DE69433462T2

DE69433462T2 - Adeno-assoziierte virale (avv) liposomen und damit zusammenhängende verfahren

Info

Publication number: DE69433462T2
Application number: DE1994633462
Authority: DE
Inventors: Ramila Philip; Jane Lebkowski
Original assignee: Gencell SAS
Current assignee: Gencell SAS
Priority date: 1993-09-13
Filing date: 1994-09-13
Publication date: 2004-11-18
Anticipated expiration: 2014-09-14
Also published as: KR100421753B1; FI961146A0; PT719343E; CA2171318A1; KR960705055A; AU692470B2; SG48099A1; WO1995007995A3; US5861314A; US5861171A; EP0719343B1; FI961146A; DK0719343T3; WO1995007995A2; JPH09505982A; NO961010L; DE69433462D1; AU7717594A; NO961010D0; ATE257177T1

Description

TECHNISCHER BEREICH
Genmodifikation
Die vorliegende Erfindung betrifft die zelluläre Manipulation und insbesondere die Verwendung kationischer Liposome zur Erleichterung der Transfektion durch adenoassoziierte virale (AAV) Plasmide.
TECHNISCHER HINTERGRUND
Die Transfektion eukaryotischer Zellen ist eine Technik, die für die Studie und Entwicklung der Gentherapie immer bedeutender wird. Fortschritte in der Gentherapie sind größtenteils von der Entwicklung von Liefersystemen abhängig, die DNA effizient in eine Target-Zelle einführen können. Es wurde eine Reihe von Verfahren für die dauerhafte oder kurzzeitige Expression heterologer Gene in kultivierten Zelltypen entwickelt. Dazu gehören Transduktionstechniken, die ein Trägermolekül oder Virus verwenden.
Die meisten Gentherapiestrategien stützen sich auf eine Transduktion durch Transgeninsertion in retrovirale oder DNA-Virusvektoren. Adenovirus- und andere DNA-Virusvektoren können jedoch Infektionsfolgen hervorrufen, nach wiederholten Verabreichungen immunogen sein und nur eine begrenzte Menge an Insert-DNA verpacken.
Von den Virusvektorsystemen hat sich das rekombinante adenoassoziierte virale (AAV) Transduktionssystem als eines der wirksamsten Vektorsysteme für eine dauerhafte und effiziente Beförderung von Genen in eine Vielfalt von Säugetierzelltypen erwiesen (Lebkowski, J. S., et al., „Adeno-associated virus: A vector system for efficient introduction and integration of DNA into a variety of mammalian cell types", Mol. Cell. Biol. (1988) 8: 3988–3996). Es ist gut dokumentiert, dass sich AAV-DNA in zelluläre DNA als eine bis mehrere Tandemkopie(n) integriert, die mit zellulärer DNA durch terminale invertierte Wiederholungen (ITR) der viralen DNA verbunden sind, und dass die physikalische Struktur integrierter AAV-Genome nahe legt, dass virale Insertionen gewöhnlich als multiple Kopien mit einer Tandem-Kopf- zu -Schwanz-Orientierung über die AAV terminalen Wiederholungen erscheinen (Kotin, R. M., et al., „Site-specific integration of adeno-associated virus", Proc. Natl. Acad. Sci. (1990) 87: 2211–2215). Folglich sind die AAV terminalen Wiederholungen (ITR) ein wesentlicher Bestandteil des AAV-Transduktionssystems.
Rekombinante adenoassoziierte virale (AAV) Vektoren unterscheiden sich zwar von adenoviralen Vektoren, doch sind die Transgen-DNA-Größenbeschränkungs- und -Verpackungseigenschaften die gleichen wie bei jedem anderen DNA-Virusvektor.
AAV ist ein lineares einzelsträngiges DNA-Parvovirus, das eine Koinfektion durch ein zweites nicht verwandtes Virus benötigt, um eine produktive Infektion zu erreichen. AAV weist zwei Sätze funktioneller Gene auf: rep-Gene, die für eine virale Replikation notwendig sind, und strukturelle Kapsid-Proteingene (Hermonat, P. L., et al., „Genetics of adeno-associated virus: Isolation and preliminary characterization of adeno-associated type 2 mutants", J. Virol. (1984) 51: 329–339). Die rep- und Kapsid-Gene von AAV können durch ein erwünschtes DNA-Fragment ersetzt werden, um AAV-Plasmid-DNA zu erzeugen. Eine Transkomplementation von rep- und Kapsid-Genen ist notwendig, um einen rekombinanten Virus-Vorrat zu erzeugen. Nach einer Transduktion mit einem solchen Virus-Vorrat setzt sich das rekombinante Virus in dem Nukleus frei und integriert sich in dem Wirtsgenom durch seine molekularen Enden.
Trotz umfangreicher Fortschritte leiden Transduktionstechniken unter veränderlicher Effizienz, der beträchtlichen Gefahr einer möglichen Rekombination mit endogenem Virus, zellulärer Toxizität und immunologischen Wirtsresponse-Reaktionen. Es besteht somit Bedarf an nichtviralen DNA-Transfektionsprozeduren.
Liposome werden zum Einkapseln und Liefern einer Vielfalt von Materialien zu Zellen verwendet, einschließlich Nucleinsäuren und Viruspartikel (Faller, D. V. und D. Baltimore, „Liposome encapsulation of retrovirus allows efficient superinfection of resistant cell lines", J. Virol. (1984) 49: 269–272).
Es wurde gezeigt, dass vorgebildete Liposome, die synthetische kationische Lipide enthalten, stabile Komplexe mit polyanionischer DNA bilden (Felgner, P. L., et al., „A highly efficient, lipid-mediated DNA transfection procedure"; Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84: 7413–7417). Kationische Liposome, Liposome, die irgendein kationisches Lipid beinhalten, die das membranfusionsfördernde Lipid Dioctadecyl-Dimethyl-Ammonium-Bromid (DDAB) enthielten, transferierten heterologe Gene effizient in eukaryotische Zellen (Rose, J. K., et al., „A new cationic liposome reagent mediating nearly quantitative transfection of animal cells", Biotechniques (1991) 10: 520–525). Kationische Liposome können eine starke zelluläre Expression von Transgenen oder mRNA vermitteln, indem sie in eine Vielfalt kultivierter Zelllinien geführt werden (Malone, R., et al., „Cationic liposome mediated RNA transfection", Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86: 6077–6081).
Es hat sich gezeigt, dass ecotrope und amphotrope, verpackte Retrovirusvektoren kultivierte Zellen in Anwesenheit kationischer Liposome wie Lipofektin (BRL, Gaithersburg, MD) und in Abwesenheit spezifischer Rezeptoren infizieren (Innes, C. L., et al., „Cationic liposomes (Lipofectin) mediate retroviral infection in the absence of specific receptors", J. Virol. (1990) 64: 957–961).
Zwar haben nichtvirale Techniken einige der Probleme der viralen Systeme überwunden, doch besteht weiterhin Bedarf an einer verbesserten Transfektionseffizienz in nichtviralen Systemen, Bedarf an einer Erhöhung der Auswahl transfizierbarer Zelltypen, Bedarf an einer Verlängerung der Expressionsdauer in transfizierten Zellen und Bedarf an einer Erhöhung der Expressionsstärke im Anschluss an eine Transfektion. In gewissem Maße wird eine bessere Effizienz durch die Verwendung von Promotor-Enhancer-Elementen in den Plasmid-DNA-Konstrukten erzielt (Philip, R., et al., „In vivo gene delivery: Efficient transfection of T lymphocytes in adult mice", J. Biol. Chem. (1993) 268: 16087–16090).
Immunzerstörung von Tumorzellen
Die Verwendung von Interleukin-2 (IL-2) bei der Behandlung neoplastischer Zellen, wie metastatische Nierenzellkarzinome (RCC), ist eine Möglichkeit zur Durchführung einer immunvermittelten Zerstörung humaner Neoplasmen. Obwohl dauerhafte komplette Remissionen erreicht wurden, war die Gesamtreaktionsrate gering.
Während der Erprobung von rIL-2 (Chiron Corp., Emeryville, CA) an Patienten mit Krebs war die dosisbegrenzende Toxizität von Verabreichungsweg und -plan abhängig. Eine hochdosierte IL-2-Bolus-Verabreichung war mit einer bedeutenden Toxizität verbunden, einer Toxizität, die nahezu jedes Organsystem involvierte. Ferner wurde bei Patienten mit einem ECOG-Leistungszustand von 0 eine Mortalitätsrate von 4% in Verbindung mit einer hochdosierten IL-2-Verabreichung festgestellt. Eine Übersicht über den ECOG-Leistungszustand ist z. B. in Oken, Am. J. Clin. Oncol. (CCT) 5: 649–655 (1982) „Toxicity and Response Criteria of the Eastern Cooperative Oncology Group", Tabelle 2, S. 654, enthalten.
Im Unterschied zur Bolus-Verabreichung wird in Bezug auf die Verwendung einer niedriger dosierten (1 – 7 × 10⁶ Cetus-Einheiten/M²/d) kontinuierlichen intravenösen Infusion (CIV) von IL-2 über eine klinische Wirksamkeit und geringere Toxizität berichtet, was auf ein verbessertes Sicherheitsprofil in der adoptiven Immuntherapie von fortgeschrittenem Krebs schließen lässt (West, W. H., et al., „Constant Infusion of Recombinant Interleukin-2 in Adoptive Immunotherapy of Advanced Cancer", (1987) N. Engl. J. Med. 316: 898).
Zu Zellelementen, die potentiell die Immunzerstörung von Tumoren in Kombination mit IL-2 verbessern, gehören Lymphokin-aktivierte Killer-(LAK)-Zellen und zytotoxische T-Lymphozyten-(CTL)-Zellen wie zytotoxische tumorinfiltrierende Lymphozyten-(TIL)-Zellen.
Tumorinfiltrierende Lymphozyten (TIL) sind in erster Linie T-Lymphozyten, die gewöhnlich in enger Apposition zu einer Tumormasse zu finden sind, und die in vitro isoliert, expandiert und aktiviert werden können. TIL-Zellen sind in der Studie der Neoplasie-Behandlung von Interesse, da diese Zellen Affinität zu Tumorzellen haben. Demzufolge sind zytotoxische TIL von besonderem Interesse, da diese Zellen Affinität zum Tumor haben und außerdem zytotoxische Qualitäten besitzen.
Im Rahmen einer Behandlungsmethodik werden TIL zusammen mit exogenem IL-2 in einen Wirt reinfundiert (s. z. B. US-Patent Nr. 5,126,132 von Rosenberg, erteilt am 30. Juni 1992). Eine Behandlung mit IL-2 in Kombination mit TIL hat in einigen Fällen zu dauerhaften kompletten Remissionen in der Behandlung fortgeschrittener Malignitäten geführt.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Kationische Liposome wurden zur Erleichterung adenoassoziierter viraler (AAV) Plasmidtransfektionen von primären und kultivierten Zelltypen verwendet. AAV-Plasmid-DNA, die mit Liposomen komplexiert war, wies eine mehrfach stärkere Expression als Komplexe mit Standardplasmiden auf. Darüber hinaus hielt die Expression 30 Tage ohne jegliche Selektion an. AAV-Plasmid : Liposom-Komplexe induzierten Transgenexpressionsstärken, die mit solchen vergleichbar waren, die durch rekombinante AAV-Transduktion erzielt werden. Eine starke Genexpression wurde in frisch isolierten CD4⁺ und CD8⁺ T-Zellen, tumorinfiltrierenden Lymphozyten und CD34⁺ Stammzellen von normalem humanem pheripherem Blut beobachtet.
Primäre Brust-, Eierstock- und Lungentumorzellen wurden mit den AAV-Plasmid-DNA : Liposom-Komplexen transfiziert. Die transfizierten Tumorzellen waren in der Lage, nach der letalen Bestrahlung ein Transgenprodukt zu exprimieren. Die Transfektionseffizienz lag zwischen 10 und 50%, wie anhand der β-Galactosidasegenexpression beurteilt wurde. Die Fähigkeit, Transgene in primären Tumorzellen zu exprimieren, wird zur Herstellung eines Tumorimpfstoffs und zur Erzeugung von Lymphoidzellen genutzt, die hochspezifische Modulationen der zellulären Immunantwort bei Krebs und AIDS und in Gentherapien ermöglichen.
Es wird hierin eine Zusammensetzung zur genetischen Manipulation offenbart. Die Zusammensetzung umfasst ein Liposom, das Lipidmaterial beinhaltet, und adenoassoziierte Virus-DNA, wobei die adenoassoziierte Virus-DNR ein Plasmid sein kann und das Plasmid pMP6-IL2, wie in 3 dargestellt, oder pACMV-IL2 sein kann, wie in 1 dargestellt. Die adenoassoziierte Virus-DNA kann eine terminale invertierte Wiederholung oder zwei oder mehrere terminale invertierte Wiederholungen umfassen. Liegen zwei terminale invertierte Wiederholungen in der adenoassoziierten Virus-DNA vor, dann kann ein genetisches Material von Interesse zwischen zwei terminalen invertierten Wiederholungen integriert werden; ferner kann ein Promotor zwischen zwei terminalen invertierten Wiederholungen integriert werden, der Promotor kann ein unmittelbar früher CMV-Promotor, ein unmittelbar später CMV-Promotor, ein früher CMV-Promotor, ein ADA-Promotor oder ein TK-Promotor sein. Die Zusammensetzung kann eine genetische Sequenz von Interesse umfassen, wie zum Beispiel eine genetische Sequenz eines IL-2-Gens oder eines β-Gal-Gens. Das Lipidmaterial kann ein kationisches Lipid beinhalten. Offenbart werden mit der Zusammensetzung transfizierte Zellen.
Es wird hierin ein Verfahren zur Einführung einer genetischen Sequenz von Interesse in eine Wirtszelle offenbart. Das Verfahren umfasst das Bereitstellen einer Zusammensetzung, die Liposom, adenoassoziierte virale DNA und eine genetische Sequenz von Interesse umfasst, und das Inkontaktbringen der Zusammensetzung mit einer Wirtszelle, die genetisches Material umfasst, so dass die genetische Sequenz von Interesse in die Wirtszelle eingeführt wird. Die Wirtszelle kann eine CD34⁺ Stammzelle, eine T-Zelle wie eine CD3⁺, CD4⁺ oder CD8⁺ Zelle, eine Zelle einer Tumorzelllinie, wie eine Blasen-, Prostata-, B-Lymphom- oder Urnierenzelllinie, oder eine Primärtumorzelle sein.
Der Schritt des Bereitstellens einer Zusammensetzung kann das Bereitstellen eines Liposoms umfassen, das selbst kationisches Lipid beinhaltet. Der Schritt des Bereitstellens einer Zusammensetzung kann das Bereitstellen adenoassoziierter Virus-DNA umfassen, die ein Plasmid beinhaltet, und das Plasmid kann pMP6-IL2, wie in 3 dargestellt, oder pACMV-IL2 sein, wie in 1 dargestellt. Das Verfahren zur Einführung der genetischen Sequenz von Interesse in eine Zelle kann ferner einen Schritt zum Integrieren des genetischen Materials von Interesse in das genetische Material der Wirtszelle umfassen.
Es wird ein Verfahren zur Verwendung einer Zusammensetzung offenbart, umfassend ein Liposom, das Lipidmaterial beinhaltet, adenoassoziierte Virus-DNA, eine genetische Sequenz von Interesse. Das Verfahren umfasst das Verfügen über einen Patienten mit einer Krankheit; und Bereitstellen einer Zusammensetzung, die Liposom, adenoassozierte virale DNA und eine genetische Sequenz von Interesse umfasst. Das Verfahren umfasst ferner den Schritt des Inkontaktbringens der Zusammensetzung mit einer Wirtszelle, so dass die genetische Sequenz von Interesse in die Wirtszelle eingeführt wird. Der Schritt des Inkontaktbringens kann in vivo erfolgen, und die Wirtszelle ist eine Zelle des Patienten. Das Inkontaktbringen kann aber auch ex vivo erfolgen; erfolgt das Inkontaktbringen ex vivo, dann umfasst das Verfahren ferner den Schritt des Lieferns der Wirtszelle, die die eingeführte genetische Sequenz von Interesse beinhaltet, zum Patienten. Der Schritt des Verfügens über einen Patienten kann das Verfügen über einen Patienten mit einer Krankheit wie einem Neoplasma, einer Infektion, wie z. B. einer HIV-Infektion, einer Autoimmunkrankheit oder einer genetischen Anomalie wie ein fehlendes oder defektes Gen umfassen. Der Schritt des Bereitstellens einer Zusammensetzung kann das Bereitstellen einer genetischen Sequenz von Interesse umfassen, die ein Peptid, ein Antisense-Oligonucleotid oder RNA kodiert. Der Schritt des Bereitstellens einer Zusammensetzung kann das Bereitstellen eines Plasmids wie pMP6-IL2, wie in 3 dargestellt, oder pACMV-IL2, wie in 1 dargestellt, umfassen. Der Schritt des Bereitstellens einer Zusammensetzung kann das Bereitstellen einer genetischen Sequenz von Interesse umfassen, die eine genetische Sequenz beinhaltet, die ein Cytokin, einen Costimulationsfaktor, ein MHC-Klasse-I-Molekül, ein tumorspezifisches Antigen oder ein tumorassoziiertes Antigen kodiert. Der Schritt des Verfügens über einen Patienten kann das Verfügen über einen Patienten mit einer malignen neoplastischen Krankheit oder einer HIV-Infektion umfassen; der Schritt des Bereitstellens einer Zusammensetzung kann das Zuführen einer genetischen Sequenz von Interesse, die IL-2-Genommaterial beinhaltet, zu solchen Patienten umfassen. Der Schritt des Verfügens über einen Patienten kann das Verfügen über einen Patienten mit einer malignen neoplastischen Krankheit umfassen; der Schritt des Bereitstellens einer Zusammensetzung kann das Zuführen einer genetischen Sequenz, die das MDR-I-Gen beinhaltet, zu solchen Patienten umfassen. Der Schritt des Inkontaktbringens der Zusammensetzung mit einer Wirtszelle kann das Inkontaktbringen mit einer Wirtszelle umfassen, die eine neoplastische Zelle, eine Knochenmarkblutbildungszelle oder eine periphere Blutzelle ist der Schritt des Inkontaktbringens kann das Inkontaktbringen mit einer Wirtszelle umfassen, die ein tumorinfiltrierender Lymphozyt, eine Zelle einer Tumorzelllinie oder eine Primärtumorzelle ist.
Es wird ein Expressionsvektor offenbart, der eine genetische Sequenz umfasst, die im Grunde der in 3 dargestellten entspricht; es wird ein Expressionsvektor offenbart, der eine genetische Sequenz umfasst, die im Wesentlichen der genetischen Sequenz in 3 entspricht; und es wird ein Expressionsvektor offenbart, der eine genetische Sequenz umfasst, die der genetischen Sequenz in 3 entspricht. Es wird eine Zelle offenbart, die mit dem Expressionsvektor genmodifiziert wird, der eine genetische Sequenz umfasst, die im Grunde der in 3 entspricht; die Zelle kann eine periphere Blutzelle, eine Knochenmarkszelle, ein tumorinfiltrierender Lymphozyt, eine Zelle einer Tumorzelllinie oder eine Primärtumorzelle sein.
Offenbart wird ein Expressionsvektor, der eine genetische Sequenz umfasst, die im Grunde der genetischen Sequenz des Plasmids pMP6 entspricht; ein Expressionsvektor, der eine genetische Sequenz umfasst, die im Wesentlichen der genetischen Sequenz des Plasmids pMP6 entspricht; ein Expressionsvektor mit einer genetischen Sequenz, die der genetischen Sequenz des Plasmids pMP6 entspricht. Ein Expressionsvektor, der eine genetische Sequenz umfasst, die im Grunde der genetischen Sequenz des Plasmids pMP6 entspricht, kann ferner eine genetische Sequenz von Interesse umfassen; eine Zelle kann mit einem solchen Expressionsvektor genmodifiziert werden; die Zelle kann eine periphere Blutzelle, eine Knochenmarkszelle, ein tumorinfiltrierender Lymphozyt, eine Zelle einer Tumorzelllinie oder eine Primärtumorzelle sein.
Es wird ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins offenbart. Das Proteinherstellungsverfahren umfasst das Bereitstellen einer Zusammensetzung, die Liposom, adenoassoziierte Virus-DNA und eine genetische Sequenz von Interesse beinhaltet. Die Zusammensetzung wird mit einer Wirtszelle in Kontakt gebracht, die genetisches Material beinhaltet, so dass die genetische Sequenz von Interesse in die Wirtszelle eingeführt wird. Das Herstellungsverfahren umfasst ferner den Schritt des Exprimierens eines Proteins, das durch die genetische Sequenz von Interesse kodiert ist. Die Wirtszelle kann eine CD34⁺ Stammzelle, eine T-Zelle, eine Zelle einer Tumorzelllinie oder eine Primärtumorzelle sein; die Wirtszelle kann ein tumorinfiltrierender Lymphozyt, eine CD3⁺, CD4⁺ oder CD8⁺ Zelle sein. Die Wirtszelle kann von einer Tumorzelllinie stammen, die eine Blasen-, Prostata-, B-Lymphom- oder Urnierenzelllinie ist. Der Schritt des Bereitstellens einer Zusammensetzung, die Liposom beinhaltet, kann das Bereitstellen einer Zusammensetzung umfassen, die kationisches Lipid beinhaltet. Der Schritt des Bereitstellens einer Zusammensetzung kann das Bereitstellen von adenoassoziierter Virus-DNA umfassen, die ein Plasmid wie pMP6-IL2, wie in 3 dargestellt, oder pACMV-IL2 beinhaltet, wie in 1 dargestellt. Das Verfahren zur Herstellung eines Proteins kann einen weiteren Schritt des Integrierens des genetischen Materials von Interesse in das genetische Material der Wirtszelle umfassen. Der Schritt des Exprimierens eines Proteins kann das Exprimieren eines Lymphokin-Analogs umfassen. Der Schritt des Exprimierens eines Proteins kann das Exprimieren von IL-2, β-Galactosidase-Chloramphenicol-Acetyl-Transferase oder MDR I umfassen.
Es wird ein Verfahren zur Zubereitung einer therapeutischen Zellzusammensetzung zur Behandlung eines Patienten mit einem Neoplasma offenbart. Das Verfahren umfasst das Gewinnen einer Zellzusammensetzung, die Effektor-T-Lymphozytenzellen beinhaltet; Inkontaktbringen der Zellzusammensetzung mit spezifischen Bindungsproteinen, wobei die spezifischen Bindungsproteine kovalent an eine Oberfläche gebunden sind, so dass Effektor-T-Lymphozytenzellen, die spezifisch durch die spezifischen Bindungsproteine gebunden sind, spezifisch an die Oberfläche gebunden werden, und Entfernen von Zellen, die ungebunden sind, während gleichzeitig spezifisch gebundene Effektor-T-Lymphozytenzellen an der Oberfläche gebunden bleiben. Das Verfahren zur Zubereitung einer therapeutischen Zellzusammensetzung kann ferner den Schritt des Expandierens der Effektor-T-Lymphozytenzellen umfassen, so dass eine im Wesentlichen homogene Phänotyp-Population erzeugt wird; der Expansionsschritt kann ferner das Kultivieren der Effektor-T-Lymphozytenzellen mit Tumorzellen umfassen; die Tumorzellen können bestrahlt werden; die Tumorzellen können mit einem Vektor genmodifiziert werden, der eine Expressionskassette für Interleukin-2 umfasst. In dem Verfahren zur Zubereitung einer therapeutischen Zellzusammensetzung kann der Gewinnungsschritt das Gewinnen von Effektor-T-Lymphozytenzellen umfassen, die tumorinfiltrierende Lymphozyten sind, die tumorinfiltrierenden Lymphozyten können von einem neoplastischen Gewebe stammen, das autolog oder allogen ist. Der Schritt des Inkontaktbringens kann das Inkontaktbringen der Zellzusammensetzung mit spezifischen Bindungsproteinen, die für CD4, CD8 spezifisch sind, oder einem Gemisch spezifischer Bindungsproteine umfassen, die für CD4 und CD8 spezifisch sind. Das Verfahren zur Zubereitung einer therapeutischen zellulären Zusammensetzung kann ferner den Schritt des Freisetzens der spezifisch gebundenen Zellen umfassen, wobei die Zellenfreisetzung im Wesentlichen frei von den spezifischen Bindungsproteinen ist. Die spezifischen Bindungsproteine können monoklonale Antikörper umfassen. Das Verfahren kann ferner den Schritt des Genmodifizierens der spezifisch gebundenen Zellen umfassen, wie zum Beispiel durch Transfizieren mit einem Plasmid, das IL-2-Genommaterial beinhaltet, woraus sich eine therapeutische zelluläre Zusammensetzung ergibt, die ohne systemische Verabreichung von Interleukin-2 einen therapeutischen Effekt hat. Es wird eine im Wesentlichen homogene Population von Zellen offenbart, die gemäß dem Verfahren hergestellt werden. Es wird die Verwendung einer Population offenbart, die gemäß dem Verfahren hergestellt wird, zur Behandlung eines Patienten mit einem Neoplasma wie einem Nierenzellkarzinom, infiltrierenden Duktuskarzinom, Melanom, Ovarialkarzinom, Lungenkarzinom oder Plattenepithelzellkarzinom.
Es wird eine im Wesentlichen homogene Population von CD8⁺ TIL-Zellen offenbart, wobei die Zellen der Population externe Oberflächen umfassen und die externen Oberflächen der Zellen im Wesentlichen antikörperfrei sind; die Zellen der Population können wenigstens 80% homogen in Bezug auf CD8 sein.
Es wird ein Verfahren zur Zubereitung einer therapeutischen Zellzusammensetzung zur Behandlung eines Patienten mit einem Neoplasma offenbart, das die Gewinnung neoplastischer Zellen, die Genmodifizierung der Zellen mit einer Zusammensetzung umfasst, die Liposom, das Lipidmaterial beinhaltet, und adenoassoziierte Virus-DNA und ferner eine genetische Sequenz von Interesse umfasst, wie zum Beispiel eine Sequenz, die ein Lymphokin kodiert. Es wird auch Verwendung einer Zusammensetzung offenbart, die gemäß diesem Verfahren zubereitet wird.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1. Plasmidkarten von drei Plasmiden, die in den vorliegenden Studien verwendet werden. Das Plasmid pACMV-IL2 enthielt den CMV-Promotor, IL-2 cDNA und Ratten- Präproinsulin sowie SV40 Polyadenylierungssequenzen, die mit pBC12/CMV-IL2 Plasmid identisch waren; des Weiteren hatte pACMV-IL2 auch AAV terminale invertierte Sequenzwiederholungen (ITR) an beiden Enden. Das Plasmid pA1CMVIX-CAT wurde mit CMV-Promotor konstruiert und CAT-Gen wurde zwischen den beiden AAV ITR eingesetzt.
2. Diese Figur stellt eine ausführliche Restriktionskarte der IL-2-Ausgestaltung des pMP6 Plasmids (pMP6-IL2) dar.
3A–G. Diese Figur stellt die DNA-Sequenz des pMP6-IL2 Plasmids dar. In der Figur zeigen die Felder a–e aufeinander folgende Teile der Sequenz. Auf Teile der pMP6-IL2 Sequenz, die mit bekannten DNA-Sequenz übereinstimmen, wird hingewiesen; die entsprechende Sequenzinformation steht direkt unterhalb der Sequenzinformation für das pMP6-IL2 Plasmid. Nicht markierte Sequenzen sind von Linkern.
4a–b. 4a stellt die Stärke der durch Plasmid-DNA : Liposom-Komplexe induzierten Genexpression dar. Verschiedene IL-2-Plasmidkonstrukte wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit überprüft, eine Genexpression mit einer Ratten-Blasen- und einer Ratten-Prostatazelllinie zu induzieren, wenn die Konstrukte mit Liposomen komplexiert waren. In beiden Zelllinien wies das AAV-Plasmidkonstrukt die höchste Expressionsstärke auf. Die Stärke wird in Pikogramm je ml je 10⁶ Zellen ausgedrückt. 4b stellt den Zeitverlauf der durch die AAV-Plasmid : Liposom-Komplexe induzierten Genexpression dar. Für einen Vergleich der Transgenexpressionsdauer wurde die Prostatazelllinie mit AAV-Plasmid (pACMV-IL2) transfiziert und das entsprechende Kontrollplasmid (pBC12/cMV-IL2) wurde mit Liposomen komplexiert. Die Überstände wurden zu verschiedenen Zeitpunkten aufgefangen und per Elisa hinsichtlich der IL- 2-Werte untersucht. Die IL-2-Werte sind in Picogramm/ml/10⁶ Zellen in 24-h-Kultur ausgedrückt.
5a–b. Ein Vergleich der AAV-Plasmid : Liposom-Komplex-vermittelten Transfektion mit einer rekombinanten AAV-Transduktion. Zur Bestimmung, ob die durch die AAV-Plasmid : Liposom-Komplexe induzierten Genexpressionsstärken der rAAV-Transduktion entsprachen, wurden mit einer Prostatazelllinie (5a) und einer Blasenlinie (5b) Transfektion und Transduktion des IL-2-Gens verglichen. IL-2-Werte wurden per Elisa beurteilt. Die Werte sind in Pikogramm/ml/10⁶ Zellen in 24-h-Kultur ausgedrückt.
6. Expression des IL-2-Gens durch Lipofektion mit ARV-Plasmid : Liposom-Komplexen verschiedener Primärtumorzellen. Eine Lungen-, eine Eierstock- und zwei Brusttumorproben wurden von frischen Tumorbiopsien isoliert. IL-2-Werte wurden per Elisa gemessen. Die Werte sind in Pikogramm/ml/10⁶ Zellen in 24-h-Kultur angegeben.
7a–b. Expression von IL-2 durch Zellen, die erfindungsgemäß transfiziert und dann einer letalen Bestrahlung ausgesetzt wurden. Zur Bestimmung des Bestrahlungseffektes auf die Genexpression wurden die Prostatazelllinie (7a) und die Primärbrustzellen ( 7b) transfiziert und hinsichtlich einer Genexpression nach einer letalen Bestrahlung beurteilt, wie hierin beschrieben wird. Überstände wurden 24, 48, 72 und 96 Stunden nach der Bestrahlung aufgefangen und hinsichtlich IL-2-Werte getestet. Die IL-2-Werte sind in pg/ml/10⁶ Zellen in 24-h-Kultur ausgedrückt.
8. Effizienz der AAV : Liposom-Transfektion, gemessen anhand β-Gal-Genexpression. Das β-Gal-Reportergen wurde zur Beurteilung der Transfektionseffizienz auf Zellbasis verwendet. Die Prostatazelllinie wurde zur Transfektion verwendet, wie hierin beschrieben wird. Die Daten geben den prozentualen Anteil von Fluoreszenzpositiven Zellen an.
9a–d. Dünnschichtchromatographiestudien, die transfizierte T-Lymphozyten darstellen. Blut wurde von Spendern mit der Bezeichnung A oder B gewonnen. Peripheres Blut des Spenders A oder B wurde zum Isolieren von T-Zellen und zur Transfektion verwendet. Frisch von peripherem Blut eines Spenders isolierte primäre T-Zellen wurden hinsichtlich einer Transgenexpression unter Verwendung von AAV-Plasmid-DNA : Liposom-Komplexen getestet. T-Lymphozyten wurden als CD3⁺ (9a) oder CD5/8⁺ (9b) oder als CD4⁺ (9c) oder CD8⁺ (9d) Populationen mit AIS MicroCELLectoren fraktioniert. Die relevanten Zellen wurden aufgefangen und wie hierin beschrieben kultiviert. Anschließend wurden 5 – 10 × 10⁶ Zellen plattiert und transfiziert mit 50 Mikrogramm der AAV-Plasmid-DNA und 50 oder 100 nmol an Liposomen, um ein Verhältnis zwischen DNA und Liposomen von 1 : 1 oder 1 : 2 zu erhalten. Die Zellen wurden 3 Tage nach der Transfektion geerntet. Der normalisierte Proteingehalt der Extrakte wurde mit einem chromatographischen Test auf CAT-Aktivität geprüft.
10. Dünnschichtchromatographie von CD34⁺ Stammzellen von peripherem Blut, die mit AAV-Plasmid : Liposomen transfiziert wurden. Die Zellen wurden 3 und 7 Tage nach der Transfektion geerntet. Der normalisierte Proteingehalt der Extrakte wurde mit einem chromatographischen Test auf CAT-Aktivität geprüft.
11a–b. Verstärkte Chemilumineszenz-(ECL)-Southern-Analyse von genomischer DNA von mit AAV-Plasmid-DNA : Liposom-Komplexen transfizierten Klonen. In 11a wurden Proben mit Bam HI und Hind III verdaut und mit IL-2 sondiert. Für die Daten in 11b wurden Proben mit Bam HI verdaut und mit IL-2 sondiert. Bei allen analysierten Klonen lag das IL-2-Gen vor, wie anhand der 0,685 kb Banden demonstriert wird. In den 11a–b ist:

Bahn 1: 1 kb Leiter

Bahn 2: Plasmid, zerschnitten mit Bam HI/HindIII (9a) und BamHI/pvuII (9b).

Bahn 3: R33 nicht transfiziert

Bahnen 4–11: Klone

12a–b. Southernanalyse (³²P) von Klon 1A11 und 1B11. Nach dem Southern-Blotting wurde der in 12a dargestellte Filter mit einem 0,68 kb IL2 Bam HI/Hind II Fragment von pACMV-IL-2 sondiert. In 12a ist:

Bahn 1:	Klon 1A11, zerschnitten mit Bam HI/Hind III
Bahn 2:	Klon 1B11, zerschnitten mit Bam HI/Hind III
Bahn 3:	Klon R33, zerschnitten mit Bam HI/Hind III
Bahn 4:	Klon 1A11, zerschnitten mit Bam HI
Bahn 5:	Klon 1B11, zerschnitten mit Bam HI
Bahn 6:	Klon R33, zerschnitten mit Bam HI
Bahn 7:	Klon 1A11, zerschnitten mit Hind III
Bahn 8:	Klon 1B11, zerschnitten mit Hind III
Bahn 9:	Klon R33, zerschnitten mit Hind III
Bahn 10:	leer
Bahn 11:	pACMV-IL2 Plasmid, zerschnitten mit Bam HI/Hind III
Bahn 12:	pACMV-IL2 Plasmid, zerschnitten mit Hind III/pvuII
Bahn 13:	pACMV-IL2 Plasmid, zerschnitten mit Bam HI/pvuII

Für die Daten in 12b wurde der Filter mit einem 0,85 kb pvuII/HindIII (AAV ITR/CMV) Fragment des Plasmids pACMV-IL2 sondiert. In 12b ist:

Bahn 1:	Klon 1A11, zerschnitten mit smaI
Bahn 2:	Klon 1B11, zerschnitten mit smaI
Bahn 3:	Klon R33, zerschnitten mit smaI
Bahn 4:	Klon 1A11, zerschnitten mit pvuII/Hind III
Bahn 5:	Klon 1B11, zerschnitten mit pvuII/Hind III
Bahn 6:	Klon R33, zerschnitten mit pvuII/Hind III
Bahn 7:	pACMV-IL2, zerschnitten mit Bam HI/Hind III
Bahn 8:	pACMV-IL2, zerschnitten mit Hind III/pvuII
Bahn 9:	pACMV-IL2, zerschnitten mitsmaI
Bahn 10:	1kb Leiter

13. Diese Figur stellt eine T-Zell-Rezeptor-(TCR)-Repertoireanalyse mit RNAase-Schutz von Brustkrebs-TIL dar, die mit autologem Tumor, mit IL-2-transduziertem Tumor und mit IL-2 alleine expandiert wurden. In den Achsen der Figur ist V_β ein variables Segment der β-Kette des TCR; C_β ist das konstante Segment der β-Kette des TCR; auf der horizontalen Achse stehen A, B und C für verschiedene Patienten.
14. Diese Figur stellt die Proliferation von Brustkrebstumor infiltrierenden Lymphozyten (TIL) dar; die Daten wurden 5 Tage nach der IL-2-Gentransfektion erhalten.
15. Diese Figur stellt die Effizienz der Genexpression in Brustkrebs-TIL dar, die mit dem pMP6 Plasmid transfiziert wurden, das das Neomycin-Resistenzgen und das Thy 1.2 Gen (pMP6/neo/Thy1.2) anstelle des Gens für IL-2 beinhaltete. Das pMP6/neo/Thy1.2 Plasmid wurde mit DDAB : DOPE-Liposomen komplexiert. Die Liposomzusammensetzungen waren die gleichen Zusammensetzungen wie die für die Daten in 14.
16. In dieser Figur werden Stärke und Dauer der Transgenexpression nach Transfektionen mit verschiedenen Plasmidkonstrukten verglichen. Die Prostatatumorzelllinie R3327 wurde mit Standardplasmid (pBC12/CMV-IL2) oder Plasmid (pACMV-IL2) transfiziert, das mit DDAB : DOPE-Liposomen komplexiert war. Überstände wurden zu verschiedenen Zeitpunkten aufgefangen und per Elisa in Bezug auf IL-2-Werte geprüft. Die IL-2-Werte sind in pg/ml/10⁶ Zellen in 24-h-Kultur ausgedrückt.
17. Diese Figur stellt die Southern-Blot-Analyse von chromosomaler DNA von R3327 Zellen dar, die entweder mit dem AAV-Plasmid (pACMV-IL2) oder dem Standardplasmid (pBC12/CMV-IL2) transfiziert wurden. Der Blot wurde mit dem 0,685 kb Bam HI/Hind III Fragment des IL-2-Gens sondiert. C = DNA von nicht transfizierten Zellen. Das IL-2-Insert ist in der letzten Bahn dargestellt.
18. Die Figur zeigt die Ergebnisse einer intrazellulären Prüfung der Transfektionseffizienz des IL-2-Gens in der Prostatazelllinie R3327. Die Zellen wurden mit AAV IL-2-Plasmid transfiziert, das mit DDAB : DOPE-Liposomen komplexiert war (1 : 1 oder 1 : 2 Zusammensetzung). Transfizierte Zellen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten für intrazelluläre IL-2-Proteinwerte gefärbt. Die Daten stellen den prozentualen Anteil positiver Zellen dar, die IL-2-Protein exprimieren. Nicht transfizierte Zellen wurden als negative Kontrollen genommen, und die Werte der Kontrollen wurden von den Werten transfizierter Gruppen subtrahiert.
19a–b. Diese Figur stellt die Expression von IL-2 durch bestrahlte Zellen der Prostatatumorzelllinie ( 19a) und durch bestrahlten Primärbrusttumor (19b) dar. Primärbrustzellen und Zellen der Prostatazelllinie wurden transfiziert und hinsichtlich der Genexpression nach einer letalen Bestrahlung beurteilt. Überstände wurden 24, 48, 72 und 96 Stunden nach der Bestrahlung aufgefangen und hinsichtlich der IL-2-Werte getestet. Die IL-2-Werte werden in pg/ml/10⁶ Zellen in 24-h-Kultur ausgedrückt.
VERFAHREN ZUR DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Die Studien, die hierin zum ersten Mal offenbart werden, untersuchten den Transport von AAV-Plasmid-DNA in Zellen durch ein System, das keine virale Transduktion beinhaltete. Alternativ wurden im Rahmen eines erfindungsgemäßen Verfahrens verschiedene Säugetierzelltypen durch die Verwendung von Liposomen, die AAV-Material beinhalteten, effizient transfiziert. Die vorliegende Offenbarung betrifft die Transfektion und nutzt das elegante Trägersystem der Lipofektion zusammen mit dem effizienten Transduktionsvermögen des AAV-Plasmid-Konstrukts. Vorteilhafterweise wurden kationische Liposomen als ein Mittel zur Erleichterung des Eintritts von AAV-Plasmid-DNA in Zellen in Abwesenheit von rep- und Kapsid-Transkomplementation, rekombinantem Virus oder Wildtyp-AAV verwendet. Ein erfindungsgemäßes Lipofektionsverfahren wurde zur Beurteilung der Effizienz der Genexpression ausgewertet. Die vorliegenden Daten demonstrierten die Fähigkeit zur Transfektion unmodifizierter Stammzellen, unmodifizierter Primärlymphoidzellen wie T-Zellen, einer Vielfalt von frisch isolierten Tumorzellen und kultivierten Säugetierzelltypen, mit einer hohen Effizienz hinsichtlich kurzzeitiger und anhaltender Expression von DNA. Die Fähigkeit, unmodifizierte T-Zellen, wie tumorinfiltrierende Lymphozyten, unmodifizierte Stammzellen, Zellen von Tumorzelllinien und Primärtumorzellen effizient zu transfizieren, wird in der Technik zum ersten Mal offenbart.
I. AUSGANGSMATERIALIEN UND ANGEWANDTE VERFAHREN
A. Zelllinien
Eine Ratten-Prostatazelllinie (R3327) und Ratten-Blasenzelllinie (MBT-2) wurden von Dr. Eli Gilboa, Duke University, erhalten. Beide Zelllinien wurden in mit 5% fetalem Rinderserum (FBS) angereichertem RPMI- 1640 Medium gehalten. Die Zelllinie 293, die eine humane Urnierenzelllinie ist, die durch Adenovirus Typ 5 transformiert wurde, wurde von der ATCC erhalten (Graham, F. L., et al., „Characteristics of a human cell live transformed by DNA from human adenovirus type 5", J. Gen. Virol. (1977) 36: 59–72). Die Zelllinie 293 wurde in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium wachsen gelassen, das mit 10% FBS angereichert war.
B. Zellpräparation von Primärtumorzellen
Primäre Lungen-, Eierstock- und drei Brusttumorzellen wurden von festen Tumoren von Patienten erhalten. Die Tumorproben wurden in kleine Stücke zerkleinert und in 200 ml AIM V Medium (Gibco) verdaut, das mit 450 u/ml Kollagenase IV (Sigma), 10,8 K Einheiten/ml DNase I (Sigma) und 2000 u/ml Hyaluronidase V (Sigma) angereichert war (Topolian, S. L., et al., „Expansion of human tumor infiltrating lymphocytes for use in immunotherapy trials", J. Immunol. Methods (1987) 102: 127–141). Nach einem 1-2-stündigen Verdau wurden die Zellen mit einem Glashomogenisator (Bellco) homogenisiert. Die Zellen wurden dreimal in DPBS-CMF (Whittaker) gewaschen. Die Lymphozyten wurden von nichtlymphoiden Zellen durch Auffangen auf einem AIS MicroCELLector-CD5/8-Gerät (AIS, Santa Clara, CA) separiert. Nichtadhärente Zellen (hauptsächlich Tumorzellen) wurden entfernt und in RPMI 1640 kultiviert, das mit 2 mM L Glutamin, 100 u/ml Penicillin-Streptomycin und 10% FBS angereichert war. Tumorzellen wurden 2 bis 4 Wochen lang vor der Transfektion kultiviert.
C. Präparation von einkernigen peripheren Blutzellen
Einkernige periphere Blutzellen (PBMC) von gesunden Kontrollpatienten wurden von Buffy Coats (Stanford University Blood Bank, Stanford, CA) mit Lymphoprep (Nycomed, Norwegen) isoliert.
T-Zellen, T-Zellen-Subsets oder CD34⁺ Zellen wurden weiter mit AIS MicroCELLectoren (Applied Immune Sciences, Santa Clara, CA) isoliert, umfassend Oberflächen, an die kovalent gebundene spezifische Bindungsproteine (wie monoklonale Antikörper) gebunden sind. Kurz, PBMCs wurden zu 15 × 10⁶ Zellen je ml in 0,5% Gamimmune (Miles, Inc., Elkhart, IN) resuspendiert und auf gewaschene CD3, CD4, CD8, CD5/8 oder CD34 AIS MicroCELLectoren gegeben. Nach 1 Stunde wurden nichtadhärente Zellen von den AIS MicroCELLectoren entfernt. Vollmedium, RPMI 1640 (Whittaker) mit 10% fetalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin und 100 u/ml Penicillin/Streptomycin, wurde zu den adhärenten Zellen in den AIS MicroCELLectoren gegeben. Nach 2–3 Tagen in einer befeuchteten Umgebung mit 5% CO₂ und 37°C wurden adhärente Zellen entfernt und zur Transfektion präpariert.
D. Plasmidpräparation
Ein erstes in den vorliegenden Studien verwendetes Plasmid war (pACMV-IL2): dieses Plasmid enthielt das humane Interleukin-2-Gen (IL-2) als IL-2 cDNA und das unmittelbar frühe Promotor-Enhancer-Element des humanen Zytomegalie-Virus (CMV) und Ratten-Präproinsulin und SV40 Polyadenylierungssequenzen, flankiert durch terminale invertierte Wiederholungen (ITR) des adenoassoziierten Virus an beiden Enden. (Dieses Plasmid ist von Dr. J. Rosenblatt, UCLA, CA erhältlich; Dr. Rosenblatts Bezeichnung für das Plasmid ist pSSV9/CMV-IL2). Außerdem verwendete man ein entsprechendes Kontrollplasmid pBC12/CMV-IL2, das mit pACMV-IL2 identisch war, dem jedoch die AAV terminalen Wiederholungen fehlten (1).
Ein zweites Studienplasmid, pA1CMVIX-CAT, enthielt die unmittelbar frühen CMV-Promotor-Enhancer-Sequenzen und ein Intron, das von pOG44 (Stratagene) stammte; das bakterielle CAT-Gen; spätes SV40-Polyadenylierungssignal, flankiert durch AAV terminale Wiederholungen in einem pBR322-Gerüst (1).
Die Plasmide pATK-βgal und pAADA-βgal enthielten das β-Gal-Gen, das jeweils mit dem TK- oder ADA-Promotor verknüpft war, in einem AAV-Plasmid-Gerüst. (βgal-Plasmide sind von Dr. Eli Gilboa, Duke Univ. erhältlich).
Ein weiteres in den vorliegenden Studien verwendetes Plasmid war pMP6. Wie in 2 dargestellt ist, ist das Plasmid mit IL-2 DNA (pMP6-IL2) ein doppelsträngiges kreisförmiges Plasmid. Beim pMP6-IL2 Plasmid befindet sich das humane Interleukin-2-Gen unter der Kontrolle eines CMV-Promotors und eines SV40-Polyadenylierungssignals. Zwischen dem Promotor und den Kodierungssequenzen von IL-2 befindet sich ein Intron (von pOG44, Stratagene, abstammend), das die Expression von IL-2 oder irgendeinem anderen, ins Plasmid platzierten exogenen. Gen verstärken soll. Die gesamte Expressionskassette befindet sich zwischen der linken und der rechten terminalen Sequenz des adenoassoziierten Virus. Das pMP6-IL2 Plasmid hat außerdem ein Bluescript-Gerüst; das Gerüst hat einen Col-E1-Bakterien-Replikationsstartpunkt und ein Ampicillin-Resistenzgen, das die Propagierung dieses Plasmids in E. coli erleichtert.
Die 3A–G stellen die DNA-Sequenz des pMP6-IL2 Plasmids dar; die Felder a bis e zeigen aufeinander folgende Teile der Sequenz. In der Figur werden Teile der pMP6-IL2 Sequenz angegeben, die mit bekannten DNA-Sequenzen übereinstimmen; die entsprechende Sequenzinformation steht direkt unterhalb der Sequenzinformation für das pMP6-IL2 Plasmid. Nicht markierte Sequenzen sind von Linkern.
Es wurden auch Standardplasmidkonstrukte verwendet, die das IL-2-Gen, aber keine AAV-Komponenten enthielten. Die Standardplasmidkonstrukte wiesen das IL-2-Gen auf, mit einer Adenosindesaminase (ADA), einer Thymidinkinase (TK) oder dem unmittelbar späten Zytomegalie-Virus-(CMV)-Promotor (Standardplasmide wurden von der ATCC erhalten). Daten für ausgewählte Plasmide sind in Tabelle 1 enthalten.
Tabelle 1 In vorliegenden Studien verwendete ausgewählte Plasmide
Alle Plasmide wurden durch alkalische Lyse und Ammoniumacetatpräzipitation isoliert und anschließend mit DNase-freier RNase, Phenol/Chloroform/Isoamyl-Extraktionen und Ammonium-Acetat-Präzipitation behandelt (Ausubel, F. M., et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1993)).
E. Liposompräparation
Kleine unilamellare Liposome wurden von dem kationischen Lipid Dioctadecyl-Dimethyl-Ammonium-Bromid (DDAB) (Sigma) in Kombination mit dem neutralen Lipid Dioleoyl-Phosphatidyl-Ethanolamin (DOPE) (Avanti Polar Lipids) präpariert. Die Lipide wurden in Chloroform gelöst. DDAB wurde mit DOPE in einem Molverhältnis von 1 : 1 oder 1 : 2 in einem Rundkolben vermischt, und das Lipidgemisch wurde auf einem Rotationsverdampfer getrocknet. Der Lipidfilm wurde durch die Zugabe von sterilem doppelt destilliertem Wasser rehydratisiert, um eine Endkonzentration von 1 mM DDAB zu erhalten. Diese Lösung wurde in einem Badbeschallungsgerät (Laboratory Supplies, Hicksville, NY) beschallt, bis sie klar war. Die Liposome wurden bei 4°C unter Argon gelagert. Für den In-vivo-Gebrauch von Liposomen durch intravenöse Verabreichung wird ein DDAB : DOPE-Verhältnis von 1 : 4 bis 1 : 5 verwendet; für die intraperitoneale Verabreichung wird ein DDAB : DOPE-Verhältnis von 1 : 1 bis 1 : 2 verwendet.
F. Präparation von rekombinantem ARV (rAAV) für eine Transduktion mit Virusinfektion
Zur Präparation rekombinanter AAV-Vorräte wurden Zellen der Zelllinie 293 gespalten und auf etwa 30–50% Konfluenz wachsen gelassen. Anschließend wurden die Zellen mit Adenovirus-Typ 5 bei einer Infektionsmultiplizität von 1 bis 5 infiziert und bei 37°C inkubiert. Nach 2 bis 4 Stunden wurden die infizierten Zellen mit 10 μg eines Plasmids, das ein Gen von Interesse enthielt, und 10 μg des rep-Kapsid-Komplementationsplasmids pΔBal je 100 mm Gewebekulturschale (0,5 – 1 × 10⁷ Zellen) cotransfiziert. Für die Transfektion wurde eine Calciumphosphat-Copräzipitation angewendet (Hermonat, P. L. und Muzyczka, N., „Use of adeno-associated virus as a mammalian DNA cloning vector. Transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells", Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81: 6466–6470). 12 bis 18 Stunden nach der Transfektion wurde das Medium aus den Zellen entfernt und durch 5 ml DMEM-Medium mit 10% FBS ersetzt.
48 bis 72 Stunden nach der Transfektion wurde ARV mit dem folgenden Verfahren geerntet: Zellen und Medium wurden zusammen aufgefangen und dreimal gefroren und aufgetaut, um die Zellen zu lysieren. Die Suspension von Zellen und Medium wurde dann zentrifugiert, um Zellbruchstücke zu entfernen, und der Überstand wurde bei 56°C 1 Stunde lang inkubiert, um Adenovirus zu inaktivieren (Hermonat, P. L. und N. Muzyczka, „Use of adeno-associated virus as a mammalian DNA cloning vector. Transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells", Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81: 6466–6470; Tratschin, J. D., et al., "Adeno-associated virus vector for high frequency integration, expression, and rescue of genes in mammalian cells", Mol. Cell. Biol. (1985) 5: 3251–3260). Nach der Wärmeaktivierung wurde der Virusüberstand durch Celluloseacetat-Filter (1,2 um) filtriert. Virus-Vorräte wurden dann bei –20°C aufbewahrt. Ein Milliliter AAV-Überstand wurde zum Transduzieren von 1 × 10⁶ Zellen verwendet.
G. Zelluläre Transfektion „Lipofektion"
Für Primärtumorzellen und die Ratten-Tumorzelllinien (R3327 und MBT-2) wurden 1 × 10⁶ Zellen in 2 ml serumfreiem Medium je Well einer 6-Well-Schale plattiert. Anschließend wurden 5 μg AAV-Plasmid-DNA mit 5 nmol DDAB als Liposome bestehend aus jeweils DDAB und DOPE in einem Molverhältnis von 1 : 2 vermischt. Serumfreies Medium (0,5 ml) wurde zum AAV : Liposom-Komplex gegeben, der dann zu den Zellen transferiert wurde. Zum Herbeiführen einer Lipofektion wurden die Zellen 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend wurde fetales Rinderserum zu den Zellen gegeben, um eine Endkonzentration von 5% fetales Rinderserum zu erhalten.
Für T-Zellen wurden 5 – 10 × 10⁶ Zellen in 1 ml serumfreiem Medium je Well einer 6-Well-Schale plattiert. 50 μg Plasmid-DNA wurden mit 50 nmol DDAB als Liposome bestehend aus DDAB und DOPE in einem Molverhältnis von 1 : 1 vermischt. Die Transfektionen „Lipofektionen" wurden dann wie für die Tumorzellen durchgeführt.
Für Stammzellen wurden 1 – 2 × 10⁶ Zellen mit Komplexen transfiziert, die 10 Mikrogramm Plasmid-DNA und 10 nmol Liposom umfassten. Die transfizierten Zellen wurden mit Medium kultiviert, das Stammzellenfaktor, IL-3 und IL-1, enthielt. Am 3. und 7. Tag wurden die Zellen geerntet und es wurden Auszüge gemacht.
H. IL-2-Test
Die Zellen wurden gezählt, und 1 × 10⁶ Zellen wurden in 1 ml je Well einer 24-Well-Platte plattiert. Am folgenden Tag wurden Überstände aufgefangen und mit einem Quantikine IL-2 Elisa-Kit beurteilt (R&D Systems, Minneapolis, MN). Die IL-2-Werte wurden in Pikogramm/ml des Überstands definiert.
I. β-Galactosidase-Test
Der FluoReporter-lacZ-Genfusionsnachweis-Kit von Molecular Probes (Eugene, OR) wurde zum quantitativen Bestimmen von lacZ-β-D-Galactosidase in einzelnen Zellen durch Messen der Fluoreszenz des Enzymhydrolyseprodukts Fluorescein verwendet. Die AAV/β-Gal-Plasmide (pATK-βgal und pAADA-βgal) wurden mit diesem Kit verwendet. Fluorescein wird durch enzymatische Spaltung von Fluorescein-di-b-D-Galactopyranosid (FDG) in Zellen produziert, die das Markergen b-D-Galactosidase exprimieren. Die Zellen wurden dann mit Durchflusszytometrie analysiert (FACScan, Becton Dickinson, San Jose, CA).
II. ERGEBNISSE DER STUDIE
A. Stärke der IL-2-Genexpression durch die Verwendung eines Komplexes aus AAV-Plasmid und kationischem Liposom
Zur Beurteilung der Gentransfereffizienz von AAV-Plasmiden wurde die IL-2-Gentransfereffizienz von AAV-Plasmiden mit der Effizienz von Standardplasmidkonstrukten verglichen. Die Standardplasmide trugen das IL-2-Gen, mit einem Adenosindesaminase-(ADR)-Promotor (pADA-IL2), einem Thymidinkinase-(TK)-Promotor (pTKIL-2) oder dem unmittelbar späten Zytomegalie-Virus-(CMV)-Promotor (pCMV-IL2). Ein AAV IL-2-Studienplasmid (pACMV-IL2) enthielt den CMV-Promotor (unmittelbar-früh), wobei das IL-2-Gen stromabwärts vom Promotor platziert war (1). Wie in 1 dargestellt ist, war das entsprechende Kontrollplasmid, das pBC12/CMV-IL2-Konstrukt, mit pACMV-IL2 identisch, allerdings fehlten ihm die AAV terminalen Wiederholungen (ITR).
Zum Vergleich wurden fünf Plasmide (pACMV-IL2, pBC12/CMV-IL2, pADA-IL2, pTK-IL2, pCMV-IL2), die das IL-2-Gen enthielten, mit Liposomen komplexiert und auf die Transfektionseffizienz an den folgenden zwei kultivierten Tumorzelllinien getestet: die Rattenblasen-(MBT-2) und die Rattenprostata-(R3327)-Zelllinie. Die Zelllinien wurden mit 10 Mikrogramm Plasmid-DNA transfiziert, die mit 10 nmol Liposomen je 1 × 10⁶ Zellen komplexiert war. Überstände wurden am 3. Tag aufgefangen und hinsichtlich der IL-2-Werte mit einem IL-2-Elisa-Kit getestet.
Das AAV-Plasmid-(pACMV-IL2) induzierte die höchste Expressionsstärke in beiden Zelllinien (4a). Das IL-2-Gen mit einem ADA-Promotor (pADA-IL2) induzierte den geringsten Expressionsgrad in beiden Zelllinien. Wie in 4a zu sehen ist, induzierten sowohl TK- als auch CMV-(unmittelbar früher Promotor)-IL-2-Konstrukte vergleichbare IL-2-Expressionsstärken in beiden Zelllinien. Das pBC12/CMV-IL2 Plasmid, das den unmittelbar frühen CMV-Promotor enthielt, wies jedoch eine höhere Genexpressionsstärke in der Prostatazelllinie im Vergleich zur Blasenzelllinie auf. Unter den getesteten Plasmiden induzierte das AAV IL-2 Studienplasmid die höchste Expressionsstärke in beiden Zelllinien, wobei eine wesentliche Zunahme in der Prostatazelllinie beobachtet wurde.
Es wurde die Dauer der durch das entsprechende Kontrollplasmid (pBC12/CMV-IL2) und das AAV IL-2 Studienplasmid (pACMV-IL2) in der Prostatazelllinie R3327 induzierten Expression untersucht (4b). Die Expression wurde bis zu 30 Tage lang in diesen Kulturen ohne jegliche Selektion beurteilt. Die Zellen wurden zu 1 × 10⁶/ml beimpft und Überstände wurden alle 24 Stunden zur Analyse aufgefangen. Die Zellen verdoppelten sich alle 48 Stunden in Kultur. Die Daten in 4b zeigen, dass neben der erhöhten Expressionsstärke die Dauer der Expression nach der Transfektion mit AAV-Plasmid (pACMV-IL2) bei 30 Tagen lag. Insbesondere hielt eine wesentliche Expression während der gesamten Dauer der Beurteilung an. Wie in 4b zu sehen ist, induzierten beide Plasmide maximale Expressionsstärken zwischen dem 2. und dem 7. Tag; bis zum 15. Tag nahmen die IL-2-Werte ab und blieben dann nur in der mit AAV-Plasmid transfizierten Gruppe bei etwa 100 pg/ml. Ebenso wurden anhaltende Expressionsstärken in der Blasenzelllinie beobachtet, sowie bei Zellen eines Primärlungen-, Brust- und Eierstocktumors, als AAV-Plasmid : Liposom-Komplexe zur Transfektion verwendet wurden (Daten sind in 4b nicht aufgeführt).
B. Vergleich zwischen AAV-Plasmid : Liposom-Transfektion „Lipofektion" und rekombinanter AAV-Transduktion
Die Prostata- und Blasenzelllinien wurden transfiziert und transduziert, um zu bestimmen, ob eine optimale AAV : Liposom-Transfektion mit einer optimalen rekombinanten AAV-Transduktion vergleichbar ist. Für eine optimale Transfektion wurden 10 Mikrogramm AAV-Plasmid-DNR mit 10 nmol Liposomen je 1 × 10⁶ Zellen in 2-ml-Endvolumen komplexiert. Für eine maximale rAAV-Transduktion wurden 2 ml des viralen Überstands zu 1 × 10⁶ Zellen in 1 ml Vollmedium gegeben. Nach 24 Stunden wurden die Zellen gewaschen und in frischem Vollmedium resuspendiert. Überstand wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Transfektion und Transduktion aufgefangen.
In der Prostatalinie (5a) induzierte die Transfektion höhere Expressionsstärken als die AAV-Transduktion unter Testbedingungen (2 ml viraler Überstand für 1 × 10⁶ Zellen, gegenüber 10 μg DNA : 10 nmol Liposome). Die Ergebnisse zwischen dem 3. und dem 5. Tag wiesen zwar etwa 10 mal höhere IL-2-Werte bei der Transfektion auf, doch wurden bis zum 20. Tag vergleichbare Werte in den transfizierten und den transduzierten Gruppen beobachtet.
Die Transduktion mit rekombinantem AAV induzierte zu Anfang höhere IL-2-Produktionswerte in der Blasenzelllinie im Vergleich zur Transfektion mit Liposomen (5b). Ähnlich wie bei der Prostatazelllinie ergab die Transduktion der Blasenzelllinie ebenfalls einen Rückgang der IL-2-Werte bis zum 20. Tag, die IL-2-Werte aus der Transfektion nahmen während dieses Zeitraums jedoch zu; vergleichbare IL-2-Werte wurden bis zum 33. Tag sowohl in der transfizierten als auch in der transduzierten Gruppe erhalten.
C. Transfektion von Primärtumorzellen unter Verwendung von Komplexen aus AAV-Plasmid-DNA und Liposom
In den hierin offenbarten vorangehenden Experimenten wurde eine signifikante Transgenexpression in kultivierten Zelllinien demonstriert. Um zu beurteilen, ob kationische Liposom : AAV-Plasmid-DNA-Komplexe auch eine vergleichbare Transgen-Expression in frisch isolierten Primärtumorzellen vermittelten, wurden Zellen von vier verschiedenen Primärtumoren mit AAV-IL-2-Studienplasmid unter Verwendung von Liposomen transfiziert. Die Tumorzellen wurden in RPMI-1640 Medium, das mit 10% FBS angereichert war, 2–3 Wochen lang vor der Transfektion kultiviert. Die Zellen wurden zu 1 × 10⁶ Zellen je ml Konzentration plattiert und mit 10 Mikrogramm DNA transfiziert, die mit 10 nmol Liposomen komplexiert war. Überstände wurden am 2. und 3. Tag aufgefangen.
Wie in 6 zu sehen ist, erbrachten alle vier Primärzelltypen signifikante IL-2-Werte nach der Transfektion. Die höchste Expressionsstärke wurde am 3. Tag des Studienzeitraums von 10 Tagen beobachtet (die Lungen- und eine Brustprobe wurden über längere Zeiträume untersucht). Die IL-2-Genexpression wurde in Zellen des Lungentumors und in Zellen von einem der Brusttumore 25 Tage lang nach der Transfektion in Kultur verfolgt. Am 15. Tag waren die Werte in beiden Zelllinien und in den von Primärtumoren stammenden Zellen gleich (100 pg/ml IL-2) (Daten sind nicht dargestellt).
D. Effekt einer letalen Bestrahlung auf die Transgenexpression
Zum Bestimmen des Effekts einer Bestrahlung auf die Genexpression wurden die Prostatazelllinie (7a) und die Zellen eines Primärbrusttumors (7b) transfiziert und hinsichtlich Genexpression nach einer letalen Bestrahlung beurteilt. Beide Zelltypen wurden mit optimalen AAV-Plasmid : Liposom-Komplexen transfiziert. Am zweiten Tag nach der Transfektion wurde ein aliquoter Teil jeder Kultur mit einem ⁶°Co-Bestrahlungsgerät 6000 Rad ausgesetzt, wodurch die Zellteilung aufgehoben wurde; die aliquoten Teile wurden dann in Kultur gehalten. Eine Hälfte der jeweiligen Kulturen wurde als nicht bestrahlte Kontrolle genommen. Die aliquoten Teile wurden mit einem ⁶°CO Bestrahlungsgerät 6000 Rad ausgesetzt, während die Expressionsstärke von IL-2 bei etwa 300–400 pg/ml lag. Überstände wurden 24, 48, 72 und 96 Stunden nach der Bestrahlung aufgefangen und dann hinsichtlich der IL-2-Werte getestet.
Wie in den 7a–b zu sehen ist, wurde die Transgenexpression durch die letale Bestrahlung nach der Transfektion nicht gehemmt. Weder die Prostatazelllinie noch die Primärtumorzellen wiesen irgendeine Veränderung der IL-2-Expression nach der Bestrahlung auf. Obwohl die Zellteilung aufgehoben war, war die IL-2-Sekretion folglich gegenüber der Bestrahlung nicht empfindlich. Dies ist von Vorteil, da viele Gentherapiestrategien eine Genlieferung zu Primär-T-Lymphozyten beinhalten (die sich ohne Aktivierung im Allgemeinen nicht teilen) und oft nicht über eine Virusinfektion transduziert werden können.
E. Stärke der β-D-Galactosidase-Genexpression durch die Verwendung eines RAV-Plasmid : Liposom-Komplexes
Um die Expressionsstärken auf Zellbasis zu demonstrieren, wurde das β-D-Galactosidasegen für Transfektionsexperimente verwendet. Die beiden AAV-β-Gal-Plasmide (pATK-Bgal und pAADA-Bgal) (Plasmide von Dr. Eli Gilboa, Duke University) wurden jeweils mit kationischen Liposomen komplexiert und zur Transfektion der Prostatazelllinie verwendet. Zehn Mikrogramm pATK-βgal- oder pAADA-βgal-Plasmid-DNR wurden mit 10 nmol Liposomen komplexiert; die Komplexe wurden dann zum Transfizieren von 1 × 10⁶ Zellen in 2-ml-Volumen verwendet. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden etwa 5 × 10⁵ Zellen geerntet und mit Fluoreszenzsubstrat FDG gefärbt und per Durchflusszytometrie analysiert.
Eine maximale Transgenexpression wurde zwischen dem 7. und 15. Tag beobachtet (8). Signifikante β-Gal-Aktivitätsniveaus wurden bis zum 25. Tag beobachtet. Die Durchflusszytometrieanalyse von β-Gal-positiven Zellen erbrachte mit beiden Plasmidkonstrukten maximale Transfektionseffizienzwerte von 10 bis 50%. Die Werte gingen bis zum 25. Tag auf 5 bis 10% zurück. Das Expressionsmuster und die Dauer waren ähnlich wie bei der oben beschriebenen IL-2-Expression.
F. Durch AAV-Plasmid : Liposom-Komplex in frisch isolierten peripheren Blut-T-Zell-Subpopulationen induzierte Transgenexpression
Es wurde der Effekt des AAV-Plasmid : Liposom-Komplexes beim Transfizieren von frisch isolierten humanen peripheren Blut-T-Zellpopulationen untersucht. Das Gen für das Chloramphenicol-Acetyl-Transferase-(CRT)-Enzym wurde als Reportergen in dem pA1CMVIX-CAT-Plasmid verwendet (1). Die pA1CMVIX-CAT-Konstrukte wurden unter Verwendung des AAV-Gerüsts (pA1) mit unmittelbar frühen CMV-Promotor-Enhancer-Sequenzen und CAT-Gen hergestellt. Die gesamten und gereinigten CD4⁺ und CD8⁺ Subpopulationen von T-Zellen wurden für die Transfektionen verwendet. Sowohl die gesamten (CD3 oder CD5/8 ausgewählt) als auch die gereinigten (CD4 oder CD8 ausgewählt) Subpopulationen von T-Zellen (9a–d) sowie CD34⁺ Stammzellen (10, beschrieben in Sektion G. unten) wiesen signifikante CAT-Genexpressionsstärken auf.
Primäre T-Zellen, die von peripherem Blut frisch isoliert waren, wurden auf Transgenexpression mit AAV-Plasmid-DNA : Liposom-Komplexen untersucht. Die Ergebnisse der Dünnschichtchromatographietests in Bezug auf CAT-Aktivität von CD3⁺-T-Zellen, CD5/8 ausgewählten T-Zellen (gesamte T-Zellen), die CD4⁺ Subpopulation von T-Zellen und die CD8⁺ Subpopulation von T-Zellen sind jeweils in den 9a–d dargestellt.
T-Lymphozyten wurden als CD3⁺ oder CD5/8⁺ oder CD4⁺ oder CD8⁺ Populationen mit AIS MicroCELLector-Geräten fraktioniert. Die relevanten Zellen wurden aufgefangen und nichtadhärente Zellen wurden abgewaschen. Die adhärenten Zellen wurden von den Geräten nach 2 Tagen in Kultur mit RPMI-1640 und 10% FBS entfernt. Fünf bis 10 × 10⁶ Zellen wurden plattiert und transfiziert mit 50 Mikrogramm AAV-Plasmid-DNA und 50 oder 100 nmol Liposomen, um ein Verhältnis zwischen DNA und Liposom von 1 : 1 oder 1 : 2 zu erhalten. Die Zellen wurden 3 Tage nach der Transfektion geerntet, die Zellextrakte wurden nach Proteingehalt normalisiert, und die CAT-Aktivität wurde anhand einer Chromatographieanalyse gemessen. Blut wurde von Spendern mit der Bezeichnung A oder B gewonnen. Peripheres Blut vom Spender A oder B wurde zur Isolierung der T-Zellen und zur Transfektion verwendet.
Wie in den 9a–d dargestellt ist, wurde die Lipidzusammensetzung der Liposome, umfassend AAV, sowie das Verhältnis zwischen DNA und Liposom variiert. In der Studie von CD3⁺ T-Zellen (9a) wurden Zellen von einem Spender (Spender A) verwendet. Für die Studien an CD5/8 ausgewählten T-Zellen (9b) wurden die CD4⁺ Subpopulation von T-Zellen (9c), die CD8⁺ Subpopulation von T-Zellen (9d) und CD34⁺ Stammzellen (10), die nachfolgend beschrieben werden, Zellen von zwei Patienten (Spender A und Spender B) verwendet.

Tabelle 2 Bedingungen der in Fig. 9a dargestellten Studien

Bedingung Nr.	Parameter
1	pA1CMVIX-CAT + DDAB : DOPE (1 : 1), Verhältnis zwischen DNA und Liposom (1 : 1)
2	pA1CMVIX-CAT + DDAB : DOPE (1 : 1), Verhältnis zwischen DNA und Liposom (1 : 2)
3	pA1CMVIX-CAT + DDAB : DOPE (1 : 2), Verhältnis zwischen DNA und Liposom (1 : 1)
4	pA1CMVIX-CAT + DDAB : DOPE (1 : 2), Verhältnis zwischen DNA und Liposom (1 : 2)

Tabelle 3 Bedingungen der in den Fig. 9b–d dargestellten Studien

Bedingung Nr.	Parameter
1	pA1CMVIX-CAT + DDAB : DOPE (1 : 1), Verhältnis zwischen DNA und Liposom (1 : 1)
2	pA1CMVIX-CAT + DDAB : DOPE (1 : 1), Verhältnis zwischen DNA und Liposom (1 : 2)
3	pA1CMVIX-CAT + DDAB : chol (1 : 1), Verhältnis zwischen DNA und Liposom (1 : 1)
4	pA1CMVIX-CAT + DDAB : chol (1 : 1), Verhältnis zwischen DNA und Liposom (1 : 2)

Im Rahmen der in den 9a–d dargestellten Studien wurden maximale Expressionsstärken am 2. und 3. Tag sowohl in den gesamten als auch in den gereinigten Subpopulationen beobachtet. Signifikante Expressionsstärken wurden bis zum 14. Tag nachgewiesen. Die Zellen wurden 3 Tage nach der Transfektion geerntet, und der normalisierte Proteingehalt von jedem Extrakt wurde auf CAT-Aktivität analysiert. Die gleiche Liposomzusammensetzung und das DNA-/Liposom-Verhältnis induzierten ähnliche Expressionsstärken in allen Populationen.
G. Durch AAV-Plasmid : Liposom-Komplex in frisch isolierten CD34⁺ Stammzellen induzierte Transgenexpression
Es wurde der Effekt des AAV-Plasmid : Liposom-Komplexes beim Transfizieren frisch isolierter humaner pheripherer Blut-CD34⁺-Stammzellen untersucht. Das Gen für das Chloramphenicol-Acetyl-Transferase-(CAT)-Enzym wurde als Reportergen im pA1CMVIX-CAT-Plasmid verwendet (1). Die pA1CMVIX-CAT-Konstrukte wurden wie oben beschrieben hergestellt. Die CAT-Expressionsstärke, die anhand einer Dünnschichtchromatographie von CD34⁺ Stammzellen bestimmt wurde, ist in 10 dargelegt.
Tabelle 4 Bedingungen der in Fig. 10 dargestellten Studien

Bedingung Nr. Parameter

1 pA1 CMV IX CAT + DDAB : DOPE (1 : 1), Verhältnis DNA zu Liposom (1 : 1)

2 pA1 CMV IX CAT + DDAB : DOPE (1 : 1), Verhältnis DNA zu Liposom (1 : 2).
Frisch isolierte periphere CD34⁺-Blutstammzellen wurden mit AAV-CAT-Plasmid-DNA : Liposom-Komplexen transfiziert. CD34⁺-Zellen wurden von peripherem Blut mit AIS CD34 MicroCELLectoren gereinigt, nachdem im Wesentlichen alle T-Zellen mit dem CD5/8 MicroCELLetor-Gerät entfernt worden waren. Die Stammzellen wurden von dem Gerät entfernt und 0,5 – 1 × 10⁶ Zellen wurden mit Komplexen transfiziert, die 10 Mikrogramm Plasmid-DNA und 10 nmol Liposom umfassten. Die transfizierten Zellen wurden mit Medium kultiviert, das Stammzellenfaktor, IL-3 und IL-1, enthielt. Am 3. und 7. Tag wurden die Zellen geerntet und es wurden Extrakte hergestellt. Der normalisierte Proteingehalt des Extrakts wurde in Bezug auf CRT-Aktivität untersucht. Wie in 10 zu sehen ist, gab es in den peripheren C34⁺-Blutstammzellen signifikante CAT-Genexpressionsstärken.
H. Integrationsstudien
Die 11a–b zeigen verstärkte Chemilumineszenz-(ECL)-Southern-Analysen von genomischer DNA von stabilen Klonen (Klone, die mindestens über den 30. Tag hinaus stabil sind), die mit AAV-Plasmid-DNA : Liposom-Komplexen gemäß der Erfindung transfiziert wurden. Genomische DNA wurde isoliert und analysiert mit dem ECL-Direkt-Nucleinsäuremarkierungs- und Nachweissystem (Amersham). Eine IL-2-Sonde wurde von dem 0,685 kb IL-2-Gen von pACMV-IL2 präpariert. Nach dem Hybridisieren wurde die Membran zweimal 10 Minuten lang in 0,5 × SSC/0,4% SDS bei 55°C und zweimal 5 Minuten lang in 2 × SSC bei Raumtemperatur gewaschen.
In 11a wurden die Proben mit Bam HI und Hind III verdaut und mit IL-2 sondiert. Wie in 11a zu sehen ist, zeigten alle Klone die Anwesenheit des IL-2-Gens, wie anhand der 0,685 kb Bande in mit Bam HI und Hind III verdauter genomischer DNA demonstriert wird.
Für die Daten in 11b wurden Proben mit Bam HI verdaut und mit IL-2 sondiert. Wieder zeigten alle Klone eine IL-2-Genintegration (11b). In 11b wird die Integration von IL-2 durch die Banden von hoher Molekülmasse (zwischen 1,6 und 2 kb) demonstriert, Banden, die mit der Integration des Gens in Verbindung mit angelagertem genomischem Wirtsmaterial vereinbar sind, das per Verdau gewonnen wurde. Die Daten in 11b zeigen, dass es mehr als einen Integrationsort gab, da mehrere Banden von hoher Molekülmasse in der mit Bam HI verdauten genomischen DNA vorhanden waren. Ferner wurde gezeigt, dass der Integrationsort an verschiedenen Stellen in verschiedenen Klonen vorlag, wie anhand der verschieden großen Banden in den verdauten Klonen demonstriert wird (11b).
Die 12a–b stellen chromosomale DNA-Analysen unter Anwendung eines ³²p Southern-Tests von zwei Klonen dar, die in der vorliegenden Studie gewonnen wurden. Zellkern-DNA wurde von den zwei IL-2-Klonen (1A11 und 1B11) unter Verwendung des Hirt-Fraktionierungsprotokolls isoliert. Als negative Kontrolle wurde die gesamte DNA von nicht transfizierten Zellen der R3327 Zelllinie isoliert.
Nach einem Restriktionsenzymverdau wurden 10 Mikrogramm jeder Probe zusammen mit angemessenen Plasmidkontrollen auf ein 1%iges Agarosegel geladen, Elektrophorese unterzogen, denaturiert und auf Hybond+ Membran übertragen. Die Filter wurden über Nacht bei 68°C mit DNA-Fragmenten hybridisiert, die durch Random-Priming mit ³²p markiert waren. Die Membranen wurden anschließend bei 68°C 2 × 30 Minuten lang mit jeweils 2 × SSC, 0,1% SDS und 0,2 × SSC, 0,1% SDS gewaschen. Autoradiogramme dieser Filter wurden auf Röntgenfilm exponiert.
In 12a wurde das IL-2-Gen wieder als Sonde verwendet. Nach einem Southern-Blotting wurde der in 12a dargestellte Filter somit mit einem 0,68 kb IL2 Bam HI/Hind III Fragment von pACMV-IL2 sondiert. Die Daten in 12a zeigen, dass die Kopiezahl des IL-2-Gens, das sich in einen Klon integrierte, von Klon zu Klon variierte; diese Erkenntnis wurde anhand der unterschiedlichen Dichten der 0,685 kb Bande in den Verdaus (wie in der kurzen Beschreibung der Zeichnungen angegeben wird) von Zellen der beiden Klone demonstriert. Ferner wurden auch Banden von höherer Molekülmasse demonstriert, was mit der Integration des IL-2-Gens zusammen mit genomischem Wirtsmaterial vereinbar ist, das in den verschiedenen Verdauprotokollen erhalten wird.
Für die in 12b dargestellten Daten wurde der Filter mit einem 0,85 kb pvuII/HindIII (ARV ITR/CMV) Fragment des Plasmids pACMV-IL2 sondiert. Die Daten in 12b deuten auf die Anwesenheit der rechten AAV ITR hin, wie anhand der 0,8 kb Bande in der mit smaI und pvuII verdauten chromosomalen DNA demonstriert wird. Die Anwesenheit der linken AAV ITR in einem Klon (Klon A) wurde anhand der 2,1 kb Bande in der mit samI und pvuII verdauten chromosomalen DNA demonstriert.
III. BEISPIELE
Ein erfindungsgemäßes Verfahren, das Liposome nutzt, die AAV-Virusmaterial beinhalten, wird zur Lieferung von Genen für Cytokine, Costimulationsmoleküle wie B7 und Moleküle mit MHC-Klasse-I-Antigenen in eine große Auswahl von Zelltypen angewendet. Ein solches genomisches Material kann zum Beispiel in Primärtumorzellen oder Tumorzelllinien geführt werden, um Tumorimpfstoffe bereitzustellen, und in periphere Blut- oder Knochenmarkszellen geführt werden, um hämatologische oder neoplastische Krankheiten zu behandeln.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren, das die Verwendung von Liposomen umfasst, die AAV-Virusmaterial enthalten, wird zum Liefern und Exprimieren von Genen für Substanzen wie Peptide, Antisense-Oligonucleotide und RNA angewendet. Nach dem Exprimieren solcher Peptide, Antisense-Oligonucleotide und RNA wird die Immunantwort eines Subjekts moduliert. Die Modulation der Immunantwort umfasst entweder das Induzieren der Immunantwort oder das Hemmen der Immunantwort. Demzufolge wird eine HIV-Infektion durch die Verwendung von Antisense-Oligonucleotiden, RNA oder Ribozymen behandelt, die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren exprimiert wurden. Darüber hinaus wird die immunologische Reaktion auf einen Tumor durch die Verwendung von Peptiden oder RNA moduliert, die gemäß der Erfindung exprimiert wurden. Die Immunantwort eines Patienten wird moduliert, um auf tumorspezifische und/oder tumorassoziierte Antigene zu reagieren. Demzufolge werden nichtimmunogene Tumore in immunogene Tumore verändert, die eine zytolytische T-Zell-Reaktion sowohl in vivo als auch in vitro induzieren.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren wird zum Liefern von Genen zu Primärlymphoidzellen wie B-Zellen oder T-Zellen angewendet. Ein alternatives erfindungsgemäßes Verfahren wird zum Liefern von genetischem Material zu CD34⁺-Stammzellen angewendet. Demzufolge werden die Gene exprimiert und in der Therapie von Krankheiten wie HIV-Infektion, genetische Defekte, Neoplasien und Autoimmunkrankheiten verwendet, bei denen die Expression eines Gens von Interesse erwünscht ist, wie für die allgemein fachkundige Person verständlich sein wird. Bei einer malignen neoplastischen Erkrankung wird das MDR-I-Gen zum Beispiel gemäß der Erfindung geliefert, exprimiert und hat einen therapeutischen Effekt.
In einem weiteren Beispiel werden CD8⁺-Zellen mit AIS MicroCELLectoren ausgewählt. Das Ausgangsmaterial für die CD8⁺-Zellen umfasst für HIV-Patienten peripheres Blut und für Patienten mit Neoplasien Tumorproben. Die T-Zellen werden dann mit in der Technik bekannten Verfahren aktiviert, wie zum Beispiel durch die Verwendung von Phytohämagglutinin (PHA). Die aktivierten Zellen werden 20 Tage lang wachsen gelassen. Anschließend werden die Zellen gemäß der Erfindung mit RAV : Liposom-Komplexen, die IL-2-Genommaterial beinhalten, transfiziert. Die transfizierten Zellen werden zum Patienten zurückgeführt. Folglich wird die anschließende Verabreichung von IL-2 einem Patienten, um seine zytotoxische T-Zell-Aktivität zu bewahren, reduziert. Vorteilhafterweise ermöglicht das erfindungsgemäß verabreichte IL-2-Gen, dass geringere IL-2-Mengen einem Patienten systematisch verabreicht werden. Die Verringerung der IL-2-Menge, die systematisch verabreicht wird, ist von Vorteil, da systematisch verabreichtes IL-2 mit letaldosisbezogener Toxizität assoziiert ist.
A. Tumorvakzination
Im Rahmen von Tumorvakzinationsprotokollen werden typischerweise nicht proliferierende neoplastische Zellen verwendet. Die Proliferation neoplastischer Zellen wird dadurch verhindert, dass die Zellen einer Bestrahlung ausgesetzt werden, oder dadurch, dass die Zellen Hochdruckkammern ausgesetzt werden. Man geht davon aus, dass, wenn neoplastische Zellen im Körper vorhanden sind, abgesehen von anfänglichen Tumormassen oder -foci, der Körper in der Lage ist, eine wirksame Antitumorreaktion zu starten.
Bei einigen Tumorvakzinationsversuchen wurde ein genmodifizierter Tumor (GMT) für Patienten mit Melanom und Nierenzellenkrebs verwendet, um die Tumorzellenantigenität zu verbessern; diese Versuche stützten sich auf einen Ex-vivo-Retrovirus-Gentransfer. Der Ex-vivo-Retrovirus-Gentransfer hat den Nachteil, dass er ein sehr komplexes Verfahren ist und dass eine aktive Targetzellteilung vorliegen muss, um Einbau und Expression der gelieferten Gene zu erreichen. Ferner kann es sehr schwierig sein, ex vivo ausreichend neoplastische Zellen zu kultivieren, um eine geeignete Menge therapeutisches Produkt zu erzeugen.
Im Gegensatz zum Retrovirus-Gentransfer wurden Plasmidkonstrukte, die die terminalen Wiederholungselemente des adenoassoziierten Virus (AAV) an den Orten 3' und 5' zum zu transduzierenden Gen besaßen, effizient exprimiert, wenn sie über einen nichtviralen liposomvermittelten Transfer eingeführt wurden. Wie nachfolgend ausführlicher beschrieben wird, wurden zum Beispiel Liposome zum Liefern von AAV-Plasmid, wie pMP6-IL2, das cDNA für Interleukin-2 beinhaltete, zu humanen Primärtumorzellen wie Melanomzellen verwendet. Die Primärtumorzellen exprimierten dann anschließend Interleukin-2. Tumorzelllinien wurden auch effektiv transfiziert.
Die Expression von IL-2, die durch eine AAV-Liposom-Transfektion erhalten wurde, war dauerhaft und sehr stark.
Das Niveau der Cytokin-Sekretion von Zellen, die durch AAV-Plasmid-Liposom-Zusammensetzungen genmodifiziert wurden, übertraf das Niveau, das mit retroviral infizierten Zellen erreicht wurde.
Demzufolge werden Zellen durch die Verwendung einer Zusammensetzung genmodifiziert, die AAV-Plasmid und Liposome enthält; diese genmodifizierten Zellen werden in therapeutischen Tumorvakzinationsregimen verwendet. Vorteilhafterweise konnten durch eine Genmodifikation durch die Verwendung einer Zusammensetzung mit AAV-Plasmid und Liposomen Primärtumorzellen modifiziert werden, so dass die allgemeine Notwendigkeit zur Bildung einer Tumorzelllinie von Primärtumorzellen zum Beeinflussen der Genmodifikation, die vor der vorliegenden Offenbarung erforderlich war, entfiel. Es ist außerdem überaus vorteilhaft, dass Tumorzellen, die genmodifiziert sind und IL-2 exprimieren, nicht zusammen mit systemischem IL-2 verabreicht werden müssen: systemisches IL-2 ruft bekanntlich äußerst gefährliche, sogar tödliche Nebenwirkungen hervor.
B. Lipofektion von Zellen mit Transgen-DNA zur Verwendung in der therapeutischen Verabreichun
Mit systemischem IL-2 werden derzeit bestimmte schwere Erkrankungen wie maligne Neoplasie behandelt. Darüber hinaus sind aktivierte T-Zellen von exogenem IL-2 für Wachstum und Überleben sowohl in vitro als auch in vivo abhängig. Wird der IL-2-Stimulus weggenommen, dann machen die T-Zellen innerhalb weniger Tage eine Apoptose (DNA-Fragmentierung) durch. Systemisch verabreichtes IL-2 verursacht jedoch bekanntlich gefährliche Nebenwirkungen, zuweilen mit Todesfolge. Es besteht daher Bedarf an der Entwicklung von Therapien, die die Notwendigkeit für eine Verabreichung von systemischem IL-2 eliminieren oder verringern.
Die durch die folgenden Daten repräsentierten Studien behandelten den Transport von AAV-Plasmid-DNA und Transgen-DNA in T-Zellen durch ein System, das keine Virustransduktion beinhaltet. Insbesondere betreffen die vorliegenden Daten die Transfektion, unter Verwendung des eleganten Trägersystemn der Lipofektion und der effizienten Transduktionsfähigkeit von AAV-Plasmidkonstrukten.
Folglich wurden AAV-Plasmide mit Transgen und ARV terminalen Wiederholungen als DNA-Vektor verwendet und kationische Liposome wurden als Trägermoleküle verwendet. (Eine allgemeine Erörterung der Transfektion und Expression in T-Lymphozyten ist in Philip, R. et al., Mol. Cell. Biol. (1994) 14(4): 2411–2418 enthalten). In einer bevorzugten Ausgestaltung ist das Transgen für IL-2. AAV-Plasmid : Liposom-Komplexe induzierten Transgenexpressionsstärken, die mit den durch die rekombinante AAV-Transdektion erhaltenen Stärken vergleichbar waren. Vorteilhafterweise erleichterten die kationischen Liposomen den Eintritt von AAV-Plasmid-DNA in Zellen in Abwesenheit von rep- und Kapsid-Transkomplementation, rekombinantem Virus oder Wildtyp-AAV. Die Komplexe aus AAV-Plasmid-DNA und Liposom transfizierten effizient TIL-Zellen. AAV-Plasmid-DNA, die mit Liposomen komplexiert war, erbrachte um das Mehrfache höhere Expressionsstärken als Komplexe mit Standardplasmiden. Ferner dauerte die Expression 30 Tage lang ohne jegliche Selektion.
Das hierin offenbarte IL-2-Genexpressionssystem für T-Zellen ermöglicht es aktivierten Zellen, ausreichend endogenes IL-2 zu produzieren, um ihre Aufrechterhaltung in vivo zu unterstützen; folglich wird eine Apoptose verhindert und es besteht keine Notwendigkeit für eine systemische Verabreichung von IL-2.
In einer kontrollierten Studie wurden verschiedene T-Zell-Populationen mit einem AAV-Plasmid transfiziert, das IL-2 cDNA aufwies und mit Liposomen komplexiert war; diese Populationen wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet, Wachstum und Proliferation ohne exogenes IL-2 in vitro beizubehalten.
Für T-Zellen zeigten die Tests, dass bei einer Transfektion mit dem IL-2-Gen primäre und aktivierte CD8⁺ T-Zellen stärker proliferierten als Kontrollen, die mit irrelevanten Genen transfiziert wurden.
Das Wachstumsniveau der mit IL-2 transfizierten CD8+ Zellen wurde ohne exogenes IL-2 aufrechterhalten, und eine Apoptose wurde wesentlich reduziert. Eine Southern-Blot-Analyse an diesen transfizierten T-Zellen deutete auf die Anwesenheit des IL-2-Plasmids bis zu 25 Tage lang hin. Die vorliegenden Daten demonstrieren, dass der IL-2-Gentransfer in ex vivo aktivierte und expandierte CD8⁺ Zellen das Wachstum solcher Zellen unterstützte und eine Apoptose ohne exogenes IL-2 verhinderte.
Zu genmodifizierbaren Zellen gehören unter anderem: primäre Lungen-, Eierstock- und Brustkarzinome; Melanome; autologe Fibroblasten; transformierte B-Zellen; dendritische Zellen; und Zellen von Zelllinien. Genmodifizierte Zellen wie diese können alleine oder in Verbindung mit Tumorzellen zur Stimulierung von TIL verwendet werden. Genmodifizierte Zellen können so gestaltet werden, dass sie tumorassoziierte Antigene (z. B. HER2, K-ras, Muzine) exprimieren, die zur Bereitstellung einer Antigenpräsentation zur TIL-Stimulierung während der Kultur von Nutzen sind. Ferner können antigenpräsentierende Zellen wie transformierte B-Zellen und dendritische Zellen genmodifiziert und so gestaltet werden, dass sie tumorassoziierte Antigenpeptide wie MAGE-1 und MART-1 exprimieren, um eine Antigenpräsentation zur TIL-Stimulierung während der Kultur bereitzustellen. Die vorliegenden Daten demonstrieren die Fähigkeit für eine Transfektion von T-Zellen und neoplastischen Zellen mit hoher Effizienz für sowohl kurzzeitige als auch anhaltende DNA-Expression. Die Transfektion fand in Abwesenheit eines rekombinanten Virus statt (produzierbar von rep- und cap-Kapsidpartikeln in adenoviral infizierten Zellen). Die durch die AAV-Transfektion gewonnenen Zellen werden zur Behandlung von Patienten verwendet. Die mit solchen Zellen behandelten Patienten profitieren von einer spürbaren therapeutischen Wirkung.
1. Reaktantenpräparation und verwendete Protokolle
a. Plasmide
i. Plasmid pACMV-IL2
Das Plasmid (pACMV-IL2) enthält das humane Interleukin-2-Gen (IL-2) als IL-2 cDNA und das unmittelbar frühe Promotor-Enhancer-Element des humanen Zytomegalie-Virus (CMV) und Ratten-Präproinsulin und SV40 Polyadenylierungssequenzen, die durch terminale invertierte Wiederholungen (ITR) des adenoassoziierten Virus an beiden Enden flankiert sind. Ein entsprechendes Kontrollplasmid pBC12/CMV-IL2 war mit pACMV-IL2 identisch, ihm fehlten jedoch die AAV terminalen Wiederholungen. 1 stellt Plasmidkarten von pACMV-IL2 und pBC12/CMV-IL2 dar.
ii. Plasmid pMP6-IL2
Wie in 2 dargestellt ist, ist das Plasmid pMP6-IL2 ein doppelsträngiges kreisförmiges Plasmid. Beim Plasmid pMP6-IL2 befindet sich das humane Interleukin-2-Gen unter der Kontrolle eines CMV-Promotors und eines SV40 Polyadenylierungssignals. Zwischen dem Promotor und den Kodierungssequenzen von IL-2 befindet sich ein Intron, das die Expression von IL-2 verstärkt. Die gesamte Expressionskassette befindet sich zwischen den linken und rechten terminalen Sequenzen des adenoassoziierten Virus. Das Plasmid pMP6-IL2 hat außerdem ein Bluescript-Gerüst; das Gerüst hat einen Col-E1 Bakterien-Replikationsstartpunkt und ein Ampicillinresistenzgen, das die Propagierung dieses Plasmids in E, coli erleichtert.
Die 3a–e stellen die DNA-Sequenz des pMP6-IL2 Plasmids dar; die Felder a bis e stellen aufeinander folgende Teile der Sequenz dar. In der Figur sind Teile der pMP6-IL2 Sequenz angegeben, die mit bekannten DNA-Sequenzen übereinstimmen; die entsprechende Sequenzinformation steht direkt unterhalb der Sequenzinformation für das pMP6-IL2 Plasmid. Nicht markierte Sequenzen sind von Linkern.
Die pMP6-IL2 Plasmide wurden durch alkalische Lyse und Ammoniumacetatpräzipitation gereinigt. Die Konzentration der Nucleinsäure wurde durch UV-Absorption bei 260 nm bestimmt.
iii. Plasmid pA1CMVIX-CAT
Das Plasmid pA1CMVIX-CAT enthält das CMV-Promotor-Enhancer-Element, die dazwischen liegenden Spleiß-Akzeptor-Sequenzen, das bakterielle Chloramphenicol-Acetyltransferase-(CAT)-Gen und das späte Simian-Virus-540-Polyadenylierungssignal, das durch AAV terminale Wiederholungen in einem pBR 322 Derivat flankiert ist.
Die Plasmide wurden durch alkalische Lyse und Ammoniumacetatpräzipitation gereinigt. Die Nucleinsäurekonzentration wurde durch UV-Absorption bei 260 nm gemessen.
b. Liposompräparation
i. Mit pACMV-IL2 verwendete Liposome
Kleine unilamellare Liposome wurden vom kationischen Lipid Dioctadecyl-Dimethyl-Ammonium-Bromid (DDAB) (Sigma) in Kombination mit dem neutralen Lipid Dioleoyl-Phosphatidyl-Ethanolamin (DOPE) (Avanti Polar Lipids) präpariert. Die Lipide wurden in Chloroform aufgelöst. DDAB wurde mit DOPE in einem Rundkolben in einem Molverhältnis von 1 : 1 vermischt. Das Lipidgemisch wurde auf einem Rotationsverdampfer getrocknet. Der Lipidfilm wurde durch Zugabe von sterilem doppelt destilliertem Wasser rehydratisiert, um eine Endkonzentration von 1 mM DDAB zu erhalten. Diese Lösung wurde in einem Badbeschallungsgerät (Laboratory Supplies, Hicksville, NY) beschallt, bis sie klar war. Die Liposomen wurden bei 4°C unter Argon gelagert.
ii. Mit pMP6-IL2 verwendete Liposome
Liposome wurden durch Kombinieren des kationischen Lipids Dioctadecyl-Dimethyl-Ammonium-Bromid (DDAB) mit dem neutralen Lipid Dioleoyl-Phosphatidyl-Ethanolamin (DOPE) in einem Molverhältnis von 1 : 1 oder durch Kombinieren von DDAB mit Cholesterol in einem Molverhältnis von 1 : 0,6 und Eindampfen der Lipide zur Trockne in einem Rotationsverdampfer präpariert. Die Lipide wurden in sterilem deionisiertem Wasser resuspendiert, um eine Konzentration von 1 mM DDAB zu erhalten, und dann in einem Ultraschallbad beschallt, bis sie klar waren. Die Liposomen wurden bei 4°C unter Argon gelagert und waren wenigstens 4 Monate lang stabil.
iii. Bei der TIL-Stimulation verwendete Liposome
Liposome wurden durch Kombinieren des kationischen Lipids (DDAB) mit dem neutralen Lipid (DOPE) oder Cholesterol in einem Molverhältnis von 1 : 1 oder 1 : 2 und Eindampfen der Lipide zur Trockne in einem Rotationsverdampfer präpariert. Die Lipide wurden in sterilem deionisiertem Wasser resuspendiert, um eine Konzentration von 1 mM DDAB zu erhalten. Die Lösung wurde dann in einem Ultraschallbad beschallt, bis sie klar war. Die Liposome wurden bei 4°C unter Argon gelagert und waren mindestens 4 Monate lang stabil.
c. Zellpräparation
i. Isolierung von TIL-Zellen
TIL-Zellen wurden mit AIS MicroCELLectoren^® selektiert. Das Ausgangsmaterial umfasste Tumor- oder Lymphsystemproben von Patienten mit einer Neoplasie. Die T-Zellen wurden anschließend mit in der Technik bekannten Verfahren aktiviert, wie zum Beispiel durch die Verwendung von IL-2. Die aktivierten Zellen wurden 20 Tage lang wachsen gelassen.
ii. Isolierung von T-Zellen und neoplastischen Zellen
Primäre T-Zellpopulationen wurden von einkernigen peripheren Blutzellen isoliert, und TIL und Tumorzellen wurden mit Geräten (Microcellector^®, Applied Immune Sciences) isoliert. Die Zellen wurden für eine Transfektion gemäß Standardverfahrensweisen präpariert.
1) Neoplastische Zellen von einer festen Gewebequelle
Zur Gewinnung einer zu transfizierenden Zellpopulation wurden Zellen von festen primären oder metastatischen Läsionen oder von Lymphsystemgewebe gewonnen. Biopsien von Brusttumoren wurden zum Beispiel von Patientinnen erhalten, die aufgrund einer präoperativen Diagnose eines refraktären oder rekurrenten Brustkrebsverdachtes einer Operation unterzogen wurden. Diese Studien wurden auch erfolgreich mit Zellen von einem Eierstocktumor durchgeführt. Die Biopsiegewebekerne wurden geteilt, wobei Fragmente zur Routinepathologie durch Lichtmikroskopie und immunohistochemische Analyse verarbeitet wurden.
Demzufolge wurden frisch exzidierte Tumore in 0,5 cm große Würfel geschnitten. Bis zu 10 Tumorwürfel wurden in einen 25 ml Schleuderkolben gegeben, der 25 ml AIM-V-Medium (GIBCO) enthielt. Der Kolben wurde in einen Inkubator (37°C) gesetzt, der 5% CO₂ enthielt; der Kolben wurde vorsichtig mit 100–120 UPM 12–18 Stunden lang gerührt. Nach der Inkubation wurde nicht disaggregiertes Gewebe filtriert und dann Zellen in Suspension pelletiert. Die pelletierten Brustkrebszellen wurden in Gewebekulturkolben (Falcon) in AIM-V-Medium gegeben. Die Zellen wurden in befeuchteter Luft mit 5% CO₂ bei einer Temperatur von 37°C gehalten.
Nach einer 48-stündigen Kultivierung in dem serumfreien Medium wurden adhärente und nichtadhärente Zelllinien durch Ansaugen der nichtadhärenten Zellen erzeugt. Die nichtadhärenten Zellen wurden gewaschen und dann in einem frischen Kolben rekultiviert. Im Laufe der Rekultivierung wurden die adhärenten Zellen bis zur Konfluenz wachsen gelassen, trypsinisiert mit 0,05 Trypsin und 0,02% EDTR und bei hoher Zelldichte in neue Kolben geführt.
Alternativ wurden primäre Lungen-, Eierstock- und Brusttumorzellen von festen Tumorproben gewonnen und wie folgt isoliert: der Tumor wurde zerkleinert und 2 Stunden lang einem enzymatischen Verdau unterzogen. Das Gewebe wurde anschließend homogenisiert und mit PBS gewaschen. Lymphozyten wurden von nichtlymphoiden Zellen durch Auffangen auf AIS MicroCELLector-CD5/8-Geräten separiert. Die nichtadhärente Population enthielt Tumorzellen, die in RPMI 1640 + 10% FBS mit L-Glutamin und Pen/Strep kultiviert wurden.
2) Neoplastische Zellen von einer Fluidquelle
Als eine alternative Quelle für Zellen, die letztendlich transfiziert werden, wurde malignes Ascites-Fluid oder Pleuraleffusionen zum Isolieren autologer neoplastischer Zellen verwendet. Demzufolge wurde malignes Ascites- oder Effusionsfluid zentrifugiert, und die zellhaltigen Pellets wurden in AIM-V-Medium resuspendiert. Die Zellen wurden gezählt, und die Lymphozyten-Subpopulation wurde entweder durch die Verwendung eines 2-Stufen-Ficoll-Gradienten oder durch die Verwendung von AIS CELLector^®-CD5/CD8-Geräten erschöpft. Die Wahl zwischen dem Ficoll-Gradienten und den AIS-CELLector^®-CD5/CD8-Geräten wurde im Hinblick auf die gesamte Zelldichte getroffen, wie die allgemein fachkundige Person verstehen wird. Die Isolierung neoplastischer Zellen von einer Fluidquelle ist besonders relevant für Malignitäten wie Eierstock- und Lungenkrebs, die bekanntlich mit Pleuraleffusionen zusammenhängen. Die T-Zellen-erschöpfte Fraktion wurde hinsichtlich neoplastischer Zellen verstärkt.
Alle autologen neoplastischen Zellen wurden durch Lichtmikroskopie, Durchflusszytometrie und immunohistochemische Färbung charakterisiert, um die Onkogenexpression zu prüfen und einen Proliferationsindex festzulegen. Für Studien mit Brustkrebspatientinnen wurden zum Beispiel nur Zellen als autologe Tumorzellen angesehen und anschließend als solche verwendet, die morphologische Brustkrebszellen waren oder die mit brustkrebsspezifischen Antikörpern anfärbten.
3) Zelllinien
Zellen der Maus-B-Lymphomzelllinie 38C13 wurden von Dr. Bernd Gansbacher (Sloan Kettering Memorial Cancer Center) zur Verfügung gestellt; Zellen der Ratten-Prostatazelllinie R3327 wurden von Dr. Eli Gilboa (Duke University) bereitgestellt; und Zellen der MDA-231 Brusttumorzelllinie wurden von der RTCC erhalten.
d. Celluläre Transfektion „Lipofektion"
i. Lipofektion von TIL-Zellen
Zur Transfektion von TIL-Zellen wurden 5 – 10 × 10⁶ Zellen in 1 ml serumfreiem Medium je Well einer 6-Well-Schale plattiert. 50 μg Plasmid-DNA, die IL-2 Genommaterial (z. B. pMP6-IL2) beinhaltete, wurden mit 50 nmol DDAB vermischt (als Liposome bestehend aus DDAB und DOPE in einem Molverhältnis von 1 : 1). Serumfreies Medium (0,5 ml) wurde zum AAV : Liposom-Komplex gegeben. Der AAV : Liposom-Komplex und serumfreies Medium wurden dann zu den Zellen gegeben. Zur Beeinflussung der Lipofektion wurden die Zellen bei Raumtemperatur 5 Minuten lang inkubiert, anschließend wurde fetales Rinderserum zu den Zellen gegeben, um eine Endkonzentration von 5% fetalem Rinderserum zu erhalten.
Die transfizierten TIL-Zellen werden zum Patienten zurückgeführt. Diese Zellen bieten die therapeutischen Vorzüge zytotoxischer TIL-Zellen in Kombination mit IL-2. Vorteilhafterweise wird die Notwendigkeit einer systemischen Verabreichung von IL-2 einem Patienten, um zytotoxische T-Zell-Aktivität zu bewahren, reduziert oder eliminiert. Eine Verringerung der Menge von systemisch verabreichtem IL-2 ist von Vorteil, da in dieser Weise verabreichtes IL-2 bekanntlich mit potentiell letaler, dosisbezogener Toxizität zusammenhängt.
ii. Lipofektion neoplastischer Zellen
Eine neoplastische Zellkultur, wie zum Beispiel eine Kultur von Brustkrebszellen oder Eierstocktumorzellen, wurde in der folgenden Weise transfiziert: neoplastische Zellen (1 × 10⁶ Zellen) wurden mit 5 Mikrogramm Plasmid-DNA (z. B. pMP6-IL2), die mit 30 nmol Gesamtlipid vermischt war, transfiziert, wobei das Lipid Liposome umfasste, die aus DDAB und DOPE in einem Molverhältnis von 1 : 1 bestanden. Ein ml AIM-V-Medium wurde zum Liposom-DNA-Komplex gegeben und bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubiert. Die Kombination aus Medium und Liposom-DNA-Komplex wurde dann zu den Zellen übertragen. Die Zellen wurden daraufhin 24 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen letal bestrahlt (10.000 Rad).
Alternativ wurden DNA-Liposom-Komplexe mit dem folgenden Verfahren gebildet: die gewünschte Menge DNA wurde in ein steriles Glasfläschchen gegeben; 1 oder 2 nmol DDAB je μg DNA wurden zugegeben und vermischt. Anschließend wurde 1 ml serumfreies Medium zum Liposom-DNA-Komplex gegeben. Alle zu transfizierenden Zellen wurden in 6-Well-Platten plattiert. Primärtumor und Tumorzelllinien wurden zu 1 × 10⁶ Zellen je Well in 2 ml serumfreiem Medium plattiert. Der Liposom-DNA-Komplex wurde zu den Zellen gegeben und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. FBS wurde zugegeben, um die Endkonzentration auf 10% zu bringen.
e. Transgenexpressionstest
i. Extrazelluläre Tests
Die Expression des Transgens wurde durch Prüfen der IL-2-Expression durch die letal bestrahlten Zellen dokumentiert; diese IL-2-Tests können per Elisa-Test gemäß Informationen erfolgen, die der allgemein fachkundigen Person bekannt sind.
Zellfreie Überstände wurden aufgefangen und ihre IL-2-Konzentration durch Elisa zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmt. IL-2-Tests wurden zum Beispiel an 72-Stunden-Überständen im Duplikat durchgeführt. Eine erfolgreiche Transfektion genmodifizierter Zellen wurde damit definiert, wo IL-2-Konzentrationen von > 100 pg/72h/10⁶ Zellen erhalten wurden.
ii. Intrazelluläre Tests
Zellen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten geerntet, mit PBS gewaschen und in kaltem 1% Paraformaldehyd in PBS resuspendiert. Nach 10 Minuten bei 4°C wurden die Zellen mit kaltem Saponinpuffer (0,1% Saponin, 10% FBS in PBS) gewaschen und mit Maus-Antihuman-IL-2-Antikörper 15 Minuten lang bei 4°C angefärbt. Die Zellen wurden dann mit kaltem Saponin-Puffer gewaschen und mit FITC-konjugiertem Ziegen-Antimaus-F(ab')2-Antikörper 15 Minuten lang bei 4°C angefärbt. Zellen wurden mit Saponin und anschließend PBS gewaschen und per Durchflusszytometrie analysiert.
f. Southern-Hybridisierung für IL-2 DNA
Chromosomale DNA wurde durch Hirt-Fraktionierung isoliert. Im Anschluss an Restriktionsverdaus wurden 5 μg DNA je Probe der Elektrophorese unterworfen, zu Hybond N + Nylonmembran übertragen und mit dem 0,685 kb IL-2-Fragment hybridisiert.
g. Zytotoxizitätstest
Targetzellen wurden mit 100 μCi ⁵¹Cr je 1 × 10⁶ Zellen markiert. 5000 Targetzellen wurden im Triplikat in 96-Well-Platten plattiert. Effektorzellen wurden zugegeben, um ein Verhältnis zwischen Effektor und Target von 20 : 1 zu erzielen. 100 μl Überstand von jedem Well wurden nach einer 4-stündigen Inkubation aufgefangen und in einem γ-Zähler gezählt.
h. Proliferationstest
Zum Testen der Proliferation wurden 5 × 10⁹ Zellen in 100 μl AIM-V-Medium im Triplikat in 96-Well-Platten plattiert. Jeder Well wurde mit 1 μCi ³H-Thymidin gepulst. Zellen wurden 24 Stunden später geerntet und mit einem Szintillationszähler gezählt.
i. TCR-Analyse
TIL-Zellen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten in Kultur und nach Stimulationsexperimenten eingefroren. Die TCR-Restriktion wurde durch Umkehrtranskriptase-(RT)-PCR gemäß in der Technik bekannten Verfahrensweisen analysiert.
2. Resultierende Daten und Ergebnisses
a. Ex-vivo-Aktivierung von tumorspezifischem CTL; Stimulierung von TIL-Zellen im Laufe der Kultur
Die Stimulierung erfolgte mit TIL, die in einem 50 : 1-Verhältnis mit autolog bestrahltem Tumor kultiviert wurden; oder mit IL-2-transfiziertem, bestrahltem autologem Tumor. Die Stimulationsdauer betrug 5–7 Tage. Diese Zellen wurden mit TIL verglichen, die in mit 600 I. E./ml rIL-2 angereichertem AIM-V-Medium kultiviert wurden. Die Zellen wurden nach der Stimulierung hinsichtlich Veränderungen des Phänotyps, der zytotoxischen Aktivität, Proliferation und des TCR-Repertoirs untersucht. Dieses einfache und schnelle Verfahren zur Stimulierung von TIL-Zellen während der Kultur wird sowohl bei In-vitro- als auch bei In-vivo-Gentransferprotokollen angewendet.
Als alternatives Mittel zur Stimulierung von TIL in Kultur können tumorassoziierte Antigenpeptide direkt zur TIL-Kultur gegeben werden.
i. Stimulierung von TIL mit transfizierten neoplastischen Zellen
Zur Kultivierung von TIL mit transfizierten neoplastischen Zellen wurden neoplastische Zellen zum Beispiel mit pMP6-IL2 transfiziert und bestrahlt. Vierundzwanzig Stunden nach der Bestrahlung wurden die transfizierten Zellen gewaschen, durch Trypsinisierung geerntet, durch Zentrifugation pelletiert und in Kulturmedium resuspendiert. Die transfizierten und bestrahlten neoplastischen Zellen wurden dann mit TIL kultiviert.
Die Tumorspezifität wurde von den TIL während der Kultur und Expansion beibehalten.
Demzufolge wurden Tumorzellen (sowohl autologe als auch HLA-übereinstimmend allogene) zur Restimulation selektierter TIL im Laufe der Expansionsphase verwendet. Dies ist von erheblichem Vorteil, da die Spezifität von T-Zellen für ihr Target im Laufe der Expansion bekanntlich gelegentlich abnimmt.
Folglich wurden Tumorzellen selbst genetisch modifiziert, z. B. mit einer Zusammensetzung aus Liposom und pMP6-IL2, um ihre Antigenität weiter zu erhöhen.
Die Langzeitkultur von TIL induzierte oft eine polyklonale Expansion, mit einer Verringerung der Tumorspezifität durch die expandierten Zellen. Wie in 13 zu sehen ist, wurde die Spezifität erhöht, wenn expandierte TIL mit autologem Tumor stimuliert wurden. Die Spezifität von TIL, die mit IL-2 transduziertem Tumor stimuliert wurden, war höher als bei nicht modifiziertem Tumor, wie anhand TCR-Repertoires beurteilt wurde. Die erhöhte Spezifität von mit transfiziertem Tumor kultivierten/stimulierten TIL war besonders bei Daten beachtenswert, die 30 Tage nach der Kultur gewonnen wurden.
Die Daten zeigten, dass kationische Liposome, die mit einem AAV-Plasmid komplexiert waren, effizient Primärtumorzellen sowie kultivierte Tumorzelllinien transfizierten. Bis zu 50% der transfizierten Zellen exprimierten IL-2, wie anhand der intrazellulären IL-2-Werte beurteilt wurde, und die Expressionsdauer lag bei bis zu 30 Tagen. Die Transgenexpressionsstärke wurde durch eine Bestrahlung von Tumorzellen nach der Transfektion nicht verändert.
Eine TCR-Analyse demonstrierte eine Expansion tumorspezifischer T-Zellen, wobei diese tumorspezifischen T-Zellen durch die Kultur von massenexpandierten TIL mit genmodifiziertem autologem Tumor beeinflusst wurden.
b. Proliferation von TIL nach Transfektion mit dem IL-2- Gen
Für die in 14 dargestellten Daten wurden Brust-TIL mit CD8-Geräten von Pleuraleffusion isoliert und drei Wochen lang in Medium kultiviert, das 600 I. E./ml IL-2 enthielt. Analoge Experimente wurden mit TIL von einem Eierstocktumor durchgeführt; die Ergebnisse stimmten mit den Ergebnissen überein, die mit Brusttumor-TIL erhalten wurden.
Etwa 10 × 10⁶ TIL-Zellen wurden mit verschiedenen Zusammensetzungen transfiziert, die pMP6-IL2-DNA : Liposom-Komplexe beinhalteten. Man testete zwei Liposomzusammensetzungen, „RPR DDAB" (Nattermann Phospholipid GmbH, Köln, Deutschland) und „1100-28" (Applied Immune Sciences, Inc., Santa Clara, CA). Die RPR DDAB Liposome hatten ein DDAB : DOPE-Verhältnis von 1 : 1, die 1100-28 Liposome hatten ein DDAP : DOPE-Verhältnis von 1 : 0,6. Die transfizierten TIL-Zellen wurden dann ohne irgendein exogenes IL2 kultiviert; positive Kontrollen wurden in Anwesenheit von 600 I. E./ml IL-2 kultiviert.
Fünf Tage nach der Transfektion wurden transfizierte und nicht transfizierte Gruppen mit ³H Thymidin markiert und auf Einbau beurteilt. Die Anzahl positiver Kontrollen wurde als 100 Prozent genommen. Das prozentuale Wachstum reichte von 40–80% bei den mit RPR DDAB Liposom transfizierten Gruppen und von 40–60% bei der 1100-28 Liposomgruppe.
Die in 14 dargestellten Daten zeigen, dass mit dem IL-2-Gen transfizierte Brustkrebs-TIL kein exogenes IL-2 benötigten, um eine Proliferation in vitro zu bewahren.
c. Thy 1.2 Genexpression in TIL
Für die in 15 illustrierten Daten wurden Brustkrebs-TIL mit pMP6 Plasmid, das das Neomycin- Resistenzgen und das Maus-Thy-1.2-Gen (pMP6/neo/Thy1.2) enthielt, als alternative Ausgestaltung zum pMP6 Plasmid transfiziert, das das IL-2 Gen beinhaltete. Das pMP6/neo/Thy1.2 Plasmid wurde mit DDAB : DOPE-Liposomen komplexiert. Die Liposomzusammensetzungen waren die gleichen Zusammensetzungen wie die für die in 14 dargestellten Daten beschriebenen. Am 2. Tag wurden die transfizierten Zellen mit Anti-Thy1.2-PE-Antikörpern (Pharmingen, San Diego, Ca) angefärbt und per Durchflusszytometrie analysiert. Wie in 15 zu sehen ist, wurde der Maus-T-Zellen-Oberflächenmarker Thy1.2 in transfizierten humanen CD8+ TIL effizient exprimiert.
d. Transgenexpression in bestrahlten humanen Melanomtumorzellen nach der Transfektion
Die folgenden Daten wurden durch Transfizieren von Tumorzellen mit pMP6-IL2 erhalten. Diese Daten demonstrierten, dass die Tumorzellen erfolgreich genmodifiziert waren. Zusätzlich zu DDAB : DOPE wurden auch andere Lipidzusammensetzungen verwendet. Diese verschiedenen Lipidzusammensetzungen erreichten erfolgreich eine Lipofektion und anschließende Cytokin-Expression.
Melanomzellen wurden von metastatischen Foci durch die folgenden enzymatischen Verdaumethodiken isoliert, die der allgemein fachkundigen Person bekannt sind. Zellen wurden in mit 5–10% fetalem Kälberserum angereicherten DMEM wachsen gelassen und 5 Tage bis 8 Jahre lang kultiviert.
Zur Vorbereitung der Lipofektion wurden Tumorzellen auf 60 mm Schalen in einem Volumen von 5 × 10⁵ Zellen/Schale plattiert. Am Tag nach der Plattierung wurden Liposome, die 10–30 nmol kationisches Lipid und 2-10 μg DNA beinhalteten, vermischt und in serumfreiem Medium zu den adhärenten Monolagen übertragen. Die Zellen wurden 1–5 Stunden lang inkubiert, und FCS wurde zum Medium gegeben.
Es wurden verschiedene Liposom-Präparate erfolgreich verwendet, einschließlich: DMRIE : DOPE in einem Molverhältnis von 1 : 1 (Vical, San Diego CA); DOSPA : DOPE in einem Massenverhältnis von 3 : 1 (Gibco, Gaithersberg, MD) und DDAB : DOPE in einem Molverhältnis von 1 : 2.
Die transfizierten Zellen wurden 24 Stunden nach der Lipofektion letalen Röntgenbestrahlungsniveaus (5000 Rad) ausgesetzt. Überstände wurden nach 72 Stunden aufgefangen; anschließend wurden IL-2-Werte per Elisa gemäß Informationen gemessen, die der allgemein fachkundigen Person bekannt sind. Die höchste IL-2-Expressionsstärke, die mit den jeweiligen Liposom-Präparaten erhalten wurde, ist in Tabelle 4 aufgeführt.
Folglich wurde eine starke Expression (> 5000 pg/mi) in nicht proliferierenden lebensfähigen Zellen bis zu 26 Tage nach der Bestrahlung nachgewiesen.
TABELLE 4
Diese Daten demonstrieren eine erfolgreiche Transfektion humaner Melanomzelllinien über eine nichtvirale, liposomvermittelte Lieferung des Plasmids pMP6-IL2. Die Transfektion resultierte in einer signifikanten Produktion von IL-2 nach der letalen Bestrahlung.
e. Extrazelluläre Analysen der Transgenexpression in einer Prostatatumorzelllinie nach einer Transfektion mit verschiedenen Plasmidkonstrukten
Für einen Vergleich der Stärke und Dauer der Transgenexpression im Anschluss an Transfektionen mit verschiedenen Plasmidkonstrukten wurde die Prostatatumorzelllinie R3327 mit 10 μg Standardplasmid (pBC12/CMV-IL2) oder 10 μg AAV-Plasmid (pA CMV-IL2), das mit 10 nmol DDAB als DDAB : DOPE Liposome (1 : 2) komplexiert war, transfiziert.
Überstände wurden zu verschiedenen Zeitpunkten aufgefangen und per Elisa hinsichtlich der IL-2-Werte untersucht. Für die in 10 dargestellten Daten wurden die IL-2-Werte in pg/ml/10⁶ Zellen in 24-h-Kultur ausgedrückt. Eine Transfektion mit AAV-Plasmid erbrachte IL-2-Werte, die wesentlich höher waren als mit Standardplasmid. Darüber hinaus bewirkte eine Transfektion mit AAV-Plasmid eine mindestens 30 Tage lange IL-2-Produktion, im Gegensatz von nur 7 Tagen mit Standard-IL-2-Plasmid.
17 zeigt eine Southern-Blot-Analyse chromosomaler DNA von R3327 Zellen, die mit einem AAV-Plasmid (pACMV-IL2) oder dem Standardplasmid (pBC12/CMV-IL2) transfiziert wurden. Der Blot wurde mit dem 0,685 kb Bam HI/Hind III Fragment des IL-2-Gens sondiert. In 17 ist die Kontrolle (C) DNA von nicht transfizierten Zellen. Das IL-2-Insert wird in der letzten Bahn dargestellt.
f. Intrazelluläre Analysen der Transgenexpression in einer Prostatatumorzelllinie nach einer Transfektion mit AAV-Plasmidkonstrukten
Die Prostatazelllinie R3327 wurde mit AAV-IL-2-Plasmid (wie z. B. pACMV-IL2) transfiziert, das mit DDAB : DOPE Liposomen komplexiert war; die Liposomen lagen in einem Zusammensetzungsverhältnis zwischen DDAB und DOPE von 1 : 1 oder 1 : 2 vor. Das Verhältnis zwischen DNA und Liposom lag in beiden Gruppen bei 10 μg DNA : 10 nmol DDAB.
Transfizierte Zellen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten für intrazelluläre IL-2-Proteinanteile mittels eines modifizierten Durchflusszytometrieverfahrens wie hierin beschrieben angefärbt; die Ergebnisse sind in 18 dargestellt. Die Daten in 18 sind als prozentualer Anteil positiver Zellen dargestellt, die IL-2-Protein exprimieren. Nicht transfizierte Zellen wurden als negative Kontrollen verwendet, und die Werte der Kontrollen wurden von den Werten der transfizierten Gruppen subtrahiert.
g. Transgenexpression in primären Tumorzellen
AAV-Plasmid-Liposom-Komplexe wurden zum Transfizieren verschiedener Primärtumorzellen verwendet. Eine Lungen-, eine Eierstock- und zwei Brusttumorproben wurden von frischen Tumorbiopsien isoliert. Tumorzellen wurden in mit 10% FBS angereichertem RPMI-1640 Medium 2–3 Wochen lang vor der Transfektion kultiviert.
Die Primärtumorzellen wurden mit 10 μg Plasmid (wie z. B. pACMV-IL2) transfiziert, das mit 10 nmol DDAB als DDAB : DOPE (1 : 1) komplexiert war. Überstände wurden am 2. und 3. Tag aufgefangen. IL-2-Werte wurde durch Elisa gemessen; die Ergebnisse sind in 6 dargestellt, in der die IL-2-Werte in pg/ml/10⁶ Zellen in 24-h-Kultur ausgedrückt sind.
h. Transgenexpression nach Bestrahlung primärer Brusttumorzellen und Zellen der Prostatatumorzelllinie
Zum Bestimmen des Bestrahlungseffektes auf die Genexpression wurden primäre Brusttumorzellen und Zellen einer Prostatazelllinie (R3327) mit einer Zusammensetzung transfiziert, die pACMV-IL2 und DDAB : DOPE-Liposomkomplexe beinhaltete, und im Anschluss an die letale Bestrahlung hinsichtlich Genexpression beurteilt. Die Daten für die Tumorzelllinie sind in 19A, die Daten für die Primärtumorzellen in 19B enthalten. In diesen Studien war das Transgen für IL-2. Am 2. Tag wurde ein aliquoter Teil der Zellen mit einem ⁶⁰Co Bestrahlungsgerät 6000 r ausgesetzt und dann zur Kultur zurückgeführt. Überstände wurden 24, 48, 72 und 96 Stunden nach der Bestrahlung aufgefangen und hinsichtlich der IL-2-Werte getestet. Wie in 19 zu sehen ist, führte die letale Bestrahlung nach der Transfektion zu keiner Transgenexpressionsinhibition. In 19 sind die IL-2-Werte in pg/ml/10⁶ Zellen in 24-h-Kultur ausgedrückt.
IV. BESPRECHUNG
In den vorliegenden Studien wurden das AAV-Plasmid, das Transgen und AAV terminale Wiederholungen beinhaltete, als DNA-Vektor und kationische Liposome als Trägermoleküle verwendet. Es wurde gezeigt, dass die AAV-Plasmid-DNA : Liposomen-Komplexe Primärtumorzellen, kultivierte Zelllinien, Primärlymphoidzellen und CD34⁺ Stammzellen effizient transfizierten. Es wurde außerdem demonstriert, dass in Abwesenheit eines rekombinanten Virus (produzierbar von rep- und cap-Kapsid-Partikeln in adenoviral infizierten Zellen) eine Integration mit starker und anhaltender Expression von Transgen durch das elegante Transfektionsverfahren erreicht wird.
Zusätzlich zu einer starken Expression induzierte die hierin offenbarte Kombination aus AAV-Plasmid und Liposomen eine langfristige (bis zu 30 Tage lange) Expression von Genen (5a–b) im Gegensatz zur kurzzeitigen Expression, die mit einer typischen liposomvermittelten Transfektion erreicht wird. Eine anhaltende Expression wird insbesondere in der mit AAV-Plasmid lipofizierten Gruppe sowie in der mit rekombinantem AAV transduzierten Gruppe demonstriert (5a–b). Ferner wurden mit AAV-Plasmid um das Zehnfache höhere Expressionsstärken im Vergleich zur Standardplasmid-Transfektion beobachtet, wie in 4a–b dargestellt ist.
Unter den hierin offenbarten Testbedingungen gab es zwischen der optimalen AAV-Transdektion und der maximalen AAV-Plasmid : Liposom-Transfektion keinen Unterschied in Bezug auf die Effizienz. Was den Zeitverlauf der Expression betrifft, so wurde zuvor gezeigt, dass kationische Liposome lediglich eine kurzzeitige Expression von Standardplasmid-DNA in Säugetierzelltypen vermitteln (Felgner, P. L., et al., „A highly efficient, lipid-mediated DNA transfection procedure", Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84: 7413–7417; Rose, J. K., et al., „A new cationic liposome reagent mediating nearly quantitative transfection of animal cells", Biotechniques (1991) 10: 520–525). Was die Integrationseffizienz betrifft, so wurde ferner bei der früheren liposomvermittelten Transfektion eine weit weniger effiziente Integration in das Wirtsgenom im Vergleich zu den hierin offenbarten Ergebnissen beobachtet (Shaefer-Ridder, M., et al., „Liposomes as gene carriers: Efficient transfection of mouse L cells by thymidine kinase gene", Science (1982) 215: 166–168). Wie hierin gezeigt wird, erhöhten kationische Liposome, die mit RAV-Plasmid-DNA komplexiert waren, die die AAV terminalen Wiederholungen trugen, jedoch die Integration genomischer DNA im Vergleich zum Standardplasmid, dem nur die AAV terminalen Wiederholungen (ITR) fehlten. Liposome, die AAV-Plasmidmaterial umfassten, lieferten die Plasmid-DNA in Abwesenheit spezifischer Zelloberflächenrezeptoren und ersetzten die Virusfunktion bei der Genlieferung.
In den vorliegenden Studien wurde demonstriert, dass Virusvektoren komplett durch Liposome ersetzt werden können, und dass eine effiziente Expression und Integration durch die Verwendung des Konstrukts, einschließlich der viralen Elemente, die sowohl für Effizienz als auch für Integration verantwortlich sind, erzielt wurde. Auf diese Weise wird die Produktion eines Infektionsvirus verhindert, so dass die Möglichkeit eines nachteiligen rekombinanten Ereignisses praktisch eliminiert wird. Die Endergebnisse wurden mittels eines eleganten Transfektionsverfahrens erreicht, das AAV-Plasmid und kationische Liposome kombiniert.
Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung wurden durch die Kombination von AAV-Plasmid und kationischen Liposomen nicht nur effizient die kultivierten Zelllinien transfiziert, sondern auch Primärtumorzellen und periphere Blutzellen wie T-Zellen und Stammzellen. Diese Daten sind beachtenswert, da die meisten Gentherapiestrategien eine Genlieferung zu Primär-T-Lymphozyten oder Tumorzellen einschließen. Bisher stützten sich diese Strategien in erster Linie auf eine Transgeninsertion in retrovirale oder DNA-Virus-Vektoren. Als grundlegender Nachteil des Retrovirussystems gilt die Unfähigkeit einer Transfektion von sich nicht teilenden Primärzellen. Die vorliegenden Studien haben gezeigt, dass kationische Liposome, die AAV-Material beinhalteten, eine Transfektion sowohl von sich teilenden als auch von sich nicht teilenden Zelltypen vermittelten. Gemäß der Erfindung liefern AAV-Plasmid : kationische Liposome ein hocheffizientes Transfektionssystem, das eine anhaltende, starke Expression erreicht.
Vorteilhafterweise können Plasmid-DNA : Liposom-Komplexe in vivo zugeführt werden (z. B. durch intravenöse, intraperitoneale und Aerosol-Verabreichung), ohne dass es zu einer messbaren Toxizität kommt (Philip, R., et al., „In vivo gene delivery: Efficient transfection of T lymphocytes in adult mice", J. Biol. Chem. (1993) 268: 16087–16090 Stribling, R., et al., „Aerosol Gene Delivery in vivo", Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 11277–11281; Zhu, N., et al., "Systemic gene expression after intravenous DNA delivery into adult mice", Science (1993) 261: 209–211; Stewart, M. J., et al., "Gene transfer in vivo with DNA-liposome complexes: Safety and acute toxicity in mice", Human Gene Therapy (1992) 3: 267–275). Gemäß der Erfindung kann die DNA-Konzentration optimiert werden, um eine maximale Expression zu erreichen. Der Gentransfer mit Liposomen, die AAV-Material umfassten, übertrug AAV- und Transgenmaterial ex vivo in eine große Vielfalt von Zelltypen und ist auch in vivo von Nutzen. Die vorliegenden Ergebnisse sind für jedes Gentherapieprotokoll von enormem Nutzen.
Ferner wurden verschiedene primäre neoplastische Zelltypen, neoplastische Zelllinien und mehrere T-Zell-Subpopulationen mit AAV-Plasmiden unter Verwendung von DNA : Liposom-Komplexen transfiziert. Wie hierin gezeigt, erleichterten kationische Liposome adenoassoziierte virale (AAV) Plasmidtransfektionen in Zellen. Die Transfektion von Primärtumorzellen war sehr verlockend, da die Transfektion solcher Zellen im Allgemeinen sehr schwierig ist. Neben einer starken Expression induzierte die Verwendung von AAV-Plasmid : Liposomen eine langfristige (> 30 Tage) Transgenexpression. Darüber hinaus wurde das Plasmid nach einer Aktivierung und Transfektion naiver T-Zellen mit IL-2-Plasmiden mindestens 25 Tage lang nach der Transfektion in einem nichtselektierten Zustand in den Zellen nachgewiesen. Diese Erkenntnisse stehen im Gegensatz zur kurzzeitigen Expression, die mit einer typischen liposomvermittelten Transfektion unter Verwendung von Standardplasmiden erreicht wird.
Ferner wurde festgestellt, dass mit Cytokin-Transgen transfizierte TIL expandieren, ohne dass exogenes Cytokin erforderlich ist. Dieses Ergebnis ist sehr vorteilhaft, da TIL Patienten zugeführt werden können, ohne dass eine Behandlung mit systemischem IL-2 notwendig ist, so dass die gefährlichen Nebenwirkungen einer systemischen IL-2-Behandlung vermieden werden.
Die IL-2-Genexpression in den transfizierten T-Zellen veränderte die Effekte von exogenem IL-2-Entzug. Insbesondere IL-2-transfizierte T-Zellen produzierten ausreichend endogenes IL-2, um ihr Wachstum und ihre Proliferation zu bewahren und eine Apoptose zu verhindern, die normalerweise mit dem exogenen IL-2-Entzug von den Effektor-T-Zellen stattfindet, wie in der Technik bekannt ist. Die Abhängigkeit von exogenem IL-2 wurde beseitigt.
Primäre Brust-, Lungen- und Eierstocktumorzellen waren unter Verwendung von AAV-Plasmid-DNA : Liposom-Komplexen transfizierbar. Transfizierte primäre und kultivierte Tumorzellen konnten das Transgenprodukt selbst nach einer letalen Bestrahlung exprimieren.
Ausgestaltungen der vorliegenden Offenbarung beinhalten, dass Tumorzellen (sowohl autolog als auch HLA-übereinstimmend allogen) zum Restimulieren ausgewählter TIL im Laufe der Expansionsphase verwendet werden können. Transfizierte neoplastische Zellen werden in Tumorvakzinsationsprotokollen verwendet. Typischerweise werden die transfizierten neoplastischen Zellen zusammen mit einem pharmazeutischen Bindemittel bereitgestellt, wie in der Technik bekannt ist. Transfizierte neoplastische Zellen werden auch zum Stimulieren entsprechender TIL-Zellen während der Kultur verwendet. Phänotyp-, Zytotoxizitäts- und T-Zell-Rezeptor-Analysen demonstrierten, dass, obwohl TIL zu Anfang Tumorzellenspezifität aufwiesen, als sie vom Tumor isoliert wurden, die Langzeitkultur in rIL-2 oft eine polyklonale Expansion und einen Verlust von Tumorspezifität induzierte. Durch eine Kultur von TIL in einem Milieu, das neoplastische Zellen und bevorzugterweise transfizierte neoplastische Zellen enthielt, wurde die Tumorspezifität der expandierten TIL-Zellen deutlich erhöht.
Die hierin und in den beiliegenden Ansprüchen verwendeten Singularformen „ein/eine/einer", und „der/die/das" schließen Pluralangaben ein, sofern der Kontext nicht deutlich etwas anderes sagt. Der Verweis auf „eine Formulierung" schließt somit zum Beispiel Gemische verschiedener Formulierungen ein, und der Verweis auf „das Behandlungsverfahren" schließt Verweise auf entsprechende Schritte und Verfahren ein, die der fachkundigen Person bekannt sind, und so weiter.
Sofern nicht anders angegeben, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, die der allgemein fachkundigen Person, für die diese Erfindung bestimmt ist, geläufig ist. Es können zwar beliebige Verfahren und Materialien, die den hierin beschriebenen ähnlich sind oder diesen entsprechen, in der Praxis oder Erprobung der Erfindung verwendet werden, doch werden die bevorzugten Verfahren und Materialien nun beschrieben.
Captions to figures:
1.

AAV right TR = AAV rechte TR
CMV immediate/early promoter = unmittelbar früher CMV-Promotor
rat preproinsulin II gene = Ratten-Präproinsulin-II-Gen
intron = Intron
poly A = poly A
pEMBL8(+) backbone = pEMBL8(+)-Gerüst
pXF3 backbone = pXF3-Gerüst
SV40 ori = SV40 Urs
AAV sequence containing left TR = AAV-Sequenz mit linker TR CMV immediate/early promoter and splice donor site = ummittelbar früher CMV-Promotor und Spleiß-Donorstelle
Splice acceptor sequence = Spleiß-Akzeptor-Sequenz
CAT gene + SV40 L poly A = CAT-Gen + SV40 L poly A
AAV sequence containing right TR = AAV-Sequenz mit rechter TR
pBR322 derivative backbone = pBR 322 Derivatgerüst

2:

CMV Promoter = CMV-Promotor
Intron = Intron
Bluescript backbone = Bluescript-Gerüst

3A:

Bluescript KS II + = Bluescript KS II + Left terminal region of AAV = Linke terminale Region von AAV
CMV Promoter = CMV-Promotor

3B:

Adeno virus major late intervening sequence = Späte Haupt-Intervening-Sequenz des Adenovirus
Mouse immunoglobulin intervening sequence = Maus-Immunglobulin-Intervening-Sequenz
Rat preproinsulin 5' untranslated region = 5' nicht translatierte Region von Ratten-Präproinsulin
Rat insulin signal peptide = Ratten-Insulin-Signalpeptid

3C:

Human IL-2 = Humanes IL-2
SV40 Polyadenylation signal = SV40 Polyadenylierungssignal
Right terminal region of AAV = Rechte terminale Region von AAV

3D + 3G

Bluescript KS II + = Bluescript KS II +

4A:

BLADDER = BLASE
PROSTATE = PROSTATA
CELL LINE = ZELLLINIE

4B, 5A, 5B:

DAYS = TAGE

6:

Lung = Lunge
Ovarian = Eierstock
Breast-1 = Brust-1
Breast-2 = Brust-2
DAY-2 = TAG-2
DAY-3 = TAG-3
DAYS = TAGE

7A, 7B, 19A, 19B:

No-Irradiation = Keine Bestrahlung
Irradiation = Bestrahlung
PRE = VORHER
24HR POST = NACH 24 h
48HR POST = NACH 48 h
72HR POST = NACH 72 h
96HR POST = NACH 96 h
DAYS = TAGE

8:

β-gal Positive = % β-gal-positiv
DAYS = TAGE

9B:

10 μg PACMVIXCAT + 10 nmole D as D : D 1.1 = 10 μg PACMVIXCAT + 10 nmol D als D : D 1 : 1

11A:

1 kb ladder = 1 kb Leiter
control plasmid = Kontrollplasmid
parent = Stamm

11B:

parent = Stamm

12A:

endogenous bands = endogene Banden
7 hr exposure = 7 h Einwirkung
(didn't digest) = (verdaute nicht)
Blank = Leer
kb ladder = kb Leiter
Blot D2 = Blot D2
IL2 band = IL-2 Bande

13:

TIL + Irra Tumor/d 34 = TIL + Bestr. Tumor/d 34
TIL + IL2 Transf. Tumor/D34 = TIL + IL2 transf. Tumor/D34

14:

PERCENT GROWTH = WACHSTUM IN
DNA (μg):Liposome (nM) = DNA (μg):Liposom (nM)

15:

PERCENT POSITIVE = POSITIV IN
DNA(μg):Liposome(nm) = DNA(μg):Liposom(nM)

16:

DAYS = TAGE

17:

day = Tag
plasmid = Plasmid

18:

PERCENT POSITIVE = POSITIV IN
day = Tag
DNA : liposomes = DNA : Liposome

Claims

Zusammensetzung zur genetischen Manipulation, umfassend: ein Liposom, das Lipidmaterial beinhaltet; und adenoassoziierte Virus-DNA, die eine oder mehrere terminale invertierte Wiederholungen umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei sich die adenoassoziierte Virus-DNA in einem Plasmid befindet.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das Plasmid pMP6-IL2, wie in 3 dargestellt, oder pACMV-IL2 ist, wie in 1 dargestellt.
Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die adenoassoziierte Virus-DNA zwei terminale invertierte Wiederholungen umfasst.
Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, ferner umfassend eine genetische Sequenz von Interesse.
Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei eine genetische Sequenz von Interesse zwischen zwei terminalen invertierten Wiederholungen eingebaut ist.
Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei ein Promotor zwischen zwei terminalen invertierten Wiederholungen eingebaut ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei der Promotor ein unmittelbar früher CMV-Promotor, ein unmittelbar später CMV-Promotor, ein früher CMV-Promotor, ein ADA-Promotor oder ein TK-Promotor ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei die genetische Sequenz von Interesse ein IL-2-Gen oder ein β-Gal-Gen umfasst.
Zusammensetzung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Lipidmaterial ein kationisches Lipid umfasst.
Verfahren zur Einführung einer genetischen Sequenz von Interesse in eine Wirtszelle, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Bereitstellen einer Zusammensetzung, umfassend ein Liposom, eine adenoassoziierte Virus-DNA, umfassend eine oder mehrere terminale invertierte Wiederholungen und eine genetische Sequenz von Interesse; und Inkontaktbringen der Zusammensetzung ex vivo mit einer Wirtszelle, die genetisches Material beinhaltet, so dass die genetische Sequenz von Interesse in die Wirtszelle eingeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Wirtszelle eine CD34⁺ Stammzelle, eine T-Zelle, eine Zelle einer Tumorzelllinie oder eine Primärtumorzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Wirtszelle ein tumorinfiltrierender Lymphozyt, eine CD3⁺, CD4⁺ oder CD8⁺ Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Zelle von einer Tumorzelllinie stammt, die eine Blasen-, Prostata-, B-Lymphom- oder eine Urnierenzelllinie ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, wobei das Liposom ein kationisches Lipid umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, wobei die Zusammensetzung der Definition in den Ansprüchen 1 bis 9 entspricht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 16, ferner umfassend das Einbauen des genetischen Materials von Interesse in das genetische Material der Wirtszelle.
Zelle, die durch eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10 transfiziert ist oder in die eine genetische Sequenz durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 17 eingeführt wurde.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder von Wirtszellen nach Anspruch 18 zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung einer Krankheit, ausgewählt aus einem Neoplasma, einer Infektion, einer Autoimmunkrankheit oder einer genetischen Anomalie.
Verwendung nach Anspruch 19 einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 5 bis 10.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei die genetische Anomalie ein fehlendes oder defektes Gen beinhaltet.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei die Krankheit eine HIV-Infektion ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 22, wobei die genetische Sequenz von Interesse ein Peptid kodiert, ein Antisense-Oligonucleotid oder RNA ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 23, wobei die Zusammensetzung ein Plasmid bereitstellt.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei das Plasmid pMP6-IL2, wie in 3 dargestellt, oder pACMV-IL2 ist, wie in 1 dargestellt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 25, wobei die genetische Sequenz von Interesse eine genetische Sequenz umfasst, die ein Cytokin, einen Costimulationsfaktor, ein MHC-Klasse-I-Molekül, ein tumorspezifisches Antigen oder ein tumorassoziiertes Antigen umfasst.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei die Krankheit eine maligne neoplastische Krankheit oder HIV-Infektion ist und die genetische Sequenz IL-2-Genommaterial umfasst.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei die Krankheit eine maligne neoplastische Krankheit ist und die genetische Sequenz das MDR-I-Gen umfasst.
Verwendung nach Anspruch 20, die das Inkontaktbringen der Zusammensetzung mit einer Wirtszelle ex vivo beinhaltet, so dass die genetische Sequenz von Interesse in die Wirtszelle eingeführt wird, und die Wirtszelle autolog oder allogen ist.
Verwendung nach Anspruch 29, wobei die Wirtszelle eine neoplastische Zelle, eine Knochenmarkblutbildungszelle oder eine periphere Blutzelle ist.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei die Wirtszelle ein tumorinfiltrierender Lymphozyt, eine Zelle einer Tumorzelllinie oder eine Primärtumorzelle ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder eine Zelle nach Anspruch 18 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen Körpers.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Bereitstellen einer Zusammensetzung, umfassend Liposom, adenoassoziierte Virus-DNA, umfassend eine oder mehrere terminale invertierte Wiederholungen und eine genetische Sequenz von Interesse; Inkontaktbringen der Zusammensetzung mit einer Wirtszelle, die genetisches Material umfasst, so dass die genetische Sequenz von Interesse in die Wirtszelle eingeführt wird; und Exprimieren eines Proteins, das durch die genetische Sequenz von Interesse kodiert ist.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei die Wirtszelle eine CD34⁺ Stammzelle, eine T-Zelle, eine Zelle einer Tumorzelllinie oder eine Primärtumorzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 34, wobei die Wirtszelle ein tumorinfiltrierender Lymphozyt, eine CD3⁺, CD4⁺ oder CD8⁺ Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 34, wobei die Zelle von einer Tumorzelllinie abstammt, die eine Blasen-, eine Prostata-, eine B-Lymphom- oder eine Urnierenzelllinie ist.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei die Zusammensetzung ein kationisches Lipid umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 37, wobei die adenoassoziierte Virus-DNA ein Plasmid umfasst.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei das Plasmid pMP6-IL2, wie in 3 dargestellt, oder pACMV-IL2 ist, wie in 1 dargestellt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 39, ferner umfassend das Einbauen des genetischen Materials von Interesse in das genetische Material der Wirtszelle.
Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 40, wobei das exprimierte Protein ein Lymphokin-Analog ist.
Verfahren nach Anspruch 41, wobei das Protein IL-2 ist.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei das Protein P-Galactosidase, Chloramphenicol-Acetyl-Transferase oder MDR I ist.