MXPA02009454A - Metodo de tratamiento usando conjugados ligando-inmunogeno. - Google Patents

Metodo de tratamiento usando conjugados ligando-inmunogeno.

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Abstract

Se proporcionan un metodo y composicion farmaceutica para estimular la eliminacion mediada por respuesta inmune endogena de una poblacion de celulas patogenas en un animal huesped, en donde las celulas patogenas expresan preferencialmente, expresan unicamente o sobreexpresan un sitio de union para un ligando particular. La invencion comprende administrar el ligando conjugado a un inmunogeno a un animal huesped que porta la poblacion de celulas patogenas. Anticuerpos, preexistentes o administrados al animal huesped para establecer una inmunidad pasiva, dirigidos contra el inmunogeno se unen al conjugado ligando-inmunogeno dando como resultado la eliminacion de la celula patogena por la respuesta inmune del huesped. Se administra por lo menos un factor terapeutico adicional que se selecciona del grupo que consiste en un agente de eliminacion de celulas, un estimulador de la penetracion en tumores, un agente quimioterapeutico, un agente antimicrobiano, una celula inmune citotoxica y un compuesto capaz de estimular una respuesta inmune endogena, en donde el compuesto no se une al conjugado ligando-inmunogeno.

Description

MÉTODO DE TRATAMIENTO USANDO CONJUGADOS LIGANDO-INMUNOGENO Campo de la invención Esta, invención se refiere a un método y a una composición farmacéutica para usarse en el tratamiento de estados de enfermedad caracterizados por la existencia de poblaciones de células patógenas. Más particularmente, se administran a un huésped enfermo complejos ligando-inrmunógeno dirigidos a células, de preferencia en combinación con un estimulante del sistema inmune u otro factor terapéutico, para estimular y/o redirigir las respuestas inmunes del huésped a las células patógenas.
Antecedentes y breve descripción de la invención El sistema inmune de los mamíferos proporciona un medio para el reconocimiento y eliminación -de células tumorales, otras células patógenas y patógenos extraños invasores. Aunque el sistema inmune normalmente proporciona una fuerte linea de defensa,, existen aún muchos casos en los que las células cancerosas, otras células patógenas o agentes infecciosos evaden una respuesta inmune del huésped y 1 REF.: 141914 proliferan o persisten con patogenicidad de huésped concomitante. Se ha desarrollado agentes quimioterapéuticos y terapias de radiación para eliminar neoplasmas replicantes. Sin embargo, la mayoría, sino es que todos, los agentes quimioterapéuticos y regímenes de terapia de radiación actualmente disponibles tienen efectos secundarios adversos porque ^ funcionan no sólo para destruir las células cancerosas, sino que también afectan las células huésped normales, tales como las células del sistema hematopoyético. Además, los agentes quimioterapéuticos tienen eficacia limitada en casos en los que el huésped desarrolla resistencia a fármacos. 3 Los patógenos extraños también pueden proliferar en un huésped al evadir la respuesta inmune competente o cuando el sistema inmune del huésped ha sido comprometido por terapias con fármacos o por otros problemas de salud. Aunque se han desarrollado muchos compuestos terapéuticos, muchos patógenos son o se han vuelto resistentes a estos productos terapéuticos. La capacidad de las células cancerosas y de los organismos infecciosos para desarrollar resistencia a agentes terapéuticos, y los efectos secundarios -adversos de los fármacos anticancerosos actualmente disponibles, resaltan la necesidad del desarrollo de nuevas terapias especificas para poblaciones de células patógenas con toxicidad a huésped reducida. Los investigadores han desarrollado protocolos terapéuticos para destruir células cancerosas al dirigir compuestos citotóxicos específicamente a esas células. Estos protocolos utilizan toxinas conjugadas a ligandos que se unen a receptores únicos para, o sobreexpresados por células cancerosas en un intento por minimizar el suministro de la toxina a las células normales. Mediante el uso de este enfoque se han desarrollado ciertas inmunotoxinas que consisten en anticuerpos dirigidos a receptores específicos sobre células patógenas, los anticuerpos siendo enlazados a toxinas tales como ricina, exotoxina de Pseudomonas, toxina de difteria y factor de necrosis tumoral. Estas inmunotoxinas se dirigen a las células tumorales que portan los receptores específicos reconocidos por el anticuerpo (Olsnes S., Immunol Today 10, pp. 291-295, 1989; Melby, E.L., Cáncer Res, 53(8), pp. 1755-1760, 1993; Better, M.D. publicación de PCT No. WO 91/07418, publicada el 30 de mayo de 1991) . Otro enfoque para identificar selectivamente poblaciones de células cancerosas o patógenos extraños en un huésped es el de estimular la respuesta inmune del huésped contra las células patógenas, evitando de esta manera la necesidad de administrar .compuestos que también podrían exhibir toxicidad a huésped independiente. Una estrategia de inmunoterapia que se ha reportado es la? de unir anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos multiméricos genéticamente manipulados, a la superficie de la célula tumoral para desplegar la región constante de los anticuerpos sobre la superficie de la célula y de esta manera inducir la eliminación de las células tumorales mediante var?jos procesos mediados por el sistema inmune (De Vita, V.T., Biologic Therapy of Cáncer, 2da. edición, Filadelfia, Lippincott, 1995; Soulillou J.P., patente de E.U.A. 5,672,^486). Sin embargo, este enfoque ha sido complicado por las dificultades para definir antígenos específicos para tumores. Otro enfoque para confiar en la competencia del sistema inmune del huésped es la dirección de un anticuerpo receptor de células anti-T o un anticuerpo receptor anti-Fc a las superficies de las células tumorales para promover la unión directa de las células inmunes a los tumores (Kranz, D.M., patente de E.U.A. 5,547,668) . También se ha descrito un enfoque a base de vacunas que se basa en una vacuna que comprende antigenos fusionados a citocinas, con la citocina modificando la inmunogenicidad del antigeno de la vacuna, y de esta manera, estimulando la respuesta inmune al agente patógeno (Pillai, S . , publicación de PCT No. WO 91/11146, publicada el 7 de febrero de 1991) . Ese método se basa en la modulación indirecta de la respuesta inmune reportada. Otro enfoque para eliminar poblaciones de células no deseadas utiliza fragmentos de IL-2 o Fab de globulina anti-timocitos enlazada a antígenos para eliminar células T no deseadas; sin embargo, con base en datos experimentales reportados, el método parece eliminar sólo el 50% de la población de células identificadas, y da como resultado una eliminación de células no especifica in vivo (es decir, 50% de los linfocitos de sangre periférica que no son células T también son eliminados (Pouletty, P., publicación PCT Número WO 97/37690, publicada el 16 de octubre de 1997) ) . De esta manera, permanece una necesidad significativa por terapias dirigidas al tratamiento de estados de enfermedad caracterizados .por la existencia de poblaciones de células patógenas en un huésped afectado. La presente invención está dirigida a un método para eliminar poblaciones de células patógenas en un huésped al incrementar el reconocimiento y la respuesta del sistema inmune del huésped a estas poblaciones de células. En forma efectiva, la antigenicidad de los patógenos celulares es incrementada para estimular la eliminación de la población de células patógenas mediada por una respuesta inmune endógena. El método evita o reduce , al mínimo el uso de agentes terapéuticos citotóxicos o antimicrobianos. El método comprende la administración de un conjugado ligando-inmunógeno en el que el ligando es capaz de unirse específicamente a una población de células patógenas in vi vo que expresa únicamente, expresa preferencialmente o sobreexpresa una porción de unión a ligando, y el inmunógeno conjugado al ligando es capaz de desarrollar la producción de anticuerpos o, en forma más preferible, es capaz de ser reconocido por anticuerpos endógenos o exógenos coadministrados en el animal huésped. La eliminación de las células patógenas mediada por el sistema inmune es dirigida por la unión de ligando conjugado al inmunógeno a un receptor, un transportador u otra proteína presentada en la superficie expresada únicamente, sobreexpresada o expresada preferencialmente por la célula patógena. Una proteina presentada en la superficie que es expresada únicamente, sobreexpresada o expresada preferencialmente por la célula patógena es un receptor que no está presente o que está presente en cantidades más bajas sobre células no patógenas, proporcionando un medio para la eliminación selectiva de las células patógenas. Al menos un factor terapéutico adicional, por ejemplo, un estimulante del sistema inmune, un agente d eliminación de células, un estimulador de la penetración e el tumor, un agente quimioterapéutico, una célula inmun citotóxica, o un agente antimicrobiano pueden coadministrars al animal huésped para incrementar la eficiencia de l terapia. En una modalidad, el presente método incluye la etapas de administrar ligandos capaces de la unión específic de alta afinidad in vivo a proteínas en la superficie de la células expresadas únicamente, expresadas preferencialmente sobreexpresadas sobre la población de células patógena identificada, los ligandos se conjugan a inmunógenos contr los cuales ya exista una inmunidad innata o adquirida, o s pueda desarrollar en el animal huésped, y opcionalmente l coadministración de por lo menos un factor terapéutico que e un activador endógeno de la respuesta inmune o un compuest citotóxico. En una modalidad preferida el método incluy administrar una composición de conjugado ligando-inmunógen al animal huésped, en donde el ligando es ácido fólico u otr ligando de unión al receptor de folato. El ligando e conjugado, por ejemplo, mediante unión covalente, a u inmunógeno capaz de desarrollar una respuesta a anticuerpo en el animal huésped o, _ muy preferiblemente, un inmunógen capaz de unirse a anticuerpos endógenos preexistentes (consecuentes a una inmunidad innata o adquirida) o anticuerpos coadministrados (es decir, mediante inmunización pasiva) en el animal huésped. Al menos un factor terapéutico adicional, incapaz de la unión específica al complejo ligando-inmunógeno, pero capaz de estimular o incrementar una respuesta inmune endógena, un agente de eliminación de células, un estimulador de la penetración en el tumor, tal como un agente inflamatorio o proinflamatsrio, un agente quimioterapéutico, una célula inmune citotóxica o un agente antimicrobiano se pueden administrar al animal huésped en conjunto con la administración de los conjugados ligando-inmunógeno . De acuerdo con otra modalidad de la invención, se proporciona un método para estimular una eliminación específica mediada por respuesta inmune endógena de una población de células patógenas en un animal huésped que porte la población, en donde los miembros de la población de células tienen un sitio de^ unión accesible para un ligando. El métoFdo comprende la etapa de administrar al huésped una composición de conjugado ligando-inmunógeno que comprende un complejo del ligando y un inmunógeno en el que se sabe que el inmunógeno es reconocido por un anticuerpo endógeno o exógeno en el huésped, o se sabe que es reconocido directamente por una célula inmune en el huésped, y al menos una composición adicional que comprende un factor terapéutico, el factor se selecciona del grupo que consiste en un agente de eliminación de células, un estimulador de la penetración en tumores, un agente quimioterapéutico, un agente antimicrobiano, una célula inmune citotóxica y un compuesto capaz de estimular una respuesta inmune endógena, en donde el compuesto no se une al conjugado ligando-inmunógeno. De acuerdo con una modalidad alternativa de la invención, se proporciona un método para estimular una eliminación específica mediada por respuesta inmune endógena de una población de células patógenas en un animal huésped que porte la población, en donde la población expresa un sitio de unión para un ligando. El método comprende las etapas de administrar al huésped una composición que comprende un complejo del ligando t y un inmunógeno, administrar al huésped anticuerpos dirigidos contra el inmunógeno, y administrar al huésped por lo menos un factor terapéutico adicional, el factor se selecciona del grupo que consiste en un agente de eliminación de células, un estimulador de la penetración en tumores, un agente quimioterapéutico, un agente antimicrobiano, una célula inmune citotóxica y un estimulante de una respuesta inmune endógena que no se une al complejo ligando-inmunógeno. En una modalidad preferida de la invención, se proporciona un método para estimular una eliminación específica mediada por respuesta inmune endógena de una población de células patógenas en un animal huésped que porte la población, en donde la población expresa preferencialmente, expresa únicamente o sobreexpresa un receptor de ácido fólico. El método comprende la etapa de administrar al huésped una composición que comprende un conjugado enlazado covalentemente de un inmunógeno, en donde se sabe que el inmunógeno es reconocido por un anticuerpo endógeno o-exógeno en el huésped, o se sabe que es reconocido directamente por una célula inmune en el huésped, y un ligando que comprende ácido fólico o un análogo de ácido fólico que tiene un grupo glutamilo _ en donde el enlace covalente al inmunógeno es sólo a través del grupo ?-carboxi del grupo glutamilo. En otra modalidad se administra al huésped al menos una composición adicional que comprende un factor terapéutico, el factor se selecciona del grupo que consiste en un agente de eliminación de células, un estimulador de la penetración en tumores, un agente quimioterapéutico, un agente antimicrobiano, una célula inmune citotóxica y un compuesto capaz de estimular una respuesta inmune endógena, en donde el compuesto no se une al conjugado ligando-inmunógeno. En otra modalidad de la invención, se proporciona un método para estimular una eliminación especifica mediada por respuesta inmune endógena de una población de células patógenas en un animal huésped que porte esta población, en donde la población expresa preferencialmente, expresa únicamente o sobreexpresa, un receptor de ácido fólico. El método comprende la etapa de administrar al huésped una composición que comprende un conjugado enlazado covalentemente de un inmunógeno, en donde se sabe que el inmunógeno es reconocido por un anticuerpo endógeno o exógeno en el huésped, o se sabe que es reconocido directamente por una célula inmune en el huésped, y un ligando que comprende ácido fólico o un análogo de ácido fólico que tiene un grupo glutamilo en donde el enlace covalente al inmunógeno es sólo a través del grupo ?-carboxi del grupo glutamilo. En otra modalidad, se administra al huésped al menos una composición adicional que comprende un factor terapéutico, el factor se selecciona* del grupo que consiste en un agente de eliminación de células, un estimulador de la penetración en tumores, un agente quimioterapéutico, un agente antimicrobiano, una célula inmune citotóxica y un compuesto capaz de estimular una respuesta inmune endógena, en donde el compuesto no se une al conjugado ligando-inmunógeno. En otra modalidad más de esta invención, la población de células patógenas identificada es una población de células cancerosas. En otra modalidad la población de células identificada son células endógenas infectadas por virus. En otra modalidad, la población -de células identificada es una población de organismos exógenos tales como bacterias, micoplasma, levadura u hongos. El conjugado ligando-inmunógeno se une a la superficie de las células tumorales u organismos patógenos y "marca" los miembros de células de la población de células identificada con el inmupógeno, desencadenando de esta manera una respuesta mediada por el sistema inmune dirigida a la población de células marcada. Los anticuerpos administrados al huésped en una inmunización pasiva o los anticuerpos que existen en el sistema inmune del huésped a partir de una inmunidad innata o adquirida preexistente, se unen al inmunógeno y desencadenan respuestas inmunes endógenas. La unión del anticuerpo al conjugado ligando-inmunógeno unido a las células da como resultado una citotoxicidad mediada por complementos, una citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos, opsonización y fagocitosis de anticuerpos, agrupamiento de receptores inducido por anticuerpo que señaliza muerte celular o quiescencia, o cualquier otra respuesta inmune humoral o celular estimulada por la unión de anticuerpos a conjugados ligando-inmunógeno unidos a células. En los casos en los que un antígeno se pueda reconocer directamente por las células inmunes sin la previa opsonizacíón del anticuerpo, puede ocurrir la eliminación directa de las células patógenas . La eliminación de los patógenos extraños o de células endógenas infectadas o neoplásicas se puede incrementar más al administrar un factor terapéutico capaz de estimular una respuesta inmune endógena, un agente de eliminación de células, un estimulador de la penetración en tumores, un agente quimioterapéutico, una célula inmune citotóxica o un agente antimicrobiano. En una modalidad, la célula inmune citotoxica es una población de células inmunes citotóxicas que es aislada, expandida ex vivo, y luego es inyectada en el animal huésped. En otra modalidad de la invención se usa un estimulante inmune, y el estimulante inmune puede ser una interleucina tal como IL-2, IL-12 o IL- 15, o un IFN tal como IFN-?, IFN-ß o IFN-? . o GM-CSF. En otra modalidad/ el estimulante inmune puede ser una composición de citocinas que comprenda combinaciones de citocinas, tales como IL-2, IL-12 o IL-15 en combinación con IFN-a, IFN-ß o IFN-? . o GM-CSF, o cualquier combinación efectiva de las mismas, o cualquier otra combinación efectiva de citocinas. En otra modalidad más de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende cantidades terapéuticamente efectivas de un conjugado ligando-inmunógeno capaz de la unión específica a una población de células patógenas en un animal huésped para promover la eliminación específica de dichas células mediante una respuesta inmune adquirida o innata, anticuerpos coadministrados, o directamente por una célula inmune en el huésped, un factor terapéutico seleccionado del grupo que consiste en un agente de eliminación de células, un estimulador de la penetración en .tumores, un agente quimioterapéutico, un agente antimicrobiano, una célula inmune citotóxica y un compuesto capaz de estimular una respuesta inmune endógena, en donde el compuesto no se une al complejo ligando-inmunógeno, y un vehículo farmacéuticamente aceptable para la misma. En una modalidad, la composición farmacéutica está en una forma de dosificación parenteral de liberación prolongada. En otra modalidad, el factor terapéutico es un estimulante inmune que comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste en interleucinas tales como IL-2, IL-12 o IL-15, IFNs tales como IFN-a, IFN-ß o IFN-?, y GM-CSF, o combinaciones de los mismos.
Descripción detallada de la invención Se proporcionan métodos para el tratamiento terapéutico de un huésped con cáncer, o de un huésped infectado con organismos patógenos . Los métodos dan como resultado la estimulación de la eliminación mediada por respuesta inmune de poblacio.nes de células patógenas al hacer/marcar las células patógenas antigénicas, dando como resultado su reconocimiento y eliminación por el sistema inmune del huésped. _ El método emplea un conjugado ligando-inmunógeno capaz de la unión de alta afinidad a células cancerosas' u otros agentes patógenos. La unión de alta afinidad puede ser inherente al ligando y puede ser modificada (incrementada) mediante el uso de un ligando químicamente modificado o a partir del enlace químico particular entre el ligando y el inmunógeno que esté presente en el conjugado. El método también puede utilizar terapia de combinación al emplear el conjugado ligando-inmunógeno y un factor terapéutico adicional capaz de estimular una respuesta inmune endógena, un agente de eliminación de células, un agente quimioterapéutico, un estimulador de la penetración en tumores-, una célula inmune citotóxica o un agente antimícrobiano para estimular la eliminación mediada por respuesta inmune de las poblaciones de células patógenas. El método de la presente invención se utiliza para estimular una eliminación mediada por respuesta inmune endógena de una población de células patógenas en un animal huésped que porte la población de células patógenas. La invención es aplicable a poblaciones de células patógenas que ocasionen una variedad de patologías tales como cáncer y enfermedades infecciosas. De esta manera, la población de células patógenas puede ser una población -de células cancerosas que sea tu origénica, incluyendo tumores benignos- y tumores malignos, o puede ser no tumorigénica. La población de células cancerosas puede originarse espontáneamente o mediante procesos tales como mutaciones presentes en la línea germinal del animal huésped o mutaciones somáticas, o puede ser inducida químicamente, viralmente o por radiación. La invención puede utilizarse para tratar cánceres tales como carcinomas, sarcomas, linfomas, enfermedad de Hodgkin, melanomas, mesoteliomas, linfoma de Burkitt, carcinomas nasofaríngeos, leucemias y ielomas. La población de células cancerosas puede incluir, pero no está limitada a, cánceres oral, tiroide, endocrino, dérmico, gástrico, esofágico, laríngeo, pancreático, de colon, vejiga, hueso, ovárico, cervical, uterino, de mama, testicular, prostático, rectal, de riñon, higado y pulmón. La población de células patógenas también puede ser un patógeno exógeno o una población de células que porte un patógeno exógeno, por ejemplo, un virus. La presente invención es aplicable a patógenos , exógenos tales como bacterias, hongos, virus, micoplasma. y parásitos. Los agentes infecciosos que pueden ser tratados con la presente invención incluyen cualquier organismo _ infeccioso reconocido en la técnica que cause patogénesis en un animal, incluyendo organismos tales como bacterias que sean cocos o bacilos gram-negativos o gram-positivos, virus de ADN y ARN, incluyendo pero no limitados a, virus de ADN tales como virus de papiloma, parvovirus, adenovirus, virus de herpes y virus de vaccinia, y virus de ARN, tales como arenavirus, coronavirus, rinovirus, virus sincitiales respiratorios, virus de influenza, picornavirus, paramixovirus, reovirus, retrovirus y rabdovirus . De particular interés son las bacterias que son resistentes a anticuerpos tales como especies de Streptococcus y especies de Staphylococcus resistentes a antibióticos, o bacterias que sean susceptibles a antibióticos, pero que causen infecciones recurrentes tratadas con antibióticos de tal forma que se desarrollen eventualmente organismos resistentes. Estos organismos pueden tratarse con los conjugados ligando-inmunógeno de la presente invención en combinación con dosis más bajas de antibióticos que normalmente serían administrados a un paciente para evitar el desarrollo de estas cepas bacterianas resistentes a antibióticos. La presente invención también es aplicable a cualquier hongo, especie de micoplasma, parásito u otros organismos infecciosos que ocasionen enfermedades en animales. Ejemplos de hongos que pueden tratarse con el método de la presente invención incluyen hongos que crecen como mohos o que son tipo levadura, incluyendo, por ejemplo, hongos que ocasionan enfermedades tales como tina, histoplasmosis, blastomicosis, aspergilosis, criptococosis, esporotricosis, coccidioidomicosis, paracoccidio-idomicosis y candidiasis. La presente invención se puede utilizar para tratar infecciones parasíticas que incluyen, pero no están limitadas a, infecciones causadas por tenias somáticas, tremátodos sanguíneos, áscaris de tejidos, amibas y especies de Plasmodi um, Trypanosoma , Leis±zmania y Taxoplasma . Los parásitos de particular interés son aquellos que expresan receptores de folato y se unen a folato; sin embargo, la literatura está repleta de referencias a ligandos que exhiben alta afinidad para organismos infecciosos. Por ejemplo, las penicilinas y cefalosporinas que se conocen por su actividad antibiótica y su unión específica a los precursores de las paredes celulares bacterianas se pueden usar similarmente como ligandos para preparar los conjugados ligando-inmunógeno para usarse de acuerdo con esta invención. Los conjugados ligándo-inmunógeno de la invención taipbién se pueden dirigir a una población de células que porte patógenos endógenos, en donde los antígenos específicos para patógenos se expresen de preferencia sobre la superficie de células que porten los patógenos, y actúen como receptores para el ligando con el ligando uniéndose específicamente al antigeno. El método de la presente invención se puede usar tanto para aplicaciones de medicina clínica humana como veterinarias. De esta manera, los animales huésped que portan la población de organismos patógenos y que se tratan con los conjugados ligando-inmunógeno pueden ser humanos o, en eL caso de aplicaciones veterinarias pueden, ser animales de laboratorio, agrícolas, domésticos o salvajes. La presente invención se puede aplicar a animales huéspedes que incluyen, pero no están limitados a, humanos, animales de laboratorio tales como roedores (por ejemplo, ratones, ratas, hámsters, etc.), conejos, monos, chimpancés, animales domésticos tales como perros, gatos y conejos, animales agrícolas tales como vacas, caballos, cerdos, borregos, cabras y animales salvajes en cautiverio tales como osos, pandas, leones, tigres, leopardos, elefantes, cebras, jirafas, gorilas, delfines y ballenas. El conjugado ligando-inmunógeno se administra de preferencia al animal huésped parenteralmente, por ejemplo, intradérmicamente, subcutáneamente, intramuscularmente, intraperitonealmente o intravenosamente. Como alternativa, el conjugado se puede administrar al animal huésped mediante cualquier otro proceso médicamente útil, y puede usarse cualquier dosis efectiva y forma de dosificación terapéutica adecuada, incluyendo formas de dosificación de liberación prolongada. El método de la presente invención se puede usar en combinación con la remoción quirúrgica de un tumor, terapia de radiación, quimioterapia o terapias biológicas tales como otras inmunoterapias que incluyen, pero no están limitadas a, terapia con anticuerpos monoclonales, tratamiento con agentes inmunomoduladores, transferencia adoptiva de células efectoras inmunes, tratamiento con factores de crecimiento hematopoyéticos, citocinas y vacunación. De acuerdo con la presente invención, los conjugados ligando-inmunógeno se pueden seleccionar de una amplia variedad de ligandos e inmunógenos. Los ligandos deben ser capaces de eliminar específicamente una población de células patógenas en el animal huésped gracias a la expresión preferente de un receptor para el ligando o accesibles para la unión al ligando en las células patógenas. Los ligandos aceptables incluyen ácido fólico, análogos de ácido fólico y otras moléculas de unión a receptor de folato, otras vitaminas, ligandos peptídicos identificados a partir de análisis de bibliotecas, péptidos específicos para tumores, aptámeros específicos para tumores, carbohidratos específicos para tumores, anticuerpos monoclonales o policlonales específicos para tumores, fragmentos Fab o scFv (es decir, una región variable de una sola cadena) de anticuerpos tales como, por ejemplo, un fragmento Fab de un anticuerpo dirigido a EphA2 u otras proteínas expresadas específicamente o únicamente accesibles sobre células cancerosas metastásicas, moléculas orgánicas pequeñas derivadas de bibliotecas combinatorias, factores de crecimiento tales como EGF, FGF, insulina y factores de crecimiento tipo insulina, y polipéptidos homólogos, somatostatina y su análogos, transferrina, complejos de lipoproteínas, sales biliares, selectinas, hormonas esferoides, péptidos que contengan Arg-Gly-Asp, retinoides, varias Galectinas, ligandos del receptor d-opioide, ligandos del receptor de colecistocinina A, ligandos específicos para receptores de angiotensina ATI o AT2, ligandos del receptor ?. activados por proliferador de peroxisomas, antibióticos de ß-lactama, moléculas orgánicas pequeñas que incluyen fármacos antimicrobianos, y otras moléculas que se unen específicamente a un receptor expresado de preferencia sobre la superficie de células tumorales o sobre un organismo infeccioso, o fragmentos de cualquiera de estas moléculas. De interés en el caso de ligandos que se unen a organismos infecciosos son muchas moléculas, tales como antibióticos u otros fármacos, que se sabe en la técnica que se unen de preferencia al microorganismo. La invención aplica también a ligandos que sean moléculas, tales como fármacos antimicrobianos, diseñados para ajustarse en la cavidad de unión de un receptor particular, con base a la estructura cristalina del receptor, u otra proteína de la superficie celular, y en donde estos receptores son de preferencia expresados sobre la superficie de tumores, bacterias, virus, micoplasma, hongos, parásitos u otros patógenos. También se •contempla, en una modalidad preferida de la invención, que pueden utilizarse los ligandos que se unan a cualquier antígeno tumoral u otras moléculas expresadas de preferencia sobre la superficie de las células tumorales. El sitio de unión para el ligando puede incluir receptores para cualquier molécula capaz de unirse específicamente a un receptor, en donde el receptor u otra proteina se exprese de preferencia sobre la población de células patógenas, incluyendo, por ejemplo, receptores de factores de crecimiento, vitaminas, péptidos incluyendo péptido-s opioides, hormonas, anticuerpos, carbohidratos y moléculas orgánicas pequeñas. El sitio de unión también puede ser un sitio de unión para cualquier molécula, tal como un antibiótico u otro fármaco, en donde se conozca en la técnica que el sitio existe preferiblemente en microorganismos. Por ejemplo, los presentes sitios de unión pueden ser sitios de unión en la pared de la célula bacteriana para un antibiótico de ß-lactama tal como penicilina, o sitios de unión para un agente antiviral presente únicamente sobre la superficie de un .virus. La invención- también aplica a sitios de unión para ligandos, tales como fármacos antimicrobianos, diseñados para ajustarse én el sitio de unión del receptor, con base en la estructura cristalina del receptor, y en donde el receptor es expresado de preferencia sobre la superficie de las células u organismos patógenos. Se contempla también que los antígenos específicos para tumores pueden funcionar como sitios de unión para ligandos en el método de la presente invención. Un ejemplo de un antígeno específico para tumor que podría funcionar como un sitio de unión para conjugados ligando-inmunógeno es un epítope extracelular de un miembro de la familia de proteínas Efrina, tales como EphA2. La expresión de EphA2 está restringida a uniones célula-célula en células normales, pero EphA2 se distribuye sobre la superficie celular completa en células tumorales metastásicas. De esta manera, la EphA2 sobre células metastásicas sería accesible para su unión a, por ejemplo, un fragmento Fab de un anticuerpo conjugado a un inmunógeno, mientras que la proteína no sería accesible para unirse al fragmento Fab sobre células normales, dando como resultado un conjugado ligando-inmunógeno específico para células cancerosas metastásicas . La invención contempla _ además el uso de combinaciones de conjugados ligando-inmunógeno, para maximizar la identificación de las células patogénicas para su eliminación por una respuesta inmune adquirida o innata, o por anticuerpos coadministrados. Los inmunógenos aceptables para usarse en la presente invención son inmunógenos que son capaces de desarrollar la producción de anticuerpos en un animal huésped o que han desarrollado anteriormente la producción de anticuerpos en un animal huésped dando como resultado una inmunidad preexistente, o que forman parte del sistema inmune innato. Como alternativa, los anticuerpos dirigidos contra el inmunógeno se pueden administrar al animal huésped para establecer una inmunidad pasiva. Los inmunógenos adecuados para usarse en la invención incluyen antígenos o péptidos antigénicos contra los cuales se haya desarrollado una inmunidad preexiste mediante vacunas programadas normalmente o la exposición natural anterior a agentes tales como antígenos de virus de polio, tétanos, tifus, rubéola, sarampión, paperas, pertussis, tuberculosis y de influenza, y grupos a-galactosilo. En tales casos, los conjugados ligando-inmunógeno se usarán para redirigir una inmunidad humoral o celular adquirida anteriormente a una población de células patógenas en el animal huésped para la eliminación de las células extrañas u organismos patógenos. Otros inmunógenos adecuados incluyen antígenos o péptidos antigénícos a los cuales el animal huésped haya desarrollado una inmunidad novedosa a través de la inmunización contra un antígeno o hapteno no natural (por ejemplo, 'isotiocianato de fluoresceína o dinitrofenilo) y antigenos contra los cuales exista una inmunidad innata (por ejemplo, superantígenos y dipéptido de muramilo) . Los ligandos e inmunógenos de la invención se pueden conjugar utilizando cualquier método reconocido en la técnica para formar un complejo. Esto puede incluir la unión covalente, iónica o por hidrógeno del ligando al inmunógeno, ya sea directa o indirectamente por medio de un grupo enlazador tal como un enlazador divalente. El conjugado se forma típicamente mediante el enlazamiento covalente del ligando al inmunógeno a través de la formación de enlaces de amida, éster o imino entre grupos de ácido, aldehido, hidroxi, amino o hidrazo sobre los componentes respectivos del complejo. En una modalidad preferida de la invención, el ligando es ácido fólico, un análogo de ácido fólico, o cualquier otra molécula receptora de unión de folato, y el ligando de folato se conjuga al inmunógeno mediante un procedimiento que utiliza anhídrido trifluoroacético para preparar ?-ésteres de ácido fólico mediante intermediario de azida de pteroilo. Este procedimiento preferido da como resultado la sintesis de un ligando de folato, conjugado al inmunógeno únicamente a través del grupo ?-carboxi de los grupos de ácido glutámico del folato, en donde el ?-conjugado se une al receptor de folato con alta afinidad, evitando la formación de mezclas de un a-conjugado y el ?-conjugado. Como alternativa, los a-conjugados puros pueden prepararse a partir de intermediarios en los que el grupo ?-carboxi sea bloqueado selectivamente, el a-conj ugado se forme y el grupo ?-carboxi se desbloquee subsecuentemente usando protocolos y procedimientos de síntesis orgánica ; reconocidos en la técnica. En forma notable, se pueden emplear otras vitaminas como ligandos para preparar los conjugados de acuerdo con esta invención. Por ejemplo, se pueden formar conjugados ligando-inmunógeno con biotina y riboflavina, así como con folato. (Véanse las patentes de E.U.A. Nos. 5,108,921, 5,416,016 y 5,635,382 incorporadas en la presente a manera de referencia) . Los conjugados ligando-inmunógeno de la invención estimulan una eliminación mediada por respuesta inmune endógena de una población de células patógenas . La respuesta inmune endógena puede incluir una respuesta humoral, una respuesta inmune mediada por células, y cualquier otra respuesta inmune endógena al animal huésped, incluyendo la lisis de células mediada por complementos, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) , opsonización de anticuerpos que lleve a fagocitosis, agrupación de receptores después de su unión a anticuerpos dando co o resultado la señalización de apoptosis, antiproliferación o diferenciación, y el reconocimiento directo por células inmunes del antígeno/hapteno suministrado. Se contempla también que la respuesta inmune endógena empleará la secreción de citocinas que regulen procesos tales como la multiplicación y migración de células inmunes . La respuesta inmune endógena puede incluir la participación de tipos de células inmunes tales como células B, células T, incluyendo células T auxiliares y citotóxicas, macrófagos, células asesinas naturales, neutrófilos, células LAK y similares. La respuesta humoral puede ser una respuesta inducida por procesos tales como vacunación programada normalmente, o inmunización activa con un antígeno natural o un antígeno o hapteno no natural (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína) , con el antígeno no natural induciendo una inmunidad novedosa. La inmunización activa incluye varias inyecciones del antígeno o hapteno no natural programadas fuera de un régimen de vacunación normal para inducir la inmunidad novedosa. La respuesta humoral también puede resultar a partir de una inmunidad innata en donde el animal huésped tenga una inmunidad preexistente natural, tal como una inmunidad a grupos a-galactosilo. Como alternativa, se puede establecer una inmunidad pasiva al administrar anticuerpos para el animal huésped tales como anticuerpos naturales tomados del suero, o anticuerpos monoclonales que puedan o no ser anticuerpos genéticamente manipulados, incluyendo anticuerpos humanizados. ~ La utilización de una cantidad particular de un reactivo de anticuerpo para desarrollar una inmunidad pasiva, y el uso de conjugado ligando-inmunógeno en donde los anticuerpos administrados en forma pasiva sean dirigidos al inmunógeno, proporcionaría la ventaja de un conjunto estándar de reactivos para usarse en casos en los que una concentración preexistente de anticuerpos a otros antígenos potenciales de un paciente no fuera terapéuticamente útil. Los anticuerpos administrados en forma pasiva se pueden "coadministrar" con el conjugado ligando-inmunógeno, y la coadministración se define como la administración de anticuerpos en un momento anterior, al mismo tiempo o en un momento después de la administración del conjugado ligando-inmunógeno.
Se contempla que los anticuerpos preexistentes, los anticuerpos inducidos o los anticuerpos administrados pasivamente serán redirigidos a las células tumorales u organismos infecciosos mediante la unión preferencial de los conjugados ligando-inmunógeno a estas células u organismos invasores, y que las células patógenas serán eliminadas mediante lisis mediada por complementos, ADCC, fagocitosis dependiente de anticuerpos, o la agrupación por anticuerpos de receptores. Los procesos citotóxicos también pueden incluir otros tipos de respuestas inmunes, tales como inmunidad mediada por células, así como respuestas secundarias que se originen cuando las células presentadoras antígenos atraídas fagocitocen las células no deseadas y presenten antígenos tumorales naturales o antígenos de patógenos extraños al sistema inmune para la eliminación de las células u organismos que porten los antígenos. Por lo menos una composición adicional que comprenda un factor terapéutico se puede administrar al huésped en combinación o como un adyuvante a la metodología descrita anteriormente, para- estimular la eliminación mediada por respuesta inmune endógena de la población de células patógenas, o puede administrarse más de un factor terapéutico. El factor terapéutico se puede seleccionar de un compuesto capaz de estimular una respuesta inmune endógena, un agente quimioterapéutico, un agente antimicrobiano u otro factor terapéutico capaz de complementar la eficacia del complejo ligando-inmunógeno administrado. El método de la invención se puede llevar a cabo al administrar al huésped, además de los conjugados descritos arriba, compuestos o composiciones capaces de estimular una respuesta inmune endógena que incluyen, pero no están limitados a, citocinas o factores de crecimiento de células inmunes tales como interleucinas 1-18, factor de células madre, FGF, EGF, G-CSF, GM-CSF, ligando FLK-2, HILDA, MlP-la, TGF-a, TGF-ß, M-CSF, IFN-a, IFN-ß, IFN-?, CD23 soluble, LIF y combinaciones de los mismos. También pueden usarse combinaciones terapéuticamente efectivas de estas citocinas. En una modalidad preferida, por ejemplo, cantidades terapéuticamente efectivas de IL-2, por ejemplo, en cantidades que varían de aproximadamente 5000 Ul/dosis/día a aproximadamente 500,000 Ul/dosis/día en un régimen diario de dosis múltiples, un IFN-a, por ejemplo, en cantidades que varían de aproximadamente 7,500 Ul/dosis/día a aproximadamente 150,000 Ul/dosis/día en un régimen diario de dosis múltiples, se usan junto con isotiocianato de fluoresceína enlazado a folato para eliminar células patógenas en un animal huésped que porte esta población de células. En otra modalidad preferida se usan IL-12 e IFN-a en cantidades terapéuticamente" efectivas, y en otra modalidad preferida más se usan IL-15 e IFN-a en cantidades terapéuticamente efectivas. En una modalidad alternativa que se prefiere se usan en combinación IL-2, IFN-a o IFN-? y GM-CSF. De Preferencia, los factores terapéuticos usados, tales como IL-2, IL-12, IL-15, IFN-a . IFN-? y GM-CSF, incluyendo combinaciones de los mismos, activan las células asesinas y/o células T naturales. Como alternativa, el factor terapéutico o combinaciones del mismo, incluyendo una interleucina en combinación con un interferón y GM-CSF, pueden activar otras células efectoras inmunes tales como macrófagos, células B, neutrófilos, células LAK o similares. La invención contempla también el uso de cualquier otra combinación efectiva de citocinas que incluya combinaciones de otras interleucinas e interferones y factores de estimulación de colonia. Los agentes quimioterapéuticos, los cuales son a su vez citotóxicos, pueden funcionar para incrementar la permeabilidad en tumores y son adecuados para usarse en el método de la invención, incluyen adrenocorticoides, agentes alquilantes, antiandrógenos, antiestrógenos, andrógenos, estrógenos, antimetabolitos tales como arabinósido de citocina, análogos de purina, análogos de pirimidina y metrotrexato, busulfán, carboplatina, clorambucilo, cisplatina y otros compuestos de platino, tamoxifén, taxol, ciciofosfamida, alcaloides vegetales, prednisona, hidroxiurea, tenipósido, antibióticos tales como mitomicina C y bleomicina, mostazas nitrogenadas, nitrosureas, vincristina, vinblastina, agentes inflamatorios y proinfla atorios y cualquier otro agente quimioterapéutico conocido en la técnica. Otros agentes terapéuticos que se pueden administrar como adyuvantes de la administración de los presentes conjugados, incluyen penicilinas, cefalosporinas, vancomícina, eritromicina, clindamicina, rifampina, cloramfenicol, aminoglucósidos, gentamicina, anfotericina B, aciclovir, trifluridina, ganciclovir, zidovudina, amantadina, ribavirina y cualquier otro compuesto antimicrobiano conocido en la técnica. La eliminación de la población de células patógenas comprenderá una reducción o eliminación de la masa tumoral o de organismos patógenos, dando como resultado una respuesta terapéutica. En el caso de un tumor, la eliminación puede ser una eliminación de células del tumor primario o de células que se hayan metastatizado o estén en el proceso de disociarse del tumor primario. También se contempla de acuerdo con la invención un tratamiento profiláctico para evitar el regreso de un tumor después de su remoción mediante cualquier enfoque terapéutico que incluya la remoción quirúrgica del tumor, terapia con radiación, quimioterapia o terapia biológica. El tratamiento profiláctico puede ser un tratamiento inicial con el conjugado ligando-inmunógeno, tal como un tratamiento en un régimen diario de dosis múltiples, y/o puede ser un tratamiento adicional o series de tratamientos después de un intervalo de días o meses después del tratamiento o tratamientos iniciales. La invención está dirigida también a una composición farmacéutica que comprende una cantidad de un conjugado ligando-inmunógeno efectiva para "marcar" una población de células patógenas en un animal huésped para su eliminación específica por una respuesta inmune endógena o por anticuerpos coadministrados. La composición comprende además una cantidad de un factor adicional, efectiva para incrementar la eliminación de las células patógenas, seleccionado del grupo que consiste en un agente de eliminación de células, un estimulador de la penetración en tumores, un agente quimioterapéutico, un agente antimicrobiano, una célula inmune citotóxica y un compuesto capaz de estimular una respuesta inmune endógena en donde el compuesto no se una al conjugado ligando-inmunógeno. La composición farmacéutica contiene cantidades terapéuticamente efectivas del conjugado ligando-inmunógeno y el factor terapéutico, y el factor puede comprender una citocina tal como IL-2, IL-12 o IL-15, o combinaciones de citocinas, incluyendo IL-2, IL-12 o IL-15 e interferones tales como IFN-a o IFN-? y combinaciones de interferones, interleucinas y factores estimuladores de colonia, tales como GM-CSF. La dosis diaria unitaria del conjugado ligando-inmunógeno puede variar significativamente dependiendo de la condición del huésped, del estado de enfermedad que se esté tratando, del peso molecular del conjugado, de su ruta de administración y distribución en los tejidos, y de la posibilidad del uso conjunto de otros tratamientos terapéuticos tales como terapia de radiación. La cantidad efectiva que se administrará a un paciente se basa en el área superficial del cuerpo, peso del paciente y diagnóstico médico de la condición del paciente. Una dosis efectiva puede variar de aproximadamente 1 ng/kg a aproximadamente 1 mg/kg, muy preferiblemente alrededor de 1 µq/ g a aproximadamente 500 µg/kg y más preferiblemente alrededor de 1 µg/kg a aproximadamente 100 µg/kg. Se puede usar cualquier régimen efectivo para administrar el conjugado ligando-inmunógeno y el factor terapéutico para redirigir anticuerpos preexistentes a las células tumorales u organismos infecciosos o para inducir una respuesta humoral al inmunógeno. Por ejemplo, el conjugado ligando-inmunógeno y el factor terapéutico se pueden administrar como dosis individuales, o se pueden dividir y administrar como un régimen diario de dosis múltiples. Además, se puede usar un régimen escalonado, por ejemplo de uno a tres días a la semana, como una alternativa al tratamiento diario, y con el propósito de definir esta invención éste régimen diario intermitente o escalonado se considera como equivalente a un tratamiento diario y dentro del alcance de esta invención. En una modalidad preferida de la invención, el huésped se trata con varias inyecciones del conjugado ligando-inmunógeno y el factor terapéutico para eliminar la población de células patógenas. En una modalidad, el huésped es inyectado varias veces (de preferencia aproximadamente dos hasta aproximadamente 50 veces) con el conjugado ligando-inmunógeno, por ejemplo a intervalos de 12-72 horas o a intervalos de 48-72 horas.
Inyecciones adicionales del conjugado ligando-inmunógeno pueden administrarse al paciente a un intervalo de días o meses después de las inyecciones iniciales, y las inyecciones adicionales prevenir la recurrencia de la enfermedad. Como alternativa, las inyecciones iniciales del conjugado ligando-inmunógeno pueden evitar la recurrencia de la enfermedad. El factor terapéutico puede administrarse al animal huésped antes, después o al mismo tiempo que el conjugado ligando-inmunógeno, y el factor terapéutico puede administrarse como parte de la misma composición que contenga el. conjugado, o como parte de una composición diferente que la del conjugado ligando-inmunógeno. Cualquiera de estas composiciones terapéuticas gue contenga él factor., terapéutico a una dosis terapéuticamente efectiva puede usarse en la presente invención. Además, se puede usar más de un tipo de conjugado ligando-inmunógeno. Por ejemplo, el animal huésped puede ser preinmunizado tanto con isotiocianato de fluoresceína como con dinitrofenilo y después ser tratado con isotiocianato de fluoresceina y dinitrofenilo enlazado al mismo o a diferentes ligandos en un. protocolo de co-dosificación. En el caso de agentes tguimioterapéuticos y antimicrobianos, el factor terapéutico se puede administrar a una dosis subóptima junto con el conjugado ligando-inmunógeno en una terapia de combinación para evitar el desarrollo de resistencia al agente quimioterapéutico o antimicrobiano por el animal huésped. El conjugado ligando-inmunógeno y el factor terapéutico se inyectan de preferencia parenteralmente, y estas inyecciones pueden ser inyecciones intraperitoneales, inyecciones subcutáneas, inyecciones intramusculares, inyecciones intravenosas o inyecciones intratecales . El conjugado ligando-inmunógeno y el factor terapéutico también se pueden suministrar usando una bomba lenta. Ejemplos de formas de dosificación parenteral incluyen soluciones acuosas del agente activo, en una solución salina isotónica, 5% de glucosa u otro vehículo líquido farmacéuticamente aceptable bien conocido tal como alcoholes líquidos, glicoles, esteres y amidas. La forma de dosificación parenteral de acuerdo con esta invención puede estar en forma de un liofilizado reconstituible que comprenda la dosis de conjugado ligando-inmunógeno y factor terapéutico. En un aspecto preferido de la presente modalidad, puede administrarse cualquiera de un número de formas de dosificación de liberación prolongada conocida en la técnica, tal como, por ejemplo, las matrices de carbohidratos biodegradables descritas en las patentes de E.U.A. Nos. 4,713,249; 5,266,333 y 5,417,982, cuyas descripciones se incorporan en la presente a manera de referencia.
Ejemplo 1 Efecto de conjugados de folato-isotiocianato de fluoresceína en la supervivencia de ratones con implantes de tumor de pulmón Ratones Balb/c hembra de seis a ocho semanas de edad (~20-22 gramos) se inmunizaron subcutáneamente en varios lugares con isotiocianato de fluoresceína y albúmina de suero de bovino (BSA) marcada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) usando un adyuvante comercial (por ejemplo, adyuvante de Freund o Titer Max™-Gold) . Después de asegurarse de que las concentraciones de anticuerpo anti-FITC fueran altas en todos los ratones (evidenciado por los resultados de ensayos ELISA de muestras de suero de los ratones) , a cada animal se le inyectó intraperitonealmente 5xl05 células M109, una línea de células de cáncer pulmonar singeneicas que expresa altos niveles del receptor de folato. Los lugares con cáncer se dejaron después fijar y crecer. Cuatro y siete días después de la implantación de las células cancerosas, a todos los animales se les inyectó intraperitonealmente solución salina de pH regulado con fosfato (PBS) o una cantidad específica de FITC conjugado a ácido -fólico mediante un puente de etilendiamina enlazado a gamma carboxilo. Las concentraciones de folato-FITC inyectadas fueron 0 (control de PBS-) , 4.5, 45, 450 y 4,500 nmoles/kg y ocho ratones fueron inyectados por cada concentración de folato-FITC para un total de 40 animales inyectados. Una serie de cinco inyecciones diarias (los dias 8 a 12) de 5,000 Ul de IL-2 humana recombinante se administraron después a todos los ratones para estimular el sistema inmune. La eficacia de esta inmunoterapia se evaluó después al monitorear la supervivencia como una función de tiempo de ratones tratados con folato-FICT comparados con animales de control. Como se muestra en la figura 1, la supervivencia promedio de los ratones tratados con folato-FITC dependió de la dosis, con los ratones de control exhibiendo una supervivencia promedio de 23 días después de la implantación del tumor, y los ratones de folato-FITC sobreviviendo cada vez más al incrementar la dosis del conjugado. Tan poco como 45 nmoles/kg de folato-FITC fueron capaces de promover la supervivencia a largo plazo de ratones, con dosis más altas siendo proporcionalmente más efectivas . Aunque se encontró que el folato-FITC se concentraba en los tumores, cierto folato-FITC estuvo presente en tejido de riñon (pero no a niveles comparables en otros tejidos normales). No se detectó toxicidad en riñon o en otros órganos normales en exámenes de autopsia por un patólogo veterinario certificado.
Ejemplo 2 Formación de imágenes de tejido tumoral normal versus tumoral con folato conjugado a isotiocianato de fluoresceína Los procedimientos fueron similares a los descritos en el ejemplo 1, excepto que los animales fueron inyectados con células tumorales 24JK-FBP, y los ratones se sacrificaron justo después de la inyección con folato-FITC haciendo cortes delgados de los tejidos y examinándolos mediante inmunofluorescencia con FITC usando microscopía por fluorescencia confocal para la localización de fo?ato-FITC en tejidos particulares, incluyendo tejidos tumoral, de riñon, de pulmón y muscular. La figura 2 muestra micrografías de contraste de fases de los diferentes cortes de tejido como controles junto con las micrografías por fluorescencia. Se encontró que el folato-FITC se localizaba específicamente en tejido tumoral y en células tubulares cercanas al riñon en donde los receptores de ácido fólico abundan en forma única.
Ejemplo 3 Formación de imágenes de tejido tumoral con folato conjugado a isotiocianato de fluoresceína o con IgG anti-ratón de cabra marcado con ficoeritrina Los procedimientos fueron similares a los descritos en el ejemplo 2, excepto que se usaron células M109, y los tejidos se examinaron mediante fluorescencia. con FITC (imágenes verdes) y fluorescencia con ficoeritrina (PE) (imágenes rojas) . Para la fluorescencia con PE, el marcador fluorescente se unió a anticuerpos IgG anti-ratón de cabra para usarse en la detección de la unión de anticuerpos anti- FITC de ratón endógenos al conjugado folato-FITC que se acumula sobre las células tumorales. Se compararon los tejidos tumorales tratados con folato-FITC y no tratados, y ambos tipos de muestras se examinaron también mediante microscopía de contraste de fases, como se describió en el ejemplo 2. La fluorescencia con FITC demuestra la localización de folato-FITC en tejidos tumorales (figura 3). La fluorescencia con PE demuestra que los anticuerpos anti-FITC de ratón endógenos se unieron a los conjugados de folato-FITC localizados en las células tumorales. Otros estudios (no mostrados) demuestran la falta de esta unión de IgG a tejidos normales, incluyendo de riñon. La ausencia de la unión de anticuerpos a folato-FITC localizado en tejidos de riñon se origina del hecho de que si el receptor de folato está sobre la membrana apical de las células tubulares cercanas al riñon, los anticuerpos no obtienen acceso a esa región del riñon. Las imágenes de contraste de fases (imágenes transmitidas) muestran la morfología de tejidos tumorales tratados y no tratados, revelando la muerte de células en las muestras tratadas.
Ejemplo 4 Efecto de conjugados de folato-isotiocianato de fluoresceína en el crecimiento de tumores sólidos Los procedimientos fueron similares a los descritos en el ejemplo 1, excepto que cada animal fue inyectado subcutáneamente en el hombro con 1 x 106 células M109 (día 0) después de una inmunización anterior con FITC. Las inmunizaciones con folato-FITC después de la implantación de células tumorales consistieron en 1,500 nmoles/kg de folato-FITC administrado en seis dosis intraperitoneales a intervalos de 48 horas (días 7, 9, 11, 13, 15 y 17) . Se midieron los tumores de hombro sólidos resultantes y se determinó el incremento porcentual en el tamaño del tumor. Las curvas de crecimiento de tumor ilustradas" en la figura 4 muestran que el crecimiento de los tumores sólidos fue inhibido significativamente cuando los animales se trataron con folato-FITC en combinación con IL-2.
Ejemplo 5 Efecto del tratamiento con combinaciones de citocinas Los procedimientos fueron similares a los descritos en el ejemplo 1, excepto que los animales fueron tratados con cinco inyecciones diarias (los días 8 a 12) de 5,000 Ul de IL-2 humana recombinante junto con IFN-a (5 inyecciones diarias a 2.5 x 104 Ul/día) , IL-12 (5 "inyecciones diarias a 0.5 µg/día) o TNF-a (3 inyecciones los días 8, 10 y 12 a 2 µg/día) después de la inyección aon dos dosis de 1,500 nmol/kg de folato-FITC o aminofluoresceina los días 4 y 7 después de la implantación de las células tumorales. Además, en un esfuerzo por reducir el tiempo requerido para obtener datos de supervivencia a largo plazo, las células tumorales fueron implantadas intraperitonealmente cerca del higado.
Por lo tanto, el tiempo de vida de los ratones portadores de tumores se acortó generalmente en comparación con el mostrado en el ejemplo 1. Los resultados mostrados en la figura 5 demuestran que la IL-2 sola fue mucho más efectiva para promover la supervivencia a largo plazo de los animales que el tratamiento de combinación con IL-2 e IL-12 o con IL-2 y TNF-a. En contraste, el tratamiento de combinación con IL-2 e IFN-a fue más efectivo para promover la supervivencia a largo plazo que la IL-2 sola. Se inyectó aminofluoresceína junto con las diferentes combinaciones de citocinas como un control, porque este compuesto no se enlaza a folato y no volverá a redirigir anticuerpos antifluoresceina a células tumorales .
Ejemplo 6 Efecto de inyecciones múltiples con conjugados de folato- isotiocianato de fluoresceína Los procedimientos fueron similares a los descritos en el ejemplo 1, excepto que los animales fueron inyectados intraperitonealmente a intervalos de 48 horas con seis inyecciones diarias (los días 7, 9, 11, 13, 15 y 17 después de la implantación de las células tumorales) de 1,500 nmol/kg de folato-FITC. Los resultados muestran (figura 6) que varias inyecciones con folato-FITC mejoraron la supervivencia a largo plazo de animales tratados con folato-FITC e IL-2 en comparación con dos inyecciones de folato-FITC administradas los dias 4 y 7 después de la implantación de las células tumorales.
Ejemplo 7 Efecto sinergístico de conjugados de folato-isotiocianato de fluoresceína e IL-2 Los procedimientos fueron similares a los descritos en el ejemplo 1, excepto que los animales fueron inyectados con 1,500 nmoles/kg de folato-FITC y algunos animales se trataron con folato-FITC o IL-2 solo. Además, las células tumorales se implantaron intraperitonealmente como se describe en el ejemplo 5. Este experimento (véas.e figura 7) se llevó a cabo para determinar si el folato-FITC e IL-2 actúan sinergísticamente para promover la supervivencia a largo plazo_de ratones portadores de tumores. Los tiempos de supervivencia promedio para *el grupo de control (n = 8), y los grupos (n = 8) tratados con IL-2, folato-FITC, o folato-FITC + IL-2 fueron IB, 19, 22 y 42 dias, respectivamente. Los resultados mostrados en la figura 7 demuestran que la capacidad del folato-FITC e IL-2 para promover la supervivencia a largo plazo de ratones portadores de tumores es fuertemente sinergística, con la IL-2 a dosis baja sola teniendo un efecto insignificante en la supervivencia de los ratones en ausencia de folato-FITC y con folato-FITC teniendo sólo un efecto menor.
Ejemplo 8 Implicación de células NK en el efecto sinergístico de los conjugados de folato-isotiocianato de fluoresceína e IL-2 Los procedimientos fueron similares a los descritos en el ejemplo 7, excepto que un grupo _de animales se trató con anticuerpos policlonales de célula NK anti-ratón de conejo (antí-asialo GM1; Wako Puré Chemical Industries, Ltd., Richmond, Va) en combinación con folato-FITC e IL-2. Se inyectó a cada ratón 0.2 ml de una dilución 1:10 de la solución de anticuerpos los días 1, 4, 9 y 14 después de la implantación de tumores para lograr la depleción de las células NK. Los tiempos de supervivencia promedio para el grupo de control y los grupos tratados con folato-FITC + IL-2 o folato-FITC + IL-2 + antipuerpo a-NK fueron 18, 42 y 18.5 días, respectivamente. Los resultados mostrados en la figura 8 demuestran que las células NK median la estimulación sinergística de la supervivencia a largo plazo de ratones portadores de tumores ocasionada por el tratamiento de combinación con folato-FITC e IL-2.
Ejemplo 9 Desarrollo de inmunidad celular contra células tumorales M109 Los procedimientos fueron similares a los descritos en el ejemplo 1, excepto que las células tumorales se implantaron intraperitonealmente en la posición descrita en el ejemplo 5, y los animales se inyectaron con PBS (control) o fueron co-inyectados con folato-FITC (1,500 nmoles/kg), IL- 2 (250,000 Ul/dosis) e IFN-a (25,000 U/dosis) los días 7, 8, 9, 11 y 14 después de la implantación de las células tumorales. Además, los animales fueron confrontados mediante una inyección de 5 x 105 células M109 el día 62 después de la implantación inicial de las células tumorales, mediante una inyección de 1.5 x 106 células M109 el día 96 después de la implantación inicial de las células tumorales o por la inyección de 2.5 x 105 de células de la Linea 1 (un carcinoma pulmonar espontáneo de Balb/c) el día 127 después de la implantación inicial de las células tumorales.
Como se muestra en la figura 9, el tiempo de supervivencia promedio de los ratones de control inyectados con 5 x 105 células M109 fue de 18.5 días. El tiempo de supervivencia promedio de los ratones de control inyectados con 1.5 x 106 células M109 fue de 18 días. El tiempo de supervivencia promedio de los ratones de control inyectados con 2.5 x 105 células de la Línea 1 fue de 23.5 días. El tiempo de supervivencia promedio de los ratones inyectados con 5 x 105 células M109 tratados con folato-FITC en combinación con IL-2 e IFN-a, confrontados el dia 62 con 5 x 105 células M109, confrontados el dia 96 con 1.5 x 106 células M109 y confrontados el día 127 con 2.5 x 105 células de la Línea 1 fue de más de 192 días. Los resultados mostrados en la figura 9 muestran el desarrollo de una inmunidad celular específica para tipos de células de gran duración en los animales tratados con folato- FITC en combinación con IL-2 e IFN-a. Esta inmunidad de larga duración protegió a los animales implantados con células M109 y que recibían la inmunoterapia dirigida con folato de la recurrencia de la enfermedad después de la confrontación mediante una inyección subsecuente de células M109. El tiempo de supervivencia en estos animales después de la confrontación final con células de la Linea 1 puede deberse a la presencia de receptores de folato en las células de la Linea 1 a niveles más bajos que en las células M109, y a la presencia de antígenos tumorales compartidos entre las células M109 y las células de la Línea 1, dando como resultado una respuesta inmune celular específica para M109 capaz de la interferencia con las células de la Línea 1.
Ejemplo 10 Efecto de dosis de IL-2 en la supervivencia de ratones tratados con conjugados de folato-isotiocianato de fluoresceína Los procedimientos fueron similares a los descritos en el. ejemplo 1, excepto que las células tumorales se implantaron intraperitonealmente en la posición descrita en el ejemplo 5, y los animales se trataron con PBS (control) o fueron co-inyectados con folato-FITC (1,500 nmoles/kg) e IL-2 a dosis de 5 x 103 Ul (IX), 0.5 x 105 Ul (10X) , 2.5 x 105 Ul (50X) o 5 x 105 Ul (100X) los días 7, 8, 9, 11 y 14 después de la implantación de las células tumorales. Además, los animales fueron inmunizados con hemocianina de lapa en forma de cerradura (KLH) marcada con FITC en lugar de BSA marcado con FITC. Como se muestra en la figura 10, el tiempo de supervivencia promedio de _los ratones implantados con células M109 y tratados con folato-FITC incrementó con una dosis cada vez más alta de IL-2 arriba de una dosis de IL-2 de 5 x 103 Ul . En contraste, no se observó diferencia substancial entre los tiempos de supervivencia promedio de ratones de control (ratones inyectados con células M109 y tratados con PBS) y los ratones tratados solamente con IL-2.
Ejemplo 11 Incremento de supervivencia por IFN-a de ratones tratados con conjugados de folato-isotiosianato de fluoresceína e IL-2 Los procedimientos fueron similares a los descritos en el ejemplo 1, excepto que las células tumorales se implantaron intraperitonealmente en la posición descrita en el ejemplo 5, y los animales se trataron con PBS (control) o fueron co-inyectados con folato-FITC (1,500 nmoles/kg) e IL-2 (5,000 Ul/dosis) o folato-FITC (1,500 nmoles/kg), IL-2 (5,000 Ul/dosis) e IFN-a (25,000 Ul/dosis) los días 7, 8, 9, 11 y 14 después de la implantación de las células tumorales. Un grupo adicional de ratones fue co-inyectado con folato-FITC, IL-2 e IIN-a, pero los animales no fueron preinmunizados con BSA-FITC. La figura 11 muestra que el tiempo de supervivencia promedio de los ratones de control tratados con PBS fue de 18.5 dias, el tiempo de supervivencia promedio de los ratones co-inyectados con folato-FITC e IL-2 fue de 20.5 días, el tiempo de supervivencia promedio de los ratones co-inyectados con folato-FITC, IL-2 e IFN-a fue de más de 60 dias, y el tiempo de supervivencia promedio de los ratones co-inyectados con folato-FITC, IL-2 e IFN-a, pero no preinmunizados, fue de 24.3 días. El tiempo de supervivencia promedio de los ratones inyectados con folato-FITC e IL-2 no fue sustancialmente diferente al de los ratones de control, porque los ratones fueron inyectados con 5,000 Ul de IL-2 y, como describió en el ejemplo 10, se requieren dosis de IL-2 de más de 5, 000 Ul para incrementar el tiempo de supervivencia promedio de los ratones tratados con folato-FITC usando el régimen de días 7, 8, 9, 11 y 14. Los resultados mostrados en la figura 11 demuestran que el IFN-a mejora más el incremento en el tiempo de supervivencia promedio que lo que ocurre como resultado del tratamiento con folato-FITC e IL-2 de los ratones implantados con células tumorales. Ejemplo 12 Efecto de la depleción de células T CD8+ en la inmunoterapia dirigida son folato Los procedimientos fueron similares a los descritos en el ejemplo 1, excepto que las células tumorales se implantaron intraperitonealmente en la posición descrita en el ejemplo 5, y los animales se inyectaron con PBS (control) o fueron co-inyectados con folato-FITC (1,500 nmoles/kg), IL-2 (5,000 Ul/dosis) e IFN-a (25,000 Ul/dosis) los días 7, 8, 9, 11 y 14 después de la implantación de las células tumorales . Grupos adicionales de ratones fueron co-inyectados con aminofluoresceina (1,500 nmoles/kg), IL-2 e IFN-a . o con folato-FITC, "" IL-2, ÍFN-a y anticuerpo anticélulas T CDd^ (en forma de ascites y administrado los días 2, 3, 7, 11 y 15) . Como se muestra en la figura 12, el anticuerpo anti-células T CD8+ inhibe el incremento en el tiempo de supervivencia promedio de los ratones tratados con folato-FlTC, IL-2 e IFN-a, indicando que las células T CD8+ juegan un papel en la activación de la respuesta inmune celular por medio de inmunoterapia dirigida con folato. Se inyectó aminofluoresceina junto con la combinación de IL-2, IFN-a y citocinas como un control, porque este compuesto no es enlazado a folato y no redirigirá anticuerpos anti-fluoresceína a las células tumorales. La figura 12 muestra que la aminofluoresceína junto con IL-2 e IFN-a es mucho menos efectiva que folato-FITC, IL-2 e ITN-a para incrementar el tiempo de supervivencia promedio de los ratones implantados con células M109.
Ejemplo 13 Efecto aumentador de GM-CSF en inmunoterapia dirigida con folato estimulada por IL-2 e IF?-a Los procedimientos fueron similares a los descritos en el ejemplo 1, excepto que las células tumorales se implantaron intraperitonealmente en la posición descrita en el ejemplo 5. Además, como se indica en la figura 13, los animales fueron inyectados con varias citocinas que incluían IL-2 (5,000 Ul/dosis), IF?-a (25,000 U/dosis) y GM-CSF (3,000 U/dosis) . Las citocinas fueron co-inyectadas en una serie de cinco inyecciones diarias los días 8 a 12 después de la implantación de las células M109, que fue subsecuente a la inyección con dos dosis de 1,500 nmoles/kg de folato-FITC los días 4 y 7. Los resultados ilustrados en la figura 13 muestran que el tiempo de supervivencia promedio de los ratones tratados con PBS fue de 19 dias, el tiempo de supervivencia promedio de los ratones inyectados con IL-2, IFN-a y GM-CSF sin folato-FITC fue de 22 dias, el tiempo de supervivencia promedio de los ratones inyectados con folato-FITC, IL-2 e IFN-a fue de 38 días, y el tiempo de supervivencia promedio de los ratones inyectados con folato-FITC, IL-2, IFN-a y GM-CSF fue de más de 57.5 días. Los resultados demuestran que GM-CSF aumenta más la eliminación de células tumorales dirigida con folato en ratones tratados también con IL-2 e IFN-a. El tiempo de supervivencia promedio de los ratones inyectados con PBS, IL-2,~IFN-a y GMCSF no fue significativamente diferente al de los ratones de control, indicando la importancia de dirigir una respuesta inmune específica para tumores usando folato-FITC.
Ejemplo 14 Efecto de la dosis de IFN-a en la supervivencia de ratones tratados con conjugados de folato-isotiocianato de fluoresceína Los procedimientos fueron similares a los descritos en el ejemplo 1, excepto que las células tumorales se implantaron intraperitonealmente en la posición descrita en el ejemplo 5, y los animales se trataron con PBS (control) o fueron co-inyectados con folato-FITC (1,500 nmoles/kg) e IFN-a a dosis de 1.5 x 105 Ul/dosis (6X), 7.5 X 104 Ul/dosis (3X), 2.5 X 10" Ul/dosis (IX) y 7.5 X 103 Ul/dosis (0.3 X). Además, los animales fueron inmunizados con hemocianina de lapa en forma de cerradura (KLH) marcada con FITC en lugar de BSA marcado con FITC, .y los animales se inyectaron con folato-FITC e IFN-a los días 7, 8, 9, 11 y 14 después de la implantación de las células tumorales. Como se muestra en la figura 14, el tiempo de supervivencia promedio de los ratones implantados con células M109 y tratados con folato-FITC incrementó con una dosis cada vez más alta de IFN-a por arriba de una dosis de IFN-a de 0.8 X 104 Ul/dosis.
Ejemplo 15 Efecto de dmitrofenilo como el inmunógeno en la inmunoterapia dirigida con folato Los procedimientos fueron similares a ios descritos en el ejemplo 1, excepto que las células tumorales se implantaron intraperitonealmente en la posición descrita en el ejemplo 5, y los animales se trataron con PBS (control) o fueron co-inyectados con dinitrofenilo (DNP) (1,500 nmoles/kg), IL-2 (5,000 Ul/dosis/día) e IFN-a (2.5 x 10 unidades/día) o con folato-dinitrofenilo (DNP) (1,500 nmoles/kg), IL-2 (5,000 Ul/dosis/día) e IFN-a (2.5 x 104 unidades/día) los días 7, 8, 9, 11 y 14 después de la implantación de las células tumorales. Además, los animales fueron inmunizados con hemocianina de lapa en forma de cerradura (KLH) marcada con DNP. Como se muestra en la figura 15, el tiempo de supervivencia promedio de los ratones tratados con folato-DNP, IL-2 e IFN-a se incrementó en relación con los ratones de control (tratados con PBS) o los ratones tratados con DNP, IL-2 e IFN-a. De esta manera, el DNP es también un inmunógeno efectivo para usarse en la inmunoterapia dirigida con folato.
Ejemplo 16 Efecto sinergístico de los conjugados de folato-isotiocianato de fluoresceína e IFN-a ' Los procedimientos fueron similares a los descritos en el ejemplo 1, excepto que las células tumorales se implantaron intraperitonealmente en la posición descrita en el ejemplo 5, y los animales se trataron con PBS (control), IFN-a solo (7.5 x 104 unidades/día), folato-FITC solo (1,500 nmoles/kg) o fueron co-inyectados con folato-FITC (1,500 nmoles/kg) e IFN-a (7.5 x 104 unidades/día) los días 7, 8, 9, 11 y 14 después de la implantación de las células tumorales. Además, los animales (5 ratones por grupo) fueron inmunizados con hemocianina de lapa en forma de cerradura (KLH) marcada con FITC en lugar de BSA marcado con FITC. Como se muestra en la figura 16, los tiempos de supervivencia promedio para los grupos tratados con PBS (control) , IFN-a, folato-FITC o folato-FITC + IEN-a fueron 17, 17, 23 y 33 días, respectivamente. Estos resultados muestran que IFN-a, al igual que IL-2, actúa sinergísticamente con folato-FITC para promover la supervivencia a largo plazo de ratones que portan tumores .
Ejemplo 17 Efecto de dinitrofenilo como el inmunógeno y de citocinas a altas concentraciones en la supervivencia a largo plazo de ratones Los procedimientos fueron similares a los descritos en el ejemplo 1, excepto que las células tumorales fueron implantadas intraperitonealmente en la posición descrita en el ejemplo 5, y los animales fueron tratados con PBS (control) o fueron co-inyectados con PBS, IL-2 (2.5 x 105 unidades/día) e IFN-a (7.5 x 104 unidades/día) o con folato-dinitrofenilo (DNP) (1,500 nmoles/kg), IL-2 (2.5 x 105 unidades/día) e IFN-a (7.5 X 104 unidades/día), los días 7, 8, 9, 11 y 14 después de la implantación de las células tumorales. Además, los animales fueron inmunizados con hemocianina de lapa en forma de cerradura (KLH) marcada con DNP. Como se muestra en la figura 17, el tiempo de supervivencia promedio de los ratones tratados con folato-DNP, IL-2 e IFN-a fue incrementado en relación con los ratones de control (tratados con PBS) o los ratones tratados con PBS, IL-2 e IFN-a. Los ratones tratados con folato-DNP, IL-2 e IFN-a (con IL-2 e IFN-a a concentraciones de 2.5 x 105 unidades/día y 7.5 x 104 unidades/día, respectivamente) se curaron completamente. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (50)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Uso de un conjugado ligando-inmunógeno que comprende un complejo de un ligando y un inmunógeno en donde el inmunógeno es reconocido por un anticuerpo endógeno o exógeno en un animal huésped, o es reconocido directamente por una célula inmune en el huésped, o un factor terapéutico, el factor se selecciona del grupo que consiste en un agente de eliminación de células, un estimulador de la penetración en tumores, un agente quimioterapéutico, un agente antimicrobiano, una célula inmune citotóxica y un compuesto capaz de estimular una respuesta inmune endógena, en donde el compuesto no se une al conjugado ligando-inmunógeno,_ en la fabricación de un medicamento para usarse en un método para estimular una eliminación específica mediada por respuesta inmune endógena de una población de células patógenas en el animal huésped que porta la población, en donde los miembros de la población de células tienen un sitio de unión accesible para el ligando, el uso comprende la etapa de administrar al huésped el conjugado ligando—inmunógeno y el factor terapéutico.
2. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde la población de células patógenas es una población de células cancerosas.
3. El uso de conformidad con la reivindicación 2, en donde la población de células cancerosas es tumorigénica.
4. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde la población de células patógenas es un patógeno exógeno o una población de células endógenas que porta patógenos exógenos.
5. El uso de conformidad con la reivindicación 4, en donde el patógeno exógeno se selecciona del grupo que consiste en bacterias, hongos, virus, micoplasma y parásitos.
6. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el ligando es una vitamina capaz de unirse específicamente a un receptor de membrana celular.
7. El uso de conformidad con la reivindicación 6, en donde el ligando se selecciona del grupo que consiste en ácido fólico y otros ligandos de unión-a receptor de folato.
8,. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el ligando es complejado químicamente al inmunógeno a través de una unión que comprende unión covalente, iónica o por hidrógeno.
9. El uso de conformidad con la reivindicación 8, en donde el ligando es un análogo de ácido fólico que tiene una porción glutamilo enlazada covalentemente al inmunógeno por medio de la porción ?-carboxilo del glutamilo del ligando .
10. El uso de conformidad con la reivindicación 8, en donde el ligando es un análogo de ácido fólico que tiene una porción glutamilo enlazada covalentemente al inmunógeno por medio de la porción glutamilo a-carboxilo del ligando.
11. El uso de conformidad con la reivindicación 9 ó 10, en donde el enlace covalente entre el inmunógeno y el ligando es mediante unión covalente directa al inmunógeno o mediante unión covalente a través de un enlazador divalente.
12. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el ligando es una molécula orgánica pequeña capaz de unirse a un receptor, y en donde el receptor es expresado preferencialmente, expresado únicamente o sobreexpresado sobre la superficie de la población de células patógenas.
13. El uso de conformidad con la reivindicación 12, en donde la molécula orgánica pequeña es un fármaco antimicrobiano .
14. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el ligando es un antibiótico de ß-lactama.
15. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el sitio de unión a ligando es un antígeno expresado preferencialmente, expresado únicamente o sobreexpresado sobre células cancerosas metastásicas.
16. El uso de conformidad con la reivindicación 15, en donde el sitio de unión a ligando es EphA2.
17. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el inmunógeno es una molécula orgánica que tiene un peso molecular de menos de 20,000 daltons.
18. El uso de conformidad con la reivindicación 17, en donde la molécula orgánica es fluoresceína o dinitrofenilo.
19. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el inmunógeno es un grupo a-galactosilo.
20. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es exógeno al huésped y es coadministrado con la composición del conjugado.
21. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el factor terapéutico comprende una citocina.
22. El uso de conformidad con la reivindicación 21, en donde el factor terapéutico comprende IL-2, IL-12, IL-15 o combinaciones de las mismas.
23. El uso de conformidad con la reivindicación 21, en donde el factor terapéutico comprende IL-2, IL-12, IL-15 o combinaciones de las mismas, en combinación con IFN-a o IFN-
24. El uso de conformidad con la reivindicación 21, en donde el factor terapéutico comprende IL-2, IL-12, IL-15 o combinaciones de las mismas, en combinación con IFN-a o IFN-?, o una combinación de los mismos, y GM-CSF.
25. El uso de conformidad con la reivindicación 21, e"n donde el factor terapéutico comprende por lo menos un estimulante de células NK o células T.
26. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde la composición de conjugado ligando-inmunógeno se administra en inyecciones múltiples.
27. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el animal huésped había sido expuesto naturalmente antes al inmunógeno, por lo que el animal huésped tiene una inmunidad preexistente al inmunógeno evidenciada por la presencia de anticuerpos endógenos al inmunógeno.
28. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el animal huésped había sido expuesto antes al inmunógeno por medio de un proceso no. natural que dio como resultado el cebado de la respuesta inmune del animal huésped al inmunógeno.
29. El uso de conformidad con la reivindicación 28, en donde el proceso no natural que da como resultado el cebado de la respuesta inmune del animal es la vacunación.
30. El uso de conformidad con la reivindicación 28, en donde el proceso no natural que da como resultado el cebado de la respuesta inmune del animal es la inmunización activa.
31. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde la respuesta inmune endógena comprende una respuesta inmune humoral .
32. El uso de conformidad con la reivindicación 31, en donde la respuesta humoral es una respuesta inmune adquirida.
33. El uso de conformidad con la reivindicación 31, en donde la respuesta humoral es una respuesta inmune innata.
34. El uso de conformidad con la reivindicación 32, en donde la respuesta adquirida es inducida al administrar al animal huésped una composición de vacuna.
35. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde la respuesta inmune endógena comprende una respuesta inmune mediada por células .
36. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde- la respuesta inmune endógena comprende una respuesta inmune humoral y mediada por células.
37. Uso de un complejo de un ligando para un sitio de unión expresado por una población de células patógenas en un animal huésped que porta la población y un inmunógeno; o anticuerpos dirigidos contra el inmunógeno; o por lo menos un factor terapéutico adicional, el factor se selecciona del grupo que consiste en un agente de eliminación de células, un estimulador de la penetración en tumores, un agente quimioterapéutico, un agente antimicrobiano, una célula inmune citotóxica y un estimulante de una respuesta inmune endógena que no se une al conjugado ligando-inmunógeno, en la fabricación de un medicamento para usarse en un método para estimular una eliminación específica mediada por respuesta inmune endógena de una población de células patógenas en el animal huésped, el uso comprende las etapas de administrar aL huésped el complejo, los anticuerpos y el por lo menos un factor terapéutico adicional.
38. Uso de un conjugado enlazado covalentemente de un inmunógeno, en donde el inmunógeno es reconocido por un anticuerpo endógeno o exógeno en un animal huésped, o es reconocido directamente por una célula inmune en el huésped, y un ligando que comprende ácido fólico o un análogo de ácido fólico que tiene un grupo glutamilo en donde el enlace covalente al inmunógeno es sólo a través del grupo ?-carboxi del grupo glutamilo, ' en la fabricación de un medicamento para usarse en un método para estimular una eliminación específica mediada por respuesta inmune endógena de una población de células patógenas en el animal huésped que porta la población, en donde la población expresa preferencialmente, expresa únicamente o sobreexpresa un receptor de ácido fólico, el método comprende la etapa de administrar al huésped el conjugado.
39. Uso un conjugado enlazado covalentemente de un inmunógeno, en donde el inmunógeno es reconocido por un anticuerpo endógeno o exógeno en un animal huésped, o es reconocido directamente por una célula inmune en el huésped, y un ligando que comprende ácido fólico o un análogo de ácido fólico que tiene un grupo glutamilo en donde el enlace covalente al inmunógeno es sólo a través del grupo a-carboxi del grupo glutamilo, en la fabricación de un medicamento para usarse en un método para estimular una eliminación específica mediada por respuesta inmune endógena de una población de células patógenas en el animal huésped que porta la población, en donde la población expresa preferencialmente, expresa únicamente o sobreexpresa un sitio de unión para un receptor de ácido fólico, el método comprende la etapa de administrar al huésped el conjugado.
40. Uso de un conjugado enlazado covalentemente de un inmunógeno, en donde el inmunógeno es reconocido por un anticuerpo endógeno o exógeno en un animal huésped, o es reconocido directamente por una célula inmune en el huésped, y un ligando que comprende ácido fólico o un análogo de ácido fólico que tiene un grupo glutamilo en donde el enlace covalente es sólo a través del grupo ?-carboxi del grupo glutamilo; o al menos un factor terapéutico adicional, el factor se selecciona del grupo que consiste en un agente de eliminación de células, un estimulador de la penetración en tumores, un agente quimioterapéutico, un agente antimicrobiano, una célula inmune citotóxica y un compuesto capaz de estimular una respuesta inmune endógena, en donde el compuesto no se une al conjugado ligando-inmunógeno, en la fabricación de un medicamento para usarse en un método para estimular una eliminación específica mediada por respuesta inmune endógena de una población de células patógenas en el animal huésped que porta la población, en donde la población expresa preferencialmente, expresa únicamente o sobreexpresa un sitio de unión para un receptor de ácido fólico, el método comprende las etapas de administrar al huésped el conjugado y el factor terapéutico.
41. Uso de un conjugado enlazado covalentemente de un inmunógeno, en donde el inmunogeno es reconocido por un anticuerpo endógeno o exógeno en un animal huésped, o es reconocido directamente por una célula inmune en el huésped, y un ligando que comprende ácido fólico o un análogo de ácido fólico que tiene un grupo glutamilo en donde el enlace covalente es sólo a través del grupo a-carboxi del grupo glutamilo; o al menos un factor terapéutico adicional, el factor se selecciona del grupo que consiste en un agente de eliminación de células, un estimulador de la penetración en tumores, un agente quimioterapéutico, un agente antimicrobiano, una célula inmune citotóxica y un compuesto capaz de estimular una respuesta inmune endógena, en donde el compuesto no se une al conjugado ligando-inmunógeno, en la fabricación de un medicamento para usarse en un método para estimular una eliminación específica mediada por respuesta inmune endógena de una población de células patógenas en el animal huésped que porta la población, en donde la población expresa preferencialmente, expresa únicamente o sobreexpresa un receptor de ácido fólico, el método comprende la etapa de administrar al huésped el conjugado y el factor terapéutico.
42. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende cantidades terapéuticamente efectivas de un conjugado ligando-inmunógeno capaz de la unión específica a una población de células patógenas en un animal huésped para la eliminación específica de las células por una respuesta inmune adquirida o innata, anticuerpos coadministrados o directamente mediante una célula inmune en el huésped, y un factor terapéutico seleccionado del grupo que consiste en un agente de eliminación de células, un estimulador de la penetración en tumores, un agente quimioterapéutico, un agente antimicrobiano y un compuesto capaz de estimular una respuesta inmune endógena, en donde el compuesto no se une al conjugado ligando-inmunógeno, y un vehículo farmacéuticamente aceptable para la misma .
43. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada porque está en una forma de dosis parenteral de liberación prolongada.
44. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada porque el factor terapéutico es un estimulante inmune.
45. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada porque el estimulante inmune comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste en IL-2, IL-12, IL-15, IFN-a, IFN-? y GM-CSF, o combinaciones de los mismos.
46. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una cantidad de un conjugado ligando-inmunógeno efectiva para marcar una población de células patógenas en un animal huésped para su eliminación específica por una respuesta inmune endógena o por anticuerpos coadministrados, en donde el ligando es una vitamina y el inmunógeno es un hapteno, y un vehículo farmacéuticamente aceptable para la misma.
47. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque la vitamina es ácido fólico.
48. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 46 ó 47, caracterizada porque el hapteno es fluoresceína o dinitrofenilo.
49. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 48, caracterizada porque el conjugado ligando-inmunógeno es isotiocianato de fluoresceína conjugado a ácido fólico por medio de un puente de etilendiamina enlazado a gamma carboxilo (folato-FITC) .
50. Uso de folato-FITC en la fabricación de un medicamento para marcar una población de células patógenas en un animal huésped para su eliminación específica por una respuesta inmune endógena o por anticuerpos coadministrados.
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