DE69936444T2

DE69936444T2 - Systemische verabreichung von serum-stabilen plasmid-lipid partikeln zur krebstherapie

Info

Publication number: DE69936444T2
Application number: DE69936444T
Authority: DE
Inventors: Ian Vancouver MACLACHLAN; Roger Vancouver GRAHAM
Original assignee: Protiva Biotherapeutics Inc
Current assignee: Protiva Biotherapeutics Inc
Priority date: 1998-02-03
Filing date: 1999-02-03
Publication date: 2008-03-20
Anticipated expiration: 2019-02-04
Also published as: WO1999039740A8; WO1999039741A2; EP1053023B1; AU2405799A; JP2002502831A; DE69936444D1; DE69936444T3; CA2319468A1; WO1999039741A3; ATE366121T1; EP1053023B2; CA2321837C; CA2321837A1; WO1999039740A3; WO1999039740A2; AU749881B2; EP1053023A2; WO1999039740A9

Description

FACHGEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft Methoden und Zusammensetzungen zur Behandlung einer Neoplasie, und insbesondere eines Tumors in einem Säuger.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die systemische Verabreichung von therapeutischen Nukleinsäuren für gentherapeutische Anwendungen stellt ein in hohem Maße erwünschtes Ziel dar. Die systemische Verabreichung unter Ausnutzung der Blut- oder Lymph-Kreislaufsysteme wird es möglich machen, dass therapeutische Nukleinsäuren vielfache distale Erkrankungsstellen aufspüren und sich einer Erkrankungsstelle von vielfachen Punkten aus nähern. Erfolgreiche Systeme werden gegen Krebsformen (d.h. feste, nicht-feste oder metastatische Tumoren), Infektionserkrankungen, Entzündung und andere krankhafte Ziele, die sich distal zu der Stelle der Verabreichung befinden, nützlich sein.
Derzeit sind die weitverbreitetsten Arbeitssysteme für die humane in vivo-Gentherapie nicht-systemische Verabreichungssysteme. Die aktuellen Systeme wenden die direkte, d.h. lokale, Injektion oder Inhalation von modifizierten Adenoviren (siehe Englehardt, "Methods for Adenovirus-Mediated Gene Transfer to Airway Epithelium," Kapitel 11 in Methods in Molecular Medicine, Gene Therapy Protocols. Ed. P. Robbins, 1997. Humana Press Inc., Totowa, NJ), Retroviren (Olsen, et al., "Methods for the Use of RetroviralVectors for Transfer of the CFTR Gene to Airway Epithelium," Kapitel 10, Methods in Molecular Medicine, supra), kationischen Lipid-Plasmid-Aggregaten (Nabel, et al., "Methods for Liposome-Mediated Gene Transfer to Tumor Cells in vivo," Kapitel 21, Methods in Molecular Medicine, supra; Son, et al., "Cationic Liposome-Mediated Gene Transfer to Tumor Cells in vitro and in vivo," Kapitel 23, Methods in Molecular Medicine, supra) oder die einfache Verabreichung von nackter DNA an (siehe US-Patent Nr. 5,589,466 an Felgner, et al.).
Ungünstigerweise gibt es wohl bekannte Nachteile bei diesen populären Methoden, die ihre Anwendung als systemische Verabreichungssysteme verhindern. Zum Beispiel werden kationische Lipid-Plasmid-Aggregate mittels der Leber, Lunge oder Milz nach der intravenösen Verabreichung schnell ausgeschieden und erfüllen daher die Kriterien für die systemische Verabreichung nicht, da sie kaum eine nützliche Transfektion an anderer Stelle zeigen. Dies ist möglicherweise eine Folge ihres großen Durchmessers, d.h. > 200nm, und der starken kationischen Oberflächenladung. Darüber hinaus sind adenovirale und retrovirale Systeme immunogen, werden schnell aus dem Kreislauf beseitigt und erlauben keine wiederholte Dosierung. Außerdem wird nackte DNA im Blut schnell abgebaut und ist daher nicht für die systemische Verabreichung geeignet.
Die systemische Verabreichung für die in vivo-Gentherapie, d.h. die Verabreichung einer therapeutischen Nukleinsäure an eine distale Zielzelle über Körpersysteme, wie etwa den Kreislauf, ein weniger gut erforschter Zugang, ist unter Verwendung von Lipid-Plasmid-Partikeln erreicht worden, wie etwa solchen, die beschrieben sind in der veröffentlichten PCT-Patentanmeldung WO 96/40964 , US-Patent Nr. 5,705,385 , und US-Patentanmeldungen der laufenden Nrn. 08/485,458 , 08/484,282 , 08/660,025 , 08/856,374 , 60/073,598 und 60/063,473 , die alle demselben Antragsteller der vorliegenden Erfindung erteilt sind. Dieses letztere Format liefert ein vollständig eingekapseltes Lipid-Plasmid-Partikel, das die therapeutische Nukleinsäure vor einem Nuklease-Abbau in Serum schützt, nicht-immunogen ist, von kleiner Größe ist und für eine wiederholte Dosierung geeignet ist.
Ist das systemische Verabreichungssystem einmal festgelegt worden, so besteht der nächste fragliche Punkt in der Bestimmung dessen, welcher krankhafte Zustand zu behandeln und welche therapeutische Nukleinsäure zu verabreichen ist. Bis heute hat keine Veröffentlichung therapeutische Daten berichtet, bei denen in einem systemischen Verabreichungssystem die Variante der gentherapeutischen Technik an gewendet wurde, die bekannt ist als "Gene-delivered Enzyme Prodrug Therapy" ("GDEPT"), oder alternativ das "Suizidgen/Prodrug"-System, welches zuerst entwickelt wurde von Moolten, F.L., Cancer Res., 46:5276-5281 (1986). Für eine Übersicht über das GDEPT-System, siehe Moolten, F.L., The Internet Book of Gene Therapy, Cancer Therapeutics, Kapitel 11 (Sobol, R.E., Scanlon, NJ (Hrsg.) Appelton & Lange (1995)). Bei dieser Methode wird ein heterologes Gen in eine Zelle übertragen, wobei das heterologe Gen, das für ein Enzym kodiert, welches den Stoffwechsel einer ersten Verbindung, gegen die die Zelle weniger empfindlich ist (d.h. die "Prodrug"), zu einer zweiten Verbindung fördert, für die die Zelle empfindlicher ist. Die Prodrug wird in die Zelle entweder mit dem Gen übertragen oder nach Transfer des Gens. Das Enzym wird die Prodrug zu einer zweiten Verbindung prozessieren und entsprechend reagieren. Ein von Moolten vorgeschlagenes geeignetes System ist das Herpes simplex-Virus-Thymidinkinase (HSV-TK)-Gen und die Prodrug Ganciclovir. Diese Methode ist vor kurzem unter Verwendung von kationischen Lipid-Nukleinsäure-Aggregaten für die lokale Übertragung (d.h. direkte intra-tumorale Injektion) oder regionale Übertragung (d.h. intraperitoneal) des TK-Gens in Haustumoren verwendet worden durch Zerrouqui, et al., Can. Gen. Therapy, 3(6):385-392 (1996); Sugaya, etal., Hum. Gen. Ther., 7:223-230 (1996) und Aoki, et al., Hum. Gen. Ther., 8:1105-1113 (1997). Humane klinische Versuche unter Verwendung eines GDEPT-Systems unter Verwendung von viralen Vektoren sind vorgeschlagen worden (siehe Hum. Gene Ther., 8:597-613 (1997), und Hum. Gene Ther., 7:255-267 (1996)) und sind auf dem Wege.
Patentanmeldungen in Bezug auf die GDEPT-Methode sind unter den folgenden Nummern veröffentlicht worden: WO 97/19180 ; WO 97/07118 ; WO 96/22277 ; WO 97/19183 ; WO 96/16179 ; WO 96/03515 ; WO 96/03515 ; WO 96/03151 ; EP 690129 ; EP 657541 ; EP 657539 ; WO 95/05835 und EP 415731 .
Aus dem Vorangegangenen ist ohne weiteres erkennbar, dass die systemische Verabreichung von therapeutischen Nukleinsäuren an distale Erkrankungsstellen eindeutig signifikante Vorteile gegenüber existierenden gentherapeutischen Modalitäten bieten würde. Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, die Methoden und Zusammensetzungen zur Erreichung dieses Ziels bereitzustellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung liefert, unter anderem, die Methoden und Zusammensetzungen für die Behandlung einer metastatischen Neoplasie, z.B. eines Tumors, in einem Säuger. Die vorliegende Erfindung kann zur Behandlung einer metastatischen Neoplasie in einem Säuger durch Verabreichen an den Säuger eines Serum-stabilen Nukleinsäure-Lipid-Partikels verwendet werden, umfassend eine Nukleinsäure, die vollständig eingekapselt ist innerhalb eines Lipids, wobei die Verabreichung durch intravenöse Injektion an eine Injektionsstelle erfolgt, die physisch getrennt ist von der Neoplasie in dem Säuger.
Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden zur Sensibilisierung einer neoplastischen Zelle durch: (a) Transfizieren der neoplastischen Zelle mit einem Serumstabilen Nukleinsäure-Lipidpartikel, umfassend eine Nukleinsäure, die vollständig eingekapselt ist innerhalb eines Lipids und die für ein Genprodukt kodiert, das die Prozessierung, d.h. Umwandlung, einer ersten Verbindung (z.B. einer Prodrug) zu einer zweiten Verbindung fördert, wobei die Verabreichung durch intravenöse Injektion an einer Injektionsstelle, die physisch getrennt ist von der Neoplasie in dem Säuger, erfolgt; und (b) Verabreichen an die neoplastische Zelle der ersten Verbindung, wobei die Zelle empfindlicher für die zweite Verbindung als für die erste Verbindung ist.
Bei den obigen Methoden können die Nukleinsäure und die erste Verbindung in Lipid-Formulierungen verabreicht werden, die die gleichen oder verschiedene sein können. Die Lipid-Formulierungen, ob nun zur Verabreichung der Nukleinsäure oder der ersten Verbindung (z.B. Prodrug) verwendet, können aus einer Vielfalt von Lipiden, Lipid-Konjugaten und zusätzlichen kompatiblen Komponenten, die im Fachgebiet bekannt sind, präpariert werden. Die Lipid-Formulierungen können zum Beispiel aus Sphingomyelin und Cholesterol präpariert werden. Darüber hinaus können die Lipid-Formulierungen zusätzliche Komponenten enthalten, die die Eigenschaften oder Charakteristika der Formulierungen verbessern, wie etwa die Undichtigkeit, Langlebigkeit im Kreislauf, reduzierte Toxizität, Verkapselungseffizienz etc. Zu sol chen Komponenten zählen zum Beispiel kationische Lipide, ATTA-Lipid-Konjugate, PEG-Lipid-Konjugate, Zielagentien (Targeting Agents) etc. Einmal hergestellt, können die Lipid-Nukleinsäure-Formulierungen und/oder Lipid-Prodrug-Formulierungen dem Säuger unter Anwendung einer Vielfalt von Techniken, die den Fachleuten des Gebiets bekannt sind, verabreicht oder übertragen werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die Lipid-Nukleinsäure-Formulierung systemisch (z.B. durch intravenöse Injektion) verabreicht, wohingegen die Lipid-Prodrug-Formulierungen systemisch oder regional oder lokal verabreicht werden können.
Jegliche in der Behandlung einer Neoplasie in einem Säuger nützliche Nukleinsäure kann unter Verwendung der Zusammensetzungen und Methoden der vorliegenden Erfindung verabreicht werden. Wird beispielsweise das GDEPT-System angewendet, so kann die Nukleinsäure jegliche Nukleinsäure sein, die für ein Genprodukt kodiert, das die Prozessierung, d.h. Umwandlung, einer ersten Verbindung (z.B. einer Prodrug) zu einer zweiten Verbindung fördert, für die der Säuger oder die Zelle von Interesse empfindlicher oder empfänglicher ist. Zu Beispielen geeigneter Genprodukte zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Herpes simples-Virus-Thymidinkinase, Cytosindeaminase, Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase, Purinnukleosidphosphorylase, Cytochrom P450 2B1 und deren Analoga. Weitere geeignete Genprodukte zur Verwendung bei den Methoden der vorliegenden Erfindung werden für Fachleute des Gebiets ohne weiteres erkennbar sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erste Verbindung eine Prodrug, d.h. eine Verbindung, gegenüber der die Zelle von Interesse nicht ursprünglich empfindlich ist, doch die das Genprodukt zu einer Verbindung umwandelt, gegen die die Zelle von Interesse empfindlicher ist. Zu Beispielen geeigneter Prodrugs zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Ganciclovir, Acyclovir, Bromvinyldesoxyuridin, 5-Fluorocytosin, 6-Thioxanthin, MeP-dr und Cyclophosphamid. Weitere geeignete Prodrugs zur Verwendung bei den Methoden der vorliegenden Erfindung werden für Fachleute des Gebiets ohne weiteres erkennbar sein.
Die vorliegende Erfindung kann für die Sensibilisierung einer Zelle für eine Verbindung verwendet werden, welche Methode umfasst: a) Übertragen an eine Zelle eines Enzyms, welches die Prozessierung einer ersten Verbindung zu einer zweiten Verbindung fördert; und b) Übertragen an die Zelle der ersten Verbindung in einer Lipid-Formulierung; wobei die Zelle für die zweite Verbindung empfindlicher ist als für die erste Verbindung. In einer derzeit bevorzugten Ausführungsform werden sowohl das Enzym als auch die erste Verbindung in Lipid-Formulierungen verabgereicht.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung zur Behandlung einer metastatischen Neoplasie in einem Säuger bereit, welche Zusammensetzung eine Nukleinsäure in einer Lipid-Formulierung und einen pharmazeutisch geeigneten Träger umfasst. In einer derzeit bevorzugten Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung außerdem eine Prodrug in einer Lipid-Formulierung.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Kit für die Behandlung einer metastatischen Neoplasie in einem Säuger bereit, welcher Kit umfasst: a) eine Nukleinsäure in einer Lipid-Formulierung; und b) eine Prodrug in einer Lipid-Formulierung.
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung Methoden für die Präparierung Lipidformulierter Nukleinsäuren (z.B. Vektoren und Enzyme) und Prodrugs bereit, die in der Ausführung der Methoden der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
Weitere Merkmale, Ziele und Vorteile der Erfindung und ihrer bevorzugten Ausführungsformen werden aus der ausführlichen Beschreibung, die folgt, erkennbar werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 veranschaulicht die Beziehung der Citrat-Konzentration in dem Dialysepuffer und der mol-% DODAC in dem Lipid für die Herstellung von Lipid-Plasmid-Partikeln. Die festen Punkte stehen für Formulierungen einer guten Qualität mit hohen Assoziationsleistungen (> 40 %), kleiner Größe (< 100 nm) und niedrigen Werten der Größenpolydispersität (Chi-Quadrat weniger als 10, vorzugsweise weniger als 3) auf einem NICOMP Particle Sizer. Die Kreuze stehen für Formulierungen, die Aggregate mit großen Polydispersitätswerten enthalten; und die leeren Kreise stehen für Formu lierungen mit geringen Assoziationsleistungen (< 40 %). Eine korrekte Einstellung der Citratpuffer-Konzentration zu der kationischen Lipid-Ladung scheint die Formulierung zu verbessern. Alternative anionische Puffer können ebenfalls verwendet werden, wenn die Gegenionen das kationische Lipid am Aggregieren während des Entfernungsschritts des Detergenz hindern können.
2 zeigt die Bioverteilung von 303i in verschiedenen Organen (d.h. Blut, Milz und Leber) in C57-Lewis-Lung-Mäusen.
3 zeigt die Ansammlung von 303i an der Tumorstelle in C57-Lewis-Lung-Mäusen.
4 zeigt einen Zeitverlauf der Genprodukt-Aktivität an distalen (metastatischen) Tumorstellen.
5 zeigt die Genexpression in LS180-Tumoren (Dosiswirkung von 303i nach 48 Stunden).
6(A und 6(B) zeigen das Muster der HSV-TK-Genexpression innerhalb peritonealer Tumoren.
7 veranschaulicht das pINEX-TK10-Konstrukt, welches aus einem von pBR322 abgeleiteten Plasmid besteht, das einen CMV-Promotor, geknüpft an ein "Hyper"-HSV-TK-Gen, eine Rinder-Wachstumshormon-Polyadenylierungssequenz und ein Kanamycin-Resistenzgen enthält.
8(A) zeigt in vivo-Wirksamkeitsstudien unter Verwendung eines Tumormodells.
8(B) zeigt ein 16-Tage-Behandlungsregime an Testmäusen nach der Tumorinokulation.
9(A) zeigt das in vivo-Genexpressions-Protokoll.
9(B) zeigt eine Auswertung des Tumorwachstums, wobei die leere Formulierung das größte Tumorvolumen ergibt.
9(C) zeigt die Wirksamkeit des Suizidgens SPLP dieser Erfindung.
10 zeigt das langfristige Überleben nach der Behandlung mit dem Suizidgen SPLP (d.h. Formulierung 1.1 oder alternativ INEX 303 oder 303i) dieser Erfindung.
11 zeigt die Wirksamkeit der systemischen Verabreichung von TK303 in dem BALG/c CT26-Tumormodell, d.h. einem kolorektalen Tumormodell.
12 zeigt die Wirkung des TK FS-(Frameshift)-Konstrukts, das kein aktives TK-Polypeptid exprimiert, und des TK-Konstrukts auf das Tumorvolumen.
DEFINITIONEN
"Sensibilisieren", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Fähigkeit, die Empfindlichkeit eines bezeichneten Systems, wie etwa einer Zelle, zu erhöhen. Dieser Begriff umfasst das Verändern einer Zelle, um sie ansprechbar oder mehr ansprechbar auf eine Verbindung zu machen, auf die sie zuvor nicht ansprechbar oder empfindlich war oder weniger empfindlich war. Sensibilisieren und "empfindlicher" umfasst auch Veränderungen an einer Zelle, so dass die Exposition an eine zuvor nicht-abtötende Substanz zu Zelltod führt.
"Nukleinsäure-Vektor" oder "Vektor", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Zusammensetzung, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Genprodukt kodiert. Dies ist üblicherweise ein Plasmid oder virales Genom, kann aber auch andere Zusammensetzungen umfassen, wie etwa lineare Nukleinsäuren, Protein/Nukleinsäure-Konjugate etc. In Abhängigkeit von der Anwendung kann Vektor sich auch auf eine Nukleinsäure beziehen, die in ein Virus-verkapseltes oder Protein-beschichtetes Format übertragen wird, wobei die gesamte Zusammensetzung als ein Vektor bekannt ist.
"Neoplasie", wie hierin verwendet, bezieht sich auf jegliches abweichende Wachstum von Zellen, Tumoren, malignen Effusionen, Warzen, Polypen, nicht-festen Tumoren, Zysten und anderen Wucherungen. Eine Stelle von Neoplasie kann eine Vielfalt von Zelltypen enthalten, einschließlich neoplastischer Zellen, die zerstörerische genetische Mutationen beherbergen, normale Zellen, die durch Neoplasie induziert sind, wie etwa vaskuläres Endothel, oder Immunsystem-Zellen, wie etwa Makrophagen und Leukozyten etc..
"Therapeutisch wirksame Menge", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Menge, die ausreichend oder erforderlich ist, um eine gewünschte therapeutische Wirkung entstehen zu lassen. Die therapeutische Wirkung kann direkt oder indirekt erhalten werden. Zum Beispiel kann das therapeutische Agens zu einer Aktivierung anderer therapeutischer Agenzien führen oder kann in Kombination mit zusätzlichen therapeutischen Agenzien wirken. Für eine Neoplasie kann eine therapeutische Wirkung zum Beispiel eine Verminderung im Wachstum, Hemmung oder Verminderung der Größe der Neoplasie oder Hemmung oder Verminderung von Metastasen und anderen malignen Attributen, oder anderen günstigen Wirkungen, wie etwa subjektive oder objektive Beobachtungen der Ärzte und Patienten, sein.
"Genprodukt", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Produkt eines Gens, wie etwa ein RNA-Transkript. Das RNA-Transkript kann aus sich selbst heraus therapeutisch sein, wie im Falle von Antisens- oder Ribozym-Transkriptionsplasmiden, oder das RNA-Transkript kann in ein Polypeptid translatiert sein, das ebenfalls ein Genprodukt ist.
"Distale Stelle", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine physisch getrennte Stelle, was nicht auf ein angrenzendes Kapillarbett beschränkt ist, sondern Stellen umfasst, die über einen gesamten Organismus breit verteilt sind.
"Serum-stabil" in Bezug auf Lipid/therapeutische Nukleinsäure-Partikel bedeutet, dass das Partikel nach Exposition an einen Serum- oder Nuklease-Assay, der freie DNA signifikant abbauen würde, nicht signifikant abgebaut wird. Zu geeigneten As says zählen zum Beispiel ein standardmäßiger Serum-Assay oder ein DNAse-Assay, wie etwa die, die in dem Abschnitt der Beispiele beschrieben sind.
"Systemische Verabreichung", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Verabreichung, die zu einer breiten Bioverteilung einer Verbindung innerhalb eines Organismus führt. Einige Techniken der Verabreichung können zu einer systemischen Verabreichung bestimmter Verbindungen führen, andere dagegen nicht. Systemische Verabreichung bedeutet, dass eine nützliche, vorzugsweise therapeutische, Menge einer Verbindung den meisten Teilen des Körpers ausgesetzt wird. Um eine breite Bioverteilung zu erreichen, ist allgemein eine Blutlebensdauer erforderlich, so dass die Verbindung nicht schnell abgebaut oder ausgeschieden wird (wie etwa die durch Erstpassage-Organe (Leber, Lunge etc.) oder durch eine schnelle, nicht-spezifische Zellbindung), bevor sie eine Erkrankungsstelle distal zu der Stelle der Verabreichung erreicht. Eine systemische Verabreichung von Lipid/therapeutischen Nukleinsäure-Partikeln wird vorzugsweise durch intravenöse Verabreichung erzielt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG UND BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung stellt Methoden und Zusammensetzungen bereit, die zur Behandlung einer Neoplasie mit einer therapeutischen Nukleinsäure, vorzugsweise einem Plasmid, die für ein exprimierbares Gen kodiert, geeignet sind, wobei die therapeutische Nukleinsäure in ein Lipidpartikel eingekapselt ist und intravenös an eine Stelle verabreicht wird, die physisch getrennt ist von der Stelle der metastatischen Neoplasie und an die Stelle der Neoplasie durch systemische Verabreichung transportiert wird.
Die Erfindung zieht Nutzen aus Lipid-Nukleinsäure-Partikeln, wobei die Nukleinsäure vollständig eingekapselt und vor einem Abbau durch Nuklease geschützt ist und wobei die Partikel einen kleinen Durchmesser (50-200 nm) aufweisen und weitere Attribute besitzen, die für die systemische Verabreichung geeignet sind.
Im Allgemeinen wird die Therapie eines Patienten unter Anwendung der Erfindung wie folgt erreicht. Zunächst werden die Partikel unter Verwendung von Lipiden und einer therapeutischen Nukleinsäure präpariert. Daraufhin werden die Partikel einem Säuger mit einer metastatischen Neoplasie durch intravenöse Injektion an einer Stelle verabreicht, die physisch getrennt ist von der Stelle der Neoplasie. Die Partikel werden an die Stelle der Neoplasie durch das Blut, Lymphe oder andere interne Körperflüssigkeit übertragen. Eine therapeutisch wirksame Menge der Partikel sammelt sich an der Stelle der Neoplasie an und wird durch die Zellen an der Stelle aufgenommen. Therapeutische Wirkungen werden an der Stelle der Neoplasie generell durch die Transkription der Nukleinsäure erzielt, was entweder zu einem therapeutischen Transkriptionsprodukt (d.h. einem Ribozym oder Antisense-Oligonukleotid oder einer anderen RNA) oder zu einer mRNA führt, die in ein therapeutisches Polypeptid translatiert wird.
Der Nutzen der systemischen Gentherapie gegen Tumoren unter Verwendung von Lipid-therapeutischen Nukleinsäure-Partikeln umfasst, ohne darauf beschränkt zu sein, die folgenden Vorteile.
Erstens sind Nukleinsäuren im Vergleich zu anderen verwendeten chemotherapeutischen Agenzien typischerweise nicht-toxisch. Zweitens zeigen die Lipid-Trägersysteme der vorliegenden Erfindung eine präferenzielle Ansammlung an vielen Tumorstellen. Dieses Phänomen hängt zum Teil von der "Undichtigkeit" der Neovaskulatur des Tumors ab. Dieses präferenzielle "passive" Anzielen kann durch Zielagenzien verstärkt werden, die an die äußere Lipid-Monoschicht gebunden sind, wie etwa FGF, welches die Lokalisierung der Lipidpartikel an der Tumorstelle erhöht (siehe z.B. Forum, et al., "Liposome Targeting in Animal Models," L. Huang (Hrsg.), Journal of Liposome Research, 7(4):315-534 (1997)). Drittens liefern therapeutische Nukleinsäuren potenziell wirksamere Therapeutika als herkömmliche Arzneimittel, da sie zur Replikation an der Stelle der Erkrankung fähig sind. Die generierten vielen Kopien der Transkripte oder Genprodukte reduzieren die Gesamtzahl der aktiven Agenzien, die den Zellen dargereicht werden muss. Weiterhin können therapeutische Nukleinsäuren innerhalb der Zielzellen Polypeptide generieren, die ansonsten zu teuer in der Herstellung oder zu schwer verabreichbar sein könnten. Viertens können therapeuti sche Nukleinsäuren, indem sie zur Synthese von Polypeptiden innerhalb der erkrankten Zelle führen, zur Übertragung von Polypeptiden an Stellen innerhalb der erkrankten Zelle verwendet werden, an die das Polypeptid auf exogenen Wegen nicht übertragen werden könnte. Schließlich können therapeutische Nukleinsäuren aufgrund ihrer geringen Toxizität geeignete Kandidaten für eine Kombinationstherapie mit anderen chemotherapeutischen Agenzien darstellen. Ein geeigneter Ansatz einer Kombinationstherapie ist beschrieben in der vorläufigen US-Patentanmeldung der laufenden Nr. 60/082,665 (TTC Anwaltsaktenzeichen Nr. 16303-007100), die demselben Antragsteller der vorliegenden Erfindung erteilt ist.
Bis heute sind mehrere Ansätze für die Einführung von Nukleinsäuren in Zellen in vivo verfolgt worden. Zu diesen zählen der Liposomen-basierte Gentransfer, die intratracheale Instillation, der aerosolierte Gentransfer oder die Direktinjektion. Zum Beispiel beschreiben Debs und Zhu WO 93/12240 , Debs WO 92/1108 und Debs US-Patent Nr. 5,641,662 alle den aerosolierten Gentransfer von Lipid-DNA-Komplexen an Säuger. Ähnlich beschreiben Stribling, et al., PNAS, 89:11277-11281 (1992) die Lipid-Verabreichung an Mäuse. McLachlan, et al., Gene Therapy, 2:614-622 (1995) beschreiben die DOTAP-vermittelte Lipid-Verabreichung von hCFTR an Mäuse. Canonico, et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 10:24-29 (1994), und Canonico, et al., The American Physiological Society, 415-419 (1994) beschreiben den Lipofektinvermittelten Gentransfer von ha1AT in Kaninchen durch aerosolierten Gentransfer. Alton, et al., Nature Genetics, 5:135-142 (1993) beschreiben den DC-Chol/DOPE-DOTAP-vermittelten Transfer von hCFTR und a-gal durch Aerosol- oder Trachial-Instillation in Mäuse. Capelen, et al., Nature Medicine, 1(1):39 (1995) beschreiben die Verabreichung von CFTR an das Nasenepithel von Menschen unter Anwendung einer DC-Chol/DOPE-vermittelten Verfahrensweise, ebenso wie McLachlan, et al., Gene Ther., 3(12): 1113-23 (1996). Eine Vielzahl von Berichten zur Verabreichung von Lipid-DNA-Komplexen durch parenterale Verabreichung sind ebenfalls erfolgt, einschließlich Brigham WO 91/06309 , US-Patent Nr. 5,676,954 , und Debs und Zhu WO 93/24640 . Demgemäß ist eine Vielfalt von Verfahrensweisen zur Transduzierung von Zellen in vivo unter Anwendung Lipid-vermittelter Techniken bekannt. Diese Verfahren sind jedoch nicht als nützlich für die systemische Verabreichung nachgewie sen worden. Einzelheiten zu den bevorzugten Formulierungen der vorliegenden Erfindung sind nachstehend angegeben.
A. Therapeutische Nukleinsäuren
Die Zusammensetzungen und Methoden der vorliegenden Erfindung sind zur Verabreichung einer breiten Vielfalt von therapeutischen Nukleinsäuren nützlich. Diese Nukleinsäuren können für therapeutische Polypeptide (d.h. jegliches therapeutische Genprodukt) oder therapeutische Polynukleotide (d.h. Antisense- oder Ribozym-Transkriptionsplasmide) kodieren. Die therapeutischen Nukleinsäuren der Erfindung können exprimierbare Gene sein, wie etwa die soeben beschriebenen, oder sie können Nukleinsäuren sein, die aus sich selbst heraus irgendeine Form von Reaktion induzieren, möglicherweise durch Stimulierung des Immunsystems.

Zur Anwendung mit der vorliegenden Erfindung sind die bevorzugtesten therapeutischen Nukleinsäuren solche, die in der Gene-delivered Enzyme Prodrug Therapy ("GDEPT") nützlich sind. Jegliche Suizidgen/Prodrug-Kombination kann gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Mehrere Suizidgen/Prodrug-Kombinationen, die zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind zitiert bei Sikora, K. in OECD Documents, Gene Delivery Systems auf S. 59-71 (1996), was hierin durch Bezugnahme mit aufgenommen ist, einschließlich, doch nicht beschränkt auf die folgenden:

Suizidgen-Produkt	Wenig aktive Prodrug	Aktivierter Wirkstoff
Herpes simplex-Virus Typ	Ganciclovir(GCV), Acy-	Phosphorylierte dGTP-
1-Thymidinkinase (HSV-	clovir, Bromvinyldesoxyu	Analoga
TK)	ridin oder andere Substrate
Cytosindeaminase (CD)	5-Fluorzytosin	5-Fluoruracil
Xanthin-Guanin-	6-Thioxanthin (6TX)	6-
Phosphoribosyltransferase		Thioguanosinmo
(XGPRT)-		nophosphat
Purinnukleosidphosphory	MeP-dr	6-Methylpurin
lase
Cytochrom P450 2B1	Cyclophosphamid	[zytotoxische Metaboliten]
Linamarase	Amygdalin	Cyanid
Nitroreduktase	CB 1954	Nitrobenzamidin
Beta-Laktamase	PD	PD Mustard
Beta-Glucuronidase	Adria-Glu	Adriamycin
Carboxypeptidase	MTX-Alanin	MTX
Glukoseoxidase	Glukose	Peroxid
Penicillinamidase	Adria-PA	Adriamycin
Superoxiddismutase	XRT	DNA-schädigendes Agens
Ribonuklease	RNA	Spaltprodukte

Jede beliebige Prodrug kann verwendet werden, wenn sie durch das heterologe Genprodukt zu einer Verbindung metabolisierbar ist, für das die Zelle empfindlicher ist. Vorzugsweise sind Zellen wenigstens 10-mal empfindlicher für den Metaboliten als die Prodrug.
Modifikationen des GDEPT-Systems, die mit der Erfindung nützlich sein können, umfassen zum Beispiel die Verwendung eines modifzierten TK-Enzym-Konstrukts, worin das TK-Gen mutiert worden ist, um eine schnellere Umwandlung der Prodrug zum Wirkstoff zu erreichen (siehe zum Beispiel Black, et al., PNAS (USA), 93:3525-3529 (1996)). Alternativ kann das TK-Gen in einem bizistronischen Konstrukt mit einem anderen Gen verabreicht werden, das seine Wirkung verstärkt. Um zum Beispiel den "Bystander-Effekt", auch bekannt als "Nachbareffekt" (wobei die Zellen in der Umgebung der transfizierten Zelle ebenfalls abgetötet werden), zu verstärken, kann das TK-Gen mit einem Gen für ein Gap-Junction-Protein, wie etwa Connexin 43, verabreicht werden. Das Connexin-Protein erlaubt die Diffusion der toxischen Produkte des TK-Enzyms von einer Zelle in eine andere. Das TK/Connexin 43-Konstrukt weist einen CMV-Promotor auf, der an ein TK-Gen durch eine interne Ribosomeneingangssequenz und eine Connexin 43-kodierende Nukleinsäure operativ geknüpft ist.
Im zweiten Schritt wird die Prodrug an die Zellen verabreicht. Die Prodrug kann der freie Wirkstoff sein oder kann alternativ in einer Lipid-Formulierung vorliegen. Die Verwendung von Lipid-Formulierungen in dem GDEPT-System weist viele überraschende und zuvor unentdeckte Vorteile gegenüber der Verabreichung des freien Wirkstoffs auf, einschließlich, doch nicht beschränkt auf eine verbesserte Anzielung auf die durch den Vektor transfizierte Erkrankungsstelle, eine verlängerte Halbwertszeit im Kreislauf, eine erhöhte Wirkstoffbeladung, eine verminderte Toxizität gegenüber Nicht-Zielgeweben, verbesserte Behandlungsmodalitäten, wie etwa eine einzelne Bolusinjektion gegenüber dem IV-Tropf und ähnliche. Diese Vorteile überwinden die Einschränkungen der zuvor bekannten GDEPT-Systeme. Weiterhin wird die liposomale Formulierung der Prodrug einer Lipid-Vektor-Formulierung vorzugsweise eine ähnliche Bioverteilung verleihen, wobei sowohl der Vektor als auch die Prodrug an der Erkrankungsstelle konzentriert werden.
Üblicherweise wird der Vektor an die Zielzelle vorab zu der Prodrug verabreicht, um die Synthese des Suizidgen-Produkts vor der Ankunft der Prodrug zu ermöglichen. Eine temporäre Trennung kann entweder durch separate Verabreichung des Vektors und der Prodrug, oder alternativ durch gleichzeitige Bereitstellung der Formulierungen, wobei sich die Vektor-Formulierung an der Zielstelle schnell ansammelt und den Vektor abgibt, und sich die Prodrug-Formulierung langsamer ansammelt und ihre Ladung abgibt, erreicht werden. Unter Anwendung der Zusammensetzungen und Methoden der Erfindung wird der Vektor als solcher an die Zelle durch direkte Synthese des Suizidgen-Produkts verabreicht, wobei die Zelle sensibilisiert wird und die Prodrug an die Zelle abgegeben wird und so eine Therapie des Patienten, z.B. Re duktion der Tumorgröße, Entzündung oder infektiösen Ladung und ähnliches, erreicht wird.
Über die GDEPT-Systeme hinaus besteht eine sehr breite Vielfalt von therapeutischen Nukleinsäuren, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Die Nukleinsäuren können human, nicht-human (d.h. von irgendeiner anderen Pflanze, Tier oder Mikroorganismus) oder gänzlich synthetisch (d.h. nicht-natürlich vorkommend) sein. Die Nukleinsäuren können für die Zellen des Patienten endogen sein, oder können exogen sein, was bedeutet, dass die Nukleinsäure normalerweise nicht in den Zellen der Patienten zu finden ist. Da die Behandlung einer Neoplasie nicht notwendigerweise eine langfristige oder stabile Expression der verabreichten Nukleinsäure erfordert, sind auch Gene, die in transienten Expressionssystemen wirksam sind, wie etwa Toxine oder immunstimulatorische Proteine, bei den Methoden der vorliegenden Erfindung nützlich.
Ist die therapeutische Nukleinsäure eine solche, die dem Patienten endogen ist, so kann eine modifizierte Sequenz, eine erhöhte Kopienzahl, oder ein Konstrukt, das eine erhöhte transkriptionelle Aktivität relativ zu dem nativen Gen aufweist, verabreicht werden. Das Genprodukt kann direkt toxisch oder indirekt toxisch sein, oder es kann eine Apoptose oder Zelldifferenzierung induzieren. In dem bevorzugtesten System wird das Genprodukt des therapeutischen Gens eine geringe Toxizität für Nicht-Zielgewebe, und eine hohe Toxizität für die Erkrankungsstelle, zeigen. Wenn beispielsweise in den bevorzugten Lipid-Nukleinsäure-Partikeln der Erfindung verabreicht, weist das Genprodukt vorzugsweise eine größere Toxizität für Tumorzellen als für Leber- oder Milzzellen auf, wobei ein großer Anteil der Partikel normalerweise ausgeschieden wird. Die Spezifität für die Erkrankungsstelle kann auch unter Verwendung von Gewebe/Erkrankungs-spezifischen Promotoren für die Gentranskription oder -translation erhöht werden. Gewebe-spezifische Promotoren, und Methoden, um sie mit den therapeutischen Nukleinsäuren zu assoziieren, sind den Fachleuten des Gebiets bekannt.
Zu bevorzugten endogenen Genen, die zur Verwendung bei den Methoden dieser Erfindung geeignet sind, zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, pro-apoptotische Gene; Poreifirin; Tumorsupressorgene (p53 und ähnliche); Zytokine (IL-2, IL-12, IL-15, GM-CSF etc); Hitzeschockproteine; immundominantes Ag (oder Tumorspezifische Proteingene); Gene, die nur in Embryonen aktiviert sind; TIMP-2 (Gewebeinhibitor von Metalloproteinase-2) und weitere Metastase-hemmende Proteine; Ersetzungsgene, wie etwa CFTR, DMD; LDL-R und ähnliche; und anti-angiogene Gene, wie etwa Endostation oder Angiostatin (siehe WO 97/15666 ; WO 95/29242 ; Boehm, et al., Nature, 309:404-407 (1997); und Kerbel, et al., Nature, 309:335 (1997)). IL-12 ist ein bevorzugtes endogenes Gen, das als eine therapeutische Nukleinsäure bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann (siehe Tahara, H. und Lotze, M.T., Gene Ther., 2:96-106 (1995)). Ein geeignetes IL-12-Plasmid-Konstrukt für den Transfer ist pNGVL3-mIL12, wie bereitgestellt durch die National Gene Therapy Vector Laborstory an der University of Michigan (Ann Arbor, Michigan).
Exogene Gene, die in den Zellen der Patienten natürlicherweise nicht zu finden sind, können vorteilhaft sein, da ihre Genprodukte auch zur Induzierung einer Immunantwort dienen können. Zum Beispiel können Gene, die in einem Suizidgen-Prodrug-System verwendet werden, diese Wirkung zeigen.
Zu bevorzugten exogenen Genen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Gene, die in GDEPT-Kombinationen (Behandlung in Verbindung mit Prodrugs) verwendet werden; Ribozyme oder Transkriptionsplasmide, die für Ribozyme oder Antisense-Transkripte kodieren; Toxin-Gene, wie etwa Saporin, Ricin, Diphterietoxin und Choleratoxin (oder irgendwelche anderen Pflanzen-, Bakterien- oder Pilzgene), virale Proteingene, wie etwa E1A; mutiertes E6; SV40 Tag etc. Weitere exogene Gene, die zur Verwendung bei den Methoden der vorliegenden Erfindung geeignet sind, werden für Fachleute des Gebiets ohne weiteres erkennbar sein.
Methoden zur Konstruktierung von Plasmiden oder anderen Vektoren, die die hierin beschriebenen therapeutischen Nukleinsäuren tragen, sind den Fachleuten des Gebiets wohl bekannt (siehe z.B. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, et al. (Hrsg.) 1995). Die therapeutische Aktivität kann durch das Hinzufügen von Transkriptions- oder Translationspromotoren und anderen Nukleinsäureele menten erhöht werden, die ebenfalls allesamt den Fachleuten des Gebiets bekannt sind.
Lipid-Nukleinsäure- und die Lipid-Prodrug-Formulierungen können mittels jeglicher bekannten Methode erhalten werden. Die bevorzugten Methoden führen zu einer hoch effizienten Verkapselung, wodurch Verschwendung und Kosten für die Formulierung reduziert werden. Lipid-Nukleinsäure- und die Lipid-Prodrug-Formulierungen können unter Anwendung standardmäßiger Gefrier-Auftau- und Extrusionstechniken synthetisiert werden, wie beschrieben bei Hope, et al., Biochim. Biophys. Acta, 812:55-65 (1985). Außerdem sind weitere Wirkstoffbeladungs- und Verkapselungstechniken, die angewendet werden können, beschrieben in US-Patentanmeldungen der laufenden Nrn. 08/399,692 , 08/607,614 , 08/588,542 , 08/741,622 . Die Dimensionierung der Lipid-Formulierungen kann unter Verwendung von Extrudern, Druckzellen und anderen Geräten, die den Fachleuten des Gebiets bekannt sind, erreicht werden.
Die möglichen Lipid-Komponenten für die Lipid-Nukleinsäure- und Lipid-Prodrug-Formulierungen der Erfindung umfassen solche Komponenten, wie sie typischerweise im Fachgebiet verwendet werden. Zum Beispiel können Sphingosome, die beschrieben sind in US-Patent Nr. 5,543,152 und US-Patentanmeldungen der laufenden Nrn. 08/536,584 , 08/316,399 , 08/485,608 , 08/442,267 , in den Formulierungen verwendet werden.
B. Herstellung der Lipid/therapeutischen Nukleinsäure-Partikel
Die Lipid-Nukleinsäure-Formulierungen können unter Anwendung jeglicher Methode nach dem Stand der Technik erhalten werden. Die bevorzugten Methoden für die systemische (d.h. intravenöse oder andere parenterale) Verabreichung führen zu einer hoch effizienten Verkapselung, worin weniges der Nukleinsäure einer freien Lösung ausgesetzt oder an der äußeren Oberfläche der Lipidpartikel adsorbiert wird. Solche Methoden sind beschrieben in der veröffentlichten PCT Patentanmeldung WO 96/40964 , US-Patent Nr. 5,705,385 und US-Patentanmeldungen der laufenden Nrn. 08/485,458 , 08/484,282 , 08/660,025 , 08/856,374 , 60/073,598 und 60/063,473 , die alle demselben Antragsteller der vorliegenden Erfindung erteilt sind. Generell bietet eine hoch wirksame Verkapselung eine geringe Immunogenität und verbesserte Toleranz, wenn für die systemische Verabreichung injiziert. Ferner sind die Lipid-Nukleinsäure-Partikel relativ leicht zu charakterisieren und zu definieren im Vergleich zu kationischen Lipid-Plasmid-Aggregaten, wie sie bei lokalen Verabreichungsmethoden verwendet werden.
Die bevorzugten Verkapselungsmethoden sind in dem Abschnitt der Beispiele dargestellt. Die mittels dieser Methoden erhaltenen Lipid-therapeutischen Nukleinsäure-Partikel weisen identifizierbare Charakteristika auf, die sie zur Verwendung bei der Erfindung geeignet machen. Zum Beispiel sind sie Partikel einer kleinen Größe, die typischerweise im Mittel etwa 50 bis etwa 200 nm beträgt, und vorzugsweise etwa 60 bis etwa 130 nm. Am bevorzugtesten sind die Partikel von einer relativ gleichmäßigen Größe und weisen einen x²-(Chi-Quadrat)-Wert von weniger als etwa 3, bevorzugter weniger als etwa 1, und am bevorzugtesten weniger als etwa 0,5, auf.
Darüber hinaus sind die Lipid-therapeutischen Nukleinsäure-Partikel der vorliegenden Erfindung Serum-stabil und werden daher nach Exposition an einen Serum- oder Nuklease-Assay, der freie DNA signifikant abbauen würde, nicht signifikant abgebaut. Zu geeigneten Assays für die Messung der Serumstabilität zählen ein standardmäßiger Serum-Assay oder ein DNAse-Assay (die im Abschnitt der Beispiele beschrieben sind). Die Nukleaseresistenz/Serumstabilität stellt ein Maß der Fähigkeit der Formulierung dar, die therapeutische Nukleinsäure vor einem Nuklease-Verdau entweder in einem in vitro-Assay oder im Kreislauf zu schützen. Die verkapselten Partikel der vorliegenden Erfindung weisen eine größere Nukleaseresistenz und Serumstabilität als Lipid-Plasmid-Aggregate (auch bekannt als kationische Komplexe), wie etwa DOT-MA/DOPE-(LIPOFECTIN^TM)-Formulierungen, auf.
Außerdem weisen die Lipid-therapeutische Nukleinsäure-Partikel der vorliegenden Erfindung ein Verhältnis von Nukleinsäure zu Lipid auf, das bei verschiedenen Höhen formuliert werden kann. Zur Verwendung bei den Methoden dieser Erfindung weisen die Partikel ein Verhältnis von Wirkstoff zu Lipid von wenigstens etwa 3 mg Nukleinsäure pro mmol Lipid auf, bevorzugter von wenigstens etwa 14 mg Nuklein säure pro mmol Lipid, und sogar noch bevorzugter von größer als etwa 25 mg Nukleinsäure pro mmol Lipid. Die bevorzugten Partikeln, wenn zu einer Fertigformulierung für die Verabreichung verarbeitet, betragen etwa 60-80 mg Nukleinsäure pro mmol Lipid (d.h. sie sind Formulierungen mit hohem Verhältnis). Die zur Herstellung von Formulierungen mit hohem Verhältnis angewendete Methode kann auch unter Verwendung von reduzierten Mengen der DNA zum Erhalt von Formulierungen mit geringerem Verhältnis angewendet werden. Wie hierin verwendet, bezieht sich das "Wirkstoff zu Lipid-Verhältnis" auf die Menge an therapeutischer Nukleinsäure (d.h. die Menge an Nukleinsäure, die verkapselt wird und die auf Exposition an das Blut hin nicht schnell abgebaut wird) in einem definierten Volumen des Präparats, geteilt durch die Menge an Lipid in demselben Volumen. Dies kann auf einer Mol-zu-Mol-Basis, auf einer Gewichts-zu-Gewichts-Basis oder auf einer Gewichts-zu-Mol-Basis bestimmt werden. Für Fertigformulierungen für die schließliche Verabreichung wird das Wirkstoff-zu-Lipid-Verhältnis nach der Dialyse berechnet, wobei die Chromatographie und/oder der Nuklease-Verdau zur Entfernung von möglichst viel des extern assoziierten therapeutischen Agens angewendet worden sind. Das Wirkstoff-zu-Lipid-Verhältnis stellt ein Maß der Potenz der Formulierung dar, obschon das höchstmögliche Wirkstoff-zu-Lipid-Verhältnis nicht immer die potenteste Formulierung ist.
Eine alternative Beschreibung der Lipid-Nukleinsäure-Partikel der vorliegenden Erfindung ist "hoch effiziente" Formulierungen, wobei der daran beteiligte aktive Ladeprozess betont wird und dies im Kontrast zu geringer Effizienz oder passiver Verkapselung steht. Die passive Verkapselung von Nukleinsäure in Lipidpartikel, die im Fachgebiet bekannt ist, erzielt eine Verkapselung von weniger als 15 % des therapeutischen Agens und ergibt Partikel mit einem geringen Verhältnis von weniger als 3 mg Nukleinsäure pro mmol Lipid. Die bevorzugten Lipid/therapeutischen Nukleinsäure-Partikel der vorliegenden Erfindung weisen eine Verkapselungseffizienz von größer als etwa 30 % auf. Wie hierin verwendet, bezieht sich "Verkapselungseffizienz" auf die absolute Effizienz, d.h. die Gesamtmenge an dem Ausgangsgemisch zugegebener DNA, die zur Verabreichung einer kompetenten Formulierung führt. Manchmal wird die relative Effizienz berechnet, wobei das Wirkstoff-zu-Lipid-Verhältnis des Ausgangsgemischs durch das Wirkstoff-zu-Lipid-Verhältnis der fertigen Verabreichungs-kompetenten Formulierung geteilt wird. Die Menge an Lipid, die während des Formulierungsprozesses verloren geht, kann berechnet werden. Effizienz stellt ein Maß der Verschwendung und Kosten der Formulierung dar.
Weitere nutzbringende Merkmale, die aus der Verwendung der bevorzugten Partikel der vorliegenden Erfindung erwachsen, wie etwa die geringe nicht-spezifische Toxizität, verbesserte Bioverteilung, therapeutische Wirksamkeit und einfache Herstellbarkeit, werden den Fachleuten des Gebiets ersichtlich sein. Es ist möglich, wie oben beschriebene Partikel mittels alternativer Methoden der Verkapselung zu entwickeln. Diese Methoden können standardmäßige Techniken zur Beladung der Liposome anwenden, die zur Verwendung mit herkömmlichen Wirkstoffen wohl bekannt sind. Zu diesen Methoden zählen die Gefrier-Auftau-Extrusion, Dehydratation/Rehydratation, Umkehrphasen-Evaporation und ähnliche, von denen einige beschrieben sind bei Monnard, et al., "Entrapment of nucleic acids in liposomes," Biochim. Biophys. Acta., 1329:39-50 (1997). Diese Methoden beziehen sich nicht auf Formulierungen mit hoher Verkapselungseffizienz, noch auf Formulierungen mit hohen Verhältnissen, sondern vielmehr schlägt die vorliegende Offenbarung die Nutzung solcher Partikel zur Verwendung in der Gentherapie gegen distale Tumorstellen vor.
Über die bei den obigen Methoden verwendeten Lipide hinaus gibt es eine enorme Anzahl zusätzlicher Lipid- und Nicht-Lipid-Komponenten, die zur Verbesserung der Verabreichung oder des Anzielens der Partikel verwendet werden können. Zu zusätzlichen Lipid-Komponenten zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Lipide mit neutralen, anionischen, kationischen oder zwitterionischen Kopfgruppen, und ähnliche. Diese standardmäßigen Komponenten sind im Fachgebiet und in den oben genannten Patentanmeldungen angegeben, die hierin durch Bezugnahme mit aufgenommen sind. Geladene Lipide, die mit der Erfindung besonders bevorzugt sind, sind N,N-Dioleyl-N,N-dimethylammoniumchlorid (DODAC), der Gegenstand des vor kurzem erteilten US-Patents Nr. 5,753,613 , das hierin durch Bezugnahme mit aufgenommen ist und demselben Antragsteller der vorliegenden Erfindung erteilt ist; und 1,2-Dioleoyl-3-dimethylammoniumpropan (DODAP), das Gegenstand der US-Patentanmeldung der laufenden Nr. 08/856,374 ist, deren Lehren hierin durch Bezugnahme mit aufgenommen sind.
Sowohl die Nukleinsäure- als auch die Prodrug-Formulierungen können weitere Komponenten enthalten, ausgewählt aus einer breiten Vielfalt von Lipiden, Lipid-Konjugaten und im Fachgebiet bekannten kompatiblen zusätzlichen Komponenten. Zum Beispiel können Cholesterol und seine Derivate in den Nukleinsäure- und Prodrug-Formulierungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Noch weitere Formulierungen können polykationische Verbindungen verwenden, die DNA zu kleinen Größen vor der Lipid-Verkapselung kondensieren können. Polylysin und Polyethylenimin sind, unter anderen Verbindungen, durch Fachleute des Gebiets in dieser Eigenschaft verwendet worden. Kondensierte Partikel können auch bei den Methoden dieser Erfindung verwendet werden.
Außerdem können Umhüllungsmittel (cloaking agents) verwendet werden, um die Eliminierung durch das Immunsystem des Wirts zu vermindern. Zu solchen Umhüllungsmitteln zählen beispielsweise Polyamidoligomer-Lipid-Konjugate, wie etwa ATTA-Lipide, wie beschrieben in US-Patentanmeldung der laufenden Nr. 08/996,783 , eingereicht am 2. Februar 1998 (TTC Anwaltsaktenzeichen Nr. 16303-005800) und PEG-Lipid-Konjugate, wie beschrieben in US-Patentanmeldung der laufenden Nm. 08/486,214 , 08/316,407 und 08/485,608 , deren Lehren hierin durch Bezugnahme mit aufgenommen sind. Diese Komponenten können auch Zielagenzien sein, die die Lipid-Formulierungen darin fördern, sich an der Fläche der Erkrankung oder der Zielstelle anzusammeln. Außerdem können diese Komponenten Verbindungen sein, die die Merkmale der Formulierung verbessern, wie etwa Undichtigkeit, Langlebigkeit im Kreislauf, Verminderung der Toxizität, Einkapselungsleistung etc. Beispiele dieser Komponenten und anderer, die nutzbringend in die Formulierungen der Erfindung aufgenommen werden können, sind den Fachleuten des Gebiets bekannt und werden durch sie verwendet.
Bezüglich sowohl der Nukleinsäure als auch der Prodrug-Lipid-Formulierungen ist es manchmal bevorzugt, eine programmierbare fusogene Lipid-Formulierung zu verwenden. Dies bezieht sich auf eine Formulierung, die eine geringe Neigung zur Fusionierung mit Zellmembranen und Abgabe ihrer Ladung aufweist, bis ein gegebenes Signalereignis aufgetreten ist. Dies erlaubt der Lipid-Formulierung eine gleichmäßigere Verteilung, nachdem sie in einen Organismus oder eine Erkrankungsstelle inji ziert ist und bevor sie mit den Zellen zu verschmelzen beginnt. Das Signalereignis kann zum Beispiel eine Veränderung im pH, Temperatur, Ionenumgebung oder einfach der Zeit sein. In diesem letzteren Fall kann eine Fusions-verzögernde oder "umhüllende" (cloaking) Komponente, wie etwa ein ATTA-Lipid-Konjugat oder ein PEG-Lipid-Konjugat, sich ganz einfach aus der Liposomenmembran heruas über die Zeit austauschen. Bis zu dem Zeitpunkt, zu dem die Formulierung in geeigneter Weise im Körper verteilt ist, wird sie kalkulierterweise ausreichend Umhüllungsmittel verloren haben, so dass sie fusogen ist. Bei anderen Signalereignissen mag es erwünscht sein, ein Signalereignis auszuwählen, das mit der Erkrankungsstelle oder Zielzelle assoziiert ist, wie etwa eine erhöhte Temperatur an einer Entzündungsstelle.
Einer der großen Vorteile der Erfindung ist ihre Fähigkeit zur Anzielung eines breiten Bereichs von Erkrankungsstellen. Insbesondere werden Lipid-verkapselte Formulierungen in nützlicher Weise zur Anzielung und Abtötung von Tumorzellen oder anderen Neoplasien, oder anderen Zelltypen an Erkrankungsstellen, eingesetzt, die zur Ausübung irgendeiner anderen Funktion in nützlicher Weise modifiziert oder sensibilisiert werden können. Zu weiteren Zelltypen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Zellen an Entzündungsstellen, Stellen, an denen Gene in Infektionsstellen übermäßig exprimiert werden und ähnliches.
Die Nukleinsäure, z.B. Vektor, wird in einer Lipid-verkapselten Formulierung durch intravenöse Verabreichung übertragen. Diese Verabreichungsform zieht Nutzen aus der bekannten Neigung der Lipid-verkapselten Formulierungen, sich an Tumoren oder Neoplasien sogar ohne spezifische Anziel-Aspekte anzusammeln. Diese Fähigkeit wird als das Ergebnis einer "undichten" Vaskulatur an Stellen der Neoplasie erachtet, in die Lipidpartikel einer kleinen Größe leicht eindringen können (siehe Jain, Sci. Am., 271:58-65 (1994)).
Wo ein spezifisches Zelltyp-Targeting bevorzugt ist, können die Lipid-Formulierungen an der äußeren Oberfläche Antigene oder Marker enthalten, die durch Komponenten erkannt werden oder die Rezeptoren auf der Zielzelle erkennen. Beispiele eines solchen Targetings sind zu finden beispielsweise in Forum, et al., "Liposome Targeting in Animal Models," L. Huang (Hrsg.), Journal of Liposome Research, 7(4):315-534 (1997), dessen Lehren hierin durch Bezugnahme mit aufgenommen sind.
C. Verabreichungsfertige pharmazeutische Präparate
Generell werden bei intravenöser Verabreichung die Nukleinsäure- und/oder die Prodrug-Formulierungen mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger formuliert. Viele pharmazeutisch akzeptable Träger können bei den Zusammensetzungen und Methoden der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Geeignete Formulierungen zur Anwendung bei der vorliegenden Erfindung sind zu finden zum Beispiel in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES., Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17. Aufl. (1985). Eine Vielfalt von wässrigen Trägern kann verwendet werden, zum Beispiel Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4 % Saline, 0,3 % Glyzin und ähnliches, und können Glykoproteine für eine erhöhte Stabilität umfassen, wie etwa Albumin, Lipoprotein, Globulin etc. Allgemein wird normale gepufferte Saline (135-150 mM NaCl) als dem pharmazeutisch akzeptablen Träger verwendet, doch werden auch andere geeignete Träger genüge tun. Diese Zusammensetzungen können mittels herkömmlicher liposomaler Sterilisationstechniken sterilisiert werden, wie etwa der Filtration. Diese Zusammensetzungen können pharmazeutisch akzeptable Hilfssubstanzen je nach Erfordernissen enthalten, um sie physiologischen Bedingungen anzunähern, wie etwa pH-einstellende und Puffermittel, Tonizitäts-einstellende Mittel, Benetzungsmittel und ähnliches, zum Beispiel Natriumacetat, Natriumlaktat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Kalziumchlorid, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminoleat etc. Diese Zusammensetzungen können unter Anwendung der oben genannten Techniken sterilisiert werden, oder alternativ können sie unter sterilen Bedingungen hergestellt werden. Die resultierenden wässrigen Lösungen können zur Verwendung abgepackt oder unter aseptischen Bedingungen filtriert und lyophilisiert werden, wobei die lyophilisierten Präparate mit einer sterilen wässrigen Lösung vor der Verabreichung kombiniert werden. Träger können ebenfalls verwendet werden, wenn der Vektor oder die Prodrug-Formulierungen mittels anderer, im Fachgebiet bekannter parenteraler Methoden verabreicht werden, wie etwa der subkutanen, intratumoralen oder intramuskulären Injektion, Inhalation und ähnliches.
Bei der Herstellung der pharmazeutischen Präparate der Lipid/therapeutischen Nukleinsäure-Partikel der Erfindung ist die Verwendung von Mengen der Partikel bevorzugt, die gereinigt worden sind, um leere Partikel oder Partikel mit Nukleinsäure, die mit der äußeren Oberfläche assoziiert sind, zu vermindern oder auszuschalten.
D. Krankheits-Indikationen, für die eine Behandlung durch die Erfindung geeignet sind
Die vorliegende Erfindung ist besonders nützlich zur Behandlung einer Neoplasie bei Säugern. Behandlung meint die Erzielung einer therapeutischen Wirkung an der Stelle der Neoplasie. Die Behandlung eines breit gefächerten Bereichs von Tumoren kann unter Verwendung der Zusammensetzungen dieser Erfindung erzielt werden. Außerdem können die Zusammensetzungen und Methoden dieser Erfindung gegen standardmäßige NIH-empfohlene Modelle getestet werden. Siehe zum Beispiel Driscoll, "The preclinical new drug research program of the National Cancer Institute," Cancer Treatment Reports, 68:63-76 (1984). Außerdem können in vivo- und/oder in vitro-Modelle verwendet werden, wie sie routinemäßig bei von dem National Cancer Institute gesponsorten Wirkstoff-Screening-Auswertungen zur Identifizierung eines Nutzens gegen humane Neoplasie eingesetzt werden, um den Nutzen der vorliegenden Erfindung zu bestätigen (siehe Boyd, M.R., "The NCl In Vitro Anticancer Drug Discovery Screen. In Anticancer Drug Development Guide" (B. Teicher (Hrsg.), 1995, Humana Press, Totawa, NJ).
Zu den Charakteristika einer Neoplasie, gegen die diese Erfindung nützlich ist, zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Tumoren oder Neoplasien, die 1) angemessen transfizierbar durch Lipid/therapeutische Nukleinsäure-Partikel sind; 2) responsiv für das Genprodukt der Nukleinsäure sind; und 3) nicht ohne weiteres für chirurgische Ansätze zugänglich sind. Zu solchen Tumoren zählen metastatische oder nicht-feste Tumoren, insbesondere Mikrometastasen, Metastasen, die außerhalb der Lunge, Leber oder Milz ("Erstpassage-Organe") gefunden werden und ähnliche. Somit ist die Erfindung auf eine Vielfalt von Tumor-Typen anwendbar. Ein Schlüssel-Charakteristikum einer geeigneten Krankheits-Indikation wird ihre Zugänglichkeit für die Lipid/therapeutischen Nukleinsäure-Partikel der Erfindung sein.
E. Kombinationstherapie
Eine Kombinations-Chemotherapie, eine wohl bekannte Technik unter Verwendung herkömmlicher Wirkstoffe zur Behandlung von Krebs, kann ebenfalls unter Verwendung der Lipid-Nukleinsäure-Partikel der Erfindung eingesetzt werden. Eine Behandlung mit einer Kombinations-Chemotherapie weist Vorteile darin auf, dass: 1) sie eine Resistenz gegen ein einzelnes Agens umgeht; 2) sie in einer heterogenen Tumorpopulation Zellen mittels verschiedener Mechanismen abtöten kann; und 3) jedes Mittel, indem Wirkstoffe mit nicht-überlappenden Toxizitäten ausgewählt werden, bei voller Dosis verwendet werden kann. Zu Kombinationsregimen, die kurativ sind, wenn eine Behandlung mit einem einzelnen Agens dies nicht ist, zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, die folgenden: akute lymphozytische Leukämie – Vincristin, Prednison, Doxorubicin und L-Asparaginase; Hodgkin-Krankheit – Mechorethamin, Vincristin, Procarbazin und Prednison (MOPP); histiozytisches Lymphom – Cyclophosphamid, Vincristin, Procarbazin und Prednison (C-MOPP); und testikuläres Karzinom – Bleomycin, Vinblastin, Cisplatin.
Einige Überlegungen, die bei der Auswahl von Wirkstoff-Kombinationen wohl bekannt sind, umfassen die folgenden:
Kinetische Überlegungen: ein heterogener Tumor wird zunächst mit Nicht-Zellzyklusspezifischen Agenzien behandelt (z.B. Cyclophosphamid und Doxorubicin), um ein „Debulking" des Tumors zu erreichen und sich langsam teilende Zellen in die aktive DNA-Synthese zu rekrutieren; gefolgt von einem Zellzyklus-spezifischen Wirkstoff, wie etwa Methotrexat und 5-FU. Der Wirkstoff-Zyklus wird in regelmäßigen Intervallen wiederholt.
Wirkstoffresistenz-Überlegungen: Zwei oder mehr nicht-kreuzresistente Wirkstoffe werden gleichzeitig verwendet, um die Selektion resistenter Tumorzellen zu vermeiden. Doppelresistente Mutanten können durch sequenzielle Chemotherapie entstehen.
Wirkstoff-Wechselwirkungen: Einige Kombinationen (d.h. Methotrexat und 5-FU) wirken synergistisch, wenn in der geeigneten Sequenz gegeben, antagonistisch, wenn in der umgekehrten Reihenfolge gegeben. Einige Kombinationen (d.h. L-Asparaginase und Methotrexat) sind anfangs antagonistisch, doch nach einem längeren Zeitraum (etwa 10 Tage) werden die Tumorzellen als empfindlicher gegenüber Methotrexat befunden.
Alle diese Überlegungen können eine Rolle in der geeigneten Auswahl der therapeutischen Gene und verwendeten anti-neoplastischen Agenzien spielen. Einige mögliche Kombinationstherapien unter Verwendung der Gentherapie und chemotherapeutischer Agenzien sind angegeben in US-Patentanmeldung der laufenden Nr. 60/082,665 (TTC Anwaltsaktenzeichen Nr. 16303-007100), die demselben Antragsteller der vorliegenden Erfindung erteilt ist. Es ist besonders nützlich, therapeutische Nukleinsäuren an Neoplasien zu verabreichen, die als Multi-Drug-resistent identifiziert worden sind, um den Tumor für das chemotherapeutische Agens rezusensibilisieren.
F. Dosierungen der Wirkstoffe
Die präzise an einen Patienten zu verabreichende Dosierung, ob als Teil des GDEPT-Systems oder als Teil einer Kombinations-Chemotherapie, wird letztendlich vom Ermessen und der professionellen Beurteilung des betreuenden Arztes abhängen und wird zum Teil von solchen Faktoren wie dem Alter, Gewicht und der speziellen Neoplasie des Patienten abhängen. Die Mengen und das präzise Regime wird natürlich von weiteren Faktoren abhängen, einschließlich dem Schweregrad der zu behandelnden Bedingung.
Bei anderen Systemen wird das exakte Dosierungsschema durch die individuellen Kliniker bestimmt werden müssen, was durch die exakte Natur der zu verabreichenden Nukleinsäure und der zu behandelnden Bedingung kontrolliert sein wird, doch kann eine gewisse allgemeine Richtlinie angegeben werden. Im Allgemeinen kann die Dosierung ohne weiteres im Bereich von etwa 0,1 μg bis 1 g oder mehr der Nukleinsäure liegen. Bevorzugter wird die Dosis an Nukleinsäure im Bereich von etwa 0,1 μg bis etwa 5 mg pro Kilogramm für einen typischen Patienten von 70 kg liegen, und die Dosen der Vektoren, die ein virales Partikel enthalten, werden so berechnet, dass sie eine äquivalente Menge an therapeutischer Nukleinsäure ergeben.
In GDEPT-Systemen wird eine geeignete Dosis des Nukleinsäure-Lipid-Partikels die Menge an Nukleinsäure sein, die etwa 500 bis etwa 200.000 Enzym-Einheiten/m² (z.B. 20.000 Enzym-Einheiten/m²) produziert. Die Dosis der Prodrug wird vorteilhafterweise in einem Bereich von etwa 0,1 bis 250 mg pro Kilogramm Körpergewicht des Empfängers pro Tag betragen, bevorzugt etwa 0,1 bis 100 mg pro Kilogramm Körpergewicht.
Bei der Kombinations-Chemotherapie wird eine geeignete Dosis der Nukleinsäure typischerweise im Bereich von 0,1 μg bis etwa 5 mg pro Kilogramm für einen typischen Patienten von 70 kg liegen. Außerdem wird eine geeignete Dosis des anderen Wirkstoffs, z.B. des anderen Antikrebsmittels, vorteilhafterweise in dem Bereich von etwa 0,1 bis 250 mg pro Kilogramm Körpergewicht des Empfängers pro Tag liegen, und bevorzugter in dem Bereich von etwa 0,1 bis 100 mg pro Kilogramm Körpergewicht des Empfängers pro Tag.
Typischerweise werden die Partikel dem Patienten verabreicht und wird dann die Aufnahme und Transfektion in die Zellen zum Beispiel durch Gewinnung und Analyse einer Biopsieprobe des angezielten neoplastischen Gewebes überwacht. Dies kann durch klinische Versuche bestimmt werden, die das Verabreichen eines Bereichs von Versuchsdosierungen an einen Patienten und Messen des Grades der Transfektion in eine Zielzelle oder den Tumor einbeziehen. Bei den Methoden der vorliegenden Erfindung wird die Prodrug üblicherweise im Anschluss an die Verabreichung der Nukleinsäure, die für ein Genprodukt kodiert, verabreicht.
Die Erfindung wird in größerer Ausführlichkeit anhand von spezifischen Beispielen beschrieben werden, die in Entsprechung zu dem Canadian Council an Animal Care, 2. Aufl., "Guide to the care and use of experimental animals," Hrsg. Olfert, E., Cross, B. und McWilliam, A. (1993) durchgeführt werden. Die folgenden Beispiele dienen zu Zwecken der Veranschaulichung und sind in keinster Weise zur Beschränkung der Erfindung vorgesehen. Fachleute des Gebiets werden ohne weiteres eine Vielzahl nicht-kritischer Parameter erkennen, die verändert oder modifiziert werden können, und dabei im Wesentlichen dieselben Ergebnisse ergeben.
BEISPIELE
Die Beispiele, die sich auf andere Neoplasien als metastatische Neoplasien beziehen, sind zu Vergleichszwecken angegeben.
BEISPIEL 1
Dieses Beispiel veranschaulicht die Synthese von 5 Lipid-Plasmid-Partikel-Formulierungen für die systemische Verabreichung.
Materialien: Die Plasmide sind vorzugsweise superspiralisiert, 4.000 bis 15.000 bp lang, für Gene und Enhancerelemente kodierend, etc., je nach Erfordernissen. Kationisches Lipid, N,N-Dioleyl-N,N-dimethylammoniumchlorid ("DODAC") und Monomethoxypolyethylen-2000-glykolsuccinat-(C8:0-Ceramid) ("PEG-Cer-C8") wurden bei Inex Pharmaceuticals Corp. synthetisiert. Dioleylphosphatidylethanolamin (DOPE) wurde geliefert von Northern Lipids, Vancouver. Standardmäßige Dialysemembranen: Spectro/Por 5-regenerierte Cellulose (12-14.000 MWCO) wurde bezogen von VWR (hergestellt von Spectrum Medical Industries Inc.). Natriumcitrat wurde bezogen von BDH. Natriumchlorid, Triton X-100 und Octyl-beta-D-glukopyranosid ("OGP") wurden erhalten von VWR Scientific, Fisher Scientific oder Sigma Chemical Company.
Formulierung 1.1 (oder alternativ INEX 303 oder INEX 303i)
Plasmid (50-400 μg) wurde mit DODAC in 500 μL der Präp-Lösung, enthaltend 0,2 M OGP in 150 mM NaCl; 5 mM HEPES, pH 7,4, für 30 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Dieses Gemisch wurde einem Gemisch aus DOPE und PEG-Cer-C14 oder PEG-Cer-C20 oder PEG-Cer-C8 in 500 μL derselben Präp-Lösung zugegeben. Die Lipid-Gesamtkonzentration betrug entweder 5 oder 10 mg/mL, wobei das molare Verhältnis von DOPE:DODAC:PEG-Cer 84:6:10 betrug. Das Gemisch wurde gegen 150 mM NaCl, 5 mM HEPES (pH 7,4) für 36-48 Std. mit zwei Pufferaustäuschen dialysiert.
Nicht-verkapselte DNA wurde durch Anionenaustausch-Chromatographie auf einer DEAE-Sepharose-Säule (1 × 4 cm) entfernt. Leere Liposomen wurden durch Poolen von Lipid/DNA-Proben entfernt, die auf der DEAE-Säule oben auf einem Sucrose-Dichtegradienten in 12,5 mL-Ultrazentrifugierröhrchen koeluierten. Der Gradient wurde mit 3 mL jeweils an 10 % Surose, 2,5 % Sucrose und 1 % Sucrose in HBS, die aufeinander folgend von unten nach oben aufgeschichtet waren, gebildet. Die Gradienten wurden bei 36.000 rpm (160.000 × g) für 2 Std. bei 20°C in einer Beckman Optima XL-100K-Ultrazentrifuge unter Verwendung eines SW-28-Rotors zentrifugiert. Die aufgetrennten Banden wurden von oben nach unten entfernt. Die Fraktionen wurden für 3H-Plasmid und 14C-CHE durch doppelmarkierte Szintillationszählung unter Verwendung eines Beckman LS6500-Szintillationszählers analysiert. Die Lipidverkapselte Plasmid-DNA bildete eine enge Bande an der Grenzfläche zwischen 2,5 % und 10 % Sucrose, wohingegen das nicht-assoziierte Lipid als ein senkrechter Streifen von der Oberfläche des Gradienten bis zu der Grenzfläche zwischen 1 % und 2,5 % Sucrose vorhanden war. Die Formulierung kann in 12-14.000 MWCO Dialyseröhrchen gegen 500.000 MW PEG (Aquacide II) konzentriert werden. Ist das gewünschte Volumen erreicht, so wird die Formulierung in einen neuen Dialysebeutel übertragen und über Nacht gegen HBS dialysiert, um die NaCl-Konzentration auf 150 mM einzustellen.
Formulierung 1.2 (oder alternativ INEX 351)
In der Formulierung 1.2 wurden die folgenden Konzentrationen verwendet. Lipid-Konzentration: 5,0 mg/mL (oder 5,3 mM); Plasmid-Konzentration, 200 ig, Ausgangsvolumen, 1,0 mL; Lipid-Ausgangslösungen (in 95:5 Benzol:Methanol, 2:1 Chloroform:Methanol oder Ethanol). Berechnet nach Molarität (gelöst in 95:5 Benzol:Methanol oder 2:1 Chloroform:Methanol). DOPE (744 g/mol), 40 mM; DODAC (582 g/mol), 40 mM; und PEG-C8 (2515 g/mol), 20 mM. Formulierung für 351: 42,5:42,5:15 (Mol-%) DOPE:DODAC:PEG-C8

DOPE DODAC PEG-C8

mg 1,68 1,315 2,005

Mol-% 42,5 42,5 15

μmol 2,25 2,25 0,8

MI 56,2 56,2 40
Formulierungsverfahren (1 ml-Maßstab):
Lipid-Ausgangslösungen werden in ein sauberes, trockenes Teströhrchen aliquotiert und zu einem Lipidfilm unter Verwendung eines Stroms von N₂-Gas getrocknet und dann unter Vakuum für mindestens 2 Std. getrocknet. 50 μL an 2M OGP werden zugegeben und 500 μL an 2-fach-Stärke-Dialysepuffer werden zugegeben, dann werden 200 μg Plasmid zugegeben und durch Vortexen zum Lösen des Lipidfilms gemischt. Dies wird auf 1,0 mL mit sterilem entionisiertem H₂O aufgefüllt, gemischt und etwa 30 Min. bei Raumtemperatur inkubieren gelassen. Die Lösung wird in einen Dialysebeutel eingebracht und für 40-48 Std. gegen 2 l Dialysepuffer bei 1-2 Pufferaustäuschen nach etwa 24 Std. dialysiert, und das Volumen der Probe wird durch Wiegen in einem geteerten Röhrchen (angenommene Dichte von 1,0) bestimmt. Diesen Schritten können eine DEAE-Reinigung und/oder Sucrose-Dichtegradienten-Zentrifugation folgen, wie oben beschrieben.

Nach der DEAE-Reinigung und Sucrose-Dichtezentrifugation, wie oben beschrieben, weist die fertig gestellte INEX 351-Formulierung eine Konzentration von etwa 200 μg/ml Plasmid und 5 mg/ml Gesamtlipid auf. Vermerke für INEX 351:

Vermerk 1:	geeignete Dialysepuffer-Konzentrationen: p53: 150 mM NaPO₄ + 150 mM NaCl (Versuch mit 140-160 mM NaCl), pH 7,4 pLuc: + 175 mM NaCl (etwa 150-170 mM NaCl), pH 7,4
Vermerk 2:	150 mM NaPO₄-Puffer, pH 7,4: 35,77 g dibasisches Natriumphosphat (Na₂HPO₄) 6,62 g monobasisches Natriumphosphat (NaH₂PO₄) Zugeben einer geeigneten Menge an NaCl, Lösen in 2 l (Endvolumen) an entionisiertem Wasser unter Rühren. Der endgültige pH-Wert kann zwischen einem pH von etwa 7,3 und etwa 7,4 variieren; dies ist normalerweise nicht eingestellt worden und hat die Leistungsfähigkeit der Formulierung nicht beeinträchtigt.
Vermerk 3:	Verwenden von 0,2 μm filtriertem Puffer mit der Lipid/Piasmid/Detergenz-Lösung
Vermerk 4:	Als einer Alternative zur Zugabe von 2x Dialysepuffer kann das Plasmid gegen Dialysepuffer vordialysiert werden und kann die Formulierung zu ihrem Endvolumen unter Verwendung von Normalstärke-Dialysepuffer verdünnt werden. Zwar bedeutet dies, dass ein geringfügiger Unterschied in der Pufferkonzentration vorliegen wird, doch beeinflusst dies nicht die Verkapselungseffizienz oder resultierende Partikelgröße.
Vermerk 5:	Ist das Volumen der Formulierung erhöht (d.h. über 5 ml), so wird ein weiterer Dialyseaustausch hinzugefügt.
Vermerk 6:	Die DEAE-Sepharose-Säulen werden oftmals durch Eluieren von 50 μl einer 10 mg/ml extrudierten oder beschallten 1:1-Phosphatidylcholin:Cholesterol-Vesikelformulierung (verdünnt in 2 ml) zur Blockierung jeglicher nicht-spezifischer Lipidbindung an die Säule vorbehandelt.

Um die kationische Oberflächenladung der INEX 351-Formulierungen zu vermindern, mag es erwünscht sein, die verwendete Menge an kationischem Lipid (d.h. DODAC) zu verringern. Wird die Menge an DODAC verändert, so wird auch die Menge an DOPE verändert, um dieselbe Gesamtmenge an Lipid beizubehalten. Formulierungen unterhalb von 30 % DODAC werden vorzugsweise in 10 mg Gesamtlipid vorgenommen. Der Dialysepuffer kann wie in nachstehender Tabelle 1 ausgetauscht werden: Tabelle 1. Charakterisierung von repräsentativen großmaßstäblichen Formulierungen.

Konz.	Ausgangsvolumen	Puffer	Verkapslungseffizienz	Nicomp-Partikelgröße (nm)^a
42,5%	30 ml	150 mM NaPO₄, 130 mM NaCl	49%	131
30 %	12 ml	150 mM NaPO₄	56,8 %	109
24 %	30 ml	130 mM NaPO₄	50,7 %	250
20 %	15 ml	105 mM NaPO₄	63 %	178

^aNicomp-Analyse der mittleren Partikelgröße, Gauss-Destillation, Volumengewicht, vor der DEAE-Reinigung und Isolierung.

Formulierung 1.3 (oder alternativ INEX 321)
Lipid-Plasmid-Partikel mit 10-30 % DODAC sind bei der vorliegenden Erfindung nützlich. Diese können wie oben beschrieben oder wie folgt formuliert werden.
Lipid-Ausgangslösungen: Die individuellen Ausgangslösungen jedes Lipids wurden in Chloroform/Methanol (2:1 v/v) zu einer Endkonzentration von 2 oder 20 mg/ml gelöst.
OGP-Lösung: 1,0 M OGP-Lösung wurde in Wasser von MilliQ-Qualität präpariert.
Citratpuffer: Natriumcitratpuffer wurde zur Dialyse verwendet, um das Detergenz aus der Formulierung zu entfernen. Die Citrat-Konzentrationen wurden entsprechend der Menge an DODAC variiert. Der Puffer enthielt außerdem 150 NaCl und 5 mM HE-PES bei pH 7,4, sofern nicht anders angegeben. Generell wurde eine 10X-Lösung präpariert und 1:10 in Wasser von MilliQ-Plus-Qualität für die Dialyse unter Verwendung eines Messzylinders verdünnt.
Herstellung eines Lipid/DNA/OGP-Gemischs: Eine typische Formulierung enthielt 10 mg eines Lipids aus DODAC/DOPE/PEG-Cer-C8 und 200 μg DNA. Entsprechende Mengen der Ausgangslösungen, die DODAC, DOPE und PEG-Cer-C8 (normalerweise 15 Mol-% in dieser Studie) enthielten, wurden in einem Glasteströhrchen gemischt. Wird die Menge an DODAC verändert, so wird auch die Menge an DOPE verändert, um insgesamt 10 mg Lipid beizubehalten. Das Lösungsmittel wurde zunächst unter einem Strom von N₂-Gas entfernt, gefolgt von einer Inkubation unter Vakuum für 3-5 Std. Dem Lipid wurden 0,2 mL an 1 M OGP zugegeben. Die Suspension wurde gevortext, bis das Lipid vollständig gelöst war und die Lösung klar wurde. Dann wurden 0,2 ml DANN-(1 mg/ml)-Lösung, enthalten 200 μg DNA und 0,6 ml HBS (HEPES-gepufferte Saline) oder Citratpuffer (Konzentrationen bezeichnet in 1) zu einem fertigen Gesamtvolumen von 1 ml zugegeben. Wurde die Lösung nicht klar, so wurde eine geringe Menge an OGP (50 μl) zugegeben. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 1 Std. inkubiert, damit sich die Komponenten äquilibrieren konnten.
Dialyse: Dialyseröhrchen wurden in 60 % Ethanol (oder in destilliertem Wasser, wenn keine Sterilisation erforderlich war) für 30 Min. eingeweicht. Das Gemisch aus DNA/Lipid/OGP-Lösung wurde dann in das Dialyseröhrchen übertragen. Die Probe wurde für 2 Tage in 2-4 l Citratpuffer (Konzentration wie in 1 beschrieben) bei zwei Austäuschen des Puffers täglich dialysiert.
Nach der Präparierung können leere Liposomen durch die DEAE-Reinigung und Sucrose-Dichtezentrifugation wie oben beschrieben entfernt werden. Nachdem in diesem Beispiel die verschiedenen Lipid-Plasmid-Partikel-Formulierungen, die für die systemische Verabreichung geeignet sind, gelehrt worden sind, wäre es für einen Fachmann des Gebiets offensichtlich, wie diese zum Beispiel für eine verbesserte Plasmid-Übertragung und/oder intrazelluläre Expression unter Anwendung einer oder mehrerer möglicher Variationen modifiziert werden können. Variationen des folgenden Typs werden vorgeschlagen: Prozentsatz an PEG-Lipid; Größe des PEG; Länge der hydrophoben (Anker-) Kette; pH-empfindliche PEG-Lipide; Ersetzung des PEG durch ATTA (beschrieben in US-Patentanmeldung der laufenden Nr. 08/996,783 , eingereicht am 22. Dezember 1997 (die die TTC-Anwaltsaktenzeichen Nr. 16303-005800 trägt und die demselben Antragsteller der vorliegenden Erfindung erteilt ist); Zugabe von Membran-modifizierenden Lipiden, wie etwa Cholesterol oder DOPE; Verwendung alternativer kationischer Lipide, wie etwa DMRIE, DOTAP, DOTMA, DODMA, AL-1 etc.; Verwendung fusogener Komponenten, wie etwa pH-empfindlicher Lipide, Peptide (EALA) oder Polymere (PEAA); Verwendung von Zielagenzien; Verwendung von DNA-kondensierenden Peptiden (d.h. Polylysin oder Spermin) oder Polymeren (d.h. PEI); Verwendung von negativ geladenen Lipiden, wie etwa Phosphatidylserin; oder Verwendung alternativer PEG-Lipid-Linker, wie etwa SPDP oder PDPH (beschrieben in US-Patentanmeldung der laufenden Nr. 08/536,584 , die demselben Antragsteller der vorliegenden Erfindung erteilt ist).
Formulierung 1.4
Formulierung 1.4 enthält DOPE:DODAC:PEG-Cer-C20 (83:7:10) in Mol-%. Das Syntheseprotokoll ist wie folgt: Die Lipid-Ausgangslösungen (in Ethanol) werden in einen autoklavierten, sauberen, trockenen Rundbodenkolben aliquotiert. Die Lösung wird zu einem Lipidfilm unter Verwendung eines Rotavap in einem Wasserbad von 65°C getrocknet und über Nacht vakuumiert. HBS mit Oktylglukopyranosid (OGP) wird zu einer End-OGP-Konzentration von 200 mM zugegeben. Das Gemisch wird verwirbelt, um den Lipidfilm zu lösen, sofern erforderlich, und wird auf 37°C erhitzt, um sicherzugehen, dass das Lipid vollständig gelöst ist. Dann wird Plasmid-DNA (400 μg/10 mg Lipid) zu den gelösten Lipidfilmen zugegeben. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur für 30 Min. wird die resultierende Lösung in einen Dialysebeutel eingebracht, der vorab in filtersterilisiertem destilliertem H₂O eingeweicht und autoklaviert worden ist. Die Dialyse erfolgt über Nacht gegen 20 l Dialysepuffer (5 mM HEPES, 150 mM NaCl pH 7,4, filtersterilisiert durch einen sterilen 0,2-Mikronenfilter) bei zwei Pufferaustäuschen.
Nicht-verkapselte DNA wurde durch Anionenaustausch-Chromatographie auf einer DEAE-Sepharose CL-6B-Säule entfernt. Die Partikelsuspension wird abgesammelt, wie sie im Eluat erscheint, und unter Verwendung des Amicon-Difiltrationssystems (YM 30-Membran) konzentriert. Als nächstes werden die leeren Liposomen unter Verwendung eines Sucrose-Dichtegradienten entfernt. Der Gradient wurde durch Aufschichten von 10 % Sucrose, 5,0 % Sucrose und 2,5 % Sucrose in HBS, pH 7,4, gebildet. Die Probe wird durch Schweben lassen oben auf die 2,5 % Sucroseschicht aufgeladen und bei 28.000 rpm für 18 Std. bei 20°C unter Verwendung einer Beckman Optima XL-100K-Ultrazentrifuge und eines SW-28-Rotors zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wird die untere Bande mit einer Spritze und Nadel entfernt und die Proben gepoolt. Die Sucrose wird entfernt und die Probe wird unter Verwendung des Amicon-Systems gleichzeitig konzentriert. Das Endvolumen wird durch einen 0,2-Mikronenfilter filtersterilisiert. Die DNA-Konzentration wird anhand von Picogreen-Assays, die Lipid-Konzentration anhand einer HPLC und die Partikelgröße anhand einer Nicomp-Analyse analysiert.
Formulierung 1.5
Diese Methode, die in der PCT-Patentveröffentlichung WO 96/40964 dargestellt ist, ergibt eine alternative hoch effiziente Formulierung des Lipid/Nukleinsäure-Partikels. Sie ist im Wesentlichen ein Präparat von Lipid-therapeutischen Nukleinsäure-Partikeln in einem organischen Lösungsmittel. Die folgenden Ausgangslösungen des Lipids werden in 100 % Ethanol hergestellt: DSPC – 20 mg/ml (20 Mol-%) = 128,4 μl; Chol – 20 mg/ml (25 Mol-%) = 113,1 μl; DODAP – 40 mg/ml (45 Mol-%) = 44,5 μl; PEG-Cer-C20 (oder C14) – 50 mg/ml (10 Mol-%) = 67,6 l.
Die Lipide werden miteinander vermengt, und das Volumen wird auf ein Gesamtvolumen von 0,400 ml mit 100 % Ethanol erhöht. Ein entsprechendes Volumen an 300 mM Citratpuffer (pH 3,3) wird der DNA zu einem Endvolumen von 600 ml und pH 3,8 zugegeben. Die beiden Lösungen werden auf 65°C für 2 Min. erwärmt. Unter Vortexen des DNA-Röhrchens wird unter Verwendung einer Pasteur-Pipette Lipid (in Ethanol) der DNA-Lösung tropfenweise zugegeben. Die resultierende Lösung wird trübe werden und kann Blasen bilden, doch sollten keine Verklumpungen vorhanden sein. Die Lösung wird in ein vorgetränktes Dialyseröhrchen (12-14.000 MWCO) eingebracht und für 1 Std. gegen 300 mM Citratpuffer (pH 3,7-4,0) dialysiert. Das Dialyseröhrchen wird in HBS übertragen (pH 7,5) und für 12 Std. dialysiert. Nicht- verkapselte DNA wird mittels Anionenaustausch-Chromatographie unter Verwendung einer in HBS äquilibrierten DEAE-Sepharose-Säule entfernt. Sofern erforderlich, kann das Endpräparat unter Verwendung des Amicon-Systems (YM 30-Membran) konzentriert werden. Die DNA-Konzentration wird anhand von Picogreen-Assays und die Lipid-Konzentration anhand einer HPLC analysiert.
Alle der obigen Lipid/therapeutische Nukleinsäure-Formulierungen weisen günstige Charakteristika auf, die sie zur Verwendung bei den Methoden der vorliegenden Erfindung geeignet machen. Zu diesen Charakteristika zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, die folgenden: Zunächst einmal sind sie kleine Partikel mit einer mittleren Größe von etwa 50 bis etwa 200 nm, und bevorzugter von etwa 60 bis etwa 130 nm. Am bevorzugtesten sind die Partikel von einer relativ gleichmäßigen Größe und weisen sie einen T2-Wert von weniger als 3, bevorzugter weniger als 1 und sogar noch bevorzugter weniger als 0,5 auf. Zweitens sind sie Serum-stabil und werden somit nach Exposition an einen Serum- oder Nuklease-Assay, der freie DNA signifikant abbauen würde, nicht wesentlich abgebaut. Drittens weisen sie ein Verhältnis von Nukleinsäure zu Lipid auf, das bei verschiedenen Mengen formuliert werden kann. Zur Verwendung bei den Methoden dieser Erfindung bestehen die Partikel vorzugsweise aus mindestens etwa 3 mg Nukleinsäure pro mmol Lipid, bevorzugter mindestens etwa 14 mg pro mmol Lipid, und am bevorzugtesten mindestens etwa 25 mg pro mmol. Die Lipid-Nukleinsäure-Partikel der vorliegenden Erfindung weisen weitere vorteilhafte Merkmale auf, wie etwa eine geringe nicht-spezifische Toxizität, verbesserte Bioverteilung, therapeutische Wirksamkeit und einfache Herstellbarkeit.
Assays für die Serum-Stabilität
Die gemäß der oben notierten Techniken formulierten Lipid/therapeutische Nukleinsäure-Partikel können auf die Serum-Stabilität mittels einer Vielfalt von Methoden untersucht werden.
Bei einem typischen DNase 1-Verdau wird zum Beispiel 1 μg an DNA, die in das Partikel von Interesse eingekapselt ist, in einem Gesamtvolumen von 100 μl an 5 mM HEPES, 150 mM NaCl, 10,0 mM MgCl2, pH 7,4, inkubiert. DNase-behandelte Pro ben werden entweder mit 100 oder 10 U an DNase 1 (Gibco-BRL) behandelt. 1,0 % Triton X-100 kann in Kontroll-Experimenten zugegeben werden, um sicherzugehen, dass die Lipid-Formulierungen das Enzym nicht direkt inaktivieren. Die Proben werden bei 37°C für 30 Min. inkubiert, nach welcher Zeit die DNA durch Zugabe von 500 μl an DNAZOL, gefolgt von 1,0 ml Ethanol, isoliert wird. Die Proben werden für 30 Min. bei 15.000 rpm in einer Tischmikrofuge zentrifugiert. Der Überstand wird abgeschöpft und das resultierende DNA-Pellet wird zweimal mit 80 % Ethanol gewaschen und getrocknet. Diese DNA wird in 30 μl an TE-Puffer resuspendiert. 20 μl dieser Probe werden auf ein 1,0 % Agarosegel aufgeladen und einer Elektrophorese in TAE-Puffer unterzogen.
In einem typischen Serum-Assay wurden 50 μg an DNA in freier, verkapselter oder verkapselter + 0,5 % Triton X100-Form in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen aliquotiert. Den Röhrchen wurden 45 μl normales murines oder humanes Serum und dH₂O (um das Endvolumen auf 50 μl zu bringen) zugegeben. Die Röhrchen wurden mit Parafilm versiegelt und bei 37°C inkubiert. Eine Probe der freien, verkapselten oder verkapselten + 0,5 % Triton X100-Form, die nicht durch Nuklease verdaut war (Standard) wurde in Flüssigstickstoff in einem Eppendorf-Röhrchen eingefroren und bei -20°C gelagert. Aliquots wurden zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen, diese GDP-Puffer, der Proteinase K (133 μg/ml) enthielt, zugegeben und sofort in Flüssigstickstoff zum Stoppen der Reaktion eingefroren. Sobald alle Zeitpunkte entnommen waren, wurden die Proben bei 55°C in einem Wasserbad zur Aktivierung der Proteinase K inkubiert, um sie dazu zu befähigen, jegliche verbliebene Exonuklease zu denaturieren. Die mit Proteinase K verdauten Proben wurden auf Polyacrylamidgele aufgebracht, um die Mengen des Exonuklease-Abbaus auszuwerten.
Die oben beschriebenen Partikel zeigen eine Serum-Stabilität, indem sie weniger als 5 % und vorzugsweise nicht detektierbare Mengen eines DNA-Abbaus (teilweise oder gesamt) als ein Ergebnis einer solchen Behandlung, sogar in der Gegenwart von 100 U DNase 1, aufweisen. Dies steht in einem günstigen Vergleich zu freier DNA, die vollständig abgebaut wird, und Plasmid/Lipid-Komplexen (wie etwa DOTMA oder DODAC:DOPE-Komplexe), worin DNA wesentlich (d.h. größer als 20 %, oftmals 80 %) nach einer solchen Behandlung abgebaut ist.
Beispiel 2

Dieses Beispiel veranschaulicht die Messung der therapeutischen Wirkung von Lipid-formuliertem Ganciclovir auf subkutane Tumoren, die mit Lipid-verkapseltem HSV-TK transfiziert sind.

Gruppe	Tumor	Plasmid	Prodrug	Weg	Assay	Mäuse pro Gruppe
A	B16	L018	PBS	IV	Tumorvolumen	6 C57
B	B16	L018	GCV	IV	Tumorvolumen	6 C57
C	B16	pTK10	PBS	IV	Tumorvolumen	6 C57
DC	B16	pTK10	GCV	IV	Tumorvolumen	6 C57

Das Plasmid L018, welches auf pBR322 basiert, trägt einen CMV-Promotor, der an ein Luciferase-Gen operativ geknüpft ist.

Das pINEX-TK10-Konstrukt besteht aus einem pBR322-abgeleiteten Plasmid, das einen CMV-Promotor, geknüpft an ein "Hyper"-HSV-TK-Gen, eine Rinderwachstumshormon-Polyadenylierungssequenz und ein Kanamycin-Resistenzgen, enthält. "Hyper"-HSV-TK ist eine aktivere Form des HSV-TK-Gens, wie beschrieben von Black, et al., PNAS (USA), 93:3525-3529 (1996). Das verwendete Plasmid-Konstrukt ist in 7 dargestellt.
Am Tag Null wurden 24 weibliche C57-Mäuse (Harlan Sprague Dawley, Inc., Indianapolis, IN) subkutan mit 100.000 B16-Maus-Melanomzellen (NCl Katalog B16B6-6) in einem Gesamtvolumen von 50 μl (Gruppen A, B, C, D) beimpft. Das Tumorvolumen wurde durch Messen der Länge, Breite und Höhe des Tumors mit Hauttastzirkeln sobald als möglich und anschließend täglich bestimmt. Gruppen A bis D wurden mit 100 μg Plasmid des entsprechenden Lipid-formulierten Plasmids, das gemäß Beispiel 1 formuliert war, einmal täglich, beginnend um 9.00 Uhr am Tag Fünf und an jedem folgenden Tag behandelt. Die Plasmid-Formulierung wurde IV in die Schwanzvene in einem Gesamtvolumen von 200 μl PBS injiziert. Gruppen B und D wurden mit Lipid-formuliertem Ganciclovir, das gemäß Beispiel 4 hergestellt war, einmal täglich, beginnend um 15.00 Uhr am Tag Fünf und an jedem folgenden Tag behandelt.
0,5 mg Ganciclovir (~ 25 mg/kg) wurden IV in die Schwanzvene in einem Gesamtvolumen von 200 μl PBS injiziert. Am Tag 21 wurden die Mäuse geopfert. Die Tumoren wurden entnommen und gewogen.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die Mäuse der Gruppe D entweder keine Tumoren entwickelten oder ansonsten Tumoren signifikant langsamer als die Mäuse der Kontrollgruppen A, B und C entwickelten.
BEISPIEL 3

Dieses Beispiel veranschaulicht die Messung der therapeutischen Wirkung der systemischen Verabreichung der Behandlung mit der therapeutischen Nukleinsäure HSV-TK, gefolgt von der Behandlung mit Lipid-formuliertem Ganciclovir, auf SCID-Mäuse mit humanen (SKOV-3) intraperitonealen (IP) Tumoren.

Gruppe	Tumor	Plasmid	Prodrug	Weg	Assay	Mäuse pro Gruppe
A	SKOV-3	L018	PBS	IV	Tumorvolumen	6 C57
B	SKOV-3	L018	GCV	IV	Tumorvolumen	6 C57
C	SKOV-3	pTK10	PBS	IV	Tumorvolumen	6 C57
D	SKOV-3	pTK10	GCV	IV	Tumorvolumen	6 C57

* Es wird angemerkt, dass sich der "Weg" auf die Verabreichung der Prodrug bezieht.

Am Tag Null werden 24 weibliche C57-Mäuse intraperitoneal mit 5.000.000 SK-OV-3 humanen Eierstock-Adenokarzinomzellen (ATCC HTB-77) in einem Gesamtvolumen von 50 μl (Gruppen A, B, C, D) beimpft. Gruppen A bis D wurden mit 100 μg Plasmid des entsprechenden Lipid-formulierten Plasmids, das gemäß Beispiel 1 formuliert war, einmal täglich, beginnend um 9.00 Uhr am Tag Fünf und an jedem folgenden Tag behandelt. Die Plasmid-Formulierung wurde IV in die Schwanzvene in einem Gesamtvolumen von 200 μl PBS injiziert. Die Behandlung wurde für zwei Wochen fortgesetzt.
Gruppen B und D wurden mit Lipid-formuliertem Ganciclovir, das gemäß Beispiel 4 hergestellt war, einmal täglich, beginnend um 15.00 Uhr am Tag Fünf und an jedem folgenden Tag behandelt. 0,5 mg Ganciclovir (~ 25 mg/kg) wurden IV in die Schwanzvene in einem Gesamtvolumen von 200 μl PBS injiziert. Die Mäse wurden auf die Überlebenden überwacht. Entwickelten sich Tumoren, so wurden die Mäuse geopfert und die Tumoren entnommen und gewogen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die Mäuse der Gruppe D entweder keine Tumoren entwickelten oder ansonsten Tumoren signifikant langsamer als die Mäuse der Kontrollgruppen A, B und C entwickelten.
BEISPIEL 4
Dieses Beispiel veranschaulicht das Protokoll für die Herstellung des Lipidformulierten Ganciclovirs in einer Sphingomyelin/Cholesterol-Lipid-Formulierung.
Für ein 1 ml-Präparat wurden 100 mg (180 μmol) Lipid verwendet, von dem 55 Mol-% Sphingomyelin (99 μmol) und 45 Mol-% Cholesterol (81 μmol) waren (Northern Lipids, Vancouver, BC). Jedes Lipid wird in 1 ml Chloroform gelöst. Die erforderlichen Mengen jedes Lipids werden in ein Röhrchen aliquotiert, um ein 55/45 SM/Chol-Gemisch zu erhalten. Als nächstes werden 4.500 dpm/μmol Lipid von ¹⁴C-CHE (¹⁴C-Cholesterylhexadecylether) zugegeben und das Lipid nahezu bis zur Trockne unter Stickstoff getrocknet. Dies wird über Nacht auf den Lyophylisator aufgebracht, und es wird eine 70/30-% Lösung von HBS/Ethanol hergestellt (HBS in 20 mM Hepes, 145 mM NaCl, pH 7,45). Als nächstes werden 100 mg Ganciclovir (109 mg Ganciclovir-Na, Hoffmann LaRoche Ltd.) in 1 ml an 70/30 % HBS/Ethanol gelöst und dies gut gevortext. Dem werden 42.000 dpm/μmol an 3H-GCV (7,5 μL eines 1 Ci/ml Vorrats) zugegeben, und die Ganciclovirlösung wird dem Lipidfilm zugegeben und gut gevortext. Das Vortexen wird fortgesetzt, bis die Lösung homogen erscheint. Es wird für 5 Zyklen eingefroren/aufgetaut (Flüssigstickstoff und 65°C). Die Kryophiole wird leicht angewärmt, bevor sie in das Wasserbad eingebracht wird. Als nächstes werden 2-10 μl Prä-Extrusionsproben genommen und diese auf die Radio aktivität unter Anwendung des dualen Markierungsprogramms untersucht. Das Endvolumen wird notiert und dieses zur Bestimmung der spezifischen Aktivität sowohl für das Lipid als auch GCV verwendet. Die Probe wird 2 × durch 3 × 100 nm-Filter bei 65 °C bei 350 psi extrudiert. Zu diesem Zeitpunkt wird die Probe ziemlich viskös. 1 mL HBS wird den Proben zugegeben und durch Auf- und Abpipettieren untergemischt. Die Extrusion wird für insgesamt 10 Durchgänge fortgesetzt. 2-10 μl Post-Extrusionsproben werden entnommen und auf die Radioaktivität untersucht. Einige Dialyseröhrchen (MW-Cutoff 12.000-14.000) werden in dH₂O für 15 Min. hydriert. Als nächstes wird die extrudierte Probe in das Röhrchen eingebracht und für 1 Std. gegen 2 l HBS dialysiert. Es wird gegen frischen Puffer ausgetauscht und über Nacht dialysiert. Proben von 2-10 μl werden entnommen und auf die Radioaktivität untersucht und die prozentuale Beladung im Vergleich zu den Prä-Extrusions- und Post-Dialyse-Verhältnissen von ³H/¹⁴C bestimmt. Zum Beispiel: ³H/¹⁴C Prä-Extrusion = 12,0; ³H/¹⁴C-Post-Dialyse = 1,2; 1,2/12,0 × 100 % = 10 % Verkapselung.
BEISPIEL 5
Dieses Beispiel gibt das Protokoll für die stabile Transfektion von B16-Tumorzellen mit HSV-TK zur Verwendung in Beispielen 6 und 7 wieder, wie beschrieben in SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, dritte Auflage, Seite 9-13 bis 9-15, mit den folgenden Modifikationen.
Gemäß der Methode wurden die folgenden Materialien verwendet. Plasmide: pCMVTKIRESneo basiert auf Plasmid pBR322 und enthält einen CMV-Promotor, HSV-TK-Gen, interne Ribosomeneingangsstelle und Neomycin-Resistenzgen. L018 basiert ebenfalls auf pBR322, trägt aber einen CMV-Promotor und ein Luciferase-Gen. Zunächst werden B16-murine Melanomzellen in einem Gewebekulturkolben (T-75) bei 5 × 10⁵ Zellen/Kolben in 10 ml MEM-Medium unter Zugabe von 10 % FBS und Glutamin ausplattiert und über Nacht in einem CO₂-Inkubator bei 37 °C bis zu 70 % Konfluenz gezüchtet. Als nächstes wird das Medium abgesaugt und werden die Zellen mit 3,8 mL frischem Medium pro Kolben 2 Std. vor der Transfektion gefüttert und das Plasmid/Lipid-Lipofektin-(GIBCO BRL)-Aggregat in einem Polystyrol-Röhrchen gemäß den Anleitungen des Herstellers hergestellt. Alternativ wird das Plasmid zu 20 μg/ml in sterilem destilliertem Wasser verdünnt. Luciferase L018-Plasmid wird als eine Kontrolle für die negative Selektion in Geneticin (G418) verwendet, Thymidinkinase (Neomycin) 20A wird für TKneo-stabile Zellen verwendet; das Lipid wird zu 1 mM in sterilem destilliertem Wasser verdünnt; das Lipid wird zu einem Ladungsverhältnis von 1 in sterilem destilliertem Wasser verdünnt (1,2 ml Lipid/8 ml Wasser); ein Volumen an DNA (20 mg/ml) wird einem äquivalenten Volumen an Lipid (CR1) unter Vortexen zugetropft; und der DNA/Lipid-Komplex wird für 30 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Als nächstes werden 1,2 ml DNA/Lipid-Komplex/-T75 dem Kolben zugegeben, dies vorsichtig vermischt und 24 Std. lang im CO₂-Inkubator bei 37 °C inkubiert (Komplex ist 1:4 im Medium verdünnt). Das Medium wird abgesaugt, mit PBS-Puffer gewaschen, und jeder T75-Kolben wird in 2-100 × 20 mm Gewebekultur-Schalen aufgeteilt. 24 Std. nach dem Ausplattieren in die Schalen wird als nächstes das selektive Agens, Geneticin (G418), bei der geeigneten Konzentration zugegeben, um nicht-transfizierte Zellen abzutöten, doch den mit TKneo transfizierten Zellen das Überleben zu ermöglichen. Die Luciferase-Kontrollzellen sollten absterben. Alle 2-3 Tage wird das Medium zur Entfernung von toten Zell-trümmern ausgetauscht. Innerhalb von 10 Tagen sind Klone am Boden der 100 mm-Schale sichtbar, die Neomycin-resistent und TK-positiv sind. Die Klone werden in 1 ml Medium in einer 24-Well-Platte geschabt und in T-75-Kolben expandiert. Zellen, die TK stabil exprimieren, können dann für die lokale, regionale oder systemische Injektion in Mäuse verwendet werden. Um identifizierte Klone auf die TK-Expression zu screenen, werden 2.000 Zellen/Well in eine 96-Well-Platte in einem Volumen von 150 μl ausplattiert und für 48 Std. in einem CO₂-Inkubator bei 37 °C gezüchtet; die spezifische Prodrug für TK, Ganciclovir, wird in einer Verdünnungsreihe über die Platte eingebracht, die zu 2,5-fachen Konzentration angelegt ist, und 100 μl/Well (auf ein Volumen von 150 μl zugegeben) werden hinzugefügt; dies wird 3 Tage lang in einem CO₂-Inkubator bei 37 °C inkubiert, das Medium wird aus den Wells abgesaugt und Alamar Blue wird gemäß den Anleitungen der Hersteller (Biosource International) hinzugefügt (1:10-Verdünnung in Medium); 100 μl/Well werden zugegeben und für 1, 2, 4 Std. inkubiert und die Platten in Zeitintervallen auf dem Fluoreszenz-Plattenlesegerät ausgelesen (550, 595 nm; 750V; 70 Offset; 100 ms Integrationszeit).
BEISPIEL 6

Dieses Beispiel veranschaulicht die Wirkungen von systemisch verabreichtem Lipid-formuliertem Ganciclovir auf das Tumorwachstum in Mäusen mit intradermalen B16-Tumoren, die mit HSV-TK stabil transfiziert sind.

Gruppe	Tumor	Prodrug	Weg	Assay	Zeitpunkt (Assay)	Mäuse pro Gruppe
A	B16	PBS	IV	Tumorvolumen	Täglich	8 C57
B	B16 TK	PBS	IV	Tumorvolumen	Täglich	8 C57
C	B16	LIPO-GCV	IV	Tumorvolumen	Täglich	8 C57
D	B16 TK	LIPO-GCV	IV	Tumorvolumen	Täglich	8 C57

*Es wird angemerkt, dass sich der "Weg" auf die Verabreichung der Prodrug bezieht, d.h. Ganciclovir (GCV).

32 weibliche C57-Mäuse (Harlan Sprague Dawley, Inc., Indianapolis) wurden intradermal in Gruppen A und C mit parenteralen B16-Kontrollzellen (B16), und in Gruppen B und D mit B16-Tumorzellen, die stabil transfiziert waren und HSV-TK exprimierten (B16 TK) (wie zuvor beschrieben präpariert) bei einer Dosis von 150.000 Zellen in einem Gesamtvolumen von 50 μl Phosphat-gepufferter Saline am Tag Null beimpft. Das intradermale Tumorvolumen wurde täglich durch Messung der Länge, Breite und Höhe des Tumors mit Hauttastzirkeln sobald wie möglich und daraufhin jeden Tag bestimmt.
Die Mäuse wurden mit der Ganciclovir-Prodrug, die wie in Beispiel 4 Lipid-formuliert war, einmal alle zwei Tage, beginnend am Tag Vier und an jedem folgenden zweiten Tag behandelt. Die Ganciclovir-Dosis von 0,5 mg (~ 25 mg/kg) wurde IV in einem Gesamtvolumen von 200 μl PBS (Phosphat-gepufferter Saline) injiziert. Die Mäuse erhielten insgesamt neun Behandlungen. Am Tag 21 wurden die Mäuse geopfert.
Die Tumoren wurden entnommen und vor der Fixierung zur Sektionierung gewogen.
Die stabil mit HSV-TK transfizierten intradermalen Tumoren zeigten kein messbares Wachstum, wenn sie systemisch mit Lipid-formuliertem Ganciclovir behandelt waren. Unbehandelte B16-Tumoren, und behandelte B16-Tumoren ohne TK, wurden durch den Wirkstoff nicht beeinflusst.
BEISPIEL 7
Dieses Beispiel wurde zur Bestimmung der Wirkung von Lipid-formuliertem Ganciclovir auf die TK-Genexpression in B16-Tumorzellen, die mit HSV-TK stabil transfiziert waren und intravenös implantiert waren, durchgeführt.

Gruppe Tumor Prodrug Weg Assay Zeitpunkt (Assay) Mäuse pro Gruppe

A B16 TK PBS IV Tumorvolumen Täglich 8 C57

B B16 TK LIPO-GCV IV Tumorvolumen Täglich 8 C57

* Es wird angemerkt, dass sich der "Weg" auf die Verabreichung der Prodrug bezieht, d.h. Ganciclovir (GCV).

16 weibliche C57-Mäuse wurden mit B16-Tumorzellen, die HSV-TK stabil exprimierten, mittels Schwanzvenen-Injektion bei einer Dosis von 150.000 Zellen in einem Gesamtvolumen von 200 μl Phosphat-gepufferter Saline am Tag Null beimpft. Die Mäuse wurden mit der Ganciclovir-Prodrug, die wie in Beispiel 4 Lipid-formuliert war, einmal täglich, beginnend am Tag Zwei und an den beiden folgenden Tagen, behandelt. Die Ganciclovir-Dosis von 0,5 mg (~ 25 mg/kg) wurde IV in einem Gesamtvolumen von 200 μl PBS (Phosphat-gepufferte Saline) injiziert. Die Mäuse erhielten insgesamt drei Behandlungen. Am Tag 21 wurden die Mäuse geopfert und die Tumoren punktbewertet. Die Lebern, Lungen, Milz und Bauchspeicheldrüse wurden fotogra fiert. Es lag eine signifikante Verringerung sowohl der Größe als auch der Anzahl der metastatischen Tumorknötchen vor.
BEISPIEL 8
Dieses Beispiel veranschaulicht die Genexpression in distalen metastatischen Tumoren unter Verwendung der Lipid-Plasmid-Partikel der Formulierung 1.1.
Am Tag Null wurden C57BL/6-Mäuse (Harlan Sprague Dawley, Inc., Indianapolis, IN) mit 300.000 LL/2 (Lewis-Lung-Mauskarzinom) Zellen (ATCC CRL-1642) durch intravenöse/Schwanzvenen-Injektion mit einem Gesamtvolumen von 200 μl beimpft. Am Tag 10 wurden die Mäuse mit den Plasmid-Lipid-Partikeln der Formulierung 1.1 intravenös injiziert. Die Partikel tragen das Plasmid L018, welches ein standardmäßiges Konstrukt ist, das das Luciferase-Gen, geknüpft an den CMV-Promotor, enthält. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Plasmid-Injektion wurden die Mäuse geopfert, und die Organe und Tumoren wurden schnell in Flüssigstickstoff eingefroren, dann bei -70 °C gelagert. Die Organe/Tumoren werden auf das Luciferase-Gen untersucht, um die Übertragung auf das Organ/Tumorstelle nachzuweisen. Die Ergebnisse der Bioverteilung für die Organe sind in 2 gezeigt. Die Ansammlung an der Tumorstelle ist in 3 dargestellt. Southern-Blot-Daten zeigen das Vorhandensein von intaktem Plasmid an der Tumorstelle, das auf mindestens 96 Std. verlängert ist, an. Das Zellprotein aus den Organen/Tumoren wird ebenfalls präpariert und auf Luciferase gemäß standardmäßiger Techniken untersucht. Ein Zeitverlauf der Genprodukt-Aktivität an distalen (metastatischen) Tumorstellen ist in 4 gezeigt.
BEISPIEL 9
Dieses Beispiel veranschaulicht die systemische Vektorübertragung und Genexpression in vivo in einem Humantumor.
SCID-Mäuse (Harlan Sprague Dawley, Inc., Indianapolis, IN) wurden mit 1 × 10⁶ LS180 humanen Dickdarm-Adenokarzinomzellen (ATTC CL-187) mittels subkutaner Injektion am Tag Null beimpft. Am Tag 11 wurden die Mäuse in Gruppen A, B und C intravenös mit den angegebenen Dosen an L018-Plasmid in Lipid-Formulierung 1.1 in einem Gesamtvolumen von 200 μl injiziert. Am Tag 17 wurden die Mäuse in Gruppen D und E intravenös mit L018-Plasmid in Lipid-Formulierung INEX 320 unter Verwendung von C8- oder C20-PEG-Cer gemäß dem Beispiel 1 in einem Gesamtvolumen von 200 μl injiziert. Zu den angegebenen Zeitpunkten nach der Plasmidinjektion wurden die Mäuse geopfert und die Organe (Leber, Milz und Lungen) und Tumoren geerntet. Die Expression des Enzyms Luciferase wurde gemäß standardmäßigen Techniken an allen Proben untersucht.

Die erhaltenen Daten weisen die ausgezeichnete Transfektion und Expression des Reportergens Luciferase, die in vivo in einem Humantumor unter Verwendung der Lipid-Nukleinsäure-Partikel der vorliegenden Erfindung erzielt wurde, nach (siehe 5).

Gruppe	Formulierung	Assay	Zeitpunkt	Mäuse pro Gruppe
A	1,1 (75 μm)	Luciferase	48 Std.	5
B	1,1 (100 μm)	Luciferase	48 Std.	5
C	1,1 (125 μm)	Luciferase	48 Std.	5
D	320 (100 μm)	Luciferase	24 Std.	4
E	320 (100 μm)	Luciferase	48 Std.	4
F	PBS	Luciferase	48 Std.	1

BEISPIEL 10
Dieses Beispiel zeigt die systemische Verabreichung und Expression an einer in vivo-Tumorstelle eines Vektors, der das HSV-TK-Gen enthält, unter Verwendung eines Lipid-Nukleinsäure-Partikels, der gemäß Beispiel 1 hergestellt war.
C57-Mäuse werden intraperitoneal mit 100.000 B16-Tumorzellen in einem Gesamtvolumen von 200 μl PBS am Tag Null beimpft. Am Tag 14 werden die Testmäuse mit Formulierung 1.2 (100 μg DNA in 500 μL PBS), das wie in Beispiel 1 hergestellt war, injiziert. Der verwendete Plasmid-Vektor ist pINEX-TK10 (7) wie früher be schrieben. 24 Std. später wurden die Mäuse geopfert, und die Tumoren wurden isoliert, innerhalb von 5 Min. fixiert und in Paraffin-Sektionen unter Anwendung standardmäßiger Techniken präpariert. Die Expression des HSV-TK-Gens an der distalen Tumorstelle wird durch in situ RNA/RNA-Hybridisation unter Anwendung von im Fachgebiet standardmäßigen Techniken untersucht. Eine dieser Techniken ist nachstehend zusammengefasst.
Das Muster der HSV-TK-Genexpression innerhalb der peritonealen Tumoren ist in 6(A) und (B) gezeigt. In allen Fällen der Genexpression wird ein positives Signal als ein zellulärer Gehalt von B16-Zellen oder Endothelzellen beobachtet. Positiv gefärbte Zellen sind in der mit Blutgefäßen assoziierten proliferativen Zone oder dem peripheren Bereich lokalisiert.
BEISPIEL 11

Dieses Beispiel beschreibt die Behandlung von Tumoren unter Anwendung der Methode der Erfindung. Insbesondere zeigt dieses Beispiel die Wirkung von pINEX-TK10 in Formulierung 1.1 in der Hemmung des Wachstums von MCA-207-Tumoren auf die Behandlung mit Ganciclovir hin. Die allgemeine Methode ist in 8 dargestellt.

Gruppe	Formulierung	GCV	Weg*	Assay	Zeitpunkt	Anzahl der Mäuse
A	PBS	PBS	IP	Volumen/CTL	-	6 C57
B	Leere 1.1	PBS	IP	Volumen/CTL	-	6 C57
C	1.1 TK	PBS	IP	Volumen/CTL	-	6 C57
D	1.1 TK	GCV	IP	Volumen/CTL	-	6 C57

*Es wird angemerkt, dass sich der "Weg" auf die Verabreichung der Prodrug bezieht, d.h. Ganciclovir.

24 weibliche C57-Mäuse wurden mit 100.000 MCA-207 Fibrosarkom-Tumorzellen (bereitgestellt von S. Rosenberg, National Cancer Institute, Frederick/Bethesda, MD) mittels intradermaler Injektion am Tag Null beimpft. Die Tumorzellen waren kultiviert und präpariert worden gemäß den standardmäßigen Techniken unter Verwendung von RPMI-Medium mit 10 % fötalem Rinderserum (siehe zum Beispiel Current Protocols in Molecular Biology). Beginnend am Tag 5 wurden alle Tiere mit der Lipid/-therapheutischen Nukleinsäure-Formulierung behandelt, die in der obigen Tabelle aufgelistet sind. Die Formulierung wurde intravenös durch die Schwanzvene verabreicht. 80 μg an pINEX-TK10-DNA wurden in einem Gesamtvolumen von 200 μl injiziert. Die Behandlungen wurden an Tagen 5, 7, 9, 11 und 13 verabreicht.
Beginnend am Tag 5 wurden alle Tiere mit Ganciclovir zweimal täglich behandelt. 1 mg (~ 50 mg/kg) wurde intraperitoneal in einem Gesamtvolumen von 200 μl PBS injiziert. Die Behandlungen wurden zweimal täglich für 12 Tage fortgesetzt (siehe 9(A)). Die Mäuse wurden auf das Tumorwachstum überwacht.
9(B) stellt in quantitativerer Weise die Wirkung der Behandlungen dar. Die mit HSV-TK in Formulierung 1.1 behandelten Mäuse zeigen stark reduzierte Tumoren im Vergleich zu den behandelten Kontrollmäusen. Nicht gezeigt sind die Daten für die Kontrollmäuse, die zeigen, dass die Behandlung mit leeren Liposomen und Ganciclovir keine Wirkung auf die Tumorreduktion hat. 9(C) zeigt die Wirkung der Behandlung auf Testmäuse im Vergleich zu Kontrollmäusen am Tag 16 nach der Tumorinokulation.
BEISPIEL 12
Dieses Beispiel veranschaulicht das Protokoll für die in situ RNA/RNA-Hybridisation von in vivo-Tumoren, die durch systemisch verabreichtes Plasmid transfiziert sind.
Die Tumoren wurden für die in situ-Untersuchung durch Paraffin-Einbettung und Färbung präpariert. Spezifisch wurden die peritonealen Tumoren in 4 % Paraformaldehyd/PBS-Fixativ (Sigma Chemical Co.) gesammelt und über Nacht bei 4 °C fixiert. Serielle 5 μm-Sektionen wurden vorgenommen, nachdem die Proben in abgestuften Ethanollösungen dehydriert, in Chloroform gegeben und in Paraffinwachs (Paraplast Plus, Fisher) eingebettet worden waren.
Wenn gebrauchsfertig, wurden die präparierten Proben bei zwei Xylolaustäuschen für 10 Min., jeweils gefolgt von einer Rehydratation in bis zu 50 % Ethanol abgestuften Ethanollösungen, behandelt. Die Proben wurden durch standardmäßiges Spülen, Inkubieren mit 0,1 M Triethanolamin-(TEA)-Puffer, pH 8,0, enthaltend 0,25 % (v/v) Essiganhydrid, gefolgt von einer Behandlung bei 56 °C für mindestens 60 Min. in Hybridisationspuffer vorhybridisiert, der enthielt: 40 % entionisiertes Formamid, 10 % Dextransulfat, 1 × Denhardt-Lösung (0,02 % Ficoll, 0,02 % Polyvinylpyrrolidon, 10 mg/ml RNase-freies Rinderserumalbumin), 4 × SSC, 10 mM DTT, 1 mg/ml Hefe-t-RNA und 1 mg/ml denaturierte und gescherte DNA aus Lachssperma.
Die Markierung der RNA-Sonde durch in vitro-Transkription von DNA war wie folgt. Das Fragment aus 599 bp (532-1131) von HSV-TK (pTK10) wurde in Kpnl- und BamHI-Stellen des Vektors pGEM-7Zf(+) (pTK11) kloniert. Das Plasmid wurde mittels standardmäßiger Techniken kloniert und unter Verwendung von Qiagen 500 (Qiagen, Inc.) präpariert. Für die Antisense-Sonde wurde dieses Plasmid durch Schneiden mit Kpnl an dem ursprünglichen 5'-Ende der cDNA HSV-TK linearisiert und gereinigt. Dieselbe Logik wurde für die Sense-(Kontroll-)-Sonde angewendet (d.h. Schneiden an der Seite des 3-Endes des Inserts durch BssHII oder BamH oder SacI). Das Plasmid wurde durch Ethanolpräzipitation gereinigt. Das Folgende wurde dann in einem sterilen, RNase-freien 1,5 ml-Mikrozentrifugierröhrchen auf Eis gemischt: 4 μl (4 μg) gereinigte, linearisierte Plasmid-DNA, 5 μl an 10 × konzentriertem DIG RNA-Markierungsgemisch (geliefert vom Hersteller), 10 μl an 5 × konzentriertem Transkriptionspuffer (400 mM Tris-HCk (pH 8,0, 20 °C), 60 mM MgCl₂, 100 mM Dithiothreitol (DTT), 20 mM Spermidin), 2 μl RNasin, 3 μl RNA-Polymerase (SP6 für Antisense oder T7 für Sense) und steriles, redestilliertes Wasser, um das gesamte Reaktionsvolumen auf 50 μl zu bringen.
Die Komponenten wurden gemischt und kurz zentrifugiert und dann für 2 Std. bei 37 °C (für T7 RNA-Polymerase) oder bei 40 °C (für SP6-Polymerase) inkubiert. Nach der Inkubation wurden 3 μl DNase I, RNase-frei, und 1 μl RNasin dem Röhrchen zugegeben und für 15 Min. bei 37 °C inkubiert. Dann wurden 2,5 μl an 0,5 M EDTA (pH 8,0) dem Röhrchen zugegeben, um die Polymerisationsreaktion zu stoppen.
Das markierte RNA-Transkript wird durch Vornehmen der folgenden Schritte präzipitiert. Dem Reaktionsröhrchen werden 6,25 μl an 4 M LiCl und 180 μl an vorgekühltem (-20 °C) 100 % Ethanol zugegeben und dies über Nacht bei -70 °C inkubiert. Das Röhrchen wird für 15 Min. bei 4 °C zentrifugiert (bei 13.000 × g). Der Überstand wird weggegossen. Das Pellet wird mit 50 μl eiskaltem 70 % (v/v) Ethanol gewaschen. Das Röhrchen wird für 5 Min. bei 4 °C (bei 13.000 × g) zentrifugiert. Der Überstand wird weggegossen und das Pellet bei Raumtemperatur getrocknet. Das RNA-Pellet wird für 30 Min. bei 37 °C oder (R.T.) in 20 μl DEPC-(Diethylpyrocarbonat)-behandeltem, sterilem, redestilliertem Wasser gelöst, dem 20 μl entionisiertes Formamid und 1 μl RNasin zugesetzt ist. Das Transkript wird bei -20 °C oder -70 °C aufbewahrt.
Eine akkurate Quantifizierung der DIG-markierten RNA, die in der Markierungsreaktion erhalten wurde, ist für optimale und reproduzierbare Ergebnisse bei verschiedenen Membran- oder in situ-Hybridisationstechniken am wichtigsten. Eine zu hohe Sondenkonzentration in dem Hybridisationsgemisch bewirkt üblicherweise einen Hintergrund, wohingegen eine zu geringe Konzentration zu schwachen Signalen führt. Die Auswertung der Ausbeute kann in einem Seite-an-Seite-Vergleich der DIG-markierten Proben-Nukleinsäure mit einer DIG-markierten Kontrolle, die in den Markierungs-Kits bereitgestellt wird, vorgenommen werden. Verdünnungsreihen von beiden werden präpariert und auf ein Stück Membran aufgetupft. Anschließend wird die Membran kolorimetrisch detektiert. Der direkte Vergleich der Intensitäten der Probe und der Kontrolle erlaubt die Einschätzung der Markierungsausbeute.
Daraufhin wird die Hybridisationsreaktion vorgenommen. Der Vor-Hybridisationspuffer wird von den vorhybridisierten Trägern ablaufen gelassen, und jede Sektion wird mit 200 μl Hybridisationspuffer, enthaltend 0,2-1 ng an Digoxigenin-markierter RNA-Sonde (0,2 ng/μl) überschichtet. Die Proben werden mit einem 24 × 30 mm hydrophoben Deckglas aus Kunststoff bedeckt. Die Sektionen werden bei 56 °C über Nacht in einer Feuchtekammer inkubiert. Die Waschgänge können einen RNase-Schritt umfassen, welcher den Hintergrund reduziert, aber auch das Signal vermindert. Es ist wichtig, die Gewebesektionen zu allen Zeitpunkten während der Wasch gänge feucht zu halten. Die Träger werden in 2 × SSC bei 55 °C für 30 Min. gewaschen, in 50 % Formamid, 2 × SSC bei 65 °C für 30 Min. gewaschen; in 2 × SSC 3-mal bei 37 °C für jeweils 5 Min. gewaschen; in RNase 10 μg/ml, 1 × Waschlösung bei 37 °C für 30 Min. gewaschen; in 50 % Formamid, 2 × SSC bei 65 °C für 30 Min. gewaschen; in 2 × SSC bei 37 °C für 15 Min. gewaschen; in 2 × SSC 5-mal bei 37 °C für jeweils 5 Min. gewaschen.
Nach der Hybridisation werden die Zellen mit DIG-spezifischem Antikörper inkubiert. Die Träger werden in TBS bei RT für 30 Min. gewaschen. Die Sektionen werden mit Blockierlösung (TBS und 2 % Ziegenserum) bei RT für 1 Std. inkubiert. Die Blockierlösung wird abgegossen und die Sektionen werden mit Ziegen-Anti-DIG-alkalische Phosphatase-(Fab-Fragment)-Verdünnung 1:500 bei RT für 1 Std. inkubiert. Die Träger werden in TBS bei RT für 30 Min. gewaschen. Die Träger werden in Substratpuffer (100 mM Tris-HCl (pH 9,5), 100 mM NaCl, 50 mM MgCl₂) bei RT für 30 Min. gewaschen. Eine Farblösung wird hergestellt, die enthält: 10 ml Substratpuffer, 50 μl NBT (Nitroblau-Tetrazolium) und 37 μl BCIP. Die Träger werden in die Farblösung bei Raumtemperatur für 1-2 Std. oder bei 4 °C für 2-3 Tage eingetaucht. Die Träger werden mit Wasser gewaschen und mittels Lichtmikroskopie untersucht. Die Ergebnisse sind in 6(A) und (B) gezeigt.
BEISPIEL 13
Dieses Beispiel veranschaulicht die Behandlung von Tumoren unter Anwendung der Methoden und Zusammensetzungen der Erfindung. Insbesondere zeigt dieses Beispiel die langfristige Überlebensrate von Mäusen, die MCA-207-Tumoren tragen, die mit einer Abfolge von intravenösem pINEX-TK10 in Formulierung 1.1, kombiniert mit intraperitonealen Injektionen von Ganciclovir (GCV), behandelt wurden.
Das pINEX-TK10-Konstrukt, wie oben beschrieben, wurde in Formulierung 1.1 formuliert, wie oben beschrieben. C57-Mäuse wurden mit 100.000 MCA-207 Fibrosarkom-Tumorzellen (bereitgestellt von S. Rosenberg, National Cancer Institute, Frederick/Bethesda, MD) durch intradermale Injektion am Tag Null beimpft. Die Tumorzellen waren kultiviert und präpariert worden gemäß der standardmäßigen Techniken unter Verwendung von RPMI-Medium mit 10 % fötalem Rinderserum (siehe zum Beispiel Current Protocols in Molecular Biology).
Es waren insgesamt 20 Mäuse in jeder der Behandlungsgruppen, und die Gruppen wurden wie folgt behandelt: Gruppe I, Ganciclovir allein (GCV); Gruppe II, leere SPLPs und Ganciclovir (leeres SPLP + GCV); Gruppe III, formuliertes Plasmid allein (INXC-gTK); und Gruppe IV, formuliertes Plasmid, zusammen mit Ganciclovir (INXC-gTK + GCV). Die Lipid/therapeutische Nukleinsäure-Formulierung wurde intravenös durch die Schwanzvene verabreicht. 80 μg an pINEX-TK10-DNA wurden in einem Gesamtvolumen von 200 μl PBS injiziert. Die Behandlungen mit der Lipid/therapeutischen Nukleinsäure-Formulierung wurden an Tagen 5, 7, 9, 11 und 13 verabreicht. Die Tiere wurden mit Ganciclovir zweimal täglich behandelt. 1 mg (~ 50 mg/kg) wurde intraperitoneal in einem Gesamtvolumen von 200 μl PBS injiziert. Die Behandlungen wurden zweimal täglich für 12 Tage fortgesetzt. Die Mäuse wurden auf die langfristig Überlebenden überwacht.
10 zeigt die Wirkung der Behandlung in quantitativer Weise. Mäuse, die mit HSV-TK in Formulierung 1.1, zusammen mit Ganciclovir, behandelt waren, weisen eine stark erhöhte langfristige Überlebensrate auf. Lediglich mäßige Wirkungen wurden im Anschluss an die Behandlung mit HSV-TK in Formulierung 1.1 alleine im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen beobachtet. Solche Ergebnisse weisen die erfolgreiche Anwendung eines nicht-viralen Gentransfersystems, das eine Regression in distalen Tumoren auf die intravenöse Verabreichung hin produzieren kann, nach.
BEISPIEL 14

Dieses Beispiel veranschaulicht die Wirksamkeit der systemischen Verabreichung von TK303 in dem BALG/c CT26-Tumormodell, einem kolorektalen Tumormodell

Gruppe	Formulierung	GCV	Weg	Assay	Anzahl der Mäuse
A	HBS	PBS	IP	Volumen/CTL	8 BALG/c
B	Leere 303	PBS	IP	Volumen/CTL	8 BALG/c
C	Leere 303	GCV	IP	Volumen/CTL	8 BALB/c
D	303 TK	PBS	IP	Volumen/CTL	8 BALB/c
E	303 TK	GCV	IP	Volumen/CTL	8 BALB/c

Leere 303 ist die Formulierung INEX 303 (Beispiel 1) ohne DNA; 303 TK ist die Formulierung INEX 303, enthaltend pTK10 (7).

Am Tag Null wurden 48 weibliche BALB/c-Mäuse mit 100.000 CT26-Tumorzellen (ID) unter Anwendung des in den obigen Beispielen beschriebenen Protokolls beimpft. Beginnend am Tag 5 wurden alle Tiere mit der Formulierung behandelt, die IV durch die Schwanzvene verabreicht wurde. 50 μg DNA wurden IV in einem Gesamtvolumen von 200 μl PBS injiziert. Die Behandlung wurde an jedem zweiten Tag für die nächsten acht Tage fortgesetzt.
Gruppen C und E wurden mit Lipid-formuliertem Ganciclovir einmal täglich am Tag fünf und an jedem folgenden Tag behandelt. 1,5 mg (~ 75 mg/kg) wurden IV in die Schwanzvene in einem Gesamtvolumen von 300 μl PBS injiziert. Die Mäuse wurden auf die Überlebenden überwacht. Entwickelten sich Tumoren, so wurden die Mäuse geopfert und die Tumoren entnommen und gewogen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die Mäuse der Gruppe E entweder keine Tumoren entwickelten oder ansonsten die Tumoren wesentlich langsamer als die anderen Mäuse entwickelten (siehe 11).
BEISPIEL 15

Dieses Beispiel veranschaulicht die Wirksamkeit der systemischen Verabreichung von TK303 in dem BALG/c CT26-Tumormodell, d.h. einem kolorektalen Tumormodell.

Gruppe	Formulierung	GCV	Weg	Assay	Anzahl der Mäuse
A	HBS	PBS	IP	Volumen	8 BALG/c
B	Leere 303	PBS	IP	Volumen	8 BALG/c
C	Leere 303	GCV	IP	Volumen	8 BALG/c
D	303 TK FS*	PBS	IP	Volumen	8 BALG/c
E	303 TK FS*	GCV	IP	Volumen	8 BALG/c
F	303 TK	PBS	IP	Volumen	8 BALG/c
G	303 TK	GCV	IP	Volumen	8 BALG/c

* Die bei diesem Experiment verwendeten Vektoren waren wie folgt: "TK" bezieht sich auf pTK10, welches die Thymidinkinase-Kodierungssequenz in ihrem korrekten Leseraster aufweist, so dass das Thymidinkinase-Protein exprimiert wird. "TK FS" weist die im Leseraster verschobene Thymidinkinase-Kodierungssequenz relativ zu dem Translationsinitiationscodon auf, so dass kein Thymidinkinase-Protein produziert wird.

Am Tag Null wurden 65 weibliche BALB/c-Mäuse mit 100.000 CT26-Tumorzellen (ID) unter Anwendung des in den obigen Beispielen beschriebenen Protokolls beimpft. Beginnend am Tag Fünf wurden alle Tiere mit der Formulierung behandelt, die IV durch die Schwanzvene verabreicht wurde. 50 μg DNA wurden IV in einem Gesamtvolumen von 200 μl PBS injiziert. Die Behandlung wurde an jedem zweiten Tag für die nächsten acht Tage fortgesetzt.
Gruppen C, E und G wurden mit Lipid-formuliertem Ganciclovir einmal täglich am Tag Fünf und an jedem folgenden Tag behandelt. 1,0 mg (~ 50 mg/kg) wurde IV in die Schwanzvene in einem Gesamtvolumen von 200 μl PBS injiziert. Die Mäuse wurden auf die Überlebenden überwacht. Entwickelten sich Tumoren, so wurden die Mäuse geopfert und die Tumoren entnommen und gewogen. Die Mäuse in Gruppe G, die GCV und das Lipid-formulierte TK-Konstrukt erhielten, und somit das TK-Protein exprimierten, zeigten eine deutliche Verminderung der Tumorwachstumsrate (siehe 12).
Es ist selbstverständlich, dass die obige Beschreibung lediglich der Veranschaulichung und nicht einer Beschränkung dienen soll. Viele Ausführungsformen werden den Fachleuten des Gebiets auf die Lektüre der obigen Beschreibung hin erkennbar sein. Der Rahmen der Erfindung soll daher nicht unter Bezugnahme auf die obige Beschreibung bestimmt sein, sondern soll statt dessen unter Bezugnahme auf die Ansprüche im Anhang, zusammen mit dem vollen Umfang der Äquivalente, zu denen diese Ansprüche berechtigen, festgelegt sein.

Claims

Verwendung eines Serum-stabilen Nukleinsäure-Lipidpartikels, umfassend einen Nukleinsäure-Anteil, der vollständig eingekapselt ist innerhalb des Lipidanteils, in der Herstellung eines Medikaments für die systemische Behandlung einer metastatischen Neoplasie in einem Säuger durch intravenöse Injektion an einer Injektionstelle, die physisch getrennt ist von der Neoplasie in dem Säuger.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure ein exprimierbares Gen umfasst.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das exprimierbare Gen für ein Mitglied codiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus therapeutischen Polypeptiden und therapeutischen Polynukleotiden.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Gen ein Mitglied ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Genen, die für Suizidenzyme, Toxine und Ribozyme codieren.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das Gen für ein Mitglied codiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Herpes simplex-Virus-Thymidinkinase (HSV-TK), Cytosindeaminase, Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase, Purinnukleosidphosphorylase, Cytochrom P450 2B1 und Analoga davon.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das Gen exogen für den Säuger ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das Gen endogen für den Säuger ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das Gen für ein Mitglied codiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Proto-Onkogenen, Zytokinen, immunstimulatorischen Proteinen und anti-angiogenen Proteinen.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das Gen ein Mitglied ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus IL-2, IL-12, IL-15 und GM-CSF.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei sich eine therapeutisch wirksame Menge des Gens an der Neoplasie angesammelt hat.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Nukleinsäure-Lipidpartikel ein protonierbares Lipid mit einer pKa im Bereich von etwa 4 bis etwa 11 umfasst.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei das protonierbare Lipid ein Mitglied ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus DODAC, DODAP, DODMA, DOTAP, DOTMA, DC-Chol, DMRIE, DSDAC und Gemischen davon.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Nukleinsäure-Lipidpartikel ein Lipidkonjugat umfasst, das die Aggregation während der Formulierung verhindert.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei das Lipidkonjugat ein Mitglied ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus PEG-Lipiden und PAO-Lipiden.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei das Lipidkonjugat mit einer äußeren Lipidmonoschicht reversibel verbunden ist, und wobei das Lipidkonjugat aus der äußeren Lipidmonoschicht bei einer schnelleren Rate als PEG-CerC20 herauswechselt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Nukleinsäure-Lipidpartikel im wesentlichen frei von Detergenzien und organischen Lösungsmitteln ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei sich eine therapeutisch wirksame Menge des Nukleinsäure-Lipidpartikels an der Neoplasie ansammelt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei eine therapeutische Wirkung an der Stelle der Neoplasie nachgewiesen wird.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei die therapeutisch wirksame Menge mehr als etwa 0,5 % einer verabreichten Dosis umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Nukleinsäure-Lipidpartikel einen Durchmesser von etwa 50 nm bis etwa 200 nm aufweist.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Nukleinsäure-Lipidpartikel einen Durchmesser von etwa 60 nm bis etwa 130 nm aufweist.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei die Nukleinsäure-Lipidpartikel von gleichmäßiger Größe sind.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Nukleinsäure-Lipidpartikel ein Verhältnis von Nukleinsäure zu Lipid von größer als etwa 3 mg Nukleinsäure pro mmol Lipid aufweist.
Verwendung nach Anspruch 23, wobei das Partikel ein Verhältnis von Nukleinsäure zu Lipid von größer als etwa 14 mg Nukleinsäure pro mmol Lipid aufweist.
Verwendung nach Anspruch 23, wobei das Partikel ein Verhältnis von Nukleinsäure zu Lipid von größer als etwa 25 mg Nukleinsäure pro mmol Lipid aufweist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure zu wenigstens 90 % intakt bleibt, wenn der Partikel, enthaltend etwa 1 μg DNA, mit etwa 100 U DNAse 1 in Verdaupuffer bei 37°C für 30 min. behandelt wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament zur gleichzeitigen oder aufeinander folgenden Anwendung mit einem chemotherapeutischen Mittel ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Injektion wenigstens einmal pro acht Wochen durchgeführt wird.
Verwendung von a) einem Serum-stabilen Nukleinsäure-Lipidpartikel, das für ein Genprodukt codiert, umfassend eine Nukleinsäure, die vollständig eingekapselt ist innerhalb des Lipids, und b) einer ersten Verbindung, die durch das Genprodukt zu einer zweiten Verbindung prozessiert wird, wobei eine neoplastische Zelle empfindlicher ist gegenüber der zweiten Verbindung als gegenüber der ersten Verbindung, in der Herstellung von Medikamenten für die gleichzeitige oder aufeinander folgende Anwendung in der Behandlung einer metastatischen Neoplasie durch Sensibilisieren der neoplastischen Zelle für die erste Verbindung, wobei das Medikament, umfassend ein Nukleinsäure-Lipidpartikel, systemisch durch intravenöse Injektion an einer Injektionsstelle verabreicht wird, die physisch von der neoplastischen Zelle getrennt ist, und wobei das Partikel die neoplastische Zelle transfiziert.
Verwendung nach Anspruch 29, wobei die erste Verbindung in einem Lipid formuliert wird.
Verwendung nach Anspruch 29, wobei das Genprodukt ein Mitglied ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus therapeutischen Polypeptiden und therapeutischen Polynukleotiden.
Verwendung nach Anspruch 29, wobei das Genprodukt ein Mitglied ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Suizidenzymen, Toxinen und Ribozymen.
Verwendung nach Anspruch 29, wobei das Genprodukt ein Mitglied ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Herpes simplex-Virus-Thymidinkinase (HSV-TK), Cytosindeaminase, Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase, Purin nukleosidphosphorylase, Cytochrom P450 2B1 und Analoga davon.
Verwendung nach Anspruch 29, wobei eine therapeutische Wirkung an der Stelle der neoplastischen Zelle nachgewiesen wird.