antikrebstherapien (Chemotherapeutika und Bestrahlung) DNS-Schädigung induzieren und durch die Induktion von Apoptose zu arbeiten scheinen, ist es denkbar, dass Änderungen in dem p53-Weg zum Versagen von Therapieregimes führen könnten.
Das Fehlen der wt-p53-Funktion wurde ebenfalls mit einer Zunahme der Bestrahlungsresistenz in Verbindung gebracht. Die Anwesenheit von mt-p53 und das nachfolgende Fehlen eines G₁-Blockes wurde ebenfalls als mit einer erhöhten Bestrahlungsresistenz in gewissen menschlichen Tumoren und Zelllinien korrelierend gefunden. Diese schließen menschliche Tumorzelllinien ein, repräsentativ Kopf- und Nacken-, Lymphom-, Blasen-, Brust-, Schilddrüsen-, Ovar- und Hirnkrebs.
Basierend auf diesen Überlegungen sollte eine Gentherapie, um die wt-p53-Funktion in Tumorzellen wiederherzustellen, die p53-abhängigen Zellzyklusprüfpunkte und den apoptotischen Weg reetablieren, was folglich zu der Umkehr der chemo-/radioresistenten Phänotypen führt. Übereinstimmend mit diesem Modell wurde Chemosensitivität zusammen mit Apoptose durch die Expression von wt-p53 in nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom-Maus-Fremdtransplantaten, die mt-p53 tragen, wiederhergestellt. Chemosensitivität von Fremdtransplantaten, die die p53-Null-Lungentumorzelllinie H1299 und T98G-Glioblastomzellen einschließen, und Sensitivität von WiDr-Kolonkrebs-Fremdtransplantaten auf Cisplatin wurden gezeigt. Ein gesteigertes Zellabtöten durch Doxorubicin oder Mitomycin C wurde ebenfalls in SK-Br-3-Brusttumorzellen durch die adenovirale Transduktion von wt-p53 gezeigt. Gewisse konfligierende Berichte zeigen jedoch an, dass die Beziehung zwischen der p53-Expression und der Chemoresistenz einen gewebe- oder zelltypspezifischen Bestandteil haben könnte. Von der Transfektion von wt-p53 durch einen Adenovirusvektor wurde ebenfalls gezeigt, dass sie ovarial und kolorektal Tumorzellen für Bestrahlung sensitiviert. Es wurde ebenfalls berichtet, dass die adenovirusvermittelte wt-p53-Zufuhr die funktionelle Apoptose in einer bestrahlungsresistenten Plattenepithelkarzinom-Tumorzelllinie des Kopfs und des Nackens (SCCHN-Tumorzelllinie) wiederherstellte, was in einer Radiosensitivierung dieser Zellen in vitro resultierte. Noch signifikanter führte die Kombination aus intratumoral injiziertem Adeno-wt-p53 und Bestrahlung zu einer vollständigen und Langzeittumorrückbildung etablierter SCCHN-Fremdtransplantattumoren.
Die gegenwärtige Erfindung weicht von der konventionellen Verwendung viraler Vektoren für die Zufuhr therapeutischer Moleküle für die Gentherapie ab, z. B. wie offenbart von Roth et al. (US-Patent 5,747,469). Diese gegenwärtig verwendeten Vehikel haben nur die begrenzte Fähigkeit der lokalen Zufuhr. Von ihrer Eignung für die Intratumorzufuhr wurde nicht nur gezeigt, dass sie für das Erreichen aller Zellen innerhalb der primären Tumormasse inadäquat sind, sondern dass sie auch unfähig sind, Stellen metastatischer Erkrankung zu erreichen.
Zusammenfassung der Erfindung
In einem Aspekt stellt die Erfindung auf Zellen gerichtete Komplexe aus Ligand, Liposom und therapeutischem Molekül für die In-vitro- oder In-vivo-Zufuhr therapeutischer Moleküle an zum Ziel genommene Zelltypen bereit. Die Komplexe sind als Zufuhrvehikel (Vektoren) für das Zuführen eines therapeutischen Moleküls an die Zielzellen nützlich. Die Komplexe sind nützlich als Vektoren, um Gentransfer und Gentherapie durchzuführen, wenn das therapeutische Molekül z. B. eine Nucleinsäure ist, die ein therapeutisches Protein kodiert. Spezifische Ausführungsbeispiele beziehen sich auf folat- und transferringerichtete kationische Liposomen für die Zufuhr eines therapeutischen Moleküls an tierische (einschließlich menschliche) Krebszellen, die Folat- oder Transferrinrezeptoren enthalten.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die einen auf Zellen gerichteten Komplex aus Ligand, Liposom und therapeutischem Molekül in einem pharmazeutisch kompatiblen Vehikel oder Träger umfassen. Die Zusammensetzungen sind für die bevorzugt intravenöse Verabreichung an einen menschlichen Patienten formuliert, um aus der effektiven Zufuhr des therapeutischen Moleküls Nutzen zu ziehen. Die Komplexe sind geeignet in der Größe angepasst, so dass sie im Körper nach i. v.-Verabreichung verteilt werden.
In einem anderen Aspekt bezieht sich die Erfindung auf therapeutische Verfahren, umfassend die Verabreichung an ein warmblütiges Tier (einschließlich Menschen), der ihr bedarf, einer therapeutisch wirksamen Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend einen Komplex aus Ligand, Liposom und therapeutischem Molekül in einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel. Wie im Detail hierin dargelegt, ist die Behandlung von menschlichem Krebs über die systemische (z. B. i. v.) Applikation eines Komplexes, umfassend einen ligandengerichteten Liposomenkomplex, der eine wt-p53 kodierende Nucleinsäure enthält, eine wichtige Ausführung dieses Aspektes der Erfindung.
Die menschliche Gentherapie im Wege der systemischen Verabreichung pharmazeutischer Zusammensetzungen, die gerichtete Liposomen-/Nucleinsäurekomplexe enthalten, worin die Nucleinsäure ein therapeutisches Gen unter der Kontrolle einer geeigneten regulatorischen Sequenz umfasst, bilden wichtige Beispiele der Erfindung. Die Gentherapie für viele Formen menschlicher Krebse wird durch die systemische Zufuhr von folat- oder transferringerichteten kationischen Liposomen, die eine wt-p53 kodierende Nucleinsäure enthalten, bewerkstelligt. Die hierin vorgestellten Daten zeigen die überragende Fähigkeit solcher Komplexe, Tumorzellen, sowohl primärer als auch metastasierender Tumoren, spezifisch sowohl in vitro als auch in vivo zum Ziel zu nehmen und (wegen der Expression des wt-p53-Gens) für Bestrahlung und/oder Chemotherapie zu sensitivieren.
Noch ein anderer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf Verbesserungen der Zubereitung von Liposomen, besonders auf Liganden gerichtete kationische Liposomen, wobei Liposomen mit vergleichsweise kleinen, gleichmäßigen Durchmessern bereitgestellt werden. Die gleichmäßigen Liposomen mit kleinem Durchmesser zeigen nach der intravenösen Applikation die Fähigkeit, in dem Blutstrom zu zirkulieren und sowohl primäre Tumoren als auch Metastasen zum Ziel zu nehmen.
Die vorliegende Erfindung spricht das Bedürfnis an, therapeutische Moleküle systemisch mit einem hohen Grad an Zielzellspezifität und hoher Effizienz zuzuführen. Wenn sie systemisch verabreicht werden, sind die Komplexe der vorliegenden Erfindung in der Lage, metastasierende ebenso wie primäre Erkrankungen zu erreichen und spezifisch zum Ziel zu nehmen, wenn die Zielzellen menschliche Krebszellen sind. Als ein Ergebnis der Zufuhr der normalen Wildtypversion des Tumorsuppressorgens p53 mittels dieses Systems, zeigten die Erfinder, dass die Tumore für Bestrahlungstherapie und/oder Chemotherapie sensitiviert werden. Die hohe Transfektionseffizienz dieses Systems resultiert in solch einem hohen Sensitivierungsgrad, dass es nicht nur Wachstumsinhibition des Krebses gibt, sondern auch, dass bereits zuvor existierende Tumore und Metastasen vollständig für einen verlängerten Zeitraum eliminiert werden. In gewissen Beispielen ist dieser Zeitraum so, dass die Erkrankung als geheilt erachtet werden kann.
Die Ausnahmewirksamkeit dieses Systems liegt zum Teil an dem Ligand-Targeting des Komplexes aus Liposom und therapeutischem Molekül. Ferner wurden die spezifischen kationischen und neutralen Lipide, die den Liposomenkomplex umfassen, ebenso wie ihr Verhältnis zueinander variiert und optimiert, so dass die Effizienz der Aufnahme des therapeutischen Moleküls für den spezifischen Zielzelltyp ideal sein würde. Das Verhältnis von Liposom zu therapeutischem Molekül wurde ebenfalls für den Zielzelltyp optimiert. Diese Optimierung des Komplexes aus Liposomen und therapeutischen Molekülen in Kombination mit der Addition eines Targetingliganden ergibt eine wesentlich verbesserte Wirksamkeit, wenn er in Verbindung mit Bestrahlung oder Chemotherapien verabreicht wird. Fachleute werden in der Lage sein, die Komplexe für das Zuführen einer Reihe therapeutischer Moleküle an eine Reihe von Zelltypen zu optimieren.
Eine wichtige Eigenschaft der Erfindung liegt in der Fähigkeit, das therapeutische Molekül der Zielzelle durch intravenöse, systemische Applikation zuzuführen. Die Fähigkeit, spezifische Zellen effizient zum Ziel zu nehmen und zu transfizieren nach intravenöser Verabreichung, wird durch die offenbarte Kombination des Auswählens eines geeigneten Targetingliganden und das Optimieren des Verhältnisses von kationischem zu neutralem Lipid in dem Liposom bewerkstelligt. In dem Fall, wo Tumorzellen die Zielzellen sind, erlaubt die systemische Zufuhr des Komplexes aus Ligand, Liposom und therapeutischem Molekül die effiziente und spezifische Zufuhr des therapeutischen Moleküls an Metastasen ebenso wie an den primären Tumor.
Die Erfindung ist nicht auf die Verwendung irgendeines spezifischen Targetingliganden begrenzt. Der Ligand kann jeder Ligand sein, für welchen ein Rezeptor differenziell auf der Zielzelle exprimiert wird. Die gegenwärtig bevorzugten Liganden sind Folsäure (verestert mit einem Lipid des Liposoms) und Transferrin und jeder dieser Liganden besitzt vorteilhafte Eigenschaften.
Liposomenkomplexe sind in der Lage, nur annähernd 20 Schichten von Zellen, welche die Blutgefäße in einem Tumor umgeben, zu durchdringen. Es wurde postuliert, dass die wt-p53-Gentherapie das Zellwachstum zum Teil durch einen "Bystander"-Effekt kontrolliert, der mit der Induktion von Apoptose durch wt-p53 in Beziehung stehen könnte. Dieser Bystander-Effekt kann zu der Wirksamkeit der hierin berichteten In-vivo-Studien beitragen und kann ein zu der Wirksamkeit der Kombinationstherapie beitragender Faktor sein. Es ist jedoch zu diesem Zeitpunkt vergleichsweise wenig bekannt, was den Mechanismus und Weg betrifft, die in diesen Vorgang für p53 verwickelt sind. Es wurde spekuliert, dass ein bis jetzt unbekanntes Apoptosesignal innerhalb der Vesikel, die aus der Apoptose resultieren, enthalten sein könnte, und welcher benachbarte Zellen letztlich phagocytiert.
Alternativ könnte dieses Apoptosesignal durch Gap junctions übertragen sein, wie angenommen wird, dass es der Fall ist für phosphoryliertes Gancyclovir mit dem HSV-TK-Gen. Die Induktion von antiangiogenen Faktoren kann ebenfalls zu dem Bystander-Effekt beitragen.
Es wurde kürzlich berichtet, dass ein ungerichteter p53-Liposomenkomplex teilweise das Wachstum von menschlichen Glioblastom-Xenotransplantaten in vivo inhibierte. Zusätzlich verwendeten Seung et al. (Cancer Res., 55, 5561–5565 (1995)) die kommerzielle ungerichtete liposomen-(lipofectin-)vermittelte intratumorale Einführung eines bestrahlungsinduzierbaren Konstruktes, enthaltend TNF-α, um teilweise das Xenotransplantatwachstum eines Mausfibrosarkoms nach dem Aussetzen an 40 Gy ionisierender Strahlung zu inhibieren. Xu et al. (Human Gene Therapy, 8, 177–175 (1997)) zeigten, dass das Einführen von 16 μg p53-DNS in einen ungerichteten Liposomenkomplex in der Lage war, das Wachstum von Brustkrebs-Xenotransplantat-Maustumoren teilweise zu inhibieren. Die ligandengerichteten Liposomen-p53-Komplexe der vorliegenden Erfindung stellen jedoch die Fähigkeit der Zielzellspezifität und hohen Transfektionseffizienz, gekoppelt mit systemischer Verabreichung, bereit. Die hierin berichteten Studien sind die ersten, die solch ein Zufuhrsystem in Kombination mit gewöhnlicher Bestrahlungs- und chemotherapeutischer Behandlung für Tumoren nutzen. Während die p53-Gentherapie alleine nicht ausreichend sein mag, um Tumoren auf lange Sicht vollständig zu eliminieren, war die gegenwärtig beschriebene Kombination von liposomenvermittelter p53-Gentherapie und gewöhnlicher (Bestrahlung und/oder Chemotherapie) Therapie in der Lage, nicht nur Wachstumsinhibition, sondern Tumorregression zu erreichen, was eine synergistische Wirkung zeigt.
Die hierin beschriebenen In-vivo-Untersuchungen zeigen, dass die Kombination einer systemischen LipF-p53- oder LipT-p53-Gentherapie mit gewöhnlicher Radiotherapie und/oder Chemotherapie merklich effektiver war als jede Behandlung alleine. Bei der klinischen Einstellung werden Bestrahlungsdosen von 65–75 Gy für einen großen Tumor und 45–50 Gy für eine mikroskopische Erkrankung gewöhnlich bei der Behandlung von Kopf- und Nackenkrebs verwendet. In Anbetracht der bekannten, mit hohen Bestrahlungs- oder Chemotherapiedosen verbundenen Nebenwirkungen, wäre die Sensitivierung von Tumoren, um eine erniedrigte, wirksame Dosis der gewöhnlichen Behandlung zu erlauben, von immensem klinischem Nutzen. Ferner würde in dem Falle der Bestrahlung die systemische Wiederherstellung der wt-p53-Funktion, die in einer Abnahme in der als wirksam befundenen Bestrahlungsdosis resultiert, den weiteren therapeutischen Eingriff für Tumoren, die wieder auftreten, erlauben.
In Berichten, die von SCCHN-Zelllinien abgeleitete Xenotransplantattumoren verwenden, die entweder wt-p53 oder mt-p53 enthalten, wurde bemerkt, dass das Einführen von wt-p53 über die intratumorale Verabreichung eines Adenovirusvektors in der Lage war, die Entwicklung von diesen Xenotransplantattumoren zu inhibieren und die Apoptose in diesen zu induzieren, unabhängig von ihrem endogenen p53-Zustand. Ähnlich war das liposomenvermittelte Einführen von wt-p53 in sowohl Glioblastom-(RT-2-) als auch Brustkrebs-(MCF-7-)Xenotransplantaten, die endogenes wt-p53 haben, in der Lage, das Wachstum dieser Tumoren teilweise zu inhibieren. Diese Studien zeigen das breite Potenzial der wt-p53-Gentherapie, unabhängig vom p53-Genstatus.
Die der vorliegenden Erfindung zu Grunde liegende Forschung zeigt, dass das Komplexsystem aus Ligand, kationischem Liposom und therapeutischem Molekül das p53-Gen in vivo selektiv Tumoren unterschiedlicher Arten zuführen kann, wobei sie für Bestrahlung und Chemotherapie empfindlich gemacht werden. Folglich kann die systemische wt-p53-Gentherapie, vermittelt durch das auf Tumoren gerichtete, vergleichsweise sichere und effiziente, ligandengerichtete kationische Liposomensystem in Kombination mit gewöhnlicher Radiotherapie oder Chemotherapie eine wirksamere Behandlungsmodalität nicht nur für primäre Tumoren, sondern ebenfalls für jene Krebse bereitstellen, bei denen die anfängliche Therapie fehlschlägt.
Es wurde ebenfalls gezeigt, dass das gerichtete Liposomenzufuhrsystem in der Lage ist, kleine DNS-Moleküle (z. B. Gegensinnoligonucleotide) zuzuführen, ebenso wie Mittel so groß wie intakte Viruspartikel. Die Zufuhr dieser kleinen (Gegensinn-)DNS-Moleküle war ebenfalls in der Lage, Tumorzellen für chemotherapeutische Mittel zu sensitivieren. Folglich sind die gerichteten Liposomen der vorliegenden Erfindung weit anwendbar auf die systemische Zufuhr therapeutischer Mittel.
Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf Verfahren zur Zubereitung von Komplexen aus Ligand, Liposom und therapeutischem Mittel. Das Verfahren, durch welches der Komplex zwischen dem Transferrinliposom und dem viralen Partikel gebildet wird, stellt eine große Anzahl von Transferrinmolekülen auf der Oberfläche des Komplexes bereit und erhöht dadurch die Stabilität des Komplexes, wenn er durch den Blutstrom reist. Darüber hinaus kann, wenn das therapeutische Molekül ein Viruspartikel ist, das Transferrinliposom ebenfalls dazu dienen, die Immunogenität des Virus durch Hemmen viraler Antigene zu reduzieren.
Unter Verwendung der vorliegenden Erfindung zeigten die Erfinder einen bemerkenswerte Wirkung nicht nur beim Kontrollieren des Zellwachstums, insbesondere des Tumorzellwachstums, sondern ebenfalls bei der Bewirkung von Langzeittumorremission. Die Tumorzellbildung und das -wachstum, ebenfalls bekannt als Transformation, beschreibt die Bildung und Proliferation von Zellen, die ihre Fähigkeit verloren haben, die Zellteilung zu kontrollieren; das bedeutet, sie sind kanzerös. Eine Anzahl unterschiedlicher Arten transformierter Zellen können als Ziele für die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung dienen, wie z. B.: Karzinome, Sarkome, Melanome und eine große Reihe fester Tumoren und Ähnliches. Obwohl jedes Gewebe mit malignem Zellwachstum ein Ziel sein kann, sind Kopf- und Nacken-, Brust-, Prostata-, Pankreas-, Glioblastom, Zervix-, Lungen-, Liposarkom, Rhabdomyosarkom, Chorionkarzinom, Melanom, Retinoblastom, Ovar-, Magen- und Kolon-Rektum-Krebse bevorzugte Ziele.
Es ist weiter bedacht, dass die Erfindung ebenfalls verwendet werden kann, um Nicht-Tumorzellen für die Zufuhr eines therapeutischen Moleküls zum Ziel zu nehmen. Während jede normale Zelle ein Ziel sein kann, sind die bevorzugten normalen Ziele dendritische Zellen, Endothelzellen der Blutgefäße, Lungenzellen, Brustzellen, Knochenmarkzellen und Leberzellen.
Es wird hierin offenbart, dass der ligandgerichtete, optimierte kationische Komplex aus Liposom und therapeutischem Molekül, wenn er systemisch zugeführt wird, in der Lage war, Tumorzellen spezifisch zum Ziel zu nehmen und merklich zu sensitivieren für Bestrahlung und/oder Chemotherapie, was in einer wesentlichen Wachstumsinhibition und Tumorregression resultiert. Der ligandgerichtete, optimierte Komplex aus kationischen Liposomen und therapeutischem Molekül kann über andere Zufuhrwege zugeführt werden, wie z. B. die intratumorale, Aerosol-, perkutane, endoskopische, topische, intraläsionale oder subkutane Verabreichung.
Die Erfindung stellt in gewissen Ausführungsbeispielen Verfahren und Zusammensetzungen für die hochzielzellspezifische und effiziente Zufuhr über die systemische Verabreichung eines ligandgerichteten Komplexes aus Liposomen und therapeutischem Molekül. Beispiele therapeutischer Moleküle schließen ein, ein Gen, DNS mit hohem Molekulargewicht, Plasmid-DNS, ein Gegensinnoligonucleotid, Peptide, Ribozyme, Peptidnucleinsäuren, ein chemisches Mittel, wie z. B. ein chemotherapeutisches Molekül, oder jedes großes Molekül, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf DNS, RNS, Viruspartikel, Wachstumsfaktoren, Cytokine, immunmodulierende Mittel und andere Proteine, einschließlich Proteinen, die, wenn sie exprimiert werden, ein Antigen präsentieren, das das Immunsystem stimuliert oder unterdrückt.
Kürzlich wurden effiziente Verfahren für die Langzeitexpression von Gentherapievektoren beschrieben (Cooper et al., 1997; Westphal et al., 1998; Calos, 1996 und 1998). Diese Vektoren können nützlich sein, um die Expressionsspiegel des offenbarten Liposomenzufuhrsystems zu erweitern und/oder zu erhöhen. Etliche autonome und episomale Vektorsysteme sind offenbart in den US-Patenten Nrn. 5,707,830 (M. P. Calos, 13. Jan. 1998); 5,674,703 (S. Woo et al., 7. Okt. 1997) und 5,624,820 (M. J. Cooper, 29. April 1997), die jeweils durch Bezugnahme hierin eingeschlossen sind. Calos bezieht sich auf episomale Expressionsvektoren, die auf dem Eppstein-Barr-Virus basieren, und die bei der autonomen Replikation in Säugerzellen nützlich sind. Woo et al. beziehen sich auf episomale Expressionsvektoren, die auf Papilloma-Virus basieren, für die Replikation in Tierzellen. Cooper et al. beziehen sich auf Vektoren, die wenigstens einen Papovavirus-Replikationsstartpunkt und eine mutierte Form des großen Papovavirus-T-Antigens enthalten, für die Langzeitepisomenexpression bei der Gentherapie für Menschen.
Wenn das therapeutische Molekül das p53-Gen oder ein Gegensinnoligonucleotid ist, resultiert die Zufuhr im Wege des Komplexes der Erfindung in der Sensitivierung einer Zelle oder von Zellen, wie eine maligne Zelle oder Zellen, für entweder Bestrahlung oder ein chemotherapeutisches Mittel, so dass die Zellen über die Kombinationstherapie abgetötet werden. Maligne Zellen werden als Zellen definiert, die ihre Fähigkeit verloren haben, den Zellteilungszyklus zu kontrollieren, was zu einem transformierten oder kanzerösen Phänotypen führt. Zusätzlich zu malignen Zellen schließen Zellen, die unter Verwendung der Erfindung abgetötet werden können, z. B. unerwünschte, jedoch benigne Zellen wie benigne Prostatahyperplasiezellen, überaktive Thyroidzellen, Lipomzellen, ebenso wie Zellen, die sich auf Autoimmunerkrankungen beziehen, wie B-Zellen, die Antikörper erzeugen, die bei Arthritis, Lupus, Myastenia gravis, Plattenepithelzellenmetaplasie, Dysplasie und Ähnliches involviert sind.
Der Komplex aus Ligand, Liposom und therapeutischem Molekül kann unter sterilen Bedingungen innerhalb einer vernünftigen Zeit vor der Verabreichung formuliert werden. Falls das therapeutische Molekül eines ist, das eine erhöhte Empfänglichkeit für eine andere Therapie bereitstellt (wie eine erhöhte Empfänglichkeit von Krebszellen für eine Chemotherapie oder Bestrahlungstherapie), kann solch eine andere Therapie vor oder nach der Applikation des Komplexes verabreicht werden, z. B. innerhalb von 12 Stunden bis 7 Tagen. Eine Kombination von Therapien, wie z. B. sowohl Chemotherapie als auch Bestrahlungstherapie, kann zusätzlich zu der Verabreichung des Komplexes genutzt werden.
Die Begriffe "kontaktiert" oder "ausgesetzt", wenn sie auf eine Zelle angewandt werden, werden hierin verwendet, um den Vorgang zu beschreiben, durch welchen ein therapeutisches Molekül einer Zelle zugeführt wird oder in direkte Nachbarschaft mit der Zielzelle gebracht wird, so dass es wirksam mit der Zelle in Wechselwirkung treten kann, um der Zelle oder dem Wirtstier einen gewünschten Nutzen zu überbringen.
Wenn die Komplexe der Erfindung als ein Element einer Kombinationstherapie für z. B. die menschliche Krebsbehandlung verwendet werden, können sie in Kombination mit einer großen Anzahl an Therapien verwendet werden, die bei der Behandlung von menschlichem oder Tierkrebs genutzt werden. Solche Therapien schließen die Verabreichung chemotherapeutischer Mittel und von Bestrahlungstherapien, wie Gamma-Bestrahlung, Röntgenstrahlen, UV-Bestrahlung, Mikrowellen, Elektronenemissionen und Ähnliches ein. Chemotherapeutische Mittel wie Doxorubicin, 5-Fluorouracil (SFU), Cisplatin (CDDP), Docetaxel, Gemcitabin, Pacletaxel, Vinblastin, Etoposid (VP-16), Camptothecia, Actinomycin D, Mitoxantron und Mitomycin C können in Kombinationstherapien gemäß der vorliegenden Erfindung genutzt werden.
Eine Reihe unterschiedlicher Arten möglicher therapeutischer Moleküle kann mit den zellgerichteten Liganden-/Liposomenkomplexen der Erfindung komplexiert werden. Diese schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf DNS-Moleküle mit hohem Molekulargewicht (Gene), Plasmid-DNS-Moleküle, kleine Oligonucleotide, RNS, Ribozyme, Peptide, immunmodulierende Agenzien, Peptidnucleinsäuren, Viruspartikel, chemische Mittel, wie an sich bekannte chemotherapeutische Mittel und Arzneimittel, Wachstumsfaktoren, Cytokine und andere Proteine, einschließlich jenen, die, wenn sie exprimiert werden, ein Antigen präsentieren, welches das Immunsystem stimuliert oder das Immunsystem supprimiert. Deshalb kann die vorliegende Erfindung zusätzlich zur Gentherapie für die Immuntherapie oder für die gerichtete Zufuhr von Arzneimitteln verwendet werden.
Diagnostische Mittel können zum Ziel genommenen Zellen ebenfalls über die offenbarten Komplexe zugeführt werden. Mittel, die in vivo nach der Applikation an einen vielzelligen Organismus detektiert werden können, können verwendet werden. Beispielhafte diagnostische Mittel schließen elektronendichte Materialien, magnetresonanzbildgebende Mittel und Radiopharmazeutika ein. Radionuclide, die nützlich sind für die Bildgebung, schließen Radioisotope von Kupfer, Gallium, Indium, Rhenium und Technetium ein, einschließlich der Isotope ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ¹¹¹In, ^99mTc, ⁶⁷Ga oder ⁶⁸Ga. Bildgebende Mittel, die von Low et al. (US-Patent Nr. 5,688,488) offenbart sind, sind bei der vorliegenden Erfindung nützlich und das Patent ist durch Bezugnahme hierin eingeschlossen.
Die Liganden-Liposomen-Zusammensetzung der Erfindung, die mit dem therapeutischen Molekül komplexiert werden wird, kann aus einem Liganden, einem kationischen Lipid und einem neutralen oder Helferlipid zusammengesetzt sein, wobei das Verhältnis von kationischem Lipid zu neutralem Lipid ungefähr 1:(0,5–3), bevorzugt 1:(1–2) (Molverhältnis) beträgt. Der Ligand kann an das neutrale Lipid z. B. über chemische Kopplung gebunden sein und mit dem kationischen Lipid und neutralen Lipid in einem Molverhältnis von ungefähr (0,1–20):100, bevorzugt (1–10):100 bzw. bevorzugter (2,5–5):100 (Ligand-Lipid:Gesamtlipide) vermischt werden. Ligand-Liposom wird mit DNS oder anderen therapeutischen Molekülen vermischt werden, um einen Komplex zu bilden. Die DNS- zu Lipidverhältnisse werden sich in einem Bereich von ungefähr 1:(0,1–50), bevorzugt ungefähr 1:(1–24) und bevorzugter ungefähr 1:(6–16) μg/nmol befinden. Für Gegensinnoligonucleotide wird der Komplex durch Mischen des Liposoms mit Oligonucleotiden in einem molaren Verhältnis von ungefähr (5–30):1 Lipid:Oligonucleotid, bevorzugt ungefähr (10–25):1 und am bevorzugtesten ungefähr 10:1 gebildet werden.
Alternativ, wie es der Fall ist bei Transferrin, kann der Ligand einfach mit den kationischen und neutralen Lipiden vermischt werden. In diesem Fall werden die kationischen Liposomen in einem molaren Verhältnis von kationischem Lipid zu neutralem Lipid von ungefähr 1:(0,5–3), bevorzugt 1:(1–2) zubereitet werden. Transferrin wird mit den kationischen Liposomen vermischt werden und dann mit DNS oder anderen therapeutischen Molekülen. Die DNS/Lipid/TF-Verhältnisse werden in dem Bereich von ungefähr 1:(0,1–50):(0,1–100) μg/nmol/μg, bevorzugter ungefähr 1:(5–24):(6–36) bzw. noch bevorzugter ungefähr 1:(6–12):(8–15) liegen.
Eine andere einzigartige Eigenschaft der Komplexe gemäß der Erfindung ist ihre gleichmäßig verteilte, vergleichsweise geringe Größe (mittlerer Durchmesser weniger als ungefähr 100 nm, bevorzugt weniger als ungefähr 75 nm und noch bevorzugter ungefähr 35–75 nm (Durchschnitt 50 nm) Durchmesser). Um den Zieltumor zu erreichen, müssen die Komplexe gegen abbauende Agenzien, auf die sie in vivo treffen, resistent sein und sie müssen ebenfalls in der Lage sein, die Blutgefäß-(Kapillar-)Wände und in das Zielgewebe zu passieren. Die Komplexe der vorliegenden Erfindung üben eine hohe Resistenz gegen Abbau durch im Serum vorhandene Elemente aus. Die permeable Größe der Kapillaren in Tumoren ist gewöhnlich 50–75 nm und die Komplexe, die weniger als ungefähr 75 nm im Durchmesser sind, können leicht durch die Kapillarwand hindurchtreten, um das Ziel zu erreichen. Basierend auf Transmissionselektronenmikroskopie scheint es, dass eine einzigartige, zwiebelartig geschichtete Struktur des LipF-DNS- und LipT-DNS-Komplexes eine wichtige Rolle bei der geringen Größe und folglich hohen Transfektionseffizienz, die in vitro und insbesondere in vivo beobachtet wird, des Komplexes der Erfindung spielt.
Der Ligand kann jedes Molekül sein, das an die Oberfläche der Zielzelle binden wird, jedoch bevorzugt an einen Rezeptor, der auf der Zielzelle differenziell exprimiert ist. Zwei besonders bevorzugte Liganden sind Folat und Transferrin. Das kationische Lipid kann jedes geeignete kationische Lipid sein, aber Dioleoyltrimethylammoniumpropan (DOTAP) und DDAB sind bevorzugt. Das neutrale Lipid kann jedes neutrale Lipid sein und bevorzugte neutrale Lipide sind Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) und Cholesterol.
Eine Anzahl von In-vivo-Parametern können verwendet werden, um die Ziel- und Zufuhreffizienz der Zusammensetzung so zu bestimmen, dass bestimmte Komplexe optimiert werden können, um ein gewünschtes therapeutisches Molekül dem gewählten Zielzelltyp zuzuführen. Diese Parameter schließen z. B. die Expression von Markergenen, wie die β-Galactosidase- oder Luciferasegene, das immunhistochemische Färben von Zielzellen für das zugeführte Protein, die Western-Blot-Analyse der Expression des Proteinproduktes durch das zugeführte Gen, die Herunterregulation des Zielgens wegen einem zugeführten Gegensinn- oder einem anderen inhibitorischen Oligonucleotid, ebenso wie die erhöhte Sensitivierung der Zielzellen auf Bestrahlung und/oder chemotherapeutische Mittel, ein.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird bedacht, dass die p53-Expressionsregion unter der Kontrolle eines starken konstitutiven Promotors, wie ein RSV- oder ein CMV-Promotor, gestellt wird. Gegenwärtig ist ein besonders bevorzugter Promotor der Cytomegalovirus-(CMV-)Promotor.
Die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind geeignet für das Zum-Ziel-Nehmen einer spezifischen Zelle oder Zellen in vitro oder in vivo. Wenn die Zielzellen in einem warmblütigen Tier lokalisiert sind, z. B. Kopf- und Nacken-, Brust-, Prostata-, Pankreas- oder Glioblastomzellen, wird der Komplex aus Ligand, Liposom und therapeutischem Molekül dem Tier in einer pharmakologisch annehmbaren Form verabreicht werden. Eine "pharmakologisch annehmbare Form", wie hierin verwendet, bezieht sich sowohl auf die Formulierung des Komplexes aus Ligand, Liposom und therapeutischem Molekül, der einem Tier verabreicht werden kann, als auch auf die Form des Kontaktierens eines Tieres mit Bestrahlung, das heißt die Weise, auf welche ein Bereich des Tierkörpers bestrahlt wird, z. B. mit Gamma-Bestrahlung, Röntgenstrahlen, UV-Bestrahlung, Mikrowellen, Elektronenemissionen und Ähnlichem. Die Verwendung von DNS-schädigender Strahlung und Wellen ist Fachleuten der Bestrahlungstherapie bekannt.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso verbesserte Verfahren zur Behandlung von Krebs, sowohl von primärem als auch metastatischem, bereit, die allgemein das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Kombination eines Komplexes aus Ligand, Liposom und therapeutischem Molekül (z. B. p53-Gen) an einen tierischen oder menschlichen Patienten, der dessen bedarf, und eine Therapie, wie Bestrahlung oder Chemotherapie umfasst.
Der Komplex wird allgemein dem Tier, gewöhnlich systemisch, in der Form einer pharmazeutisch annehmbaren Zusammensetzung verabreicht werden. In dem bevorzugten Ausführungsbeispiel würde die Zusammensetzung systemisch durch einen intravenösen Weg zugeführt werden. Es können jedoch andere Applikationswege wie über Aerosol, intratumoral, intraläsional, perkutan, endoskopisch, topisch oder subkutan genutzt werden.
Der hohe Grad der Tumorzellspezifität und der Tumortargetingfähigkeit der Erfindung wurde durch die Expression eines Reportergens nach systemischer Zufuhr durch den Folat/Transferrin/Liposom-β-Gal-Gen-Komplex demonstriert. Die β-Galactosidaseexpression war in bis zu 70% der Xenotransplantate zahlreicher menschlicher Tumorzellen, einschließlich JSQ-3, DU145 und MDA-MB-435, ersichtlich, während normale Gewebe und Organe, einschließlich dem hoch proliferierenden Darm und Knochenmark, keine Anzeichen der Transfektion zeigten. Die hoch effiziente Tumortargetingfähigkeit der Erfindung war in diesen Experimenten ebenfalls ersichtlich, wo Metastasen und sogar Mikrometastasen, so klein wie wenige Zellen, als nach systemischer Zufuhr des Komplexes spezifisch transfiziert befunden worden sind.
Der überraschende Erfolg der vorliegenden Erfindung wird durch den Befund belegt, dass die systemische Zufuhr von entweder Folat-Liposom-wt-p53-Gen oder Transferrin-Liposom-wt-p53-Gen in Kombination mit entweder Bestrahlung oder Chemotherapie profunde Ergebnisse in Studien, die ein Nacktmausmodell verwendeten, ergab. Die hohe Effizienz dieses Systems resultiert in solch einem hohen Grad der Sensitivierung von menschlichem JSQ-3- und DU145-Xenotransplantattumoren auf Bestrahlung, dass es nicht nur eine Wachstumsinhibition des Krebses gibt, sondern in einigen Experimenten wurden die vorexistierenden Tumoren und Metastasen vollständig für einen verlängerten Zeitraum eliminiert. In gewissen Fällen ist dieser Zeitraum (mehr als ein Jahr krankheitsfrei) so, dass die Krankheit als geheilt erachtet werden kann. Von Nacktmaus-Xenotransplantattumoren des menschlichen Brustkrebs MDA-MB-435 und des menschlichen Pankreaskrebs PANC I wurde ebenfalls gezeigt, dass sie hoch sensitiviert sind durch die systemische Applikation von entweder Folat-Liposom-wt-p53 oder Transferrin-Liposom-wt-p53 für chemotherapeutische Mittel, einschließlich Doxorubicin, Cisplatin, Docetaxel oder Gemcitabin.
Wie hierin verwendet, wird der Begriff "Transfektion" verwendet, um die gerichtete Zufuhr eines therapeutisches Moleküls an eukaryotische Zellen zu beschreiben, unter Verwendung des Liganden-Liposomen-Komplexes der Erfindung, und den Eintritt des therapeutischen Moleküls in die Zelle durch zahlreiche Verfahren, wie rezeptorvermittelte Endocytose, zu beschreiben. Die Zielzelle kann bevorzugt durch den Liganden des Komplexes ausgewählt werden, so dass der Ligand an einen Rezeptor binden wird, der differenziell auf der Oberfläche der Zielzelle exprimiert wird.
Bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzungen der Erfindung sind jene, die in einer pharmakologisch annehmbaren Lösung oder Puffer einen Komplex einschließen, bestehend aus einem Liganden, einem kationisch-neutralen Liposom und einem therapeutischen Molekül.
Noch weitere Ausführungen der Erfindung sind Kits für die Verwendung bei der systemischen Zufuhr eines therapeutischen Moleküls durch den Liganden-Liposomen-Komplex, wie er in therapeutischen Zusammensetzungen für die systemische Applikation formuliert sein kann. Die Kits der Erfindung werden allgemein in gesonderten, geeigneten Behältern eine pharmazeutische Formulierung des Liganden, der Liposomen und des therapeutischen Moleküls umfassen. In der bevorzugten Ausführung würde der Ligand entweder Folat oder Transferrin sein, das Liposom würde aus einem kationischen und einem neutralen Lipid bestehen und das therapeutische Molekül wäre entweder ein Konstrukt, das wt-p53 unter der Kontrolle des CMV-Promotors trägt, oder ein Gegensinnoligonucleotid. Die drei Bestandteile können unter sterilen Bedingungen vermischt werden und können dem Patienten innerhalb einem vernünftigen Zeitrahmen verabreicht werden, allgemein von 30 Minuten bis 24 Stunden nach der Zubereitung.
Die Bestandteile des Kits werden bevorzugt als Lösungen oder als getrocknete Pulver bereitgestellt. In Lösungsform bereitgestellte Bestandteile werden bevorzugt in sterilem Wasser zur Injektion formuliert, gemeinsam mit geeignetem(n) Puffer(n), die Osmolarität kontrollierenden Mitteln, Antibiotika etc. Als trockene Pulver bereitgestellte Bestandteile können durch die Zugabe eines geeigneten Lösungsmittels, wie steriles Wasser zur Injektion rekonstituiert werden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGEN
Die vorliegende Erfindung nutzt die systemische Verabreichung eines Zufuhrkomplexes aus Ligand und kationischem Liposom für die auf Tumoren gerichtete Zufuhr eines therapeutischen Moleküls über rezeptorvermittelte Endocytose. In einer der bevorzugten Ausführungen werden die ligandengerichteten Liposomen verwendet, um ein therapeutisches Molekül zuzuführen, das ein Wildtyp-(wt-)p53 kodierendes Gen umfasst. Das therapeutische Gen wird auf Tumorzellen gerichtet und ihnen effektiv zugeführt, was in der Wiederherstellung der normalen p53-Genfunktion resultiert, die vielen Tumoren fehlt. Diese Wiederherstellung hat eine starke Wirkung auf die Fähigkeit, die Tumoren zu behandeln. In einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel sind die zugeführten therapeutischen Moleküle Gegensinnoligonucleotide, die gegen Gene in dem Zellwachstumsweg gerichtet sind. Herunterregulation dieser Gene resultiert in der Sensitivierung der Tumorzellen und Xenotransplantate für Bestrahlung und chemotherapeutische Mittel. In noch einem anderen Ausführungsbeispiel ist das "therapeutische Molekül" ein intakter viraler Vektor (z. B. ein adenovirales oder retrovirales Partikel, enthaltend eine therapeutische Nucleinsäure), der der zum Ziel genommenen Zelle über den Ligand-/Liposomenkomplex zugeführt wird.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren für die Bewerkstelligung der Gentherapie bereit, um die wt-p53-Funktion in Tumorzellen wiederherzustellen, was zu dem Umkehren von chemo-/radioresistenten Phänotypen und folglich zu der Verbesserung der Fähigkeit, den Tumor über Chemo- und/oder Bestrahlungstherapie zu behandeln, führt.
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues und verbessertes Verfahren zum Bewerkstelligen der Krebs-Gentherapie bereit, indem ein systemisches Zufuhrsystem ("Komplex") bereitgestellt wird, das spezifisch gegen Tumorzellen, einschließlich Metastasen, gerichtet ist und in einer wirksameren Krebsbehandlungsmodalität resultiert. Dieses Verfahren verwendet ein auf Liganden gerichtetes kationisches Liposomensystem, um den Tumorzellen ein therapeutisches Molekül zuzuführen. In einem der bevorzugten Ausführungsbeispiele ist dieses therapeutische Molekül wt-p53. Das Einschließen eines Zelltargetingliganden (z. B. der Folat- oder Transferrinligand) in den Liposomen-DNS-Komplex nutzt den Vorteil des Tumortargeting-Aspekts und der rezeptorvermittelten Endocytose, die mit dem Liganden verbunden ist, um wt-p53 wirksam und spezifisch in die Tumorzellen in vivo ebenso wie in vitro einzuführen. Die Folge dieser Wiederherstellung der wt-p53-Funktion ist eine Zunahme in der Sensitivierung gegen gewöhnliche Bestrahlung und Chemotherapien, wodurch ihre Wirksamkeit gesteigert wird und/oder ihre Gesamtdosis reduziert wird.
Die beispielhaft angeführten Liposomenzusammensetzungen sind auf dem kationischen Lipid DOTAP basiert und auf dem fusogenen neutralen Lipid DOPE, die entweder an Folsäure konjugiert (z. B. verestert) sind (um einen Folatliganden daran bereitzustellen) oder einfach mit eisengesättigtem Transferrin vermischt sind. Das Verhältnis der Lipide selber, ebenso wie das Lipid-DNS-Verhältnis, wird für die In-vivo-Zufuhr optimiert werden, ebenso wie für unterschiedliche Tumorzellarten (z. B. Adenokarzinome im Gegensatz zu Plattenepithelzellkarzinomen). In-vitro-Studien zeigten, dass die Zugabe des Liganden wesentlich die Transfektionseffizienz für Tumorzellen erhöhte, wenn sie mit dem Liposom allein verglichen wurde, sogar in der Anwesenheit hoher Serumspiegel. Die Transfektion von wt-p53 durch dieses Verfahren resultierte in einer merklichen Radiosensitivierung einer zuvor gegen Bestrahlung resistenten SCCHN-Zelllinie in vitro.
Die In-vivo-Tumortargetingfähigkeit dieses Systems wurde unter Verwendung des β-Galactosidasereportergens in drei unterschiedlichen Krebsarten beurteilt – SCCHN, Brustkrebs und Prostatakrebs. Diese Studien zeigten, dass nach intravenöser Applikation der Komplexe nur die Tumoren mit einer Effizienz von zwischen 50 und 70% transfiziert worden sind, während normale Organe und Gewebe, einschließlich dem stark proliferierenden Knochenmark und Darmkryptenzellen keine Anzeichen der Reportergenexpression zeigten. Etwas Liganden-Liposomen-DNS-Komplex war in Makrophagen ersichtlich. Sehr signifikant war, dass sogar Mikrometastasen in der Lunge, Milz und den Lymphknoten Anzeichen einer hocheffizienten und spezifischen Transfektion zeigten.
Wenn der systemisch zugeführte Komplex aus Ligand, Liposom und wt-p53 Mäusen appliziert wurde, die bestrahlungsresistente menschliche SCCHN-Xenotransplantate trugen, und darauf Bestrahlungstherapie folgte, bildeten sich die Tumoren vollständig zurück. Die histologische Untersuchung des Gebietes des früheren Tumors zeigte nur verbleibendes normales und Narbengewebe, ohne Anzeichen lebender Tumorzellen. Dies stand im Gegensatz zu den Tumoren von Tieren, die nur mit dem Liganden-Liposomen-p53-Komplex oder nur mit Bestrahlung behandelt worden waren. Bei diesen Tieren war ein gewisser Zelltod ersichtlich. Es verblieben jedoch Nester lebender Tumorzellen, was in dem Wiederwachstum der Tumoren bei diesen Tieren resultierte. Verblüffenderweise war kein Wiederauftreten der Tumoren ersichtlich in den Tieren, die die Kombinationstherapie erhielten, sogar ein Jahr nach dem Ende der Behandlung. Ähnliche Ergebnisse wurden in Mäusen beobachtet, die menschliche Prostatatumor-Xenotransplantate trugen, mit Bestrahlung und chemotherapeutischen Mitteln, ebenso wie mit menschlichen Brustkrebs- und Pankreaskrebs-Xenotransplantaten mit chemotherapeutischen Mitteln. Folglich wird dieses System als eine wirksamere Form der Krebstherapie bereitstellend angesehen.
Deshalb stellt die vorliegende Erfindung eine signifikante Verbesserung gegenüber gegenwärtigen experimentellen Krebstherapien bereit, wie die lokale Injektion von adenoviralen Vektoren, die ein therapeutisches Molekül wie p53 tragen, die häufig unfähig sind, ein therapeutisches Molekül dem gesamten Tumorgewebe (primäre Tumormasse) zu verabreichen. Der lokalen Zufuhr fehlt ebenfalls die Fähigkeit, entfernt liegende Metastasen zu erreichen. Die spezifische Targetingfähigkeit, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, ist ebenfalls vorteilhaft, da sie Nebenwirkungen reduziert, die mit der weit verbreiteten unspezifischen Aufnahme des therapeutischen Moleküls verbunden sein können.
Die Aufnahme des Komplexes aus Ligand, Liposom und therapeutischem Molekül durch die Zielzellen wird, wenn er in Verbindung mit Begleittherapien verabreicht wird, und wenn die Zielzellen Krebszellen sind, nicht nur die Proliferationsrate dieser Zellen reduzieren, sondern tatsächlich in einem erhöhten Tumorzelltod und einer Langzeittumorregression resultieren. Die Zufuhrsysteme der Erfindung deuten auf eine Verlängerung des Patientenüberlebens hin.
Die folgenden Beispiele sind eingeschlossen, um die bevorzugten Ausführungen der Erfindung zu zeigen.
BEISPIEL 1
Konstruktion des p53-Expressionsvektors
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion der p53-Expressionsvektoren. Die verwendeten Verfahren sind jene, die Fachleuten gewöhnlich bekannt sind. Die Erfindung ist jedoch nicht auf irgendeinen bestimmten Expressionsvektor beschränkt.
Die adenoviralen Shuttle-Plasmide pRSVp53, pRSVpRo, pCMVp53 und pCMVpRo, die Sinn- und Gegensinn-cDNS von p53 enthalten, sind in 1 gezeigt. Diese Plasmide wurden konstruiert durch Klonieren des 1,7 kb großen XbaI-p53-cDNS-Fragmentes in einen adenoviralen Shuttle-Vektor. Davidson et al., Experimental Neurobiology, 125, 258–267 (1994), wird hierin durch Bezugnahme für die Zwecke der Offenbarung der Zubereitung solcher Shuttle-Vektoren eingeschlossen. Orientierung wurde durch Restriktionsverdauen bestimmt und durch cyclische DNS-Sequenzierung bestätigt. Die Plasmide wurden in E.-coli-DH5α expandiert und mit Qiagen-Plasmid-Mega/Giga-Kits (Qiagen) gereinigt. Die gereinigten Plasmide wurden spektrophotometrisch mit A₂₆₀/A₂₈₀-Werten, die sich 1,90 näherten, quantifiziert. Agarosegelelektrophorese (0,8%) bestätigte, dass mehr als 95% der Plasmid-DNS supergeknäult war.
BEISPIEL 2
Synthese von Liganden-Liposomen-DNS-Komplexen
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren, das für die Produktion des Komplexes aus Ligand, Liposom und therapeutischem Molekül geeignet ist, wobei das therapeutische Molekül Plasmid-DNS ist. 15 mmol Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) in trockenem Chloroform wurden mit 20 mmol N-Hydroxysuccinimidester von Folsäure (siehe R. J. Lee et al., J. Biol. Chem., 269, 3198–3204 (1994), hierin durch Bezugnahme für die Zwecke der Offenbarung solcher Vorgänge eingeschlossen) in der Anwesenheit von 20 mmol Triethylamin für 4 Stunden bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht und dann mit PBS dreimal gewaschen, um Folat-DOPE in Chloroform zu gewinnen. Dünnschichtchromatographie (Chloroform:Methanol:Essigsäure, 80:20:5) ergab, dass mehr als 95% des DOPE (RF = 0,65–0,70) zu Folat-DOPE (RF = 0,90–0,95) umgewandelt worden war. LipF(A) wurde wie folgt zubereitet: eine Chloroformlösung aus 5 μmol Dioleoyltrimethylammoniumpropan (DOTAP), 5 μmol DOPE und 0,1 μmol Folat-DOPE wurden miteinander in einem Rundbodenkolben vermischt und das Chloroform wurde unter reduziertem Druck verdampft. Es wurden 10 ml steriles Wasser zu dem Kolben hinzugefügt, um die Lipide zu suspendieren, dann für 10 Minuten in einem Ultraschallbad bei 4°C beschallt. Die Endkonzentration des LipF(A) betrugt 1 nmol/μl Gesamtlipide. Der LipF(A)-DNS-Komplex für die In-vitro-Verwendung wurde durch Mischen gleicher Volumina von LipF(A) und DNS in serumfreiem, folatfreiem RPMI-1640-Medium (Life Technologies, Inc.) und Inkubieren bei Raumtemperatur unter häufigem Rütteln für 15–30 Minuten zubereitet. Ein DNS-Rückhaltetest zeigte, dass bei dem Verhältnis von 1 μg DNS 8–10 nmol LipF(A) annähernd die gesamte hinzugefügte DNS mit Lipiden komplexiert worden war. Für die In-vivo-Experimente wurde Plasmid-DNS (verdünnt in HEPES-Puffer, pH 7,4, basierend auf der Gesamtmenge von DNS/Maus) mit LipF(A) (in Wasser) in einem Verhältnis von 1 μg DNS/8–12 nmol Lipide vermischt und für 15–30 Minuten bei Raumtemperatur mit häufigem Rütteln inkubiert. Eine 50%ige Dextroselösung wurde hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 5% Dextrose zu erreichen, wurde vermischt durch Umdrehen und wurde auf Anzeichen von Ausfallen untersucht (die Anwesenheit von partikulärem Material oder Trübheit). In beiden Fällen wurden die LipF(A)-DNS-Komplexe als stabil für bis zu 24 Stunden bei 4°C im Dunkeln befunden, ohne wesentlichen Verlust der Transfektionseffizienz.
Kationische Liposomen, die aus Dioleoyltrimethylammoniumpropan (DOTAP) und Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL) bestanden, wurden wie oben zubereitet. Die Endkonzentration der Liposomen war 2 nmol/μl. Holotransferrin (Tf, eisengesättigt, Sigma) wurde in reinem Wasser mit einer Konzentration von 5 mg/ml gelöst. Der Tf-Liposom-DNS-Komplex für In-vitro-Experimente wurde, mit Modifikationen, zubereitet, wie beschrieben von P. W. Cheng, Human Gene Therapy, 7, 275–282 (1996) (hierin durch Bezugnahme für den Zweck der Erläuterung der Liposomenzubereitung eingeschlossen). Kurz, es wurden 12 nmol Liposomen zu 18 mg Tf in 100 μl serumfreiem EMEM hinzugefügt und für 5–15 Minuten bei Raumtemperatur mit häufigem Rütteln inkubiert. Diese Lösung wurde dann mit 1,2 μg Plasmid-DNS in 100 μl serumfreiem EMEM vermischt und für 15–30 Minuten bei Raumtemperatur unter häufigem Rütteln inkubiert. Der zubereitete Tf-Liposom-(bezeichnet LipT(A))-DNS-Komplex wurde für die In-vitro-Zelltransfektion frisch innerhalb von einer Stunde nach der Zubereitung verwendet, obwohl er als für wenigstens 24 Stunden mit demselben Transfektionseffizienzen stabil befunden wurde. Agarosegelelektrophorese wurde genutzt, um die DNS-Rückhaltung durch LipT(A) zu beurteilen. Mehr als 90% der DNS wurde als mit dem Liposom komplexiert befunden. Für In-vivo-Studien wurden das Liposom und Transferrin (in Wasser) vermischt und für 5–15 Minuten bei Raumtemperatur mit häufigem Rütteln inkubiert. Diese Lösung wurde dann mit DNS (in HEPES-Puffer, pH = 7,4) vermischt und für 15–30 Minuten bei Raumtemperatur mit häufigem Rütteln inkubiert. Eine 50%ige Dextroselösung wurde hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 5% Dextrose zu erreichen, durch Umdrehen vermischt und für Anzeichen von Ausfällung untersucht (die Anwesenheit von partikulärem Material oder trübe). In beiden Fällen wurden die LipT(A)-DNS-Komplexe als relativ stabil für bis zu 24 Stunden bei 4°C im Dunkeln befunden, ohne wesentlichen Verlust der Transfektionseffizienz.
BEISPIEL 3
Folat-Liposom-Optimierung durch X-Gal-Färbung
Dieses Beispiel beschreibt die Optimierung des kationischen Komplexes aus Folat und Liposom (LipF-Komplex) der Erfindung für das Plattenepithelzellkarzinom des Kopfes und des Nackens (SCCHN). Um die Transfektionseffizienz für die SCCHN-Zelllinie JSQ-3 zu optimieren, wurde das E.-coli-LacZ-Gen, gelenkt durch einen SV40-Promotor, in dem Plasmid pSVb, als ein Reporter genutzt. Die Transfektionseffizienz wurde basierend auf dem Prozentsatz von mit X-Gal gefärbten Zellen berechnet. Wie in Tabelle 1, gezeigt, erhöhte die Anwesenheit des Folatliganden in dem Komplex wesentlich die Reportergenexpression. Das nicht ligandgekoppelte kationische Liposom (Lip(A)) ergab eine Transfektionseffizienz von 10%–20% in JSQ-3 in vitro, während LipF(A) in 60–70% Zellen resultierte, die das β-Galactosidasegen exprimierten. Die Zugabe von 1 mM freier Folsäure zu den Zellen vor der Transfektion war in der Lage, die Folatrezeptoren auf den Zellen zu blockieren, wodurch die Transfektionseffizienz auf 20% reduziert wurde, ähnlich zu jener, die mit LipF(A) beobachtet wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Verwendung von Folat als einen Liganden die Transfektionseffizienz kationischer Liposomen erhöht und dass diese Wirkung durch den Folatrezeptor vermittelt wird. Basierend auf einem neueren Bericht, dass die X-Gal-Färbung das Ausmaß der β-Galactosidasegenexpression um 20% oder mehr unterschätzt, ist es vorstellbar, dass die Transfektionseffizienz mit dem ligandgerichteten Liposom tatsächlich die oben festgestellten 70% überschreiten mag. Tabelle 1: In-vitro-Transfektionseffizienzen für LipF(A) in JSQ-3-Zellen:*

* Zu 60% konfluente JSQ-3-Zellen, kultiviert in folatfreiem Medium in einer 24-Well-Platte, wurden für 5 Stunden mit 0,5 ml Transfektionslösung transfiziert, die 1,2 μg pSVb enthielt. Nach zusätzlichen 2 Tagen in Kultur wurden die Zellen fixiert und mit X-Gal gefärbt. Die Transfektionseffizienz wurde als Prozentsatz blau gefärbter Zellen berechnet.
** Folat wurde unmittelbar vor der Transfektion hinzugefügt.

BEISPIEL 4
Optimierung des LipT(A)-Systems durch den Luciferasetest
Dieses Beispiel beschreibt die Optimierung des kationischen Liposomen-[LipT]-Komplexes der Erfindung für Plattenepithelkarzinom des Kopfes und des Nackens (SCCHN). Das LipT(A)-System wurde für die JSQ-3-Transfektion unter Verwendung des Luciferasetests optimiert. Das vom Cytomegalovirus-(CMV-)Promotor gelenkte Glühwürmchen-Luciferasegen im Plasmid pCMVLuc wurde als das Reportergen genutzt (Promega). 5 × 10⁴ JSQ-3-Zellen/Vertiefung wurden in einer 24-Well-Platte ausplattiert. 24 Stunden später wurden die Zellen einmal mit EMEM ohne Serum gewaschen, 0,3 ml EMEM ohne Serum oder Antibiotika wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Der frisch zubereitete Tf-Liposom-pCMVLuc-(LipT(A)-Luc-)Komplex, enthaltend unterschiedliche Mengen, bis zu 1,0 μg in 0,2 ml EMEM Plasmid-DNS, wurde zu den Zellen hinzugefügt. Nach einer 5-stündigen Inkubation bei 37°C und 5% CO₂ wurden 0,5 ml EMEM, ergänzt mit 20% fötalem Rinderserum und 1 μg/ml Hydrocortison, zu jeder Vertiefung hinzugefügt. 24 Stunden später wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen, mit 100 μl/Vertiefung 1 × Reporter-Lyse-Puffer (Promega) lysiert und die exprimierten Luciferaseaktivitäten wurden mit dem Luciferase-Testsystem (Luciferase Assay System) (Promega) auf einem Luminometer gemessen. Es wurde ein rekombinanter Glühwürmchen-Luciferase-Standard (Promega) in jeder Messung für die Umwandlung der Luminometermesswerte in relativen Lichteinheiten (RLU) in die äquivalente Menge exprimierter Luciferase verwendet. Die Proteinkonzentration des Zelllysats wurde unter Verwendung des Bio-Rad-DC-Protein-Testkits (Bio-Rad Laboratories) gemessen. Die Ergebnisse wurden als μg Luciferaseäquivalent pro mg Gesamtprotein ausgedrückt. JSQ-3-Zellen wurden mit LipT(A)-pCMVLuc (LipT(A)-Luc) in unterschiedlichen DNS- /Lipidverhältnissen in dem Komplex transfiziert. Transferrin erhöhte die Transfektionseffizienz kationischer Liposomen wesentlich. Unter Optimalbedingung, das heißt einem DNS/Lipid/Tf-Verhältnis von 1 μg/10 nmol/12,5 μg wurde Luciferase in einer Konzentration von 12,5 ± 1,1 μg/ml Gesamtprotein oder 1,25% Gesamtprotein exprimiert, 7- bis 10-mal mehr als Liposom alleine ohne Transferrin.
BEISPIEL 5
In-vitro-Transfektion von JSQ-3-Zellen durch LipT(A)-pSVb
Dieses Beispiel verwendet einen quantitativen, kolorimetrischen β-Galactosidasetest, wie beschrieben in Beispiel 3, um die erhöhte Transfektionseffizienz des Transferrin-Liposomen-Komplexes der Erfindung zu zeigen. Gereinigte β-Galactosidase (Boehringer) wurde als Standard verwendet. Die Ergebnisse wurden als Millieinheiten (mU) β-Galactosidaseäquivalent pro mg Gesamtprotein ausgedrückt. Für histochemische Untersuchungen der Tf-Liposom-pSVb-Transfektion wurden zu 60% konfluente JSQ-3-Zellen in einer 24-Well-Platte für 5 Stunden mit 1,2 μg pSVb mit oder ohne LipT(A) transfiziert. Nach zusätzlichen zwei Tagen in Kultur wurden die Zellen fixiert und mit X-Gal gefärbt. Transfektionseffizienz wurde als Prozentsatz blau gefärbter Zellen berechnet. Im quantitativen β-Galactosidasetest transfizierten die JSQ-3-Zellen bei der Optimalbedingung mit 0,5 μg DNS/10⁵ Zellen LipT(A)-pSVb, exprimierten 15,04 ± 0,60 mU/mg Gesamtprotein β-Galactosidase ohne Serum und 10,95 ± 0,15 mU/mg mit Serum. In histochemischen Untersuchungen resultierte die Transfektion mit LipT(A)-pSVb darin, dass 70–80% der Zellen transfiziert worden sind. Die Anwesenheit von Serum während der Transfektion reduzierte die Transfektionseffizienz leicht, aber sogar mit Serum färbten 40–50% der Zellen blau, während kationische Liposomen ohne Ligand nur 10–20% Effizienz ergaben. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Verwendung von Tf als einem Liganden wesentlich die Transfektionseffizienz kationischer Liposomen steigerte, sogar in der Anwesenheit von Serum.
BEISPIEL 6
Selektives Tumor- und Metastasentargeting durch den Ligand-Liposomen-Komplex in vivo
Dieses Beispiel zeigt die Fähigkeit des mit Folat oder Transferrin komplexierten Liposoms, selektiv Tumorgewebe in vivo zum Ziel zu nehmen. Xenotransplantate wurden durch die subkutane Injektion von JSQ-3-, MDA-MB-435- oder DU145-Zellen induziert. 2,5 × 10⁶ (JSQ-3) oder 5 × 10⁶ (DU145) Zellen wurden in den unteren Rücken oberhalb des Schwanzes von 4–6 Wochen alten weiblichen Nacktmäusen ohne Thymus (NCr nu-nu) injiziert. 1 × 10⁷ MDA-MB-435-Zellen wurden subkutan in das Brustfettpolster der Mäuse injiziert. Für das Metastasenmodell wurden 1 × 10⁶ JSQ-3- oder MDA-MB-435-Zellen intravenös über die Schwanzvene in die Tiere injiziert. LipF(A)-pSVb oder LipF(D)-pSVb wurden zubereitet, wie in Beispiel 2 beschrieben. LipF-pSVb oder pSVb-Plasmid alleine (in 5% Dextrose) wurden intravenös über die Schwanzvene in einer Konzentration von 25 μg Plasmid-DNS/300 μl/Tier injiziert. 2 Tage und 10 Tage nach der DNS-Injektion wurden die Tumoren ebenso wie Mausorgane entfernt, in 1 mm-Abschnitte geschnitten, einmal mit PBS gewaschen und mit 2% Formaldehyd, 0,2% Glutaraldehyd für 4 Stunden bei Raumtemperatur fixiert. Die fixierten Tumorschnitte wurden 4-mal gewaschen, jeweils für 1 Stunde, und gefärbt mit X-Gal-Lösung plus 0,1% NP-40 (pH 8,5) bei 37°C über Nacht. Die gefärbten Tumorschnitte wurden eingebettet und geschnitten unter Verwendung normaler histologischer Vorgänge und gegengefärbt mit Kernechtrot. Vier Schnitte pro Tumor wurden untersucht, um die β-Galactosidasegenexpression zu beurteilen, wie angezeigt durch die blau gefärbten Zellen.
LipF(A)-pSVb oder pSVb alleine wurden intravenös in die Nacktmäuse, die JSQ-3-Xenotransplantate tragen, injiziert. Innerhalb von 48 Stunden zeigte die mit LipF(A)-pSVb injizierte Gruppe eine Reportergenexpression in den Tumoren mit einer In-vivo-Transfektionseffizienz von annähernd 40–50%. Im Gegensatz dazu, mit pSVb-Plasmid alleine, färbten weniger als 1% der Tumorzellen für das β-Galactosidasereportergen. 10 Tage nach der i. v.-Verabreichung von LipF(A)-pSVb waren sowohl der Prozentsatz als auch die Intensität der Blaufärbung in den Tumoren wesentlich reduziert, was anzeigt, dass die LipF(A)-vermittelte systemische Transfektion vorübergehend ist. Lebende Organe in mit LipF(A)-pSVb injizierten Mäusen zeigten nur Makrophagen, wie Kupfferzellen (Leber) oder Staubzellen (Lunge), blaugefärbt, während die Hepatocyten und Lungenalveolarzellen selber ungefärbt blieben. Die Selektivität des Tumortargetings wurde ebenfalls dort gezeigt, wo der Tumor als den Muskel einwandernd gefunden wurde. LipF(A)-pSVb transfizierte nur den Tumor, während die Muskelzellen ungefärbt blieben. Noch signifikanter, die hoch proliferierenden Knochenmark- und Darmkryptenzellen waren anscheinend nicht transfiziert. Sowohl die Kryptenzellen als auch das Knochenmark zeigten wenige, wenn überhaupt (< 1%) Anzeichen der Reportergenfärbung. Das Fehlen der LipF(A)-pSVb-Transfektion in dem Knochenmark und den Kryptenzellen zeigt, dass das Targeting nicht ein nicht selektiver, zellproliferierender Effekt ist, sondern die Tumorzellen zum Ziel zu nehmen scheint. Dies wird weiter dadurch demonstriert, dass keine Färbung in den Endothelzellen von Blutgefäßen ersichtlich ist, obwohl sie der höchsten Konzentration des LipF(A)-pSVb-Komplexes ausgesetzt waren, wenn er durch den Blutstrom reist. Zusätzlich war keine Färbung in den lymphoblastischen Wachstumszentren in der Milz ersichtlich, sogar obwohl die dendritischen Zellen β-Galactosidasefärbung zeigten.
Ein Hauptproblem beim Wiederauftreten von Krebs und der Behandlung sind Metastasen. Um die Fähigkeit des LipF(A)-Komplexes zu untersuchen, Tumorzellen abseits von dem subkutanen Xenotransplantat zum Ziel zu nehmen, wurden JSQ-3-Zellen i. v. in Nacktmäuse injiziert. Zwei Wochen nach der Injektion wurden simulierte Metastasen (Inseln von Tumorzellen in multiplen Organen) gebildet. Die Tiere wurden dann intravenös mit LipF-pSVb injiziert und die simulierten Metastasen wurden für die β-Galactosidaseexpression untersucht. Es wurde extensive X-Gal-Färbung in einer Metastase gesehen, die in einem Thoraxlymphknoten gefunden wurde. Bei diesem Schnitt wurde ein Blutgefäß (BV) als von den metastatischen Tumorzellen umgeben gefunden. Obwohl die Tumorzellen eine starke X-Gal-Färbung 20–25 Schichten von dem Blutgefäß entfernt zeigten, war keine Reportergenexpression in den Endothelzellen der Blutgefäße ersichtlich, obwohl sie der höchsten Konzentration des LipF(A)-pSVb-Komplexes ausgesetzt waren, wenn er durch den Blutstrom reiste. Diese Ergebnisse bestätigten die tumorselektive Art des LipF(A)-Komplexes und zeigten, dass Metastasen ebenso wie primäre Tumoren über Folat enthaltende Liposomen zum Ziel genommen werden können.
Um die Anwendungsbreite dieses folatgekoppelten, liposomenvermittelten Zufuhrsystems für andere Krebse als SCCHN abzuschätzen, wurden Experimente ebenfalls mit Xenotransplantaten anderer menschlicher Tumorzelllinien durchgeführt, einschließlich der menschlichen Brustkarzinomzelllinien MDA-MB-435, Hs578T und der menschlichen Prostatakrebszelllinie DU145, die ebenfalls mt-p53 trägt. Hier zeigte ebenfalls eine einzelne i. v.-Injektion mit LipF(A)-pSVb Tumorselektivität. Ein hoher Spiegel an β-Galactosidaseexpression wurde in dem MDA-MB-435-Brustfettpolstertumor gesehen, während das benachbarte normale Muskelgewebe ungefärbt blieb. Die Reportergenexpression wurde nicht in Nicht-Tumorgeweben oder normalen Organen detektiert, einschließlich Darmkryptenzellen und Hepatocyten, während subkutane Brustfettpolster-Xenotransplantate einen Durchschnitt von 50–70% Blaufärbung zeigten. Zwei Wochen nach der i. v.-Injektion der MDA-MB-435-Zellen wurde das LipF(A)-pSVb systemisch über eine einzelne Schwanzveneninjektion zugeführt. Sogar kleine stimulierte Brustmetastasen in der Lunge zeigten ein hohes Maß an Färbung und das benachbarte normale Lungengewebe blieb vollständig ungefärbt.
Mäusen, die DU145-Xenotransplantate trugen, wurde eine einzelne i. v.-Injektion LipF(B)pSVb gegeben. Tumoren zeigten in diesen Mäusen ebenfalls eine Reportergenexpression, die für eine In-vivo-Transfektionseffizienz von wenigstes 40–50% steht, ein Wert, der ungefähr 50-mal höher ist als er mit Plasmid alleine erreicht wird.
Die Transferrin-Liposomen-, Liposomen-pSVb- und pSVb-DNS-Komplexe wurden in steriler 5% Dextrose anstelle von HBSS zubereitet, in einem Verhältnis von 1 μg DNS/10 nmol Liposom/12,5 g Transferrin. Das Nacktmaustumormodell wurde durch subkutane Injektion von JSQ-3-Zellen in die Flanken 4–6 Wochen alter weiblicher Nacktmäuse etabliert. 30 μg pSVb-DNS, komplexiert mit Tf-Liposomen in 300 ml Volumen, wurden in jede Maus über die Schwanzvene mit einer 1-cc-Spritze und einer 30-G-Nadel injiziert. In den Kontrollgruppen wurden Liposom-pSVb oder pSVb-DNS ohne Liposom injiziert. Nach 2 Tagen zeigten die Tumoren in Mäusen, die mit LipT(A)-pSVb injiziert worden waren, eine Reportergenexpression, die eine In-vivo-Transfektionseffizienz von annähernd 20–40% darstellt. Im Gegensatz dazu färbten mit pSVb-Plasmid alleine, ohne Liposom, weniger als 1% der Tumorzellen für die Reportergenexpression. 10 Tage nach der intravenösen Verabreichung von LipT(A)-pSVb waren sowohl der Prozentsatz positiver Zellen als auch die Intensität der Blaufärbung in den Tumoren wesentlich reduziert, was anzeigt, dass die LipT(A)-vermittelte systemische Transfektion vorübergehend war. Lebende Organe in Mäusen, die mit LipT(A)-pSVb injiziert worden waren, zeigten die Färbung von nur den Makrophagen (so wie Staubzellen der Lunge und Kupfferzellen der Leber), wohingegen die Hepatocyten und Lungenalveolarzellen ungefärbt blieben. Keine Färbung war in den lymphoblastischen Wachstumszentren in der Milz ersichtlich, obwohl die dendritischen Zellen eine mäßige Färbung zeigten. Zusammengefasst zeigte die histologische Färbung, dass die Zufuhr des Reportergens durch LipT(A) selektiv war, wobei das menschliche Xenotransplantat das am stärksten gefärbte war.
BEISPIEL 7
Expression von exogenem Wildtyp-p53-Protein in mit LipF(A)-p53 und LipT(A)-p53 transfizierten JSQ3-Zellen
Dieses Beispiel zeigt die Expression eines Fremdgens, in diesem besonderen Beispiel Wildtyp-p53, in Zellen, die mit dem Zufuhrsystem der Erfindung in Kontakt gebracht und transfiziert wurden. Indem die Transfektionseffizienz sowohl in vitro als auch in vivo optimiert worden ist, wurden LipF(A) oder LipT(A) mit dem p53-Expressionsplasmid pCMVp53 komplexiert, welches 1,7 Kb cDNS von menschlichem wt-p53 (LipF(A)-p53) oder (LipT(A)-p53) enthält. Für die DNS-Antwort der p53-Genexpression wurden 2 × 10⁵ JSQ-3-Zellen in jeder Vertiefung einer 6-Well-Platte ausplattiert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen einmal mit EMEM ohne Serum, und Antibiotika gewaschen, mit 1 ml Transfektionslösung, enthaltend LipF(A)-p53 mit steigenden Mengen (0,25–8 μg/10⁵ Zellen) pCMVp53-Plasmid-DNS, komplexiert mit LipF(A), oder als eine Kontrolle mit LipF(A)-pRo transfiziert. Alternativ dazu wurden die Zellen mit LipT(A)-p53 oder LipT(A)-pRo transfiziert, die bis zu 4 μg Plasmid-DNS/2 × 10⁵ Zellen in dem Verhältnis von 1 μg DNS/10 nmol Liposom/15 μg Tf in EMEM enthielten. Fünf Stunden nach der Transfektion wurde 1 ml EMEM, ergänzt mit 20% FBS und 1 μg/ml Hydrocortison, hinzugefügt und für weitere 48 Stunden kultiviert. Die transfizierten Zellen wurden gesammelt und in RIPA-Puffer (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) lysiert und Western-Blot-Analyse wurde mit dem pantotropen, monoklonalen Anti-p53-Antikörper Ab-2 (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) unter Verwendung von Fachleuten vertrauten Standardvorgängen durchgeführt. 40 μg Gesamtprotein wurden pro Spur geladen.
Für einen Zeitverlauf der p53-Genexpression wurden 2 × 10⁵ JSQ-3-Zellen mit 2 μg pCMVp53 oder pCMVpRo, komplexiert mit LipT(A), transfiziert. Die Zellen wurden alle 24 Stunden bis zu 5 Tage nach der Transfektion gesammelt und für die Western-Blot-Analyse verwendet.
Um die Strahlungswirkung auf die p53-Genexpression zu untersuchen, wurden JSQ-3-Zellen mit LipT(A)-p53 oder LipT(A)-pRo (2 μg DNS/2 × 10⁵ Zellen) für 2 Tage transfiziert, dann mit Trypsin behandelt und mit abgestuften Dosen von bis zu 6 Gy ¹³⁷Cs-G-Strahlen in einem Mark-I-Bestrahlungsgerät von J. L. Shepard and Associates bestrahlt. Die bestrahlten Zellen wurden erneut ausplattiert und für weitere 2 und 4 Tage vor dem Einsammeln für die Western-Blot-Analyse kultiviert.
Nach der Transfektion in JSQ-3-Zellen in vitro zeigte die Western-Blot-Analyse, dass die Transfektion mit LipF(A)-p53 in einer von der DNS-Dosis und der Zeit abhängigen Expression von Fremd-wt-p53 resultierte. Um als Kontrolle zu dienen, wurde LipF(A) ebenfalls mit dem Plasmid pCMVpRo komplexiert, welches wt-p53 in der umgekehrten Orientierung trägt (LipF(A)-pRo). Die p53-Expression in mit LipF(A)-pRo transfizierten JSQ-3-Zellen war dieselbe wie in den nicht transfizierten Zellen. Die wt-p53-Expression war 24 Stunden nach der LipF(A)-p53-Transfektion ersichtlich, hatte ihren Höhepunkt nach 48 Stunden und wurde 120 Stunden nach der Transfektion vernachlässigbar, wodurch wiederum die transiente Natur dieses Genzufuhrsystems gezeigt worden ist. Diese vorübergehende Expression ist vorteilhaft, da sie wiederholte Injektionen ohne die Akkumulierung von wt-p53 erlaubt.
Western-Blot-Analyse wurde genutzt, um zu zeigen, dass das LipT(A)-transduzierte wt-p53 in JSQ-3-Zellen exprimiert worden ist. Die Transfektion mit erhöhten Dosen des p53-Expressionsplasmides pCMVp53, komplexiert mit LipT(A) (LipT(A)-p53), resultierte in einer von der DNS-Dosis abhängigen wt-p53-Expression, während keine Fremd-p53-Expression in JSQ-3-Zellen ersichtlich war, die mit LipT(A)-pRo transfiziert worden waren, welches die wt-p53-cDNS in umgekehrter Orientierung unter dem CMV-Promotor trägt. Die wt-p53-Expression begann 24 Stunden nach der LipT(A)-p53-Transfektion und hatte ihren Höhepunkt am zweiten Tag, dann nahm sie ab. Nur Spuren an exogenem p53 waren 5 Tage nach der Transfektion übrig, was zeigt, dass die LipT(A)-vermittelte wt-p53-Expression transient war.
Wenn die JSQ-3-Zellen 24 Stunden nach der LipT(A)-p53- oder LipF(A)-p53-Transfektion bestrahlt wurden (am Höhepunkt der wt-p53-Expression), war die exogene wt-p53-Expression wesentlich in Übereinstimmung mit den Gamma-Bestrahlungsdosen erhöht und war für bis zu 4 Tage stabil, das heißt 6 Tage nach der Transfektion. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Gamma-Bestrahlung exogenes wt-p53 erhöhen und/oder stabilisieren kann, was nahe legt, dass sich das exogene p53 in einer Art analog zu normalem, endogenem wt-p53 verhält, von dem bekannt ist, dass es durch das Aussetzen an Bestrahlung stabilisiert wird.
BEISPIEL 8
Sensitivierung von JSQ-3 gegen Bestrahlung in vitro
Von der Anwesenheit einer mutierten Form von p53 wurde gezeigt, dass sie mit einer gesteigerten Bestrahlungsresistenz in gewissen menschlichen Tumoren und Zelllinien korreliert (8, 10). Deshalb untersuchte dieses Beispiel die Wirkung des Ersetzens von wt- p53 durch die LipF(A)-vermittelte Transfektion auf das Bestrahlungsüberleben. LipF(A)-vermittelte p53-Transfektion war in der Lage, JSQ-3-Zellen für Bestrahlung in einer von der DNS-Dosis abhängigen Weise zu sensitivieren. Unter den optimalen Transfektionsbedingungen, das heißt 3 μg Plasmid-DNS pro 10⁵ Zellen, war der D₁₀-Wert stark im Vergleich zu dem hochresistenten Spiegel, der in den nicht transfizierten Zellen gefunden wurde (6,65 ± 0,43 Gy), auf 4,33 ± 0,06 Gy reduziert (p < 0,01). Dies stellt annähernd eine 6- bis 10-fache Sensitivierung auf Bestrahlungsabtöten dar. Ein D₁₀-Wert von 4,33 Gy (4 μg/10⁵ Zellen) ist ähnlich wie jener einer radiosensitiven menschlichen Fibroblastenzelllinie H500 (D₁₀ = 4,50 ± 0,05 Gy) und befindet sich in dem Bereich, der als radiosensitiv erachtet wird. Weder das pCMVp53-Plasmid alleine noch das LipF(A)-pRo hatten einen wesentlichen Sensitivierungseffekt, basierend auf den D₁₀-Werten (p > 0,05) (5). In Begriffen des Überlebens ausgedrückt, diese Abnahme von mehr als 2 Gy stellt eine dramatische Zunahme an Sensitivität auf die abtötenden Wirkungen ionisierender Strahlung dar. Klinisch kann diese Verschiebung in der Sensitivität einen resistenten Tumor durch gewöhnliche Strahlungsdosen heilbar machen.
BEISPIEL 9
Apoptose induziert durch p53-Transfektion und Gamma-Bestrahlung
Dieses Beispiel zeigt, dass die Wiedereinführung von wt-p53 unter Verwendung des optimierten Transferrin-Liposomen-Komplexes der Erfindung in der Lage war, einen funktionellen p53-abhängigen apoptotischen Weg wiederherzustellen. JSQ-3-Zellen wurden mit LipT(A)-p53 oder LipT(A)-pRo (1–3 μg DNS/2 × 10⁵ Zellen) transfiziert und sowohl die angehefteten als auch die fließenden Zellen wurden über 3 Tage hinweg jeden Tag für die Analyse des Prozentsatzes apoptotischer Zellen gesammelt. Für die bestrahlungsreduzierte Apoptose wurden die Zellen für 2 Tage transfiziert, dann trypsiniert und bestrahlt, wie oben in Beispiel 8 beschrieben. Die wieder ausplattierten Zellen wurden 4 Tage später für die Analyse des Prozentsatzes apoptotischer Zellen gesammelt. Die gesammelten Zellen wurden mit dem Annexin-V-FITC-Kit (Trevigen, Inc., Gaithersburg, MD) gefärbt, gemäß dem Protokoll des Herstellers. Annexin-V-FITC bindet spezifisch an das auf apoptotischen Zellen vorhandene Phosphatidylserin. Die gefärbten Zellen wurden unter Verwendung eines FACStar-Cytometers (Becton & Dickinson) analysiert.
Um die Wirkung der wt-p53-Wiederherstellung auf die Induktion von Apoptose zu untersuchen, wurden JSQ-3-Zellen mit LipT(A)-p53 oder LipT(A)-pRo transfiziert. Eine deutliche Induktion von Apoptose wurde in einer dosisabhängigen Weise in der durch LipT(A) vermittelten wt-p53-Wiederherstellung beobachtet. Der Prozentsatz apoptotischer Zellen hatte seinen Höhepunkt am zweiten Tag der Transfektion, was mit den Spiegeln der wt-p53-Expression in den Zellen korrelierte, wie sichtbar gemacht durch den Western-Blot. Um die Wirkung der Bestrahlung auf die Induktion von Apoptose zu untersuchen, wurden die transfizierten Zellen mit unterschiedlichen Dosen an Gamma-Bestrahlung behandelt. 2–4 Tage später wurden die Zellen mit Annexin-V-FITC gefärbt und durch Durchflusscytometrie unter Verwendung von FACStar (Becton & Dickinson) analysiert. Gamma-Bestrahlung induzierte eine wesentliche Zunahme in dem Prozentsatz apoptotischer Zellen nur in mit LipT(A)-p53 transfizierten Zellen, von 18,7% (0 Gy) auf 38,7% (4 Gy) und 46,4% (6 Gy) 4 Tage nach der Bestrahlung. Es wurde keine Zunahme in den untransfizierten (UT-)Zellen und den mit LipT(A) alleine oder mit LipT(A)-pRo behandelten Zellen beobachtet. Die Zunahme war von der Bestrahlungsdosis abhängig und korrelierte mit den wt-p53-Expressionsspiegeln, die in den Western-Blot-Daten gefunden wurden, wodurch gezeigt wurde, dass die Bestrahlungserhöhung der Apoptose proportional zu den wt-p53-Spiegeln in Zellen war. Das heißt, je mehr das wt-p53 exprimiert wurde, desto mehr Apoptose wurde induziert.
BEISPIEL 10
Sensitivierung von JSQ-3-Xenotransplantat-Tumoren auf Bestrahlung durch die systemische Zufuhr von LipF(A)-p53
Bei diesem Beispiel wurde die Verwendung von systemisch zugeführtem Folat-Liposom-therapeutisches Molekül als ein Verfahren der Krebsbehandlung gezeigt. Bei diesem besonderen Beispiel ist das therapeutische Molekül das normale menschliche Wildtyp-p53-Gen (pCMVp53).
Plattenepithelzellkarzinom des oberen Atmungs- und Verdauungstraktes resultiert in einer signifikanten Morbidität und Mortalität trotz vorangegangenen Verbesserungen in der Therapie. Patienten, die frühe Stadien der Erkrankung darstellen (Stadium I oder II), werden allgemein mit entweder Chirurgie oder Bestrahlungstherapie behandelt, während die üblicheren Patienten mit einer fortgeschrittenen Erkrankung (Stadium III oder IV) allgemein mit auf Chirurgie folgender Bestrahlung behandelt werden. Trotz dieser werden die Hälfte oder mehr der für den fortgeschrittenen Erkrankungszustand behandelten Patienten an der Stelle der Ausgangserkrankung oder mit davon entfernten Metastasen wieder erkranken und letztlich daran sterben. Vermutlich resultiert ein signifikanter Anteil dieses klinischen Fehlschlagens aus der Bestrahlungsresistenz in einer Untergruppe an Tumorzellen. Deshalb sollte die Entwicklung eines effektiven Verfahrens für die Sensitivierung von Kopf- und Halstumoren für Radiotherapie eine grundlegende Wirkung auf die Behandlung dieser Erkrankung haben.
Mutierte (mt) Formen des Tumorsuppressorgens p53 wurden in einer Reihe von Studien mit schlechter klinischer Prognose für verschiedene Typen an Malignität in Verbindung gebracht. p53 kann ebenfalls in die Entwicklung und das Fortschreiten von Plattenepithelzellkarzinom des Kopfes und des Nackens (SCCHN) verwickelt sein. Unter Verwendung einer Reihe von Nachweisverfahren wurden Anormalitäten in dem p53-Gen und/oder seiner Expression in 33% bis 100% von SCCHN-Geweben identifiziert. Die Anwesenheit von mt-p53 kann ebenfalls bei SCCHN für eine erhöhte Frequenz und ein schnelleres Wiederauftreten des Tumors anzeigend sein. Von Wildtyp-(wt-)p53 wurde gezeigt, dass es bei der Regulation des Zellzyklus nach DNS-Schädigung oder Stress eher als während normaler Proliferation und Entwicklung funktioniert. Da die Anwesenheit von mt-p53 ebenfalls als mit einer erhöhten Strahlungsresistenz (RR) in gewissen menschlichen Tumoren und Zelllinien korrelierend befunden wurde und wegen eines großen Prozentsatzes von Kopf- und Nackentumoren, bei denen Bestrahlungstherapie fehlschlägt, ist es vorstellbar, dass es eine Ursache-Wirkungs-Beziehung zwischen dem Fehlen von funktionellem wt-p53, das in einer großen Anzahl von SCCHN gefunden wird, und dieser beobachteten RR gibt. Das Ersetzen durch wt-p53 kann deshalb in der Sensitivierung dieser Tumoren auf gewöhnliche Radiotherapie resultieren.
2,5 × 10⁶ JSQ-3-Zellen wurden subkutan in den unteren Rücken oberhalb des Schwanzes von 4–6 Wochen alten weiblichen, athymischen Nacktmäusen (NCr nu/nu) injiziert. Wenn die Tumoren die geeignete Größe erreichten, wurde die i. v.-Injektion von LipF(A)-p53, pCMVp53 oder LipF(A)-pRo mit einer Konzentration von 8 μg DNS/400 μl 5% Dextrose/Maus zweimal wöchentlich für insgesamt 5 Injektionen gegeben. 48 Stunden nach der i. v.-Eingangsinjektion wurden die Tiere in einem Bleihalter gesichert, der es nur erlaubte, dass der Tumorbereich bestrahlt wird, und die erste fraktionierte Dosis von 2,5 Gy ionisierender ¹³⁷Cs-Bestrahlung wurde verabreicht. Danach wurden den Tieren 2,5 Gy alle 48 Stunden bis zu einer Gesamtdosis von 25 Gy gegeben. Zum Vergleich erhielten eine Gruppe nicht transfizierter ebenso wie eine Gruppe an Mäusen, die LipF(A)-p53 erhielten, keine Bestrahlung.
Athymische Nacktmäuse, die subkutane JSQ-3-Tumoren mit einer Größe von annähernd 25–40 mm³ tragen, wurden intravenös über die Schwanzvene mit LipF(A)-p53 zweimal wöchentlich injiziert (insgesamt 5 Injektionen) und der Tumorbereich wurde nur fraktionierten Dosen von Gamma-Bestrahlung ausgesetzt (insgesamt 25 Gy). Um zu bestimmen, ob das transfizierte p53-Protein in den Tumoren exprimiert worden war, wurde ein Tumor aus den nicht transfizierten LipF(A)-p53- und LipF(A)-pRo-Gruppen während dem Verlauf des Experimentes reseziert (nach 3 Injektionen und 12,5 Gy). Ein hoher Spiegel an exogenem p53-Protein war in dem mit LipF(A)-p53 behandelten Tumor ausgeprägt, was bestätigt, dass der Komplex aus Folat und kationischem Liposom in der Lage war, das wt-p53-Gen den Tumoren systemisch zuzuführen. Die Behandlung mit Bestrahlung alleine hatte nur eine begrenzte Wirkung auf die Tumoren in den unbehandelten Tieren. Die i. v.-Injektion von pCMVp53-Plasmid-DNS oder LipF(A)-pRo in Kombination mit ionisierender Bestrahlung induzierte anfänglich eine gewisse Inhibition des Tumorwachstums. Analog mit klinischen Umständen beginnen diese Tumoren jedoch, ähnlich wie jene bei den unbehandelten Tieren, nach dem Abbruch der Bestrahlungstherapie wieder zu wachsen. Obwohl die Behandlung mit LipF(A)-p53 alleine in der Lage war, das Tumorwachstum für einen Zeitraum während und sogar nach dem Ende der i. v.-Injektionen zu inhibieren, begannen diese Tumoren ebenfalls, in der Größe innerhalb von zwei Wochen nach der letzten i. v.-Injektion zuzunehmen. Im Gegensatz dazu bildeten sich 75% der Tumoren, die die Kombination von LipF(A)-p53 plus Bestrahlung erhalten hatten, zurück, wobei sich keine Anzeichen von Wiederauftreten ca. 130 Tage nach der Bestrahlungsbehandlung zeigten. Ferner zeigten die anderen 25% nur einen minimalen Resttumor, der statisch bei weniger als 10% des Ausgangstumorvolumens über den Verlauf des Experimentes war. Die histologische Untersuchung dieser Restmasse zeigte, dass sie reifes Narbengewebe mit keinen vorhandenen, proliferierenden Tumorzellen darstellte.
Gegenwärtig, nach mehr als einem Jahr nach dem Abbruch der Behandlung, starben die Kontrolltiere entweder alle oder wurden human wegen der Tumorlast der Euthanasie unterzogen. Es gibt jedoch immer noch kein Anzeichen von erneutem Tumorwachstum in den Tieren, die die Kombinationsbehandlung erhalten hatten.
Ähnliche Ergebnisse wurden von einem anderen unabhängigen Experiment gewonnen, bei dem die anfänglichen Tumorvolumina zwischen 25 und 60 mm³ waren. Hier wiederum ist annähernd ein Jahr nach der Bestrahlung kein erneutes Tumorwachstum in den Tieren ersichtlich, die die Kombinationsbehandlung erhalten hatten.
Dies ist die erste Demonstration einer durch einen systemisch zugeführten Liposomen-p53-Komplex vermittelten vollständigen Tumorregression. Diese In-vivo-Studien zeigten, dass die Kombination von systemischer LipF(A)-p53-Gentherapie und gewöhnlicher Radiotherapie merklich wirksamer war als jede Behandlung alleine.
BEISPIEL 11
Sensitivierung von JSQ-3-Xenotransplantattumoren auf Bestrahlung durch die systemische Zufuhr von LipT(A)-p53
Bei diesem Beispiel zeigen wir die Verwendung von systemisch zugeführtem Transferrin-Liposom-therapeutisches Molekül als ein Verfahren der Krebsbehandlung. Bei diesem bestimmten Beispiel ist das therapeutische Molekül das normale menschliche Wildtyp-p53-Gen (pCMVp53).
2,5 × 10⁶ JSQ-3-Zellen wurden subkutan in den unteren Rücken oberhalb des Schwanzes von 4–6 Wochen alten weiblichen, athymischen Nacktmäusen (NCr nu/nu) injiziert. 7–10 Tage später wuchsen die Tumoren auf annähernd 40–50 mm³ an der Injektionsstelle an. Frisch zubereitetes LipT(A)-p53 oder LipT(A)-pRo, enthaltend 8 μg DNS in 300 ml 5% Dextrose, wurden intravenös über die Schwanzvene pro Maus zweimal pro Woche für insgesamt 5 Injektionen injiziert. 48 Stunden nach der ersten i. v.-Injektion wurden die Tiere in einem Bleirückhalteapparat gesichert, so dass nur der Tumorbereich der Gamma-Bestrahlung ausgesetzt war, und die erste fraktionierte Dosis von 2,5 Gy ionisierender ¹³⁷Cs-Bestrahlung wurde verabreicht. Danach wurden den Tieren 2,5 Gy alle 48 Stunden bis zu einer Gesamtdosis von 25 Gy gegeben. Zum Vergleich wurden eine Gruppe untransfizierter ebenso wie eine Gruppe von Mäusen mit LipT(A)-p53-Injektion, die jedoch keine Bestrahlung erhielten, als Kontrollen verwendet. Die Tumorgrößen wurden wöchentlich in einer blinden Weise gemessen.
Zwei unabhängige Experimente mit SCCHN-(JSQ-3-)Xenotransplantattumoren wurden mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt. Bei dem ersten wurden in Mäuse, die subkutan JSQ-3-Tumoren mit einer Größe von annähernd 25–40 mm³ trugen, LipT(A)-p53 über die Schwanzvene zweimal wöchentlich (insgesamt 5 Injektionen) injiziert und nur der Tumorbereich wurde fraktionierten Dosen von Gamma-Bestrahlung (insgesamt 25 Gy) ausgesetzt. Kurzzeitige Bestrahlungseffekte auf das Tumorwachstum waren in Zellen ersichtlich, die unter Verwendung der Kontrolle LipT(A)-CMVpRo transfiziert worden sind. Es gab nur eine minimale Tumorwachstumsinhibition in den Tieren, die LipT(A)-CMVp53 ohne Bestrahlung erhielten. Im Gegensatz dazu zeigten sämtliche der Tumoren, die die Kombination von LipT(A)-CMVp53 plus Bestrahlung erhalten hatten, eine praktisch vollständige Regression, wobei keine Anzeichen des Wiederauftretens sogar 153 Tage nach der Bestrahlungsbehandlung gezeigt wurden. Zu diesem Zeitpunkt waren die Tumor tragenden Tiere in den Kontrollgruppen gestorben oder waren wegen übermäßigen Tumorlasten human der Euthanasie unterzogen worden. Ein Jahr nach der Bestrahlung zeigte die Kombinationsbehandlungsgruppe (p53 und Bestrahlung) jedoch kein Anzeichen von erneutem Tumorwachstum. Wie in dem Fall der Tiere, die mit der Kombination von LipF(A)-p53 und Bestrahlung behandelt worden waren, waren 1 Monat nach der Behandlung nur Narbengewebe und einige wenige einwandernde Langerhans-Zellen in dem Restgewebe an der Stelle des ursprünglichen Tumors in einem Tier vorhanden, das die Kombinationsbehandlung erhalten hatte. Ähnliche Ergebnisse wurden in einem zweiten In-vivo-Experiment beobachtet.
BEISPIEL 12
Wirkung der Kombinationstherapie in einem zweiten Krebsmodell
Dieses Beispiel erläutert, dass die Wirksamkeit dieser neuen Kombination aus liposomenvermittelter, tumorgerichteter p53-Gentherapie und gewöhnlicher Radiotherapie nicht auf SCCHN beschränkt ist, wodurch die klinische Relevanz dieses Systems erhöht wird. Die Wirkung der Kombination von folatgerichteter, liposomenvermittelter p53-Gentherapie und Bestrahlung auf die menschliche Prostatazelllinie DU145 wurde in vivo beurteilt. Diese Adenokarzinomzelllinie wurde ursprünglich aus einer Läsion in dem Gehirn eines Patienten mit einem weit verbreiteten metastatischen Karzinom der Prostata gewonnen und es wird von ihr berichtet, dass sie mt-p53 trägt. Wir fanden diese Zelllinie als resistent gegen das Abtöten mit Gamma-Bestrahlung (D₁₀ bei 5,8 ± 0,22 Gy), eine der Hauptformen der Begleittherapie für diese Erkrankung. Frühere In-vitro-Experimente vermuteten, dass das Ersetzen des neutralen Lipids DOPE durch Cholesterol in einer erhöhten Transfektionseffizienz bei diesem einzelnen Tumorzelltyp resultieren könnte.
Basierend auf der Luciferaseaktivität fanden wir, dass LipF(D) eine mehr als 4-fache Zunahme in der Transfektionseffizienz im Vergleich mit LipF(A) in DU145-Zellen ergab. Deshalb wurden Mäuse, die DU145-Tumoren mit annähernd 70 mm³ trugen, i. v. über die Schwanzvene mit LipF(D)-p53 annähernd alle 5 Tage (insgesamt 5 Injektionen) injiziert und die Tumoren wurden fraktionierten Dosen von Gamma-Bestrahlung (insgesamt 25 Gy) ausgesetzt. Bei diesem Experiment wurde eine nicht-folatgerichtete Liposomen-p53-Zusammensetzung (Lip(D)-p53) ebenfalls als eine Kontrolle verwendet. Die Ergebnisse mit diesen Prostatatumoren waren ziemlich ähnlich zu jenen der SCCHN-Tumoren. Bestrahlung alleine, LipF(D)-pRo plus Bestrahlung und nicht gerichtete Lip(D)-p53 plus Bestrahlung hatte eine gewisse inhibitorische Wirkung auf das Tumorwachstum während des Verlaufs der Behandlung. Diese Tumoren nahmen jedoch sämtlich in der Größe schnell zu, wenn die Behandlung erst einmal abgebrochen war. Im Gegensatz dazu resultierte die Kombination aus LipF(D)-p53 plus Bestrahlung wiederum in einer Langzeitregression der Tumoren, sogar am Tage 84, was 64 Tage nach der Behandlung ist. Ein beobachteter Abfall im Tumorvolumen der Kontrollgruppe am Tage 63 lag an dem Verlust von Tieren in dieser Gruppe wegen der Tumorlast. Ein zweites Experiment mit Tumoren mit einer Größe von annähernd 100 mm³ zeigten analoge Ergebnisse, ohne beobachtetes erneutes Wachstum, sogar 47 Tage, nachdem sämtliche Behandlung beendet worden war.
BEISPIEL 13
Chemosensitivierung von JSQ-3 auf Cisplatin (CDDP) in vitro
Zusätzlich zur Bestrahlung wird es üblicher, Chemotherapie bei der Behandlung von SCCHN zu verwenden. Da ein Fehlen von funktionellem wt-p53 mit dem Fehlschlagen auf das Ansprechen von Chemotherapie in Verbindung gebracht worden ist, untersuchten wir in diesem Beispiel die Wirkung einer ligandenerleichterten, liposomenvermittelten wt-p53-Gentherapie auf die Sensitivierung der SCCHN-Zelllinie JSQ-3 für chemotherapeutische Mittel. 1 × 10⁴ Zellen wurden pro Vertiefung einer 96-Well-Platte ausplattiert. 24 Stunden später wurden die Zellen mit LipT(A)-p53 transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurden antineoplastische Mittel in steigenden Konzentrationen (3-fach) hinzugefügt. 4–6 Tage später wurde der XTT-Zellproliferationstest durchgeführt und IC₅₀-Werte, das heißt die Arzneimittelkonzentration, die eine 50%ige Wachstumsinhibition ergab, wurden berechnet. Von der Behandlung mit so wenig wie 0,2 μg wt-p53-DNS, komplexiert an LipT(A), wurde gezeigt, dass sie wesentlich JSQ-3-Zellen sowohl für CDDP als auch für 5-FU sensitiviert, zwei Arzneimittel, die häufig bei der Begleit-Chemotherapie genutzt werden. Während die Transfektion mit dem LipT(A)-Komplex alleine oder mit LipT(A), das wt-p53 in der umgekehrten Orientierung trug (LipT(A)-pRo), eine gewisse Sensitivierung für CDDP ergab, war ein 24-facher Grad an Sensitivierung gegenüber jenem der untransfizierten Zellen in den mit LipT(A)-p53 transduzierten Zellen ersichtlich. Ferner wurde eine 15,4-fache Sensitivierung von JSQ-3 für das chemotherapeutische Mittel 5-FU ebenfalls nach der Transfektion mit dem LipT(A)-p53-Komplex beobachtet.
BEISPIEL 14
p53-vermittelte Chemosensitivierung, wie durch erhöhte Induktion von Apoptose angezeigt
Dieses Beispiel untersucht die Wirkung von durch Ligand-Liposom vermittelter wt-p53-Wiederherstellung auf die durch ein chemotherapeutisches Mittel induzierte Apoptose. JSQ-3-Zellen wurden in 6-Well-Platten ausgesät und mit LipT(A)-p53, LipT(A)-pVec (der Vektor ohne das p53-Gen) oder LipT(A) alleine mit 1 oder 2 μg DNS pro 2 × 10⁵ Zellen transfiziert. 24 Stunden später wurden chemotherapeutische Mittel zu jedem Plattensatz hinzugefügt, in Konzentrationen in der Nähe des IC₅₀-Wertes für jede Zelllinie. Nach einem zusätzlichen Inkubationstag wurden sowohl die anhefteten als auch die frei fließenden Zellen gesammelt und mit AnnexinV-FITC gefärbt, welches spezifisch an auf apoptotischen Zellen anwesendes Phosphatidylserin bindet, unter Verwendung eines AnnexinV-FITC-Kits (Trevigen, Inc., Gaithersburg, MD), gemäß dem Protokoll des Herstellers. Die gefärbten Zellen wurden auf einem FACStar-Durchflusscytometer (Becton and Dickinson) analysiert.
Eine von der p53-DNS Dosis abhängige Induktion von Apoptose wurde in den Zellen beobachtet, die mit dem LipT-vermittelten wt-p53-Komplex der Erfindung behandelt worden waren. Ferner induzierte die Zugabe chemotherapeutischer Mittel (CDDP, Taxotere, 5-FU) in Dosen in der Nähe ihrer IC₅₀-Werte eine wesentliche Zunahme in dem Prozentsatz apoptotischer Zellen nur in der Population der LipT(A)-p53-transfizierten Zellen, nicht in den untransfizierten (UT) und nur mit LipT(A) oder LipT(A)-pVec transfizierten Zellen. Die Zunahme war von der p53-DNS-Dosis abhängig und korrelierte mit den wt-p53-Expressionsspiegeln, die im Western-Blot beobachtet wurden, was zeigt, dass die durch chemotherapeutische Mittel induzierte Verstärkung der Apoptose proportional zu dem wt-p53-Spiegel in Zellen war, das heißt je mehr wt-p53 exprimiert wurde, desto mehr Apoptosen wurden induziert. Die Apoptosezunahme, die nach der Kombination des LipT(A)-p53 plus Arzneimittel beobachtet wurde, war wesentlich mehr als die Summe des chemotherapeutischen Mittels alleine (UT plus Arzneimittel) und der p53-Transfektion alleine (p53, kein Arzneimittel), was eine synergistische Wirkung anzeigt, wenn die p53-Gentherapie mit chemotherapeutischen Mittel kombiniert wurde.
BEISPIEL 15
Chemosensitivierung von MDA-MB-435 auf Cisplatin oder Doxorubicin in vitro durch Ligand-Liposom-p53
Bei der Behandlung von Brustkrebs ist das Fehlschlagen eines wesentlichen Teils der Tumoren und ihrer Metastasen, auf die Begleit-Chemotherapie anzusprechen, eine Hauptsorge. In diesem Beispiel untersuchten wir die Fähigkeit des Zufuhrsystems der Erfindung, Brustkrebszellen für gegenwärtig verwendete chemotherapeutische Mittel zu sensitivieren.
Die menschliche Brustkrebszelllinie MDA-MB-435 wurde genutzt. Der verwendete Liganden-Liposomen-Komplex war die Zusammensetzung, welche für die Plattenepithelzellen des Halses und Kopfes optimiert worden war – eine histologisch unterschiedliche Zellart von jener, die in Brustkrebs gefunden wird. Transfektion mit LipT(A)-p53 steigerte die Wirkung von Doxorubicin auf MDA-MB-435-Zellen um das 4-fache und die Wirkung von CDDP um annähernd das 12-fache, im Vergleich mit den untransfizierten Zellen. Wie mit den SCCHN-Zellen gesehen, gab es auch eine gewisse Sensitivierung durch den LipT(A)-pRo-Komplex. Hier wurde wiederum, obwohl noch nicht für Mammakarzinome optimiert, die Chemosensitivierung von Brustkrebszellen durch die Transfektion mit LipT(A)-p53 gezeigt.
Noch viel verblüffendere Ergebnisse wurden unter Verwendung einer Zusammensetzung LipF(C) gewonnen, die für Adenokarzinom zugeschnitten wurde, der histologische Zelltyp der meisten Brustkrebse. Wie oben, wurden die IC₅₀-Werte durch den XTT-Test bestimmt. Transfektion mit LipF(C)-p53 erhöhte die Wirkung von Doxorubicin auf MDA-MB-435-Zellen um das 73,6-fache und die Wirkung von Taxol um das 31,6-fache, im Vergleich mit den untransfizierten Zellen. Wie mit den SCCHN-Zellen gesehen, gab es ebenfalls eine gewisse Sensitivierung durch den LipF(C)-pRo-Komplex. Diese Ergebnisse belegen die Chemosensitivierung von Brustkrebszellen durch die Transfektion mit transferrin- und folatgerichtetem Liposomen-p53-Komplex.
BEISPIEL 16
Chemosensitivierung von Brustkrebszellen durch LipF-p53-Gentherapie in vivo
Dieses Beispiel zeigt die Fähigkeit des systemisch zugeführten Komplexes aus Ligand, Liposom und therapeutischem Molekül der Erfindung, ein effektives therapeutisches Mittel gegen Krebszellen in vivo zu sein. Mäuse, die subkutane MDA-MB-435-Tumoren des Brustfettpolsters von annähernd 100 mm³ trugen, wurden i. v. über die Schwanzvene mit LipF(C)-p53 alle 3–4 Tage für insgesamt 8 Injektionen injiziert. Doxorubicin (Dxr) (10 mg/kg) wurde wöchentlich i. v. für 4 Wochen injiziert. Die Kombination von LipF(C)-p53 und Dxr inhibierte wesentlich das Wachstum der Tumoren. In einem zweiten Experiment wurden zwei gesonderte Liposomenzusammensetzungen [LipF(E) und LipF(C)] genutzt. Beide zeigten eine Wirkung in Kombination mit Dxr, wobei die LipF(C)-p53-Zusammensetzung jener mit LipF(E)-p53 überlegen war.
BEISPIEL 17
Optimierung der Liganden-Liposomen-Transfektion in verschiedenen Krebszelllinien
In diesem Beispiel untersuchten wir weiter das System aus Ligand und kationischem Liposom, wobei eine Palette an ligandgerichteten kationischen Liposomen zubereitet wurde, um die Transfektionseffizienz einer Reihe von menschlichen und Nagerkrebszellen zu optimieren.

Kationische Liposomen wurden wie folgt zubereitet:

LipA DOTAP/DOPE	Molverhältnis 1:1
LipB DDAB/DOPE	Molverhältnis 1:1
LipC DDAB/DOPE	Molverhältnis 1:2
LipD DOTAP/Chol	Molverhältnis 1:1
LipE DDRB/Chol	Molverhältnis 1:1
LipG DOTAP/DOPE/Chol	Molverhältnis 2:1:1
LipH DDAB/DOPE/Chol	Molverhältnis 2:1:1

1. Folatreihen: Jede der obigen Formulierungen plus 1% bis 5% Folat-DOPE oder Folat-DSPE.
2. Transferrinreihen: Jede der obigen Formulierungen, vermischt mit Holotransferrin in Medium oder Puffer, dann vermischt mit Reportergen-Plasmid-DNS in Medium oder Puffer, um den Komplex zu bilden.

Das Glühwürmchen-Luciferasegen in dem Plasmid pCMVLuc oder das E.-coli-β-Galactosidasegen in dem Plasmid pCMVb wurden als ein Reportergen verwendet.
Zubereitung von DNS-Liposomen-Komplexen:
Die zahlreichen DNS-Liposom-Folat-Komplexe wurden durch Mischen in Polypropylenröhrchen von gleichen Mengen an serumfreiem Medium und der Reportergen-Plasmid-DNS in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) und gleichen Mengen an serumfreiem Medium mit Folat-Liposom (LipA-F, LipB-F, LipC-F, LipD-F, LipE-F, LipG-F, LipH-F) und sterilem Wasser (2 μmol/ml Gesamtlipide) zubereitet. Nach 10–15 Minuten bei Raumtemperatur wurden die beiden Lösungen miteinander vermischt und 15–30 Minuten bei Raumtemperatur unter häufigem Rütteln inkubiert. Die DNS-zu-Lipid-Verhältnisse in der Optimierung erstrecken sich im Bereich von 10:0,1–1:50 μg/nmol.
Die zahlreichen DNS-Liposom-Transferrin-Komplexe wurden durch die Zugabe von Tf (eisengesättigt, Sigma, 4–5 mg/ml in Wasser, filtriert mit 0,22 mm-Filter) zu serumfreiem Medium zubereitet. 5–15 Minuten später wurden kationisches Liposom (LipA, LipE, LipC, LipD, LipE, LipC, LipH) hinzugefügt und vermischt. Nach 5–15 Minuten bei Inkubation bei Raumtemperatur mit häufigem Rütteln wurde eine gleiche Menge an Medium, enthaltend Reportergen-Plasmid-DNS hinzugefügt und vermischt und 15–30 Minuten bei Raumtemperatur unter häufigem Rütteln inkubiert. Die DNS/Lipid/Tf-Verhältnisse in der Optimierung lagen in dem Bereich von 1/(0,1–50)/(0,1–100) μg/nmol/μg.
Zelllinien:
Optimierung wurde durchgeführt an den folgenden Zelllinien:
menschliches Plattenepithelzellkarzinom des Kopfes und des Nackens: JSQ-3, HN17B, HN22a, HN-38, SCC-25
menschlicher Brustkrebs: MDA-MB-231, MDA-MB-435, MDA-MB-453, MCF-7
menschlicher Prostatakrebs: DU145, LNCaP, Ln-30, P4-20
menschlicher Eierstockkrebs: SKOV-3, PA-1
menschlicher Pankreaskrebs: PANC-1
menschlicher Kolonkrebs: SW480, LS174T, SK-CO-1
menschliches Glioblastom: U-87
menschlicher Zervixkrebs: HTB-34, ME180
menschlicher Lungenkrebs: CALU-3
menschlicher Magenkrebs: Hs 746T
menschliches Liposarkom: SW 872
menschliches Melanom: SK-MEL-31
menschliches Chorionkarzinom: JEG-3
menschliches Rhabdomyosarkom: Hs 729T
menschliches Retinoblastom: Y79
menschliches normales Brustepithel: Hs578Bst
menschliches Endothel: HUV-EC-C
Mausmelanom: B16/F10
Rattenprostatakrebs: PA-III, AT.61
Rattenhirnkrebs: RT-2
Optimierung durch Luciferasetests:
5 × 10⁴ Zellen/Well wurden in einer 24-Well-Platte ausplattiert. 24 Stunden später wurden die Zellen einmal mit Medium ohne Serum gewaschen und 0,3 ml Medium ohne Serum und Antibiotika wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Die frisch zubereiteten LipT-pCMVLuc- oder LipF-pCMVLuc-Komplexe, enthaltend unterschiedliche Mengen an Plasmid-DNS (bis zu 1,0 μg in 0,2 ml Medium), wurden zu den Zellen hinzugefügt. Nach einer 5-stündigen Inkubation bei 37°C und 5% CO₂ wurden 0,5 ml Medium, ergänzt mit 20% fötalem Rinderserum, zu jeder Vertiefung hinzugefügt. 24 Stunden später wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen, mit 100 μl/Vertiefung 1 × Reporter-Lyse-Puffer (Reporter Lysis Buffer; Promega) lysiert und die exprimierten Luciferaseaktivitäten wurden mit dem Luciferasetestsystem (Luciferase Assay System; Promega) auf einem Luminometer gemessen. Die Proteinkonzentration des Zelllysates wurde unter Verwendung des Bio-Rad-DC-Proteintestkits (Bio-Rad Laboratories) gemessen. Die Ergebnisse wurden als relative Lichteinheiten (RLU) pro μg Gesamtprotein ausgedrückt.
Optimierung durch den kolorimetrischen β-Galactosidasetest:
1 × 10⁴ Zellen wurde in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte oder 5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung in einer 24-Well-Platte ausplattiert. 24 Stunden später wurden die Zellen einmal mit Medium ohne Serum oder Antibiotika gewaschen und 100 μl Transfektionslösung, enthaltend verschiedene Mengen an LipT-pCMVb, LipF-pCMVb oder pCMVb alleine, wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Nach 5 Stunden bei 37°C wurde eine gleiche Menge an Medium, enthaltend 20% fötales Rinderserum, zu jeder Vertiefung hinzugefügt. 48 Stunden später wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und in 1 × Reporter-Lyse-Puffer (Promega) lysiert. Die Zelllysate wurden mit 100 μl 150 μM O-Nitrophenyl-β-galactopyranosid in 20 mM Tris (pH 7.5), enthaltend 1 mM MgCl₂ und 450 μM β-Mercaptoethanol, bei 37°C für 0,5 Stunden behandelt. Die Reaktion wurde durch Hinzugabe von 150 μl/Vertiefung 1 M Na₂CO₃ gestoppt. Die Extinktion wurde bei 405 nm bestimmt. Gereinigte β-Galactosidase (Boehringer) wurde als Standard verwendet. Die Ergebnisse wurden als Millieinheiten β-Galactosidaseäquivalent pro μg Gesamtprotein ausgedrückt.
Histochemische Färbung:
Für histochemische Studien der Ligand-Liposom-pCMVb-Transfektion wurden Zellen bei 60% Konfluenz (in einer 24-Well-Platte) für 5 Stunden, wie oben beschrieben, transfiziert. Nach zusätzlichen 2 Tage in Kultur wurden die Zellen fixiert und mit X-Gal gefärbt. Transfektionseffizienz wurde als Prozentsatz blau gefärbter Zellen berechnet.
Transfektionseffizienzen der unterschiedlichen Liposomenzusammensetzungen mit unterschiedlichen Zelllinien:
Wie in Tabelle 2 gezeigt, zeigten LipT(A) und LipT(D) die höchste Transfektionseffizienz für JSQ-3-Zellen, 3- bis 8-mal effizienter als andere Liposomenformulierungen. LipT(D) war am effizientesten für sowohl MDA-MB-435 als auch DU145. Bei dem Verhältnis von 1/12/15 (DNS μg/Lip nmol/Tf μg) oder höher, ergaben LipT(D) eine hohe Effizienz für JSQ-3 und LipT(A) für MDA-MB-435-Zellen, es wurde jedoch Cytotoxizität offensichtlich. Wichtiger, wenn Tf-Lip-DNS-Komplexe für In-vivo-Experimente zubereitet werden, neigt der Komplex bei diesem Verhältnis oder einem höheren (Lipide) dazu, auszufallen, die Lösung des Komplexes neigt dazu, wolkig zu werden (das heißt nicht so klar wie in niedrigeren Verhältnissen zubereitete Lösungen) und instabil. Deshalb ist das bevorzugte Verhältnis von LipT 1/10/12,5 (DNS μg/Lip nmol/Tf μg). Tabelle 2:

* × 10⁶ RLU/mg Protein
** Verhältnisse von DNS μg/Lip nmol/Tf μg

Ähnlich wie Transferrin stellten LipF(A) und LipF(C) die besten Ergebnisse für JSQ-3-Zellen bereit, 2- bis 8-mal effizienter als andere Liposomenformulierungen (Tabelle 3). Interessanterweise ergaben Folat-Liposomen vollständig unterschiedliche Effizienzmuster im Vergleich mit Tf-Liposomen in sowohl MDA-MB-435- als auch DU145-Zellen und ebenso auch in anderen Zelllinien. LipF(C) stellte die besten Ergebnisse für MDA-MB-435 und LipF(E) stellte die besten Ergebnisse für DU145 bereit (Tabelle 3). Ähnliche Ergebnisse mit einer geringeren Effizienz wurden in gewissen Krebszelllinien erhalten, die mit Liposomen aus DOTMA/DOPE in 1:1- und 1:2-Molverhältnissen transfiziert worden sind. Tabelle 3:

* × 10⁶ RLU/mg Protein
** Verhältnisse: DNS μg/Lip nmol

Tabelle 4 zeigt die bevorzugten Ligand-Liposomen-Formulierungen für etliche der Zelllinien, die wir in vitro unter Verwendung des in der Erfindung offenbarten Liganden-Liposomen-Systems getestet haben. Es sollte festgestellt werden, dass die optimalen Zusammensetzungen für die In-vitro-Transfektion nicht notwendigerweise die optimalen für die In-vivo-Transfektion sind. Doch es scheint so, dass die für in vitro bevorzugten Zusammensetzungen ein guter Ausgangspunkt sind, der zu den bevorzugten Zusammensetzungen für in vivo führt. Deshalb ist eine Optimierung vor den systemischen In-vitro-Gentherapieexperimenten unter Verwendung des Nacktmaus-Xenotransplantat-Modells notwendig, wie in der Erfindung offenbart.
Tabelle 4:
Wirkung von Serum auf die Transfektionseffizienz von Ligand-Liposomen:
LipT(D) hatte den höchsten Grad an Transfektionseffizienz mit der menschlichen Glioblastomzelllinie U-87 ohne Serum. In der Anwesenheit von 10% Serum war jedoch seine Transfektionseffizienz wesentlich reduziert, während LipT(A) in der Anwesenheit von Serum für diese Zelllinie am effizientesten war. Für die menschliche Pankreaskrebszelllinie PANC-1 schien Serum die Transfektion mit gewissen Liposomenzusammensetzungen zu erhöhen, wobei LipT(H) den höchsten Effizienzgrad zeigt. Hier wiederum beobachteten wir unterschiedliche Transfektionseffizienzmuster in unterschiedlichen Zelllinien und unterschiedliche Effekte des Serums auf die Transfektionseffizienz. Für die Zwecke der In-vivo-Transfektion sollten Serumeffekte während der Optimierung berücksichtigt werden.
BEISPIEL 18
Chemosensitivierung anderer Zelllinien durch Tf- oder durch Folat-Liposom vermittelte wt-p53-Gentherapie in vitro
Dieses Beispiel fasst einen Teil der in vitro durchgeführten, p53-vermittelten Chemosensitivierungsexperimente (XTT-Tests) zusammen, die an den Zelllinien durchgeführt wurden, für welche die Transfektion mit transferringekoppelten oder folatgekoppelten Liposomen in Beispiel 17 beschrieben ist. Die in der folgenden Tabelle vorgestellten Daten zeigen, dass sowohl LipT- als auch LipF-vermittelte p53-Gentransfektion diese Tumorzellen für chemotherapeutische Mittel sensitiveren kann. Die Chemosensitivierungswirkung ist von dem verwendeten Liposom und der p53-DNS-Dosis abhängig. VIN = Vinblastin; DXR = Doxorubicin; CDDP = Cisplatin. Das Vielfache der Sensitivierung wird aus den einzelnen IC₅₀-Werten berechnet. DNS-Dosis = μg DNS appliziert pro Vertiefung (annähernd 1 × 10⁴ Zellen/Vertiefung in einer 96-Well-Platte).
BEISPIEL 19
Wirkung der Kombination von systemisch zugeführtem LipF-p53 und Chemotherapie auf das Wachstum von DU145-Xenotransplantaten in vivo
Chemotherapie wird bei der Behandlung von Prostatakrebs zunehmend üblicher verwendet. Das Fehlen von funktionellem wt-p53 wurde mit dem Fehlschlagen des Ansprechens auf Chemotherapie in Verbindung gebracht. Dieses Beispiel untersucht die Wirkung der Kombination von Liganden-Liposomen-p53 und Chemotherapeutika auf das Wachstum von Prostatatumor-Xenotransplantaten in vivo.
Mäusen, die subkutane DU145-Xenotransplantattumoren mit annähernd 100 mm³ trugen, wurde über die Schwanzvene ein Liganden-Liposomen-p53-Komplex unter Verwendung von Folat als dem Targetingligand (LipF(B)-p53) injiziert. Dieser Liposomenkomplex wurde zweimal pro Woche verabreicht (bis zu insgesamt 5 Injektionen), gemeinsam mit dem chemotherapeutischen Mittel Docetaxel in einer Dosis von 10 mg/kg. Behandlungen der Tiere mit weder dem LipF(B)-p53-Komplex alleine noch mit Docetaxel alleine hatten irgendeine wesentliche Wirkung auf das Tumorwachstum. Die Behandlung mit der Kombination des systemisch zugeführten LipF(B)-p53 der Erfindung plus Docetaxel führte zu einer wesentlichen Tumorregression. Obwohl der verwendete Komplex nicht vollständig für Prostatazellen optimiert worden war, unterstützten diese Ergebnisse stark die Fähigkeit von systemisch zugeführten, gerichteten Liposomen, um wt-p53 den Tumoren zuzuführen, was in ihrer Sensitivierung für gewöhnliche Therapeutika resultiert.
BEISPIEL 20
Wirkung der Kombination von systemisch zugeführtem LipF-p53 und Chemotherapie auf das Wachstum von PANC-1-Xenotransplantaten an vivo
Dieses Beispiel zeigt die Wirkung der Kombination von Liganden-Liposomen-p53 und Chemotherapeutika auf das Wachstum von Pankreaskrebs-Xenotransplantaten in vivo. Xenotransplantattumoren der Pankreaskrebszelllinie PANC-1 wurden durch die subkutane Inokulierung von mehr als 1 × 10⁷ Zellen in athymische Nacktmäuse induziert. Wenn die Tumoren eine Größe von annähernd 500 bis 1000 mm³ erreicht hatten, wurden die Tumoren ausgeschnitten und in kleine (< 1 mm) Stücke zerhackt. Diese frisch zubereiteten Tumorstücke (in PBS suspendiert) wurden subkutan inokuliert (unter Verwendung einer 14-G-Nadel) auf den Flanken athymischer Nacktmäuse. Wenn die Tumoren einen Durchschnitt von 100 mm³ im Volumen erreicht hatten, wurde die Behandlung begonnen. Die Tiere erhielten im Wege der intravenösen Injektion LipF(B)-p53. Dieser Liposomenkomplex wurde zweimal pro Woche bis zu insgesamt 7 Injektionen verabreicht. Das chemotherapeutische Mittel Gemcitabin wurde ebenfalls intraperitoneal in einer Dosis von entweder 60 mg/kg oder 120 mg/kg zweimal pro Woche verabreicht. Insgesamt 13 Gemcitabininjektionen wurden verabreicht. Eine Zielgruppe erhielt ebenfalls zweimal wöchentlich intratumorale Injektionen von LipF(B)-p53 (insgesamt 6) zusätzlich zu der intravenösen Verabreichung von LipF(B)-p53 und Gemcitabin. Die Kontrollgruppen der Tiere, die keine Behandlung, nur Gemcitabin, nur LipF(B)-p53 oder mit dem pCMV-Vektor komplexiertes LipF(B) ohne p53 (LipF(B)-Vec) erhielten, wurden wegen der Tumorlast am Tage 54 der Euthanasie unterzogen. Im Gegensatz dazu zeigten die drei Gruppen an Tieren, die die Kombination aus LipF(B)-p53 und Gemcitabin erhielten, eine wesentliche Wachstumsinhibition ihrer Tumoren, sogar 12 Tage nach dem Ende der Behandlung. Dies war besonders in der Gruppe ersichtlich, die sowohl i. v.- als auch i. t.-Injektionen erhaltten hatte. Deshalb wurde wiederum unter Verwendung eines anderen Tumormodells die Kombination von systemtisch zugeführtem Ligand-Liposom-therapeutischem Molekül und chemotherapeutischen Mitteln als wesentlich effektiver als derzeit zugängliche Therapien befunden.
BEISPIEL 21
Chemosensitivierung von Tumorzellen durch ligandengerichtete, liposomenvermittelte Gegensinnoligonucleotide in vitro und in vivo
Dieses Beispiel zeigt die Fähigkeit des systemisch verabreichten Zufuhrsystems aus Ligand, Liposom und therapeutischem Molekül der Erfindung, um kleine Oligonucleotide als das therapeutische Molekül zuzuführen. Weiterhin zeigt dieses Beispiel die Fähigkeit der systemisch verabreichten Liganden-Liposomen-Zufuhr der kleinen Oligonucleotide, um die kontaktierten Tumorzellen für chemotherapeutische Mittel zu sensitivieren.
Optimierung der Folat-Liposom-(LipF-)Zusammensetzung für zahlreiche Tumorzelltypen
Beginnend mit dem für SCCHN-Zelllinien abgeleiteten und oben beschriebenen Liganden-Liposomen-Komplex wurden weitere Liganden-Liposomen-Zusammensetzungen für das Zuführen von Gegensinn-HER-2-(AS-HER-2-)Oligonucleotiden an Tumorzellen entwickelt. Das AS-HER-2-Oligonucleotid war ein 15-mer, das zu einer Sequenz in der Nähe des Startkodons des HER-2-Gens komplementär ist (Pirollo et al., BBRC 230, 196–201 (1997)).
Sättigung der Liposomen durch Oligonucleotide:
Vielfache neue Folat-Liposomen-(LipF-)Zusammensetzungen wurden durch Variieren des kationischen und neutralen Lipids in dem Komplex produziert. Helferlipide wurden ebenfalls in einigen Zusammensetzungen eingeschlossen. Das Verhältnis von kationischem zu neutralem Lipid wurde ebenfalls variiert. Unter Verwendung eines mit ³²P markierten AS-HER-2-Oligonucleotids bestimmten wir das Verhältnis von Liposom zu Oligonucleotid, um die optimale Bindung des Oligonucleotids an die verschiedenen Zusammensetzungen zu ergeben. Ein Beispiel dieser Untersuchungen ist in der folgenden Tabelle gezeigt, wo ein Vergleich zwischen den LipF-Zusammensetzungen B und C mit Liposom A gemacht wird, welches die LipF-Zusammensetzung ist, die für SCCHN optimiert worden ist.
Es gibt einen deutlichen Unterschied in der Oligonucleotidbindung zwischen den drei Zusammensetzungen. Nichtsdestotrotz wird eine vollständige Sättigung mit allen dreien bei einem Liposom:Oligonucleotid-Verhältnis von 25:1 erzielt. Es war jedoch eine wesentliche Höhe an Toxizität bei diesem Verhältnis ersichtlich. Es ist ebenfalls aus diesen Daten ersichtlich, dass für unterschiedliche Liposomenzusammensetzungen das optimale Verhältnis dramatisch unterschiedlich ist.
AS-HER-2-Oligonucleotidaufnahme durch Tumorzelllinien mit verschiedenen LipF-Zusammensetzungen:
Transfektionsexperimente wurden mit den LipF-Zusammensetzungen und der menschlichen Brustkrebszelllinie MDA-MB-435, der SCCHN-Zelllinie JSQ-3, der Prostatatumorzelllinie DU145 und der Pankreaszelllinie PANC-1 durchgeführt, um die Transfektionseffizienz von jeder der LipF-Zusammensetzungen zu bestimmen. Jene verwendeten waren die vier Zusammensetzungen (bezeichnet B-E), die als die effizienteste Oligonucleotidbindung ausweisend befunden wurden. Die beiden Molverhältnisse von Liposom:Oligonucleotid, die anfänglich in diesen Untersuchungen verwendet wurden, waren 10:1 und 25:1, jene, die als die höchsten Oligonucleotidbindungsspiegel besitzend gefunden worden sind (siehe oben). Ein Verhältnis von 25:1 wurde jedoch als toxisch für die Zellen befunden. Deshalb wurde der Rest des Experimentes durchgeführt unter Verwendung eines Verhältnisses von 10:1 (Liposom:Oligonucleotid). Transfektionen unter Verwendung von mit ³²P markiertem AS-HER-2 wurden durchgeführt, wie kürzlich beschrieben für LipF(A)-p53 für SCCHN. Nach 20 Stunden Inkubation bei 37°C wurden die Medien jedoch entfernt und die Zellen wurden 5-mal mit PBS gewaschen. Die Medien und Waschungen wurden kombiniert und es wurde sich der Menge an nicht eingebauter Markierung versichert. Die Menge an mit Zellen assoziiertem, ³²P markiertem Anti-HER-2-Oligonucleotid wurde durch Vergleichen des ³²P-Spiegels innerhalb der Zellen gegen das nicht eingebaute Oligonucleotid bestimmt. Bei diesen Studien ist LipF(A) die Zusammensetzung, die ursprünglich für SCCHN optimiert worden ist. Wie in der folgenden Tabelle gezeigt, ergab die LipF-Zusammensetzung B den höchsten Grad an Transfektionseffizienz in MDA-MB-435-Brustkrebszellen, während die LipF-Zusammensetzung E für sowohl DU145 als auch PANC-1 besser war. Deshalb wurde die LipF-Zusammensetzung B [LipF(B)] für den Rest der Untersuchungen mit MDA-MB-435, unten beschrieben, verwendet.
Die Oligonucleotidkonzentration war 2 μM
Das Molverhältnis von Liposomen:Oligonucleotid war 10:1
Stabilität von LipF(B)-AS-HER-2 in vitro und im Blut:
Da ein Ziel dieser Untersuchungen war, ein systemisches Zufuhrsystem für Gegensinnoligonucleotide zu entwickeln, war es wichtig, die Stabilität des LipF(B)-AS-HER-2-Komplexes im Serum zu bestimmen. Deshalb wurde der Komplex zu 50% Serum hinzugefügt und bei 37°C inkubiert. Zu verschiedenen Zeiten von 0–24 Stunden wurden Proben entnommen, die Oligonucleotide wurden mit ³²P markiert und ein prozentualer Abbau wurde durch PAGE beurteilt. Kein Abbau des AS-HER-2-Oligonucleotides wurde über 24 Stunden gefunden, wenn es mit LipF(B) komplexiert worden ist. Im Gegensatz dazu wurden 50% der freien Oligonucleotide so früh als nach 6 Stunden abgebaut, mit einem praktisch vollständigen Abbau nach 24 Stunden.
Die Stabilität wurde ebenfalls in Mausblut untersucht, eine Lage, die der In-vivo-Situation analoger ist. Sogar nach 24 Stunden verblieben mehr als 75% des komplexierten Oligonucleotids intakt. Deshalb wurde geschlossen, dass das folatgerichtete Zufuhrsystem die Oligonucleotide lange genug in der Zirkulation schützen sollten, um ihnen zu erlauben, die Tumorzellen wirksam zu erreichen.
In-vitro-Chemosensitivierung von Krebszellen durch LipF-AS-HER-2:
Die Fähigkeit des mit LipF(B) zugeführten AS-HER-2 MDA-MB-435-, JSQ-3-, DU145- und U87-(menschliche Glioblastom)Zellen für chemotherapeutische Mittel zu sensitivieren, wurde beurteilt. Sensitivität wurde unter Verwendung des XTT-Zellproliferationstests bestimmt. Transfektion mit LipF(B)-AS-HER-2 steigerte wesentliche die Tötungswirkung von Docetaxel auf die 435-Zellen. Ein Vergleich der durch LipF(B) vermittelten mit AS-HER-2 behandelten Zellen mit jenen Zellen, die mit LipF(B)-Kontroll-Oligonucleotid (SC) behandelt worden waren, zeigte eine mehr als 30-fache Zunahme bei der Sensitivierung von 435-Zellen für Taxoter. Im Gegensatz dazu war nur ein 2,5-faches Maß der Sensitivierung nach der Transfektion mit AS-HER-2 unter Verwendung von im Handel erhältlichen Lipofectin (Life Technologies, Inc.) ersichtlich. Die Behandlung von JSQ-3-Zellen mit LipF(E)-AS-HER-2 erhöhte die Wirkung von Docetaxel annähernd 25-fach. Ferner wurde ebenfalls die Wirkung von Cisplatin (CDDP) auf JSQ-3-Zellen um mehr als das 17-fache nach der Behandlung mit AS-HER-2, komplexiert mit transferringerichtetem Liposom A (LipT(A)), gesteigert. Eine 2-fache Zunahme in der Sensitivierung von DU145-Zellen auf Docetaxel wurde nach der Behandlung mit LipF(E)-AS-HER-2 gesehen. Die menschliche Glioblastomzelllinie U87 zeigte eine mehr als 8-fache Zunahme in der Chemosensitivität auf das Arzneimittel Gemcitabin nach der Behandlung mit LipF(B)-AS-HER-2.
Um weiter die Verwendung des gerichteten Liposomenkomplexes als einen Vektor für die Gegensinngentherapiezufuhr zu zeigen, wurde die Fähigkeit von LipF(B), das ein Anti-RAS-Oligonucleotid (AS-RAS, eine 11-mer-Sequenz, komplementär zu der Sequenz in der Nähe des Startkodons des Gens) trägt, PANC-1-Pankreaskarzinomzellen für Docetaxel zu sensitivieren, untersucht. Hier wurde ebenfalls eine mehr als 70-fache Zunahme in der Arzneimittelsensitivität durch die Behandlung mit LipF(B)-AS-RAS induziert. Die Daten zeigen, dass die LipF(B)-vermittelte Gegensinngentherapie zu einer wesentlichen Zunahme in der Wirksamkeit chemotherapeutischer Mittel in zuvor resistenten menschlichen Krebszellen führen kann.
In-vivo-Studien
Die Fähigkeit von LipF(B)-AS-HER-2, vorexistierende MDA-MB-435-Xenotransplantattumoren in vivo zum Ziel zu nehmen und für das chemotherapeutisch Docetaxel zu sensitivieren, wurde unter Beurteilung der Tumorregression ebenso wie der Tumorwachstumsinhibition untersucht. Weiblichen athymischen Mäusen (Ncr nu/nu), die MDA-MB-435-Xenografttumoren des Brustfettpolsters mit annähernd 70 mm³ trugen, wurde intravenös über die Schwanzvene LipF(B)-AS-HER-2 (mit annähernd 0,6 mM Oligonucleotide) jeden Tag bis zu insgesamt 11 Injektionen injiziert. Insgesamt 11 intravenöse Dosen Docetaxel (annähernd 20 mg/kg/Dosis jeden Tag) wurden den Tieren ebenfalls verabreicht. Eine dramatische Wachstumsinhibition der Tumoren war in den Tieren ersichtlich, die die Kombination aus LipF(B)-AS-HER-2 und Docetaxel erhielten. Im Gegensatz dazu war eine minimale Wachstumsinhibition in jenen Mäusen ersichtlich, die nur AS-HER-2 erhielten. Ferner, während es einen gewissen Docetaxel-Effekt gab, begannen die Tumoren, schnell in der Größe nach dem Abbrechen der Behandlung zuzunehmen. Deshalb war die systemisch zugeführte, gerichtete Liposomenzufuhr von Gegensinnoligonucleotiden, in diesem Fall AS-HER-2, klar in der Lage, diese Tumoren für das chemotherapeutische Mittel zu sensitivieren, wodurch das Tumorwachstum annähernd drei Wochen nach dem Ende der Behandlung stark inhibiert worden ist.
BEISPIEL 22
Targeting von Adenovirus durch Transferrin-Liposomen
Das Verbessern der Effizienz und der Spezifität des Gentransfers bleibt ein wichtiges Ziel bei der Entwicklung neuer Strategien für die Gentherapie. Adenoviren (Ad) sind hoch effiziente Vektoren, sie sind jedoch beschränkt durch das Fehlen einer Tumortargetingspezifität und einer wesentlichen Immunogenität. Es wurde berichtet, dass kationische Lipide einen nicht kovalenten Komplex mit Adenovirus bilden können und die Gentransfereffizienz erhöhen können. Kationischen Lipiden selber fehlt jedoch immer noch die Zielspezifität.
Bei diesem Beispiel zeigten wir, dass der Liganden-Liposomen-Vektor der Erfindung ebenfalls einen Komplex mit Adenoviruspartikeln bilden kann, wodurch ihre Gentransfereffizienz erhöht wird und, wesentlicher, ihre Targetingspezifität. Ferner erlaubt die Verwendung des Zufuhrsystems aus Ligand, Liposom und therapeutischem Molekül der Erfindung, wenn das therapeutische Molekül ein intaktes Adenoviruspartikel ist, das effiziente Tumorzelltargeting und die systemische Verabreichung von therapeutischem Adenovirus für die Gentherapie, ein anderer neuer Ansatz für die Gentherapie.
Zubereitung des Transferrin-Liposom-Adenovirus-Komplexes:
Bei dieser Studie wurde das replikationsdefiziente Adenovirus vom Serotyp 5, enthaltend das β-Galactosidasegen LacZ von E. coli unter einem CMV-Promotor, Ad5LacZ, verwendet. Ad5LacZ in einer Konzentration von 1,1 × 10¹² Partikel (pt)/ml oder 5,5 × 10⁹ Plaque bildenden Einheiten (pfu)/ml, in PBS (pH 7,4) plus 3% Suchrose wurden in dieser Studie verwendet. Holotransferrin (Tf, eisengesättigt, Sigma) wurde in Wasser mit 4–5 mg/ml gelöst und mit einem 0,22 ml-Filter filtriert. Tf wurde als Erstes auf 0,5 mg/ml in 10 mM HEPES-Puffer (pH 7,4) verdünnt, wonach unterschiedliche Mengen an Tf zu 50 μl HEPES-Puffer in Mikrozentrifugenröhrchen hinzufügt und gut vermischt wurden. Nach 5–10-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde Lip(A) (DOTAP:DOPE, Molverhältnis 1:1) mit 0,1 mmol/μl zu den Röhrchen so hinzugefügt, dass sich die Lipid/Tf-Verhältnisse im Bereich von 1 nmol/1–10 μg erstreckten. Die Lösungen wurden gut vermischt und bei Raumtemperatur für 5–10 Minuten inkubiert. 1 × 10⁶ bis 1 × 10⁷ pt Adenovirus wurden zu jedem Röhrchen hinzugefügt, so dass sich die Verhältnisse von kationischem Lipid zu Adenovirus von 1 × 10³ bis 1 × 10⁷ Lipidmoleküle/pt erstreckten. Die Proben wurden bei Raumtemperatur 10–15 Minuten inkubiert und dann wurden 150 μl EMEM ohne Serum zu jeder hinzugefügt.
In-vitro-Adenovirustransduktion
5 × 10⁴ JSQ-3-Zellen/Vertiefung wurden in einer 24-Well-Platte ausplattiert. 24 Stunden später wurden die Zellen einmal mit EMEM ohne Serum gewaschen und 0,3 ml EMEM ohne Serum oder Antibiotika wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Die Ad5LacZ- oder Tf-Ad5LacZ-Komplexe in unterschiedlichen Verhältnissen in 200 μl EMEM wurden zu jeder Vertiefung doppelt hinzugefügt. Das Verhältnis von Virus zu Zelle erstreckte sich von 20 bis 2000 Viruspartikel/Zelle (pt/Zelle). Nach 4 Stunden Inkubation bei 37°C, 5% CO₂ und mit gelegentlichem Rütteln, wurden 0,5 ml EMEM mit 20% Serum hinzugefügt. Nach 2 Tagen Kultur wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen, in 1 × Reporter-Lyse-Puffer (Promega) lysiert. Die Zelllysate wurden zentrifugiert, in eine 96-Well-Platte doppelt übertragen, mit 100 μl 150 μM O-Nitrophenyl-β-galactopyranosid in 20 mM Tris (pH 7,5), enthaltend 1 mM MgCl₂ und 450 μM β-Mercaptoethanol, bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 150 μl/Vertiefung 1 M Na₂CO₃ gestoppt. Die Extinktion wurde bei 405 nm in einem ELISA-Plattenlesegerät bestimmt. Gereinigte β-Galactosidase (Boehringer) wurde verwendet, um eine Standardkurve zu erzeugen. Die Ergebnisse wurden als Millieinheit (mU) β-Galactosidaseäquivalent pro mg Gesamtprotein ausgedrückt.
Histochemische Färbung
Für histochemische Untersuchungen der LipT-Ad5LacZ-Transduktion wurden zu 60% konfluente Zellen in 24 Well-Platten für 5 Stunden mit Transfektionslösungen, wie oben beschrieben, transfiziert. Nach zusätzlichen zwei Tagen in Kultur wurden die Zellen fixiert und mit X-Gal gefärbt. Die Transfektionseffizienz wurde als Prozentsatz blau gefärbter Zellen berechnet.
In einer viralen Dosis von 500 pt/Zelle oder 2,5 MOI (Multiplizität der Infektion oder pfu/Zelle) wurden 10 mU/μg Protein oder Reportergenprodukt β-Galactosidase durch Ad5LacZ alleine exprimiert. Das mit Transferrin-Liposom komplexierte Virus, LipT-Ad5LacZ, in einem Verhältnis von 1 × 10⁴ kationischen Lipidmolekülen/pt ergab eine Reportergenexpression von 23,5 mU/μg Protein. LipT-Ad5LacZ bei 1 × 10⁵ Lipidmolekülen/pt ergab eine Expression von 30,7 mU/μg, während LipT-Ad5LacZ bei 1 × 10⁶ Molekülen/pt in einer Expression von 30,8 mU/μg resultierte. Dies stellt eine 2,4-, 3,07- bzw. 3,08-fache Zunahme in der Gentransduktion als Ad5LacZ alleine dar. Eine Sättigung wurde anscheinend bei 1 × 10⁵ Lipidmolekülen/pt erreicht.
In einer Dosis von 1000 pt/Zelle (oder 5 MOI) zeigte LipT-Ad5LacZ bei 10⁴ Lipiden/pt eine 2,6-fache Zunahme in der Reportergenexpression, während LipT-Ad5LacZ bei 10⁵ Lipiden/pt eine 2,8-fache Zunahme und LipT-Ad5LacZ bei 10⁶ Lipiden/pt einen 3,8-fach höheren Spiegel der Reportergenexpression als Ad5LacZ alleine ergaben. Der Liposomenkomplex ohne Transferrin ergab nur eine begrenzte Verstärkung. Deshalb schienen die optimale Verhältnisse des LipT-Ad5LacZ-Komplexes ungefähr 10–1000 kationische Lipide/Tf-Molekül und ungefähr 10⁴–10⁷ kationische Lipide/pt, bevorzugt ungefähr 15–50 kationische Lipide/Tf-Molekül und ungefähr 10⁶ kationische Lipide/pt zu sein. Falls das Lipid/pt-Verhältnis zu hoch ist, kann Ausfällung geschehen.
Histochemische Färbung zeigt, dass Ad5LacZ alleine eine 20–30%ige Transfektionseffizienz ergab, während ein mit Transferrin-Liposom komplexiertes Adenovirus LipT-Ad5LacZ bei 10⁶ Lipiden/pt eine 70–90%ige Effizienz ergab.
Andere Liposomenzusammensetzungen wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit, Adenovirus zu komplexieren, untersucht. LipT(B) (DDAB/DOPE, Molverhältnis 1:1) und LipT(D) (DOTAP/Chol, Molverhältnis 1:1) zeigten eine verstärkte Adenovirusgentransduktion in die menschliche Prostatakrebszelllinie DU 145.
Das Liganden-Liposomen-Zufuhrsystem der Erfindung wurde ebenfalls mit dem replikationsdefizienten Adenovirus vom Serotyp 5 komplexiert, der 1,7 kb des menschlichen wt-p53-Gens enthält (LipT(D)-Adp53). Der LipT(D)-Adp53-Komplex wurde intravenös in Nacktmäuse injiziert, die DU145-Prostatakrebs-Xenotransplantattumoren trugen. Westernanalyse (72 Stunden nach der Injektion durchgeführt) des Tumors zeigte die Anwesenheit von zusätzlichen Banden, welche das in dem Tumorgewebe vorhandene exogene menschliche wt-p53-Protein darstellen. Keine zusätzlichen exogenen wtp-53-Sequenzen waren in den normalen Geweben (z. B. Leber, Lunge oder Milz) der behandelten Tiere ersichtlich. Diese Daten zeigen, dass das Zufuhrsystem aus Ligand, Liposom und therapeutischem Molekül der Erfindung in der Lage ist, Adenovirus als das "therapeutische Molekül" spezifisch Tumorgeweben nach systemischer Verabreichung zuzuführen.
Die obigen Ergebnisse zeigten, dass Transferrin-kationische Liposomen Adenovirus komplexieren können und wesentlich die adenovirale Gentransduktion verstärken können. Die Verabreichung der Liganden-Liposomen-Adenovirus-Komplexe stellt einen neuen Ansatz in der menschlichen Gentherapie dar.
BEISPIEL 23
Transferrin-Liposom-gerichtete retrovirale Gentransduktion
Retrovirale Vektoren sind einer der am weitest verbreiteten Gentherapievektoren in klinischen Versuchen. Wie mit adenoviralen Vektoren sind retrovirale Vektoren durch ihre schlechte Tumorspezifität und signifikante Immunogenität begrenzt. Bei diesem Beispiel zeigen wir, dass ähnlich wie mit Adenovirus Ligand-Liposom der Erfindung einen Komplex mit Retroviruspartikeln bilden kann und dabei ihre Gentransfereffizienz und signifikanter ihre Targetingspezifität verstärken kann. Weiterhin erlaubt die Verwendung des Zufuhrsystems aus Ligand, Liposom und therapeutischem Molekül der Erfindung, wenn das therapeutische Molekül ein intaktes Retroviruspartikel ist, das effiziente Tumorzelltargeting und die systemische Verabreichung von retroviralen Vektoren für die Gentherapie.
Das replikationsdefiziente Retrovirus, enthaltend das LacZ-Gen von E. coli, RvLacZ, in einer Konzentration 1 × 10¹⁰ Partikeln (pt)/ml, enthaltend 3 × 10⁷ transformierende Einheiten (TU)/ml, wurde in dieser Studie genutzt. Holotransferrin (Tf, eisengesättigt, Sigma) wurde in Wasser mit 4–5 mg/ml gelöst und mit einem 0,22 mm-Filter filtriert. Der LipT-RvLacZ-Komplex wurde ähnlich zubereitet, wie der von LipT-Ad5LacZ, in Beispiel 21 oben beschrieben. Kurz, Tf wurde als Erstes auf 0,5 mg/ml in 10 mM HEPES-Puffer (pH 7,4) verdünnt. Unterschiedliche Mengen an Tf wurden zu 15 μl HEPES-Puffer in Mikrozentrifugenröhrchen hinzugefügt und gut vermischt. Nach 5–10-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur, kationisches Liposom Lip(A) (DOTAP:DOPE, Molverhältnis 1:1). Die Lösungen wurden gut vermischt und bei Raumtemperatur für 5–10 Minuten inkubiert. 1 × 10⁶ bis 1 × 10⁷ pt Retrovirus wurden zu jedem Röhrchen hinzugefügt, so dass sich die Verhältnisse von kationischem Lipid/Retrovirus von 1 × 10³ bis 1 × 10⁷ Lipidmoleküle/pt erstreckten. Die Proben wurden bei Raumtemperatur 10–15 Minuten inkubiert und 150 μl EMEM ohne Serum wurden zu jeder hinzugefügt. Retrovirale In-vitro-Transduktion wurde, wie in Beispiel 21 beschrieben, durchgeführt. Das Virus-zu-Zell-Verhältnis erstreckte sich von 100–2000 virale Partikel/Zelle (pt/Zelle).
In einer Dosis von 1000 pt/Zelle oder 3 MOI (Multiplizität der Infektion oder TU/Zelle) ergab LipT-RvLacZ bei 10⁵ Lipiden/pt eine 1,5-fache Zunahme in der Reportergenexpression. LipT-RvLacZ bei 10⁶ Lipide/pt ergab eine 2,3-fache Zunahme in dem Expressionsspiegel im Vergleich mit nur RvLacZ. Der Liposomenkomplex ohne Transferrin ergab nur eine begrenzte Verstärkung. Deshalb schienen die optimalen Verhältnisse des LipT-RvLacZ-Komplexes ungefähr 10–1000 kationische Lipide/Tf-Molekül zu sein und ungefähr 10⁴ bis 10⁷ kationische Lipide/pt, bevorzugt ungefähr 15–50 kationische Lipide/Tf-Molekül und ungefähr 10⁶ kationische Lipide/pt. Falls das Lipid/pt-Verhältnis zu hoch ist, kann Ausfällung geschehen.
Histochemische Färbung zeigte, dass RvLacZ alleine eine 20–30%ige Transduktionseffizienz ergab, während mit Transferrin-Liposom komplexiertes Retrovirus LipT-RvLacZ (10⁶ Lipide/pt) eine 60–80%ige Effizienz ergab.
Die obigen Ergebnisse zeigten, dass Transferrin-kationische Liposome mit Retrovirus komplexieren und die retrovirale Gentransduktion wesentlich verstärken können.
BEISPIEL 24
Elektronenmikroskopische Analyse des Liganden-Liposomen-DNS-Komplexes
Liposomen können unter einem Elektronenmikroskop (EM), wie z. B. einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) mit Negativfärbung oder einem Rasterelektronenmikroskop (SEM), beobachtet werden. EM kann die Struktur und Größenverteilung der Liposomenkomplexe erleuchten. EM kann ebenfalls für die Qualitätskontrolle der Liposomenzubereitung verwendet werden.
In diesem Beispiel zeigen wir eine neue, einzigartige Transferrin-Liposomen-Struktur, eine die zu der mit dem in dieser Anmeldung beschriebenen Liganden-Liposomen- therapeutischem Molekül der Erfindung beobachteten Stabilität und Wirksamkeit beitragen kann.
Wir beobachteten die Ligand-kationischen Liposomen unter dem Transmissionselektronenmikroskop mit Negativfärbung. Ein Kupfergitter mit Formvar- und Carbonüberzug (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA) wurde in der Studie verwendet. Liganden-Liposomen-pCMVp53-Komplexe wurden, wie in den Beispielen 2 und 17 beschrieben, zubereitet. Ein Tropfen des Liposomenkomplexes wurde auf das Gitter gegeben. Nach 5 Minuten wurde überschüssige Flüssigkeit durch Kapillarwirkung mit Filterpapier an der Ecke des Gitters entfernt. Ein Tropfen 4% Uranacetat wurde dann zu dem Gitter für Negativfärbung hinzugefügt. Nach 5 Minuten wurde überschüssige Flüssigkeit ebenfalls wie oben entfernt. Das Gitter wurde bei Raumtemperatur für 15 Minuten luftgetrocknet, bevor es in die Probenkammer des TEM gegeben wurde. Es wurden JOEL 1200EX oder JOEL 1005 in der Studie gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Fotos wurden in Vergrößerungen von 10–50 k, 60 kVolt aufgenommen. Die Liposomenproben auf dem Gitter wurden innerhalb von 1 Stunde zubereitet, frisch gefärbt und beobachtet.
Viele Veröffentlichungen deuteten an, dass kationische Liposomen-DNS-Komplexe eine mannigfaltige Struktur und Größe im Bereich von 100 nm bis 1000 nm haben. In unserer Studie beobachteten wir unerwarteterweise, dass die Liganden-Liposomen-DNS-Komplexe, zubereitet in Übereinstimmung mit dieser Erfindung, eine viel geringere Größe und eine viel gleichmäßigere Größenverteilung haben. Besonders LipT(A)-p53-Komplexe haben eine Größe im Bereich von ungefähr 30 bis 100 nm im Durchmesser, bevorzugt 35 bis 65 nm (mittelnd um 50 nm). Da das kationische Liposom Lip(A) selber eine Größe von 15–40 nm, im Durchschnitt 25 nm, hat, änderte sich die Größe nicht merklich, wenn Transferrin mit Lip(A) komplexiert worden ist. Es wurden jedoch dickere Liposomenwände oder -membranen beobachtet, was anzeigt, dass Transferrin auf der Liposomenmembran komplexiert worden ist. Auf den vergrößerten Fotos beobachteten wir eine unregelmäßige oder azentrische, zwiebelähnliche Struktur in dem Kern des LipT(A)-DNS-Komplexes. Ein Zwischenzustand der Bildung der Struktur, z. B. ein Zwischenschritt bei der Kondensation der DNS-Kette durch LipT(A), wurde ebenfalls beobachtet. Wenn die Inkubationszeit für das Vermischen von LipT(A) mit DNS von 15 auf 5 Minuten verkürzt wurde, wurden mehr dieser Zwischenzustände beobachtet.

Basierend auf den TEM-Beobachtungen scheint es, dass die einzigartige Struktur des LipT(A)-DNS-Komplexes eine wichtige Rolle bei der hohen Gentransfektionseffizienz spielen könnte, die in vitro und insbesondere in vivo beobachtet wurde. Die azentrische, zwiebelähnliche Kernstruktur könnte über die folgenden Schritte während der Bildung des LipT(A)-DNS-Komplexes gebildet werden:

Schritt 1:	Etliche (4–8 oder mehr) Tf-Liposomen kontaktieren jedes DNS-Molekül, wobei sie an die DNS-Kette durch elektrostatische Wechselwirkung anhaften.
Schritt 2:	Jedes anheftete Tf-Liposom umhüllt oder kondensiert die DNS-Kette, um einzelne lamellenartige Strukturen entlang der DNS-Kette zu bilden.
Schritt 3:	Die Lamellenstruktur kondensiert, um eine einzelne Kernlamellenstruktur zu bilden. Diese feste Kernstruktur ist kleiner in der Größe als die Summe der 4–8 Tf-Liposomen.
Schritt 4:	Während der endgültigen Kondensation kann ein Phasenübergang von der lamellenartigen Phase zu der umgekehrt hexagonalen Phase geschehen, was die unregelmäßige oder azentrische, zwiebelähnliche Struktur verursacht.

Von der umgekehrten hexagonalen (H_II)-Phase wird angenommen, dass sie wesentlich effizienter ist als die lamellenartige (L_II)-Phase bei der Transfektion und mit DNS-Freisetzung und -Zufuhr in Beziehung stehen könnte (Koltover, I. Science 281: 78, 1998). Unter Verwendung von Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie, beschrieb B. Sternberg (Biochim. Biophys. Acta, 1998; 1375: 23–35) eine "Map-Pin"-Struktur in kationischen Liposom-DNS-Komplexen, mit DDAB/Chol gebildet, die die höchste In-vivo-Transfektionsaktivität hatten. Diese hohe In-vivo-Aktivität, nahm er an, stehe in Beziehung mit den kleinen (100–300 nm) stabilisierten Komplexen, wohingegen eine hohe In-vitro-Aktivität mit hexagonalen Lipidpräzipitaten verbunden sei. Es ist in der Literatur keine Ultrastrukturanalyse von Komplexen aus Liganden, kationischen Liposomen und DNS erhältlich. Wir nehmen an, dass in der Anwesenheit von Transferrin oder anderen Liganden der Übergang von L_II zu H_II dazu neigt, zu geschehen, und dass die gebildete unregelmäßige azentrische, zwiebelähnliche Kernstruktur durch den Liganden stabilisiert wird. Wie für den Mechanismus des Phasenübergangs von der lamellenartigen zu der umgekehrt hexagonalen könnten neben jenen Mechanismen, die durch Koltover vorgeschlagen wurden, die Liganden eine wichtige Rolle spielen. Auf die Liposomenoberfläche angeheftetes oder auf der Liposomenoberfläche phosphatgekoppeltes Tf könnte bei dem Phasenübergang helfen oder ihn beschleunigen, was die hocheffizienten azentrischen, zwiebelähnlichen Kernstrukturen verursacht.
Bei den hierin offenbarten Zubereitungsbedingungen haben mehr als 95% der LipT(A)-DNS-Komplexe die unregelmäßige oder azentrische, zwiebelähnliche Kernstruktur. Falls es diesen Übergang nicht gäbe, würden die kondensierten Lamellenstrukturen in den Schritten 3 bis 4 bevorzugt reguläre oder zentrierte, zwiebelähnliche Kernstrukturen bilden, um stabil zu sein. Dieser L_II-H_II-Übergang und diese Tf-Stabilisierung könnten zu der unerwartet hohen In-vivo-Gentransfektionseffizienz beitragen.
Da die Komplexierung ein 4-Schritt-Vorgang ist, ist es wichtig, dass, wenn der Komplex zubereitet wird, er für eine ausreichende Zeitdauer zwischen jedem Mischschritt inkubiert wird, unter Verwendung von häufigem Schütteln, um es der azentrischen, zwiebelähnlichen Kernstruktur zu erlauben, sich vollständig zu bilden. Für die hierin offenbarten Zubereitungsvorgänge sollte die Inkubationszeit ungefähr 5–15 Minuten nach jedem Mischen betragen und ungefähr 10–30 Minuten nach dem Mischen mit DNS, bevorzugt ungefähr 15–30 Minuten.
Eine weitere einzigartige Eigenschaft der Liposomen gemäß der Erfindung ist ihre gleichmäßig verteilte kleinere Größe (Durchmesser weniger als 100 nm, bevorzugt weniger als ungefähr 75 nm, bevorzugter ungefähr 35–65 nm (50 nm durchschnittlich)). Um den Zieltumor in vivo zu erreichen, müssen die Liposomen als Erstes resistent gegen Serum sein und müssen dann durch die Blutgefäß-(Kapillar-)wand passen. Die Komplexe der vorliegenden Erfindung zeigen eine hohe Resistenz gegen Abbau durch Serum. Die permeable Größe der Kapillaren im Tumor beträgt gewöhnlich 50–75 nm; deshalb passen die Komplexe durch die Kapillarwand, um das Ziel zu erreichen.
Die TEM-Struktur des LipF(B)-DNS-Komplexes ist ähnlich wie jene von LipT(A)-DNS und dieser Komplex hat eine Größe im Bereich von 30–100 nm, bevorzugt 35–75 nm (Durchschnitt 50 nm) im Durchmesser. Die einzigartigen, unregelmäßigen oder azentrischen, zwiebelähnlichen Kernstrukturen wurden ebenfalls beobachtet. Der Übergang von der Lamellenphase zur umgekehrt hexagonalen Phase kann in einem ähnlichen 4-Schritt-Prozess geschehen, der zu der unerwartet hohen In-vivo-Gentransfektionseffizienz beiträgt.
BEISPIEL 25
Stabilität von Ligand-kationischen Liposomen
Stabilität ist eine wichtige Angelegenheit für Liposomenpharmazeutika. Liposomenlösungen sollten für einen verlängerten Zeitraum nach der Zubereitung stabil sein, um die Fracht und Lagerung ohne wesentlichen Verlust ihrer biologischen/pharmazeutischen Aktivitäten zu erlauben, um als therapeutische Mittel nützlich zu sein. Im Lichte der künftigen klinischen Verwendung des Komplexes aus Ligand, Liposom und therapeutischem Molekül dieser Erfindung untersuchten wir die Stabilität der Liganden-Liposomen- und der Liganden-Liposomen-DNS-Komplexe.
Lip(A) wurde in Wasser zubereitet und unter Stickstoff im Dunkeln bei 4°C für verschiedene Zeiträume gelagert, bis zu 6 Monate. An dem Tag des Tests wurden die gelagerten Liposomen, ebenso wie frisch zubereitetes Lip(A), verwendet, um den LipT(A)-pCMVb-Komplex herzustellen. Der Komplex wurde dann verwendet, um JSQ-3-Zellen unter Verwendung des in Beispiel 5 beschriebenen Transfektionstests zu transfizieren. Kein merklicher Unterschied in dem Spiegel der Transgenexpression wurde zwischen den Lip(A)-Zubereitungen beobachtet, die sich für unterschiedliche Zeiträume in Lagerung befunden haben, und dem frisch zubereiteten Lip(A). In einem gesonderten Experiment bewahrte eine für 12 Monate gelagerte Lip(A)-Zubereitung immer noch > 90% ihrer Transfektionsaktivität. Die Transferrinlösung (5 mg/ml in Wasser) und pCMVb-Plasmid-DNS (0,5–1,0 μg/ml in 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) wurden jeweils gesondert zubereitet. Folat-Liposom-Komplexe wurden als denselben Grad an Stabilität aufweisend befunden.
Die Liposomen, Tf und Plasmid-DNS sind sämtlich individuell bei der Lagerung stabil. Wenn sie jedoch miteinander vermischt werden, um den LipT-DNS-Komplex zu bilden, ist der Komplex für einen verlängerten Zeitraum unstabil. Zum Beispiel war der LipT-DNS-Komplex für nur wenige Tage stabil. Am Tag 3 verblieben nur 50% Transfektionsaktivität. Für LipF-DNS verblieben nur 60% Transfektionsaktivität nach 24 Stunden, mit einem annähernd vollständigen Verlust an Aktivität 3 Tage nach der Zubereitung.
Basierend auf diesen Beobachtungen scheint es, dass die Bestandteile der Komplexe aus Ligand, Liposom, therapeutischem Molekül dieser Erfindung vorteilhafterweise in Kitform bereitgestellt werden können. Die Bestandteile können an dem Tag der Verwendung miteinander nacheinander vermischt werden, indem zuerst das Tf zu dem Liposom hinzugefügt wird, gefolgt von der DNS-Lösung (10–15 Minuten Inkubieren zwischen jedem Mischen), und dann der Zugabe von Dextrose auf 5%. Der Komplex sollte so schnell wie praktikabel verabreicht werden, bevorzugt innerhalb von 24 Stunden nach seiner Zubereitung.

Claims

Vektor für die systemische Übermittlung eines therapeutischen oder diagnostischen Mittels an eine Zielzelle in einem Wirtstier, umfassend einen Komplex aus einem Zell-zielrichtenden Liganden, einem Liposom und dem Mittel, worin der Vektor einen mittleren Durchmesser von weniger als etwa 100 nm aufweist und worin das Liposom und der Ligand direkt aneinander gebunden sind.
Vektor gemäß Anspruch 1, worin der Vektor einen mittleren Durchmesser von etwa 30 bis 75 nm hat.
Vektor gemäß Anspruch 2, worin der Vektor einen mittleren Durchmesser von etwa 50 nm hat.
Vektor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Mittel eine Nukleinsäure ist.
Vektor gemäß Anspruch 4, worin die Nukleinsäure codiert: (a) ein Protein oder (b) ein antisense Oligonukleotid.
Vektor gemäß Anspruch 5, worin die Nukleinsäure das wildtyp p53 codiert.
Vektor gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6, worin das Liposom und die Nukleinsäure in einem Verhältnis im Bereich von 0,1–50 Nanomol Liposom auf 1,0 μg Nukleinsäure vorhanden sind.
Vektor gemäß Anspruch 7, worin das Verhältnis von 1,0–24 Nanomol Liposom auf 1,0 μg Nukleinsäure reicht.
Vektor gemäß Anspruch 8, worin das Verhältnis von 6–16 Nanomol Liposom auf 1,0 μg Nukleinsäure reicht.
Vektor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, worin der Vektor eine azentrische Struktur aufweist.
Vektor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, worin der Vektor einen festen Kern hat.
Vektor gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, worin der Zell-zielrichtende Ligand ein auf Tumorzellen zielrichtender Ligand ist.
Vektor gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, worin der Zell-zielrichtende Ligand Folat ist.
Vektor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, worin der Zell-zielrichtende Ligand Transferrin ist.
Vektor nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Liposom ein kationisches Liposom ist, umfassend kationisches Lipid und ein neutrales oder Helferlipid.
Vektor zum in vivo Übermitteln eines therapeutisch wirksamen Nukleinsäuremoleküls an ein einen Tumor tragendes Tier, wobei der Vektor im Wesentlichen besteht aus einem Komplex aus einem Zell-zielrichtenden Liganden, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Folat und Transferrin, einem kationischen Liposom und einem Nukleinsäuremolekül, worin der Vektor einen mittleren Durchmesser von weniger als etwa 100 nm aufweist.
Vektor gemäß Anspruch 16, worin das Liposom und das Nukleinsäuremolekül in einem Verhältnis von 0,1–50 Nanomol Liposom auf 1,0 μg Nukleinsäure vorhanden sind.
Vektor gemäß Anspruch 17, worin das Verhältnis 1,0–24 Nanomol Liposom auf 1,0 μg Nukleinsäure beträgt.
Vektor gemäß Anspruch 18, worin das Verhältnis 6–16 Nanomol Liposom auf 1,0 μg Nukleinsäure beträgt.
Vektor gemäß einem der Ansprüche 16 bis 19, worin der Vektor eine azentrische Struktur aufweist.
Vektor gemäß einem der Ansprüche 16 bis 20, worin der Vektor einen festen Kern hat.
Vektor nach einem der Ansprüche 16 bis 21, worin die Nukleinsäure das wildtyp p53 codiert.
Pharmazeutische Zubereitung, umfassend einen Vektor nach einem der vorstehenden Ansprüche in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Verwendung eines Komplexes zur Herstellung eines Medikaments, wirksam bei der Bereitstellung eines therapeutischen Mittels an ein Tier, das dieses Mittels bedarf, worin der Komplex umfasst: einen Zell-zielrichtenden Liganden, ein kationisches Liposom und das therapeutische Mittel, worin der Komplex einen mittleren Durchmesser von weniger als etwa 100 nm aufweist und worin das Liposom und der Ligand direkt aneinander gebunden sind.
Verwendung gemäß Anspruch 24, worin das Liposom und die Nukleinsäure in einem Verhältnis im Bereich von 0,1–50 Nanomol Liposom auf 1,0 μg Nukleinsäure vorhanden sind.
Verwendung gemäß Anspruch 25, worin das Verhältnis von 1–24 Nanomol Liposom auf 1,0 μg Nukleinsäure reicht.
Verwendung gemäß Anspruch 26, worin das Verhältnis von 6–16 Nanomol Liposom auf 1,0 μg Nukleinsäure reicht.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 24 bis 27, worin der Komplex eine azentrische Struktur aufweist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 24 bis 28, worin der Komplex einen festen Kern hat.
Verwendung nach einem der Ansprüche 24 bis 29, worin das therapeutische Mittel eine Nukleinsäure ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 24 bis 30, worin der Zell-zielrichtende Ligand Folat oder Transferrin ist, das Liposom ein kationisches Liposom ist und das therapeutische Mittel eine Nukleinsäure, codierend das wildtyp p53, ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 24 bis 31, worin das Medikament den Komplex und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger in einer pharmazeutisch annehmbaren Zubereitung umfasst.
Verwendung eines Komplexes zur Herstellung eines Medikaments, wirksam bei der Behandlung oder Linderung von Krebs in einem warmblütigen Tier, worin der Komplex umfasst: einen auf Krebszellen zielrichtenden Liganden, ein Liposom und eine therapeutische Nukleinsäure, worin der Komplex einen mittleren Durchmesser von weniger als etwa 100 nm aufweist und worin das Liposom und der Ligand direkt aneinander gebunden sind.
Verwendung gemäß Anspruch 33, worin das Liposom und die Nukleinsäure in einem Verhältnis im Bereich von 0,1–50 Nanomol Liposom auf 1,0 μg Nukleinsäure vorhanden sind.
Verwendung gemäß Anspruch 34, worin das Verhältnis von 1–24 Nanomol Liposom auf 1,0 μg Nukleinsäure reicht.
Verwendung gemäß Anspruch 35, worin das Verhältnis von 6–16 Nanomol Liposom auf 1,0 μg Nukleinsäure reicht.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 33 bis 36, worin der Komplex eine azentrische Struktur aufweist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 33 bis 37, worin der Komplex einen festen Kern hat.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 33 bis 38, worin der Komplex einen Zell-zielrichtenden Liganden, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Folat und Transferrin, ein kationisches Liposom und eine Nukleinsäure, codierend wildtyp p53, aufweist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 33 bis 39, worin das Medikament zur gleichzeitigen, getrennten oder sequentiellen Anwendung mit einem chemotherapeutischen Mittel gegen Krebs oder der Strahlentherapie gegen Krebs geeignet ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 33 bis 40, worin das Medikament für die intratumorale Verabreichung geeignet ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 24 bis 41, worin das Medikament für die systemische Verabreichung geeignet ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 24 bis 42, worin das Medikament für die intravenöse Verabreichung geeignet ist.
Verfahren zur Herstellung von Komplexen, die weniger als 100 nm Durchmesser haben, worin die Komplexe ein Lipide umfassendes Liposom, einen Zell-zielrichtenden Liganden und eine Nukleinsäure umfassen, das Verfahren umfassend die Schritte: (a) Mischen des Liganden mit den Lipiden zur Bildung eines Liposom/Liganden-Komplexes; (b) Mischen des Liposom/Liganden-Komplexes und der Nukleinsäure in einem Verhältnis von 0,1–50 Nanomol Liposom auf 1,0 μg Nukleinsäure zur Bildung eines Komplexes aus Liposom/Ligand/Nukleinsäure; und (c) Rütteln des Komplexes aus Liposom/Ligand/Nukleinsäure.
Verfahren gemäß Anspruch 44, worin das Verhältnis von 1–24 Nanomol Liposom auf 1,0 μg Nukleinsäure beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 45, worin das Verhältnis von 6–16 Nanomol Liposom auf 1,0 μg Nukleinsäure beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 44 bis 46, worin die Lipide ein neutrales Lipid umfassen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Dioleylphosphatidylethanolamin und Cholesterin.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 44 bis 47, worin die Lipide ein kationisches Lipid umfassen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Dioleyltrimethylammoniumpropan und Dimethyldioctadecylammoniumbromid.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 44 bis 48, worin der Ligand Folat oder Transferrin ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 44 bis 49, worin der Liposom/Liganden-Komplex aus Schritt (a) unter Schütteln für 5–15 Minuten vor Durchführung des Schrittes (b) inkubiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 44 bis 50, worin Schritt (c) für 10 bis 30 Minuten durchgeführt wird.