KR100421753B1 - 아데노-수반바이러스(aav)리포좀및이와관련된방법 - Google Patents

아데노-수반바이러스(aav)리포좀및이와관련된방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100421753B1
KR100421753B1 KR1019960701259A KR19960701259A KR100421753B1 KR 100421753 B1 KR100421753 B1 KR 100421753B1 KR 1019960701259 A KR1019960701259 A KR 1019960701259A KR 19960701259 A KR19960701259 A KR 19960701259A KR 100421753 B1 KR100421753 B1 KR 100421753B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
composition
tumor
plasmid
aav
Prior art date
Application number
KR1019960701259A
Other languages
English (en)
Other versions
KR960705055A (ko
Inventor
필립 라밀라
레브코우스키 제인
Original Assignee
아벤티스 파마슈티칼스 인크
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아벤티스 파마슈티칼스 인크 filed Critical 아벤티스 파마슈티칼스 인크
Publication of KR960705055A publication Critical patent/KR960705055A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100421753B1 publication Critical patent/KR100421753B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 지질 물질을 포함하는 리포좀,및 아데노 수반 비루스 (AAV) 물질을 포함하는, 유전자 조작을 위한 조성물을 제공한다. 통상적으로, AAV 물질은 플라스미드이고, AAV 게놈의 말단 반복 단위를 포함한다. 본 발명은 AAV 리포좀을 사용함으로써 유전 물질을 세포에 도입하는 방법을 기술하고 있다. 따라서,유전 물질을 도입시켜 이를 간세포, T 세포, 원시 종양 세포 또는 종양 세포주에 통합시킨다.

Description

아데노-수반 바이러스(AAV) 리포좀 및 이와 관련된 방법{Adeno-associated viral(AAV) liposomes and methods related thereto}
유전자 변이
본 발명은 세포 조작에 관한 것이며, 보다 상세하게는 아데노 수반 바이러스(AAV) 플라스미드에 의한 형질감염을 촉진시키기 위한 양이온성 리포좀의 용도에 관한 것이다.
발명의 배경
진핵세포의 형질감염은 유전자 치료의 연구 및 개발을 위해 점점 더 중요한 기술이 되고 있다. 유전자 치료의 진보는 대부분 표적 세포에 DNA를 효과적으로 도입할 수 있는 전달 시스템의 개발에 의존한다. 배양된 세포 타입에서 이형 유전자의 안정한 또는 일시적인 발현을 위한 많은 방법이 개발되어 왔다. 이러한 방법은 담체 분자 또는 바이러스를 사용하는 형질도입 기술을 포함한다.
대부분의 유전자 치료 전략은 레트로바이러스성 또는 DNA 바이러스 벡터로의 형질전환 유전자의 도입에 의한 형질도입에 의존해 왔다. 그러나, 아데노 바이러스 및 다른 DNA 바이러스성 벡터는 전염성 속발증을 유도하고 반복 투여 후 면역원성으로 될 수 있으며, 한정량의 삽입 DNA만을 팩키징할 수 있다.
바이러스성 벡터 시스템 중의 재조합 아데노 수반 바이러스성(AAV) 형질도입시스템은 유전자를 다양한 포유 동물 세포로 안정적으로 및 효과적으로 운반하기 위한 가장 효과적인 벡터 시스템 중의 하나인 것으로 입증되어 있다(Lebkowski J.S., et al., "Adeno-associated virus: A vector system for efficient introduction and integration of DNA into a variety of mammalian cell types," Mol. Cell. Bio. (1988) 8:3988-3996). AAV DNA는 바이러스 DNA의 전위된 말단 반복 단위(ITR)를 통해 세포 DNA에 결합된 여러개의 직렬식(tandem) 복사체의 하나로서 세포 DNA에 통합되고, 통합된 AAV 게놈의 물리적 구조는 바이러스 삽입이 통상적으로 AAV 말단 반복 단위를 통해 직렬식의 머리부터 꼬리로의 배향인 다중 복사체로서 나타남을 제안하는 것은 잘 보고되어 있다(Kotin, R.M., et al., "Site-specific integration of adeno-associated virus," Proc. Natl. Acad. Sci. (1990) 87:2211-2215). 따라서, AAV 말단 반복 단위(ITR)는 AAV 형질도입 시스템의 필수 분야이다.
재조합 아데노 수반 바이러스성(AAV) 벡터는 아데노 바이러스성 벡터와 상이하지만, 형질전환 유전자 DNA의 크기 제한 및 팩키징 특성은 임의의 다른 DNA 바이러스성 벡터와 동일하다.
AAV는 선형의 일본쇄 DNA 파르보바이러스이며, 생산적인 감염을 이루기 위해 제2의 관련 없는 바이러스에 의한 공동 감염을 요한다. AAV는 2세트의 기능적 유전자: 즉, 바이러스 복제에 필수적인 렙(rep) 유전자 및 구조적 캡시드(capsid) 단백질 유전자를 운반한다(Hermonat, P.L., et al., "Genetics of adeno-associated virus: Isolation, and Preliminary characterization of adeno-associated type 2mutants," J. Virol. (1984) 51:329-339). AAV의 rep 및 캡시드 유전자는 AAV 플라스미드 DNA를 생성하는 목적하는 DNA 단편에 의해 대체될 수 있다. 재조합 바이러스 스톡을 창출하기 위해 rep 및 캡시드 유전자의 트랜스상보(transcomplementation)가 요구된다. 이러한 바이러스 스톡을 사용한 형질도입시, 재조합 바이러스는 핵내에서 코팅되지 않으며, 이의 분자 말단에 의해 숙주 게놈에 통합된다.
광범위한 진보가 이루어져 왔지만, 형질도입 기술은 내인성 바이러스와의 가능한 재조합, 세포 독성 및 면역학적 숙주 응답 반응과 같은 심각한 문제와 다양한 효율로 어려움이 있다. 따라서, 비-바이러스성 DNA 형질감염 과정이 필요하다.
리포좀은 핵산 및 바이러스 입자를 포함한 각종 물질을 캡슐내에 봉입하여 세포에 전달하는 데 사용되어 왔다(Faller. D.V. 및 D. Baltimore, "Liposome encapsulation of retrovirus allows efficient superinfection of resistant cell line," J. Virol. (1984) 49:269-272).
합성 양이온성 지질을 함유하는 예비형성된 리포좀은 다중 음이온성 DNA와 함께 안정한 복합체를 형성하는 것으로 밝혀져 있다(Felgner, P.L., et al. "A highly efficient, lipid-mediated DNA transfection procedure," Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84:7413-7417). 양이온성 리포좀, 즉 막 융합을 촉진시키는 지질인 디옥타데실-디메틸-암모늄-브로마이드(DDAB)를 함유하는, 특정 양이온성 지질로 이루어진 리포좀은 이종 유전자를 진핵 세포에 효율적으로 전달한다(Rose. J.K. et al., "A new cationic liposome reagent mediating nearly quantativetransfection of animal cells," Biotechniques(1991) 10:520-525). 양이온성 리포좀은 형질전환 유전자 또는 mRNA를 각종 배양 세포주에 전달함으로써 이들의 높은 수준의 세포 발현을 매개할 수 있다(Malone, R., et al., "Cationic liposome mediated RNA transfection," Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989), 86:6077-6081).
동종숙주역(ecotropic) 및 양쪽성 숙주역(amphotropic)의 팩키징된 레트로바이러스 벡터는, 리포팩틴(BRL. Gaithersburg, MD) 등의 양이온성 리포좀의 존재하 및 특이적 수용체(Innes, C.L., et al., "Cationic liposomes(Lipofectin) mediate retroviral infection in the absence of specific receptors," J. Virol. (1990) 64:957-961)의 부재하에서 배양된 세포를 감염시킨다는 것이 밝혀졌다.
비-바이러스 기술이 바이러스 시스템의 문제점의 일부를 극복하더라도, 여전히 비-바이러스 시스템에서 개선된 형질감염 효율의 필요성, 형질감염가능한 세포 타입의 범위를 증가시킬 필요성, 형질감염된 세포 내에서의 발현 기간을 증가시킬 필요성, 및 형질감염 후 발현 수준을 증가시킬 필요성이 남아 있다. 어느 정도까지 개선된 효율은 플라스미드 DNA 작제물 내에 프로모터 인핸서 요소를 사용함으로써 수득된다(Philip, R., et al., "In vivo gene delivery: Efficient transfection of T lymphocytes in adult mice," J. Biol. Chem. (1993) 268:16087-16090).
종양 세포의 면역 파괴
전이성 신장 세포 암종(RCC) 등의 신생물성 세포 치료에서 인터류킨-2(IL-2)의 사용은 사람 신생물의 면역 매개 파괴를 수행하기 위한 한가지 방법이다. 지속적인 완전한 차도가 획득되지만, 전체적인 응답 속도는 느리다.
암 환자에 대한 rIL-2(Chiron Corp., Emeryville, CA)의 시험 동안, 독성을 제한하는 투여량은 투여 경로 및 스케줄에 의존한다. 고용량의 일시 IL-2 투여는 거의 모든 장기 시스템에 연루된 독성인 현저한 독성을 수반한다. 더욱이, 고용량의 IL-2 투여에 따라 ECOG 0 수행 능력 상태의 환자에서 4% 치사율이 확인되었다. ECOG 수행 능력 상태의 개관을 위해, 예를 들면, Oken, Am. J. Clin. Oncol.(CCT) 5:649-655(1982) "Toxicity and Response Criteria of the Estern Cooperative Oncology Group" 654페이지 표 2를 참조한다.
일시 투여와 구별되는 바와 같이, IL-2를 적은 투여량(1-7 x 106Cetus 단위/M2/d)으로 연속적으로 정맥내 주입하여 사용하는 경우, 임상 효능 및 보다 적은 독성을 나타낸다는 것이 보고되었으며, 진행 암의 입양 면역 요법에서 개선된 안전 프로필을 갖는다는 것이 제안되었다(West, W. H., et al., "Constant Infusion of Recombinant Interleukin-2 in Adoptive Immunotherapy of Advanced Cancer,"(1987) N. Engl. J. Med. 316:898).
IL-2와 조합된 경우의 종양의 면역 파괴를 잠재적으로 향상시키는 세포 요소는 세포 독성 종양 침윤 임파구(TIL) 세포 등의 림포킨 활성화 킬러(LAK) 세포 및 세포 독성 T 임파구(CTL) 세포를 포함한다.
종양 침을 임파구(TIL)는 통상적으로 종양괴에 밀접하게 부착되어 발견되는 원발성 T 임파구이며, 시험관 내에서 분리, 증대 및 활성화될 수 있다. TIL 세포는 종양 세포에 대한 친화력이 있기 때문에, 신생물 치료에 관한 연구 분야에서 관심이 집중되고 있다. 따라서, 세포 독성 TIL 세포는 종양에 대한 친화력뿐만 아니라 세포 독성을 갖기 때문에, 특히 관심이 집중되고 있다.
치료 방법학으로서, TIL은 외인성 IL-2와 함께 숙주 내로 재주입되어 왔다(예를 들면 1992년 6월 30일자로 로젠버그(Rosenberg)에게 허여된 미합중국 특허 제5,126,132호 참조). TIL과 함께 IL-2를 사용하는 치료는 경우에 따라 진전된 악성 종양의 치료에서 지속적인 완전한 치료를 가져온다.
발명의 개시
양이온성 리포좀이 원발성 및 배양된 세포 타입의 아데노 수반 바이러스(AAV) 플라스미드 형질감염을 촉진시키기 위해 사용되었다. 리포좀과 복합체를 형성하는 AAV 플라스미드 DNA는 표준 플라스미드와의 복합체보다 몇 배 더 큰 발현 수준을 보였다. 또한, 발현은 임의의 선택 없이 30일의 기간 동안 지속되었다. AAV 플라스미드:리포좀 복합체는 재조합 AAV 형질도입에 의해 수득된 것과 비교할만한 형질전환 유전자 발현 수준을 유도하였다. 정상적인 사람의 말초 혈액으로부터 신선하게 분리된 CD4+및 CD8+T 세포, 종양 침윤 임파구, 및 CD34+간세포 중에서 큰 수준의 유전자 발현이 관찰되었다.
원발성 유방, 난소 및 폐 종양 세포는 AAV 플라스미드 DNA:리포좀 복합체를 사용하여 형질감염시켰다. 형질감염된 종양 세포는 치사량 조사 후 형질전환 유전자 산물을 발현시킬 수 있었다. β-갈락토시다제 유전자 발현에 의해 평가한 바 형질감염 효율은 10-50% 범위였다. 원발성 종양 세포에서 형질전환 유전자를 발현시키는 능력은 종양 백신을 생산하고, 암 및 AIDS에서 및 유전자 치료에서 세포 면역 반응의 매우 특이적 조절을 허용하는 임파구 세포를 생산하는 데 이용하였다.
본 명세서에 개시된 것은 유전자 조작에 관한 조성물이다. 이 조성물은 지질 물질 및 아데노 수반 바이러스 물질로 이루어진 리포좀으로 이루어지며, 당해 아데노 수반 바이러스 물질은 플라스미드일 수 있고, 당해 플라스미드는 pMP6-IL2 또는 pACMV-IL2일 수 있다. 아데노 수반 바이러스 물질은 전위된 말단 반복 단위 또는 2개 이상의 전위된 말단 반복 단위로 이루어질 수 있다. 2개 이상의 전위된 말단 반복 단위가 아데노 수반 바이러스 물질내에 존재하는 경우, 목적하는 유전 물질은 2개의 전위된 말단 반복 단위로 통합될 수 있지만, 프로모터는 2개의 전위된 말단 반복 단위 사이에서 통합될 수 있고, 이 프로모터는 즉시형 초기 CMV 프로모터, CMV 즉시형 후기 프로모터, CMV 초기 프로모터, ADA 프로모터 또는 TK 프로모터일 수 있다. 당해 조성물은 IL-2 유전자 또는 β-gal 유전자의 유전자 서열 등의 목적하는 유전자 서열로 이루어질 수 있다. 지질 물질은 양이온성 지질로 이루어질 수 있다. 당해 조성물에 의해 형질감염된 세포가 개시되어 있다.
본 명세서에서 개시된 것은 목적하는 유전자 서열을 숙주 세포에 도입하는 방법이다. 당해 방법은 리포좀, 아데노 수반 바이러스 물질 및 목적하는 유전자 서열로 이루어진 조성물을 제공하는 단계 및 당해 조성물을 유전자 서열로 이루어진 숙주 세포와 접촉시킴으로써 목적하는 유전자 서열을 숙주 세포에 도입하는 단계로 이루어져 있다. 숙주 세포는 CD34+간 세포; CD3+, CD4+또는 CD8+세포 등의 T-세포등의 T-세포; 방광, 전립선, B 임파종 또는 태아의 신장 세포주 등의 종양 세포주; 또는 원발성 종양 세포일 수 있다. 조성물을 제공하는 단계는 양이온성 지질로 이루어진 리포좀 자체를 제공하는 것으로 이루어질 수 있다. 조성물을 제공하는 단계는 플라스미드로 이루어진 아데노 수반 바이러스 물질을 제공할 수 있으며, 이 플라스미드는 pMP6-IL2 또는 pACMV-IL2일 수 있다. 세포에 목적하는 유전자 서열을 도입하는 방법은 추가로 숙주 세포의 유전 물질에 목적하는 유전 물질을 통합시키는 단계로 이루어질 수 있다.
지질 물질로 이루어진 리포좀, 아데노 수반 바이러스 물질, 목적하는 유전자 서열로 이루어진 조성물을 사용하는 방법이 개시되어 있다. 당해 방법은 임의의 상태를 갖는 환자를 제공하고, 리포좀, 아데노 수반 바이러스 물질 및 목적하는 유전자 서열로 이루어진 조성물을 제공하는 것으로 이루어져 있다. 당해 방법은 추가로 당해 조성물과 숙주 세포를 접촉시키는 단계로 이루어짐으로써 목적하는 유전자 서열이 숙주 세포에 도입된다. 접촉 단계는 생체 내에서 이루어질 수 있으며, 숙주 세포는 환자의 세포이다. 별법으로, 접촉은 생체 외에서 이루어질 수 있으며, 접촉이 생체 외에서 이루어지는 경우, 이 방법은 추가로 목적하는 유전자 서열이 도입된 숙주 세포를 환자에 전달하는 단계로 이루어진다. 환자를 제공하는 단계는 신생물 등의 상태; HIV 감염증 등의 감염증; 자가-면역 상태; 또는 결손 또는 결함 유전자 등의 유전자 이상 등의 상태를 갖는 환자를 제공할 수 있다. 조성물을 제공하는 단계는 펩티드, 안티-센스 올리고뉴클레오티드 또는 RNA를 암호화하는 목적하는 유전자 서열을 제공할 수 있다. 조성물을 제공하는 단계는 pMP6-IL2 또는 pACMV-IL2 등의 플라스미드를 제공할 수 있다. 조성물을 제공하는 단계는 사이토킨, 동시자극 인자, MHC 부류 I 분자, 종양-특이적 항원 또는 종양 관련 항원으로 이루어진 목적하는 유전자 서열을 제공할 수 있다. 환자를 제공하는 단계는 악성 신생물 상태 또는 HIV 감염증인 환자를 제공할 수 있으며, 조성물을 제공하는 단계는 이러한 환자에게 IL-2 게놈 물질로 이루어진 목적하는 유전자 서열을 제공할 수 있다. 환자를 제공하는 단계는 악성 신생물 상태를 갖는 환자를 제공할 수 있으며; 조성물을 제공하는 단계는 이러한 환자를 위해, MDR I 유전자로 이루어진 유전자 서열을 제공할 수 있다. 조성물을 숙주 세포와 접촉시키는 단계는 신생물성 세포, 골수 조혈 세포 또는 말초 혈액 세포인 숙주 세포와 접촉시키는 단계로 이루어질 수 있고; 접촉 단계는 종양 침윤 임파구, 종양 세포주의 세포 또는 원발성 종양 세포인 숙주 세포와 접촉시키는 것으로 이루어질 수 있다.
본 명세서에는 제3도에 나타낸 것과 본질적으로 동일한 유전자 서열로 이루어진 발현 벡터가 개시되어 있고; 제3도의 유전자 서열과 실질적으로 동일한 유전자 서열로 이루어진 발현 벡터가 개시되어 있고; 제3도의 유전자 서열과 동일한 유전자 서열로 이루어진 발현 벡터가 개시되어 있다. 본 명세서에는 제3도의 유전자 서열과 실질적으로 동일한 유전자 서열로 이루어진 발현 벡터로 변형된 유전자인 세포가 개시되어 있고, 이 세포는 말초 혈액 세포, 골수 세포, 종양 침윤 임파구, 종양 세포주 세포 또는 원발성 종양 세포일 수 있다.
본 명세서에는 플라스미드 pMP6의 유전자 서열과 본질적으로 동일한 유전자 서열로 이루어진 발현 벡터가 개시되어 있고; 플라스미드 pMP6의 유전자 서열과 동일한 유전자 서열로 이루어진 발현 벡터가 개시되어 있다. 플라스미드 pMP6의 유전자 서열과 동일한 유전자 서열로 이루어진 발현 벡터는 추가로 목적하는 유전자 서열을 포함할 수 있고; 세포는 이러한 발현 벡터에 의해 유전자-변형될 수 있고, 이 세포는 말초 혈액 세포, 골수 세포, 종양 침윤 임파구, 종양 세포주 세포 또는 원발성 종양 세포일 수 있다.
본 명세서에는 단백질의 제조 방법이 개시되어 있다. 단백질 제조 방법은 리포좀, 아데노 수반 바이러스 물질 및 목적하는 유전자 서열로 이루어진 조성물을 제공하는 단계로 이루어진다. 이 조성물은 유전 물질로 이루어진 숙주 세포와 접촉시킴으로써 목적하는 유전자 서열을 숙주 세포에 도입시킨다. 제조 방법은 추가로 목적하는 유전자 서열에 의해 암호화된 단백질을 발현시키는 단계로 이루어진다. 숙주 세포는 CD34+간세포, T-세포, 종양 세포주의 세포 또는 원발성 종양 세포일 수 있으며, 이 숙주 세포는 종양 침윤 임파구, CD3+, CD4+또는 CD8+세포일 수 있다. 숙주 세포는 방광, 전립선, B 임파종 또는 태아의 신장 세포주인 종양 세포 주일 수 있다. 리포좀으로 이루어진 조성물을 제공하는 단계는 양이온성 지질로 이루어진 조성물을 제공할 수 있다. 조성물을 제공하는 단계는 pMP6-IL2 또는 pACMV-IL2 등의 플라스미드로 이루어진 아데노 수반 바이러스 물질을 제공할 수 있다. 단백질을 제조하는 방법은 추가로 목적하는 유전 물질을 숙주 세포의 유전 물질에 통합시키는 단계로 이루어질 수 있다. 단백질을 발현시키는 단계는 림포킨 동족체를 발현시키는 것으로 이루어질 수 있다. 단백질을 발현시키는 단계는 IL-2, β-갈락토시다제 클로람페니콜-아세틸-트랜스퍼라제 또는 MDR I을 발현시킬 수 있다.
본 발명은 신생물을 갖는 환자를 치료하기 위한 치료 세포 조성물의 제조 방법을 개시한다. 이 방법은 작동 인자 T-임파구 세포로 이루어진 세포 조성물을 수득하는 단계; 이 세포 조성물을 특이적 결합 단백질과 접촉시키는 단계; 및 표면에 결합된 특이적 결합 작동 인자 T-임파구 세포를 이탈시키면서 비결합 상태의 세포를 제거하는 단계로 이루어져 있으며, 여기서 특이적 결합 단백질은 표면에 공유적으로 결합되어 있고, 이로 인해 특이적 결합 단백질에 의해 특이적으로 결합된 작동 인자 T-임파구 세포는 표면에 특이적으로 결합되게 된다. 치료용 세포 조성물의 제조 방법은 추가로 작동 인자 T-임파구 세포를 증대시킴으로써 실질적으로 동종의 표현형 모집단이 수득되는 단계로 이루어질 수 있으며, 이 증대 단계는 추가로 작동 인자 T-임파구 세포를 종양 세포와 함께 배양시키는 것으로 이루어질 수 있고, 종양 세포에는 방사선 조사될 수 있으며; 종양 세포는 인터류킨-2에 대한 발현 카세트로 이루어진 벡터에 의해 변형된 유전자일 수 있다. 치료용 세포 조성물의 제조 방법에 있어서, 수득 단계는 종양 침윤 임파구인 작동 인자 T-임파구 세포를 수득하는 것으로 이루어질 수 있고, 종양 침윤 임파구는 자기 유래 또는 동종인 신생물 조직일 수 있다. 접촉 단계는 세포 조성물을 CD4, CD8에 대해 특이적인 특이적 결합 단백질 CD4 및 CD8에 대해 특이적인 특이적 결합 단백질의 혼합물과 접촉시키는 단계로 이루어질 수 있다. 치료용 세포 조성물을 제조하는 방법은 추가로 특이적으로 결합된 세포를 방출함으로써 방출된 세포가 특이적 결합 단백질로부터 실질적으로 유리되는 단계로 이루어질 수 있다. 특이적 결합 단백질은 모노클로날 항체일 수 있다. 이 방법은 추가로 IL-2 게놈 물질로 이루어진 플라스미드로 형질감염시킴으로써 특이적으로 결합된 세포를 유전자 변형시키고, 이로 인해 치료용 세포 조성물이 인터류킨-2의 전신 투여 없이 치료 효과를 초래하는 단계로 이루어질 수 있다. 본 발명은 이 방법에 따라 제조한 세포의 실질적으로 동종인 모집단을 개시한다. 본 발명은 신장의 세포암, 침윤 분비관 암, 흑색종, 난소암, 폐암 또는 편평세포암 등의 신생물을 갖는 환자를 치료하기 위해 상기 방법에 따라 제조한 모집단을 사용하는 것을 개시한다.
본 발명은 CD8+TIL 세포의 실질적으로 동종인 모집단을 기술하며, 여기서 모집단 세포는 외부 표면으로 이루어지고, 세포의 외부 표면은 실질적으로 항체로부터 유리되며; 모집단 세포는 CD8에 대해 80% 이상이 동종이다.
본 발명은 신생물성 세포를 수득하는 단계, 지질 물질로 이루어진 리포좀 및 아데노 수반 바이러스 물질 및 추가로 본 발명의 방법에 따라 제조한 조성물의 림포킨 사용을 암호화하는 서열 등의 목적하는 유전자 서열로 이루어진 조성물로 세포를 유전자 변형시키는 단계로 이루어진, 신생물을 갖는 환자를 치료하기 위한 치료용 세포 조성물의 제조 방법을 개시한다.
도면의 간단한 설명
제1도는 본 연구에 사용된 3가지 플라스미드의 플라스미드 지도이다. 플라스미드 pACMV-IL2는 CMV 프로모터, IL-2 cDNA 및 랫트의 프레프로인슐린 및 pBC12/CMV-IL2 플라스미드와 동일한 SV40 폴리아데닐화 서열을 함유하고, pACMV-IL2는 또한 양 말단에 AAV 전위된 말단 반복 단위(ITR)를 갖는다. 플라스미드 pA1CMVIX-CAT는 2개의 AAV ITR 사이에 삽입된 CMV 프로모터 및 CAT 유전자로 구축된다.
제2도는 pMP6 플라스미드의 IL-2 실시태양(pMP6-IL2)의 상세한 제한 지도를 제공한다.
제3a-e도는 pMP6-IL2 플라스미드의 DNA 서열을 나타낸다. 이 도면에서, 패널 a-e는 서열의 연속적인 부분을 나타낸다. 공지된 DNA 서열에 대응하는 pMP6-IL2 서열 부분을 나타냈으며; 대응하는 서열 정보는 pMP6-IL2 플라스미드에 대한 서열 정보 아래에 직접적으로 열거하였다. 표지하지 않은 서열은 링커로부터 유래된 것이다.
제4a-b도 중 4a는 플라스미드 DNA:리포좀 복합체에 의해 유도된 유전자 발현 수준을 나타낸다. 각종 IL-2 플라스미드 작제물을 이들이 리포좀과 복합화될 때 랫트의 방광 및 랫트의 전립선 세포주로 유전자를 발현시킬 수 있는 능력에 대해 시험하였다. 두 세포주에서, AAV 플라스미드 작제물은 가장 큰 발현 수준을 보였다. 수준은 pg/ml/106개 세포로서 나타냈다. 제4b도는 AAV 플라스미드:리포좀 복합체에 의해 유도된 유전자 발현의 시간 경과를 나타낸다. 형질전환 유전자 발현의 지속 기간을 비교하기 위해, 전립선 세포주를 AAV 플라스미드(pACMV-IL2) 및 리포좀과 복합체를 형성하는 상응하는 대조군 플라스미드(pBC12/CMV-IL2)로 형질감염시켰다. 상층액을 여러 시점에서 수거하고, ELISA를 사용하여 IL-2 수준에 대해 평가하였다. IL-2 수준은 24시간 배양 단위로 pg/ml/106개 세포로서 나타냈다.
제5a-b도는 재조합 AAV 형질도입에 대한 AAV 플라스미드:리포좀 복합체 매개된 형질감염의 비교를 나타낸다. AAV 플라스미드:리포좀 복합체에 의해 유도된 유전자 발현의 수준이 rAAV 형질도입과 동등한지의 여부를 평가하기 위해, 전립선 세포주(제5a도) 및 방광 세포주(제5b도)를 사용하여 IL-2 유전자의 형질감염과 형질 도입을 비교하였다. IL-2 수준은 ELISA를 사용하여 평가하였다. 수준은 24시간 배양 단위로 pg/ml/106개 세포로서 나타냈다.
제6도는 여러 가지 원발성 종양 세포의 AAV 플라스미드:리포좀 복합체를 사용한 리포펙션에 의한 IL-2 유전자의 발현을 나타낸다. 1개의 폐종양 시료, 1개의 난소 종양 시료, 및 2개의 유방 종양 시료를 신선한 종양 생검으로부터 분리시켰다. IL-2 수준은 ELISA를 사용하여 평가하였다. 수준은 24시간 배양 단위로 pg/ml/106개 세포로서 나타냈다.
제7a-b도는 본 발명에 따라 형질감염되고, 치사량이 방사선 조사된 세포에 의한 IL-2 발현을 나타낸다. 유전자 발현에 대한 방사선 조사의 효과를 측정하기 위해, 본 명세서에 기재한 바와 같이, 전립선 세포주(제7a도) 및 원발성 유방 세포(제7b도)를 형질감염시키고, 치사량의 방사선 조사 후 유전자 발현에 대해 평가하였다. 상층액을 방사선 조사 후 24, 48, 72 및 96시간째에 수거하고, IL-2 수준에 대해 시험하였다. IL-2 수준은 24시간 배양 단위로 pg/ml/106개 세포로서 나타냈다.
제8도는 β-gal 유전자 발현에 의해 측정한 바의 AAV:리포좀 형질감염의 효율을 나타낸다. β-gal 리포터 유전자는 세포 자체를 기준으로 형질감염 효율을 평가하기 위해 사용하였다. 전립선 세포주는 본 명세서에 기재된 바와 같이 형질 감염을 위해 사용하였다. 데이터는 형광 물질에 대해 양이온성인 세포의 백분율로서 나타냈다.
제9a-d도는 형질감염된 T 임파구를 나타내는 박층 크로마토그래피 연구를 나타낸다. 혈액은 A 또는 B로서 언급한 공급자로부터 입수한다. 공급자 A 또는 B의 말초 혈책은 T 세포를 분리시키고, 형질감염을 위해 사용하였다. 공급자의 말초 혈액으로부터 신선하게 분리시킨 원발성 T 세포는 AAV 플라스미드 DNA:리포좀 복합체를 사용하여 형질전환 유전자 발현에 대해 시험하였다. T 임파구는 AIS MicroCELLector 장치를 사용하여 CD3+(제9a도) 또는 CD/8+(제9b도) 모집단으로서 또는 CD4+(제9c도) 또는 CD8+(제9d도) 모집단으로서 분획화하였다. 관련된 세포를 본 명세서에 기재된 바와 같이 포획하고 배양시켰다. 이후, 5-10x106개 세포를 평판 배양시키고, 50마이크로그램의 AAV 플라스미드 DNA 및 50 또는 100nmole의 리포좀으로 형질감염시켜 1:1 또는 1:2의 DNA:리포좀 비율을 수득한다. 형질감염 후 3일째에 세포를 수거하였다. 추출물로부터 규정화된 단백질 함량은 크로마토그래피 분석을 사용하여 CAT 활성에 대해 분석하였다.
제10도는 AAV 플라스미드:리포좀으로 형질감염된 말초 혈액의 CD34+ 간세포의 박층 크로마토그래피이다. 형질감염 후 3일 및 7일째에 세포를 수거하였다. 추출물로부터 규정화된 단백질 함량은 크로마토그래피 분석을 사용하여 CAT 활성에 대해 평가하였다.
제11a-b도는 AAV 플라스미드 DNA:리포좀 복합체로 형질감염된 클론으로부터 게놈 DNA의 증강된 화학발광성(ECL) 서던 블롯 분석을 나타낸다. 제11a도에서, 시료는 Bam HI 및 Hind III으로 분해시키고, IL-2로 프로브화하였다. 제11b도의 데이터에 대해, 시료는 Bam HI로 분해시키고, IL-2로 프로브화하였다. 분석된 모든 클론은 IL-2 유전자의 존재를 나타냈으며, 0.685kb 밴드에 의해 입증되었다. 제 11a-b도에 대해:
제12a-b도는 클론 1A11 및 1B11의 서던 분석을 나타낸다. 서던 블로팅 후, 제12a도에 나타낸 필터는 pACMV-IL-2의 0.68kb IL2 Bam HI/Hind III 단편으로 프로브화하였다. 제12a도에 대해:
제12b도에 나타낸 데이터에 대해, 필터는 플라스미드 pACMV-IL2의 0.85kbpvuII/Hind III(AAV ITR/CMV) 단편으로 프로브화하였다. 제12b도에 대해:
제13도는 자가 유래의 종양, IL-2 형질도입된 종양, 및 IL-2만으로 증대된 유방암 TIL의 RNAase 보호에 의한 T 세포 수용체(TCR) 레퍼터리 분석을 나타낸다. 도면의 축에 대하여, Vβ는 TCR의 β쇄의 다양한 단편이고; Cβ는 TCR의 β쇄의 일정한 단편이며; 수평축에 대하여, A, B, 및 C는 상이한 환자를 나타낸다.
제14도는 유방암 종양 침윤 임파구(TIL)의 증식을 나타내는 도면이고, 그 데이터는 IL-2 유전자 형질감염 후 5일째에 획득한다.
제15도는 네오마이신 내성 유전자 및 IL-2에 대한 유전자 대신에 Thy1.2 유전자(pMP6/neo/Thy1.2)를 함유하는 pMP6 플라스미드로 형질감염된 유방암 TIL에서의 유전자 발현 효율을 나타내는 도면이다. pMP6/neo/Thy1.2 플라스미드는 DDAB:DOPE 리포좀에 복합화되었다. 리포좀 조성물은 제14도에 상응하는 데이터에 대한 것과 동일한 조성물이었다.
제16도는 각종 플라스미드 작제물로 형질감염된 후 형질전환 유전자의 발현 수준 및 시간을 비교하는 도면이다. 전립선 종양 세포주 R3327은 표준 플라스미드(pBC12/CMV-IL2) 또는 DDAB:DOPE 리포좀에 대해 복합화된 플라스미드(pACMV-IL2)로 형질감염시켰다. 상층액을 여러 시점에서 수거하고, ELISA에 의해 IL-2 수준에 대해 평가하였다. IL-2 수준은 24시간 배양 단위로 pg/ml/106개 세포로서 나타냈다.
제17도는 AAV 플라스미드(pACMV-IL2) 또는 표준 플라스미드(pBC12/CMV-IL2)로 형질감염시킨 R3327로부터 염색체 DNA의 서던 블롯 분석을 나타내는 도면이다. 이 블롯은 IL-2 유전자의 0.685kb Bam HI/Hind III 단편으로 프로브화하였다. C는 형질감염되지 않은 세포로부터 수득된 DNA이다. IL-2 삽입물은 마지막 레인에서 제시한다.
제18도는 전립선 세포주 R3327에서 IL-2 유전자의 형질감염 효율의 세포내 분석 결과를 나타내는 도면이다. 이 세포는 DDAB:DOPE 리포좀으로 복합화된 AAV IL-2 플라스미드 1:1 또는 1:2 조성물로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포는 세포내 IL-2 단백질 수준에 대해 여러 시점에서 염색하였다. 데이터는 IL-2 단백질을 발현시키는 백분율 양성 세포로서 나타냈다. 음성 대조군으로서 형질감염되지 않은 세포를 사용하고, 대조 수치를 형질감염된 군의 수치로부터 공제하였다.
제19a-b도는 방사선 조사된 전립선 종양 세포주 세포(제12a도) 및 방사선 조사된 원발성 유방 종양(제19b도)에 의한 IL-2의 발현을 나타내는 도면이다. 원발성 유방 세포 및 전립선 세포주 세포를 형질감염시키고, 치사량의 방사선 조사 후 유전자 발현에 대해 평가하였다. 상층액은 방사선 조사 후 24, 48, 72 및 96시간 째에 수거하고 IL-2 수준에 대해 시험하였다. IL-2 수준을 24시간 배양 단위로 pg/ml/106개 세포로서 나타냈다.
본 발명을 실시하기 위한 양태
본 명세서에 처음으로 기재된 연구는 바이러스 형질도입을 포함하지 않은 시스템에 의한 AAV 플라스미드 DNA의 세포로의 수송을 조사하였다. 별법으로, 본 발명에 따른 방법은 AAV 물질로 이루어진 리포좀을 사용함으로써 여러 가지 포유 동물성 세포 타입을 효율적으로 형질감염시켰다. 본 발명은 형질감염에 관한 것으로, AAV 플라스미드 작제물의 숙련된 형질도입 능력과 함께 리포펙션의 정연한 담체 시스템을 이용한다. 유리하게도, 양이온성 리포좀은 rep 및 캡시드 트랜스상보, 재조합 바이러스 또는 야생형 AAV의 부재하에 AAV 플라스미드 DNA의 세포내 도입을 촉진시키는 수단으로서 사용하였다. 본 발명에 따른 리포펙션은 유전자 발현의 효율을 평가하기 위해 산출되었다. 본 데이터는 DNA의 일시적 및 지속적인 발현을 위해큰 효율로, 변형되지 않은 간세포, 변형되지 않은 원발성 임파구 세포(예: T 세포), 새로이 분리한 다양한 종양 세포 및 배양된 포유 동물 세포 타입을 형질감염시키는 능력을 설정하였다. 종양 침윤 임파구 등의 변형되지 않은 T 세포; 변형되지 않은 간세포; 종양 세포주 세포; 및 원발성 종양 세포를 효율적으로 형질감염시키는 능력을 당업계에서 처음으로 기재한다.
I. 원료 물질 및 사용된 방법
A. 세포주
랫트의 전립선 세포주(R3327) 및 랫트의 방광 세포주(MBT-2)를 듀크 대학의 엘리 길보아 박사(Dr. Eli Gilboa)로부터 입수하였다. 두 세포주를 5% 송아지 태아 혈청(FBS)으로 보충된 RPMI-1640 내에 유지시켰다. 사람 태아의 신장 세포주인 세포주 293은 아데노바이러스 타입 5에 의해 형질전환시키고, ATCC로부터 입수하였다(Graham, F.L., et al., "Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5," J. Gen. Virol. (1977) 36:59-72). 세포주 293은 10% FBS로 보충된 둘베코 변형 이글 배지 중에서 성장시켰다.
B. 원발성 세포의 세포 제조
원발성, 난소 종양 세포 및 3개의 유방 종양 세포를 환자의 충실성 종양으로 부터 획득하였다. 이들 종양 시료를 작은 조각으로 다지고, AIM 배지(Gibco) 200ml 중에서 분해시키고, 콜라게나제 V(Sigma) 450u/ml, 10.8K 단위/ml의 DNase I(Sigma) 및 히알루로니다제 V(Sigma) 2000u/ml로 보충하였다(Topolian, S.L, etal., "Expression of human tumor infiltrating lymphocytes for use in immunotherapy trials, J. Immunol. Methods(1987) 102:127-141). 분해된지 1-2시간 후, 세포를 유리 균질화기(Bellco)로 균질화시켰다. 세포를 DPBS-CMF(Whittaker)에서 3회 세척하였다. 임파구를 AIS MicroCELLector-CD5/8 장치(AIS, 캘리포니아주 산타 클라라 소재) 상에 포획시킴으로써, 비임파구 세포로부터 분리하였다. 비유착 세포(주로 종양 세포)를 제거하고, 2mM L 글루타민, 100u/ml 페니실린-스트렙토마이신 및 10% FBS로 보충된 RPMI 1640 중에서 배양하였다. 형질감염시키기에 앞서 종양 세포들을 2 내지 4주 동안 배양시켰다.
C. 말초 혈액 단핵 세포의 제조
건강한 대조군 환자로부터 획득된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 Lymphoprep(Nycomed. Norway)을 사용하여 연층(Stanford University Blood Bank, 캘리포니아주 스탠포드 소재)으로부터 분리시켰다.
T 세포, T 세포 서브세트 또는 CD34+세포는 AIS MicroCELLector(Applied Immune Sciences, 캘리포니아주 산타 클라라 소재)를 사용하여 추가로 분리시켰으며, 이 장치는 그 위에 부착된 공유적으로 부착되는 특이적 결합 단백질 (예를 들면 모노클로날 항체)를 갖는 표면으로 이루어져 있다. 간단히 말해, PBMC를 0.5% Gamimmune(Miles, Inc., 인디아나주 엘카트 소재) 중에서 ml당 15x106개 세포로 제현탁시키고, 세척된 CD3, CD4, CD8, CD5/8 또는 CD34 AIS MicroCELLector 상으로 로딩시켰다. 1시간 후, 비유착 세포를 AIS MicroCELLector로부터 제거하였다. 10%송아지 태아 혈청, 2mM L-글루타민 및 100u/ml 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 완전 배지, RPMI 1640(Whittaker)을 AIS MicroCELLector 내의 유착 세포에 첨가하였다. 2-3일 후, 5% CO2, 37℃ 습도 환경에서, 유착 세포를 제거하고, 형질 감염을 위해 준비하였다.
D. 플라스미드 제조
본 연구에 사용된 제1 플라스미드는 (PACMV-IL2)이다: 이 플라스미드는 IL-2 cDNA로서 사람 인터류킨-2 유전자I(IL-2), 및 사람 사이토메갈로바이러스(CMV)의 즉시형 초기 프로모터-인핸서 요소, 및 랫트의 프레프로인슐린 및 양 말단에서 말단 반복 단위(ITR)가 전위된 아데노 수반 바이러스에 의해 플랭킹(franking)된 SV40 폴리아데닐화 서열을 함유한다(이 플라스미드는 캘리포니아주 UCLA의 제이 로젠블래트 박사(Dr. J. Rosenblatt)로부터 입수하였으며, 이 플라스미드에 대한 로젠블래트 박사의 호칭은 pSSV9/CMV-IL2이다). pACMV-IL2와 동일하지만 AAV 말단 반복 단위가 결실된 상응하는 대조군 플라스미드 pBC12/CMV-IL2가 사용되었다(제1도).
제2의 연구용 플라스미드 pA1CMVIX-CAT는 CMV 즉시형 초기 프로모터 인핸서 서열, 및 pOG44(Stratagene)로부터 유도된 인트론; 세균성 CAT 유전자; pBR322 골격 내에서 AAV 말단 반복 단위에 의해 플랭킹된 SV40 후기 폴리아데닐화 시그날을 함유한다(제1도).
플라스미드 pATK-βgal 및 pAADA-βgal은 각각 AAV 플라스미드 골격 내에서TK 또는 ADA 프로모터에 결합되어 있는 βgal 유전자를 함유한다(βgal 플라스미드는 듀크 대학의 엘리 길보아 박사가 제공하였다).
본 연구에 사용된 다른 플라스미드는 pMP6이었다. 제2도에 나타낸 바와 같이, IL-2 DNA(pMP6-IL2)를 함유하는 플라스미드는 이본쇄의 환형 플라스미드이다. pMP6-IL2 플라스미드는 CMV 프로모터 및 SV40 폴리아데닐화 시그날의 조절하에 사람 인터류킨-2 유전자를 갖는다. 프로모터와 IL-2의 암호화 서열 사이에는 IL-2 또는 플라스미드 내로 위치하게 되는 임의의 다른 외인성 유전자의 발현을 증진시키는 것으로 이해되는 인트론(pOG44로부터 유도됨, Stratagene)이 있다. 완전한 발현 카세트는 아데노 수반 바이러스의 좌측 및 우측 말단 서열 사이에 있다. pMP6-IL2 플라스미드는 블루스크립트 골격(Bluescript backbone)도 가지며; 이 골격은 이. 콜라이 내에서 이러한 플라스미드의 증식을 촉진시키는 암피실린 내성 유전자 및 Col-E1 세균 복제 오리진을 갖는다.
제3a-e도는 pMP6-IL2 플라스미드의 DNA 서열을 나타낸다. a 내지 e 패널은 서열의 연속 부분을 나타낸다. 도면에서, 공지된 DNA 서열에 상응하는 pMP6-IL2 서열 부분을 나타냈으며; 상응하는 서열 정보를 pMP6-IL2 플라스미드에 대한 서열 정보 바로 아래에 열거하였다. 표지하지 않은 서열은 링커이다.
IL-2 유전자를 함유하지만 AAV 성분은 함유하지 않는 표준 플라스미드 작제물도 사용하였다. 표준 플라스미드 작제물은 IL-2 유전자를 아데노신 데아미나제(ADA), 티미딘 키나제(TK) 또는 즉시형 후기 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터와 함께 가지고 있다(표준 플라스미드는 ATCC로부터 입수함). 선택된 플라스미드에 대한 데이터는 표 1에 나타냈다.
표 1
본 연구에 사용된 선택된 플라스미드
모든 플라스미드를 알칼리 용해 및 아세트산암모늄 침전에 의해 분리시킨 후, DNase-비함유 RNase로 처리하고, 페놀/클로로포름/이소아밀로 추출하고, 아세트산암모늄으로 침전시켰다(Ausubel, F.M., et al., Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons, Inc. 1993)).
E. 리포좀 제조
소단층 리포좀은 중성 지질 디올레오일-포스파티딜-에탄올아민(DOPE)(Avanti Polar Lipids)과 함께 양이온성 지질 디옥타데실-디메틸-암모늄-브로마이드(DDAB)(Sigma)로부터 제조하였다. 지질을 클로로포름 중에 용해시켰다. DDAB는 환저 플라크스 내에서 에테르 중의 DOPE와 1:1 또는 1:2의 몰비로 혼합하고, 지질 혼합물을 회전 증발기 상에서 건조시켰다. 지질 필름은 무균 2차 증류수를 첨가함으로써 다시 수화시켜 최종 농도 1mM의 DDAB를 수득하였다. 이 용액은 투명해질 때까지 욕조 초음파 분해기(Laboratory Supplies, 뉴욕주 힉스빌 소재) 내에서 초음파 분해하였다. 리포좀을 아르곤하에 4℃에서 저장하였다. 리포좀을 정맥내 투여를 통해 생체 내에서 사용하기 위해, 1:4 내지 1:5비의 DDAB:DOPE를 사용하고; 복강 내 투여를 위해 1:1 내지 1:2비의 DDAB:DOPE를 사용하였다.
F. 바이러스 감염으로 형질도입하기 위한 재조합 AAV(rAAV)의 제조
재조합 AAV 스톡을 제조하기 위해, 세포주 293의 세포를 분할하고, 약 30-50% 콘플루언스로 성장시킨다. 이후 곧, 세포들을 1 내지 5의 감염 다중도로 아데노바이러스 타입 5로 감염시키고, 37℃에서 배양시켰다. 2 내지 4시간 후, 감염된 세포들을 100mm 조직 배양 디쉬당 rep 캡시드 상보 플라스미드, p△Bal 10㎍ 및 목적하는 유전자로 이루어진 플라스미드 10㎍과 함께 동시 형질감염시켰다(0.5-1x107개 세포). 형질감염을 위해 인산칼슘 동시 침전을 사용하였다(Hermonat, P.L. 및 Muzyczka, N., "Use of adeno-associated virus as a mammalian DNA cloningvector. Transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells," Proc. Natl. Acad. Sci, USA (1984) 81: 6466-6470). 형질감염 후 12 내지 18시간째에, 배지를 세포로부터 제거하고, 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지 5ml로 대체하였다.
형질감염 후 48 내지 72시간째에, AAV를 다음 과정에 따라 수거하였다: 세포 및 배지를 함께 수거하고, 세포를 용해시키기 위해 3회 냉동 해동시켰다. 이어서, 세포 및 배지의 현탁액을 원심분리시켜 세포 파편을 제거하고, 상층액을 56℃에서 1시간 동안 배양시켜 아데노바이러스를 불활성화시켰다(Hermonat. P.L. 및 Muzyczka, N., "Use of adeno-associated virus as a mammalian DNA cloning vector. Transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81: 6466-6470; Tratschin. J.D., et al., "Adeno-associated virus vector for high frequency integration, expression, and rescue of genes in mammalian cells," Mol. Cell. Biol. (1985) 5: 3251-3260). 열 불활성화 후, 바이러스 상층액을 셀룰로오스 아세테이트 필터를 통해 여과하였다(1.2μm). 이어서, 바이러스 스톡을 -20℃에서 저장하였다. AAV 상층액 1mL를 사용하여 1 x 106개 세포를 형질도입하였다.
G. 세포의 형질감염 "리포펙션"
원발성 종양 세포 및 랫트의 종양 세포주(R3327 및 MBT-2)에 대해, 1 x 106개 세포를 6웰 디쉬의 웰당 무혈청 배지 2ml 중에서 평판 배양시켰다. 이후, AAV 플라스미드 DNA 5㎍을 각각 1.2 몰 비의 DDAB:DOPE로 이루어진 리포좀으로서 DDAB 5nmole과 혼합하였다. 무혈청 배지 0.5ml를 AAV:리포좀 복합체에 첨가한 후, 이를 세포에 전달하였다. 리포펙션을 달성하기 위해, 세포를 실온에서 5분 동안 배양시킨 후, 송아지 태아 혈청을 이 세포에 첨가하여 최종 농도 5%의 태아 송아지 혈청을 획득한다.
T 세포에 대해서, 5-10x106개 세포를 6웰 디쉬의 웰당 무혈청 배지 1ml중에서 평판 배양시켰다. 플라스미드 DAN 5㎍을 1:1 몰 비의 DDAB 및 DOPE로 구성된 리포좀으로서 DDAB 50nmole과 혼합하였다. 이어서, 형질감염 "리포펙션"을 종양 세포에 대해 수행하였다.
간세포에 대해, 1-2x106개 세포를 플라스미드 DNA 10㎍ 및 리포좀 10nmole로 이루어진 복합체로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포는 간세포 인자, IL-3 및 IL-1을 함유하는 배지와 함께 배양시켰다. 3 및 7일째에, 세포를 수거하고 추출하였다.
H. IL-2 분석
세포를 계수하고, 1x106개 세포를 24웰 플레이트의 웰당 배지 1ml 중에서 평판 배양시켰다. 다음 날, 상층액을 수거하고, Quantikine IL-2 ELISA 키트(R&D Systems, 미네소타주 미네아폴리스 소재)를 사용함으로써 평가하였다. IL-2 수준은 피코그램/상층액 ml로서 정의하였다.
I. β-갈락토시다제 분석
Molecular Probes(Eugene, OR)로부터 구입한 FluoReporter lacZ 유전자 융합검출 키트를 사용하여 효소 가수분해 산물인 플루오레스세인의 형광을 측정함으로써 단일 세포 내의 lacZ β-D-갈락토시다제를 정량화하였다. AAV/β-gal 플라스미드(pATK-βgal 및 pAADA-βgal)를 이 키트와 함께 사용하였다. 플루오레스세인은 마커 유전자 b-D-갈락토시다제를 발현시키는 세포에서 플루오레스세인 디-b-D-갈락토시다제(FDG)를 효소 절단시킴으로써 생산한다. 이어서, 세포를 유동 혈구계산기(FACScan, Becton Dickinson, 캘리포니아주 산호세 소재)을 사용하여 분석하였다.
II. 연구 결과
A. AAV 플라스미드:양이온성 리포좀 복합체의 사용에 의한 IL-2 유전자의 발현 수준
AAV 플라스미드의 유전자 전달 효율을 평가하기 위해, AAV 플라스미드의 IL-2 유전자 전달 효율을 표준 플라스미드 작제물의 효율과 비교하였다. 표준 플라스미드는 아데노신 데아미나제(ADA) 프로모터(pADA-IL2), 티미딘 키나제(TK) 프로모터(pTKIL-2) 또는 즉시형 후기 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(pCMV-IL2)와 함께 IL-2 유전자를 갖는다. AAV IL-2 연구 플라스미드(pACMV-IL2)는 CMV 프로모터(즉시형 초기)와 이 프로모터 하류에 위치하는 IL-2 유전자를 함유한다(제1 도). 제1도에 나타낸 바와 같이, 상응하는 대조군 플라스미드 pBC12/CMV-IL2 작제물은 pACMV-IL2와 동일하지만, AAV 말단 반복 단위(ITR)가 결실되어 있다.
비교를 위해, IL-2 유전자를 함유하는 5개의 플라스미드(pACMV-IL2,pBC12/CMV-IL2, pADA-IL2, pTK-IL2, pCMV-IL2)를 리포좀과 복합화시키고, 2종의 배양된 종양 세포주: 즉, 랫트의 방광(MBT-2) 및 랫트의 전립선(R3327) 세포주에 대한 형질감염 효율에 대해 시험하였다. 세포주를 1x106개 세포당 리포좀 10nmole과 복합체를 형성하는 플라스미드 DNA 10㎍으로 형질감염시켰다. 상층액은 3일째에 수거하고 IL-2 ELISA 키트를 사용하여 IL-2의 수준에 대해 시험하였다.
AAV 플라스미드(pACMV-IL2)는 두 세포주에서 가장 큰 발현 수준을 유도한다(제4a도). IL-2 유전자는 ADA 프로모터(pADA-IL2)와 함께 두 세포주 내에서 가장 적은 양으로 발현된다. 제4a도에서 보여지는 바와 같이, 두 TK 및 CMV(즉시형 후기 프로모터) IL-2 작제물은 두 세포주에서 비교할 만한 수준의 IL-2 발현을 유도한다. 그러나, CMV 즉시형 초기 프로모터를 함유하는 pBC12/CMV-IL2 플라스미드는 방광 세포주와 비교할 때 전립선 세포주에서 보다 큰 수준의 유전자 발현을 보였다. 시험한 플라스미드 중에서, AAV IL-2 연구 플라스미드는 두 세포주에서 가장 큰 발현 수준을 유도하였으며, 현저한 수준의 증가가 전립선 세포주에서 관찰되었다.
전립선 세포주 R3327에서 AAV IL-2 연구 플라스미드(pACMV-IL2) 및 상응하는 대조군 플라스미드(pBC12/CMV-IL2)에 의해 유도된 발현의 기간을 연구하였다(제4b도). 발현은 임의의 선택 없이 배양물 중에서 30일째까지 평가하였다. 1x106개/ml로 세포를 접종하고, 상층액을 24시간마다 분석을 위해 수거하였다. 세포는 배양 중에 48시간마다 2배로 되었다. 제4b도에 나타낸 데이터는 증진된 발현 수준 외에, 발현 기간이 AAV 플라스미드(pACMV-IL2)로 형질감염된 후 30일 지속되었다. 명백하게도,현저한 발현이 전체 평가 기간에 걸쳐 계속되었다. 제4b도에 나타낸 바와 같이, 두 플라스미드는 2일 내지 7일 사이에 최대 발현 수준을 유도하고, 15일째까지 IL-2 수준이 감소된 후, AAV 플라스미드로 형질감염된 그룹에서만 약 100pg/ml로 유지되었다. 마찬가지로, AAV 플라스미드:리포좀 복합체가 형질감염을 위해 사용되었을 때, 원발성 폐, 유방 및 난소 종양으로부터 획득된 세포뿐만 아니라 방광 세포주에서 지속되는 발현 수준이 관찰되었다(데이터는 제4b도에 나타내지 않음).
B. AAV 플라스미드:리포좀 형질감염 "리포펙션"과 재조합 AAV 형질도입의 비교
전립선 및 방광 세포주를 형질감염시키고, 형질도입시켜 최적의 AAV:리포좀 형질감염이 최적 재조합 AAV 형질도입에 필적하는지의 여부를 측정하였다. 최적 형질감염을 위해, AAV 플라스미드 DNA 10㎍을 최종 용적 2ml 중의 1x106개 세포당 리포좀 10nmole에 복합화시켰다. 최대 rAAV 형질도입을 위해, 바이러스 상층액 2ml를 완전 배지 1ml 중의 1x106개 세포에 첨가하였다. 24시간 후, 이들 세포를 세척하고, 신선한 완전 배지 중에서 재현탁시켰다. 상층액을 형질감염 및 형질도입 후 여러 시점에서 수거하였다.
전립선 세포주(제5a도)에서, 형질감염은 시험 조건하에 AAV 형질도입보다 더 큰 수준의 발현을 유도하였다(DNA 10㎍:리포좀 10nmole에 대한 1x106개 세포를 위한 바이러스 상층액 2ml). 3일 내지 5일째에 형질감염으로 약 10배 더 큰 IL-2 수준을 보였지만, 20일째까지 비교할 만한 수준이 형질감염 및 형질도입된 그룹에서 관찰되었다.
재조합 AAV에 의한 형질도입은 초기에 리포좀을 사용한 형질감염에 비해 방광 세포주에서 보다 큰 수준의 IL-2 생성을 유도하였다(제5b도). 전립선 세포주와 마찬가지로, 방광 세포주의 형질도입은 20일째까지 IL-2 수준의 감소를 보였으며, 형질감염에 의한 IL-2 수준은 이 기간 동안 증가하였지만, 비교할 만한 IL-2 수준이 33일에 걸쳐 형질감염 및 형질도입된 그룹 모두에서 획득된다.
C. AAV 플라스미드 DNA:리포좀 복합체를 사용한 원발성 종양 세포의 형질감염
본 명세서에 앞서 기재한 실험에서, 현저한 형질전환 유전자 발현은 배양된 세포주에서 나타났다. 양이온성 리포좀:AAV 플라스미드 DNA 복합체가 새로이 분리된 원발성 종양 세포 내에서 비교할 만한 형질전환 유전자 발현을 역시 매개하는지의 여부를 평가하기 위해, 리포좀을 사용한 AAV IL-2 연구 플라스미드로 4가지 상이한 원발성 종양 세포를 형질감염시켰다. 종양 세포를 형질감염시키기에 앞서 10% FBS로 보충한 RPMI-1640 배지 중에서 2 내지 3주간 배양하였다. 세포를 ml당 1x106개 세포 농도로 평판 배양시키고, 리포좀 10nmole과 복합체를 형성하는 DNA 10㎍으로 형질감염시켰다. 상층액을 2일 및 3일째에 수거하였다.
제6도에 나타낸 바와 같이, 4가지 원발성 세포 타입 모두는 형질감염 후 현저한 IL-2 수준을 나타냈다. 가장 큰 발현 수준은 10일의 연구 기간 동안 3일째에 관찰되었다(폐 및 1개 유방 시료를 장기간 동안 연구하였다). IL-2 유전자 발현은배양 중에 형질감염 후 25일 동안 폐 종양 세포에서 및 유방 종양 세포 중 하나의 세포에서 나타났다. 15일째의 수준은 두 세포주에서 및 원발성 종양으로부터 유도된 세포에서 동일하였다(IL-2 100pg/ml)(데이터는 나타내지 않음).
D. 형질전환 유전자 발현에 대한 치사량의 방사성 조사 효과
유전자 발현에 대한 방사선 조사 효과를 측정하기 위해, 전립선 세포주(제7a 도) 및 원발성 유방 종양 세포(제7b도)를 형질감염시키고, 치사량의 방사선 조사후 유전자 발현에 대해 평가하였다. 두 세포 타입은 최적 AAV 플라스미드:리포좀 복합체를 사용하여 형질감염시켰다. 형질감염 후 2일째에, 각 배양물의 분취량을60Co 방사선 조사기를 사용하여 6000 라드 조사함으로써 세포 분열을 종료하고, 분취량을 배양액 중에 유지시켰다. 각 배양액의 절반을 조사되지 않은 대조군으로서 유지하였다. 분취량을60Co 방사선 조사기를 사용하여 6000라드로 조사하였으며, 그 동안 IL-2의 발현 수준은 약 300-400pg/ml였다. 상층액은 방사선 조사 후 24, 48, 72 및 96시간째에 수거한 후 IL-2 수준에 대해 시험하였다.
제7a-b도에 나타낸 바와 같이, 형질감염 후 치사량의 방사선 조사는 형질전환 유전자 발현을 억제하지 못한다. 전립선 세포주뿐만 아니라 원발성 종양 세포는 방사선 조사 후 IL-2 발현에서 어떠한 변화를 나타내지 않았다. 따라서, 세포 분열은 종료되었지만, 1L-2 분비는 방사선 조사에 대해 감응성이 아니었다. 이점은 많은 유전자 치료 전략이 원발성 T 임파구(일반적으로 활성화 없이 분열되지 않음)로의 유전자 전달을 포함하고, 종종 바이러스 감염을 통해 형질도입되지 않을 수 있기 때문에 유리하다.
E. AAV 플라스미드:리포좀 복합체의 사용에 의한 β-D-갈락토시다제의 유전자 발현 수준
세포 기준의 발현 수준을 입증하기 위해, 형질감염 실험에 β-D-갈락토시다제 유전자를 사용하였다. 2종의 AAV β-gal 플라스미드(pATK-βgal 및 pAADA-βgal)(이 플라스미드는 듀크 대학의 엘리 길보아 박사로부터 입수함) 각각을 양이온성 리포좀과 복합시키고, 전립선 세포주의 형질감염을 위해 사용하였다. pATK-βgal 또는 pAADA-βgal 플라스미드 DNA 10㎍을 리포좀 10nmole과 복합시킨 후, 이 복합체를 2ml 용적의 1x106개 세포를 형질감염시켰다. 여러 시점에서, 약 5x105개 세포를 수거하고, 형광 기질 PDG로 염색하고, 유동 혈구 계산법을 이용하여 분석하였다.
최대 형질전환 유전자 발현을 7일 내지 15일째 사이에서 관찰하였다(제8도). 현저한 수준의 β-gal 활성이 25일에 걸쳐 관찰되었다. β-gal 양성 세포의 유동 혈구 계산 분석은 두 플라스미드 작제물에 의해 10 내지 50%의 형질감염 효율의 최대 수준을 보였다. 그 수준은 25일째까지 5 내지 10%로 감소되었다. 발현 패턴 및 기간은 상기한 IL-2 발현과 유사하였다.
F. 새로이 분리시킨 말초 혈액 T세포 아집단에서 AAV 플라스미드:리포좀 복합체에 의해 유도된 형질전환 유전자 발현
새로이 분리시킨 사람 말초 혈액 T 세포 모집단을 형질감염시키는 데 있어서AAV 플라스미드:리포좀 복합체의 효과를 조사하였다. 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 효소에 대한 유전자를 pA1CMVIX-CAT 플라스미드 내에서 리포터 유전자로서 사용하였다(제1도). pA1CMVIX-CAT 작제물은 CMV 즉시형 초기 프로모터 인핸서 서열 및 CAT 유전자와 함께 AAV 골격(pA1)을 사용하여 제조하였다. 형질감염을 위해 T 세포의 전체 및 정제된 CD4+및 CD8+아집단을 사용하였다. CD34+간세포(제 10도, 아래 섹션 G.에 기재함)뿐만 아니라, T 세포의 전체(CD3 또는 CD5/8이 선택 됨) 및 정제된(CD4 또는 CD8이 선택됨) 아집단(제9a-d도)은 현저한 수준의 CAT 유전자 발현을 보였다.
말초 혈액으로부터 새로이 분리시킨 원발성 T 세포는 AAV 플라스미드 DNA:리포좀 복합체를 사용하여 형질전환 유전자 발현에 대해 시험하였다. CD3+T 세포, CD5/8 선택된 T 세포(전체 T 세포), T 세포의 CD4+아집단, 및 T 세포의 CD8+아집단으로부터 CAT 활성에 대한 박층 크로마토그래피 분석 결과를 각각 제9a-d도에 나타냈다.
T 임파구는 AIS MicroCELLector 장치를 사용하여 CD3+, CD5/8+또는 CD4+또는 CD8+모집단으로서 분획화시켰다. 관련 세포를 포획하고, 비유착 세포를 세척하여 제거하였다. 유착 세포를 RPMI-1640 및 10% FBS로 배양한지 2일 후 장치로부터 제거하였다. 5 내지 10x106개 세포를 평판 배양시키고, AAV 플라스미드 DNA 50㎍ 및리포좀 50 또는 100nmole로 형질감염시켜 1:1 또는 1:2 DNA:리포좀 비를 획득한다. 세포는 형질감염 후 3일째에 수거하고, 세포 추출물은 크로마토그래피 분석을 사용하여 측정한 단백질 함량 및 CAT 활성에 의해 규정화시켰다. 혈액은 A 또는 B로서 언급한 공급자로부터 입수하였다. 공급자 A 또는 B의 말초 혈액은 T 세포를 분리시키기 위해서 및 형질감염을 위해 사용하였다.
제9a-d도에 나타낸 바와 같이, AAV로 이루어진 리포좀의 지질 조성물은 변화하였으며, 리포좀에 대한 DNA의 비율도 마찬가지다. CD3+T 세포의 연구(제9a도)에 있어서 한사람의 공급자(공급자 A)로부터 구입한 세포를 사용하였다. 하기한 CD5/8 선택된 T 세포(제9b도), T 세포의 CD4+아집단(제9c도), 및 T 세포의 CD8+아집단(제9d도) 및 CDC34+간세포(제10도)의 연구를 위해, 2명의 환자(공급자 A 및 공급자 B)로부터 유도된 세포를 이용하였다.
표 2
제9a도에 나타낸 연구에 사용된 조건
표 3
제9b-d도에 나타낸 연구에 사용된 조건
제9a-d도에 나타낸 연구에서, 전체 및 정제된 아집단 모두에서 2일 및 3일째에 최대 수준의 발현이 관측되었다. 현저한 수준의 발현은 14일째까지 관측되었다. 이 세포를 형질감염 후 3일째에 수거하고, 각각의 추출물로부터의 규정화된 단백질 함량을 CAT 활성을 위해 분석한다. 동일한 조성의 리포좀 및 리포좀 비에 대한 DNA는 모든 아집단내에서 유사한 발현 수준을 유도시킨다.
G. 신선하게 분리시킨 CD34+간세포에서 AAV 플라스미드:리포좀 복합체에 의해 유도된 형질전환 유전자 발현
신선하게 분리시킨 사람 말초 혈액 CD34+간세포를 형질감염시키는 데 있어서 AAV 플라스미드:리포좀 복합체의 효과를 조사하였다. 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 효소에 대한 유전자를 pA1CMVIX-CAT 플라스미드 내에서 리포터 유전자로서 사용하였다(제1도). pA1CMVIX-CAT 작제물은 상기한 바와 같이 제조하였다. CD34+간세포로부터 박층 크로마토그래피에 의해 측정한 바의 CAT 발현 수준을 제10도에 나타냈다.
표 4
제10도에 나타낸 연구에 사용된 조건
새로이 분리된 CD34+말초 혈액 간세포를 AAV CAT 플라스미드 DNA:리포좀 복합체로 형질감염시켰다. CD34+세포는 모든 T 세포를 CD5/8 MicroCELLector 장치를 사용하여 본질적으로 제거한 후, 말초 혈액으로부터 AIS CD34 MicroCELLector 장치를 사용하여 정제시켰다. 간세포를 장치로부터 제거하고, 0.5 내지 1x 106개 세포를 플라스미드 DNA 10㎍ 및 리포좀 10nmole로 이루어진 복합체로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 간세포 인자 IL-3 및 IL-1을 함유하는 배지로 배양시켰다. 3일 및 7일째에 세포를 수거하고 추출하였다. 추출물로부터 규정화된 단백질 성분을 CAT 활성에 대해 평가하였다. 제10도에 나타낸 바와 같이, CD34+말초 혈액 간세포에서 현저한 수준의 CAT 유전자 발현을 나타냈다.
H. 통합 연구
제11a-b도는 본 발명에 따라 AAV 플라스미드 DNA:리포좀 복합체로 형질감염된 안정한 클론(적어도 30일 이내에 안정한 클론)으로부터 게놈 DNA의 증진된 화학 발광(ECL) 서던 분석을 나타낸다. 게놈 DNA를 분리시키고, ECL 직접 핵산 표지화 및 검출 시스템(Amersham)을 사용하여 분석하였다. IL-2 프로브는 pACMV-IL2로부터 0.685kb IL-2 유전자로부터 제조하였다. 하이브리드화시킨 후, 막을 55℃에서 0.5×SSC/0.4% SDS 중에서 10분 동안 2회 세척하고, 실온에서 2×SSC에서 5분 동안 2회 세척하였다.
제11a도에서, 시료를 Bam HI 및 Hind III로 분해시키고, IL-2로 프로브화하였다. 제11a도에 나타낸 바와 같이, 모든 클론은 Bam HI 및 Hind III으로 분해한 게놈 DNA 내에서 0.685kb 밴드에 의해 입증되는 바와 같이, IL-2 유전자의 존재를 보였다.
제11b도의 데이터에 대해, 시료를 Bam HI로 분해시키고, IL-2로 프로브화하였다. 다시, 모든 클론은 IL-2 유전자 통합을 보였다(제11b도). 제11b도에서 IL-2의 통합은 고분자량의 밴드(1.6 내지 2kb)에 의해 나타냈으며, 이 밴드는 분해를 통해 수득한 부착된 숙주 게놈 물질과 연관된 유전자의 통합과 일치한다. 제11b도에 나타낸 데이터는 Bam HI 분해된 게놈 DNA 내에 다중 고분자량 밴드가 있기 때문에 1개 이상의 통합 부위가 존재함을 나타낸다. 더욱이, 이 통합 부위는 분해된 클론에서 상이한 크기의 밴드로 나타낸 바와 같이, 상이한 클론 내에 상이한 위치에 있는 것으로 보였다(제11b도).
제12a-b도는 본 연구로부터 획득한 2개의 클론의32P 서던 분석을 사용한 염색체 DNA 분석을 나타낸다. 핵의 DNA는 Hirt 분획화 프로토콜을 사용하여 2개의 IL-2 클론(1A11 및 1B11)로부터 분리시켰다. 음성 대조군으로서, 전체 DNA를 R3327 세포주의 형질감염되지 않은 세포로부터 분리시켰다. 제한 효소 분해 후, 각각의 시료 10㎍을 적절한 플라스미드 대조군과 함께 1% 아가로스 겔 상으로 로딩하고, 전기 영동시키고, 변성시키고, Hybond + 막 상으로 전달하였다. 필터는 랜덤 프라이밍에 의해32P로 방사선 표지된 DNA 단편으로 68℃에서 밤새 하이브리드화 시켰다. 이어서, 막을 68℃에서 2x30분 동안 각각 2xSSC, 0.1% SDS 및 0.2xSSC, 0.1% SDS로 세척하였다. 이들 필터의 방사선 사진을 X-레이 필름 상에 노출시켰다.
제12a도에서, I1-2 유전자는 다시 프로브로서 사용하였다. 따라서, 서던 블로팅 후, 제12a도에 나타낸 필터는 pACMV-IL2의 0.68kb IL2 Bam HI/Hind III로 프로브화하였다. 제12a도에 나타낸 데이터는 클론 내로 통합된 IL-2 유전자의 복사체 수가 클론마다 변화함을 나타내며, 이러한 발견은 두 클론의 세포의 분해물(도면의 간단한 설명에서 명시됨)에서 0.685kb 밴드의 여러 밀도에 의해 입증되었다. 더욱이, 보다 큰 분자량의 밴드 역시 나타냈으며, 이는 다양한 분해 프로토콜로부터 획득한 숙주 게놈 물질과 함께 IL-2 유전자의 통합과 일치한다.
제12b도에 나타낸 데이터에 대해, 필터를 플라스미드 pACMV-IL2의 0.85kb pvuII/Hind III(AAV ITR/CMV)로 프로브화시켰다. 제12b도에 나타낸 데이터는 SmaI 및 pvuII 분해된 염색체 DNA에서 0.8kb 밴드에 의해 나타낸 바와 같이, 우측 AAV ITR의 존재를 나타낸다. 1개의 클론(클론 A) 중의 좌측 AAV ITR의 존재는 SmaI 및pvuII 분해된 염색체 DNA에서 2.1kb 밴드에 의해 입증되었다.
III. 실시예
AAV 바이러스 물질로 이루어진 리포좀을 이용하는 본 발명에 따른 방법은 사이토킨, B7 등의 동시자극성 분자, 및 MHC 제I 부류 항원을 갖는 분자에 대한 유전자를 다양한 세포 타입에 전달하는 데 사용된다. 예를 들면, 이러한 게놈 물질은 종양 백신을 제공하기 위해 원발성 종양 세포 또는 종양 세포주로; 혈액학 또는 신생물 상태를 치료하기 위해 말초 혈액 또는 골수 세포에 전달될 수 있다.
AAV 바이러스 물질을 함유하는 리포좀을 사용하는 것을 포함하는 본 발명에 따른 방법은 펩티드, 안티-센스 올리고뉴클레오티드, 및 RNA 등의 기질을 위한 유전자를 전달하고 발현시키는 데 사용된다. 이러한 펩티드, 안티-센스 올리고뉴클레오티드 및 RNA의 발현에 따라, 피검자의 면역 반응이 조절된다. 면역 반응의 조절은 면역 반응을 유도하거나 또는 면역 반응을 억제하는 것이다. 따라서, HIV 감염은 안티-센스 올리고뉴클레오티드, RNA 또는 본 발명에 따른 방법에 의해 발현되는 리보자임을 사용하여 치료한다. 또한, 종양에 대한 면역학적 반응은 본 발명에 따라 발현된 펩티드 또는 RNA를 사용함으로써 조절된다. 환자의 면역 반응은 종양 특이적 및/또는 종양 수반 항원에 대해 반응하도록 조절된다. 따라서, 비-면역원성 종양은 생체내 및 시험관 내에서 모두 세포용해 T 세포 반응을 유도하는 면역 종양으로 변형된다.
본 발명에 따른 방법은 유전자를 B 세포 또는 T 세포 등의 원발성 임파구 세포에 전달하는 데 사용된다. 본 발명에 따른 또 다른 방법은 유전 물질을 CD34+간 세포에 전달하는 데 사용된다. 따라서, 유전자는 발현되고, 당업계의 통상의 기술을 가진 자들이 인식하는 바와 같이 목적하는 유전자 발현이 요구되는, HIV 감염증, 유전적 결함 상태, 신생물 및 자가 면역 상태 등의 상태를 치료하는 데 사용된다. 예를 들면, 악성 신생물 상태를 위해, MDR I 유전자는 본 발명에 따라 전달되고, 발현되고, 치료 효과를 갖는다.
추가의 실시예에서, CD8+세포는 AIS MicroCELLector를 사용하여 선택한다. CD8+세포에 대한 원료 물질은 HIV 감염증을 앓는 환자의 말초 혈액 및 신생물인 환자의 종양 시료이다. 이어서, T 세포를 식물성 혈구 응집소(PHA)를 사용하는 것 등의 당업계에 공지된 방법에 따라 활성화시킨다. 활성화된 세포를 20일 동안 성장시킨다. 이후, 당해 세포를 본 발명에 따라 IL-2 게놈 물질로 이루어진 AAV:리포좀 복합체로 형질감염시킨다. 형질감염된 세포는 환자에게 복귀시킨다. 따라서, 이들의 세포 독성 T 세포 활성을 유지하기 위해 환자에게 IL-2를 후속 투여하는 것은 감소된다. 유리하게도, 본 발명에 따라 투여된 IL-2 유전자는 환자에게 전신적으로 제공되어야 하는 IL-2의 양을 감소시킨다. 전신적으로 투여되는 IL-2는 치사량 관련 독성과 연관이 있기 때문에 전신적으로 투여되는 IL-2의 양을 감소시키는 것이 유리하다.
A. 종양 백신화
전형적으로, 종양 백신화 프로토콜은 증식하지 않는 신생물성 세포를 사용한다. 신생물성 세포의 증식은 이들 세포를 방사선에 노출시키거나, 또는 이들 세포를 고압 챔버에 넣음으로써 억제된다. 신생물성 세포가 초기 종양 매싱 또는 병변에서 벗어나 신체에 존재하는 경우, 신체는 효과적인 항종양 반응을 개시할 수 있는 것으로 믿어진다.
일부 종양 백신화 치료는 종양 세포 항원성을 증진시키기 위해 흑색종 및 신장 세포암 환자에 대해 유전자 변형된 종양(GMT)을 사용하였으며, 이러한 치료는 생체 외 레트로바이러스 유전자 전달에 의존한다. 세포 외 레트로바이러스 전달은 매우 복잡한 방법을 수행해야 하고, 전달된 유전자의 도입 및 발현을 수득하기 위해 표적 세포 분열이 활성화되어야 한다는 단점이 있다. 더욱이, 적절한 양의 치료 생성물을 제공하기에 충분한 신생물성 세포를 생체 외 배양시키는 것은 매우 어려울 수 있다.
레트로바이러스 유전자 전달과는 대조적으로, 형질도입되어야 할 유전자에 대해 3' 및 5' 위치에 아데노 수반 바이러스(AAV)의 말단 반복 요소를 갖는 플라스미드 작제물은 비바이러스성 리포좀-매개 전이를 통해 도입되는 경우에 효율적으로 발현된다. 예를 들면, 이하 더 상세히 논의하는 바와 같이, 리포좀은 인터류킨-2-에 대한 cDNA로 이루어진 pMP6-IL2 등의 AAV 플라스미드를 흑색종 세포 등의 원발성 사람 종양 세포로 전달하기 위해 사용하였다. 이어서, 원발성 종양 세포는 인터류킨-2-를 발현시킨다. 종양 세포주 역시 효율적으로 형질감염되었다.
AAV-리포좀 형질감염을 사용하여 획득된 IL-2 발현은 지속적이며, 수준이 높았다. AAV 플라스미드-리포좀 조성물에 의해 유전자 변형된 세포로부터 분비된 사이토킨 수준은 레트로바이러스에 의해 감염된 세포로부터 획득된 수준을 초과하였다.
따라서, 세포는 AAV 플라스미드 및 리포좀으로 이루어진 조성물을 사용함으로써 유전자 변형되었으며, 이들 유전자 변형된 세포는 치료용 종양 백신화 섭생에 사용하였다. 유리하게도, AAV 플라스미드 및 리포좀으로 이루어진 조성물을 사용한 유전자 변형은 원발성 종양 세포가 변형되게 함으로써 본 개시에 앞서 요구되는 바의 유전자 변형에 영향을 미치도록 원발성 종양 세포로부터 종양 세포주를 확립할 일반적인 필요성이 없어진다. 유전자 변형되고, IL-2를 발현시키는 종양 세포가 전신적인 IL-2와 함께 투여될 필요가 없는 것이 매우 유리하며, 전신적인 IL-2는 매우 심각한, 심지어 치명적인 부작용을 유도하는 것으로 알려져 있다.
B. 치료학적 투여에 사용하기 위한 형질전환 유전자 DNA에 의한 세포의 리포펙션
전신적인 IL-2 악성 신생물 등의 특정한 심각한 상태를 치료한다. 또한, 활성화된 T 세포는 시험관 내 및 생체 내 모두에서 성장 및 생존을 위해 외인성 IL-2에 의존하게 된다. IL-2 자극이 제거될 때, T 세포는 며칠 내에 아폽토시스(apoptosis)(DNA 단편화)를 겪는다. 그러나, 전신 투여된 IL-2는 사망을 포함한 심각한 부작용을 유발하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 전신 IL-2 투여에 대한 필요성을 제거하거나 또는 감소시키는 요법을 개발할 필요성이 있다.
다음 데이터에 의해 나타낸 연구는 바이러스 형질도입을 포함하지 않는 시스템에 의한 AAV 플라스미드 DNA 및 형질전환 유전자 DNA의 T 세포로의 수송에 관한것이다. 보다 특히, 본 데이터는 형질감염에 관한 것이며, 리포펙션의 완만한 담체 시스템 및 AAV 플라스미드 작제물의 숙련된 형질도입 능력을 이용한다.
따라서, 형질전환 유전자 및 AAV 말단 반복 단위를 함유하는 AAV 플라스미드를 DNA 벡터로서 사용하고, 양이온성 리포좀을 담체 분자로서 사용하였다(T 임파구에서 형질감염 및 발현의 일반적인 논의에 대하여, Philip. R., et al., Mol. Cell. Biol. (1994) 14(4):2411-2418 참조). 바람직한 양태에서, 형질전환 유전자는 IL-2에 대한 것이다. AAV 플라스미드:리포좀 복합체는 재조합 AAV 형질도입에 의해 획득된 수준과 비교할 만한 형질전환 유전자 발현 수준을 유도한다. 유리하게도, 양이온성 리포좀은 rep 및 캡시드 트랜스상보, 재조합 바이러스 또는 야생형 AAV의 부재하에 세포로의 AAV 플라스미드 DNA의 도입을 촉진시킨다. AAV 플라스미드 DNA:리포좀 복합체는 TIL 세포를 효율적으로 형질감염시킨다. 리포좀과 복합체를 형성하는 AAV 플라스미드 DNA는 표준 플라스미드에 의한 복합체보다 몇 배 더 큰 발현 수준을 제공한다. 더욱이, 발현은 임의의 선택 없이 30일의 기간 동안 지속되었다.
본원에 기재된 T 세포에 대한 IL-2 유전자 발현 시스템은 활성화된 세포가 생체 내에서 이들을 유지하기에 충분한 내인성 IL-2를 제공할 수 있게 하며; 이로 인해 아폽토시스가 방지되고, IL-2를 전신 투여할 필요가 없다.
대조 연구에서, 여러 가지 T 세포 모집단을 IL-2 cDNA를 보유하고, 리포좀과 복합체를 형성하는 AAV 플라스미드로 형질감염시키고, 이들 모집단을 시험관 내에서 외인성 IL-2 없이 성장 및 증식을 유지할 수 있는 이들의 능력에 대해 시험하였다.
T 세포에 대한 분석은 IL-2 유전자로 형질감염되었을 때, 원발성 및 활성화된 CD8+T 세포가 관계없는 유전자로 형질감염된 대조군보다 더 큰 수준까지 증식되었다.
IL-2 형질감염된 CD8+세포의 성장 수준은 외인성 IL-2 없이 유지되었으며, 아폽토시스는 현저하게 감소되었다. 이들 형질감염된 T 세포에 대한 서던 블롯 분석은 25일째까지 IL-2 플라스미드가 존재함을 보였다. 본 발명의 데이터는 생체 외 활성화 및 증대된 CD8+세포로의 IL-2 유전자 전달이 이러한 세포의 성장을 지지하고, 임의의 외인성 IL-2 없이 아폽토시스를 방지됨을 나타낸다.
유전자 변형될 수 있는 세포는 원발성 폐, 난소 및 유방 암종; 흑색종; 자가 유래의 섬유아세포; 형질전환된 B 세포; 수상 돌기 세포; 및 세포주의 세포를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 이들과 같이 유전자 변형된 세포는 단독으로 사용되거나 또는 종양 세포와 결합되어 사용되어 TIL을 자극한다. 유전자 변형된 세포는 배양 중에 TIL 자극을 위해 항원을 제공하도록 사용되는 종양 수반 항원(예, HER2, K-ras, 뮤신)을 발현시키도록 제조될 수 있다. 더욱이, 형질전환된 B 세포 및 수상 돌기 세포 등의 항원을 나타내는 세포는 유전자 변형될 수 있고, 배양 중에 TIL 자극을 위해 항원의 존재를 제공하는 MAGE-1 및 MART-1 등의 종양 수반 항원성 펩티드를 발현시키도록 제조된다. 본 발명의 데이터는 DNA의 일시적 및 지속적 발현 모두를 위해 높은 효율로 T 세포 및 신생물성 세포를 형질감염시킬 수 있는 능력을 설정한다. 형질감염은 (아데노바이러스에 감염된 세포에서 rep 및 캡시드 입자로부터 생산할 수 있는) 임의의 재조합 바이러스의 부재하에 발생하였다. AAV 형질감염에 의해 수득된 세포는 환자를 치료하기 위해 사용된다. 이러한 세포로 치료된 이들 환자는 현저한 치료 효과를 획득한다.
I. 사용된 시약의 제조 및 프로토콜
a. 플라스미드
i. 플라스미드 pACMV-IL2
플라스미드(pACMV-IL2)는 IL-2 cDNA로서 사람 인터류킨-2 유전자(IL-2), 및 사람 사이토메갈로바이러스(CMV)의 즉시형 초기 프로모터-인핸서 요소, 및 랫트의 프레프로인슐린 및 양 말단에서 말단 반복 단위(ITR)가 전위된 아데노 수반 바이러스에 의해 플랭킹된 SV40 폴리아데닐화 서열을 함유한다. 상응하는 대조군 플라스미드 pBC12/CMV-IL2는 pACMV-IL2와 동일하지만 AAV 말단 반복 단위가 결실되어 있다. 제1도는 pACMV-IL2 및 pBC12/CMV-IL2의 플라스미드 지도를 나타낸다.
ii. 플라스미드 pMP6-IL2
제2도에 나타낸 바와 같이, 플라스미드 pMP6-IL2는 이본쇄의 환형 플라스미드이다. pMP6-IL2 플라스미드는 CMV 프로모터 및 SV40 폴리아데닐화 시그날의 조절하에 사람 인터류킨-2 유전자를 갖는다. 프로모터와 IL-2의 암호화 서열 사이에는 IL-2의 발현을 증진시키는 인트론이 있다. 완전한 발현 카세트는 아데노 수반 바이러스의 좌측 및 우측 말단 서열 사이에 있다. pMP6-IL2 플라스미드는 블루스크립트 골격도 가지며; 이 골격은 이. 콜라이 내에서 이러한 플라스미드의 증식을 촉진시키는 암피실린 내성 유전자 및 Col-E1 세균성 복제 오리진을 갖는다.
제3a-e도는 pMP6-IL2 플라스미드의 DNA 서열을 나타낸다. a 내지 e 패널은 서열의 연속 부분을 나타낸다. 도면에서, 공지된 DNA 서열에 상응하는 pMP6-IL2 서열 부분을 나타냈으며; 상응하는 서열 정보를 pMP6-IL2 플라스미드에 대한 서열 정보 바로 아래에 열거하였다. 표지하지 않은 서열은 링커이다.
pMP6-IL2 플라스미드는 알칼리 용해 및 아세트산암모늄 침전에 의해 정제하였다. 핵산의 농도는 260nm에서 UV 흡수에 의해 측정하였다.
iii. 플라스미드 pA1CMVIX-CAT
플라스미드 pA1CMVIX-CAT는 CMV 프로모터 인핸서 요소, 개재(intervening) 스플라이스 수용체 서열, 세균 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 유전자 및 pBR322 유도체 내에서 AAV 말단 반복 단위에 의해 플랭킹된 원숭이 바이러스 540 후기 폴리아데닐화 시그날을 함유한다.
플라스미드는 알칼리 용해 및 아세트산암모늄 침전에 의해 정제시켰다. 핵산의 농도는 260nm에서 UV 흡수에 의해 측정하였다.
b. 리포좀 제조
i. pACMV-IL2와 함께 사용된 리포좀
소단층 리포좀은 중성 지질, 디올레오일-포스파티딜-에탄올아민(DOPE)(Avanti Polar Lipids)과 함께 양이온성 지질, 디옥타데실-디메틸-암모늄-브로마이드(DDAB)(Sigma)로부터 제조하였다. 지질을 클로로포름 중에 용해시켰다. DDAB는 환저 플라스크 내에서 DOPE와 1:1의 몰비로 혼합하였다. 지질 혼합물을 회전 증발기 상에서 건조시켰다. 지질 필름은 멸균 2차 증류수를 첨가함으로써 재수화시켜 최종 농도 1mM의 DDAB를 수득하였다. 이 용액은 투명해질 때까지 욕조 초음파 분해기(Laboratory Supplies, 뉴욕주 힉스빌 소재 내에서 초음파 분해하였다. 리포좀을 4℃에서 아르곤 하에 저장하였다.
ii. pMP6-IL2와 함께 사용된 리포좀
리포좀은 양이온성 지질 디옥타데실-디메틸-암모늄-브로마이드(DDAB)를 중설지질 디올레오일-포스파티딜-에탄올아민(DOPE)와 1:1의 몰비로 합하거나 또는 DDAB를 콜레스테롤과 1:0.6 몰비로 합하고, 지질을 회전 증발기내에서 증발 건조시킴으로써 제조하였다. 지질을 무균 탈이온수 중에 재현탁시켜, 농도 1mM의 DDAB를 획득한 후, 이를 투명해질 때까지 초음파 욕조 내에서 초음파 분해하였다. 리포좀을 4℃에서 아르곤하에 저장하였으며, 이는 4개월 이상 동안 안정하였다.
iii. TIL 자극에 사용된 리포좀
리포좀은 양이온성 지질(DDAB)을 중성 지질(DOPE) 또는 콜레스테롤과 1:1 또는 1:2의 몰비로 합하고, 지질을 회전 증발기 내에서 증발 건조시킴으로써 제조하였다. 지질을 멸균 탈이온수 중에 재현탁시켜, 농도 1mM의 DDAB를 획득한다. 이어서, 이 용액을 투명해질 때까지 초음파 욕조 내에서 초음파 분해하였다. 리포좀을 4℃에서 아르곤 하에 저장하였으며, 이는 4개월 이상 동안 안정하였다.
c. 세포 제조
i. TIL 세포의 분리
TIL 세포는 AIS MicroCELLectore?에 의해 선택하였다. 원료 물질은 신생물을 갖는 환자로부터 취한 종양 또는 임파계 샘플이었다. 이어서, T 세포는 IL-2를 사용하는 것 등의 당업계에 공지된 방법에 따라 활성화시켰다. 활성화된 세포를 20일 동안 성장시켰다.
ii. T 세포 및 신생물성 세포의 분리
원발성 T 세포 모집단은 말초 혈액 단핵 세포로부터 분리시키고, TIL 및 종양 세포는 해당 장치(Microcellectore?, Applied Immune Sciences)를 사용함으로써 분리시켰다. 세포는 표준 방법학에 따른 형질감염을 위해 제조하였다.
1) 충실성 조직 공급원으로부터의 신생물성 세포
형질감염시킬 세포 모집단을 획득하기 위해, 세포를 충실성 원발성 또는 전이성 병변으로부터 또는 임파계 조직으로부터 획득한다. 예를 들면, 유방암의 생검은 의심가는 난치성 또는 재발성 유방암의 수술전 진단으로 외과 수술중인 환자로부터 획득한다. 이러한 연구는 난소 종양으로부터 획득한 세포로 계속적으로 수행하였다. 생검 조직의 코어를 광 현미경 및 면역조직화학적 분석에 의한 통상의 방법으로 처리한 단편으로 분할하였다.
따라서, 새로이 절개된 종양을 0.5cm 입방체로 절단하였다. 10개 이하의 종양 입방체를 AIM V 배지(GIBCO) 25ml를 함유하는 25ml들이 스피너 플라스크에 이전시켰다. 이 플라스크를 5% CO2를 함유하는 37℃의 배양기내에 위치시키고; 이 플라스크를 12-18시간 동안 100-120RPM으로 약하게 교반시켰다. 배양 후, 분해되지 않은 임의의 조직을 여과한 후, 현탁액 중의 세포를 펠렛화하였다. 펠렛화된 유방암 세포를 AIM V 배지를 함유한 조직 배양 플라스크(Falcon) 내에 위치시켰다. 세포를 37℃의 온도에서 5% CO2를 함유하는 습한 공기 내에 유지시켰다.
무혈청 배지 중에서 48시간 동안 배양시킨 후, 유착 및 비유착 세포주는 비유착 세포를 흡인시킴으로써 생성되었다. 비유착 세포를 세척한 후, 신선한 플라스크 내에서 재배양시켰다. 재배양시에 유착 세포는 콘플루언스로 성장시키고, 0.05% 트립신 및 0.02% EDTA로 트립신 처리하여, 높은 세포 밀도로 새로운 플라스크에 이동시켰다.
별법으로, 폐, 난소 및 유방 기원의 원발성 종양 세포는 충실성 종양 시료로부터 입수하고, 다음과 같이 분리시켰다: 종양을 다지고, 2시간 동안 효소 분해시켰다. 이어서, 조직을 균질화시키고, PBS로 세척하였다. 임파구를 AIS MicroCELLector-CD5/8 장치 상에서 포획함으로써 비임파구 세포로부터 분리시켰다. 비유착 모집단은 L-글루타민 및 펜/스트렙과 함께 RPMI 1640 + 10% FBS 중에서 배양한 종양 세포를 함유한다.
2) 유체 공급원으로부터의 신생물성 세포
궁극적으로 형질감염시킬 세포에 대한 또다른 공급원으로서, 자가 유래 신생물성 세포를 분리시키기 위해 악성 복수액 또는 흉막 삼출액을 사용하였다. 따라서, 악성 복수액 또는 삼출액을 원심분리시키고, 세포를 함유하는 펠릿을 AIM V 배지 중에 재현탁시켰다. 세포를 계수하고, 임파구 아집단을 2 단계 Ficoll 구배를사용함으로써 또는 AIS CELLectorTMCD5/CD8 장치를 사용함으로써 고갈시켰다. Ficoll 구배 또는 AIS CELLectorTMCD5/CD8 장치의 사용을 선택하는 것은 당업계의 통상의 기술을 가진 자가 인식하는 바와 같이, 전체 세포수의 견지에서 이루어졌다. 유체 공급원으로부터의 신생물성 세포의 분리는 흉막 삼출액과 상호 관계를 갖는 것으로 알려진 난소 및 폐암 등의 악성 종양과 특히 관련이 있다. T 세포가 고갈된 분획이 신생물성 세포에서 증가된다.
모든 자가 유래 신생물성 세포는 광 현미경, 유동 혈구 계산 및 면역조직화학적 염색에 의해 특성화시켜 온코진(oncogene) 발현을 평가하고, 증식 지수를 설정하였다. 예를 들면, 유방암인 환자에 대한 연구를 위해, 형태학적으로 유방암 세포이거나 또는 유방암 특이적 항체로 염색한 세포만을 자가 유래 종양 세포로 취급하고, 이어서 그 자체로서 사용하였다.
3) 세포주
쥐의 B 임파종 세포주 38C13 세포는 베른트 간스바허 박사(Dr. Bernd Gansbacher)(Sloan Kettering Memorial Cancer Center)로부터 제공받고; 랫트의 전립선 세포주 R3327 세포는 엘리 길보아 박사(듀크 대학)로부터 제공받고; MDA-231 유방암 세포주 세포는 ATCC로부터 입수하였다.
d. 세포의 형질감염 "리포펙션"
i. TIL 세포의 리포펙션
TIL 세포의 형질감염을 위해, 5-10x106개 세포를 6웰 디쉬의 웰당 무혈청 배지 1ml 중에서 평판 배양시켰다. IL-2 게놈 물질로 이루어진 플라스미드 DNA(예, pMP6-IL2) 50㎍을 (1:1 몰 비의 DDAB 및 DOPE로 구성된 리포좀으로서) DDAB 50nmole과 혼합하였다. 무혈청 배지 0.5ml를 AAV:리포좀 복합체에 첨가하였다. 이어서, AAV:리포좀 복합체 및 무혈청 배지를 세포와 함께 평판 배양시켰다. 리포펙션을 유효하게 하기 위해, 세포를 실온에서 5분 동안 배양시킨 후, 송아지 태아 혈청을 이 세포에 첨가하여 최종 농도 5%의 송아지 태아 혈청을 획득한다.
형질감염된 TIL 세포를 환자에게 다시 제공했다. 이들 세포는 IL-2와 배합된 세포 독성 TIL 세포의 치료 효과를 제공한다. 유리하게도, 세포 독성 T세포의 활성을 유지하기 위해 환자에게 IL-2를 전신 투여할 필요성이 감소 또는 제거된다. 전신으로 투여되는 IL-2의 양의 감소는 이러한 방법으로 투여된 IL-2가 잠재적인 치사량-관련 독성과 상관 관계인 것으로 알려져 있기 때문에 유리하다.
ii. 신생물성 세포의 리포펙션
유방암 세포 또는 난소 종양 세포의 배양 등의 신생물성 세포 배양은 다음과 같은 방법으로 형질감염된다: 신생물성 세포(1x106개 세포)는 전체 지질 30nmole과 혼합한 플라스미드 DNA(예, pMP6-IL2) 5㎍으로 형질감염시켰으며, 여기서, 지질은 1:1 몰 비의 DDAB 및 DOPE로 구성된 리포좀으로 이루어져 있다. AIM V 배지 1ml를 리포좀-DNA 복합체에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 배양시켰다. 이어서, 배지와 리포좀-DNA 복합체의 세포로 전달시켰다. 이어서, 이 세포를 37℃에서 24시간 동안 배양시켰다. 24시간 후, 이 세포에 치사량의 방사선을 조사하였다(10,000 RADS).
별법으로, DNA-리포좀 복합체를 다음 방법에 의해 형성시켰다: 목적하는 양의 DNA를 멸균 바이알로 옮기고, DNA ㎍당 1 또는 2nmole DDAB를 첨가하여 혼합하였다. 이어서, 무혈청 배지 1ml를 리포좀-DNA 복합체에 첨가하였다. 형질감염시킬 모든 세포를 6웰 플레이트에서 평판 배양시켰다. 원발성 종양 세포 및 종양 세포주를 무혈청 배지 2ml 중에서 웰당 1x106개 세포로 평판 배양시켰다. 리포좀-DNA 복합체를 이 세포에 첨가하고, 실온에서 5분 동안 배양시켰다. FBS를 첨가하여 최종 농도가 10%로 되게 하였다.
e. 형질전환 유전자 발현의 분석
i. 세포의 분석
형질전환 유전자의 발현은 치사량의 방사선 조사된 세포에 의한 IL-2 발현을 평가함으로써 기록하였으며; 이러한 IL-2 분석은 당업계의 통상의 기술을 가진 자들에게 공지된 정보에 따라 ELISA 분석에 의해 행할 수 있다.
무세포 상층액을 수거하고, 이들의 IL-2 농도를 여러 시점에서 ELISA에 의해 측정하였다. 예를 들면, IL-2 분석은 72시간 동안 상층액에 대해 2회 수행하였다. 유전자 변형된 세포의 성공적인 형질감염은 100pg/72h/106개 세포 이상의 IL-2 농도가 획득되는 경우로서 정의된다.
ii. 세포내 분석
세포를 여러 시점에서 수거하고, PBS로 세척하고, PBS 중의 차가운 1% 파라포름알데히드 중에 재현탁시켰다. 4℃에서 10분 후, 세포를 차가운 사포닌완충액(0.1% 사포닌, PBS 중의 10% FBS)로 세척하고, 4℃에서 15분 동안 마우스 항-사람 IL-2 항체로 염색하였다. 이어서, 세포를 차가운 사포닌 완충액으로 세척하고 4℃에서 15분 동안 FITC 접합된 염소 항-마우스의 F(ab') 2 항체로 염색하였다. 세포를 사포닌, 이어서 PBS로 세척한 후, 유동 혈구 계산기에 의해 분석하였다.
f. IL-2 DNA를 위한 서던 하이브리드화
염색체 DNA를 Hirt 분획화에 의해 분리시켰다. 제한 분해 후, 시료당 DNA 5㎍을 전기영동시키고, Hybond N + 나일론 막으로 이전시키고, 0.685kb IL-2 단편으로 하이브리드화시켰다.
g. 세포 독성 검정
표적 세포를 1x106개 세포당 100μ Ci51Cr로 표지화하였다. 5000개의 표적 세포를 96웰 플레이트에서 3회 평판 배양시켰다. 작동 인자 세포를 첨가하여 20:1의 작동 인자:표적 세포 비율을 획득한다. 각각의 웰로부터 100㎕의 상층액을 4시간 동안 배양시킨 후 수거하고, γ-계수기로 계수하였다.
h. 증식 검정
증식을 검정하기 위해, AIM V 배지 100㎕ 중의 5x104개 세포를 96웰 플레이트에서 3회 평판 배양시켰다. 각각의 웰에 1μCi3H-티미딘을 펄스시켰다. 세포를 24시간 후에 수거하고, 신틸레이션 계수기로 계수하였다.
i. TCR 분석
TIL 세포를 배양 중에 및 자극 실험 후에 여러 시점에서 동결시켰다. TCR 제한을 당업계에 공지된 방법에 따라 역전사효소(RT) PCR에 의해 분석하였다.
2. 수득된 데이터 및 발견
a. 종양 특이적 CTL의 생체의 활성화;
배양 중의 TIL 세포의 자극
자극은 자가 유래의 방사선 조사된 종양 또는 IL-2 형질감염된 방사선 조사된 자가 유래의 종양과 50:1의 비율로 배양된 TIL로 수행하였다. 자극 기간은 5-7일 동안이었다. 이들 세포를 600IU/ml의 rIL-2로 보충한 AIMV 배지 중에서 배양한 TIL과 비교하였다. 세포를 자극 후 표현형, 세포 독성 활성, 증식 및 TCR 레퍼터리의 변화에 대해 검정하였다. 배양 동안 TIL 세포를 자극하는 단순하고 신속한 방법을 시험관 내 및 생체 내 유전자 전달 프로토콜 모두에 대해 이용하였다.
배양 중에 TIL을 자극하기 위한 또 다른 수단으로서, 종양 수반 항원성 펩티드를 TIL 배양액에 직접적으로 첨가할 수 있다.
i. 형질감염된 신생물성 세포에 의한 TIL의 자극
형질감염된 신생물성 세포와 TIL을 배양하기 위해, 신생물성 세포를 예를 들면 pMP6-IL2로 형질감염시키고, 방사선 조사하였다. 방사선 조사한지 24시간 후, 형질감염된 세포를 세척하고, 트립신 처리로 수거하고, 원심 분리에 의해 펠렛화하고, 배양 배지 중에 재현탁시켰다. 이어서, 형질감염되고, 방사선 조사된 신생물성 세포를 TIL과 배양시켰다.
종양 특이성은 배양 및 증식 중에 TIL에 의해 유지되었다.
따라서, 종양 세포(자가 유래 및 HLA 매치된 동종성)는 증식 기간 동안 선택된 TIL을 재자극하는 데 사용하였다. 표적에 대한 T 세포의 특이성은 때때로 증식 과정 중에 감소되는 것으로 알려져 있기 때문에, 이는 유의적인 수치이다.
따라서, 종양 세포 자체는, 예를 들면, 리포좀 및 pMP6-IL2로 이루어진 조성물에 의해 유전적으로 변형되어 이들의 항원성을 추가로 증가시킨다.
TIL의 장기간의 배양은 종종 폴리클로날 증식을 유도하며, 증식된 세포에 의해 종양 특이성이 감소된다. 제13도에 나타낸 바와 같이, 증식된 TIL이 자가 유래의 종양에 의해 자극받을 때, 특이성이 증진되었다. IL-2 형질도입된 종양으로 자극한 TIL의 특이성은 TCR 레퍼터리에 의해 분석한 바와 같이 변형되지 않은 종양에 의한 것보다 더 크다. 형질감염된 종양에 의해 배양된/자극된 TIL의 증진된 특이성은 배양한지 30일 경과 후에 획득한 데이터에 대해 특히 현저하였다.
데이터는 AAV 플라스미드와 복합체를 형성하는 양이온성 리포좀이 배양된 종양 세포주 뿐만 아니라 원발성 종양 세포를 효율적으로 형질감염시켰음을 입증한다. 형질감염된 세포 중의 50% 이하가 세포내 IL-2 수준에 의해 평가한 바와 같이 IL-2를 발현시켰으며, 발현 기간은 30일 이하였다. 형질감염 후 종양 세포의 방사선 조사는 형질전환 유전자 발현 수준을 변경시키지 않았다.
TCR 분석은 종양 특이적 T 세포의 증식을 나타낸다. 이들 종양 특이적 T 세포는 유전자 변형된 자가 유래의 종양과 함께 대량 확장된 TIL의 배양에 의한 영향을 받았다.
b. IL2 유전자에 의한 형질감염 후 TIL의 증식
제14도에 나타낸 데이터에 대해, 유방의 TIL은 CD8 장치에 의해 흉막 삼출액으로부터 분리시키고, IL-2 600IU/ml를 함유하는 배지 중에서 3주 동안 배양하였다. 유사한 실험을 난소 종양으로부터 획득한 TIL로 수행하였으며, 그 결과는 유방 종양 TIL로 획득한 결과와 일치하였다.
약 10x106개 TIL 세포가 pMP6-IL2 DNA:리포좀 복합체로 이루어진 여러 가지 조성물로 형질감염되었다. 리포좀의 2가지 조성물, "RPR DDAB"(Nattermann Phospholipid GmBH, Cologne, Germany) 및 "1100-28"(Applied Immune Sciences, Inc., 캘리포니아주 산타 클라라 소재)이 시험되었다. RPR DDAB 리포좀은 1:1의 DDAB:DOPE 비율을 가지며, 1100-28 리포좀은 1:0.6의 DDAB:DOPE 비율을 가졌다. 이어서, 형질감염된 TIL 세포를 임의의 외인성 IL2 없이 배양시키고, 양성 대조군을 IL-2 600IU/ml의 존재하에 배양시켰다.
형질감염된지 5일 후, 형질감염된 그룹 및 형질감염되지 않은 그룹을 3H 티미딘으로 표지하고 혼입에 대해 평가하였다. 양성 대조군의 수는 100%로서 설정하였다. 성장 백분율은 RPR DDAB 리포좀-형질감염된 그룹에 대해 40-80% 범위였고, 1100-28 리포좀 그룹에 대해 40-60% 범위였다.
제14도에 나타낸 데이터는 유방암 TIL이, IL-2 유전자로 형질감염되었을 때, 시험관 내에서 증식을 유지하기 위해 외인성 IL-2를 요구하지 않음을 나타냈다.
c. TIL에서 Thy1.2 유전자 발현
제15도에 나타낸 데이터에 대해, 유방암 TIL은 IL-2 유전자를 함유하는 pMP6플라스미드의 또 다른 양태로서, 네오마이신 내성 유전자 및 쥐의 Thy1.2 유전자를 함유하는 pMP6 플라스미드(pMP6/neo/Thy1.2)로 형질감염시켰다. pMP6/neo/Thy1.2 플라스미드는 DDAB:DOPE 리포좀과 복합시켰다. 리포좀 조성물은 제14도에 나타낸 데이터에 대해 기재한 바와 동일한 조성물이었다. 2일째에, 형질감염된 세포를 안티-Thy1.2. PE 항체(Pharmingen, 캘리포니아주 샌디에고 소재)로 염색하고, 유동 혈구 계산에 의해 분석하였다. 제15도에 나타낸 바와 같이, 마우스 T 세포 표면마커 Thy1.2는 형질감염된 사람 CD8+TIL에서 효율적으로 발현되었다.
d. 형질감염 후 방사선 조사된 사람 흑색종 세포에서 형질전환 유전자의 발현
다음 데이터는 종양 세포를 pMP6-IL2로 형질감염시킴으로써 획득하였다. 이들 데이터는 종양 세포가 성공적으로 유전자 변형되었음을 나타냈다. DDAB:DOPE 외에, 다른 지질 조성물도 이용되었다. 이들 다양한 지질 조성물은 리포펙션 및 후속 사이토킨 발현을 성공적으로 유도하였다.
흑색종 세포는 당업계의 통상의 기술을 가진 자들에게 공지된 다음과 같은 효소 분해 방법에 의한 전이 병변으로부터 분리시켰다. 세포를 5-10% 송아지 태아 혈청으로 보충한 DMEM 내에서 성장시키고, 5일 내지 8년 동안 배양을 유지시켰다.
리포펙션을 위한 제제에서, 종양 세포를 60mm 디쉬 상에서 5x105개 세포/디쉬의 용적으로 평판 배양시켰다. 평판 배양시킨 다음 날, 양이온성 지질 10-30nmole 및 DNA 2-10㎍으로 이루어진 리포좀을 혼합하고, 무혈청 배지 중에서 유착성 단일 층으로 전이시켰다. 세포를 1-5시간 동안 배양시키고, 이 배지에 FCS를 첨가하였다.
여러 가지 리포좀 제제가 성공적으로 사용되었으며, 그 예로는 1:1 몰비의 DMRIE:DOPE(Vical, 캘리포니아주 샌디에고 소재); 3:1 질량 비의 DOSPA:DOPE(Gibco, 미들랜드주 게이터스버그 소재); 및 1:2 몰 비의 DDAB:DOPE를 포함한다.
형질감염된 세포는 리포펙션된지 24시간 후 치사량 수준의 x-방사선(5000rads)에 노출시켰다. 상층액을 72시간째에 수거하고, 이후 IL-2 수준을 당업계의 통상의 기술을 가진 자들에게 공지된 정보에 따라 ELISA에 의해 측정하였다. 각각의 리포좀 제제에 의해 획득한 가장 큰 수준의 IL-2 발현을 표 4에 열거하였다.
따라서, 높은 수준의 발현(>5,000pg/ml)은 방사선 조사한 지 26일째까지 증식되지 않은 생존 세포에서 검출되었다.
[표 4]
이러한 데이터는 플라스미드 pMP6-IL2의 비바이러스성 리포좀 매개 전달을 통한 사람 흑색종 세포주의 성공적인 형질감염을 나타낸다. 형질감염은 치사량의 방사선 조사 후 IL-2의 현저한 생성을 초래하였다.
e. 여러가지 플라스미드 작제물에 의한 형질감염 후 전립선 종양 세포주에서 형질 전환 유전자 발현의 세포외 분석
상이한 플라스미드 작제물에 의한 형질감염 후 형질전환 유전자 발현의 수준 및 지속 기간을 비교하기 위해, 전립선 종량 세포주 R3327을 표준 플라스미드(pBC12/CMV-IL2) 10㎍ 또는 DDAB:DOPE 1:2 리포좀으로서 DDAB 10nmole과 복합체를 형성하는 AAV 플라스미드(pACMV-IL2) 10㎍으로 형질감염시켰다.
상층액을 여러 시점에서 수거하고, IL-2 수준에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. 제10도에 나타낸 데이터에 대해, IL-2 수준은 24시간 배양 단위로 pg/ml/106개세포로서 나타냈다. AAV 플라스미드에 의한 형질감염은 표준 플라스미드에 의한 것보다 훨씬 더 큰 IL-2 수준을 나타냈다. 또한, AAV 플라스미드에 의한 형질감염은 표준 IL-2 플라스미드에 의해서는 단지 7일인 것과 대조적으로 30일 이동 동안 IL-2를 생성하였다.
제17도는 AAV 플라스미드(pACMV-IL2) 또는 표준 플라스미드(pBC12/CMV-IL2)로 형질감염시킨 R3327 세포로부터 획득한 염색체 DNA의 서던 블롯 분석을 나타낸다. 이 블롯은 IL-2 유전자의 0.685kb Bam HI/Hind III 단편으로 프로브화하였다. 제17도에서, 대조군(c)은 형질감염되지 않은 세포로부터 획득한 DNA이다. IL-2 삽입물은 마지막 레인에 제시한다.
f. AAV 플라스미드 작제물로 형질감염시킨 후 전립선 종양 세포주에서 형질전환 유전자 발현의 세포내 분석
전립선 세포주 R3327을 DDAB:DOPE 조성 비율이 1:1 또는 1:2인 DDAB:DOPE 리포좀과 복합체를 형성하는 AAV 플라스미드(pACMV-IL2)로 형질감염시켰다. DNA:리포좀 비율은 두 그룹에서 DNA 10㎍:DDAB 10nmole이었다.
형질감염된 세포는 본 명세서에 기재한 바와 같이 변형된 유동 혈구 계산 방법을 사용하여 세포내 IL-2 단백질 수준에 대해 여러 시점에서 염색시켰으며, 그 결과는 제18도에 나타냈다. 제18도에 나타낸 데이터는 IL-2 단백질을 발현시키는 양성 세포의 백분율로서 나타냈다. 감염되지 않은 세포는 음성 대조군으로서 사용하였으며, 대조준의 수치는 형질감염된 그룹의 수치로부터 공제하였다.
g. 원발성 종양 세포의 형질전환 유전자 발현
AAV 플라스미드-리포좀 복합체는 여러가지 원발성 종양 세포를 형질감염시키기 위해 사용하였다. 1개의 폐, 1개의 난소, 및 2개의 유방 종양 시료를 신선한 종양 생검으로부터 분리시켰다. 종양 세포를 형질감염에 앞서 2-3주 동안 10% FBS 로 보충한 RPMI-1640 배지 중에서 배양하였다.
원발성 종양 세포는 DDAB:DOPE 1:1로서 DDAB 10nmole과 복합체를 형성하는 플라스미드(예, pACMV-IL2) 10㎍으로 형질감염시켰다. 상층액을 2일 및 3일째에 수거하였다. IL-2로 수준은 ELISA에 의해 측정하고; 그 결과는 제6도에 나타냈으며, IL-2 수준은 24시간 배양 단위로 pg/ml/106개 세포로서 나타냈다.
h. 원발성 유방 종양 세포 및 전립선 종양 세포주 세포의 방사선 조사 후 형질전환 유전자 발현
유전자 발현에 대한 방사선 조사의 효과를 측정하기 위해, 원발성 유방 종양 세포 및 전립선 세포주(R3327)의 세포를 pACMV-IL2 및 DDAB:DOPE 리포좀 복합체로 이루어진 조성물로 형질감염시키고, 치사량의 방사선 조사 후 유전자 발현에 대해 평가하였다. 종양 세포주에 대한 데이타는 제19A도에 나타냈으며, 원발성 종양 세포에 대한 데이터는 제19B도에 나타냈다. 이들 연구에서, 형질전환 유전자는 IL-2에 대한 것이었다. 2일째에, 세포의 분취량을60Co 방사선 조사기를 사용하여 6000r에 적용시킨 후 다시 배양시켰다. 상층액을 방사선 조사 후 24, 48, 72 및 96시간째에 수거하고, IL-2 수준에 대해 시험하였다. 제19도에 나타낸 바와 같이, 형질감염 후 치사량의 방사선 조사는 형질전환 유전자 발현을 억제하지 않았다. 제19도에서, IL-2 수준은 24시간 배양 단위로 pg/ml/106개 세포로서 나타냈다.
IV. 토의
본 연구에서, 형질전환 유전자 및 AAV 말단 반복 단위를 함유하는 AAV 플라스미드가 DNA 벡터로서 사용되었고, 양이온성 리포좀이 담체 분자로서 사용되었다. AAV 플라스미드 DNA:리포좀 복합체는 원발성 종양 세포, 배양된 세포주, 원발성 임파구 세포 및 CD34+간세포를 효율적으로 형질감염시키는 것으로 입증되었다. 또한, (아데노 바이러스에 의해 감염된 세포에서 rep 및 cap 캡시드 입자로부터 생산될 수 있는) 임의의 재조합 바이러스의 부재하에 형질전환 유전자의 높은 수준 및 지속적인 발현에 의한 통합은 우수한 형질감염 과정에 의해 달성되었다.
높은 수준의 발현 외에, 본 명세서에 기재된 AAV 플라스미드:리포좀의 조합은 전형적인 리포좀-매개 형질감염에 의해 입증되는 일시적인 발현과는 대조적으로, 장기간(30일까지)의 유전자 발현을 유도하였다(제5a-b도). 현저하게도, 지속되는 발현은 재조합 AAV 형질도입된 그룹에서 뿐만 아니라, AAV 플라스미드 리포렉션된 그룹에서 입증되었다(제5a-b도). 더욱이, 제4a-b도에 나타낸 바와 같이, 표준 플라스미드 형질감염에 비해 AAV 플라스미드에 의해 10배 더 큰 수준의 발현이 관찰되었다.
본 명세서에 기재된 시험 조건하에, 최적 AVV 형질도입과 최대 AAV 플라스미드:리포좀 형질감염 사이의 효율에 차이가 없었다. 발현의 시간 경과에 관하여, 양이온성 리포좀은 이미 포유 동물의 세포 타입에서 표준 플라스미드 DNA의 일시적인발현만을 매개하는 것으로 보였다(Felgner. P.L., et al., "A highly efficient, lipid-mediated DNA transfection procedure," Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84:7413-7417; Rose, J.K., et al., "A new cationic liposome reagent mediating nearly quantitative transfection of animal cells," Biotechniques (1991) 10:520-525). 더욱이, 통합의 효율에 관하여, 본 명세서에 기재된 결과에 비해 숙주 게놈으로의 통합의 훨씬 더 낮은 효율이 전자의 리포좀 매개된 형질감염에서 관찰되었다(Shaefer-Ridder, M., et al., "Liposomes as gene carriers: Efficient transfection of mouse L cells by thymidine kinase gene," Science (1982) 215:166-168). 그러나, 본 명세서에 나타낸 바와 같이, AAV 말단 반복 단위를 갖는 AAV 플라스미드 DNA와 복합된 양이온성 리포좀은 AAV 말단 반복 단위(ITR)만이 결실된 표준 플라스미드에 비해, 게놈 DNA 통합을 증가시킨다. AAV 플라스미드 물질로 이루어진 리포좀은 임의의 특이적 세포 표면 수용체의 부재하에 플라스미드 DNA를 전달하고, 유전자 전달에서 바이러스의 작용을 대체하였다.
본 연구에서, 바이러스 벡터는 리포좀에 의해 함께 대체될 수도 있으며, 효율적인 발현 및 통합이 효율 및 통합 모두에 관여하는 바이러스 요소를 포함하는 작제물을 이용함으로써 획득되었다. 이러한 방식으로, 감염을 위한 바이러스의 생산을 피할 수 있으므로, 불리한 재조합 경우를 사실상 제거할 수 있다. 최종 결과는 AAV 플라스미드 및 양이온성 리포좀을 조합한 완만한 형질감염 과정의 사용에 의해 달성되었다.
바람직한 양태에서, AAV 플라스미드와 양이온성 리포좀의 조합은 배양된 세포주를 효율적으로 형질감염시킬 뿐만 아니라, 원발성 종양 세포 및 T 세포 및 간세포 등의 말초 혈액 세포를 형질감염시켰다. 이러한 데이터는 대부분의 유전자 치료 전략이 원발성 T 임파구 또는 종양 세포로의 유전자 전달을 포함하기 때문에 주목할 만한 것이다. 이미 기재한 바와 같이, 이들 전략은 우선적으로 레트로바이러스 또는 DNA 바이러스 벡터로의 형질전환 유전자 삽입에 의존한다. 레트로바이러스계의 기본적인 단점은 분열하지 않는 원발성 세포를 형질감염시킬 수 없는 능력인 것으로 이해된다. 본 연구는 AAV 물질로 이루어진 양이온성 리포좀 분열되거나 또는 분열되지 않은 세포 타입 모두의 형질감염을 매개하는 것으로 보인다. 본 발명에 따라, AAV 플라스미드:양이온성 리포좀은 지속적이고, 매우 큰 수준의 발현을 달성하는 매우 효율적인 형질감염 시스템을 제공한다.
유리하게도, 플라스미드 DNA:리포좀 복합체는 임의의 측정할 만한 세포 독성 없이 생체 내(정맥 내, 복강 내 및 에어로졸 투여에 의함)로 전달될 수 있다(Philip, R., et al., "In vivo gene delivery: Efficient transfection of T lymphocytes in adult mice, " J. Biol. Chem. (1993) 268: 16087-16090; Stribling, R., et al., "Aerosol Gene Delivery in vivo, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:11277-11281, Zhu, N., et al., "Systemic gene expression after intravenous DNA delivery into adult mice," Science (1993) 261:209-211; Stewart, M.J., et al., "Gene transfer in vivo with DNA-liposome complexes: Safe and acute toxicity in mice, "Humam Gene Therapy (1992) 3: 267-275). 본 발명에 따라, DNA 농도는 최대 발현을 획득하도록 최적화될 수 있다. 따라서, AAV물질로 이루어진 리포좀의 사용에 의한 유전자 전달은 생체 외에서 많은 다양한 세포 타입으로 AAV 및 형질전환 유전 물질을 형질감염시키며, 생체 내에서도 또한 사용된다. 이러한 결과는 임의의 유전자 치료 프로토콜에 대해 매우 유리하다.
더욱이, 여러가지 원발성 신생물성 세포 타입, 신생물성 세포주, 및 여러가지 T 세포 아집단은 DNA:리포좀 복합체를 사용하는 AAV 플라스미드로 형질감염시켰다. 본 명세서에 나타낸 바와 같이, 양이온성 리포좀은 세포로의 아데노 수반 바이러스(AAV) 플라스미드 형질감염을 촉진시켰다. 원발성 종양 세포의 형질감염은 이러한 세포가 일반적으로 형질감염되기가 매우 어렵기 때문에 매우 호소력이 있다. 높은 수준의 발현 외에, AAV 플라스미드:리포좀의 사용은 장기간(30일 초과)의 형질전환 유전자 발현을 유도한다. 더욱이, 활성화된 원래의 T 세포가 IL-2 플라스미드로 형질감염되었을 때, 이 플라스미드는 선택되지 않은 조건에서 형질감염된지 최소한 25일째에 세포 내에서 검출되었다. 이러한 결과는 표준 플라스미드를 사용한 전형적인 리포좀 매개된 형질감염에 의해 입증된 단기간의 발현과 대조적이다.
더욱이, 사이토킨 형질전환 유전자로 형질감염된 TIL은 외인성 사이토킨에 대한 필요없이 증식되는 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과는 TIL이 전신적인 IL-2 치료의 필요없이 환자에게 제공될 수 있으며, 전신적인 IL-2 치료의 심각한 부작용을 극복할 수 있기 때문에 매우 유리하다.
형질감염된 T 세포에서 IL-2 유전자 발현은 외인성 IL-2 회수 효과를 변경하였다. 현저하게도, IL-2 형질감염된 T 세포는 이들의 성장 및 증식을 유지하고, 당업계에 알려진 작동 인자 T 세포로부터 회수한 외인성 IL-2에 의해 통상적으로 발생하는 아폽토시스를 방지하기에 충분한 내인성 IL-2를 생산하였다. 외인성 IL-2에 대한 의존성은 제거되었다.
원발성 유방, 폐 및 난소 종량 세포는 AAV 플라스미드 DNA:리포좀 복합체를 사용하여 형질감염시킬 수 있다. 형질감염된 원발성 및 배양된 종양 세포는 치사량의 방사선 조사 후에도 형질전환 유전자 산물을 발현시킬 수 있었다.
본 명세서에 기재된 양태는(자가 유래 및 HLA 매치된 동종성) 종양 세포가 증식 기간 동안 선택된 TIL을 재자극하기 위해 사용될 수 있음을 포함한다. 형질 감염된 신생물성 세포는 종양 백신화 프로토콜에 사용하였다. 전형적으로, 형질감염된 신생물성 세포는 당업계에 공지된 바와 같이 약제학적 부형제와 함께 제공된다. 형질감염된 신생물성 세포 역시 배양 중에 상응하는 TIL 세포를 자극하기 위해 사용된다. 표현형, 세포 독성 및 T 세포 수용체 분석은 TIL이 종양으로부터 분리되었을 때 초기에 종양 세포 특이성을 보이지만, rIL-2의 장기간의 배양은 종종 폴리클로날의 증식 및 종양 특이성의 손실을 유도함을 나타낸다. TIL을 신생물성 세포, 및 가장 바람직하게는 형질감염된 신생물성 세포로 이루어진 환경에서 배양 시킴으로써, 증식된 TIL 세포의 종양 특이성은 현저하게 증가하였다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구의 범위에서, 단수형은 달리 분명하게 지적하지 않는 한 복수개의 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들면 "제형"이라는 용어는 상이한 제형의 혼합물을 포함하고, "치료 방법"이라는 용어는 당업계의 숙련자들에게 공지된 것과 동일한 단계들 및 방법들에 대한 언급을 포함한다.
달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재한 것과 유사하거나 또는 동등한 임의의 방법 및 물질은 본 발명의 실시 또는 시험 중에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 기재되었다. 본 명세서에서 언급한 모든 문헌은 참고 사항이 인용된 것과 관련한 특정 정보를 기재 및 기술하기 위해 참고로 본 명세서에 인용하였다.

Claims (44)

  1. 양이온성 리포좀; 아데노-수반 바이러스(adeno-associated virus)로부터의 하나 이상의 전위된 말단 반복 단위; 및 아데노-수반 바이러스 프로모터 이외의 프로모터를 포함하는, 유전자 조작용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 아데노-수반 바이러스 DNA가 플라스미드내에 존재하는 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 플라스미드가 pMP6-IL2 또는 pACMV-IL2인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 2개의 전위된 말단 반복 단위를 포함하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 목적하는 유전자 서열을 추가로 포함하는 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 목적하는 유전자 서열이 2개의 전위된 말단 반복 단위 사이에서 통합되는 조성물.
  7. 제4항에 있어서, 프로모터가 2개의 전위된 말단 반복 단위 사이에서 통합되는 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 프로모터가 CMV 즉시형-초기 프로모터, CMV 즉시형-후기 프로모터, CMV초기 프로모터, ADA 프로모터 또는 TK 프로모터인 조성물.
  9. 제5항에 있어서, 목적하는 유전자 서열이 IL-2 유전자 또는 β-gal 유전자를 포함하는 조성물.
  10. 양이온성 리포좀, 하나 이상의 전위된 말단 반복 단위를 포함하는 아데노-수반 바이러스 DNA, 아데노-수반 바이러스 프로모터 이외의 프로모터 및 목적하는 유전자 서열을 포함하는 조성물을 제공하는 단계; 및
    당해 조성물과, 유전 물질을 포함하는 숙주 세포를 접촉시킴으로써, 목적하는 유전자 서열을 숙주 세포내로 도입시키는 단계를 포함하여, 목적하는 유전자 서열을 숙주 세포내로 도입시키는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 숙주 세포가 CD34+간세포, T 세포, 종양 세포주의 세포 또는 원발성 종양 세포인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 숙주 세포가 종양 침윤 임파구, CD3+, CD4+, 또는 CD8+세포인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 세포가 방광, 전립선, β-임파종의 종양 세포주 또는 태아의 신장 종양 세포주인 방법.
  14. 제10항에 있어서, 목적하는 유전자 서열을 숙주 세포의 유전 물질내로 통합시킴을 추가로 포함하는 방법.
  15. 제1항에 따른 조성물에 의해 형질감염된 숙주 세포.
  16. 제15항에 따른 숙주 세포를 포함하는 종양 세포, 감염증, 자가 면역 질환 또는 유전자 이상을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  17. 제3도에 제시된 서열중 뉴클레오티드 1565 내지 2071을 제외한 서열로 이루어진 발현 벡터 pMP6.
  18. IL-2 DNA가 pMP6 벡터속에 삽입되어진, 제2도에 도시된 제한 지도를 갖는 재조합 벡터 pMP6-IL-2.
  19. 제18항의 재조합 벡터 pMP6-IL-2로 유전자 변형된 세포.
  20. 제19항에 있어서, 말초 혈액 세포, 골수 세포, 종양 침윤 임파구, 종양 세포주 세포 또는 원발성 종양 세포인 세포.
  21. 제18항에 있어서, 제3도에 제시된 염기 서열로 이루어진 재조합 벡터 pMP6-IL-2.
  22. 제21항의 재조합 벡터 pMP6-IL-2로 유전자 변형된 세포.
  23. 제22항에 있어서, 말초 혈액 세포, 골수 세포, 종양 침윤 임파구, 종양 세포주 세포 또는 원발성 종양 세포인 세포.
  24. 양이온성 리포좀, 하나 이상의 전위된 말단 반복 단위를 포함하는 아데노-수반 바이러스 DNA, 아데노-수반 바이러스 프로모터 이외의 프로모터 및 목적하는 유전자 서열을 포함하는 조성물을 제공하는 단계;
    당해 조성물과, 유전 물질을 포함하는 숙주 세포를 접촉시킴으로써, 목적하는 유전자 서열을 숙주 세포내에 도입시키는 단계; 및
    목적하는 유전자 서열로 암호화된 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는, 단백질의 제조 방법.
  25. 제24항에 있어서, 숙주 세포가 CD34+간세포, T 세포, 종양 세포주의 세포, 또는 원발성 종양 세포인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 숙주 세포가 종양 침윤 임파구, CD3+, CD4+또는 CD8+세포인 방법.
  27. 제25항에 있어서, 세포가 방광, 전립선, B 임파종 또는 태아의 신장 세포주의 종양 세포주인 방법.
  28. 제24항 내지 27항중 어느 한 항에 있어서, 아데노-수반 바이러스 DNA가 플라스미드를 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 플라스미드가 pMP6-IL2 또는 pACMV-IL2인 방법.
  30. 제24항에 있어서, 목적하는 유전자 서열을 숙주 세포의 유전 물질내에 통합시킴을 추가로 포함하는 방법.
  31. 제24항에 있어서, 발현된 단백질이 림포킨 동족체인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 단백질 IL-2인 방법.
  33. 제30항에 있어서, 단백질이 β-갈락토시다제, 클로람페니콜-아세틸-트랜스퍼라제 또는 MDR I인 방법.
  34. 양이온성 리포좀, 하나 이상의 전위된 말단 반복 단위를 포함하는 아데노-수반 바이러스 DNA, 아데노-수반 바이러스 프로모터 이외의 프로모터 및 목적하는 유전자 서열을 포함하는, 종양 세포, 감염증, 자가 면역 질환 또는 유전자 이상을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 유전자 이상이 결실 또는 결함 유전자를 포함하는 조성물.
  36. 제34항에 있어서, 감염증이 HIV 감염증을 포함하는 조성물.
  37. 제34항에 있어서, 목적하는 유전자 서열이 안티-센스 올리고뉴클레오티드 또는 RNA를 암호화하는 조성물.
  38. 제34항에 있어서, 조성물이 플라스미드를 제공하는 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 플라스미드가 pMP6-IL2인 조성물.
  40. 제35항에 있어서, 목적하는 유전자 서열이 사이토킨, 동시자극 인자, MHC 제I 부류 분자, 종양-특이적 항원 또는 종양-관련된 항원을 암호화하는 유전자 서열을 포함하는 조성물.
  41. 제34항에 있어서, 종양 세포가 악성이거나 감염증이 HIV 감염증이고 유전자 서열이 IL-2 게놈 물질을 포함하는 조성물.
  42. 제34항에 있어서, 종양 세포가 악성이고 유전자 서열이 MDR-I 유전자를 포함하는 조성물.
  43. 제34항에 있어서, 조성물이 종양 세포, 골수 조혈 세포, 또는 말초 혈액 세포에 투여되는 조성물.
  44. 제34항에 있어서, 조성물이 종양 침윤 임파구, 종양 세포주의 세포 또는 원발성 종양 세포에 투여되는 조성물.
KR1019960701259A 1993-09-13 1994-09-13 아데노-수반바이러스(aav)리포좀및이와관련된방법 KR100421753B1 (ko)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12060593A 1993-09-13 1993-09-13
US08/120,605 1993-09-13
US08/120605 1993-09-13
US08/305221 1994-09-12
US08/305,221 US5834441A (en) 1993-09-13 1994-09-12 Adeno-associated viral (AAV) liposomes and methods related thereto
US08/305,221 1994-09-12

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR960705055A KR960705055A (ko) 1996-10-09
KR100421753B1 true KR100421753B1 (ko) 2004-07-01

Family

ID=26818551

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019960701259A KR100421753B1 (ko) 1993-09-13 1994-09-13 아데노-수반바이러스(aav)리포좀및이와관련된방법

Country Status (15)

Country Link
US (3) US5834441A (ko)
EP (1) EP0719343B1 (ko)
JP (1) JPH09505982A (ko)
KR (1) KR100421753B1 (ko)
AT (1) ATE257177T1 (ko)
AU (1) AU692470B2 (ko)
CA (1) CA2171318A1 (ko)
DE (1) DE69433462T2 (ko)
DK (1) DK0719343T3 (ko)
ES (1) ES2213149T3 (ko)
FI (1) FI961146A (ko)
NO (1) NO961010L (ko)
PT (1) PT719343E (ko)
SG (1) SG48099A1 (ko)
WO (1) WO1995007995A2 (ko)

Families Citing this family (100)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6652850B1 (en) 1993-09-13 2003-11-25 Aventis Pharmaceuticals Inc. Adeno-associated viral liposomes and their use in transfecting dendritic cells to stimulate specific immunity
US6197553B1 (en) 1994-07-15 2001-03-06 Merck & Co., Inc. Method for large scale plasmid purification
CA2192342A1 (en) * 1994-07-15 1996-02-01 Ann L. Lee A method for large scale plasmid purification
US5856152A (en) * 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
US6342390B1 (en) 1994-11-23 2002-01-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services Lipid vesicles containing adeno-associated virus rep protein for transgene integration and gene therapy
US5843742A (en) * 1994-12-16 1998-12-01 Avigen Incorporated Adeno-associated derived vector systems for gene delivery and integration into target cells
AR003122A1 (es) * 1995-05-19 1998-07-08 Merck & Co Inc Un proceso para aislacion y purificacion de plasmidos en fermentadores de gran escala y el adn aislado y purificado obtenido mediante dicho proceso.
CA2227065A1 (en) * 1995-07-21 1997-02-06 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Adeno-associated viral liposomes and their use in transfecting dendritic cells to stimulate specific immunity
US6086913A (en) * 1995-11-01 2000-07-11 University Of British Columbia Liposomal delivery of AAV vectors
US5952221A (en) * 1996-03-06 1999-09-14 Avigen, Inc. Adeno-associated virus vectors comprising a first and second nucleic acid sequence
DE19608751B4 (de) 1996-03-06 2006-05-18 Medigene Ag Verwendung eines Adeno-assoziierten Virus-Vektors zur Steigerung der Immunogenität von Zellen
US5866552A (en) * 1996-09-06 1999-02-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for expressing a gene in the absence of an immune response
US6251677B1 (en) 1997-08-25 2001-06-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof
US6221349B1 (en) 1998-10-20 2001-04-24 Avigen, Inc. Adeno-associated vectors for expression of factor VIII by target cells
US6200560B1 (en) 1998-10-20 2001-03-13 Avigen, Inc. Adeno-associated virus vectors for expression of factor VIII by target cells
US6759237B1 (en) * 1998-11-05 2004-07-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus serotype 1 nucleic acid sequences, vectors and host cells containing same
US6491907B1 (en) * 1998-11-10 2002-12-10 The University Of North Carolina At Chapel Hill Recombinant parvovirus vectors and method of making
US7935805B1 (en) 1998-12-31 2011-05-03 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc Polynucleotides encoding antigenic HIV Type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
EP1980617A1 (en) 1998-12-31 2008-10-15 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Improved expression of HIV polypeptides and production of virus-like particles
US6387368B1 (en) 1999-02-08 2002-05-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof
US6165754A (en) * 1999-06-08 2000-12-26 Cornell Research Foundation, Inc. Method of expressing an exogenous nucleic acid
AU2001239884B2 (en) * 2000-02-25 2006-08-10 Vegenics Limited Materials and methods involving hybrid vascular endothelial growth factor DNAs and proteins and screening methods for modulators
MXPA02009454A (es) 2000-03-31 2003-04-10 Purdue Research Foundation Metodo de tratamiento usando conjugados ligando-inmunogeno.
WO2003004620A2 (en) 2001-07-05 2003-01-16 Chiron, Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
CA2452119C (en) 2001-07-05 2013-10-15 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type b and/or type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
AU2002304965A1 (en) 2002-05-24 2003-12-12 Zensun (Shanghai) Sci-Tech.Ltd Neuregulin based methods and compositions for treating viral myocarditis and dilated cardiomyopathy
CA2525825A1 (en) 2003-05-15 2005-01-27 Chiron Corporation Hiv polynucleotides and polypeptides derived from botswana mj4
US7261882B2 (en) 2003-06-23 2007-08-28 Reagents Of The University Of Colorado Methods for treating neuropathic pain by administering IL-10 polypeptides
AU2004272114B2 (en) * 2003-09-12 2010-11-04 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Animal model for protease activity and liver damage
EP1732947B1 (en) 2004-03-05 2011-04-27 Vegenics Pty Ltd Growth factor binding constructs materials and methods
US7582442B2 (en) 2004-03-16 2009-09-01 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for using aleveolar macrophage phospholipase A2
US7319015B2 (en) * 2004-03-16 2008-01-15 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for using alveolar macrophage phospholipase A2
US7622125B2 (en) 2004-05-05 2009-11-24 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Polycistronic HIV vector constructs
JP2008503215A (ja) * 2004-06-18 2008-02-07 ザ ユニバーシティー オブ モンタナ Ａａｖ媒介性の蝸牛細胞への遺伝子送達
US20090233986A1 (en) * 2004-07-27 2009-09-17 Mount Sinai School Of Medicine Methods and compositions for using sax2
FI20050753A (fi) 2004-09-03 2006-03-04 Licentia Oy Uudet peptidit
EP2266602A3 (en) 2004-11-01 2011-08-10 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Combination approaches for generating immune responses
EP1828390B1 (en) * 2004-12-15 2012-06-13 The University Of North Carolina At Chapel Hill Chimeric vectors
US7531523B2 (en) * 2005-02-17 2009-05-12 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Sodium channel protein type III alpha-subunit splice variant
DE602006020881D1 (de) 2005-08-15 2011-05-05 Vegenics Pty Ltd Enen eigenschaften
US20080200408A1 (en) * 2005-09-30 2008-08-21 Mccormack Kenneth Deletion mutants of tetrodotoxin-resistant sodium channel alpha subunit
US7972813B2 (en) * 2005-09-30 2011-07-05 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Tetrodotoxin-resistant sodium channel alpha subunit
JP5215865B2 (ja) 2005-11-22 2013-06-19 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス インコーポレイテッド ノロウイルス抗原およびサポウイルス抗原
AU2005339101B2 (en) 2005-12-14 2013-01-10 Herantis Pharma Plc. Novel neurotrophic factor protein and uses thereof
WO2007089780A2 (en) * 2006-01-30 2007-08-09 Licentia, Ltd. Bmx/etk tyrosine kinase gene therapy materials and methods
ES2429225T3 (es) 2006-05-17 2013-11-13 The Ludwig Institute For Cancer Research Anticuerpos anti VEGF-B para tratamiento o profilaxis de diabetes de tipo II o síndrome metabólico
WO2008097926A2 (en) * 2007-02-02 2008-08-14 Yale University Transient transfection with rna
US10155038B2 (en) 2007-02-02 2018-12-18 Yale University Cells prepared by transient transfection and methods of use thereof
US9249423B2 (en) 2007-02-02 2016-02-02 Yale University Method of de-differentiating and re-differentiating somatic cells using RNA
ES2636460T3 (es) * 2007-10-08 2017-10-05 Intrexon Corporation Células dendríticas modificadas por ingeniería y usos para el tratamiento del cáncer
AU2008314485B9 (en) 2007-10-15 2015-02-26 Jingang Medicine (Australia) Pty Ltd Expression system for modulating an immune response
FI20070808A0 (fi) 2007-10-25 2007-10-25 Mart Saarma GDNF:n silmukointivariantit ja niiden käytöt
US20090196854A1 (en) * 2008-02-04 2009-08-06 Kytos Biosystems S.A. Methods and compositions for use of crl 5803 cells for expression of biotherapeutics and encapsulated cell-based delivery
FI20080326A0 (fi) 2008-04-30 2008-04-30 Licentia Oy Neurotroofinen tekijä MANF ja sen käytöt
US8052970B2 (en) * 2008-06-30 2011-11-08 The Regents Of The University Of Michigan Lysosomal phospholipase A2 (LPLA2) activity as a diagnostic and therapeutic target for identifying and treating systemic lupus erythematosis
US8889641B2 (en) 2009-02-11 2014-11-18 The University Of North Carolina At Chapel Hill Modified virus vectors and methods of making and using the same
WO2011106705A2 (en) 2010-02-26 2011-09-01 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Dna-protein vaccination protocols
WO2011119920A2 (en) 2010-03-25 2011-09-29 Oregon Health & Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
US9795658B2 (en) 2010-04-20 2017-10-24 Admedus Vaccines Pty Ltd Expression system for modulating an immune response
WO2012106281A2 (en) 2011-01-31 2012-08-09 The General Hospital Corporation Multimodal trail molecules and uses in cellular therapies
EP2710037B1 (en) 2011-05-19 2019-07-31 The Regents of The University of Michigan Integrin alpha-2 binding agents and use thereof to inhibit cancer cell proliferation
EP2691530B1 (en) 2011-06-10 2018-03-07 Oregon Health & Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
AU2012216792A1 (en) 2011-09-12 2013-03-28 International Aids Vaccine Initiative Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing HIV-1 proteins by broadly neutralizing antibodies
EP2586461A1 (en) 2011-10-27 2013-05-01 Christopher L. Parks Viral particles derived from an enveloped virus
US9365496B2 (en) 2011-11-30 2016-06-14 Ludwig Institute For Cancer Research iNKT cell modulators and methods of using the same
US20150004144A1 (en) 2011-12-02 2015-01-01 The General Hospital Corporation Differentiation into brown adipocytes
GB201120860D0 (en) 2011-12-05 2012-01-18 Cambridge Entpr Ltd Cancer immunotherapy
WO2013184209A1 (en) 2012-06-04 2013-12-12 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Mif for use in methods of treating subjects with a neurodegenerative disorder
EP2679596B1 (en) 2012-06-27 2017-04-12 International Aids Vaccine Initiative HIV-1 env glycoprotein variant
US20140037599A1 (en) * 2012-08-03 2014-02-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and Methods of Treating T Cell Deficiency
US9605074B2 (en) 2012-08-30 2017-03-28 The General Hospital Corporation Multifunctional nanobodies for treating cancer
PL3421602T3 (pl) 2012-09-06 2021-10-25 The University Of Chicago Polinukleotydy antysensowne wywołujące pominięcie egzonu i sposoby leczenia dystrofii
US9745558B2 (en) 2013-02-18 2017-08-29 Vegenics Pty Limited VEGFR-3 ligand binding molecules and uses thereof
US9844569B2 (en) * 2013-03-01 2017-12-19 The United State Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of producing enriched populations of tumor reactive T cells from peripheral blood
US10640771B2 (en) 2013-04-17 2020-05-05 Genzyme Corporation Compositions and methods for treating and preventing macular degeneration
WO2014191630A2 (en) 2013-05-28 2014-12-04 Helsingin Yliopisto Non-human animal model encoding a non-functional manf gene
EP2848937A1 (en) 2013-09-05 2015-03-18 International Aids Vaccine Initiative Methods of identifying novel HIV-1 immunogens
EP2873423B1 (en) 2013-10-07 2017-05-31 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
CA2930693A1 (en) 2013-11-15 2015-05-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior Unversity Methods of treating heart failure with agonists of hypocretin receptor 2
KR102234695B1 (ko) 2014-02-06 2021-04-02 젠자임 코포레이션 황반 변성을 치료하고 예방하기 위한 조성물 및 방법
JP7095990B2 (ja) 2014-09-18 2022-07-05 シーダーズ－サイナイ メディカル センター 線維症を治療するための組成物及び方法
US10174292B2 (en) 2015-03-20 2019-01-08 International Aids Vaccine Initiative Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers
EP3072901A1 (en) 2015-03-23 2016-09-28 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
CA2981960C (en) 2015-04-08 2023-09-19 The University Of Chicago Compositions and methods for correcting limb girdle muscular dystrophy type 2c using exon skipping
US20180112006A1 (en) 2015-04-17 2018-04-26 The General Hospital Corporation Agents, systems and methods for treating cancer
EP4194001A1 (en) 2015-04-22 2023-06-14 Cedars-Sinai Medical Center Enterically delivered bitter oligopeptides for the treatment for type 2 diabetes and obesity
EP4276106A3 (en) 2015-05-13 2024-01-24 The United States of America as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Methods and compositions for inducing an immune response using conserved element constructs
WO2016196366A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Extension of replicative lifespan in diseases of premature aging using p53 isoforms
EP3313863B1 (en) 2015-06-29 2020-12-23 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Degron fusion constructs and methods for controlling protein production
KR20180083437A (ko) 2015-12-09 2018-07-20 애드메더스 백신스 피티와이 리미티드 치료를 위한 면역조절용 조성물
CN111363761A (zh) * 2020-03-17 2020-07-03 苏州吉恒基因科技有限公司 利用阳离子多聚体dna复合物促进aav介导的基因表达方法
WO2023070072A1 (en) 2021-10-21 2023-04-27 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Retroelement-generated transcription factor decoys
CA3237482A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Precise genome editing using retrons
WO2023141602A2 (en) 2022-01-21 2023-07-27 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
WO2023183627A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Production of reverse transcribed dna (rt-dna) using a retron reverse transcriptase from exogenous rna
WO2023183589A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Rt-dna fidelity and retron genome editing
WO2023183588A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Methods of assessing engineered retron activity, and uses thereof
WO2024020346A2 (en) 2022-07-18 2024-01-25 Renagade Therapeutics Management Inc. Gene editing components, systems, and methods of use
WO2024044673A1 (en) 2022-08-24 2024-02-29 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Dual cut retron editors for genomic insertions and deletions
WO2024044723A1 (en) 2022-08-25 2024-02-29 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4394448A (en) * 1978-02-24 1983-07-19 Szoka Jr Francis C Method of inserting DNA into living cells
CA1203049A (en) * 1981-08-10 1986-04-08 Ahti A. Koski Zinc peroxide process
JPH0634727B2 (ja) * 1984-08-17 1994-05-11 東レ株式会社 ベクタ−および形質転換体
FR2583770B1 (fr) * 1985-06-21 1988-08-19 Transgene Sa Expression de l'il-2 humaine dans les cellules de mammiferes par un poxvirus recombine
ES8800981A1 (es) * 1985-06-28 1987-12-01 Univ Minnesota Un procedimiento para tratar celulas efectoras que tienen receptores de superficie para la region fc de un anticuerpo
US5139941A (en) * 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US4935372A (en) * 1986-05-20 1990-06-19 Dana Farber Cancer Institute Art nucleotide segments, vectors, cell lines methods of preparation and use
US5198344A (en) * 1986-07-15 1993-03-30 Massachusetts Institute Of Technology DNA sequence that encodes the multidrug resistance gene
US5250431A (en) * 1988-06-13 1993-10-05 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Alteration of the interaction of a T-cell receptor with a proteintyrosine kinase
DK0460065T3 (da) * 1989-02-21 1994-09-26 Terumo Corp Fremgangsmåde til at fremkalde formering af CD4-lymfocytter
WO1990013629A1 (en) * 1989-05-11 1990-11-15 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. A method for the activation of t cells
ES2071770T3 (es) * 1989-06-27 1995-07-01 Smithkline Beecham Biolog Nuevos compuestos.
US5126132A (en) * 1989-08-21 1992-06-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Tumor infiltrating lymphocytes as a treatment modality for human cancer
US5436146A (en) * 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
US5188959A (en) * 1989-09-28 1993-02-23 Trustees Of Tufts College Extracellular matrix protein adherent t cells
US5252479A (en) * 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
EP0624192A1 (en) * 1992-01-22 1994-11-17 New England Deaconess Hospital Novel protein tyrosine kinases
US5587308A (en) * 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter

Also Published As

Publication number Publication date
DK0719343T3 (da) 2004-04-26
US5861171A (en) 1999-01-19
NO961010D0 (no) 1996-03-12
EP0719343B1 (en) 2004-01-02
WO1995007995A3 (en) 1995-07-20
DE69433462D1 (de) 2004-02-05
KR960705055A (ko) 1996-10-09
DE69433462T2 (de) 2004-11-18
US5861314A (en) 1999-01-19
CA2171318A1 (en) 1995-03-23
ES2213149T3 (es) 2004-08-16
PT719343E (pt) 2004-05-31
EP0719343A1 (en) 1996-07-03
FI961146A (fi) 1996-05-10
US5834441A (en) 1998-11-10
ATE257177T1 (de) 2004-01-15
WO1995007995A2 (en) 1995-03-23
AU692470B2 (en) 1998-06-11
NO961010L (no) 1996-05-07
FI961146A0 (fi) 1996-03-12
SG48099A1 (en) 1998-04-17
JPH09505982A (ja) 1997-06-17
AU7717594A (en) 1995-04-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100421753B1 (ko) 아데노-수반바이러스(aav)리포좀및이와관련된방법
JPH11510046A (ja) アデノ関連ウイルスリポソーム及び樹状細胞をトランスフェクトして特異性免疫を刺激することにおけるそれらの使用
Prince Gene transfer: a review of methods and applications
WO1999047180A9 (en) Chimeric adenoviral vectors for targeted gene delivery
JPH07503455A (ja) 癌のリンホカイン遺伝子療法
WO2022078310A1 (zh) 新型PiggyBac转座子系统及其用途
US20160317631A1 (en) Increased t-cell tumor infiltration and eradication of metastases by mutant light
Philip et al. Gene modification of primary tumor cells for active immunotherapy of human breast and ovarian cancer.
EP1641491B1 (en) Increased t-cell tumor infiltration by mutant light
US6723561B2 (en) Materials and methods relating to the transfer of nucleic acid into quiescent cells
EP0879294B1 (en) Transduced human hematopoietic stem cells
JP2002506980A (ja) 新規の相補的レセプター−リガンド対およびそれを使用する養子免疫療法
WO2004080404A2 (en) Il-2 transmembrane constructs
Evans et al. Pre-clinical evaluation of an in vitro selection protocol for the enrichment of transduced CD34+ cell-derived human dendritic cells
US20030198626A1 (en) Inhibition of Ii expression in mammalian cells
Nande Gene transfer in a newly established spontaneous feline fibrosarcoma cell line
US20020081733A1 (en) Method to prepare drug-resistant, non-malignant hematopoietic cells
Bachier et al. Gene therapy of solid tumors and hematopoietic neoplasms
Smith et al. T Lymphocyte Based HIV Gene Therapy Strategies
WO1997018305A9 (en) Method to prepare drug-resistant, non-malignant hematopoietic cells

Legal Events

Date Code Title Description
N231 Notification of change of applicant
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee