UA125636C2 - Способи ідентифікації раку, який може реагувати на анти-folr1 антитіло або анти-folr1 імунокон'югат - Google Patents

Способи ідентифікації раку, який може реагувати на анти-folr1 антитіло або анти-folr1 імунокон'югат Download PDF

Info

Publication number
UA125636C2
UA125636C2 UAA201609144A UAA201609144A UA125636C2 UA 125636 C2 UA125636 C2 UA 125636C2 UA A201609144 A UAA201609144 A UA A201609144A UA A201609144 A UAA201609144 A UA A201609144A UA 125636 C2 UA125636 C2 UA 125636C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
okh
oko
cancer
amino acid
antibody
Prior art date
Application number
UAA201609144A
Other languages
English (en)
Inventor
Крістіна Н. Керріган
Кетлін Р. Вайтмен
Гілліан Пейн
Шеррон Ледд
Original Assignee
Іммуноджен, Інк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Іммуноджен, Інк. filed Critical Іммуноджен, Інк.
Publication of UA125636C2 publication Critical patent/UA125636C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens

Abstract

Надаються способи ідентифікації раку, який може реагувати на анти-FOLRl антитіло або анти-FOLRl імунокон'югат, при таргетній терапії раку, направленій проти людського рецептора фолату 1. Набори включають реагенти для використання за допомогою додатково передбачених способів.

Description

Надаються способи ідентифікації раку, який може реагувати на анти-ЕОЇ ВІ антитіло або анти-
ЕОІ ВІ імунокон'югат, при таргетній терапії раку, направленій проти людського рецептора фолату 1. Набори включають реагенти для використання за допомогою додатково передбачених способів.
ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ
За даною заявкою запитується перевага відносно попередньої заявки США Мо 61/471 007, поданої 1 квітня 2011 яка включена в даний документ у вигляді посилання.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
Галузь Техніки
Галузь техніки в цілому належить до підвищення ефективності лікування раку, розвиток якого характеризується надлишковою експресією людського рецептора фолату 1 (БОЇ НІ).
Зокрема, винахід належить до способу підвищення ефективності лікування пацієнтів, схильних до розвитку в них раку або з поставленим діагнозом рак, у яких пухлинні клітини надлишково експресують РОЇ ВІ, що визначається за допомогою аналізу експресії генів за допомогою антагоніста БОЇ НІ, наприклад, імунокон'югата ЕОЇ НІ.
Рівень техніки
Рак є однією із головних причин смерті в розвинених країнах світу. Більше ніж мільйону людей ставиться діагноз рак, що є причиною 500 000 смертей на рік тільки в Сполучених
Штатах Америки. Вважається, що більше ніж у 1 з З людей протягом життя розів'ється одна з форм раку. Існує більше 200 різних типів раку, на чотири з яких - рак молочної залози, легенів, товстої кишки й передміхурової залози - припадає більше половини всіх знову зареєстрованих випадків захворювання (Уетаї еї а!., 2003, Сапсег У. Сііп. 53:5-26).
Рецептор фолієвої кислоти 1 (ГЕО ВІ), також відомий як рецептор фолієвої кислоти альфа або фолатзв'язувальний білок, являє собою М-глікозилований білок, що експресується на плазматичній клітинній мембрані. ЕРОЇ В1 володіє високим ступенем спорідненості до фолієвої кислоті й дещо більш низьким - до похідних фолієвої кислоти. БОЇ АТ опосередковує доставку всередину клітини активної форми фолієвої кислоти, 5-метилтетрагідрофолату.
Надлишкова експресія ЕОЇ Н1 спостерігається в більшості випадків раку яєчників, а також у багатьох випадках раку матки, раку ендометрію, підшлункової залози, нирок, легенів і молочної залози, у той час як експресія РОЇ В1 у здорових тканинах обмежується апікальною мембраною епітеліальних клітин у проксимальних ниркових канальцях, альвеолярних пневмоцитах легенів, сечовому міхурі, яєчках, хороїдному сплетінні й щитоподібній залозі (У/ейтап 50 еї а!., Сапсег
Вез 52: 3396-3401 (1992); Апіопу АС, Аппи Нем Миїг 16: 501-521 (1996); Каїїї КЕ, єї аЇ. Супесої
Зо Опсої 108: 619-626 (2008)). Така модель експресії РОЇ В1 робить його бажаною мішенню для
ЕОЇ В1-направленої антиракової терапії.
Через звичайно безсимптомний розвиток раку яєчників аж до пізньої стадії, найчастіше він пізно діагностується й має поганий прогноз при лікуванні за допомогою доступних на даний час процедур, як правило, за допомогою хіміотерапевтичних препаратів після хірургічної циторедукції (моп Стиєпідеп М еї аї!., Сапсег 112: 2221-2227 (2008); Аупап А вї аї., Ат .) ОБзівї
Супесої! 196: 81 е81-86 (2007); Нату УМ еї а!., Обвівї Супесо!ї Би!игм 64: 548-560 (2009)). Таким чином, існує чітка нереалізована медична необхідність в більш ефективних терапевтичних засобах для лікування раку яєчників.
СУТЬ ВИНАХОДУ
Даний винахід заснований на відкритті динамічного діапазону експресії РОЇ В1 у пухлинній тканині й збільшення чутливості пухлини з підвищеним рівнем експресії РОЇ В1 до терапії анти-
ЕОЇ АТ антитілами або анти-РОЇВ1 імунокон'югатами. Даний винахід дозволяє успішно виконувати лікування пацієнтів, які мають велику ймовірність відповіді на терапію, що складається із введення терапевтичних агентів, тобто анти-РОЇ К1 антитіл або анти-РОЇ В1 імунокон'югатів пацієнтам, у яких визначається підвищений рівень експресії РОЇ В1.
Даний винахід надає спосіб ідентифікації суб'єкта, схильного до позитивної реакції на таргетну антиракову терапію проти рецептора фолату 1 (БОЇ В1-таргетну), причому спосіб включає виявлення експресії РОЇ А1 у зразку тканини суб'єкта.
Даний винахід також належить до способу збільшення ефективності лікування раку, що включає введення терапевтично ефективної дози РОЇ Н1-таргетної антиракової терапевтичної речовини суб'єкту, у зразку тканини якого була виявлена підвищена експресія РОЇ В1.
Даний винахід також належить до способу прогнозування ефективності лікування раку низькими дозами препарату, що включає введення терапевтично ефективної дози РЕОЇ В1- таргетної антиракової терапевтичної речовини суб'єкту, у зразку тканини якого була виявлена підвищена експресія РОЇ А1.
В одному варіанті втілення винаходу способи лікування направлені проти раку яєчників, недрібноклітинної аденокарциноми легенів (у тому числі бронхіолоальвеолярного раку), карциноми нирок і раку ендометрію.
В одному втіленні винаходу ступінь і рівномірність експресії РОЇВ визначається за 60 допомогою способів імуногістохімічного (ІГХ) аналізу, проточної цитометрії або гібридизації нуклеїнових кислот. В іншому варіанті рівень експресії РОЇ ВТ визначається за допомогою імуногістохімічного аналізу. Необмежуючі приклади ІГХ включають способи ІГХ, у яких різняться різні рівні ОЇ А1 і калібровані ІГХ способи, як описано в даному документі. Експресія БОЇ В1 може бути оцінена за допомогою відповідних систем, у тому числі, але не обмежуючись ними, за допомогою способів оцінки, описаних у даному документі. Наприклад, експресія ЕОЇ А1 може бути оцінена за допомогою каліброваного ІГХ способу, який включає діапазон інтенсивності забарвлювання 0, 1, 2, 3 і З, де 0 означає найнижчу інтенсивність забарвлювання й З - найвищу інтенсивність. Відповідно до іншого або додаткового варіанта, експресія РОЇ В1 може бути оцінена за допомогою каліброваного ІЇГХ способу, у якому досліджується однорідність забарвлювання, що коливається від фокальної («25 95 забарвлених клітин) до неоднорідної (25- 75 95 забарвлених клітин) і однорідної (275 95 забарвлених клітин), де фокальне забарвлювання є найменш рівномірним, а однорідне - найбільш рівномірним.
У ще одному варіанті втілення експресія РОЇ ВІ у зразку (наприклад, зразку пухлинної тканини) вимірюється й порівнюється з одним або більше еталонними зразками й виконується специфічна оцінка відповідності ступеня й рівномірності експресії РОЇ ВІ у зразку пухлинної тканини суб'єкта, ксенотрансплантата пухлини або клітинній лінії в порівнянні з одним або більше еталонними зразками. У різних прикладах експресія БОЇВ! при однорідному забарвлюванні зразка тканини або клітинного зразка з рівнями інтенсивності забарвлювання
ЕОІ АТ, що дорівнюють 1, 2, З або 3-, вважається збільшеною; експресія БОЇ В1 також вважається збільшеною за інтенсивності РОЇ 21 забарвлювання зразка тканини або клітинного зразка з рівнем З при неоднорідному або фокальному характері забарвлювання. В іншому варіанті втілення експресія РОЇ ВІ у зразку вимірюється й порівнюється з одним або більше еталонними зразками для визначення порівнянного рівня забарвлювання. В одному варіанті втілення використовується еталонний зразок з попередньою ІГХ оцінкою й/або попередньо встановленою кількістю антигена на клітину або числом ЗАК (зв'язаних антитіл на клітину), таким чином, кількість антигена або ЗАК для зразка тканини може бути визначена шляхом порівняння.
В одному варіанті втілення експресія РОЇ А1 у зразку (наприклад, зразку пухлинної тканини) вимірюється й порівнюється з одним або більше контрольними зразками й виконується
Зо специфічна оцінка відповідності ступеня й рівномірності експресії РОЇ ВІ у зразку пухлинної тканини суб'єкта, ксенотрансплантата пухлини або клітинній лінії в порівнянні з одним або більше контрольними зразками. В одному варіанті втілення експресія БОЇ ВІ у зразку порівнюється зі зразком для негативного контролю, який демонструє відсутність або низький рівень експресії РОЇ В1. В іншому варіанті втілення експресія ЕОЇ В1 у зразку порівнюється зі зразком для позитивного контролю, що володіє підвищеною експресією РОЇ А1 (рівень 1, 2, 3 або 3). У деяких варіантах втілення контрольні зразки включають, але не обмежуються ними, клітинні зразки Матаїма, 52, 5МУ620, Т470, І2ВОМХ-1, 300,19 ЕВ, Неї а або КВ. У конкретних варіантах втілення контрольні зразки включають клітини або клітинні конгломерати із клітин, трансфікованих рецепторами фолієвої кислоти (наприклад, 300.19 ЕВ).
В одному варіанті втілення РОЇ В1-таргетною антираковою терапевтичною речовиною є
ЕОЇ В1 імунокон'югат. В одному варіанті втілення імунокон'югат включає анти-ЕОЇ В1 антитіло, лінкер і цитотоксин.
В іншому варіанті втілення анти-РОЇ В1 антитіло являє собою пПИМОМ19. У іншому варіанті втілення лінкер вибирають із групи, що складається з розщеплюваного лінкера, нерозщеплюваного лінкера, гідрофільного лінкера і лінкера на основі дикарбонової кислоти. В іншому варіанті втілення лінкер вибирають із групи, що включає: М-сукцинімідил-4-(2- піридилдитіо)пентаноат (ЗРР) або /М-сукцинімідил-4-(2-піридилдитіо)-2-сульфопентаноат (сульфо-5РР), М-сукцинімідил-4-(2-піридилдитіо)бутаноат (ЗРОВ) або М-сукцинімідил-4-(2- піридилдитіо)-2-сульфобутаноат (сульфо-5РОВ), М-сукцинімідил-4-(малеімідометил) циклогексанкарбоксилат (5МСС), М-сульфосукцинімідил-4-(малеіїмідометил) циклогексанкарбоксилат (сульфоБМСсС), М-сукцинімідил-4-(йодоацетил)-амінобензоат (5ІАВ) і
М-сукцинімідил-|(М-малеіїмідопропіонамідо)тетраетиленглікольний)| естер (МНЗ-РЕС4-малеїмід).
В іншому варіанті втілення лінкер являє собою М-сукцинімідил-4-(2-піридилдитіо)-2- сульфобутаноат (сульфо-5РОВ). В іншому варіанті здійснення винаходу цитотоксичний агент вибирають із групи, що складається з майтансиноїду, аналога майтансиноїду, бензодіазепіну, таксоїду, СС-1065, аналога СС-1065, дуокарміцину, аналога дуокарміцину, каліхеаміцину, доластатину, аналога доластатину, ауристатину, похідного томайміцину й похідного лептоміцину або цих агентів у формі пролікарського засобу. В іншому варіанті втілення цитотоксичний засіб являє собою майтансиноїд. В іншому варіанті втілення цитотоксичним бо агентом є М(2')-деацетил-М-(2')-(З-меркапто-1-оксопротл)-майтансин або М(2")-деацетил-М2-(4-
меркапто-4-метил-1-оксопентил)-майтансин. В іншому варіанті втілення цитотоксичний агент являє собою М(2')-деацетил-М2-(4-меркапто-4-метил-1-оксопентил)-майтансин (ОМ4). У ще одному варіанті втілення імунокон'югат включає антитілл НОМОМ19, сульфо-5РОВ і ЮМ4 (ІМОМ853).
Винахід також належить до набору для вимірювання рівня експресії РОЇ В1 у суб'єкта, куди входить реагент для виявлення РОЇ НІ і інструкція із застосування. В одному варіанті втілення реагент для виявлення РОЇ ВІ включає ЕОЇ Н1 зв'язувальний пептид, білок або молекулярний зонд (наприклад, нуклеїнову кислоту). В іншому варіанті втілення реагент для виявлення РОЇ В1 являє собою анти-РОЇ ВІ антитіло. В іншому варіанті втілення набір додатково включає вторинне антитіло, яке зв'язується з анти-РОЇ ВТ антитілом. В одному варіанті втілення використовуються антитіла в концентрації від 0,5 до 7,5 мкг/мл, краще від 0,9 до 3,8 чж/- 0,5 мкг/мл. У різних варіантах втілення антитіла використовуються в концентраціях 1,0 ж/- 0,5 мкг/мл, 1,5 ж/- 0,5 мкг/мл, 1,9 -/-0,5 мкг/мл, 2,5 ж/- 0,5 мкг/мл, 3,0 ж/- 0,5 мкг/мл, 3,5 ж/- 0,5 мкг/мл, 3,8 -/- 0,5 мкг/мл або до 4,2 мкг/мл. В іншому варіанті втілення антитіла використовуються в концентрованому розчині з інструкціями для розведення для досягнення кінцевої концентрації від 0,9 до 3,8 я/- 0,5 мкг/мл. В іншому варіанті втілення винаходу набір додатково включає реагент для виявлення, який вибраний із групи, що складається з ферменту, флуорофора, радіоактивної мітки й люмінофора. В іншому варіанті втілення реагент для виявлення вибраний із групи, що складається з біотину, дигоксигеніну, рлуоресцеїну, тритію й родаміну.
Набір також може включати інструкції для виявлення й оцінки експресії РОЇ В1.
Також набір може включати контрольні або еталонні зразки. Приклади контрольних або еталонних зразків, що не мають обмежувального характеру, включають зразки тканин, клітинних конгломератів або клітин. Контрольні або еталонні зразки можуть бути одержані із клітинних ліній культури тканин (нормальних або пухлинних), зразків нормальної тканини (нормальний контроль) або пухлинних тканин (позитивний контроль). Типові клітинні лінії включають 5МУб20, Т470, ІЇВОМ-1, НЕГА, КВ, УЕС-3 і клітинні лінії, постійно або тимчасово трансфіковані вектором експресії, що експресує БОЇ В1 (наприклад, 300.19 ЕВ1). Приклади тканин, які можуть бути використані як зразки нормальних тканин для способів виявлення експресії БОЇ ВІ, описані в даному документі й включають нормальні тканини легенів, слинних залоз і підшлункової залози.
Винахід також належить до способу ідентифікації раку, що складається з реєстрації відповіді на анти-РОЇ ВІ антитіло або анти-РОЇ В! імунокон'югат, яка включає: (а) контактування біологічного зразка, що включає клітини зазначеної пухлини з агентом, що зв'язує РОЇ В1 білок на поверхні клітини; (б) визначення зв'язування зазначеного агента, який зв'язується з ЕОЇ В1 білком на клітинній поверхні біологічного зразка, зазначеного в (а); (в) оцінку зв'язування, зазначеного на стадії (б), зазначена оцінка присвоюється на основі порівняння з одним або декількома еталонними зразками; і (г) порівняння зазначеної на стадії (в) оцінки з оцінкою зразка тканини або клітин, при якому оцінка рівня БОЇВ зазначеного раку є більше нормального або зниженого рівня експресії РОЇ В1 еталонного зразка, або оцінка рівня ЕОЇ В1 зазначеного раку, що дорівнює або більше ніж оцінка для високого рівня експресії ЕОЇ В1 еталонного зразка, ідентифікує зазначений рак як такий, що ймовірно реагує на анти-ЕОЇ В антитіло або анти-РОЇ В1 імунокон'югат. У деяких варіантах втілення рак являє собою рак яєчників або рак легенів.
Винахід також належить до способу ідентифікації пухлини, чутливої до терапії анти-РОЇ В антитілами або анти-РОЇ ВІ імунокон'югатами, причому зазначений спосіб включає: (а) вимірювання рівня експресії БОЇВ! у зразку пухлинної тканини, одержаної із зазначеної пухлини, де зазначене вимірювання включає використання способу виявлення, що розпізнає інтенсивність або рівномірність забарвлювання в зразку пухлинної тканини, що експресує
ЕОГ В1 у порівнянні з інтенсивністю або рівномірністю забарвлювання одного або декількох еталонних зразків; (б) визначення ступеня інтенсивності забарвлювання БОЇНВ1 для зазначеного зразка пухлинної тканини; і (в) порівняння інтенсивності забарвлювання ЕОЇ 1, визначеної на етапі (б) з відносним значенням, яке визначається шляхом вимірювання експресії білка РОЇ В1, щонайменше, в одному контрольному зразку, де зазначений контрольний зразок являє собою тканину, клітини або клітинний конгломерат, який є нечутливим до терапії анти-
ЕОЇ В1 антитілами або анти-ЕОЇ В1 імунокон'югатами, і в якому інтенсивність забарвлювання
ЕОЇІ А1 зазначеного зразка визначена на етапі (б), і є більш високою, ніж зазначене відносне значення, ідентифікує дану пухлину як чутливу до терапії анти-РОЇ 21 антитілами або анти-
ЕОГ В1 імунокон'югатами. У деяких варіантах втілення виявлення виконується вручну або за допомогою автоматизованої системи. В одному варіанті втілення способом виявлення є ІГХ. В іншому варіанті втілення використовується відкалібрований спосіб ІГХ, при якому можливо розрізняти різні рівні експресії РОЇ В1.
Винахід також належить до способу оптимізації терапевтичної схеми з анти-ЕОЇ В1 антитілами або анти-ЕОЇ В1 імунокон'югатами для суб'єкта, що страждає на рак легенів або рак яєчників, причому зазначений спосіб включає: (а) контактування зазначеного зразка тканини зазначеного суб'єкта з антитілом, яке специфічно зв'язує РОЇ В1 білок на поверхні клітини; (б) вимірювання ступеня зв'язування зазначеного в (а) антитіла із зазначеним ЕОЇ В1 білком на поверхні клітини в зазначеному зразку за допомогою способу виявлення, який може розрізняти інтенсивність або рівномірність забарвлювання при експресії РОЇ ВІ у пухлинному зразку в порівнянні з інтенсивністю або рівномірністю забарвлювання одного або декількох еталонних зразків, і призначення ступеня забарвлювання зазначеному зразку; і (в) введення високої дози анти-ЕОЇ В1 імунокон'югата, коли результат вимірювання на стадії (б) є меншим або дорівнює результату для нормальної або зниженої експресії РОЇ В1 еталонного зразка, або введення низьких доз анти-РОЇ 1 імунокон'югата при результаті вимірювання, який є більшим, ніж результат для нормальної або зниженої експресії РОЇ В1 еталонного зразка.
Винахід також належить до способу виявлення експресії РОЇ ВІ на клітинній поверхні ракових клітин зразка пухлинної тканини індивідуума, де зазначений спосіб включає: (а) одержання зразка пухлинної тканини, де зразок клітин зазначеного раку зафіксований у формаліні й залитий парафіном; (б) контактування зазначеного зразка з антитілом, яке специфічно зв'язує РОЇ ВІТ білок на поверхні клітини; (в) вимірювання ступеня зв'язування зазначеного в (б) антитіла з зазначеним ЕОЇ В1 білком на поверхні клітини в зазначеному зразку пухлинної тканини за допомогою способу виявлення, який може розрізняти інтенсивність або рівномірність забарвлювання при експресії РОЇВ! у пухлинному зразку в порівнянні з інтенсивністю або рівномірністю забарвлювання одного або декількох еталонних зразків; і (г) призначення рівня експресії РОЇ 21 зазначеному ЕОЇ ВІ1 після порівняння рівня інтенсивності або рівномірності забарвлювання клітинної поверхні РОЇ ВІ у зазначеному зразку пухлинної тканини з одним або більше еталонними зразками.
Винахід також належить до способу ідентифікації суб'єкта, що страждає на рак легенів або рак яєчників, здатного відповісти на режим терапії низькими дозами анти-ЕОЇ В1 антитіл або
Зо анти-ЕРОЇ В1 імунокон'югата, що включає: (а) контактування біологічного зразка, що включає клітини зазначеного раку яєчників або легенів з агентом, який зв'язується з РОЇ В1 білком на клітинній поверхні; (б) визначення ступеня зв'язування зазначеного агента для зазначеного в (а) біологічного зразка; (в) призначення рівня зв'язування, зазначеного на стадії (б), при якому зазначений рівень надається на основі порівняння з одним або декількома еталонними зразками; і (г) порівняння зазначеного на стадії (в) рівня з рівнем еталонного зразка тканини або клітин, при якому оцінка для згаданого рівня РОЇ Н1 при раку яєчників або легенів є більшою ніж оцінка для нормального або зниженого рівня експресії ЕОЇ В1 еталонного зразка, або оцінка для згаданого рівня РОЇ 21 при раку яєчників або легенів дорівнює або є більшою за оцінку для високого рівня експресії РОЇ В1 еталонного зразка, що ідентифікує зазначений рак яєчників або легенів, як здатний відповісти на низькі дози анти-РОЇ В! антитіл або анти-ЕОЇ В1 імунокон'югата. У деяких варіантах втілення спосіб додатково включає введення терапевтично ефективної кількості гуманізованого анти-РОЇ В! антитіла або анти-РОЇ В1 імунокон'югата зазначеному суб'єкту.
КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ
Фігура 1. Ручний спосіб забарвлювання: Виявлення експресії РОЇ 21 за допомогою анти-
РОЇВ антитіл у трансфікованих клітинах. Клітини серії 300.19 були трансфіковані полінуклеотидом, що кодує людський БОЇ НА1. Експресія білка БОЇВ виявлялась із застосуванням мишачого антитіла ВМ3.2. тій АЕ еї аїЇї, Нурідота (ІГагпті). 2007
Осг26(5):281-8.
Фігура 2. Ручний спосіб забарвлювання: Використовуючи анти-РОЇ В! антитіла можна виділити різні рівні експресії РОЇ ВІ. Антитіло ВМ3.2 використовувалося для виявлення експресії РОГ ВІ у різних клітинах ксенотрансплантата. Межа виявлення для антитіла ВМ3.2 становить приблизно 4000 антитіл, зв'язаних із клітиною (ЗАК).
Фігура 3. Ручний спосіб забарвлювання: Використовуючи анти-РОЇ В! антитіла можна виділити різні рівні експресії РОЇ В1 у зразках тканин. Антитіло ВМ3.2 використовувалося для виявлення експресії ОЇ В1 у пухлинах яєчників (А) і пухлинах недрібноклітинного раку легенів (В).
Фігура 4. Ручний спосіб забарвлювання: Рівномірна експресія РОЇ В1 у пухлинах НДРЛ і раку яєчників. Експресія БОЇ ВІ була високою в багатьох зразках карциноми яєчників, а також бо аденокарциноми легенів і бронхіолоальвеолярної карциноми. Більшість зразків карциноми яєчників продемонстрували найвищі рівні інтенсивності забарвлювання серозних або ендометріоїдних клітин. При дослідженні НДРЛ найвищі значення ЗАК були виявлені в зразках бронхіолоальвеолярної карциноми й папілярної аденокарциноми.
Фігура 5. Ручний спосіб забарвлювання: Експресія РОЇВ, як правило, обмежується мембраною клітин НДРЛ. Мікроскопічне дослідження з високим розділенням показало, що забарвлювання РОЇ В1 пухлини НДРЛ було обмежено переважно клітинними мембранами.
Фігура 6. Ручний спосіб забарвлювання: Експресія РОЇВ, як правило, обмежується мембраною клітин раку яєчників. Мікроскопічне дослідження з високим розділенням показало, що забарвлювання БОЇВ пухлини раку яєчників було обмежено переважно клітинними мембранами.
Фігура 7. п о мімо ефективність пПиМомі9-таргетних кон'югатів в КВ моделі ксенотрансплантата. ЕОЇ В1-таргетований розщеплюваний кон'югат пимМом19-5РОВ-ОМА (В) у порівнянні з не-РОЇ В1-таргетованим пиС242-5РОВ-ОМА (0) і нерозщеплюваним кон'югатом пиМом19-РЕС4-МаІ-ОМ4 (С) порівняно з нетаргетованим пиСб242-РЕСАМаІ-ОМА4 (Е) були протестовані шляхом встановленої моделі ксенотрансплантата КВ клітин, підшкірно імплантованих мишам з ТКІН (тяжкою комбінованою імунною недостатністю. Таргетування пиМом19 за ЕОЇ В1 привело до значного зниження середнього об'єму пухлини.
Фігура 8. Залежна від дози протипухлинна активність ІМОМ853 терапії ОМСАВ-З3 ксенотрансплантата карциноми яєчників людини. Мишей лікували за допомогою однократної внутрішньовенної ін'єкції ІМЕОМ85З3 в дозі 1,2, 2,5 або 5,0 мг/кг. Тварини контрольної групи одержували однократну внутрішньовенну ін'єкцію ФСБ.
Фігура 9. Залежна ввід дози протипухлинна активність ІМОМ853 терапії ІШВОМ-1 ксенотрансплантата карциноми яєчників людини. Мишей лікували за допомогою однократної внутрішньовенної ін'єкції ІМЕОМ85З3 в дозі 1,2, 2,5 або 5,0 мг/кг. Тварини контрольної групи одержували однократну внутрішньовенну ін'єкцію ФСБ.
Фігура 10. Залежна від дози протипухлинна активність ІМОМ853 терапії ОУ-90 ксенотрансплантата карциноми яєчників людини. Мишей лікували за допомогою однократної внутрішньовенної ін'єкції ІМЕОМ85З3 в дозі 1,2, 2,5 або 5,0 мг/кг. Тварини контрольної групи одержували однократну внутрішньовенну ін'єкцію ФСБ.
Зо Фігура 11. Залежна від дози протипухлинна активність ІМОМ853 терапії 5КОМ-3 ксенотрансплантата карциноми яєчників людини. Мишей лікували за допомогою однократної внутрішньовенної ін'єкції ІМЕОМ85З3 в дозі 1,2, 2,5 або 5,0 мг/кг. Тварини контрольної групи одержували однократну внутрішньовенну ін'єкцію ФСБ.
Фігура 12. Залежна від дози протипухлинна активність ІМОМ853 терапії КВ ксенотрансплантата аденокарциноми шийки матки людини. Мишей лікували за допомогою однократної внутрішньовенної ін'єкції ІМЕМ853 в дозі 1,0, 2,5 або 5,0 мг/кг. Тварини контрольної групи одержували однократну внутрішньовенну ін'єкцію ФОБ.
Фігура 13. Автоматизовані способи забарвлювання: типові фотографії й гістограми, що показують експресію РОЇВ у клітинних лініях, визначену за допомогою ІГХ і проточної цитометрії. Клітини ліній 5МУб20, Т470О, Ідгом-1, 300.19/ЕВ1, Неа і КВ оцінювалися за інтенсивністю й рівномірністю забарвлювання РОЇ НА1. Ступінь і рівномірність забарвлювання клітин 5МУ6З30 і І2ВОМ-1 були оцінені, як 1-3 неоднорідна, Т470О як 1-2 неоднорідна, Неї а як 2-3 неоднорідна, у той час як 300.19/ЕВ1 і КВ були оцінені, як З однорідна.
Фігура 14. Автоматизовані способи забарвлювання: типове забарвлювання РОЇ вВ1 серозного раку яєчників. Зразки показали ступінь і рівномірність забарвлювання такі, як З однорідна, 2-3 однорідна, 2 однорідна й 2 неоднорідна, встановлені за допомогою ІГХ на зрізах тканини серозного раку яєчників.
Фігура 15. Автоматизовані способи забарвлювання: типове забарвлювання РОЇ вВ1 ендометріоїдного раку яєчників. Зразки показали ступінь і рівномірність забарвлювання такі, як
З однорідна, 2-3 однорідна, З фокальна й 1-2 неоднорідна, встановлені за допомогою ІГгХ на зрізах тканини ендометріоїдного раку.
Фігура 16. Автоматизовані способи забарвлювання: типове забарвлювання РОЇ ВТ НДРЛ підтипу аденокарциноми (за винятком бронхіолоальвеолярної карциноми). Зразки показали ступінь і рівномірність забарвлювання такі, як З однорідна, 2-3 однорідна, 2 неоднорідна, 2 однорідна й 1-2 неоднорідна, встановлені за допомогою ІГХ на зрізах тканини недрібноклітинного раку легенів, підтипу аденокарциноми.
Фігура 17. Автоматизовані способи забарвлювання: типове забарвлювання РОЇ вВ1 аденокарциноми ендометрію. Зразки показали ступінь і рівномірність забарвлювання такі, як З неоднорідна, 2 неоднорідна й 1 неоднорідна, встановлені за допомогою ІГХ на зрізах тканини бо аденокарциноми ендометрію.
Фігура 18. Автоматизовані способи забарвлювання: типове забарвлювання РОЇ А1 нирково- клітинної карциноми. Зразки показали ступінь і рівномірність забарвлювання такі, як 2 однорідна, 2 неоднорідна й 1 неоднорідна, встановлені за допомогою ІГХ на зрізах тканини нирково-клітинного раку.
Фігура 19. Цитотоксична іп міїго активність ІМЕМ853. П'ять РОЇ В1-позитивних клітинних ліній (КВ, ТаВОМ-1, УЕС-3, ЗКОМУ-3 і ОМСАВ-3) і дві ЕОЇ В1-негативні клітинні лінії (Матаїма і 52) аналізували на їх чутливість до цитотоксичних ефектів ІМЕМ853. Клітини піддавали впливу
ІМОМ853 (суцільна лінія) або ІМЕ2ЕМ853 плюс 0,5 мкМ некон'югованого пиМом19 (М9346А) (пунктирна лінія) протягом 5 днів, а виживаність клітин визначали за допомогою аналізу на основі МУ5Т-8. Показані репрезентативні дані. Відсоток клітин, що вижили, наносили на графік у порівнянні з десятковим логарифмом концентрації ІМЕМ853.
Фігура 20. Чутливість РОЇ В1-позитивних клітинних ліній до ІМЕМ853 проти рівня експресії
ЕОЇ ВТ. Ефективність і специфічність ІМЕМ853 була проаналізована на ГОЇ В1-позитивних клітинних лініях із широким спектром експресії РОЇ НІ. Клітинні лінії, інкубовані з ІМЕМ853 і КВ,
Ідгом-1 і Уед-3 показали специфічну чутливість до ІМЕМ853, тоді як некон'юговані пиИМом19 (М9346А) показали зниження активності кон'югата. ЗКох-3 і Омуса/-3 не були чутливі до
ІМОМ853, і некон'юговані пимМом19 (М9346А) не змінили активність кон'югата.
Фігура 21. Автоматизовані способи забарвлювання: моделі ефективності ксенотрансплантата карциноми яєчників, забарвлені для РОЇ 81. Зразки показали ступінь і рівномірність забарвлювання такі, як 1-3 неоднорідна (Омусаг 3), 1-3 однорідна (Ідгом 1), 1-2 неоднорідна (Ом 90) і негативний результат (КОМ 3), встановлені за допомогою ІГХ на зрізах тканини ксенотрансплантатів раку яєчників.
Фігура 22. Автоматизовані способи забарвлювання: мишачі моделі ксенотрансплантатів.
Показані зразки забарвлювання для ЕОЇ В1 ксенотрансплантатів клітинних ліній НДРЛ (А), карциноми ендометрію (В) і карциноми шийки матки (С). Зразки НДРЛ показали ступінь і рівномірність забарвлювання такі, як 2-3 однорідна або 2 однорідна, карциноми ендометрію 2 неоднорідна/3 фокальна, раку шийки матки З однорідна.
Фігура 23. Посібник з автоматизованого забарвлювання контрольних зразків тканин.
Забарвлені зразки, використовувані для негативного (стравохід 0) і позитивного контролю (слинна залоза 1-2 неоднорідна, легені 2 однорідна, підшлункова залоза З однорідна), показані підготовленими для автоматизованої ІГХ.
Фігура 24. Посібник з автоматизованого забарвлювання пухлинних тканин. Типові зразки забарвлювання рівня 3, рівня 2 і рівня 1 показані на контрольній тканині підготовленими для автоматизованої ІГХ.
Фігура 25. Посібник з автоматизованого забарвлювання пухлинних тканин. Типові зразки забарвлювання рівня 3, рівня 2 і рівня 1/ негативного показані на контрольній тканині підготовленими для автоматизованої ІГХ.
ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Даний винахід належить до способів підвищення ефективності або ймовірності відповіді на лікування раку, що характеризується надлишковою експресією БОЇВ. Даний винахід заснований на відкритті існування динамічного діапазону експресії ЕОЇ В1 у пухлинній тканині й збільшення чутливості пухлини з підвищеним рівнем експресії РОЇ В1 до терапії анти-ЕОЇ В1 антитілами або анти-РОЇ В1 імунокон'югатами. Нами також було виявлені відмінності між автоматизованими й ручними способами аналізу чутливості й виявлення динамічних діапазонів.
Додатково передбачені набори, що включають один або більшу кількість реагентів, використовуваних для практичного втілення способів згідно з винаходом.
І. Визначення
Для полегшення розуміння суті даного винаходу, нижче визначається ряд термінів і виразів.
Термін "рецептор фолієвої кислоти 1 людини" або "РОЇ 81", використовуваний у даному документі, належить до будь-якого нативного людського БОЇ А!, якщо не зазначене інше.
Термін "РОЇ В1" належить до "повнорозмірних" необроблених РОЇ ВІ, а також до будь-якої форми ЕОЇ А, одержаної в результаті процесінгу всередині клітини. Термін також включає варіанти БОЇ 21, що природно зустрічаються, наприклад сплайс-варіанти, алельні варіанти й ізоформи. Поліпептиди РОЇ В1, описані в даному документі, можуть бути виділені з різних джерел, наприклад з людських тканин різних типів, або з іншого джерела, або одержані за допомогою рекомбінантних або синтетичних способів. Приклади послідовностей ГЕО В1 включають, але не обмежуються номерами МСВІ Р15328, МР 001092242.1, ААХ29268.1,
ААХЗ37119.1, МР 057937.1і МР 057936.1 і зазначені в 5ЕО ІО Мо: 1 і 2.
Термін "підвищена експресія" РОЇ ВТ належить до зразка, що показує підвищені рівні бо експресії ЕОЇ В1. В одному прикладі експресія РОЇ В1 вимірюється за допомогою ІГХ і дається оцінка інтенсивності забарвлювання або оцінка рівномірності забарвлювання зразка в порівнянні з контрольною групою (наприклад, відкаліброваних зразків), шляхом використання визначених значень (наприклад, тестовому зразку надається значення інтенсивності З, якщо інтенсивність є порівнянною з рівнем З каліброваного зразка, або тестовому зразку надається значення інтенсивності 2, якщо інтенсивність є порівнянною з рівнем 2 каліброваного зразка).
Наприклад, показник 1, 2, З ії З. або вище, визначений за допомогою імуногістохімії показує підвищену експресію ЕОЇ В1. Рівномірність забарвлювання, яка може бути неоднорідною або однорідною, також свідчить про підвищену експресію РОЇ Н1. Інтенсивність забарвлювання й оцінки однорідності забарвлювання можуть бути використані окремо або в комбінації (наприклад, 2 однорідна, 2 неоднорідна, З однорідна, З неоднорідна тощо). В іншому прикладі підвищення рівня експресії РОЇ 21 може бути визначене шляхом виявлення його збільшення щонайменше в 2 рази, або щонайменше в З рази, або щонайменше в 5 разів у порівнянні з контрольними значеннями (наприклад, рівень експресії в тканині або клітині суб'єкта без раку або суб'єкта що має рак, не викликає підвищення значень ЕОЇ А1).
Термін "еталонний зразок" може бути використаний для кореляції й порівняння результатів, одержаних від досліджуваного зразка за допомогою способів, описаних у винаході. Еталонними зразками можуть бути клітини (наприклад, клітинні лінії, конгломерати клітин) або тканини. Рівні
ЕОЇ В1 в "еталонному зразку" можуть показувати абсолютні або відносні значення, знаходитися всередині діапазону значень, брати мінімальне й/або максимальне значення, середнє значення й/або медіанне значення ЕБОЇН1. Способи діагностики згідно з винаходом включають порівняння рівнів експресії РОЇ В1 у зразку, який тестують, з "референтними значеннями". У деяких варіантах втілення референтне значення відповідає рівню експресії ЕРОЇВ1 в еталонному зразку. Референтне значення може бути заздалегідь заданим значенням, а також може бути визначене з еталонних зразків (наприклад, контрольних біологічних зразків), досліджуваних паралельно з тестовими зразками. Референтне значення може бути одним граничним значенням, наприклад медіанним або середнім, або діапазоном значень, таким, як довірчий інтервал. Референтні значення можуть бути встановлені для різних підгруп осіб, таких, як особи, схильні до раку, особи, що мають рак на ранніх або пізніх стадіях, особи чоловічої й/або жіночої статі або особи під час проходження антиракової терапії. Приклади нормальних еталонних зразків або значень, і позитивних еталонних зразків або значень, описані в даному документі.
У деяких варіантах втілення еталонний зразок являє собою зразок здорової тканини, зокрема відповідної тканини, яка не уражена раковою пухлиною. Цей тип еталонних зразків називається зразками для негативного контролю. В інших варіантах втілення еталонний зразок являє собою зразок пухлинної тканини, яка експресує БОЇ В1. Цей тип еталонних зразків називається зразками для позитивного контролю. Зразки для позитивного контролю також можуть бути використані як індикатор порівняння для перевірки однорідності (неоднорідна проти однорідної) і/або ступеня (1, 2, 3, 3.5) інтенсивності забарвлювання, яка корелює з рівнем експресії БОЇВ. Зразки для порівняльного позитивного контролю також називають каліброваними еталонними зразками, які використовуються для визначення динамічного діапазону інтенсивності або однорідності забарвлювання. Як показано в прикладах 1-9, еталонні зразки, які не експресують РОЇ В1, включають тканини стравоходу людини; зразки з низьким рівнем експресії БОЇВ! включають тканини слинної залози (зокрема, проміжних проток) і легенів (зокрема дихального епітелію), зразки тканин з високим рівнем експресії
ЕОЇ В включають тканини підшлункової залози (зокрема, клітини проток). Клітинні лінії з низькою експресією включають, але не обмежуються ОМСАНЗ і Т470, лінії з помірною експресією включають, але не обмежуються ними, 5МУ620, І2ВОМ-1, УБОЗ і лінії з високою експресією включають, але не обмежуються ними, КВ і ІЖВОМ1. Особливо бажаними зразками для позитивного контролю високої експресії БОЇ Н1 є лінії клітин, постійно або тимчасово трансфікованих фолатним рецептором 1 (наприклад, 300.19/ЕН81). Відповідні позитивні й негативні контрольні рівні РОЇ ВТ для конкретного виду раку можуть бути визначені шляхом вимірювання рівнів РОЇ В1 у одного або у декількох відповідних суб'єктів, і такі контрольні рівні можуть бути прив'язані до конкретних популяцій пацієнтів (наприклад, контрольний рівень може відповідати віковій групі, так що порівняння може бути виконане між рівнями ЕОЇ В1 зразків, одержаних від суб'єктів певного віку, і контрольними рівнями для конкретного типу захворювання, фенотипу або відсутності таких у певній віковій групі. Такі контрольні рівні можуть бути прив'язані до конкретних способів, використовуваних для вимірювання рівня
ЕОГВ1 у біологічних зразках (наприклад, імунологічних і ін. аналізів), рівні РОЇ ВІ можуть відрізнятися через специфічну методику, на якій ці вимірювання базуються.
Термін "первинне антитіло" належить до антитіла, яке специфічно зв'язується з антигеном білка-мішені в зразку тканини. Первинне антитіло, як правило, є першим антитілом, використовуваним у процедурі імуногістохімічного (ІГХ) аналізу. В одному варіанті втілення первинним антитілом є єдине антитіло, використовуване в процедурі ІГХ. Термін "вторинне антитіло" належить до антитіла, яке специфічно зв'язується з первинним антитілом, утворюючи місток між первинним антитілом і наступним реагентом, якщо такі є. Первинне антитіло, як правило, є другим антитілом, використовуваним у процедурі імуногістохімічного аналізу. "Зразок" або "біологічний зразок" згідно з даним винаходом має біологічне походження в конкретних варіантах втілення, одержаний з еукаріотичних організмів. У кращих варіантах втілення зразок являє собою зразок тканини людини, але на практиці даного винаходу також можуть бути використані зразки тканини тварини. Необмежуючі джерела зразків для використання в даному винаході включають, наприклад, щільні тканини, аспірати, одержані під час біопсії, асцитичну рідину, рідинні екстракти, кров, плазму, сироватку, спинномозкову рідину, лімфоїдну рідину, зовнішні ділянки шкіри, дихального, кишкового й сечостатевого трактів, сльози, слину, молоко, пухлини, органи, клітинні культури й/або компоненти клітинної культури.
Даний винахід є особливо ефективним для зразків ракової тканини, які звичайно включають зразки щільних тканин, або різних рідин організму, таких як асцитична рідина, де кількість доступних матеріалів є невеликою. Даний спосіб може бути використаний для вивчення аспектів експресії ЕОЇ В1 або стану зразка, у тому числі, але не обмежуючись цим, порівняння різних типів клітин або тканин, порівняння різних стадій розвитку й виявлення або визначення присутності й/або типу захворювання або аномалії.
Для цілей даного винаходу, поняття "зріз" зразка тканини належить до одиничної частини або визначеної кількості зразка тканини, наприклад, до тонкого шару тканини або клітин, вирізаних зі зразка тканини. Необхідно розуміти, що декілька зрізів тканинних зразків можуть бути одержані й піддані аналізу відповідно до даного винаходу. У деяких випадках вибрана частина або зріз тканини складається з однорідної популяції клітин. В інших випадках вибрана частина включає ділянку тканини, наприклад, як необмежуючий приклад просвіт. Вибрана частина може складатися, наприклад, з однієї клітини або з двох клітин, або може представляти багато тисяч клітин. У більшості випадків процес збору клітин є важливим, і в той час як винахід описаний для використання з метою детекції клітинних компонентів, спосіб також може бути використаний для виявлення неклітинних компонентів організму (наприклад, як необмежуючий приклад, розчинних у крові компонентів).
Під "кюорелюванням" або "кореляцією" мається на увазі порівняння, у будь-якому разі, продуктивності й/або результатів першого аналізу із продуктивністю й/або результатами другого аналізу. Наприклад, можна використовувати результати першого аналізу при проведенні другого аналізу й/(або можна використовувати результати першого аналізу, щоб визначити, чи варто проводити другий аналіз і/або чи можна порівнювати результати першого аналізу з результатами другого аналізу. В одному варіанті втілення підвищена експресія РОЇ В1 корелює зі збільшенням імовірності ефективності ЕОЇ В1-таргетованої протиракової терапії.
Термін "антитіло" означає молекулу імуноглобуліну, яка розпізнає й специфічно зв'язується з мішенню, такою як білок, поліпептид, пептид, вуглевод, полінуклеотид, ліпід або комбінацією вищевказаного через, щонайменше, один сайт розпізнавання антигена усередині варіабельного регіону молекули імуноглобуліну. Використовуваний у даному документі термін "антитіло" включає інтактні поліклональні антитіла, інтактні моноклональні антитіла, фрагменти антитіл (наприклад, аб, Раб, Б(абБ)2 і Рму-фрагменти), одноланцюгові Ем (5сЕм) мутанти, мультиспецифічні антитіла, такі як біспецифічні антитіла, одержані з, щонайменше, двох інтактних антитіл, хімерні антитіла, гуманізовані антитіла, людські антитіла, складені білки, які включають частину антитіла, що визначає антиген і будь-які інші модифіковані молекули імуноглобуліну, що включають сайт розпізнавання антигена за умови, що антитіла володіють очікуваною біологічною активністю. Антитіло може належати до будь-якого з п'яти основних класів імуноглобулінів: ІА, дО, ІДЕ, да і ІМ, або їх підкласів (ізотипів) (наприклад, да, дае,
ІчаЗ, да, ІДА1 і ІДА2), що базуються на ідентичності їх важких ланцюгів константних доменів, називаних альфа, дельта, епсилон, гама й мю, відповідно. Різні класи імуноглобулінів володіють різними й добре відомими структурними субодиницями й тривимірними конфігураціями.
Антитіла можуть бути відкритими або кон'югованими з іншими молекулами, такими як токсини, радіоїзотопи тощо. "Блокувальне" антитіло або "антитіло-антагоніст" являє собою антитіло, яке інгібує або зменшує біологічну активність антигена, з яким воно зв'язується, наприклад, БОЇ В1. У конкретному варіанті втілення блокувальні антитіла або антитіла-антагоністи значною мірою або повністю інгібують біологічну активність антигена. Очікувана біологічна активність знижується на 10 95, 20 95, 30 У, 50 Фо, 70 9, 80 У, 90 9», 95 95 або навіть на 100 95.
Термін "анти-ЕОЇ Н1 антитіло" або "антитіло, яке зв'язується ЕОЇ В1" належить до антитіла, яке здатне зв'язувати РОЇВ з достатньою афінністю. Дане антитіло є ефективним як діагностичний і/або терапевтичний засіб для прицільного впливу на РОЇ Н1. Ступінь зв'язування анти-ЕОЇ В1 антитіла з неспорідненим, не ЕОЇ Н1 білком становить менше, ніж приблизно 10 95 від ступеня зв'язування антитіла з БОЇАї!, наприклад, виміряної за допомогою радіоїмуноаналізу (РІА). У деяких варіантах втілення антитіло, яке зв'язується з БОЇ В1 має константу дисоціації (Ка) « 1 мкМ, «100 нМ, «х 10 нМ, «х 1 нМ або « 0,1 нМ. Приклади анти-ЕОЇ В1 антитіл відомі в даній галузі й описані в патенті США Мо 2012/0009181, включеному в даний документ за допомогою посилання.
Термін "фрагмент антитіла" означає частину інтактного антитіла й належить до антиген визначальних варіабельних регіонів інтактного антитіла. Приклади фрагментів антитіла включають, але не обмежуються ними, Раб, Раб, К(аб)2 і Ем фрагменти, лінійні антитіла, одноланцюгові антитіла й мультиспецифічні антитіла, утворені із фрагментів антитіл. "Моноклональне антитіло" належить до однорідної популяції антитіл, що беруть участь у високоспецифічному розпізнаванні й зв'язуванні з однією антигенною детермінантою або епітопом. Цим вони відрізняються від поліклональних антитіл, які звичайно включають різні антитіла, спрямовані проти різних антигенних детермінант. Термін "моноклональне антитіло" включає інтактні й повнорозмірні моноклональні антитіла, а також фрагменти антитіл (наприклад, Раб, Раб", Е(аб)2, Ем), одноланцюгові (5сСЕм), мутанти, складені білки, які включають частини антитіл і будь-які інші модифіковані молекули імуноглобуліну, що включають сайт розпізнавання антигена. Крім того, поняття "моноклональне антитіло" належить до антитіл, одержаних будь-якою кількістю способів, включаючи, але не обмежуючись ними, використання гібридом, селекцію фагів, рекомбінантну експресію й трансгенні тварини.
Терміни "епітоп" або "антигенна детермінанта" використовуються взаємозамінно й належать до тієї частини антигена, яка може розпізнаватися й специфічно зв'язується з конкретним антитілом. Якщо антиген являє собою поліпептид, епітопи можуть бути сформовані із суміжних і несуміжних амінокислот зіставленням при третинному складанні білка. Епітопи, що формуються із суміжних амінокислот, як правило, зберігаються під час денатурації білка, тоді як епітопи, утворені третинним складанням звичайно втрачаються під час денатурації білка. Епітоп звичайно включає щонайменше три, а частіше, щонайменше, 5 або 8-10 амінокислот в унікальній просторовій конформації. "Афінність зв'язування" звичайно належить до інтенсивності суми нековалентних взаємодій між одним сайтом зв'язування молекули (наприклад, антитілом) і його партнером по зв'язуванню (наприклад, антигеном). Якщо не зазначене інше, при використанні в даному документі, поняття "афінність зв'язування" належить до внутрішньої афінності зв'язування, яка відображує взаємодію 1:11 між членами пари зв'язування (наприклад, антитілом і антигеном).
Афінність молекули Х щодо свого партнера У звичайно може бути представлена за допомогою константи дисоціації (Ка). Афінність може бути виміряна загальними способами, відомими в даній галузі техніки, включаючи описані в даному документі. Низькоафінні антитіла звичайно зв'язуються з антигеном повільно й, як правило, легко дисоціюють, тоді як антитіла з високою афінністю звичайно зв'язуються з антигеном швидше й, як правило, залишаються зв'язаними довше. Різні способи вимірювання афінності зв'язування добре відомі в даній галузі техніки, будь-який з них може бути використаний для цілей даного винаходу. Конкретні демонстративні варіанти втілення описані далі. "Або краще" при використанні в даному документі належить до позначення афінності зв'язування й належить до сильного зв'язку між молекулою і її партнером по зв'язуванню. "Або краще" при використанні в даному описі належить до сильного зв'язку, представленого меншим чисельним значенням Ка. Наприклад, у випадку, коли антитіло володіє спорідненістю до антигена "0,6 нМ або краще", спорідненість антитіла до антигена дорівнює «0,6 нМ, тобто 0,59
НМ, 0,58 нМ, 0,57 нМ тощо, або будь-якому значенню менше 0,6 нМ.
Фрази "по суті аналогічний" або "по суті такий самий", при використанню в даному документі, означає досить високий ступінь подібності між двома числовими значеннями (звичайно одне пов'язане з антитілом згідно з винаходом, інше пов'язане з референсним антитілом / антитілом для порівняння), так що фахівцю в даній галузі техніки необхідно враховувати різницю між двома значеннями, яка може бути малою або взагалі не нести біологічної й/(або статистичної значущості у контексті вимірювання зазначених значень біологічних характеристик (наприклад, значення Ка). Різниця між двома зазначеними значеннями становить менше ніж приблизно 60 50 965, менше ніж приблизно 40 95, менше ніж приблизно 30 95, менше ніж приблизно 20 95 або менше ніж приблизно 10 95 залежно від значення для референсного антитіла/антитіла для порівняння.
Поліпептид, антитіло, полінуклеотид, вектор, клітини або композиції, які є "виділеними", являють собою поліпептид, антитіло, полінуклеотид, вектор, клітини або композиції, що перебувають у формі, яка не зустрічається в природі. Виділені поліпептиди, антитіла, полінуклеотиди, вектори, клітини або композиції включають ті, які були очищені настільки, що далі вони існують в іншій формі порівняно з тією, у якій вони зустрічаються в природі. У деяких варіантах втілення виділені антитіло, полінуклеотид, вектор, клітини або композиції є, по суті, чистими.
Використовуваний у даному документі термін "по суті чистий" належить до матеріалу, який, щонайменше чистий на 5095 (тобто без забруднень) щонайменше чистий на 90 965, щонайменше чистий на 95 95, щонайменше чистий на 98 95 або щонайменше чистий на 99 95.
Термін "імунокон'югат" або "кон'югат", використовуваний у даному документі, належить до сполуки або її похідного, які зв'язані з агентом, що зв'язується з клітиною (наприклад, анти-
ЕОЇ ВІ антитіла або його фрагмента) і визначається загальною формулою С-1-А, де С - цитотоксин, І. - лінкер, і А - агент, що зв'язується з клітиною, або анти-РОЇ НІ антитіло або фрагмент антитіла. Імунокон'югати також можуть бути визначені загальною формулою у зворотному порядку: А-Ї -0. "Лінкер" означає будь-яку хімічну групу, яка здатна зв'язувати сполуку, як правило, лікарський засіб, такий як майтансиноїд, з агентом, що зв'язується з клітиною, таким як анти-
ЕОЇ В1 антитіло або його фрагмент, стабільним ковалентним способом. Лінкери можуть бути чутливими або бути практично стійкими до кислотно-індукованого розщеплення, розщеплення, індукованого світлом, розщеплення, індукованого пептидазою, розщеплення, індукованого естеразою й розщеплення дисульфідного зв'язку, в умовах, за яких сполука або антитіло залишається активним. Придатні лінкери добре відомі в даній галузі техніки й включають, наприклад, дисульфідні групи, тіоефірні групи, кислотно-лабільні групи, фотолабільні групи, пептидазо-лабільні групи й естеразо-лабільні групи. Лінкери також включають заряджені лінкери і їх гідрофільні форми, відомі в даній галузі техніки, як описано вище.
Терміни "рак" і "раковий" належать або описують фізіологічний стан у ссавців, у якому
Зо популяція клітин характеризується нерегульованим клітинним ростом. Приклади раку включають, але не обмежуються ними, карциному, лімфому, бластому, саркому й лейкоз. Більш конкретні приклади таких видів раку включають плоскоклітинний рак, дрібноклітинний рак легенів, недрібноклітинний рак легенів, аденокарциному легенів, плоскоклітинний рак легенів, рак черевної порожнини, гепатоцелюлярний рак, рак шлунково-кишкового тракту, рак підшлункової залози, гліобластому, рак шийки матки, рак яєчників, рак печінки, рак сечового міхура, гепатому, рак молочної залози, рак товстої кишки, колоректальний рак, карциному ендометрію або матки, карциному слинної залози, рак нирок, рак печінки, рак передміхурової залози, рак вульви, рак щитоподібної залози, карциному печінки й різні типи раку голови й шиї.
Терміни "пухлина" і "новотвір" належать до будь-якої маси тканини, яка в результаті надмірного клітинного росту або проліферації може бути як доброякісною (нераковою), так і злоякісною (раковою), включаючи передракові ураження тканин.
Терміни "ракова клітина", "клітина пухлини" і їх граматичні еквіваленти належать до загальної популяції клітин, одержаних з пухлини або передракових уражень, у тому числі й неонкогенних клітин, які становлять більшу частину популяції пухлинних клітин, і онкогенних стовбурних клітин (ракових стовбурних клітин). Термін "клітина пухлини", при використанні в даному документі, буде змінений на термін "неонкогенний", коли мова йде лише про пухлинні клітини, не здатні до відновлення й диференціювання, щоб відрізнити ці пухлинні клітини від ракових стовбурних клітин.
Термін "суб'єкт" належить до будь-якої тварини (наприклад, ссавця), включаючи, але не обмежуючись ними, людей, приматів, крім людини, гризунів тощо, яка повинна одержати конкретне лікування. Як правило, термін "суб'єкт" і "пацієнт" використовуються в даному документі взаємозамінно у відношенні суб'єкта-людини.
Призначення "у комбінації з" одним або більшою кількістю додаткових терапевтичних агентів включає одночасне (спільне) і послідовне введення в будь-якому порядку.
Термін "фармацевтична композиція" належить до препарату, який знаходиться у формі, що забезпечує біологічну активність діючої речовини для забезпечення його ефективності, і яка не включає додаткових компонентів, які Є неприйнятно токсичними для суб'єкта, якому необхідно вводити композицію. Така композиція може бути стерильною.
"Ефективна кількість" антитіла, як описано в даному документі, означає кількість, достатню для здійснення специфічно заявленого призначення. "Ефективна кількість" може бути визначена емпірично й рутинним способом щодо заявленого призначення.
Термін "тгерапевтично ефективна кількість" належить до кількості антитіла або іншого лікарського засобу для "лікування" захворювання або розладу в суб'єкта або ссавця. У випадку раку, терапевтично ефективна кількість лікарського засобу може зменшити число ракових клітин; зменшити розмір пухлини; інгібувати (тобто сповільнити до певної міри й, у певному варіанті втілення, зупинити) інфільтрацію ракових клітин у периферичні органі; інгібувати (тобто сповільнити до певної міри й, у певному варіанті втілення, зупинити) розвиток метастазів пухлини; інгібувати, до певної міри, ріст пухлини й/або полегшити до певної міри один або більше симптомів, пов'язаних з раком. Див. далі визначення поняття "лікування". Залежно від здатності препарату відповідним чином запобігати росту й/або знищувати існуючі ракові клітини, він може бути цитостатичним і/або цитотоксичним. У деяких варіантах втілення визначення підвищених рівнів ОЇ В1 дає можливість призначати знижену дозу ЕОЇ В1-таргетної терапії для досягнення такого ж терапевтичного ефекту, який був би при призначенні більш високих доз. "Кількість, ефективна для профілактики" належить до ефективної кількості, у дозах і протягом періодів часу, необхідних для досягнення бажаного профілактичного результату. Звичайно, але не обов'язково, виходячи з того, що профілактична доза використовується до початку захворювання або на його ранній стадії, профілактично ефективна кількість буде меншою, ніж терапевтично ефективна кількість.
Термін "сприятливо реагувати" звичайно належить до викликання в суб'єкта сприятливого стану. Що стосується лікування раку, термін належить до забезпечення в суб'єкта терапевтичного ефекту. Позитивний терапевтичний ефект при лікуванні раку може бути виміряний декількома способами (див. М.А. М/ерег, у). Мисі. Мей. 50:11 5-105 (2009)). Для оцінки терапевтичної ефективності антиракової терапії можуть бути використані, наприклад, оцінка інгібування росту пухлини, експресії молекулярних маркерів, експресії сироваткових маркерів і молекулярні способи візуалізації. У відношенні інгібування росту пухлини, згідно зі стандартами
МС, значення співвідношення Т/С « 42 95 є мінімальним рівнем протипухлинної активності. Т/С -10 90 вважається високим рівнем протипухлинної активності, при тому, що формула визначення Т/С виглядає, як: Т/С (95) Медіана об'єму пухлини, що піддається терапії/Медіана об'єму пухлини, використовуваної для контролю х 100.
Термін "мітка", використовуваний у даному документі, належить до виявлюваної сполуки або композиції, кон'югованої з антитілом безпосередньо або опосередковано, таким чином, що утворюється "мічене" антитіло. Мітка може виявлятися сама по собі (наприклад, радіоізотопні або флуоресцентні мітки) або, у випадку ферментної мітки, вона може каталізувати хімічне змінення субстрату сполуки або композиції, яке потім може бути виявлене. "Хіміотерапевтичний засіб" являє собою хімічну сполуку, використовувану для лікування раку, незалежно від її механізму дії. Класи хіміотерапевтичних засобів включають, але не обмежуються ними: алкілуючі агенти, антиметаболіти, рослинні алкалоїди, що блокують мітотичне веретено, цитотоксичні / протипухлинні антибіотики, інгібітори топоізомерази, антитіла, фотосенсибілізатори й інгібітори кіназ. Хіміотерапевтичні засоби включають сполуки, використовувані для "таргетної терапії" і традиційної хіміотерапії.
Такі терміни, як "терапія" або "лікування" або "лікувати" або "полегшення стану" або "полегшити стан" належать до 1) терапевтичних заходів, що дозволяють вилікувати, сповільнити розвиток, зменшити симптоми й/або зупинити прогресування діагностованого патологічного стану або розладу й 2) профілактичних або превентивних заходів, які запобігають іабо сповільнюють розвиток можливого патологічного стану або розладу. Таким чином, ті, хто потребує лікування, включають тих, хто вже має розлад; тих, хто схильні до розладу й тих, у кого необхідно запобігти розладам. У деяких варіантах втілення суб'єкт вважається успішно "вилікуваним" від раку у відповідності зі способами згідно з даним винаходом, якщо він демонструє одне або більш із наступного: зменшення кахексії, збільшення тривалості життя, подовження часу до прогресування пухлини, зниження пухлинної маси, зниження пухлинної маси й/або продовження відрізка часу до виникнення метастазів пухлини й часу до виникнення рецидиву пухлини, відповідь пухлини на лікування, повну відповідь, часткову відповідь, стабілізацію захворювання, усунення прогресування захворювання, виживаність без прогресування захворювання (ВБП), загальну виживаність (ЗВ); кожний з параметрів оцінений згідно зі стандартами, встановленими Національним інститутом раку й Адміністрацією США по харчових продуктах і лікарських речовинах для затвердження нових лікарських засобів. Див.
УЧоНнпзоп еї аї., (2003) 9. Сіїп. Опсої. 21 (7):1404-1411.
"Виживаність без прогресування" (ВБП), також називана "часом до прогресування пухлини" (ЧДП) указує тривалість часу протягом лікування й після нього, поки пухлина не росте.
Виживаність без прогресування захворювання включає відрізок часу, за який пацієнти зазнавали повну або часткову відповідь на лікування, а також відрізок часу, за який пацієнти зазнавали стабілізацію захворювання. "Період ремісії" (ПР) належить до відрізка часу протягом лікування й після нього, протягом якого пацієнт не зазнає ознак захворювання. "Загальна виживаність" (ЗВ) належить до продовження очікуваної тривалості життя в порівнянні з особами або пацієнтами, яких не піддавали будь-якому впливу або лікуванню.
При використанні в даному описі винаходу й формулі винаходу, форми однини включають форми множини, якщо з контексту явно не випливає інше.
Необхідно розуміти, що описаний у даному варіанті втілення термін "такий, що включає", в аналогічних варіантах втілення описується в термінах "такий, що складається з" і/або « такий, що по суті складається 3".
Термін "і/або", при використанні у фразі, такий як "А і/або Б" у даному описі, включає "А і Б", "А або Б", "А" і "Б". Аналогічно, термін "і/або", використовуваний у фразі типу "А, Б і/або В" призначений для охоплення кожного з наступних варіантів: А, Б і В; А, Б або В; А або В; А або Б;
Бабов;АїЇВ;А її Б, Б і В; А (окремо), Б (окремо) і В (окремо).
ІЇ. Біологічні зразки
Біологічні зразки часто фіксують за допомогою фіксатора. Для цієї мети звичайно використовуються альдегідні фіксатори, такі як формалін (формальдегід) і глютаральдегід.
Зразки тканин фіксуються за допомогою інших способів фіксації, таких як занурення в спирт (Ванйога і Коріп5Кі, У. Нівоспет. Суїоспет. (1986) 34:1095). Використовувані зразки також можуть бути залиті парафіном. В одному варіанті втілення зразки тканини фіксуються у формаліні й заливаються парафіном (ФФЗП). В іншому варіанті втілення блок ФФЗП забарвлюється гематоксиліном і еозином до вибору однієї або більше його частин для проведення аналізу з метою вибору конкретної зони (зон) зразка ФФЗП. Способи підготовки блоків тканин із цих частин зразків використовувалися в попередніх ІГХ дослідженнях різних факторів прогнозу й/(або добре відомі фахівцям у даній галузі техніки (див., наприклад,
Зо Арропаапго єї аІ., Ат У Сіїп Раїйої. 1990 Мау; 93 (5):698-702; Аїгей єї аї., Агсй Биг9у. 1990
Уап.125 ():107-13).
Коротко, всі інтактні органи або тканини можуть бути розрізані на досить дрібні зразки й витримані в різних фіксаторах (наприклад, формалін, спирт тощо) протягом різних періодів часу, поки тканина не "зафіксується". Можуть бути одержані зразки практично будь-якої інтактної тканини, хірургічно видаленої з організму. Зразки можна розрізати на відносно невеликі фрагменти, які розміщують в обладнанні, що звичайно використовується в гістопатологічних лабораторіях. Розмір фрагментів зразка звичайно становить від декількох міліметрів до декількох сантиметрів.
І. Кон'югати детекторних антитіл
Даний винахід також належить до антитіл проти ЕОЇ ВІ, звичайно моноклонального типу, які зв'язані з, щонайменше, одним агентом з утворенням кон'югата детекторного антитіла. З метою підвищення ефективності використання молекул антитіл як діагностичних, їх зв'язують звичайним або ковалентним зв'язком або утворюють комплекс, щонайменше, із однією цільовою молекулою або фрагментом. Така молекула або фрагмент може бути, не обмежуючись цим, щонайменше, однією репортерною групою. Репортерна група визначається як будь-який фрагмент, який може бути виявлений за допомогою аналізу. Необмежуючі приклади репортерних груп, кон'югованих з антитілами включають ферменти, радіоактивні мітки, гаптени, флуоресцентні мітки, фосфоресціюючі молекули, хемілюмінесцентні молекули, хромофори, люмінесцентні молекули, молекули, що проявляють фотоафінність, забарвлені
БО частки й/або ліганди, такі як біотин.
Будь-який клітинно-зв'язувальний агент (наприклад, антитіло або поліпептид) з достатньою селективністю, специфічністю або афінністю може бути використаний як основа для виявлення
РОЇВ поліпептиду. Такі властивості агента можуть бути оцінені за допомогою загальноприйнятих імунологічних скринінгових способів, відомих фахівцям у даній галузі техніки. Сайти для зв'язування з біологічно активними молекулами в молекулі антитіла, на додаток до канонічних антигензв'язуючих сайтів, включають сайти, які можуть зв'язуватися з антигеном, що знаходяться в регіоні варіабельного домену. Крім того, варіабельний домен залучений у процес самозв'язування антитіла (Кап есеї а!., 1988) і включає епітопи (ідіотопи), розпізнавані антиантитілами (КопПіег єї а!., 1989).
Деякі приклади кон'югатів, одержаних при зв'язуванні з білками (наприклад, антитіла), включають кон'югати, в яких агент, що зв'язує білок (наприклад, антитіло) зв'язаний з виявлюваною міткою. "Виявлювані мітки" є сполуками й/або елементами, які можуть бути виявлені завдяки їх особливим функціональним властивостям і/або хімічним характеристикам, використання яких дозволяє антитілу, до якого вони приєднані, бути виявленим і/або, за необхідності, кількісно оціненим.
У даній галузі техніки відома велика кількість відповідних візуалізуючих агентів, як відомі й способи їх кріплення до антитіл (див., наприклад, патенти США МоМо 5021236;. 4938948 і 4472509, кожний з яких включений у даний опис у вигляді посилання). Наприклад, у якості візуалізуючих фрагментів, можуть бути використані парамагнітні іони; радіоактивні ізотопи; флюорохроми; речовини, що виявляються за допомогою ЯМР і/або речовини для візуалізації за допомогою рентгенівського випромінювання.
Приклади флуоресцентних міток, що припускаються для використання їх як кон'югатів для зв'язування з білками (наприклад, антитілами), включають Аіїеха 350, Аіеха 430, Аїеха 488, АМСА, ВОБІРМ 630/650, ВОБІРМ 650/665, ВОБІРМ-РЇ, ВОБІРУ-НбО, ВОБІРУ-ТМА, ВОБІРУ-
ТАХ, Сазсаде Вішє, Суз3з, Субб-БАМ, Будні 488, флуоресцеїнізотіоціанат, зелений флуоресцентний білок (СЕР), НЕХ, 6-ООЕ, Огедоп Стееп 488, Огедоп Стеєп 500, Огедоп Стеєп 514, Расіїїс Вісе, фікоеритрин, ВЕС, родамін зелений, родамін червоний, тетраметилродамін (ТМЕ), Вепоадгарпіп, ВОХ, ТАМВА, ТЕТ, тетраметилродамін, Техаз5 Ней і похідні цих міток (наприклад, галогеновані аналоги, модифіковані ізотіоціанатом або іншим кон'югуючим лінкером тощо). Прикладом радіоактивної мітки є тритій.
Виявлювані кон'югати, що зв'язуються з білками (наприклад, антитіла), розглянуті в даному винаході, включають призначені для використання іп міо, де антитіло зв'язане із удруге зв'язаним лігандом і/або ферментом (ферментна мітка), які будуть забарвлювати продукт при контакті із хромогенним субстратом. Приклади придатних ферментів включають уреазу, лужну фосфатазу, пероксидазу (хрону) і/або оксидазу глюкози. Кращими лігандами вторинного зв'язування є сполуки біотину й/або авідину й стрептавідину. Використання таких міток добре відомо фахівцям у даній галузі техніки й описане, наприклад, у патентах США МоМо 3817837, 3850752, 3939350, 3996345, 4277437, 4275149 і 4366241, кожний з яких включений у даний
З0 документ у вигляді посилання.
Молекули, що включають азидогрупи, також можуть бути використані з утворенням ковалентних зв'язків з білками через реактивні нітренові інтермедіати, які генеруються ультрафіолетовим світлом низької інтенсивності (РойМег 4. Наїєу, 1983). Зокрема, 2- і в-азидові аналоги пуринових нуклеотидів були використані як сайт-орієнтовані фотозонди для ідентифікації нуклеотидних зв'язувальних білків у сирих клітинних екстрактах (Оумепз5 8 Наїеу, 1987; Атепоп еї аї!., 1985). 2- і 8-азидонуклеотиди також використовувалися для відображення нуклеотидних зв'язувальних доменів очищених білків (Кнаїсоп еї аї., 1989; Кіпд еї аї., 1989 і
Опоїакіа еї а!., 1989) і можуть бути використані як агенти зв'язування антитіл.
У даній галузі техніки відомі декілька способів приєднання або кон'югації антитіла до його кон'югованого фрагмента. Деякі зі способів приєднання включають використання комплексів хелатів металів за допомогою, наприклад, органічного хелатуючого агента, такого як ангідрид діетилентриамінпентаоцтової кислоти (ОТР А); етилентриамінтетраоцтова кислота, М-хлор-р- толуолсульфонамід і/або тетрахлор-За-ба-дифенілгліколурил-3, прикріпленого до антитіла (патент США МоМо 4472509 і 4938948, кожний з яких включений у даний опис у вигляді посилання). Моноклональні антитіла також можуть бути піддані взаємодії з ферментом за присутності зв'язувального агента, такого як глутаральдегід або періодат. Білокзв'язувальні кон'югати (наприклад такі, що зв'язують білок з антитілом) з маркерами флуоресцеїну готують за присутності цих зшиваючих агентів або шляхом взаємодії з ізоціанатом. У патенті США Мо 4938948, візуалізація пухлин молочної залози, наприклад, досягається шляхом використання моноклональних антитіл, коли виявлювані візуалізаційні фрагменти зв'язані з антитілом за допомогою лінкерів, таких як метил-р-гідроксибензимідат або /М-сукцинімідил-3-(4- гідроксифеніл)-пропіонат.
В інших варіантах втілення розглядається дериватизація імуноглобулінів шляхом виборчого введення сульфгідрильних груп в Ес регіон імуноглобуліну за допомогою умов реакції, що не змінюють сайт антитіла. Кон'югати антитіл, одержані за описаною методикою, демонструють покращену довговічність, специфічність і чутливість (патент США Мо 5196066, включений у даний документ у вигляді посилання). Сайт-специфічне кріплення ефекторної або репортерної молекули, при якому репортерна або ефекторна молекула кон'югована з вуглеводним залишком в Ес регіоні, також описане в літературі (О'ЗНаппезвзу єї аї., 1987).
В інших варіантах втілення винаходу імуноглобуліни позначені радіоактивними мітками за допомогою нуклідів, таких як тритій. У додаткових варіантах втілення використовуються наночастки золота (наприклад, розміром від приблизно 0,5 нм до 40 нм) і/або квантові точки (Наумага, Саїїї.).
ІМ. Ферменти й субстрати (Хромагени)
Для виявлення РОЇ 1 передбачається використання субстратів і індикаторів, таких як використовувані як приклад у варіантах втілення, що наводяться нижче.
Пероксидаза хрону (НАР) є ферментом, який спочатку утворює комплекс із перекисом водню, а потім приводить до його розкладання, у результаті чого виділяється вода й атомарний кисень. Як і з багатьма іншими ферментами, НАР і НАР-подібна активності можуть бути інгібовані надлишком субстрату. Комплекс, утворений між НАР і надлишковою кількістю перекису водню є каталітично неактивним і за відсутності донора електронів (наприклад хромогенної речовини) інгібує оборотним способом. Це означає, що надлишок перекису водню й відсутність донора електронів приводить до гасіння ендогенної активності НАР.
В аналітичних системах НАР також може бути використана для перетворення певного субстрату на його активований хромоген, що приводить до зміни кольору. Фермент НАР може бути кон'югований з антитілом, білком, пептидом, полімером або іншою молекулою за допомогою ряду способів. Такі способи відомі фахівцям у даній галузі техніки. Додавання глутаральдегіду в розчин, що включає суміш НАР і антитіл приведе до того, що молекули антитіла будуть більше кон'юговані одна з одною, ніж з ферментом. У двоетапній процедурі
НАР у першу чергу реагує з біфункціональними реагентами. На другому етапі з антитілом змішують тільки активовану НАР, що приводить до набагато більш ефективного мічення без полімеризації. НАР також кон'югує зі (стрепт)авідином шляхом двоетапної глутаральдегідної процедури. Ця форма використовується в процедурах, де субстратом, є, наприклад, Г АВ і
ІЗАВ. Кон'югація з біотином також складається із двох етапів, тому що біотин спочатку необхідно одержати у вигляді його похідних - біотиніл-М-гідроксисукцинімідового естеру або біотингідразиду, перш ніж його можна буде піддавати взаємодії з епсилонаміновими групами ферменту НАР.
З3,3'-діамінобензидин (САВ) є субстратом для ферментів, таких як НЕР, які виробляють
Зо кінцевий продукт коричневого кольору, практично нерозчинний в етанолі й інших органічних розчинниках. Окиснення ЮСАВ також приводить до полімеризації, що приводить до здатності його реагування з тетраоксидом осмію й, таким чином, до збільшення інтенсивності забарвлювання й електронної щільності. З декількох металів і способів, використовуваних для підвищення оптичної щільності полімеризованого ЮАВ, найбільш ефективним, очевидно, є використання хлориду золота в комбінації із сульфідом срібла.
З-аміно-9-етилкарбазол (АЕС) є субстратом для ферментів, таких як НАР. Під час окиснення він утворює кінцевий продукт рожево-червоного кольору, розчинний в етанолі. Таким чином, зразки, оброблені АЕС не слід занурювати в спирт або спиртові розчини (наприклад, гематоксилін Харриса). Замість цього необхідно використовувати водні контрастуючі й заливальні середовища. АЕС, на жаль, схильний до подальшого окиснення, і під впливом яскравого світла його інтенсивність буде зменшуватися. Тому його рекомендується зберігати в темному місці. 4-хлор-1-нафтол (СМ) є субстратом для ферментів, таких як НАР і випадає в осад у вигляді кінцевого продукту синього кольору. Оскільки СМ розчинний в етанолі й інших органічних розчинниках, зразок не повинен дегідратуватися, піддаватися контрастуючому забарвлюванню за допомогою етанолу або заклеюванню покривними стеклами в заливальних середовищах, що включають органічні розчинники. На відміну від ОАВ, СМ має тенденцію дифундувати від місця осадження. р-фенілендіаміну дигідрохлорид/пірокатехін (реактив Ханкера-Яте) є субстратом донора електронів для ферментів, таких як НАР і дає продукт реакції синьо-чорного кольору, нерозчинний у спирті й інших органічних розчинниках. Як і полімеризований САВ, даний продукт реакції може бути зафіксований у розчині осмієвої кислоти. Різні результати були досягнуті при використанні реактиву Ханкера-Яте в імунопероксидазних способах.
Лужна фосфатаза кишечнику теляти (АР) (молекулярна маса 100 кДа) являє собою фермент, який видаляє (шляхом гідролізу) і переносить фосфатні групи органічних складних ефірів шляхом розриву зв'язку Р-0; при цьому короткочасно формується проміжний зв'язок фермент-субстрат. Основними металічними активуючими добавками для АР є Мач--, Мп» і
Сажк.
АР ніколи широко не використовувалася в імуногістохімії до публікації процедури за бо допомогою неміченої лужної фосфатази-антилужної фосфатази (АРААР). Розчинні імунні комплекси, використовувані в цій процедурі, мають молекулярну масу приблизно 560 кДа.
Основною перевагою АРААР процедури в порівнянні з РАР способом є відсутність завад, пов'язаних з активністю ендогенної пероксидази. Через можливе відволікання ендогенної активності пероксидази на РАР забарвлювання, техніка АРААР рекомендується для використання на мазках крові й кісткового мозку. Ендогенна активність лужної фосфатази, одержаної із тканин костей, нирок, печінки й деяких лейкоцитів може бути подавлена додаванням 1 мМ левамізолу в розчин субстрату, хоча було встановлено, що більш ефективним є додавання 5 мМ. Кишкова лужна фосфатаза належним чином не пригнічується левамізолом.
В імуногістохімічному способі забарвлювання за допомогою лужної фосфатази, фермент гідролізує нафтолові фосфатні ефіри (субстрат) до фенольних сполук і фосфатів. Феноли контактують із безбарвними солями діазонію (хромоген) з одержанням нерозчинних кольорових азобарвників. Були успішно використані декілька різних комбінацій субстратів і хромогенів.
Нафтол АБ-МХ-фосфат може бути використаний у його кислотній формі або у вигляді натрієвої солі. Хромогени Разі Вей ТЕ і Разі Віне ВВ виробляють яскраво-червоний або синій кінцевий продукт, відповідно. Обидва розчинні в спиртових і інших органічних розчинниках, так що для їхнього заливання необхідно використовувати середовища на водній основі. Для забарвлювання клітин мазків кращим є Равзі Неа ТА.
Додаткові приклади субстратів включають нафтол А5-ВІ фосфат, нафтол АБ-ТА фосфат і 5- бром-4-хлор-3-індоксил фосфат (ВСІР). Інші можливі хромогени включають Равзі Вей ІВ, ГРаві
Сагеї ВС, Міо Віпе тетразол (МВТ) йодонітротетразол Міоієї (ІМТ) і похідні структури.
М. Імунологічні способи
В інших варіантах втілення даний винахід належить до імунологічних способів зв'язування, очищення, кількісного видалення й/або іншого виявлення біологічних компонентів, таких як ліганди, розглянутих у даному винаході. Антитіла, одержані відповідно до даного винаходу можуть бути використані для виявлення лігандів дикого типу й/або мутантів білків, поліпептидів іабо пептидів. Як описано в даний публікації, передбачається використання лігандів дикого типу й/або мутантів специфічних антитіл. Деякі способи імунодетекції включають проточну цитометрію, імуноферментний аналіз (ІФА), радіоіїмуноаналіз (РІА), імунорадіометричний
Зо аналіз, флуороіїмуноаналіз, хемілюмінесцентний аналіз, біолюмінесцентний аналіз і вестерн- блот, тут згадані деякі з них. Етапи різних корисних імунологічних способів були описані в науковій літературі, такій як, наприклад, роботи Оооіїше М Н апа Веп-7еєм 0, Меїнподз Мої! Віо). 1999; 109:215-37; Сішбів В ії Саіапа Р, Нит Раїйої. 1993 ЮОес.:24 (12):1271-85; і Оє дадег В еї аї.,
Зетіп Мис! Мед. 1993 Арг.;23 (2): 165-79, кожна з яких включений у даний документ у вигляді посилання.
Загалом, способи імунного зв'язування включають одержання зразка, який імовірно включає ліганд білка, поліпептиду й/або пептиду й контактування зразка з першим лігандзв'язувальним пептидом (наприклад, анти-лігандним антитілом), відповідно до даного винаходу, залежно від обставин, за умов, що сприяють формуванню імунних комплексів.
З погляду виявлення антигена, аналізованим біологічним зразком може бути будь-який зразок, який може включати ліганд дикого типу або мутантний ліганд білково-специфічного антигена, наприклад, зріз тканини або зразка, гомогенізований екстракт тканини, аспірат біопсії, клітину, виділену й/(або очищену форму будь-якої з вищевказаних композицій дикого типу або мутантів, що включають РОЇ НІ, або навіть будь-яку біологічну рідину, яка стикається з тканиною, у тому числі кров і/або сироватку, хоча кращими є зразки або екстракти тканин.
Контактування вибраного біологічного зразка з антитілом за відповідних умов і протягом періоду часу, достатнього для утворення імунних комплексів (первинних імунних комплексів), як правило, полягає в простому додаванні композиції антитіл до зразка й витримуванню суміші протягом досить довгого періоду часу для того, щоб антитіла сформували з ними імунні комплекси, тобто зв'язалися з будь-якими лігандами білка, що включають антигени. Після закінчення цього періоду часу, композиції зразок-антитіло, такі як зріз тканини, ІФА планшет, обладнання для дот-блота або вестерн-блота, як правило, промивають, щоб видалити будь-які види неспецифічно зв'язаних антитіл, залишаючи для виявлення тільки антитіла, специфічно зв'язані з первинними імунними комплексами.
У цілому, способи виявлення утворених імунокомплексів добре відомі в даній галузі техніки й можуть виконуватися із застосуванням численних підходів. Ці способи звичайно засновані на виявленні маркера або мітки, такої як будь-яка з радіоактивних, флуоресцентних, біологічних і ферментативних міток. Використання таких міток описане, наприклад, у патентах США МоМо 3817837, 3850752, 3939350, 3996345, 4277437, 4275149 і 4366241, кожний з яких включений у 60 даний документ у вигляді посилання. Звичайно, як відомо в даній галузі техніки, можна знайти додаткові переваги за рахунок використання вторинного зв'язування ліганду, такі як організація зв'язування лігандів із вторинними антитілами й/або біотином/авідином.
Антитіла до антиліганду, використовувані для виявлення, самі можуть бути зв'язані з виявлюваною міткою, яку потім можна було б просто виявити, у такий спосіб дозволяючи визначити кількість первинних імунних комплексів у композиції. В альтернативному варіанті перше антитіло, яке зв'язується з первинним імунним комплексом може бути виявлене за допомогою другого зв'язувального агента, який володіє зв'язувальною здатністю до антитіла. У цих випадках другий зв'язувальний агент може бути зв'язаний з виявлюваною міткою. Другий зв'язувальний агент сам часто є антитілом, яке, таким чином, може називатися "вторинним" антитілом або полімерною системою виявлення. Первинні імунні комплекси контактують із міченим вторинним зв'язувальним агентом або системою виявлення антитіло/полімер за відповідних умов і протягом періоду часу, достатнього для утворення вторинних імунних комплексів. Потім вторинні імунні комплекси звичайно піддають промиванню для видалення неспецифічно зв'язаних мічених вторинних антитіл або лігандів, а потім проводять детекцію міток, які залишилися на вторинних імунних комплексах.
Інші способи включають виявлення первинних імунних комплексів у два етапи. Другий зв'язувальний агент, такий як антитіло, що володіє зв'язувальною здатністю до антитіл, як описано вище, використовується для утворення вторинних імунних комплексів. Після промивання, вторинні імунні комплекси контактують із третім зв'язувальним агентом або антитілом, що володіє зв'язувальною здатністю із другим антитілом, за таких самих відповідних умов і протягом періоду часу, достатнього для утворення імунних комплексів (третинних імунних комплексів). Третій ліганд або антитіло зв'язане з виявлюваною міткою, що дозволяє виконувати виявлення третинних імунних комплексів у такий же спосіб. За необхідності дана система може забезпечити ампліфікацію сигналу.
В іншому варіанті втілення для виявлення цільового антигена(ів) використовуються біотинільовані моноклональні або поліклональні антитіла, а потім антитіло на другому етапі використовується для виявлення біотину, прикріпленого до біотинових комплексів. При використанні даного способу досліджуваний зразок спочатку інкубують у розчині, що включає антитіла для першого етапу. Якщо є присутнім антиген-мішень, деякі з антитіл зв'язуються з
Зо ним, щоб сформувати біотинільований комплекс антитіло/лантиген. Потім комплекс антитіло/"антиген ампліфікують шляхом інкубації в послідовних розчинах стрептавідину (або авідину), біотинільованих ДНК і/або комплементарних біотинільованих ДНК, з додаванням на кожному етапі додаткових біотинових сайтів до комплексу антитіло/антиген. Етапи ампліфікації повторюються, поки не буде досягнутий відповідний рівень ампліфікації, після чого зразок інкубують у розчині, що включає антитіла проти біотину для другого етапу. Це антитіло другого етапу мічене, наприклад, ферментом, який може бути використаний для виявлення присутності комплексу антитіло/(антиген шляхом гістоензимології за допомогою хромогенного субстрату.
При відповідній ампліфікації кон'югат зв'язування білків (наприклад, з антитілами) може проводитися до макроскопічної видимості.
Інший відомий спосіб імунодетекції використовує переваги методології імуно-ПЛР (полімеразної ланцюгової реакції). Спосіб ПЛР використовує комплекс
ДНК/біотин/стрептавідин/антитіло, що промивається буфером з низьким рН або з високим вмістом солі, що приводить до вивільнення антитіл. Потім результуючий промивний розчин використовують для проведення ПЛР-реакції з придатними праймерами під відповідним контролем. У конкретних варіантах втілення величезні можливості ампліфікації й специфічності
ПЛР можуть бути використані для виявлення однієї молекули антигена. Таке виявлення може відбуватися в режимі реального часу. Наприклад, розглядається використання кількісної ПЛР реального часу.
Під час клінічної діагностики й/або моніторингу хворих з різними формами захворювання, виявлення ЕОЇ В1 мутанта й/або змінювання рівнів РОЇ Н1 у порівнянні з рівнями у відповідній біологічній пробі нормального суб'єкта вказує на пацієнта із захворюванням. Однак, як відомо фахівцям у даній галузі техніки, клінічний діагноз не обов'язково може бути поставлений на основі тільки даного способу. Фахівцям у даній галузі техніки добре знайомі істотні відмінності в типах і/або кількості біомаркерів, які використовуються для позитивної ідентифікації й/або низького рівня і/або зміни фонового рівня біомаркерів. Дійсно, фонові рівні експресії часто використовуються, щоб сформувати рівень "відсікання", перевищення якого вважається як значуще й/або позитивне значення.
В одному варіанті втілення виявлення за допомогою імунологічних способів (імуногістохімії)
ЕОЇ ВІ оцінюється за інтенсивністю й рівномірністю (відсоток забарвлених клітин - тільки бо мембрани). Порівняльна шкала інтенсивності експресії РОЇ В1 встановлюється, як 0 - негативна інтенсивність, 0-1 - дуже слабка, 1 - слабка, 1-2 - від слабкої до помірної, 2 - помірна, 2-3 - від помірної до сильної, З - сильна. Кількісно, оцінка 0 указує на те, що забарвлювання мембран пухлинних клітин не спостерігається. Оцінка 1 указує на слабке / ледь помітне забарвлювання мембран пухлинних клітин. Для оцінки 2 у пухлинних клітинах спостерігається помірне забарвлювання мембран. Нарешті, оцінка З або З-- указує на ступінь забарвлювання мембран пухлинних клітин від помірної до сильної. Зразки з оцінкою експресії РОЇ В1 0 або 1 можуть бути охарактеризовані, як зразки без гіперекспресії ЕОЇ ВІ, тоді як зразки з 2 або З балами можуть бути охарактеризовані, як зразки з гіперекспресією РОЇ В1. Зразки з гіперекспресією ЕОЇ ВІ також можуть бути класифіковані за допомогою імуногістохімічної оцінки, відповідної до числа копій молекули ЕОЇАН1, експресованих клітиною й визначених біохімічно: 0-0-10000 копій/клітину, 1 - щонайменше, близько 200000 копій/клітину, 2 - щонайменше, близько 500 000 копій/клітину й З - щонайменше, близько 2000000 копій/клітину. Порівняльні шкали для ЕОЇ В1 відсотків однорідності забарвлювання мембрани клітини корелює в такий спосіб: 0 - негативна, фокальна (осередкова) - «25 9о, неоднорідна (гетеро) - 25-75 95, однорідна (гомо) - »75 Об.
МІ. Гібридизація нуклеїнових кислот іп 5йш гібридизацію звичайно проводять на клітинах або зрізах тканини, закріплених на стеклах. Іп 5йи гібридизація може бути виконана згідно з декількома стандартними методикам (див., наприклад, І ейсий єї аі. Іп вйш НуБбгіаігайоп: а ргасіїса! дпіде, Охота ВІО5 Зсієпійіс
РибріїзНнегз, Містозсору Напароокз у. 27 (1994)). В одній іп зйи процедурі флуоресцентні барвники (такі як флуоресцеїну ізотіоціанат (РІТС), який флуоресціює зеленим світінням при збудженні аргоновим іонним лазером) використовуються для позначення зонда у вигляді послідовності нуклеїнової кислоти, комплементарної нуклеотидної послідовності-мішені в клітині. Кожна клітина, що включає нуклеотидну послідовність-мішень зв'язується міченим зондом, що виробляє флуоресцентний сигнал при дії на клітини джерела світла з довжиною хвилі, що підходить для порушення специфічних флуорохромів, використовуваних у зонді.
Можуть бути використані різні ступені гібридизації. З підвищенням точності умов гібридизації підвищується необхідний ступінь комплементарності між зондом і мішенню для формування й підтримки стабільного дуплексного зв'язку. Точність умов збільшується при підвищенні температури, зниженні концентрації солі або збільшенні концентрації формаміду. Додавання
Зо сульфату декстрану або підвищення його концентрації також може збільшити ефективну концентрацію міченого зонда, що збільшить швидкість гібридизації й інтенсивність кінцевого сигналу. Після гібридизації стекла промивають у розчині, що звичайно включає реагенти, подібні із застосовуваними в розчині для гібридизації, з часом промивання від декількох хвилин до декількох годин, залежно від необхідної точності. Більш тривалі або більш точні промивання звичайно знижують неспецифічні фонові впливи, але при цьому існує ризик зниження загальної чутливості.
Зонди, використовувані в аналізі гібридизації нуклеїнових кислот можуть бути РНК або ДНК олігонуклеотидами або полінуклеотидами й можуть включати не тільки природні нуклеотиди, але і їх аналоги, такі як, наприклад, дигоксигенін дЦТФ, біотин дЦТФф 7-азагуанозин, азидотимідин, інозин або уридин. Інші придатні зонди включають, наприклад, пептидні зонди і їх аналоги, розгалужені ДНК-зонди, пептидометики, пептидні нуклеїнові кислоти (ПНК) і/або антитіла.
Необхідно, щоб зонди володіли достатньою комплементарністю із цільовою послідовністю нуклеїнових кислот, що являє інтерес, щоб забезпечити стабільне й специфічне зв'язування між цільовою послідовністю нуклеїнових кислот і зондом. Ступінь гомології, необхідна для стабільної гібридизації, залежить від точності середовища гібридизації й/або промивного середовища. У даному винаході кращим є використання повністю гомологічних зондів, але фахівцям у даній галузі техніки буде зрозуміло, що зонди, які демонструють меншу, але достатню гомологію також можуть бути використані в даному винаході (див., наприклад, затргоок, «)., Нгіївси, Е. Е., Мапіаїв, Т., МоІесшаг Сіопіпу А І арогаїюгу Мапиаї, Соїа ріпу Нагрог
Ргез5, (1989)).
Зонди також можуть бути утворені й вибрані декількома способами, включаючи, але не обмежуючись цим, відображення за допомогою гібридизації іп 5йш, панелі гібридних соматичних клітин або спот-блота відсортованих хромосом; аналіз хромосомальних зв'язків; або клонування й виділення з відсортованих хромосомних бібліотек клітинних ліній людини або гібридів соматичних клітин з людськими хромосомами, радіаційних гібридів соматичних клітин, мікродисекцією хромосомних регіонів або штучних хромосом дріжджів (УАС5), виявлюваних за допомогою ПЛР із праймерами, специфічними до унікальних локусів хромосом або іншого придатного засобу, такого як сусідні МАС-клони. Зонди можуть являти собою геномну ДНК, 60 КДНК або РНК, клоновану в плазміди, фаги, косміди, МАС, бактеріальні штучні хромосоми
(ВАС), вірусні або будь-які інші придатні вектори. Зонди можуть бути клоновані або синтезовані хімічним шляхом звичайними способами. У випадку клонування, виділені як зонд фрагменти нуклеїнової кислоти звичайно вбудовуються у вектор, такий як лямбда фаг, рВА322, М13, або вектори, що включають 5Рб або 17 промотор і клоновані у вигляді бібліотеки в бактерії-хазяїні.
ІДив., наприклад, Затьгоок, .)., Егївси, Е. Е., Мапіаїїв, Т., МоіІесшціаг Сіопіпа А І арогаюгу Мапиаї,
Соа 5ргіпд Нагтбог Ргезз, (1989)).
Зонди краще помітити, наприклад, за допомогою флуорофорів. Приклади флуорофорів, включають, але не обмежуються ними, хелати рідкісноземельних металів (хелати європію),
Теха5 Вед, родамін, флуоресцеїн, дансил, лісамін, умбеліферон, фікоеритрин, фікоціанін або комерційно доступні рлуорофори, такі, як ХГРЕСТВОМ ОВАМСЕ "М ії БРЕСТАОМ СВЕЕМ М і/або похідні будь-якого одного або більше з перерахованих вище. Декілька зондів, використовуваних для аналізу, можуть бути помічені більше, ніж одним розпізнаваним флуоресцентним або пігментним кольором. Ці відмінності кольору забезпечують засоби для ідентифікації позицій гібридизації специфічних зондів. Крім того, зонди, які не розділені просторово, можна ідентифікувати за різними кольорами світіння або пігментами у результаті змішування двох інших кольорів (наприклад, ясно--ервоний ж зелений - жовтий) пігмент (наприклад, синій жовтий - зелений) або за допомогою набору фільтрів, які пропускають світло тільки одного колірного відтінку.
Зонди можна мітити прямо або непрямо за допомогою флуорофору шляхом звичайної методології, відомої фахівцям у даній галузі техніки.
МІЇ. Набори й композиції для виявлення
Крім того, у винаході передбачені набори для використання в практиці даного винаходу, як описано в даному документі. Такі набори можуть включати контейнери, кожний з яких включає один або більше різних реагентів (звичайно в концентрованій формі), використовуваних у способах, у тому числі, наприклад, один або декілька зв'язувальних агентів (антитіла), які вже прикріплені до маркера або, необов'язково, реагенти для з'єднання зв'язувального агента з антитілом або молекулою нуклеїнової кислоти (також, як і сам маркер); буферні розчини відповідних нуклеотидних трифосфатів (наприклад, дАТФ, дЦТФ, дГТФ, ДдТТФ, ДдУТФ, АТФ, СТР,
СТР ї ОТР), зворотну транскриптазу, ДНК-полімеразу, РНК-полімеразу, один або більше
Зо специфічний до послідовностей або вироджений праймер, використовуваний для детекції молекул нуклеїнових кислот шляхом ампліфікації; і/або реагенти й обладнання для виділення (необов'язково шляхом мікродиссекції) для підтримки практичного здійснення винаходу. Також до набору звичайно включають опис мітки або індикатора, набір інструкцій для використання компонентів набору в способі виявлення ліганд згідно з даним винаходом, де інструкції можуть бути розміщені на вкладиші й/або в упакуванні набору або його компонентів.
В інших варіантах втілення даний винахід належить до наборів для імунодетекції для використання з імунологічними способами, описаними вище. Як антитіла для виявлення білків дикого типу й/або мутантних білків, поліпептидів і/або пептидів, як правило, використовуються антитіла, краще включені в комплект. Імунологічні набори, таким чином, містять у відповідних контейнерах перше антитіло, яке зв'язується з білком дикого типу й/або мутантним білком, поліпептидом і/або пептидом і/або, необов'язково, імунологічний реагент, і/або крім того, необов'язково, білок дикого типу й/або мутантний білок, поліпептид і/або пептид.
Реагенти, що входять до складу імунологічного набору можуть приймати будь-яку форму, у тому числі виявлюваних міток, які об'єднані й/або зв'язані з даним антитілом. Розглядаються також виявлювані мітки, які об'єднані й/або приєднані до вторинного зв'язаного ліганду.
Прикладами вторинних лігандів є вторинні антитіла або полімери, що мають спорідненість до першого антитіла.
Інші придатні імунологічні реагенти для використання в даному наборі включають двокомпонентні реагенти, які включають вторинне антитіло, що володіє зв'язувальною здатністю до першого антитіла, разом із третім антитілом або полімером, що володіє зв'язувальною здатністю до другого антитіла. Третє антитіло зв'язане з виявлюваною міткою. Як відзначалося вище, у даній галузі техніки відомий ряд типових міток і/або всі вони можуть бути відповідним чином використані в даному винаході.
Набори можуть також містити відповідні аліквотовані композиції білків дикого типу й/або мутантних білків, поліпептиди й/або мічені й/або немічені поліпептиди, які можуть бути використані для одержання стандартної кривої для аналізу виявлення. Набори можуть містити кон'югати з антитіло- або полімерними мітками, або в повністю кон'югованій формі, у вигляді проміжних сполук і/або у вигляді окремих фрагментів для кон'югування користувачем набору.
Компоненти наборів можуть бути поміщені у водне середовище й/або знаходитись у бо ліофілізованій формі.
Контейнер, що містить комплект, звичайно включає, щонайменше, один флакон, пробірку, колбу, посудину, шприц й/або інші ємності, у які можуть бути поміщені антитіла, і/або краще, відповідним чином розділені на аліквоти. Набори згідно 3 даним винаходом також звичайно включають ємність, що містить антитіла, антигени й/або будь-які інші контейнери з реагентами в щільно закритому упакуванні для комерційного продажу. Такі контейнери можуть включати пристрої для ін'єкцій і/або пластикові контейнери видувного формування, у яких зберігаються необхідні флакони.
Набори можуть також включати один або більше терапевтичних агентів для лікування раку, таких як ЕОЇ ВІ імунокон'югат і/або хіміотерапевтичний засіб.
Набір може додатково включати реагент для виявлення БОЇ В1, використовуваний для вимірювання рівня експресії РОЇ ВІ у суб'єкта, куди входить реагент для виявлення ЕОЇ НН і інструкція із застосування. В одному варіанті втілення реагент для виявлення РОЇ 21 включає
ЕОЇ В1 зв'язувальний пептид, білок або молекулярний зонд (наприклад, нуклеїнову кислоту). В іншому варіанті втілення реагент для виявлення РОЇ ВІ являє собою анти-ЕОЇ В1 антитіло. В іншому варіанті втілення набір додатково включає вторинне антитіло, яке зв'язується з анти-
ЕОЇ В1 антитілом. В одному варіанті втілення використовуються специфічні антитіла БОЇ В1 в концентрації від 0,5 до 7,5 мкг/мл, краще від 0,9 до 3,8 ж/- 0,5 мкг/мл. В іншому варіанті втілення використовуються антитіла в концентрації 1,0 ж/- 0,5 мкг/мл, 1,5 ж/- 0,5 мкг/мл, 1,9 ж/- 0,5 мкг/мл, 2,5 -/- 0,5 мкг/мл, 3,0 ж/- 0,5 мкг/мл, 3,5 ж/- 0,5 мкг/мл, 3,8 ж/- 0,5 мкг/мл або до 4,2 мкг/мл. В іншому варіанті втілення антитіло використовується в концентрованому розчині з інструкціями для розведення для досягнення кінцевої концентрації від 0,9 до 3,8 ж/- 0,5 мкг/мл. В іншому варіанті втілення винаходу набір додатково включає реагент для виявлення, вибраний із групи, що складається з ферменту, флуорофора, радіоактивної мітки й люмінофора. В іншому варіанті втілення реагент для виявлення вибраний із групи, що складається з біотину, дигоксигеніну, флуоресцеїну, тритію й родаміну.
Набір також може включати інструкції для виявлення й оцінки експресії РОЇ А1. Набір також може включати контрольні або еталонні зразки. Необмежуючі приклади контрольних або еталонних зразків включають конгломерати клітин або клітинних ліній тканинної культури, одержані зі зразків нормальної тканини (нормальний контроль) або тканини пухлини (позитивний контроль). Приклади клітинних ліній включають КВ, МСІ-Н2110, Ідгом-1, Івпікаула,
Уед-3, 5Кох-3, Неїа, Т470, Сасог2, 5М/620, ОАМУ28, НОСВ27, Оусаї-8 і Оусаг-3, Оум-90, інші лінії пухлинних клітин з відомою експресією ЕОЇ ВІ, їі клітинні лінії, які постійно або тимчасово трансфіковані вектором експресії що експресує РОЇ ВІ. Додаткові приклади тканин для позитивного контролю наведені в прикладах 9-11. Набір може також містити посібник з забарвлювання, де візуально зображені позитивні й нормальні еталонні зразки інтенсивності й однорідності забарвлювання. Такі посібники з забарвлювання можуть містити еталонні зразки нормальної легені, підшлункової залози й/або слинної залози й забарвлені пухлинні тканини з уніфікованими оцінками (наприклад, тканини пухлини яєчників, легенів, нирок і ендометрію, як описано в прикладах і продемонстровано на Фіг. 23-25)
МІ. РОГ-В1 зв'язувальні агенти
Будь-які антитіла, що зв'язують РОЇ НТ можуть бути використані для способів виявлення в даному винаході. Приклади терапевтично ефективних анти-РОЇ В! антитіл можна знайти в заявці на патент США Мо 2012/0009181, включеній в даний документ за допомогою посилання.
Повнорозмірна амінокислотна (аа) і нуклеотидна (пі) послідовності для РОЇ В1 відомі в цій галузі техніки й представлені в даному документі у вигляді 5ЕС ІО МоМо 1 ї 2 відповідно.
Особливо ефективним антитілом для виявлення РОЇ ВТ є мишаче моноклональне антитіло анти-пШЕРОЇ ВТ, клон ВМ3.2 (Ієїса й МСІ-І-ЕРаІрна). Прикладом терапевтично ефективного анти-РОЇ ВТ антитіла є НиМом19 (МУ9346А). Поліпептидні послідовності 5ЕС 10 МоМо: 3-5 включають варіабельний домен важкого ланцюга пиМом19 (М9346А), варіабельний домен легкого ланцюга версії 1.00 і варіабельний домен легкого ланцюга, версія 1.60 для пиМом19 відповідно. У деяких варіантах втілення пПиМом19 (М9346А) антитіла, які кодуються плазмідами, депоновані в Американській колекції типових культур (АТСС), розташованій за адресою: 10801
МОпімегзйу Вошемага, Мапаззаз5х, МА 20110 від 7 квітня 2010 р. відповідно до умов
Будапештського договору, і мають АТСС депозитні номери РТА-10772 і РТА-10773 або 10774.
Приклади БОЇ АВ1 імунокон'югатів, використовуваних у терапевтичних способах згідно з винаходом наведені нижче.
ЇХ. РОГ В1 Імунокон'югати
Даний винахід також належить до способів підвищення ефективності кон'югатів (які також згадуються в даному документі як імунокон'югати), що включають анти-РОЇ В1 антитіла, бо фрагменти антитіл, функціональні еквіваленти, покращені антитіла і їх аспекти, як описано в даному документі, зв'язані або кон'юговані з цитотоксином (лікарським засобом) або пролікарським засобом. Приклади імунокон'югатів РОЇ В1 можна знайти в заявці на патент США
Мо 2012/0009181, включеній в даний документ за допомогою посилання. Зокрема, ефективні терапевтичні імунокон'югати, згідно з винаходом, включають антитіло пПимМом19, описане вище.
Придатні лікарські засоби або пролікарські засоби добре відомі фахівцям у даній галузі техніки. У деяких варіантах втілення ліки або пролікарські засоби є цитотоксичними агентами.
Цитотоксичний агент, використовуваний у складі цитотоксичного кон'югата згідно з даним винаходом може бути будь-якою сполукою, яка призводить до загибелі клітини, або індукує загибель клітин, або в будь-який спосіб зменшує життєздатність клітин і включає, наприклад, майтансиноїди і їх аналоги, бензодіазепіни, таксоїди, СС-1065 і аналоги СС-1065, дуокарміцини і їх аналоги, енедийни, наприклад каліхеаміцини, доластатин і його аналоги, включаючи ауристатини, похідні томайміцину, похідні лептоміцину, метотрексат, цисплатин, карбоплатин, даунорубіцин, доксорубіцин, вінкристин, вінбластин, мельфалан, мітоміцин С, хлорамбуцил і морфолінодоксорубіцин. У деяких варіантах втілення цитостатичні агенти являють собою майтансиноїди й аналоги майтансиноїдів.
Лікарський засіб або пролікарський засіб може бути зв'язаний, наприклад, з анти-ЕОЇ В1 антитілом, таким як пиМом19 або його фрагментом за допомогою дисульфідного зв'язку.
Лінкерна молекула або зшиваючий агент включає реакційноздатну групу хімічних речовин, які можуть реагувати з анти-РОЇ В1 антитілом або його фрагментом. У деяких варіантах втілення реакційноздатними групами хімічних речовин, здатними реагувати із клітинно-зв'язувальним агентом є М-сукцинімідилові естери й М-сульфосукцинімідилові естери. Крім того, лінкерна молекула включає реакційноздатну групу хімічних речовин, у деяких варіантах втілення дитіопіридильну групу, яка може реагувати з лікарським засобом з утворенням дисульфідного зв'язку. У конкретних варіантах втілення лінкерні молекули включають, наприклад, М- сукцинімідил 3-(2-піридилдитіо)пропіонат (5РОР) (див., наприклад, Сагіззоп еї аї., Віоспет. У., 173: 723-737 (1978)), М-сукцинімідил-4-(2-піридилдитіо)бутаноат (ЗРОВ) (див., наприклад, патент США Мо 4563304), М-сукцинімідил-4-(2-піридилдитіо) 2-сульфобутаноат (сульфо-5РОВ) (див. публікацію США Мо 20090274713), М-сукцинімідил-4-(2-піридилдитіо) пентаноат (5РР) (див., наприклад, реєстраційний номер САБ5Б 341498-08-6), 2-імінотіолзан або ангідрид
Зо ацетилбурштинової кислоти.
Також можуть бути одержані кон'югати антитіло-майтансиноїд з нерозщеплюваними зв'язками. Такі зшиваючі агенти описані в даній галузі техніки (див. Пегтовзсіепійїіс Ріегсе
СтоззіїпКіпд Тесппіса! Напаросок і заявку на патент США Мо 2005/0169933), і включають, але не обмежуються ними, М-сукцинімідил-4-(малеімідометил) циклогексанкарбоксилат (ЗМО), М- сукцинімідил-4-(М-малеїмідометил)-циклогексан-1-карбоксі-(б-амідокапроат), який Є "довголанцюговим" аналогом 5ЗМОС (10-5МО00), к-малеіїмідоундеканової кислоти /-М- сукцинімідиловий естер (КМИОА), Д-малеімідопропіонової кислоти М-сукцинімідиловий естер (ВМР5), у-малеімідомасляної кислоти М-сукцинімідиловий естер (ЯМВ5), є-малеімідокапронової кислоти М-гідроксисукцинімідовий естер (ЕМСО5), т-малеімідобензоїл-М-гідроксисукцинімідовий естер (МВ5), М-(а-малеімідоацетокси)-сукцинімідовий естер (АМАб5), сукцинімідил-6-В- малеімідопропіонамідо)гексаноат (ЗМРН), М-сукцинімідил-4-(р-малеімідофеніл)-бутират (ЗМРВ) і М-(р-малеімідофеніл)ізоціанат (РМРІ), М-сукцинімідил-4-(йодоацетил)-амінобензоат (ЗІАВ), М- сукцинімідилийодацетат (5ІА), М-сукцинімідилбромацетат (5ВА) і М-сукцинімідил /3- (бромацетамідо)пропіонат (ВАР). У деяких варіантах втілення антитіло модифікують за допомогою зшиваючих реагентів, таких як сукцинімідил-4-(М-малеіїмідометил)-циклогексан-1- карбоксилат (5МОС), сульфо-5МОС, малеїімідобензоїл-М-гідроксисукцинімід (МВ5), сульфо-
МВ5 або сукцинімідилиодацетат, як описано в літературі, внесенням від 1 до 10 реакційноздатних груп (МозпйакКе еї аї., Єик. У. Віоспет., 101:395-399 (1979); Навзпіда ебї а)!., 9.
Арріїєа Віоспет., 56-63 (1984); апа Пи єї аї., Віоспет., 18:690-697 (1979)).
Даний винахід включає аспекти, у яких від приблизно 2 до приблизно 8 молекул лікарського засобу ("лікарське навантаження"), наприклад, майтансиноїду, зв'язані з анти-РОЇ В1 антитілом або його фрагментом. Протипухлинний ефект такого кон'югата є набагато більш ефективним у порівнянні з лікарським навантаженням більшим або меншим числом препаратів, зв'язаних з тим самим клітинно-зв'язувальним агентом. Поняття "лікарське навантаження", при використанні в даному документі, належить до кількості молекул лікарського засобу (наприклад, майтансиноїду), які можуть бути прикріплені до клітинно-зв'язувального агента (наприклад, до анти-РОЇ В1 антитіла або його фрагмента). В одному аспекті кількість молекул лікарського засобу, які можуть бути прикріплені до клітинно-зв'язувального агента може становити в середньому від приблизно 2 до приблизно 8 (наприклад, 1,9,2,0,2,1,2,2,2,3,2,4,2,5,2,6, 2,7, 60 2,8,2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0,4,1,4,2,4,3,4,4,4,5,4,6,4,7,4,68,4,9, 5,0,
5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1). У деяких варіантах втілення лікарським засобом є Ме2- деацетил-М2-(З-меркапто-1-оксопропіл)у-майтансин (ОМ1) або М-деацетил-М2-(4-меркапто-4- метил-1-оксопентил) майтансин (ОМ4). Таким чином, у конкретному варіанті втілення антитіло пиМом19 кон'юговано з ОМІ1 або ОМА. В іншому варіанті втілення антитіло ЕВ-1-21 кон'юговано з ОМІ1 або ОМА. В іншому варіанті втілення антитіло ЕВ-1-48 кон'юговано з ОМІ або ОМА. В іншому варіанті втілення антитіло ЕВ-1-49 кон'юговано з ОМІ або ОМ4. В іншому варіанті втілення антитіло ЕВ-1-57 кон'юговано з ОМІ1 або ОМА. В іншому варіанті втілення антитіло ЕВ- 1-65 кон'юговано з ОМІ1 або ОМА.
Х. Кореляція між експресією ЕОЇ В1 і терапевтичною ефективністю
У деяких варіантах втілення винахід належить до способу ідентифікації суб'єктів з підвищеною ймовірністю відповіді на РОЇ В1-таргетну протиракову терапію. Даний винахід частково заснований на відкритті, що полягає в тому, що підвищені рівні експресії ЕОЇВ1 корелюють з ефективністю РОЇ В-1-таргетної протиракової терапії.
Оцінка зразків тканин, одержаних від пацієнтів і кореляція ефективності при використанні іп мімо моделей ксенотрансплантатів демонструє ефективність аналізу експресії для вибору суб'єктів з підвищеною ймовірністю відповіді на лікування. ІГХ забезпечує оцінку експресії
ЕОЇ ВІ на пухлинних клітинах: від 0 (експресія відсутня) до З. (дуже високі рівні експресії). Дані досліджень іп мімо за допомогою моделей ксенотрансплантатів демонструють, що зразки тканин з оцінкою 1, 2, З або 3- для експресії ОЇ В1, краще з оцінкою 2, З або 3-4, мають підвищену ймовірність реакції на ОЇ В-1-таргетну протиракову терапію клінічно значущими дозами ЕОЇ В1 імунокон'югатів (наприклад, доза імунокон'югата БОЇ В1 5 мг/кг для ксенотрансплантата буде дорівнювати приблизно 185 мг/м- для пацієнтів). Таким чином, виявлення осіб з підвищеною оцінкою РОЇ В1 допоможе визначити пацієнтів, що можуть реагувати на клінічно значущі дози.
Як описано більш докладно нижче, сприйнятливість РОЇ Н1 терапії корелює з оцінкою ЕОЇ В1, що дорівнює 2 або вище, особливо з оцінкою 3. Крім того, більш рівномірні рівні експресії
ЕОЇ 1 забезпечують кращу кореляцію з терапевтичним ефектом. Таким чином, гомогенність (однорідність) забарвлювання є кращою, але комбінації підвищеної інтенсивності з неоднорідністю забарвлювання також свідчать про підвищену експресію РОЇ В1. Наприклад,
Зо оцінка більше 2 з неоднорідним забарвлюванням є критерієм відбору пацієнта для лікування за допомогою ЕОЇ ВІ терапевтичного агента.
Аналіз експресії РОЇ В1 також ідентифікує пацієнтів, у яких знижені дози ЕОЇ В1-таргетної протиракової терапії ("терапія низькою дозою") можуть бути ефективними для одержання протипухлинної відповіді. Як було оцінено на практиці, сполуки звичайно вводять у найменшій дозі, яка достатня для досягнення бажаного терапевтичного ефекту. Це особливо важливо для терапії, що викликає клінічні й часто небажані побічні ефекти. Здатність розпізнавати пацієнтів з підвищеним рівнем експресії РОЇ 21 дозволяє мінімізувати дози ЕОЇ В-1-таргетної терапії, у такий спосіб зменшуючи можливі побічні ефекти при збереженні терапевтичної ефективності.
Як показано в даному документі, оцінка експресії РОЇ ВІ 2 або більше з неоднорідним забарвлюванням, корелює з підвищеною чутливістю до анти-РОЇ В1 імунокон'югатів. У деяких варіантах втілення спостерігається збільшення реактивності кахексії, збільшення тривалості життя, подовження часу до прогресування, зменшення маси пухлини, зниження пухлинної маси й/"або продовження часу до метастазування пухлини, часу до виникнення рецидиву пухлини, відповідь пухлини на лікування, повна відповідь, часткова відповідь, стабілізація захворювання, прогресування захворювання, збільшення виживаності без прогресування (ВБП) або загальної виживаності (38). У деяких варіантах втілення експресія ЕОЇ В1 2 або більше із неоднорідним забарвлюванням, корелює зі збільшенням ВБП, ВПЗ або ЗВ.
Набори для використання в способах виявлення й кореляції з еталонними/контрольними зразками можуть включати контрольні (для позитивного й/або негативного контролю) або еталонні зразки. Зразки для позитивного контролю або позитивні еталонні зразки можуть бути одержані із клітинних ліній культури тканин, зразків нормальних тканин або пухлинних тканин.
Позитивні й негативні еталонні зразки можуть бути одержані із клітинних ліній, включаючи
ЗМУ620, Т470, І2ВОХ-1, Нега, КВ, УЕС-3, інших пухлинних клітинних ліній і клітинних ліній постійно або тимчасово трансфікованих вектором експресії що кодує БОЇ А1. Зразки нормальної або пухлинної тканини й клітинні лінії культури тканин також можуть бути використані як еталонні зразки для негативного контролю. Для інформації про додаткові зразки, див. приклади 9-11 і Фігури 23-25.
ХІ. Фармацевтичні композиції й терапевтичні способи
ЕОЇ В1-зв'язувальні агенти (включаючи антитіла, імунокон'югати й поліпептиди) придатні для 60 використання в різних галузях застосування, включаючи, але не обмежуючись цим,
терапевтичні способи лікування, наприклад, при лікуванні раку. У деяких варіантах втілення агенти використовуються для інгібування росту пухлини, індукування диференціації, зменшення об'єму пухлини й/(або зниження онкогенності пухлини. Способи застосування можуть бути іп міо, ех мімо або іп мімо. У деяких варіантах втілення РОЇ Н1-зв'язувальний агент, або антитіло, або імунокон'югат або поліпептид являє собою антагоніст людського БОЇ ВІ, з яким він зв'язується.
У деяких варіантах втілення захворювання, лікування якого виконується за допомогою
ЕОЇ ВІТ-зв'язувального агента або антагоніста (наприклад, ПиМом19 антитіла або імунокон'югата) являє собою рак. У деяких варіантах втілення рак характеризується пухлиною, що експресує рецептор фолату 1, з яким зв'язується ЕОЇ В1-зв'язувальний агент (наприклад, антитіло).
Даний винахід належить до способів лікування раку, які включають введення терапевтично ефективної кількості РОЇ В1-зв'язувального агента суб'єкту (наприклад, пацієнту, що потребує лікування). У деяких варіантах втілення рак являє собою рак товстої кишки, рак підшлункової залози, рак легенів, рак яєчників, рак печінки, рак молочної залози, рак мозку, рак нирок, рак передміхурової залози, рак шлунково-кишкового тракту, меланому, рак шийки матки, рак сечового міхура, гліобластому й рак голови й шиї. У деяких варіантах втілення рак являє собою рак яєчників. У деяких варіантах втілення рак являє собою рак легенів. У деяких варіантах втілення суб'єктом є людина.
Даний винахід також належить до способів інгібування росту пухлини за допомогою антитіл або інших агентів, описаних у даному документі. У деяких варіантах втілення спосіб інгібування росту пухлини включає контактування клітини з ЕОЇ В1-зв'язувальним агентом (наприклад, антитілом) іп міто. Наприклад, імморталізовану лінію клітин або лінію клітин раку, що експресують РОЇ ВТ культивують у середовищі, в яке додані антитіла або інші агенти для інгібування росту пухлини. У деяких варіантах втілення пухлинні клітини виділяють зі зразка тканини пацієнта, такого як, наприклад, біоптат тканини, плевральний випіт або проба крові й культивують у середовищі, в яке доданий ЕОЇ Н1-зв'язувальний агент для інгібування росту пухлини.
У деяких варіантах втілення спосіб інгібування росту пухлини включає контактування
Зо пухлини або пухлинних клітин з РОЇ В1-зв'язувальним агентом (наприклад, антитілом) іп мімо. У деяких варіантах втілення контактування пухлини або пухлинних клітин з РОЇ В1-зв'язувальним агентом здійснюється на тваринній моделі. Наприклад, РОЇ Н1-зв'язувальні агенти можуть бути введені ксенотрансплантатам, що експресують один або більше ЕОЇ 1, які були вирощені в організмах імунологічно скомпрометованих мишей (наприклад МОБ/5СІО мишей) для інгібування росту пухлини. У деяких варіантах втілення РОЇ Н1-зв'язувальний агент вводять одночасно або невдовзі після введення онкогенних клітин в організм тварини, щоб запобігти росту пухлини. У деяких варіантах втілення РОЇ ВІ-зв'язувальний агент вводять як терапевтичний після росту онкогенних клітин до заданого розміру.
У деяких варіантах втілення спосіб інгібування росту пухлини включає введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості РОЇ В1-зв'язувального агента. У деяких варіантах втілення суб'єктом є людина. У деяких варіантах втілення суб'єкт має пухлину або пухлина була видалена.
У деяких варіантах втілення пухлина являє собою пухлину мозку, пухлину товстої кишки, пухлину підшлункової залози, пухлину легенів, пухлину яєчників, пухлину печінки, пухлину молочної залози, пухлину нирок, пухлину передміхурової залози, пухлину шлунково-кишкового тракту, меланому, пухлину шийки матки, пухлину сечового міхура, гліобластому, пухлину голови й шиї. У деяких варіантах втілення пухлина являє собою пухлину яєчників.
У деяких варіантах втілення винахід належить до способів інгібування росту пухлини за допомогою низьких доз РОЇ В1-зв'язувального агента. Термін "низька доза", використовуваний у даному документі, належить до терапевтично ефективної дози РОЇ В1-зв'язувального агента, яка є меншою, ніж звичайна або стандартна доза, необхідна для одержання терапевтичного ефекту.
Таким чином, у деяких варіантах втілення винахід належить до способів лікування раку за допомогою пиМом19 антитіл і імунокон'югатів. У деяких варіантах втілення імунокон'югатами пиМом19 є пиМом19-5Р08-ОМ4;. пиМом19-5ийо-5РР-ЮМ1; пиМом19-5РР-ОМІ, або пиМом19-
РЕС4-Ма1-ОМА4. У конкретному варіанті втілення імунокон'югатом пиМом19 є пиМом19-5Р0ОВ-
ОМА, який також називають ІМЕМ853.
У деяких варіантах втілення композиції створюються для зберігання й використання шляхом об'єднання очищеного антитіла або агента згідно з даним винаходом з фармацевтично 60 прийнятним носієм (наприклад, носієм, наповнювачем) (Кетіпдіоп, Те 5сіепсе апа Ргасіїсе ої
РПпаптасу 201 Байп Маск Рибіїєпіпу, 2000). Придатні фармацевтично прийнятні носії включають, але не обмежуються ними, нетоксичні буфери, такі як фосфатний, цитратний і інші органічні кислоти; солі, такі як хлорид натрію, антиоксиданти, включаючи аскорбінову кислоту й метіонін; консерванти (наприклад октадецилдиметилбензиламонію хлорид; гексаметонію хлорид; бензалконію хлорид; бензетонію хлорид; фенол, бутиловий або бензиловий спирт; алкілпарабени, такі як метил- або пропілпарабен; катехол; резорцин, циклогексанол, З-пентанол і м-крезол); низькомолекулярні поліпептиди (наприклад такі, що містять менше ніж приблизно амінокислотних залишків), білки, такі як сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери, такі як полівінілпіролідон, амінокислоти, такі як гліцин, глутамін, аспарагін, 10 гістидин, аргінін або лізин; вуглеводи, такі як моносахариди, дисахариди, глюкозу, манозу або декстрини; хелатуючі агенти, такі як ЕОТА; цукри, такі як сахароза, маніт, трегалоза або сорбіт; солеутворюючі протиїони, такі як натрій; комплекси металів (наприклад, 7п-протеїнові комплекси) і неіонні поверхнево-активні речовини, такі як ТМ/ЕЕМ або поліетиленгліколь (ПЕГ).
Фармацевтичні композиції згідно з даним винаходом можуть бути введені будь-якою кількістю способів для місцевої або системної терапії. Способи введення можуть бути місцевими (наприклад, на слизові оболонки, включаючи вагінальне й ректальне введення), використовуючи трансдермальні пластири, мазі, лосьйони, креми, гелі, краплі, супозиторії, спреї, рідини й порошки, легеневими (наприклад, шляхом інгаляції або інсуффляції порошків або аерозолів, у тому числі за допомогою небулайзеру; інтратрахеальним, інтраназальним, трансдермальним і епідермальним способом), пероральними або парентеральними, включаючи внутрішньовенні, внутрішньоартеріальні, підшкірні, внутрішньоочеревинні або внутрішньом'язові ін'єкції або інфузії або внутрішньочерепними (наприклад, інтратекальне або внутрішньошлуночкове введення).
Антитіло або імунокон'югат згідно з винаходом можуть бути об'єднані в комбіновану фармацевтичну композицію або в режимі дозування як комбінована терапія, із другою сполукою, що володіє протираковими властивостями. Друга сполука комбінованої фармацевтичної композиції або режиму дозування краще має додатковий вплив на навантажене лікарським засобом антитіло (АОС) комбінації так, що вони не виявляють негативного впливу один на одного. Також використовуються фармацевтичні композиції, що
Зо включають ЕОЇ В1-зв'язувальний агент і другий протираковий засіб.
Для лікування захворювання придатна доза антитіла або агента згідно з даним винаходом залежить від типу захворювання, що підлягає лікуванню, тяжкості й перебігу захворювання, чутливості захворювання до лікування, терапевтичних або профілактичних цілей введення антитіла або агента, попередньої терапії, анамнезу пацієнта тощо на розсуд лікаря. Антитіло або агент можна вводити однократно або в серії процедур тривалістю від декількох днів до декількох місяців, або поки не проявиться терапевтичний ефект або зменшиться хворобливий стан (наприклад, зменшиться розмір пухлини). Оптимальна схема введення може бути розрахована, виходячи з вимірювання накопичення лікарського засобу в організмі пацієнта й буде залежати від відносної ефективності антитіла або агента. Лікар може легко визначити оптимальні дози, методологію дозування й частоту введення. У деяких варіантах втілення доза становить від 0,01 мкг до 100 мг на кг маси тіла, і може вводитися один або декілька разів щодня, щотижня, щомісяця або щорічно. У деяких варіантах втілення антитіло або інший
ЕОЇ А1-зв'язувальний агент вводиться один раз кожні два тижні або один раз кожні три тижні. У деяких варіантах втілення дозування антитіла або іншого ЕГО В1-зв'язувального агента становить від приблизно 0,1 мг до приблизно 20 мг на кг маси тіла. Лікар може оцінити частоту введення для дози на основі виміряного часу утримування й концентрації препарату в рідинах або тканинах тіла.
Комбінована терапія може забезпечити "синергізм" і показати "синергетичний ефект", тобто ефект, що полягає в тому, що використання разом активних інгредієнтів дає ефект більший, ніж сума ефектів при використанні сполук окремо. Синергетичний ефект можна досягти тоді, коли активні інгредієнти є: (1) спільно складеними й введеними одночасно в комбінованій лікарській формі однією дозою, (2) введеними по черзі або одночасно у вигляді окремих композицій, або (3) в іншому режимі. При почерговому введенні в почерговій терапії, синергетичний ефект може бути досягнутий при послідовному введенні сполук, наприклад, шляхом ін'єкцій у окремих шприцах. Загалом, при почерговій терапії ефективну дозу кожного активного інгредієнта вводять по черзі, тобто послідовно, тоді як при комбінованій терапії ефективні дози двох або більшої кількості активних інгредієнтів уводять разом.
Варіанти втілення даного винаходу можуть бути додатково визначені за допомогою посилання на наступні не обмежуючі приклади, які докладно описують одержання деяких 60 антитіл згідно з даним винаходом й способи використання антитіл згідно з даним винаходом.
Фахівцям у даній галузі техніки буде очевидним те, що багато модифікацій як матеріалів, так і способів можуть бути здійснені без відхилення від галузі застосування даного винаходу.
ПРИКЛАДИ
Необхідно пам'ятати, що приклади й варіанти втілення описані в даному документі тільки в демонстративних цілях і що різні модифікації або зміни з їх урахуванням будуть запропоновані фахівцям у даній галузі техніки й повинні бути включені в сутність і об'єм даного додатка.
Високі рівні експресії рецептора фолату 1 (БОЇ В1) спостерігаються в пухлинах яєчників, рівні експресії від високих до помірних - у пухлинах мозку, молочної залози, сечового міхура, ендометрія, легенів, підшлункової залози й карциноми нирок. З іншого боку, у нормальних тканинах, до яких належать тканини нирок, легенів, хороїдного сплетіння, підшлункової залози, молочної залози, щитоподібної залози, яєчників, передміхурової залози й легенів, експресія
ЕОЇ В1 обмежена.
У способах кількісної оцінки РОЇВ! використовуються гомогенати свіжозамороженої тканини. У гомогенатах повного об'єму тканини неможливо відрізнити цитоплазматичну експресію від мембран-асоційованої експресії, тому свіжозаморожені зразки не піддаються дослідженню в клінічних умовах. Проте, зразки, фіксовані у формаліні й залиті парафіном (ФФЗП) за бажанням пацієнта можуть бути збережені в клініці для подальших досліджень.
Приклад 1
Імуногістохімічне забарвлювання ЕОЇ Н1 клітинних зразків - ручні способи забарвлювання.
Фіксовані формаліном і залиті парафіном конгломерати клітин і тканин використовувалися як зразки з наступними забарвлюючими реагентами й за наступних умов.
ЯРОСВІ клон ВМУа 77777771 1рРНЯЮ 1 11111111 Ппероксид//:///ИС 11111111 |Тестовийабо // |2Омк/мл.////:/(//СО/ ттиподеп:Прокаріотичний 0 |контроланий./З/| 77777777 рекомбінантний білоквідповідає 189 |препарат/:// | г оальфа-молекули рецептора фолату. | ////////// |сироватжиконя/-:/ (Контрольнийпрепарат:ї 77111111 (Месіої, СайРК-6100) 77777771 ав) 11111111 ЇХромаєн,///// |ДАБ(Сак?;//7/7/7//С(ЕеС 11111111 ЧаспроявудАБ //|збхв.//:////Ну'г
Зафіксовані у формаліні й залиті парафіном (ФФЗП) біоптати пухлини яєчників пацієнта й ксенотрансплантатну пухлину яєчників забарвлювали мишачими анти-ЕОЇ В1 антитілами клону
ВМ3.2, (І еіса, Саї 2 МС -І-ЕВаїрНна), як контроль використовували тиЇдс1 вир-ва Сошег. Після демаскування антигена буфером із рівнем рН 9,5, стекла блокували 2 95 кінською сироваткою в комбінації з авідином. Стекла промивали ФСБ і інкубували за кімнатної температури протягом 60 хвилин з анти-РОЇ 1 або контрольним тидсі антитілом, а потім 30 хвилин з біотинільованим анти-мишачим Ідсіі 40 хвилин з комплексом авідин-біотин-пероксидаза для виявлення зв'язаного вторинного антитіла. Інкубація протягом 5 хвилин з ДАБ (3,3- діамінобензидин тетрагідрохлоридом) привела до появи колірного сигналу. Стекла піддавали контрастному забарвлюванню гематоксиліном.
Інтенсивність і картина розподілення забарвлювання РОЇ ВІ були оцінені в порівнянні з контрольним забарвлюванням Ідс (неспецифічним). Інтенсивність оцінювали за шкалою від 0 до З (0 - немає забарвлювання, 1 - слабке, 2 - помірне й З - сильне), а розподілення оцінювали як фокальне («25 95 забарвлених клітин), неоднорідне (25-75 95 забарвлених клітин) і однорідне (» 75 95 забарвлених клітин).
ФФЗП зразки були одержані з мікромасивів пухлини, а блоки людських тканин - із сімох різних пухлин, як описано нижче.
ФФЗП тестові зразки (ТМА)
ЖНДРЛ7777777771111111171Ї111111111111171811111111111111Сентм залози жПухлинланирки.д С Ї77777777771111111781111111СсС2С
ЕОЇІ А досліджуваний препарат і мишачий анти-ОЇ ВІ клон ВМ3.2 були досліджені для визначення специфічності зв'язування з антигеном пИРОЇ В1. Використовуючи описані способи
Ї-Х забарвлювання, ФФЗП зрізи 300-19 і 300-19 трансфіковані пиРОї Вт (300-10/РОІ ВІ) і конгломерати клітин забарвлювали й оцінювали на РОЇ ВІ. Для визначення ЕОЇ НІ клітини досліджуваного препарату спеціально забарвлювалися 300.19/РОІ В1- і не продемонстрували забарвлювання в клітинах 300-19 (3 - однорідне й негативне забарвлювання, відповідно). Ці результати демонструють, що клон ВМ3.2 орієнтований винятково на пигОЇ В1 антиген. (Фігура 1).
ВМ3.2 антитіла також використовували для виявлення експресії РОЇ В1 у зразках тканин.
Імунореактивність кожного тестового й контрольного зразка тканин і клітинних конгломератів визначав патологоанатом-консультант, д-р ЮОамій ЮОоптап. Спочатку були оцінені клітинні конгломерати для контролю, потім оцінювалися зразки тканин. Для кожної тканини повідомлялися оцінка й опис інтенсивності й однорідності забарвлювання. Оцінка інтенсивності забарвлювання й величина однорідності описані нижче. Кінцевий бал для кожного зразка тканини обчислювався, як оцінка тестового зразка мінус оцінка відповідного контрольного зразка. Рівень ЗАК для кожного зразка оцінювали шляхом порівняння оцінки забарвлювання з каліброваним зразком конгломерату клітин. засобу) Однорідність (кількість клітин) забарвлених 0 |Негативна.//:////',й4й)/С/С 11 |ЇСлабка.////77777777777777717117Ї171717171717171717171717101111111111111|Негативна.:77/:У"УДГ
Значення показника зв'язаних антитіл на клітину (ЗАК) були визначені для ЕГО В1- позитивних пухлинних клітинних ліній (КВ, І5НОМІ, УЕС23 ії ОМСАВЗ) за допомогою антн-
ЕОЇ В1-фікоеритрину, ВО Оцапіїрпіе Веадвз і проточної цитометрії й показали різні значення ЗАК (Фігура 2). Умови забарвлювання були оптимізовані для РОЇ В1 так, щоб конгломерати клітин, одержані з РОЇ В1-позитивних пухлинних клітинних ліній показали різні рівні інтенсивності ІГХ забарвлювання. Конгломерат клітин КВ показав дуже високий ступінь однорідності забарвлювання з високою інтенсивністю (3-4), конгломерат клітин ІАОМІ показав високий ступінь забарвлювання (3), конгломерат клітин УЕСЗ показав помірний ступінь (2-3) неоднорідного забарвлювання, а конгломерат клітин ОМСАНЗ показав низький ступінь
Зо інтенсивності (1-2) неоднорідного забарвлювання. Тенденції інтенсивності забарвлювання
ЕОЇ НІ, спостережувані на конгломератах клітин відповідають наведеним значенням ЗАК, де КВ клітини показали високе значення ЗАК 1700000, І2ВОМ-1 клітини показали наступне за величиною значення ЗАК 260000, УЕС-3 мали більш низьке значення ЗАК 41000, а ОМСАВЗ клітини показали найнижче значення ЗАК 4000. Результати забарвлювання й відповідні значення ЗАК перераховані в таблиці нижче.
Значення ЗАК і відповідні результати забарвлювання
ПЧЕОЇ ВІ клітинних ліній і відповідних клітинних конгломератів
Додаткові клітинні лінії, у тому числі Сарап-1, даг, Нес-1-А, Нес-1-В, Іспікажа, МС! Нг92,
ВТА474ЕБЕЇ, РА-1, ОУ-90, СаОу-4, Сабум-3, А2780, Омсаг-5, Омсаг-4, НСТ-15, 786-О, МСІ Н8ВЗ8, МС
Н 522, МСІ Н2г110, МС! НІ734, МС! Н228 їі РГО.ОМУ-3 були досліджені й визнані ЕОЇ В1 позитивними, але їх рівні експресії РОЇ В1 і чутливості до анти-РОЇ В1 імунокон'югата сильно відрізняються. Для довідкових цілей кращими є клітинні лінії що володіють стабільною експресією ЕОЇ А і чутливістю до анти-ЕОЇ В1 імунокон'югатів.
Особливо важливим є те, що способом ІГХ удалося виявити стабільну експресію ЕОЇВ1 зразків тканини раку яєчників і недрібноклітинного раку легенів (НДРЛ). Як показано на Фігурі 3, експресія ЕОЇ В1 може бути вірогідно виявлена в зразках карциноми яєчників і НДРЛ із оцінкою від 2 неоднорідної до З однорідної. Значення ЗАК для цих зразків знаходяться у діапазоні від приблизно 41000 для зразків з оцінкою 2 неоднорідною, до більш ніж 260000 для зразків з оцінкою З однорідною. Як показано на Фігурі 4, висока інтенсивність і однорідність забарвлювання спостерігалася також для раку яєчників, аденокарциноми легенів і бронхіолоальвеолярної карциноми. Крім того, було додатково встановлено, що експресія
ЕОЇ ВІ у зразках тканин НДРЛ (Фігура 5) і раку яєчників (Фігура 6) переважно локалізована на мембранах. Експресія була виявлена на декількох зразках однієї пухлини, а також на зразках різних пухлини. Цікаво, що жоден зі зразків пухлини товстої кишки, молочної залози або дрібноклітинного раку легенів не показав оцінки вище 2 неоднорідної.
Приклад 2
Іп мімо ефективність пимМом19-РЕСЯАМа!1-ОМА ї пиМом19-5РОВ-ОМА кон'югатів у порівнянні з аналогічними нетаргетними кон'югатами в моделі ксенотрансплантата КВ
ЕОЇ В1-таргетний розщеплюваний кон'югат пимМом19-5Р0ОВ-ОМА у порівнянні з нетаргентним пиб242-5РОВ-ОМ4, нерозщеплюваний кон'югат НпиМом19-РЕСЧА-Ма1-ОМ4 у порівнянні з нетаргентним пиС242-РЕСАМа1-ОМ4 були протестовані за допомогою встановленої моделі ксенотрансплантата КВ клітин (дуже висока експресія ЕОЇ В1, З однорідна при ІГХ із ручним забарвлюванням), імплантованого підшкірно ТКІН-мишам. Миші були випадковим способом розподілені за масою тіла в групи терапії й піддавались дії або один раз (5РОВ кон'югатами) на
Зо З день після інокуляції клітин, або тричі на тиждень у дні 3, 10 ї 17 після інокуляції клітин 5 і 10 мг кон'югата/кг маси тіла, відповідно. Середній об'єм пухлини в різних групах терапії наведений на Фігурі 7. Терапія за допомогою пиМом19-5Р08-0М4 або пиМом19-РЕСАМа1-ОМА привела до зниження середнього об'єму пухлини в порівнянні з контрольною групою, у якій використовувався ФСБ, у той час як лікування за допомогою будь-якого з відповідних не таргетних кон'югатів не продемонструвало помітного ефекту.
Приклад З
Залежна від дози протипухлинна активність ІМОМ853 при дії на ОМСАВ-З3 ксенотрансплантат карциноми яєчників людини.
Протипухлинний ефект ІМОМ853 оцінювали на стандартній моделі підшкірного ксенотрансплантата карциноми яєчника. ТКІН-мишам інокулювали клітини карциноми яєчника
ОМСАВ-3 (1х107 клітин/тварину), які вводили підшкірно в правий бік тварини. Коли об'єм пухлин досягав приблизно 100 мм3 (21 день після інокуляції пухлинних клітин), мишей випадковим способом ділили на чотири групи (по б тварин у групі). Мишей лікували за допомогою однократної внутрішньовенної ін'єкції ІМЕМ853 в дозі 1,2, 2,5 або 5,0 мг/кг. Тварини контрольної групи одержували однократну внутрішньовенну ін'єсцію ФСБ. Ріст пухлини контролювали шляхом вимірювання її розміру двічі на тиждень. Розмір пухлини розраховували за формулою: довжина х ширина х висота х //».
Препарат ІМЕМ853 продемонстрував високу активність у відношенні ОМСАВ-3 пухлин (ІГХ оцінка 3, однорідна, при використанні ручних ІГХ способів) з погляду інгібування росту пухлини (Т/С - 0 95), при рівнях дози 2,5 і 5,0 мг/кг (Фігура 8). У 6/6 мишей, що одержували ІМЕМ853 в дозі 5,0 мг/кг була досягнута повна регресія (ПР) пухлини. У мишей, що одержували ІМЕМ853 у дозі 2,5 мг/кг була досягнута часткова регресія (ЧР) пухлини у 6/6, і ПР - у 4/6. Препарат
ІМОМ853 показав активність у дозі 1,2 мг/кг, з Т/С, що дорівнює 18 95 при ЧР 2/6 і ПР 1/6. У відповідності зі стандартами Національного інституту раку (МС) значення Т/С у діапазоні від 10 до 42 95 вважається активним, значення Т/С менше 10 95 вважається надзвичайно активним.
Приклад 4
Залежна від дози протипухлинна активність ІМЕМ853 при дії на ІСНОМ-1 ксенотрансплантат карциноми яєчників людини.
Протипухлинний ефект ІМОМ853 оцінювали на стандартній моделі підшкірного ксенотрансплантата карциноми яєчника. ТКІН-мишам інокулювали клітини карциноми яєчника
ІСЖВОМ-1 (1х107 клітин/тварину), які вводили підшкірно в правий бік тварини. Коли об'єм пухлин досягав приблизно 100 мм (7 день після інокуляції пухлинних клітин), мишей випадковим способом ділили на чотири групи (по б тварин у групі). Мишей лікували за допомогою однократної внутрішньовенної ін'єкції ІМЕМ853 в дозі 1,2, 2,5 або 5,0 мг/кг. Тварини контрольної групи одержували однократну внутрішньовенну ін'єкцію ФСБ. Ріст пухлини контролювали шляхом вимірювання її розміру двічі на тиждень. Розмір пухлини розраховували за формулою: довжина х ширина х висота х //».
Препарат ІМЕОМ853 продемонстрував високу активність у відношенні ІЇНАОМ-1 пухлин (ІГХ оцінка 3, однорідна, при використанні ручних ІГХ способів) в дозах 2,5 і 5,0 мг/кг результуюче співвідношення Т/С дорівнює 5 95 для обох доз (Фігура 9). У 5/6 і 6/6 мишей спостерігалася часткова регресія пухлини в дозах 2,5 і 5,0 мг/кг, відповідно. У дозі 1,2 мг/кг (Т/С - 47 9б) препарат ІМЕМ853 активності не продемонстрував.
Приклад 5
Залежна від дози протипухлинна активність ІМЕМ853 при дії на ОУ-90 ксенотрансплантат карциноми яєчників людини.
Протипухлинний ефект ІМОМ853 оцінювали на стандартній моделі підшкірного ксенотрансплантата карциноми яєчника. ТКІН-мишам інокулювали ОУ-90 клітини карциноми яєчника ІСНОМ-1 (1х107 клітин/тварину), які вводили підшкірно в правий бік тварини. Коли об'єм пухлин досягав приблизно 100 мм (13 день після інокуляції пухлинних клітин), мишей випадковим способом ділили на чотири групи (по б тварин у групі). Мишей лікували за допомогою однократної внутрішньовенної ін'єкції ІМЕМ853 в дозі 1,2, 2,5 або 5,0 мг/кг. Тварини контрольної групи одержували однократну внутрішньовенну ін'єкцію ФСБ. У контрольній групі, що одержувала ФСБ, внутрішньовенні ін'єкції проводили за таким самим графіком. Ріст пухлини контролювали шляхом вимірювання її розміру двічі на тиждень. Розмір пухлини розраховували за формулою: довжина х ширина х висота х /7/».
Препарат ІМЕМ853 продемонстрував активність у відношенні ОМУ-90 пухлин (ІГХ оцінка 3, однорідна-неоднорідна при використанні ручних ІГХ способів) в дозах 2,5 і 5,0 мг/кг, результуюче співвідношення Т/С дорівнює 36 і 18 95, відповідно (Фігура 10). У двох тварин спостерігався частковий регрес пухлини в групі 5,0 мг/кг, ніякого іншого регресу пухлини в будь- якій із груп не спостерігалось. У дозі 1,2 мг/кг (Т/С - 77 95) препарат ІМЕМ853 активності не продемонстрував.
Приклад 6
Залежна від дози протипухлинна активність ІМЕМ853 при дії на БКОМУ-3 ксенотрансплантат карциноми яєчників людини.
Протипухлинний ефект ІМОМ853 оцінювали на стандартній моделі підшкірного ксенотрансплантата карциноми яєчника. ТКІН-мишам інокулювали клітини карциноми яєчника
ЗКОМ-3 (1х107 клітин/тварину), які вводили підшкірно в правий бік тварини. Коли об'єм пухлин досягав приблизно 100 мм3 (26 день після інокуляції пухлинних клітин), мишей випадковим способом ділили на чотири групи (по б тварин у групі). Мишей лікували за допомогою однократної внутрішньовенної ін'єкції ІМЕМ853 в дозі 1,2, 2,5 або 5,0 мг/кг. Тварини контрольної групи одержували однократну внутрішньовенну ін'єсцію ФСБ. Ріст пухлини контролювали шляхом вимірювання її розміру двічі на тиждень. Розмір пухлини розраховували за формулою: довжина х ширина х висота х //».
Препарат ІМСМ853 не продемонстрував активність у відношенні БКОМ-3 пухлини (ІГХ оцінка 1-3, фокальна при використанні ручних ІЇГХ способів) у всіх дозах, з ростом пролікованих
ІМОаМ853 пухлин паралельно контрольній групі, пролікованій ФСБ (Фігура 11). Аналіз даних не проводився, а саме дослідження було достроково припинене у зв'язку з відсутністю активності
ІМОМВ853 у цій моделі.
Приклад 7
Залежна від дози протипухлинна активність ІМЕМ853 при дії на КВ ксенотрансплантат 60 людської аденокарциноми шийки матки.
Протипухлинний ефект ІМОМ853 оцінювали на стандартній моделі підшкірного ксенотрансплантата аденокарциноми шийки матки. ТКІН-мишам інокулювали клітини аденокарциноми шийки матки КВ (1х107 клітин/тварину), які вводили підшкірно в правий бік тварини. Коли об'єм пухлин досягав приблизно 100 мм" (7 день після інокуляції пухлинних клітин), мишей випадковим способом ділили на чотири групи (по б тварин у групі). Мишей лікували за допомогою однократної внутрішньовенної ін'єкції ІМЕМ853 в дозі 1,2, 2,5 або 5,0 мг/кг. Тварини контрольної групи одержували однократну внутрішньовенну ін'єкцію ФСБ. Ріст пухлини контролювали шляхом вимірювання її розміру двічі на тиждень. Розмір пухлини розраховували за формулою: довжина х ширина х висота х //».
Препарат ІМЕОМ853 продемонстрував високу активність у відношенні пухлини КВ із погляду гальмування росту пухлини (Т/С - 0 95) у дозах 2,5 і 5,0 мг/кг (Фігура 12). У шести із шести мишей у групі 5,0 мг/кг і у п'яти із шести мишей у групі 2,5 мг/кг спостерігалася ПР із повним зникненням пухлини до кінця дослідження (день 120). Доза 1,0 мг/кг продемонструвала активність, результуюче співвідношення Т/С дорівнювало 37 95, однак ні часткової, ні повної регресії в цій дозі не спостерігалось.
Приклад 8
Імуногістохімічне забарвлювання БОЇ НІ клітинних зразків, фіксованих у формаліні й залитих парафіном (ФФЗП) - автоматизовані способи забарвлювання.
При аналізі ІГХ забарвлювання використовуються ЇМО реагенти класу І. у тому числі антитіла Момосазіта БОЇВ (МомосавзігаЛ єїса Саї й МСІ-Ї-РВаірна, клон ВМ3.2) як досліджуваний препарат і автоматизоване обладнання для забарвлювання і єїса Вопіа ВХ.
Зв'язаний досліджуваний або контрольний зразок виявлявся шляхом інкубації із системою виявлення Ієіїса ВопО Неїїпє, яка включає використання первинного реагенту (кролячий антимишачий /ІдсС), а потім реагенту полімеру (козячий антикролячий полімер) і 3,3- діамінобензидин тетрагідрохлориду (ДАБ) хромогену. ФФЗП зразки забарвлювали із зазначеною концентрацією первинного антитіла (одержаний розведенням в І еіса розріджувачі
ЕОЇ ВТ), як показано нижче.
Антитіла для ІГХ
Альфа-рецептори фолієвої кислоти (Момосавіга/ єїса Саї Ж МОСІ-
Досліджуваний препарат 7? І-ЕВаїрпа, Гої 159506), мишачі, клон ВМ3.2, рідкий концентрат: 75 мкг/мл
ІДС! (ВесКтап Соцшіег Саї й 6602872, Іоїв2575Р504-23 і
Контрольний препарат 7 2575Р504-26.) концентрація початкового розчину: 1 мг/мл, мишачі, клон 2т18-2Е5
Спосіб аналізу ФФЗП за допомогою І єіса Вопа АХ нини: пи ши т пили них ст очищення) ш-000000 КЕ п - очищення)
Виявлення я :
Коо)
Усі забарвлені зразки досліджувались і оцінювались. Спочатку досліджували контрольні зразки, потім тестові зразки (зрізи цілком і окремі центральні фрагменти тканинних блоків). Для кожної досліджуваної пухлинної тканини або конгломерату клітин проводили опис інтенсивності забарвлювання й відповідних пропорцій забарвлених клітин пухлини. Забарвлювання, асоційоване з мембранами, реєстрували для кожного зразка. У випадку, якщо від одного пацієнта були одержані дублюючі оцінки, в аналіз був включений тільки найвищий бал. Якщо при оцінюванні реєстрували забарвлювання тільки цитоплазми, остаточна оцінка дорівнювала нулю (0). Інтенсивність і однорідність кожного зразка подавалися, як описано в таблиці нижче.
Інтенсивність і картина розподілення забарвлювання були оцінені в порівнянні з контрольним забарвлюванням Ідс (неспецифічним). Інтенсивність оцінювали за шкалою від 0 до З (0 - немає забарвлювання, 1 - слабке, 2 - помірне й З - сильне) а розподілення оцінювали як фокальне («2595 забарвлених клітин), неоднорідне (25-75 95 забарвлених клітин) і однорідне (275 95 забарвлених клітин). У нормальній тканині при розрахунках інтенсивності й пропорції розглядалися тільки певні підструктури.
ІЇГХ система оцінки, що складається зі шкали інтенсивності й рівномірності
Інтенсивність (кількість забарвлюючого засобу)
Спостережувана ;. . . . . . ; Категорія інтенсивності Оцінка інтенсивності інтенсивність 11101011 |Негативна./7/7777777777777777//|Ї7711111111111110111111111сСс21 01111111 |Слабба.7///77777777777771 Її
Слабка до помірної - 2
З
Однорідність (відсоток тільки забарвлених мембран клітин) 00001111 |Негативна.:/7777/7/7/7/:/3///./:-/..:; ;3л3;:;/4:Ц:/!
Неоднорідна (гетерогенна) 25-75 Чо
Однорідна (гомогенна)
ФФЗП зразки були одержані з мікромасивів пухлини, а також блоки людських тканин із сімох різних пухлин, як описано нижче.
ФФЗП тестові зразки: фрагменти тканинних блоків
Кількість . й Загальна
Анатомічна зразків на т.
Постачальник | Мо за каталогом Код кількість зона одного т. . пацієнтів пацієнта ! РТ-АВВ-КІЮ- . ! РТ-АВВ-Ї Ма- : : РТ-АВВ-ОМА-
Яєчники Віоснаїп Т8235725-5 ГАННА: ! в2 122111-1 ! РТ-АВВ-ОМА- ! РТ-АВВ-ОМА-
Матка . РТ-АВВ-ЕМЕ- с. . ! РТ-АВВ-
ФФЗП тестові зразки: зрізи цілком оз лань нен
З СснтМ властивостями аденокарциноми ендометрію, серозної й світлоклітинної аденокарцинома високого ступеня
Яєчники папілярних, серозних, ендометріоїдних і світли клітин 11111116 |Реоїводепех )|серознааденокарцдинома.//:///:/НС:(СХ/://:/З|; Я 11171118 |Реоїводепех |серознааденокарциномапапілярноготипу ( 77717178. юю |СНТМ (серознааденокарциномапапілярноготипу.д/-З ацинарна аденокарцинома, добре бронхіолоальвеолярної
Легені ою рен бенненеянння карцинома
ШИНИ Шо ший властивостями світлоклітинної 777171717178 1... |СНТМ аденокарцинома.7/77/7/7/:///:КЗН)/С:(«/3//СС сс
Клітини (пухлинні клітини або трансфіковані клітини) були зафіксовані формаліном і залиті парафіном (ФФЗП). При визначенні за допомогою проточної цитометрії, ФФЗП клітинні конгломерати зразків показали різні діапазони експресії РОЇ А1. У цьому дослідженні також були використані нормальні людські тканини для позитивного й негативного контролю й для аналізу специфічності. Конгломерати клітин показали різні рівні РОЇ ВІ, відповідні оцінки наведені нижче. У конгломератах клітин спостерігалася слабка кореляція між оцінками забарвлювання й відповідними рівнями експресії РОЇ 81 (зв'язаних антитіл на клітину, ЗАК, визначається за допомогою каліброваної проточної цитометрії). Наприклад оцінка 1-3 неоднорідна була дана для 5МУ620 і ІМНОУ-1, що показали значення ЗАК 40098 і 565481, відповідно. Крім того, клітини
НеГга показали значення ЗАК 1,5 млн. при оцінці 2-3 неоднорідна, у той час як 300.19/Е81 показали значення ЗАК 830003 при високій оцінці - З однорідна.
Зо
Остаточні оцінки для клітинних конгломератів при концентрації досліджуваного препарату 1,9 мкг/мл аОдержане значення ЗАК являє собою середнє значення зв'язаних антитіл на клітину в популяції клітин і визначається в такий спосіб: використовується концентрація 1,0х108 М анти-
ЕОЇ А1-РЕ (1:1) для визначення значень ЗАК відповідної лінії клітин за допомогою способів проточної цитометрії й Оцапіїргйе "м Веадз (ВО Віозсіепсев).
Гістограми проточної цитометрії показують розподілення клітин у порівнянні із числом анти-
ЕОЇ В1 зв'язків на клітину (рівень експресії РОЇ А). І гістограми, і відповідні результати ІГХ забарвлювання показують, що кожна із цих клітинних ліній включає гетерогенну популяцію клітин, що володіють широким діапазоном експресії РОЇ ВТ. Виключенням є клітинна лінія 300.19/ЕН1Т, що продемонструвала й рівномірну гістограму проточної цитометрії, і оцінки ІГХ забарвлювання. Ці дані свідчать про те, що клітинні лінії що експресують РОЇ В1 більш рівномірно, показують більш точну кореляцію між значеннями ЗАК і відповідними оцінками забарвлювання. Хоча аналіз показав позитивне забарвлювання всіх ГОЇї В1-позитивних контрольних конгломератів клітин, існує лише слабка кореляція між оцінкою забарвлювання й відповідними рівнями експресії РОЇВ більшості цих конгломератів клітин. Таким чином, клітинні конгломерати цієї групи не можуть бути ідентифіковані як контрольні зразки з високою, середньою й низькою експресією. Типові фотозображення й гістограми, що показують експресію
ЕОЇ ВІ у клітинних лініях, визначену за допомогою ІГХ і проточної цитометрії наведені на фігурі 13.
Для визначення умов аналізу був досліджений діапазон розведень досліджуваного й контрольного препарату для того, щоб вибрати розведення, відповідні до необхідного рівня чутливості. Експерименти проводили на панелі ФФЗП зразків, включаючи РОЇ Н1-позитивні конгломерати клітин і фрагменти тканинних блоків, та ТМА, що складаються з ЕГО В1 позитивних і негативних нормальних тканин (надниркової залози (кори/мозкової речовини), молочної залози (проток і долей/сполучної тканини), фаллопієвих труб (поверхневого епітелію/м'язової стінки), нирок (канальців/клубочків), легенів (пневмоцитів ІЛІ типу/міжальвеолярної сполучної тканини), підшлункової залози (каналів/острівців Лангерганса), слинних залоз (каналів/строми), шкіри (потових залоз/епідермісу), шлунка (поверхневого епітелію/підслизової основи)), і цілих зрізів пухлинних тканин (10 зразків пухлин яєчників і 10 зразків пухлин легенів). Кожний зразок забарвлювали за допомогою серійних розведень концентрації досліджуваного препарату (0,25, 0,5, 0,9, 1,9, 3,68 ї 7,5 мкг/мл) або концентрації контрольного препарату 1,9 мкг/мл і 3,8 мкг/мл. Відносні інтенсивності забарвлювання для кожного розведення порівнювали для кожного зразка для визначення оптимального ступеня
Зо розведення. Критерієм для оптимального ступеня розведення було розведення, яке 1) не викликало забарвлювання фону в забарвлених зразках з ізотипічним контролем 2) не викликало забарвлювання тканини зразка для негативного контролю, забарвленого тестовим препаратом і 3) демонструвало відмінність між різними рівнями асоційованої з мембранами експресії РОЇ В серед зразків, що являють інтерес (ФФЗП тканини пухлини яєчників, пухлини ендометрію, НДРЛ і пухлини нирки). З п'яти розведень досліджуваного препарату концентрація 1,9 мкг/мл показала кращий динамічний діапазон результатів забарвлювання за допомогою автоматизованих протоколів І єїса Вопа ВАХ (Протоколи термічної обробки й депарафінізування, протокол НІЕК за допомогою ЕН2 протягом 20 хвилин і протокол ІГХ забарвлювання БЕ з додатковим промиванням).
Приклад 9
Ідентифікація й характеристика контрольних зразків, що характеризують динамічний діапазон аналізу автоматизованих способів забарвлювання
Контроль якості: нормальні людські тканини слинної залози, легенів і підшлункової залози були визначені, як тканини для позитивного контролю, використовувані в кожному аналізі, щоб переконатися, що процедура забарвлювання виконується, як очікувалося. Нормальні тканини стравоходу людини були ідентифіковані як негативний контроль. Ці контрольні зразки були охарактеризовані в такий спосіб: для того, щоб забезпечити контроль, який охоплює динамічний діапазон аналізу, матричний мультитканинний блок (ММБ), що складається з декількох РОЇ В1 позитивних і негативних зразків нормальної тканини, повинен мати динамічний діапазон аналізу, використаного як аналізу перевірки контролю під час фаз оптимізації й валідації.
Чотири типи нормальних тканин з визначеними структурами в цьому ММБ були визначені як відповідні види контролю для аналізу в такий спосіб: дихальний епітелій нормальної людської легені (оцінка 2, однорідна); протоки нормальної підшлункової залози людини (оцінка 3, однорідна, апікальне забарвлювання); проміжні протоки нормальної людської слинної залози (оцінка 1-2 неоднорідна) і нормальна тканина людського стравоходу (оцінка 0). Усього було проведено більше 4 аналізів, відповідні контрольні аналізи цього ММБ дали ідентичні результати. Ці результати показують, що вибраний контрольний зразок дає стійкі результати й охоплює динамічний діапазон аналізу.
Структури в нормальних тканинах, визначені як контроль, що охоплює динамічний діапазон аналізу
Оцінка забарвлювання . (досліджуваний препарат) препарат залоза забарвл.
Апікальне забарвлювання визначається як поляризоване неоднорідне забарвлювання мембрани
Приклад 10
Аналіз ефективності автоматизованого способу забарвлювання.
Використання даного аналізу дозволяє специфічно виявити відтворюваність РОЇ ВІ і з відповідною чутливістю диференціювати різні рівні й одноманітність асоційованої з мембранами експресії БОЇВ1 (оптимальний динамічний діапазон) ФФЗП тканин пухлини яєчників, ендометрію, НДРЛ і нирок. Таким чином, критеріями ефективності вважаються специфічність, відтворюваність і чутливість.
Специфічність і чутливість аналізу оцінювали шляхом порівняння забарвлювання нормальних тканин з вивченням результатів аналізу, що повідомлялися раніше. Результати забарвлювання в цьому дослідженні були зіставлені з відповідними результатами забарвлювання в роботі 5согег єї аі. 2010 (А Риї Іттипопівіоспетіса! Емаїцайоп ої а Момеї
Зо Мопосіопа! Апіїбоду їо оїаїє Ресеріог-агрпа. Те Момосавзігта дщоцтпа! ої Нівіораїпоіоду,
ВЕАСЕМТ5: 2010 (3)8-12, що описує один і той самий клон антитіла ВМ3.2) із ФФЗП нормальної тканини й з дослідження крос-реактивності тканин (КРТ) за допомогою ІМЕМ85З (пиМом19 (М9346А) антитіл) на свіжозамороженій нормальній тканині ((ттиподеп Нероп ІМН28- 003). Порівняння результатів забарвлювання для кожного способу свідчить, що три аналізи показали в цілому аналогічні нормальні профілі забарвлювання тканин з різною відносною чутливістю. Аналіз бсогег виявився найменш чутливим, аналіз із дослідження (ІМН28-011) володів проміжною чутливістю, спосіб дослідження КРТ був найбільш чутливим. Деякі структури показали позитивне забарвлювання тільки при використанні двох більш чутливих способів (аналізу з дослідження й КРТ аналізу). Не було жодного прикладу позитивного забарвлювання в найменш чутливому аналізі бсогег, який також не був позитивним в аналізі з дослідження й при використанні способу КРТ. Дані результати показують, що специфічність і чутливість аналізу з дослідження є придатною для оцінки РОЇ Н1 експресії в нормальних тканинах.
Специфічність і чутливість аналізу з дослідження додатково характеризується забарвлюванням і оцінкою панелі пухлинних ММБ, що складається із клітин раку яєчників, ендометрію, НДРЛ і раку нирок (набір зразків призначений для клінічного використання аналізу).
Позитивне забарвлювання послідовно локалізувалось в пухлинній тканині із прилягаючими компонентами нормальної тканини, включаючи строму, судини, лімфоцити й нормальні тканини органа. Забарвлювання було негативним або позитивним, як і очікувалось. Для кожного підтипу карциноми яєчника або НДРЛ розподілення оцінок забарвлювання між ММБ різних виробників продемонструвало аналогічне розподілення оцінок, що наводить на думку, що даний спосіб є нечутливим до різних умов фіксації й обробки. Оскільки моделі розподілення серед ММБ були подібні, дані з різних блоків були об'єднані й оцінки були класифіковані. Підсумкові оцінки для підтипів пухлини, що включають 20 або більше зразків на підтип перераховані в наступних таблицях. Як показано в цих таблицях, динамічний діапазон оцінок відзначається для кожного типу пухлини й указує, що цей аналіз демонструє відповідну чутливість до розпізнавання різних рівнів і різних видів однорідності забарвлювання експресії РОЇ ВІ, асоційованої з мембранами в тканинах пухлини яєчників, ендометрію, НДРЛ і нирок. Типові фотозображення серозної карциноми яєчників, ендометріоїдної карциноми яєчників, НДРЛ, раку ендометрію й нирковоклітинної карциноми показані на Фігурах 14-18. Додаткові фотографії, придатні, наприклад, для посібника з забарвлювання або діагностичного набору, показані на Фігурах 23- 25. Дані дослідження показують, що аналіз є специфічним і володіє відповідною чутливістю для використання як діагностичного реагенту або його доповнення.
Підсумкові оцінки забарвлювання переважних підтипів пухлин яєчників
Номер зразка (95)
Підтип Всього З 22 21 1-3 Будь-який Негативн. неодн. "|Інеодн. Інеодн. | фокальн. | позитивн. ндометроїдний 335.1 15.1 18.1 .20.Ї. 1.6 1. 26 | 5.9 Л лоМметриа
Муцинозний 10322912 141 5:10 15:14 у (йо | (7 | (9 1 п7 1 (0) 1 7 | (83) серозний 129 | 44 | 92 1 92 |.ЮЙЮю 8 | 100 | 29 й (по) | (3 | (79 | 79 1 (6) 1 083 | (223 1) фокальний характер забарвлювання був виключений
Підсумкові оцінки забарвлювання пухлини НДРЛ
Тип Підтип У З 22 21 1-3 Будь-який | Нега- сього неодн. " |Інеодн. "Інеодн. "| фокальн. | позитивн. | тивн.
Аденокарци- нома Бронхісло. | 7 | 2 | 5 | 5 | 0 | 5 | 2 п (00) (293 (7) | (7) (71) (29)
Плоскоклітин- | всі 74 | 1 | 4 | 6 | 6 | 12 | 62 ний рак і (п0о0) | (3 | (5) | (8) | (8) | (6) | (89) 1) фокальний характер забарвлювання був виключений
Включені всі зразки аденокарциноми, за винятком зазначеного типу зразків бронхіолоальвеолярної карциноми
Підсумкові оцінки забарвлювання для аденокарциноми ендометрію й світлоклітинного раку нирок
Кількість зразків (95)
Тип/підтип пухлини Усього З 22 21 1-3 Будь-який Негативн. неодн. "|Інеодн. "Інеодн. | фокальн. | позитивн.
Ендометрій/аденока- рцинома (00) | (93 | (400 | (52) | (17) | (695 | (39
Нирки/Світлоклтин- | 34 | 0 1 9 | 23 | 6 | 29 | 5 ний рак (00) | (0) | (26) | (68) | (18) | (855 | (5) 1) фокальний характер забарвлювання був виключений
Точність аналізу дослідження вивчали шляхом виконання тесту внутрішньої й зовнішньої відтворюваності аналізу за допомогою трьох ФФЗП зразків пухлини тканини яєчників, НДРЛ або раку нирок, де кожний зразок демонстрував високу, середню або низьку оцінки. Для оцінки внутрішньої відтворюваності дев'ять стекол, кожне з яких містило зріз пухлини легені, яєчника й нирки були поміщені в дев'ять випадкових місць на І єіса Вопа ВХ. Для оцінки зовнішньої відтворюваності три стекла, що містять зрізи того самого зразка забарвлювали в три різні дні.
Всі стекла після проведення експериментів внутрішньої й зовнішньої відтворюваності були оцінені й продемонстрували еквівалентні оцінки забарвлювання для кожного відповідного зразка: пухлина легенів (висока: З однорідна), пухлина яєчників (середня: 2 неоднорідна) і пухлина нирок (низька: 1-2 неоднорідна). Одержані дані демонструють відтворюваність для різних типів тканин з низьким, середнім і високим рівнем експресії.
Приклад 11
Експресія ЕОЇ ВІ з ІГХ оцінкою 22 гетерогенна є критерієм відбору пацієнтів для лікування із застосуванням ІМСЕМ853.
Рівні експресії РОЇ В1 пухлинних клітинних ліній були визначені за допомогою кон'югата антитіло-РЕ (ЕВ1-24-РЕ) і системи ОцапііВВАЇ!ІТЕ. Три клітинні лінії карциноми яєчників (ВОМ-1,
ЗКом-3 і Оусаг-3), лінія клітин хоріокарциноми Уед-3 і клітинна лінія карциноми шийки матки КВ були включені в дослідження. Для того щоб одержати значення ЗАК, що заслуговують довіри, експерименти по зв'язуванню з кон'югатом антитіло-РЕ необхідно проводити при насичуючій концентрації (концентрації, за якої всі доступні сайти зв'язування зайняті кон'югатом). Для визначення такої концентрації для кон'югатів ЕНВ1-24-РЕ ми провели експерименти по зв'язуванню на панелі РОЇ В1-позитивних клітинних ліній з різними рівнями експресії ЕОЇ В1.
Клітини інкубували з ЕН1-24-РЕ кон'югатом у широкому діапазоні концентрацій протягом двох годин на льоду, промивали ФАС-буфером (ФСБ із 1 95 БСА), фіксували 1 95 формальдегідом у
ФСБ і аналізували на проточному цитометрі ЕАС5ЗСаїїриг. При концентрації 1х108 М кон'югат насичує сайти зв'язування на клітинній поверхні всіх протестованих ліній клітин Ідгом-1, дед-3,
ЗКОохУ-3, ОмусаІ-3 і КВ. У наступних експериментах зв'язування ЕН1-24-РЕ і визначення ЗАК, кон'югати використовувалися в концентрації 1х109 М. Кожний зразок піддавали трикратному аналізу, на кожній клітинній лінії виконували декілька незалежних експериментів. Найвищі
Зо значення експресії були виявлені на клітинах КВ зі значенням ЗАК приблизно 4000000-3000000, слідом ішли клітинні лінії ТЯВОМ-1 і дед-3 зі значеннями ЗАК 4000000-85000 ї 150000-75000, відповідно. Дві клітинні лінії, 5КоОох-3 і Омсаї-3 показали низький рівень експресії ЕОЇ ВІ, 20000-10000 ії 7000-4000 ЗАК відповідно. Значні зміни значень ЗАК від експерименту до експерименту спостерігали для клітинної лінії Уед-3, де значення ЗАК варіювали від 40000 до 300000. Ця варіабельність швидше за все відображує деякі біологічні властивості клітинної лінії, а не варіабельність аналізу, тому що значення ЗАК, одержані для інших проаналізованих клітинних ліній були набагато менш варіабельні (див. таблицю нижче). зареєстрований рівень зареєстрований рівень
ЗАК ЗАК
» СВ - стандартне відхилення, п - кількість незалежних експериментів
Значення ЗАК були визначені за допомогою аналізу на основі ФАС із ЕВ1-24 РЕ-міченими антитілами й системи Опцапіїргпїє. Середнє значення ж стандартне відхилення (СВ) було розраховано для незалежних експериментів.
Активність і специфічність ІМЕМ853 були проаналізовані з ГОЇ В1-позитивними клітинними лініями із широким спектром експресії РОЇ В1 (значення ЗАК клітинних ліній зазначені вище).
Крім того, в експерименти були включені ЕОЇ В1-негативні клітинні лінії Матаїма і 52.
ІМОЕМ853 показав високу цитотоксичність проти клітин КВ із підвищеною експресією ЕОЇВ1 (4000000-300000 ЗАК), Ідгом-1 (400000-85000 ЗАК) ї дуед-3 (150000ж-75000 ЗАК), при цьому значення ІКоо дорівнювали 0,10320,01 нМ, 0,50520,07 нМ їі 1,0020,05 нМ, відповідно. Активність лізису клітин у відношенні всіх трьох клітинних ліній залежала від РОЇ В1, тому що надлишок немодифікованого пиМом19 (МУ9346А) антитіла (0,5 мкМ) помітно зменшував активність кон'югата для типових неспецифічних рівнів (від 10 до 20 разів). ІМЕОМ853 показав тільки незначну активність у відношенні слабкоекспресуючих БОЇВ клітин 5Коху-3 і Оуса!-З (20000210000 ї 700024000 ЗАК відповідно), а також проти БОЇ В1-негативних клітин Матаїма і
ЗМУ2, при значеннях ІКео, що перевищують 2 нМ. Цитотоксична активність ІМЕМ853 проти цих клітинних ліній була низькою й РОЇ Н1І-незалежною, блокування пиМом19 (М9З346А) її не торкалося. Див. Фігури 19 і 20.
ФФЗП зразки, одержані з мишачих моделей ксенотрансплантата пухлини оцінювалися на
ЕОЇ В1 позитивність, використовуючи оптимізовані й затверджені способи аналізу, описаного вище. Забарвлювання не було помічене в пухлинних клітинах будь-якого зразка ксенотрансплантата, що забарвлюється контрольним препаратом. ФФЗП тканини ксенотрансплантата миші, одержані з наступних клітинних ліній показали такі моделі забарвлювання: Ідгох-1, КВ і МСІ-Н2110 показали однорідну модель забарвлювання 3-го рівня інтенсивності; Ієпікажа і Омусаг З показали неоднорідну модель забарвлювання 3-го рівня інтенсивності; | ХЕА737 показав однорідну модель забарвлювання з рівнем інтенсивності 2; ОМ- 90 показав неоднорідну модель із рівнем інтенсивності 2, «КОМЗ показав негативне значення.
Типові фотозображення ксенотрансплантатів пухлини наведені на Фігурах 21 і 22. пнизбофрамен | тизахоровня | Остленеоіне ня .. . Категорія лінія або фрагмент Тип захворювання Остаточна оцінка забарвлювання пухлини
ІСВОМ-1 Рак яєчників З однорідна фокальна
Івпікажа Рак ендометрію З неоднорідна фокальна фокальна
Поріг забарвлювання (22 неоднорідна) вимагає мінімального рівня експресії (інтенсивність забарвлювання) і мінімального розподілення забарвлювання (відсоток пухлинних клітин, що експресують ЕОЇ ВІ). Доклінічні дані надають обгрунтування для цього порога у карциноми яєчників. Зразки пухлини мишачого ксенотрансплантата з балами ІГХ 2» 2 неоднорідна показали чутливість до ІМОМ 853 в умовах іп мімо. ФФЗП зразки, одержані з мишачих моделей ксенотрансплантата пухлини оцінювалися на ЕОЇ В1 позитивність, використовуючи оптимізовані й затверджені способи аналізу, описаного вище. Дві моделі ксенотрансплантата карциноми яєчників ОМСАВ-3 ї І2ВОМУ-1 показали неоднорідне або однорідне забарвлювання 3-го рівня інтенсивності. Модель ксенотрансплантата, одержана із клітин карциноми яєчників ОМУ-90 показала неоднорідне забарвлювання з оцінкою рівня інтенсивності 2; модель карциноми
Зо яєчників ЗКоу-3 виявилася ЕОЇ В1-негативною. Висока активність ІМЕМ853 була виявлена на двох моделях яєчників з рівнем З РОЇ НІ інтенсивності, активність ОМ-90 моделі дорівнювала 2 рівню БОЇВ1 інтенсивності. 5КОМ-3 модель не показувала ніякої активності. Моделі ксенотрансплантата оцінювали також для інших захворювань, включаючи легені, ендометрій й пухлини шийки матки, і, хоча була виявлена кореляція між активністю й РОЇ В1 оцінкою забарвлювання, необхідно перевірити додаткові зразки.
Чутливість моделі ксенотрансплантата пухлин яєчників до ІМОМ853 проти рівня експресії РОЇ В1.
Активність іп мімо (5 мг/кг Оцінка інтенсивності, тип
Ксенотрансплантат й
ІМОМ853, разова доза) розподілення
ОМСАНЗ Висока активність З неоднорідна
ІШВОМ-1 Висока активність З однорідна
ОмМ-90 Активність 2 неоднорідна
ЗКОМ-3 Неактивний Негативний результат
Чутливість моделі ксенотрансплантата пухлин до ІМЕМ853 проти рівня експресії РОЇ В1
Активність іп мімо (5 мг/кг Оцінка інтенсивності, тип
Ксенотрансплантат Тип пухлини й
ІМОМ853, разова доза) розподілення
МСІ-Н2г110 НДРЛ Висока активність З однорідна
І6пікажа Ендометрія Препарат неактивний 2 однорідна
Шийки матки |/Висока активність З однорідна
Всі публікації, патенти, патентні заявки, інтернет-сайти й інвентарні номери/бази даних послідовностей (включаючи полінуклеотидні й поліпептидні послідовності), наведені в даному документі, включені шляхом посилання у всій їх повноті для всіх цілей і в такому же ступені, як якби про кожну окрему публікацію, патент, патентну заявку, інтернет-сайт або інвентарний номер/послідовності бази даних було спеціальне й окремо зазначене, що вони застосовуються як посилання.
ПОСЛІДОВНОСТІ
ЗЕО І МО: 1 - людський рецептор фолієвої кислоти 1
МАСЕМТОН ЛУ КУА УУСКАСТЕАЖАВТЕ М УЄММАКННКЕКРОРЕОКЬНЕО
СКУ ККМАССТ УТ АНКОТУХУ УВК МАВАСКАНАООТСЬУ ОВ,
СУК У ККУ МУМСОКССПОУ С ТТ ТОСКВМУНКСВУМУТММК
САУИАЛССВНВУВВТЕТУСМЕРУТНУУ КУМ УМОВ С СР УРОВАССМРМВЕУА
КЕТАЛАМЗОАХАОРУААЖВЕК КАСА М Ж В
ЗЕО ІЮ МО: 2 - людський рецептор фолієвої кислоти 1, послідовність нуклеїнової кислоти
Вівеввзсеннмрасаасвовос вер ссНевНи вові іа ізо евиввесввиВсВа онов осВи В вікаввсисісв віскі ннасвосзановосасазкнаа ав виеоєвасискн ів на вка ісвасесе звЕззеамнестве в стюєсвасиесацесввозавоювтвіва вна ви ов навісна вх ка внеассівосцевавснвонсвмесввивсво і нести веіососоваепровисгссіневісаввовии вині сарлрсінасрсвзаравесниві нас ві вовкові сво ва ек овен вів вича шісведосіююь с ЕКЧВНАНУВВ В ИВОоВоВасВи ВЕК квас сл Вин нова пово ви Ве ВТ ЕС ЦК СаО есе зехвсвсссвсі и вевж ва вес осівовасрісзиеаВс ов оссваквио ис нео св ківенсввоосавеосдовиуаюссоанеивовавівнова во всі все воечинаніввввс тво В БВОВ вас са века по Ко ВИС ВК
ЗЕО ІЮ МО: 3-пиМом19 "НО
Зб
УСБУ АВУЖУКРОАУКЕСКАКОУ ЕТО МКУ КОЮ КИНУВ Є
УМО КЕН КАТЕ ГУК АМТАНМВ ТЕКА УСТ УВС АМЕЖУКВ НУТУ
ЗЕО ІЮ МО: 4-пиМом19 мі См1.00
УСТОБ НАУ СОР АПЕСЕАВОВБУВЕАЄТ МН У КНОКРОООВК ЛУ ВАН КА
СУВОЕВКОМКТОКТМІБВУКАКОВААТУУСОСОККЕ РУТ ТК ЕК
ЗЕО ІЮ МО: 5-пиМом19 мі См1.60
ТНУТЛЧУНН ДІ УВІ АН ИСК АЗОВ УВА СТВ МАН У УНОК МНН ТК АЗМЕСА
УВІ ВЕ ТОК УКАВОААТУУ СОР ТЕО ОС КЕКЕ
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105» ІММУНОДЖЕН, ІНК.
КЕРРІГАН, Крістіна Н.
ВАЙТМЕН, Кетлін Р.
ПЕЙН, Гілліан ЛЕДД, Шеррон «120» СПОСОБИ ПІДВИЩЕННЯ ЕФЕКТИВНОСТІ БОЇ А1 ТЕРАПІЇ РАКУ -1305» 2921.015РСО01 «1405 РСТ/О52012/031544 -1415 2012-03-30 -1505 5 61/471,007 «1515 2011-04-01 -1605 5 «170» Раїепінп мегвіоп 3.5 «2105 1 «2115 257 «212» РАТ «213» Ното зарієп5 «4005 1 мет вів бій ака Меє Тиг отве Бій без веу Се бе обев Уві ттв о Уві і 5 їв їз ід уві У бі сів АїЇв бій ТВБ ага їі аз ТР Дів ага тв пі ци іо дя УВІ сСух Меї ап віз жо Ві Ні Суб Бій бух Бе Шу ге іч дв бух ви Ні біз бів Сух зго Бгто Тр ага був дви АВ бук Сук Хек ТБг дян ТВг обегобФів бів Аа нія груз АБроУВІ аг Отуг
Б та К5 хо ів Туг дго бе дай тб Ап нів су сту Біб Мет Аа го дів Кух їУух Ага ніх Ре їі біпо Ар Те Суб бе Ту бій Єув зак го АВ ще іх МО івц біу Ве тер ої1е бів бів Узі азроБів ев Тго ага бух біз Аго що що 12х уві їв акп УВІ Бго сво Сузх вуз Зір вка Суб Зі вів ТРЕ ОтТКо БВ їі її 14
Ави Су Ага тТВг оба Тує ТНРОосжа Був двгодяв ТРОНІ ух «Бк Отто 145 їх ї55 Зо хи Жбмм Кіа Ім г 42 во У ке а З ОК їі КІ КЗ з від СУ щі Її ази тїга таб оБеаР обіУу БВ Аа СУБ щу ЩІ УВІ БІ ЛІВ АТ КУН
ТЕХ чсхІх з сх ух нев МВ 155
БкгОо РБа Мі РВЕ Тук ве кго ТВкоРго їнгОХаї рев осує ахп ої Хе 155 185 13 тр ої онів бек отУк Куб УВІ Бег Ахй Туг бак о ваге бі беБК Бі ага за5 че КН
Су жі біб Має ТгРОо БВ аз вБго ата БІВ БіУу ахй Кг ахвозіц сін зжа зу У шк Ж як,
КЕ «а шк
УВІ А1В Агу гне ТуУК дів АЇЖ аів меж зве БіУу АЇв бі его тт АТа бе «З 235 о «Ж що т ячук са БУЇїчух дю С ХАІ 1 54: щої М ж жави: Кк кі учи 4 жк аа тТгрО КРО РА зіву ів) щаг офі Аїд іви Ме: фер ів тк ву ев
Я я в кат «21052 «2115 771 «212» ДНК «213» Ното зарієп5 «40052 акреєїсВч: сваїчнсанс всацетчкке сІсстівВО усе тво о Но чЧазостсзов сазан ака зсковосе жосаажЖеКККО слона Є 120 зазвсзвссаса зе зоацосКсцвау засаваскас вісаоєачКа КОС осКе 15 вщюшазозака ссмсЕаЗЕ стаскЗасвсє воссвавааа соска УК жеКЕВе що стасатасцаї всааскоцоЗа ссвссвіода зазасоЗсаєс сіоссвках вес т віссацонса ссіоссвЕха созусЗстес сссааВстоО зксстооВЕ совок ЗО ско я 5, Ж жах жк м Сех КУ и Уж м я хх, у а у у км а іо вк Ж ук ок ку а кВ ЕКЗ чассвуаОст ФффеозсавноЗ зсЗоаїаста васасщєке тотосвавоа очи ОКаВу я : зах сухим люфт щих си рух сур евузеи Кочу БМ свати засо сс век ОсВВОВ псчастецеа сао Зукс Б засмщастх садова Сазвсаєщоа пис сетоссавВес ТЕТ 5 тзсежсссиВ сассезеКиаЕ Жостеснчх ЗазажсеЗаа сісесіюєка саше вою о фиїя уми ак ум ху о вк с и о а А и НН о На о у звастзсяас: заоч совстсаїс садку сок сказ 55 есе заз че аКНсх всвоссяеа оса єтоВ ЗесСетовеа «М екс ТесЖОскка ссоосКс есте Кох ЄЕС КУ 2105 З «2115118 «2125» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» пиИМом19 УнС
«4005 З сів Уа) бів сво Уві бів бег бі Аїв бів Уві УЖ рух Бго біу дій
А З о їх зав очі уж ів ев Суб руб Аїа Зак бі Тук ТВ оБвВе ТВ ФіуУ тує о ех 30
Бе меї А Тк Уаї уз бій бек бго Бі Бій Зеб бен пін тк їв
ЩЕ в 45 -іу ага її мів РР ТуУг АхвоОБІУ АЩа ТВг о РНе тує Аж сія вже ВВЕ 55 КО «ів біу бух АЇЗ ТВ оївиу ТВ оУаі лев Гуз ек зако ахи ТВк ояїд нії
ВУ а я ВО меж бів іви ів Бак оіен ТНК Заг бів ах о Рне дів Узі ТУР ТУб СУВ а За З5
Тк ага тус ар БіУу Зак дго вій МЕЖ йзв тує Тер овіУу Бій ді тТВР що оо зо
Твгожаі тТве о Ущі его зер 115 «2105» 4 5 «2115112 «212» РАТ 213» Штучна послідовність «220» «223» пиМом19 мі См1.00 «400» 4 хв оте Уві Бей тТВгобів Зеговго рен Зег вен лів УдДі бек бе Фу ї 5 їв 15 «іп Бго ліз їі їі Зак су Куб лів Зак бій баб узі Зак РН Ай з 5 КА 5іу тТвнгошек іже Ммаж Ні Тк Тув Ні бів бу вто цію Бій ія ве ага вв сви Тіє Ту аку Аза хе А5й ів бів ліз Біт УЖЕ реє АХха 5 5 ва
Ага вне зав ці Баг обпіу звг ог ТВгодхВ вне Тнг ого ахл Зі ее 5 то 75 хо
Бгто уві біб аїа бів дер овій вій ївВг оТуУук Туг Су зів «ій Зак зго іч тек овго тує ТВе Бе пі йБіу біу ТЕ бух їжи БішШ їв руб аг і 5 19 «2105 5 «2115112 «212» РАТ 213» Штучна послідовність
«223» пиИМом19 мі См1.60 «4005 5 вхо тів УВІ фев ТВговій Заг БгоО іву Звкоїву аів УЩІ Бек о цеб СУ ї 5 Еко: ї5 пів вРе дів бів Хіє Бак Се5 БУ вій бек о Бій Зак ома? хек вве 1 га і я КО
Ру ЖНкЕ ЗаБ осей шежЖ нія тео тує Ніж бів Бех вт опіу ші» Бій вра ї5 БУВ 5
Ак сви цео бів Туг АгБ вів Бек дя Сен Бін АТ біу жа! Бго АЗо ха що ага РН ак біу Бак сі щег обу ТНК ашр РИ ТНК ев Те гів аг й 7 5 В
Бго Уві Бін Аів 5іш ав від іа тТве ТУ Тук сСув бів Ффій чвБг Аго
Зіш Тегове Тег о тТвг овзпе бі Бі бі ТтВе бух ви Бін ї1Ж вуз Ага щюЕ 1 м

Claims (42)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Спосіб ідентифікації раку, який може реагувати на анти-РОЇ КІ антитіло або анти-ЕОЇ ВІ імунокон'югат, причому зазначений спосіб включає: (а) приведення в контакт зразка раку з антитілом для виявлення або його антигензв'язувальним фрагментом, що специфічно зв'язується з БОЇ К1; (б) визначення зв'язування зазначеного антитіла для виявлення або його антигензв'язувального фрагмента зі зразком раку на стадії (а), за допомогою способу виявлення, що розрізняє інтенсивність та однорідність забарвлення при експресії РОЇ К1 у зразку раку; (в) призначення ступеня для зв'язування на стадії (б), причому ступінь призначається на основі порівняння з одним або кількома еталонними зразками; та (г) порівняння ступеня, призначеного на стадії (в), зі ступенем еталонного зразка тканини або клітини, причому ступінь для рівня БОЇ К1 при раку, який є більшим за ступінь для зниженого рівня експресії РОЇ К1 еталонного зразка, або ступінь для рівня РОЇ К1 при раку, який дорівнює або є більшим, ніж ступінь для високого рівня експресії РОЇ К1 еталонного зразка, ідентифікує зазначений рак як здатний реагувати на анти-ЕОЇ КІ антитіло або анти-РОЇ КІ імунокон'югат, де зазначене анти-РОЇ Кі антитіло включає: (а) СОКІ важкого ланцюга (ВЛ), яка включає амінокислотну послідовність СУЕММ (5ЕБО І МО:6); СОК2 ВЛ, яка включає амінокислотну послідовність КІНРУЮОСОТЕММОКРЕОС (ЗЕО ІЮ МО:7); та СОКЗ ВЛ, яка включає амінокислотну послідовність ХМОСЗКАМОМ (ЗЕО ІЮО МО:8); і (6) СОКІ легкого ланцюга (ЛЛ), яка включає амінокислотну послідовність КАБОЗМОЕБАСТЗІ МН (5ЕБО І МО:9); СОК2 ЛЛ, яка включає амінокислотну послідовність КАБМІ ЕА (5ЕО ІЮО МО:10); та СОКЗ ЛЛ, яка включає амінокислотну послідовність ФОБКЕМРУТ (ЗЕО ІЮ МО:11), Зо де зазначений анти-РОЇ КІ імунокон'югат має формулу (А) - (І) - (С), причому: (А) включає антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, який специфічно зв'язується з ЕОГ КІ і включає: (а) СОКІ важкого ланцюга (ВЛ), яка включає амінокислотну послідовність СУЕММ (5ЕБО 10 МО:6б)Ю СОК2 ВЛ, яка включає амінокислотну послідовність КІНРУЮОСОТЕММОКРОС (5ЕО ІЮ МО:7); та СОКЗ ВЛ, яка включає амінокислотну послідовність з5 мразвАМОМ (5ЕО ІЮ МО:8); і (6) СОКІ легкого ланцюга (ЛЛ), яка включає амінокислотну послідовність КАБОЗМЗЕАСТЗІ МН (ЗЕБЕО І МО:9); СОК2 ЛЛ, яка включає амінокислотну послідовність КАЗМІ ЕА (5ЕО ІЮО МО:10); та СОКЗ ЛЛ, яка включає амінокислотну послідовність ООБАВЕМРУТ (5ЕО ІЮО МО:11), ()) включає лінкер, та (С) включає цитотоксичний агент, і де лінкер (І) зв'язує (А) з (С).
2. Спосіб ідентифікації пухлини як чутливої до терапії анти-РОЇ КІ антитілом або анти-ЕОЇ ВІ імунокон'югатом, причому зазначений спосіб включає: (а) вимірювання рівня експресії БОЇ К1 у зразку пухлини, одержаному із зазначеної пухлини, за допомогою способу виявлення, який може виявляти експресію БОЇ К1 за допомогою антитіла для виявлення або його антигензв'язувального фрагмента, що специфічно зв'язується з ОЇ К1, причому спосіб виявлення розрізняє інтенсивність та однорідність забарвлення при експресії ЕОГ КІ у зразку пухлини порівняно з інтенсивністю та однорідністю забарвлення в одному або кількох еталонних зразках; (б) визначення ступеня інтенсивності забарвлення ЕОЇ КІ для зразка пухлини; та (в) порівняння ступеня інтенсивності забарвлення РОЇК, визначеного на стадії (б), з еталонним значенням, причому ступінь інтенсивності забарвлення РОЇКІ для зазначеного зразка пухлини, визначений на стадії (б), який дорівнює або є більшим за еталонне значення, ідентифікує дану пухлину як чутливу до терапії анти-БОЇ КІ антитілом або анти-ЕОЇ ВІ імунокон'югатом, де зазначене анти-РОЇ Кі антитіло включає: (а) СОКІ важкого ланцюга (ВЛ), яка включає амінокислотну послідовність СУЕММ (5ЕО ІО МО:6); СОК2 ВЛ, яка включає амінокислотну послідовність КІНРУОСОТЕММОКРЕОС (5ЕО ІО МО:7); та СОКЗ ВЛ, яка включає амінокислотну послідовність ХМОСЗКАМОМ (ЗЕО ІЮО МО:8); і (6) СОКІ легкого ланцюга (ЛЛ), яка включає амінокислотну послідовність КАБОЗМОЕБАСТОІ МН (ЗЕБЕО ІО МО:9); СОК2 ЛЛ, яка включає амінокислотну послідовність КАЗМІ ЕА (ЗЕО ІЮО МО:10); та СОКЗ ЛЛ, яка включає амінокислотну послідовність ФОБКЕМРУТ (ЗЕО ІЮ МО:11), де зазначений анти-РОЇ КІ імунокон'югат має формулу (А) - (І) - (С), причому: (А) включає антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, який специфічно зв'язується з ЕОГ КІ і включає: (ах СОКІ важкого ланцюга (ВЛ), яка включає амінокислотну послідовність СУЕММ (5ЕБО 10 МО:6б)Ю СОК2 ВЛ, яка включає амінокислотну послідовність ВІНРИСИаЮТЕММОКРОС (5ЕО ІЮО МО:7); та СОКЗ ВЛ, яка включає амінокислотну послідовність МрОБКАМОМ (5ЕБЕО ІЮ МО:8); і (6) СОКІ легкого ланцюга (ЛЛ), яка включає амінокислотну послідовність КАБОЗМЗЕАСТЗІ МН (ЗЕБЕО І МО:9); СОК2 ЛЛ, яка включає амінокислотну Ко) послідовність КАЗМІ ЕА (ЗЕО ІЮ МО:10); та СОКЗ ЛЛ, яка включає амінокислотну послідовність ООБАВЕМРМУТ (5ЕО ІО МО:11), ()) включає лінкер, та (С) включає цитотоксичний агент; і де лінкер (І) зв'язує (А) з (С).
З. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що еталонне значення визначають шляхом вимірювання експресії білка РОЇ К1 у принаймні одному еталонному зразку, де принаймні один еталонний зразок являє собою тканину, клітину або клітинний конгломерат, не чутливі до терапії анти-ЕОЇ КІ антитілом або анти-ЕОЇ КІ імунокон'югатом.
4. Спосіб за будь-яким з пп. 1-3, який відрізняється тим, що зазначене антитіло для виявлення або його антигензв'язувальний фрагмент включає: (а) СОК1 важкого ланцюга (ВЛ), яка включає амінокислотну послідовність СУЕММ (5ЕБО І МО:6); СОК2 ВЛ, яка включає амінокислотну послідовність КІНРУОСОТЕММОКРЕОС (5ЕО ІО МО:7); та СОКЗ ВЛ, яка включає амінокислотну послідовність ХМОСЗКАМОМ (ЗЕО ІЮО МО:8); і (6) СОКІ легкого ланцюга (ЛЛ), яка включає амінокислотну послідовність КАБОЗМОЕБАСТЗІ МН (5ЕБО І МО:9); СОК2 ЛЛ, яка включає амінокислотну послідовність КАЗМІ ЕА (ЗЕО ІЮО МО:10); та СОКЗ ЛЛ, яка включає амінокислотну послідовність ФООБКЕУРУТ (5ЕО ІЮ МО:11).
5. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що антитіло для виявлення або його антигензв'язувальний фрагмент включає варіабельний домен ВЛ, який включає амінокислотну послідовність ЗЕО 10 МО:3, та варіабельний домен ЛЛ, який включає амінокислотну БО послідовність ФЕО ІЮ МО:4 або 5.
6. Спосіб за будь-яким з пп. 1-3, який відрізняється тим, що антитілом для виявлення або його антигензв'язувальним фрагментом є ВМЗ.2.
7. Спосіб за будь-яким з пп. 1-6, який відрізняється тим, що антитіло для виявлення або його антигензв'язувальний фрагмент додатково включає реагент для виявлення, вибраний з групи, до якої належать: фермент, флуорофор, радіоактивна мітка, люмінофор, біотин, дигоксигенін, флуоресцеїн, тритій та родамін.
8. Спосіб за будь-яким з пп. 1-7, який відрізняється тим, що зазначений спосіб виявлення надає діапазон інтенсивності забарвлення для зразків з низьким рівнем експресії РОЇ К1, проміжним рівнем експресії РОЇ К1 або високим рівнем експресії БОЇ К1.
9. Спосіб за будь-яким з пп. 1-8, який відрізняється тим, що спосіб виявлення являє собою імуногістохімічний (ІГХ) спосіб.
10. Спосіб за п. 9, який відрізняється тим, що зазначений ІГХ спосіб виконують вручну.
11. Спосіб за п. 9, який відрізняється тим, що зазначений ІГХ спосіб виконують за допомогою автоматизованої системи.
12. Спосіб за будь-яким з пп. 9-11, який відрізняється тим, що зразок раку або пухлини має ступінь інтенсивності забарвлення 1 або більше для експресії БОЇ К1 згідно з оцінкою за допомогою ІГХ.
13. Спосіб за будь-яким з пп. 9-11, який відрізняється тим, що зразок раку або пухлини має ступінь інтенсивності забарвлення 2 або більше для експресії БОЇ К1 згідно з оцінкою за допомогою ІГХ.
14. Спосіб за будь-яким з пп. 9-11, який відрізняється тим, що зразок раку або пухлини має ступінь інтенсивності забарвлення З для експресії РОЇ КІ згідно з оцінкою за допомогою ІГХ.
15. Спосіб за будь-яким з пп. 1-14, який відрізняється тим, що зразок раку або пухлини має неоднорідну рівномірність забарвлення для експресії РОЇ К1.
16. Спосіб за будь-яким з пп. 1-14, який відрізняється тим, що зазначений зразок раку або пухлини має однорідну рівномірність забарвлення для експресії БОЇ К1.
17. Спосіб за будь-яким з пп. 9-11, який відрізняється тим, що 25-75 95 клітин зразка раку або пухлини мають ступінь інтенсивності забарвлення 2 або більше для експресії РОЇ КІ1 згідно з оцінкою за допомогою ІГХ.
18. Спосіб за будь-яким з пп. 9-11, який відрізняється тим, що більше ніж 75 95 клітин зразка раку або пухлини мають ступінь інтенсивності забарвлення 1 або більше.
19. Спосіб за будь-яким з пп. 9-11, який відрізняється тим, що 25-75 95 клітин зразка раку або пухлини мають ступінь інтенсивності забарвлення 2 або більше.
20. Спосіб за будь-яким з пп. 9-11, який відрізняється тим, що більше ніж 75 95 клітин зразка раку або пухлини мають ступінь інтенсивності забарвлення 2 або більше.
21. Спосіб за будь-яким з пп. 1 та 3-20, який відрізняється тим, що еталонний зразок є позитивним еталонним зразком.
22. Спосіб за будь-яким з пп. 1 та 3-20, який відрізняється тим, що еталонний зразок є негативним еталонним зразком.
23. Спосіб за п. 21 або п. 22, який відрізняється тим, що еталонний зразок включає клітини, клітинні конгломерати або тканини.
24. Спосіб за будь-яким з пп. 1-23, який відрізняється тим, що зразок раку або пухлини являє собою зразок раку або пухлини ендометрія.
25. Спосіб за будь-яким з пп. 1-23, який відрізняється тим, що зразок раку або пухлини являє собою зразок раку або пухлини яєчника.
26. Спосіб за будь-яким з пп. 1-23, який відрізняється тим, що зразок раку або пухлини являє собою зразок раку або пухлини очеревини.
27. Спосіб за будь-яким з пп. 1-23, який відрізняється тим, що зразок раку або пухлини являє собою зразок раку або пухлини матки.
28. Спосіб за будь-яким з пп. 1-23, який відрізняється тим, що зразок раку або пухлини являє собою зразок раку або пухлини легені.
29. Спосіб за будь-яким з пп. 1-28, який відрізняється тим, що анти-РОЇ КІ антитіло або анти- ЕОЇКІ імунокон'югат включає варіабельний домен Вл, який включає амінокислотну послідовність ЗЕО 10 МО:3, та варіабельний домен ЛЛ, який включає амінокислотну послідовність ФЕО ІЮ МО:4 або 5.
30. Спосіб за п. 29, який відрізняється тим, що анти-РОЇ МІ антитіло або анти-ЕОЇ ВІ імунокон'югат включає ВЛ, який містить амінокислотну послідовність, закодовану ВЛ-кодуючою послідовністю плазмідної ДНК, депонованої у АТСС 7 квітня 2010 року під номером РТА-10772, і ЛЛ, який містить амінокислотну послідовність, закодовану ЛЛ-кодуючою послідовністю плазмідної ДНК, депонованої у АТСС 7 квітня 2010 року під номером РТА-10773 або РТА-10774.
31. Спосіб за будь-яким з пп. 1-30, який відрізняється тим, що лінкер (І) є розщеплюваним лінкером.
32. Спосіб за п. 31, який відрізняється тим, що лінкер (І) є вибраним з групи, до якої належать: М-сукцинімідил-4-(2-піридилдитіо)пентаноат (БРР); М-сукцинімідил-4-(2-піридилдитіо)-2- сульфопентаноат (сульфо-5РР); /М-сукцинімідил-4-(2-піридилдитіо)бутаноат (5РОВ); /М- сукцинімідил-4-(2-піридилдитіо)-2-сульфобутаноат (сульфо-5РОВ).
33. Спосіб за п. 32, який відрізняється тим, що лінкер (І) являє собою М-сукцинімідил-4-(2- піридилдитіо)-2-сульфобутаноат (сульфо-5РОВ).
34. Спосіб за будь-яким з пп. 1-33, який відрізняється тим, що лінкер (І) є вибраним з групи, до якої належать: нерозщеплюваний лінкер, гідрофільний лінкер та лінкер на основі дикарбонових ее
35. Спосіб за п. 34, який відрізняється тим, що лінкер (І) є вибраним з групи, до якої належать: М-сукцинімідил-4-(малеімідометил)циклогексанкарбоксилат (5МСС); М-сульфосукцинімідил-4- (малеімідометил)циклогексанкарбоксилат (сульфо-5ЗМОС); /М-сукцинімідил-4-(йодоацетил)- амінобензоат (ЗІАВ); та М-сукцинімідил-((М-малеімідопропіонамідо)-тетраетиленгліколь|естер (МНЗ-РЕСА4-малеїмід).
36. Спосіб за будь-яким з пп. 1-35, який відрізняється тим, що цитотоксичний агент (С) є вибраним з групи, до якої належать: майтансиноїд, аналог майтансиноїду, бензодіазепін, таксоїд, СС-1065, аналог СС-1065, дуокарміцин, аналог дуокарміцину, каліхеаміцин, доластатин, аналог доластатину, ауристатин, похідна томайміцину й похідна лептоміцину, або агент у вигляді проліків.
37. Спосіб за п. 36, який відрізняється тим, що цитотоксичним агентом є майтансиноїд або аналог майтансиноїду.
38. Спосіб за п. 37, який відрізняється тим, що цитотоксичним агентом є М(2')-деацетил-М(2')- (З-меркапто-1-оксопропілу-майтансин (0ОМ1) або М(2)-деацетил-М(2')-(4-меркапто-4-метил-1- оксопентил)-майтансин (ОМ).
39. Спосіб за будь-яким з пп. 1-38, який відрізняється тим, що (А) являє собою антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що включає варіабельний домен ВЛ, який включає амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО:3, та варіабельний домен ЛЛ, який включає амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:4 або 5.
40. Спосіб за п. 39, який відрізняється тим, що (А) являє собою антитіло, що включає ВЛ, який містить амінокислотну послідовність, закодовану ВЛ-кодуючою послідовністю плазмідної ДНК, депонованої у АТСС 7 квітня 2010 року під номером РТА-10772 і ЛЛ, який містить амінокислотну послідовність, закодовану ЛЛ-кодуючою послідовністю плазмідної ДНК, депонованої у АТСС 7 квітня 2010 року під номером РТА-10773 або РТА-10774.
41. Спосіб за будь-яким з пп. 1-38, який відрізняється тим, що: (А) включає антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що включає варіабельний домен Ко) ВЛ, який включає амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:3, та варіабельний домен ЛЛ, який включає амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:4 або 5, () включає лінкер М-сукцинімідил-4-(2-піридилдитіо)-2-сульфобутаноат (сульфо-5РОВ), і (С) включає цитотоксичний агент М(2)-деацетил-М(2')-(4-меркапто-4-метил-1-оксопентил)- майтансин (ОМА).
42. Спосіб за будь-яким з пп. 1-38, який відрізняється тим, що: (А) включає антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, що включає ВЛ, який містить амінокислотну послідовність, закодовану ВЛ-кодуючою послідовністю плазмідної ДНК, депонованої у АТСС 7 квітня 2010 року під номером РТА-10772, і ЛЛ, який містить амінокислотну послідовність, закодовану ЛЛ-кодуючою послідовністю плазмідної ДНК, депонованої у АТСС 7 квітня 2010 року під номером РТА-10774, () включає лінкер М-сукцинімідил 4-(2-піридилдитіо)-2-сульфобутаноат (сульфо-5РОВ), і (С) включає цитотоксичний агент М(2)-деацетил-М(2')-(4-меркапто-4-метил-1-оксопентил)- майтансин (ОМА).
А. 300-119 клітини с МО М М ММ у З ОО ЗУ ПО ОО
С. Є ПОКО КК ОХ АЖ ОО о СО АК М МКК КК КМ с ою
В. 3000-19 клітини, транефіковані ОСИ КВ КК о. . о. 0»
У о. з с я ня 0. М ВЕ ОБ. я око ОКУ Е ща МУ КБ МОСК ЗЕ М З ОВО о В пон
Як. Клтвика синів : КВ ная зках СУСАНІ ПАК кежхМККЮ ЗВО ЯК зак ОО ОК В ВО МО ОК ВОК ОКО ОО ОК С В В ОК НК ЗО ВО м. ЕК НАМ МКК АК і! КК ОК М ВОК МОЗМ КВ ВИКОН ЗМК ОКА ПАК КАК ЗМК КК КК НЯ нн нн о. с ХЕ КК КК КН ПОД МКК МКМ ВК МАМИ М КЕ ВХ КОН и М Я ОК МЗС м МУ с ОК в о ОК п ще й ОН ОН З СК Во ще п ОКО УДК Е ОК КК у вин І СЯ ЗО КМ семи ОХЕМЛХККИДНя З аднехене жа кеслнорне ОХ мен кормя: М
Фк. 2 ке НЕК х 2 ВООЗ вна ТЗ ОО х с о і ЗТ ПО Ох ПК БА КЗ 5. с ст З вано ва М с ТКАНІ Яр ЗО ХК ТК ОК МК ВЕК ПУ МОЯ З с с я БІ с КА З одно х п: с о с З БаМОКиНЯ
В п. | с М Ввнани Ка п МКК ТОМ У х ОКХ Ж ОО УК ОО схе ся п п п новив; ОО ККУ хх ККУ ЗХ з г Ен ще МЕ КОХ ОХ ОК М КЕ со УА аа ОК ХХ ОО жк З с В хо ОК КО ПЕК с о. КО ух ТКУ ОО ОХ о. г ОК ТИКК п як зо Я ОК ЕКО Ск АФК с ОН З ЕО ЕК п КО - ЕХ ЗО КОКО МС у ом пен ОКУ ОО СК о КВ ОО ПЗ ях ММК ХК МО З ЗНО МКУ КВ В МИ ПК ОК ВУХО Пе ОО ЕКО ВМ с ОО 0. . ще о Ме 0. М Ка о СЯ Ок ОХ ЗК КО ТЯ УЕя ще т т з о: о 0. о . шо В КО у 0 С п КОКО БУ що М - с на с 1 о З І с о в М де у КУ ОБО о о ОО ру Б КЕ с КЕ В я парних Зо о о о хх оо... о. ОО осот іа М МУ ОО Соя ха Ж КОДАХ зх хз ще ЗМК а Ох ш енева кв: дк я ВЕ ЕОМ а ООН У ще З п. ОК ВЕК КОКО ОК Ух ЗО СХ ОК як - с с сек о. а ЗК С 5 КЗ с Ох ОО ОК я Кс ОО КЕ З МК ЕК З ОХ в с п о. ; о стека її З УК с ЕТООКОКАЄ ЗО 00 СЕК ОК ув КЕ ж ж І З СОЯ ОО АХ МАМ С ЕЕ ХК і. ПМ ОН ях ОК: ЖЕНЯ КОХ хх СКК Я в с с о. о. 0. т. сеетие В У с с їх о. КУ о: а. З е і ї с З ОО ЗАВ ее ЗОВ ОО М ОХ х Ко КК с ОО ОК КАЗОК СО п у Кок В З З Зх ОН с о. с о осо ОО ОК 5 о М ОДН ОН Я ПВ Се с г НЕ а . а. В о ЗО я за У КОЛА КО ЗХ КО ЗУ ОК МОХ ЗХ ХХ хх їх ати АОКЕ ОО ЗК: -Х АК КЕ с 5 ОК Оу 5 с : М ВАЄ, 55 п. 5: ск и МТ БО Фе ВА ие що пшя ш " Ес ЕЕ ОБ: 55 КОХ ОКО МО У ОБО ТВО СВ МАК ОН ОО ла що п АК І с ь п ск ХО ЗО п. мВ ОО КУ М и сх заго - З ОХ 5 Каву Фк юс ЯКО «арцин т. З ; естхівн ке НОМ й Анна мМ я я ПИ гкскекюсюсн: щчЕчмнкі : СМ ШШИХ Трест КИ. 1 СІК шин й 1 пиМІ ще ЧЕ по МИ Не кокскоеккек й ї ПЕКТИ ПІН ОТ ПИТИ МІШКИ ек юкюєию те і ОВО ПИ С ПОШее МО сесхсскеенсх Карци Н п я Дюна | БЦ НЕ ; 3 ТИ НИ фони ШК Я 4 зциноми недрібноклітниного раку : ме Однорінн | ПИ недрійноклиї В Ше пу іже КК По НУ АННИ тн і ПМК ПИТ. БОЯХ ї ПЛИНИ пен снілкж чне ЕЕ : порі ІД ней ТИВ Бен я шип чо раку ле Її ЗК пд МУ їх ПІДКОрІ о СИП, ПИТИ ВО Врн ПИЛИ ПІШИХ яку пече Е ІШЕМІЯ пий род Ії ШОЕ пл ПЕ ПЕ ЗУ ЖЕНЕ і ЖИ во 2 1 На» я що а ПЕЯ і в 1 І КАНА Пе Вс пещІй: ї КК тм ПМ ТИ ПОШИ ПІКИ І З пд я Вей перен УНЕВККЬ, я ІВ і Е в. лах ЛК Зеева, Е Оля МЕН у 1 іх ТЕ, ПжЖЕ СТЕ ке й Е: " ДЕ Кая 1 З ши як што УК б Е не ВАЛ ШИ 1 ох. Гете пе щої КН ! пе ке клинки од ще 1 й що КВН пе 5 ШК дж о і і -- ії ЖК вче НЯ перен З - мо НО ВяТь п ОБО, 5 г: СЕК. ШО до С «ВА СК Ше й ря оС ШИНКУ щи ЕЕ що ша ЕН Бі зн ї Й г о ще С ЖЕ іт 7 КЕ «ее гу ш закона кі ГУ ї ТОВ ше ї Ж й жа Я. сх ВІ квт й я ФУ до: ШК й З Е З І ШЕ МО Е ! | Ж І ЕФ Н 5 5 ФІ ери : Н Ед а І : ук зад : т мя ще х А в І МІ От ї й 5 З ї Е я т - В Вов й : ї їх ік в пит І Ї її ак Я їх ПЕКЖИЯ ої Н 7 я й й ВИМИ І шо В А лев ї й ма шу КУ Й сн о з. КО х Н З в Ще й А. С Її а ; ї . їх ке КЕН «ії я ке ЩЕ шини : щу щк Я З з Е в я ШЕ ї Я Б й Кз А їх х ох ря Кк со я У хх й Е ЩЕ ж де В с КОС з Бо МК є В ЕЕ о «КЕ я
Фіг. Я ж ее знана Бл ранія ж КО хх СН мех СВО ж КУ ще КУ пт п ї ще я пе З НЯ ОК ди Є с че 2я пк 0 т КОВО; с т о й о 5 . Ох и по ша й о. що ЗЕ п о я Ох ВО о . . нк - г 7 тя шо С ЗО ох КК с їх не КОН КА ЗК СЕК У 5.
о. о ; ОО о о: За МО ТУ С С КО о. сх НН КВУ о с й с -к, ди х.
я . у с с ХХ 5. Хо .- КК З В т ПК ХО ХОМ ОКУ о с З я 5 шо 0. З х о М я й о СК х УКВ ЗОН КО С х ЕС тк еВ ЗК У па КЕ З. Ж МОНАХ У ОО ОКХ о. ХО ЕКО о о: в о . с тя я 4 о. З о. о САМ є, ХО З 5 ее я оо 5 с в в р ЗЕ п. о. 5. ще . в Ї, 4 у, З . | с ях п . п. й і; ї о | . о. ВК МК ЗО с ЗК - ЖОВ КЕН У У КАК КО Ж КО с с о ХХ КК ща КОХ с СХ о г. КК то о. ХК А ХУ сх Ох ОК МЕ о. а МОВ ЗО КО о о оо ОО сх я є Мо о. ККУ ЗБК Ех ОЗ З Ех В ХК Ох С 5. . . о ЗК ще . о. о. УВК и ЗХ Я п КО о и З ща . о. п. и З 1 о Кі о. НН с 0. ОО о о х с. с . с Я ЗО ке ще о до о. о. У ПНТ с х п. ОК с ОБ ЗК ОО Ва МОУ й с: ОККО ЗХ ЗК ХОСЕ ОХ ЗВО по о о г : ї і о: З що ОВО: у щ с х п. п ; 7 с. Ка ЗХ ЗО З У ЗО ОО ОХ Мо МОВО х ЗКУ ж Бех Я ТВ ЗХ . . ! ї хх 5 х ! с - 7 в К Ве : ХО Ж о і ' що я хх я лозі ульня ак КЗ а ще «Віг. З Ко Ех маму . . ЧІ МИКАМ жк | - :
Ох. З з ОО Ії КЕ т . З я КОООСО ВО ще в ке ої ЩЕ зе с а МО з п. с З : севксвк о. о. нн се Хе ЗО х КОХ ХХ озон ОХ ХХ ОХ МКУ З ОО, Я п . о ч ТК З зай а с п З о З с 0 о. КВ З о: ї
НА. о. В ПК с с УКХ о а ща шк . . її ! ь 0 я о. ме о. с п. п. о ОО с о. о с що ще З о Оу ЗУ с ЗВ в ЗХ ЗК ЗХ с ; о їх з ! хх ОКУ х о 5 ЖК: дО х Х: СК х ХХ о. о й і - ех ХХ ХУ ЗЕМ ОЙ Сов, МКК ХХ СО З о. За ОВ КОХ Хек ще СУ Хе СХ ЗК ) є се . о. с Ох ОВУ КЗ ВАВ КК У ОКО: Я я ОВ 5. КК ОХ З З 0 а с п. ї - ї Є ! Се ее ПЕЖО о В Ох с С Ж МОХ й с і т 5 х о СО с М ке І ХВ БО Ж г МО Х КУ ЗК УНН З З ех СО з Мох Се ОВ ТО У З ЗО о . .
ШИК. ОКУ ПоЕВ В око МО о ХО с с дах . о . - - ї ї . б . МКУ С ХО хх х о. а г ОЗ З КУ З М в ХХ п ХОМ ПОХККК ОВ с ХХ 6. ОХ п . ТЕ ВОЗ ооо ХХ . КО КЗ о. о о й я і
КЕ. КК о. . Ох ОО 5 З о. І о. о. о т а - щі. Ох ОКО ТО о З ЗХ . 2-0 і ге . . щ шо ХХ З У ХО: М ще 2 ЗК ВО о п - ї ; ! ; с В БУ АХ ЗАКООВ З ВЕ ЕХ Са СУ З ях ХХ 5 ОО У Кох ДК еВещІВ М ЗУ о ХК се ОХ ОО ох ОБ о п. : с. з: НЕО . . А У о. о. - Зх 0 З сх .
Ж Б. о с КО КО Ве КК о о. ї Же БИ ХХ ХУ КА с ХУ КО СК КО х ОО . с її є но шо о. І о. ТВ . З п. І: пла ЗУ ХК Хе сх ХО УЗ УКХ Ах З Зх МЕ сЗ ЗХ ВО ї ен . ше : ши їй | --е о. ОО ЗХ Ще и ПКУ В - | ши че В. х ЗИМА Шо СОУМНІХ КІН : кан мех ЯК -» ЗКУ К; » є : Фіг, 5
ЖК ХЕ І Б ЩЕ ЧНУ 13 схофбхе МУ в т 5 ткехе ВХ е. ІЗ 1 Я яр ї Бах уран їй Е : БНЯ сфе ВАШМОУ ТО ВРОВ-ОМА ш-ш- : щ й пкт ! как - : ооо 5 ої пн СВЕТР ее манкиою Ж У в! -і Ез ; «і ї Щ Е : Я пеню Ко В. СВ. І г о; се ЕЛЬСІОд-РЕЦ- МЕ ОМИ ; «пе щі ЕНН і і чю й а рез БА ЕНН є ен а З: 40 що що 105 25 Дні після вокуляц
Фк. Я т. я, ККЗ - сек і св не с:ЯЙ : сон З МЕЖ КЗ ! Ки є ЛЕ зе - : ! сне КВ ВЛУКТ я ЕН ке й м Я г ТБ ї ! І ее БА МКГ "| і і їх ї і їх НИш в Ж ї ра й ї щЗ Я В ї чх ї У Ки Її шк Х яку ВІ г 5 В0б- й я ? їй ред ВЛ Ї й 5 ія і Ж ЕЕ ЕІ ій р шк: йо со ня як ; яса ій Її Др сесс у В ВВ ККУ Я пане і и зо вир а м В М ЕЕ КІ З ХВ ВИ В ВЕ Дні лова інскупації чн Я че | сеявнн 1, МЕЖ я | ФоБ т? ? шен ЗБ МЕ Я ї НО, І і -якк- БД моЖг ко Нюв кі і ж їх я і і Кі Х ї Ї ї Й дк ЗШ ї Ж Ес Я с; ; жо БОЮ. я Я ї | Шок ка а - дах. СК Я з п тоедх кекс х й й НІ хо 4) в За т 150 ДН ліспя інокуляції Фіг, З кю явно З ВНУ тк ще ЩЕ: св ж -к- В МЕ Ї -- БО МІ х я 5 г ій Х 2 Ї Со ВНІ З і Її г Н з т Її Її
З і. І Е її, і й 5 ОО ій й Й З Як я Ж й гй ве й 5 зов й С й я х І де ще ШК й же й 900000 аб сю КА; г щ я 53 8007 щ Днгпісля інокуляції як, 1 що --е ОБ - О- Уже Я З ване ж пе р ВЖЕ Ше й ж -- во ме В и КЕ й - сь и ск хх Из й КУ во щі Її Дні пюпе інокупації
Фк. 11 кО ге пф З КК ВПК жу ; з с: К есе Жак І веде ФВ МТК я 1800» ! 7 в. шо Ж я Ті « ЛО гі 1 І, їв ій Я ї 7
5 Я. Ку ї й ден ВЕН ВНУ Ге є В що ВО Б 12 Дні пеля нок
Фіг. 19
ЩОБИ Е тв йо щаласею) Зк о зкі чех ее ж сь їн ТВ ямсАВ ВОК КО ШИ інно КО Ж ще цу В посОЧНК о ВЕС ОКУ тане ех се п Вг заіштві Геровкчв оте мк ОВ Шдрнмнсодннноовнн ОО о ОН ЗИ ке НН р ПЕ « І НАТО ОКХ іх І Тексречи КВК ЗА: КО КО ООН З з: хх ОМС вежа п Б | о о . 0 ВО І кВ ше ПН ж І я о ВО вет Во МК ЛВ | ПЕОМ ОКО «ов ї КО СО м щі кОВОвннх я Же Н ПК о: ХВ М ОБ КО ді п і: ШК г ку І с с ЕХ ОО Я о для ! іе КЕ 5 ВВ ї Н ОКО КК З о а КОЮ НЕ ОБ о як ЗК ОКХ НЯ с КОМ ва : Ева ПМ. лягаю, ІЗ КК С: се ЖИ ши Я шо МОУ СО МЕ ЗХ МК т Ве В Ор дик кв ММ МЖК МЕ ОБИТОХ мо їйк зоре ати ох ВИ Ж Зана й У ПО ЕКІ ВОНО Я ща див са км в ТТ І тку званих пев кю сАю МОСКВУ І 5 ок З новин я г: ОО У Туле . ЗНМ Б РО о. ом Гежкрома сіни По) КВІТКАХ г п тане Почекн ОО Ї ддонннннннннн0О ОК екон нена її. жо о я ще Е ЖЕ о -Е птн КОВО КЕ ща с КХ З що ща о мк СЕ ї ЗК С З КО В ОККО их Е ооо Я ШИ в о ЗЕя ОК В. ВОК С хх КО : - ІЗ роз СХ КАН ха КУ Кота суттю ж Еко з т МИХ ЗО ЗК ї КК ТОВ Я о ї ВХ М 2 КО с т ї ЕК ях Б МОЇ ї КЗ п. еВ ще; ХО ОК Я і Б Ко ра Е ОМВК в НЯ мой ОХ ОКХ ВВ Ше! о НЯ Н Ко ХУВАННЯ ну во ММК ХК ОКО ХК ЕІ ОК. ЗК В ї ща о ЕХ зва ВО ВХ КВ Вих Ді КМ С НК Н ОКО щх ОО КК о С ОО М Н В ЗО щен г ОК щу с, 3 Б ЇЇ Е ее ша зе я ї СЯ. МОХ ОО ЗКУ МОН ХК ЯН УК КО ОК Я вІКЯ 5-0 ис Ох ОКО сх КеОВКОККОб . ох я МО ХХ У
ЧНк. ня Ж ою о. с сек» ОХ КОХ ж КВ ПОН КВ ХО хе КУ ЕВ сх п с пе ен о с о. . п: і Ох УМО КК ОК У 5 ЖАТОК ДУХ КК а я З я З с с Ох с ОКХ Он с о с . ОКХ хо ОХ Ох НК ЗХ КХТОХОХ я Ух МО ОК КО с. ОКО ох ЗХ с у ох КО я с. с щ с Ох Мо с ОА МО У СК ЗМО ОО НУ он ОБОХ с КО с ХМК Я ВОМ КК ОО Кто ОК ОКУ с о. с п» КО о КК ВХ хх ЕК В ОКО и Б а о. ОО ОВК ЕХ о ОО МО ВХ я с КК ОК ОО В ОХ с ОК ах ОКО ОО ОО КОХ ОО ВХ п ЗОМ шо ОО З шо оо щ ОС МОУ оо ах ЗУ НН. З З В ОБОВ г ОКУ с Ме СКК Ка а КЕ КК З 0. З МКК КК КО Сх СХ БО ОК ее М и в Б З КК о ВОВК о п не п я СХ 5. 5 с х З алое «КАККККАКннМ в с ХХ МОНО онов те НО РЕНІ ВК КОМ с ОК о їсте НИЗ, Рамітьв) що ші у - ще 2 п с КОМИ ГМК Ясна КУ. в ООН с оо К ет у аККЯ іще ІЗ, Бен а с ОО ЛИВО с ОВ - й с п КОКО о поп В В М ОК ОО о ОВ ХМ Е СІМ я ПОВ БО ХХ ККУ МЕ КЕ; ОКО ОХ ОВ ОО. З о ДЕМЖАИЕ ПИКЕІ ОО ХК ОО ОК ОК ОО МК ОХ ОКХ с с ОК ОО МЕ МОУ ОО В ЩО о ОХ Ме о З ОО В Я ОВ В ОО ОК с Х ще с ОВО с, и с ОКО с Ох с ЗВ ОБ с о В с о с . пн ОХ ОО ОКО ще с СК МК ОККО КО с Є ЗОВ ОО КО ОХ ох ко ОО ОККО Я ОО ОН КО КЕ КО ка Б ОБ МО Ох С и У УМО Зх ХХ 5 КК КОХ СКМ ОХ КО КО ОО ОО КОКО хх ВН Ко М ОК ОКО МКХХ ОК ОО З КВ о МЕМ ТК ОО КК З праву 0 с с
МОМ. ка УЕ ДОКУ пом ЗУКООО с х о ОК КОКО с ПР, Мапюттіся) шк с делі й ЗО ОБОХ ХК у нано ОН У псом ОВ, ел, г Я уми певен ЗК ММК меня да и ж с Іо МОЖ КЗ КУА МЕЛЕ 5 я о. с ОО З: сові и ОТЖЕ КАХ У ПИТОМІ ХХ о о ВМ В ОО ПК Я ГА ХХ Ку ши ПО. туш од ВЖК МОЖЕ ща» ТУ ПОЕТ С ЕХИ се и пе КО о о ПТО с пок я МН ОН МЕ ШК 7 КЗ по я ПАННО НЕ ОЖУ КК ОХ З ННЯ сша ях КОКО ІМК ХК ДАВ МОУ ї 0 я МУ НОВ КЕ ее с МОЗМ ОО Ол ОО ЕМ ТІК ЗО ПЛЕН ІКЦ ЗУ КМЗ о. ОК ОМ ОКХ ЗВ М, КК ЗБОВННК ЛИЖ ОС К І КК ОВ ПЕК ККЗ З З КАВИ УК ПЕТ я ОК ІЗ ММК ОН М ОМ ЗХ В ОК Я КОКО АК ВИК КАК КВ се ОХ ЗОНУ КЕ КК, ЗОН ЩО ПК У: 35 ХХ ХХ 5 ОКХ З ОК ЗИМ ХО МІК ПЕ МОЖ УК ЗОНА ЛИХ ОХ У ПО КОХ хх хо де З ККУ Х СХ ОЗОН сх и 5 Зо в МЕ ЖК КО ОО ОО ЗК В хх ОО ОКО Кв с ЗА Б З ОО що о ХО: ОК Ку ОХ КО З: ЩО КОКО о У КІВ ке З . о. в. ше Б Б о п. . КУ М М о а ООН и 5 ЗО ОК Пк ОО Ж БК ОХ х СО КОКОН СЯ ОК СКМ КЕ ОКО ВЕН КК ОХ ОВК І ЕК КОКО СМТ ОО ХХ Як ОХ ОКУ МКУ и ню КОКО ОКО Я х ті . Б. ще . її п . 5 ко є ! УК ж З кОм а ХО З ОКХ В: МК ЯВНУ ЕХ т ДИ КК ЗУ КоАя КК 53 сх ОВК КО Я КОКО о КЗ КОКО ВНвИ ОО о ХЕ Вя УВО ОК КВК МКУ КК я КУ ї СО МОХ ТА В Х Вей й 6. це с 5 Ух я З 0. ЗХ аз ЯН КО ОХ ЗХ КУ МК ж м КЕ У ХО ХХ ке й х ; Б і; кі ВК З Я ооо ОО ОЙ Б «З ЗО Аж фа ех КК З ОК ОТ ОО ОН ЗМ хо кре ее КУ -е ОХ КУ ОН ВІКИ Ка БЕ ОО а ХНН. (В Що о ВХ ПА М ВН СУ МК поан ко КО, Й КОСА В: У ННЯ ккушкь Хе По КО М ПОВ с й г щ3 ЗККсо то ВК КАК 5 Ва е ДІ, Рачштев сет сс ЗБОЮ соту В с й ОКО ЗЕ п пом х уувмвчех Се со ОХ и о ОМ КК КЗ МИХ КУ СЯ КА МКК КАК М осне; МОХ. ІА с их УКХ НК СОН я ОХ КК ОК УЗ ОО КЕ я ЗЕ ох ЗОМ КОКО ЗХ о. хх М о Не ОО ОКХ Я Ох МОХ 8-х с С ОО МК о. ОО ЗО ТКХ ОХ ЗХ УОЗ ПКУ ОН МЕМ ОК АК СОМ АХ КЗ ОКХ МОВО ЕЛЕ КОХ ЗОН ОЕМ ПО ММК ОО; ПО ХХ ОКХ ох п МКК ПЕК КН ВО ХОМ КО ОКХ ЗО ях с с ОО ОКХ КК ОО о КЕ ОКО НО ОО МНК ОКХ КО ОО ОКХ ко ОХ ОХ ОХ УК Ех ПІ Ки ТК ХХ З ОО ОМ ОХ ПАКЕТ З ЗХ Ух ЕК У ТИМ ОО о. МО КО ОХ ОЗ ОКХ ПО 5 ДК о ВХОКНКОЙ УК с ОК Я с ПО с ЗО ХО З с НО с ОО Я ши о ОН КУ МК ХО ВО КК ЗХ М ЗХ ГО ОЗ ХО ПІК ХОХМЕЕМК ЕЕ ХО о ВЕ Б 5, ПМ КОКО МОЗМ КК с У У СХ КИ МОЯ З ПМ УЖЕх Хе МИХ ХОМ ЕХ ХК ОУН сок со55 МУКАХ У ех с ОО ЗУ ; о. КСО ОВ ПО, ВЕ ВЗ ОК КОКОН ПЕК М У БИКОВ ДН ОО САМЕ КК З ПЕК Па о. З ООН ЗУ ХЕ ВОК ЗХ с ТЕО о ОКА КОХ КЗ КО ЗХ ХО п ЕМ с око ОКО БОМОО КО сх п КЕ КАК ВОК ЕКО ТКУ, ЕМ КУ ЕХ ОМ З ОК ОК ВЯ СВУ ОКУ с ОХ с о. о. 5 ПН ОО пох МО 0 ОО с : шо п З сх 6. ТК п. ково ре ВОМ КАК З МОХ По У : Ме се ; РТ ІК ЗХ ОКХ КО ОКХ Я ПММ с фаху ЖЕНА; ОК с ї. Я чума Я бат с у То неовною (бе ВЗ о я ШІ т ОКЛИКУ Б ПН я І:
Б. НЕ ВО івпнею ОКХ сита кі 4 Єкдвуе Ку пе ТЕ Же. Те «яз
Янг. 5
0 о що ОХ о. ! г я . о НО 12 о . с що пох 563 с. РО о о. кино Пт со 6 ще що ПВ М ке ча З Бе кока: о ХЕ СЕ о т г У Ов сх що . і "ч К. і ЗЕ о Ме САКЕ о | ! 5 о 0. . : 7 с о ОХ . о З . . шо" ОВ Й БО У 7» п . х о ке
І . - п о -Х . 0 . : чо - ' ОК що Б 7 . ; ; Те о в». КН ХХ х оо х х Еб СУ СО ще те ща Ме ПК УОЗ 5 . є те ОД 0. По в й. з ; | | с . ; п. ЖІ З х о хе М зе о с В ЗО п в 3 и. . с ге що щ . с зо о. о о кох В З їх в ! : ! о ко мох КОКО, що я с З ЗХ сх - о о зе Еди 7» х5 о. о. о о їх ПКУ ще СХ 5 я о МК я У й З ж Уже ЗЕ КОХ ее У ВКне - о в я ще У оо ТАМ Не й Б о в шОЯ ТОК о о о і З. о - Ко З МИ БО ох У т Мо УКХ МЕ УК х. У п З - о. .
о. о о З ко п док яеок о ще ХК М У Зх КО х сх Я: В хх о іа с: ї ; З я ЗО у ОВ о НЕ ДК ж І 5 Са Я І ДІ ді» пиие КЕ їх ее АХ х хх ж АК А У я що оо» г КК х яр . З тя ож З ЕК у а ІЩЕ х ТУ У ое З Бе 35 ОК х Зо М Ех с. а о х МІЖ З МН п що ПП ух НО. о о. а о ех ІА с
Х . с ОО ще о о що о. о с о. паї п. ко яв о о о шо о - - о. З - ше ЗМ ЗК ОХ МСЕ КО хо хх КК ТО Я ш - с с. хе й о М КК осоясе вит ХА 5 ЗУ о У щЗ У 535 х ОКХ ЗК кВ - хх о їх с о о | с - І . п п о се ЕЕ - о яВ о и ; о Же віз ШИК о. о о у ХоКиех З ет вбаг о. о о. : х КК У Ух ях че У 5 У З в жо У Тк ТК оооЗ в. . . . | | | | ; с че 3 о є ; о о о 5 й ; Зх що. ву о о о. о. о ж: ; З 5 м Зх Зх о. ВК хе З МО х дя о З : | ; о о . а зв г ї : . с о ОЗ о 3 КО ся г л х с о о. СХ що МО ТЕ с о. Ох о. о о о З о що В. п . ле о о о НК ЕК . М З с о о КО а с о. о. Х о. о БА о 5 ЩО КО х шк м Ж ХК ОХ о. З КК . . о. ох С У хх ЗО х 1 о У МКК ВХ М о о ХУ ХО о СК о А о ме " | о о че Ех ЗК М - с ВО о ще Пав о
З. о З о. ХО Що . и Ох ХО о НЕ шо ЕК о ОК о чо Зх п ЗКУ хх о Ся іх ОО ЯКО хх З 5 Кк о ! со я о сні ух у щ ХУ І; Фе т. Б регу не ще пен Клум ОВК Кп В сонне Кот Кт ПО по ОН ЗО и ЕТ КВВ х ОО У ОО ЗО З І ІТИ ПХТ КО я З С с Ве В пово М Мо с о. ВИ Кв В с Ти КЕ пох По оон ИШМ, ТЕЖ ДІ ПИ ОХ З ИШТ, УММИ МИХ ОХ ХХХ ХКМХКИИХ ММ СМ сен МО СЕМИ КК СК с З КАХ Я г КЕН ЕН ОВ пн В ЗОВ шо Я 5 МЕ пада ПЕК о. п с о со ПУ ша ХО УК ІК но писнннв І, НМ СХ СО ПІКИ СТЕ г ок ПІК Оу с УЖ МИ КИ» М на не Бо; о Ж: о І СК Ка я пови ОВ Ки СК НК с о ТИ МОНЕ ПИВА І КО . ПЕВ ОВ ах КОКО ШИЛОМ ОО ОК п ох о с. ОМККЕК шви В о НК КУ ОКУНЯ ПОМ АК УК ПО ОО п ПИВ о ПЕ о. Мат с с по ОВ ОКО о. СОКИ КО Ве Ко Кн Ох о В с КК М о о се о с 0. МЖК ХО, ее ПОН ННЯ МК УКВ, ОО У МЕЗО ОККО М В Х о п ОУН ВОК: Зх КЕ З АК АХ МАК ХО ОКО ОКО с Мои СК СИСТВЖОВ КЕТІ Ито ОМ ОО ЕКЗ ЗХ У ОБ п ПОох о ПЕ ноя с о - ПО о НЯ, с - пово Во ПОТІК с З Ку В В М, ЕТ с з навали їретв ее . с 5 я Же, ГБ ії. ОМ п ОО о Ох мл з ПОВ с КК ОО МК ЕТНО ж НЕОН ГО ; .- о ік есе ЗОВ, Кава ОХ ЗХ ОО ОККО МК х ОО МО вив с ОКО о ОО ММА ОКХ ККУ ОВ шо о. С. п о ЕЕ ОВО Ох й КО ВВ ОХ Я З ОК ОК Во ОО с но с с КК ЗКУ є УОЗ ОО с п КО МК с КМ ОХ ІК МКУ З У ОК п о. о С ОМ ОХ ОК ОК По ее По о о ВО що с МІ КО ОХ му ок ВЕ еВ в. о с ТОК ОК КК МУК ЕК ех ОКО п ОО Ох ОО ОО у о о МКК ОХ ПК КК КЕ МКК Кох С ОК МО ОХ САКЕ о о. о с ОХ ОК ВОНО А Он ОККО п. о Ох о с с. . о т С 5 ще Зо М С УК ЗХ ЕК МКК ХК УК У ОВ ХУ о ЖК пор п С ОКО ОО о ОККО ОО в ОК КОКО ОККО ОК Ох сг о о. що Ох МОХ КО КО МИ КИМ ОО ММК ПК У ах МО ОК у ОК ВООЗ ОКО СУ ОО ОО ою ОО ОХ ОО ЗХ МКК ОКХ ОХ КК п МЕ
КК . ос о. о с о і п КОКО ЗО ОКХ З ОВ У КОКО Кв КА . о с с ОО ОК ОО ОК ОКО МКК Ве ЗМК М М МОМ ЖЕО ЗАМОК ОК ОО ЗНО КУА ОБЖ Я и ОО ОВ ВО о. о. Кая ЕК СОМ З КК ОО З ССС ОО хх о. . ОХ ОККО ОО ОК ОКХ ОО ОК ОХ кивнн НН КОКО че т ОКУ КК оо СО ЕК ЗК КУТ ;; я М ОБОХ КК ОКО КК я воге СО, Репютієя ЗУ с о МЕН ОКО КО С КО А їв же ОККО В ОМ кує кі я З ПИ й що ур. йосме 1, Р апіюг!
Р. матом - Фе коле не Ш додали УСТ сито МО СОЯ ї 5 ОО ООН МК РО ЗЕМ Ви В я І ХЕ ОК ОК КК ОКУ ПО ОО о М ЗК ОМ ЕК КВК У шо о ХОМ МКК ОКХ ДЕК ПМ ЗО що . о. . ВООІ МН ОК ЗЕМ ЕК Ки ОХ МОЗОК Хе КЕНЕ ОМ МІК я ПМ КОКО ОХ ОКО ОКО сУуукнумя с с о и Ши ОО За Ох пох «ово п ОО С я ОО в Ох п о. о с пе МКК Уж ПЕК ОККО М СУ ОК ІМК АЖ о ТОК КАК ВОК ПК МАК АК СУ ККХ КОХ ОКХ 5 ОККО Я ОВО МАК ХХ ОВ ТЕХ ОХ КК ОХ ОК МКК її . о о КАК ОО ПЗУ ОК УМХ Ми . о о о о пох ЗО ОО я З ШУ З У В ОО Б ОК ОК АХ КК МЕМ МО З ОВУ ХМК Б о о. о о. я МЕ ЗХ ЗК ОО ЕКОН ОКО . с п Бо Ки МИХ ОК ОК ОК ТК КО З Пе ККЗ КК КО о. ОК ЗОВ . . 0. Хе І да ПЕК ня КАХ ЖАХ МЕМ с ОК ОО МУК ПОСІВ КК АХ СЕК ОК ОХ оо ЕН МЕ ОО ее о А ЕКО М п с КОХ ОА ХО ОК З З МУ. ПОВ АК МКК КУ ОО ПУХ МОХ ОКХ КО ЕМВ ЕКО КОС ХХ КОСКОВ сс ССС ОХ ЗВ ОО ОО Тео В МО КОКЗЕВ с с ККЗ п и ОВ ВОК о. п ОК їх КЕ ОО ТКТКК п ОЗ ОКО ЗХ ХК МЕЖ МАМО ОК ОККО ЗК СОВА с . шо ХК ЗОВ МКК ТЕТУ КОН ОК ЕМКОН С Я МО М ТОНКЕ В ОМА ЗЕККОХ МАМО ОХ ХАКІ КИ МАМО ХО с с о Коен Во ОХ ЗОМ МАК ОКА . с С ОМ иКМХХ ОК ке КК ОХ ЗО УКХ КОН Я КМ шо КК ОККО КОХ ее КЕ ПМ М У ОО о . о. Ох ОЗ у ОХ ОО Оу ЗК МВС КОМ ОАЕ ХОМ КМ ЩЕ с . . В ОКО ОО КОХ Зо с о. І М о ОХ КОХ ОО КО СУХІ я . . о. З Я ОКУ М Я ОМС ТОВ з ОО МКУ КК В ОО МК о я ДЛ НИК г ОО Ко ОО о Ох ЗО М о - т о с. о. ПОКООВ КК КК ОКУ п І т я - : о. А поко З УМА МЖК ИНА МКУ і в чеки ОО З СО ОО МАО СК ККЗ КОКО «КА ж ук МКМ ОВО ХО о АК МУУнеКККХ ї ОК ДЕК МОХ о с о М ЗК КК ОХ Кауеу ІЗ і ХО ВК ПВ щ- її о ло г; Яким ОКО ІК КЕ ОКО КО КОКО ких о ОВ ЗЕ ЗУ ОК УКХ ХА ЇЄ ЗХ ЩЕ о. о. ЗО ЗМ ОО З ВН Зк ТВ г а КОВО о. с С шо КОКО Б ММ КЕ ОН Й КО СО ПКУ п КА МОСК ОО с о. о п ЗХ КА ОК ОККО ВЕК хх Ох с іх с . с З ОККО КК З ДОС 55 о. о я ОМ ХМ ХУ М ОО о НО ЗВО ЗОВ КК Я ММ с о. ОО ХВ ХО МУК МИСОК МКМ СО о. КИ ОХ ПМК ХК а о. п я МЕДІ ММ Є ОХ КЕ Ох п ХОМА М ОКА ОХ о ОКО КВ ОХ ЗО о с .
о. МО ОК ЕХ о п КО ОО ОККО ЗМ о ОВ ЗУ МО ПО У ВЗ МКК ХУ У ХО МЖК ОЕМ Б о Ох сх ЗО СЕК АНЮХ ОХ с х с КЕ ЕВ АК ОХ КО о НН КВК КОКО ОВ ОМ 5 ПАМ о. о хх МОХ Ж х ОХ З ВО ОО МОНЕ З ОО с п ох ОО ОКХ К 5 й ПО ОО ЗК УМ п. ОБ шо Б БО ОО МОМ Ех о. ОО ОО ОО шо о і МОДНОВ. Фени ЇХ ЗОВ юр. йога БОБ, МеЕмБогив з ХО огухухи Боня їх 328, БУ ча емчанка.
Е . ї шу я не» пе: не з ше МАМА кю то : яву зо - й за: ММ, : . ва - 5, ВЕ дк Же ї ЩІ 7 і у в в ЕЗй ї в'я і я, Е ї Х ді 5. : С М ко і її ув Е з ях ше ; Я НЕ УА І і хі ко 5 4 Еш | Зах о у Ж і ії Ж ; ЕЙ їх, 5 хх ї х хе ще : -к і тк Е ї Я Ні Е Маре неккуу секр одедвесвютня у пі яд МУ яд ож ЗК ле атлет учклатт ул жтум М Я Ям т й т ни шк и и ом по Но в зн и МИ ПЕ КОМ іме чааь пеня М пмеезі кеВ Б Мех-ї пог діщту-х «ге як «Й 1 Кг Я зще іден і у. 4 ЖЕО овежяз чк ще ВЛ НЕ що і -к ЕІ і Ох іон НН тя» тя о о чи: й : 5 я я ЕЕ х «і о з п Я ІУ Я 4 х х зе х Н м х Ап х ж Кз ше ! ЗБ удтодуюу уро му Корм тютее то духа ї я зу у тв у зд у у КЕ а в ни А и р в мОомав м пежомеКаІ М сш й Ши І 7 БАК М
Фіг. 15 че а Ї УК (У Зоо НЕз г Жзувнні геї; ззрютте тане х г з ка спецеичне чутинечсть и ї щощеохі ще ЯСНУ ВОХ Кеш коми ниМ ЧЕ й ЗАОСНА, знижує ЯКТМеТе : щш В зве хам'якитяі жо ї я КЕ що ї Е з Є Яком-я Ж Жигченм; пиМіВ начутени са й око ВОІМОМВОО (невоноюговавнйх ня «а -М оОусаго УМЗЯКА не вмааннє БЛищУ ї У на дитиннить м кни чук се гг ігтвроет т ПКУ зни с ж ке з зних пий зала вл: МИ й вс зо в вв а каси щі пл 1 та НУ ВАС НЯЗ МКицх НМ
Фіг. 20
І 636 буваю І ЕАВОВКВ жан ОН ноодно :
п. о КО ПЕК диня ЗВ. їх у о ЗВ НЕКЯУ . ооо. паж Е ОХ КВК ще Мо ПК СКК ВО і с ОККО ІЗ Ок 0. шо п. і яко ЕКО КО я с п. че т о. 0 с п її . і ОО п одно, їх ОЗ ХО ОВЕН ПОВ ООЯ ЗХ ХО р . З . . ї ї : КВ ОН СО ОВУ с З 1 . с. що ОХ Хе КУМ Хе Сех М Х УКХ хо ХХ МУ СЕМ ЗУ с СОКОХ З ж ЯК. ЕК Ко МКК со Ме ВО ОО ОО х ОО ОМ КО СЕК о. о. ПЕ ОО МЕХОА хх ЗКУ МІК У ОЗ ХК ох КВ УОЕУ КОХ ок УМХ НЕ ЕМ с ОО о. о Ох М с 1 З ОМ М с ОХ «З ХМ МОХ ж с КК оо КЕ ВВ ХУ СЕ ХУ ОК о о ПИ СО З о. З 5. М п. о с с х с п З о. / по с. яв и 2 ОХ с. З З с ЗО КН ВЗ ХЕ їх я ЖК я 0. ОХ ХУ КЕ М о ЗНУ КОХ ПАХ о 1 | с с ВОК ЗУ ОН х Ме ш СХ У 35 АК МО зх 0. п о. с С З МКК ХО о З 1 ЕХ ТВ ККУ М с ; ЗО ОО ОКХ Ох УМО с і. її о У о о. 8 0 ХМК хе с | | о : ОХ ЗХ ЗО ОХ КІЛ ння ЖК КОХ ех мое МКК важке а на М о ЗХ СУ С МО З о о . . МКК ВЕС Ж ООН х МО ж щ ОМ ЖЕ ОО ЕСЕ о 5 КК с - с ї с КО Ме о Сх я КЕ я МОЯ пов і мк ОХ Х М ПО І Зак ЗОВ АКА ЕХ о ТО 1 п. о й с ке ех ІМК с т ПАК с с У се ШАХИ М с З . п терну о п. ОО кое рої 5. ще . . о і ОО ОХ їх ООН зе БУХ ОО с З З ке МО ХХ ОБ ОХ о 0 5 с п. не ГО ах о у МОВ БЕ с с М о ООН ОО МО 5 5 о. с о о. с с о о п. БВ З п ЗУ о. Ко З с БО КО с. З СХ НО х БУ Б МУ Ох ВО Кок ОО КО ХУ З МЕС МКУ УКХ КК ОМ У Пе М Ме що КОКО ОО ТЕ о о. о. с 5 с о. в Зо Сх . З о ха с с ОКХ М с Б ХХХ ХЕ с о Зо КАЗЕКВ У ПО ХО ХО хх КК У КЕ То ЗО З с ХУ Ки Я п. ЗК ОЗ АК ЗА 5 С ОК Я ОХ СОУ ПКУ що ЗХ ОМ Хе с . о. о. . п о З З СУС ОО ООН с с СО ММ ЗМК оо УК Х ЗК БО . ї о с Не х . М п. У с о о КО ВА З о с . М Зо со ня ІМК хх КЗ У КА МАХЖК ХО УМХ ХУ У МЕ Ж УК о. ТМ МАВ ЗКУ ЗЕ о . о МО ДЖ пе ЖЕК МОВО ЗКУ ЕХ о Ка . 5 СКК ЗУ ВЕ ОХ З М Я Ве ще У Х ж АХ АХ ІКТ СО Е У со» ек ну Ужих СО хо ХХ пи ЖК нт. 21 МЕ с І ОН ХУ
А.Й ох тік кіс МКК п із ; Кеш "МСЕНОМО: 2:З впнов, ХТО? ЕХЕАТЯ: 2 однов. (5324) Ви ша о НН Я п о ВЕ о о. о с М ПЕ КН В В .
с о. З шо ЗМ : ПМК о. о В ССС: КЕ
0. п. о: шо о п ОС ша. с се КОЖ З п ОК В КА ВВ З ЖЕ ОХ ОО ОЗ ММК ХВ МКК ОО ОН с ОКХ о ОМ о п ЕХ ОО КОКО а. М ки МК шк о В КОКО о Я с ЗХ з Я Кт с ПЕ КВ ов Коля КОКО ОМ ОКО СК МО шКека ОК М ХХ ОВО ЕК В с КК В ша МК о ЗМК ПТМ Хек А ШХХК о МН М М НН шо ОО КОКО о. с с 0 с По В о ШК В сонна ан п нн Но
В. Карцинома вндомете С. Кароннома мвейки матки івнковеа: я неваНов Я фюокальн ХТО ОКА: З еднов. СКТОО М КК ОК г ОО ВК КМИН ОК ОО 5 КК СО ЗК КК ВК ОК ОКОМ с с с о. ММК ОК МХ Ух ОХ Х З МОМ М КЕКВ ВК ВК и КЕ МОХ ММА СО ОХ НО ОК ОК МО НК ЗО ще с В Б Б М В В БЕ п г КОКО ПО ОМ В п КК с о. с о х ОМ З с х ОХ УХА В Х ОО МОУ М ОВ І Б В ЗАС . ОО ОО ВК ВХ ОК о ВЕ БО о. о ша Ен ОК НВ о. о КВК З -Х 5 сх 5 ОК се в ще Ем я я п з. 0 ЕКО КОКО с о ЗОЗ ЗБ с КН ОК КО ко со, с п.
п о. ІЗ о ОО ОО У о п. . у У с ОХ Я ОО ХО 53 КО В У пн НН НН НН нн Яріг. 22 сеавак П ат ФУЛИННЕВ Па. променя пошеокн: ве нецпнод. МІУ ІІ ЕМ ІТТ од ВИК МИ ІВ ТМ ТИ щ ОШИХКИ І, ІНТИМ ним м дн і М по АК ен но в В а ОД НЯ ООН МЕ пен В НН НН ННЯ ЛЕ он ПИТ МОЛИКМИ ВЕ о в о в в ВН и Я не ПІШЕЕД ММ у ЗД ин и Я ШЕ А Я я вв ОВУ Мо ванн НН НН до с нн в ня С а тк ВОВК КН и ВН ди ШВИ о В : и ШК нн ен я при КК : М тн вжи в т др яко о ве ви и вн С ОО а Шо и НЯ МИШІ ин СПЕ ке МЛ ДЕ ЗІ ОСИ В ТЕ ВВ ПИТТЯ УМО лищет УМ ТМУл М ШИШКИ М ПИ ЕМ и КИТИ х пе в о В не сн нн НЯ ПІТЬМИ МТК М жим ПИ НІ по. ПІ НН НН а НН ВН ПЕТ ПИ АТМ п - мл ПЕ РОЗИ ЕМ и ВМ шт пд ших ПЕ о в ЕК І ВК ЛЮД пе т МТ, КК М СТИК ПІК, ЧО ШЕЛЕСТ ШТ Ве м НМ І пам. ПІ ПИЙ ЗПП Ю Й ПДМ СУМІ ТТ ЕТ ЗИМИ да УС У ЖИ Б ІН о ни УК Ж СЕТИ Пет М ЖЖ км ПЕОМ, ПК пл Год пт в в КН НН нен Порти тя ЗЕД ТЬниє о і их ПОМ ТИМ ШУ МЕТКИ пов ВК КВ То ЕЕ потом МИ КК Тип ФМ ІМС ди. МЛ Опале : Не СОЯ ту семи Кви 00 ВВ ММ ПОШИ я ПАМ ШедИ Ст ПХТ ши п ду М ТИВИ ЖКЖТО ЖК секр ЕК М НЯ ХИЖЖКВ. М р МТЕ пден кн МВТ КИ МОДИ ха р ши Не а 5 ваш о НИ НК На НЯ по ХІМ ки Ку ОНКО ВЕ В я БУ ММ, ПИ ЛИН сити, ПЕТТІ ви ЕК пт Лх що в я З и я Б сне ни ВН й КО п ХНИ о В що сн нн ни НН А не ее ВОДУ КУ Б Ох а НУ шо до «і ОТО І ДИТ КИШКИ ВТ КОН си ЦЕ досу ОСИ НН ЖК ОК ЛЕ Од винне Ки Ж ПИ ЕН МНК ДИМ сне щ" реак ше НН в я ОККО й А Фк п ВИШ ВУ ІЕЕ прошиюо ПОММ УТНИЯ ОЕМ: ше У ІЕМ ОХ? ВЯ п. ЛШ ТУТ ЛО ЕД ШИ м ДО ЛКК щ у шо до с й виші ня НН НН ОМ ХО її Ж пк: ЖЖ дО КА Пт ЕН ІТ ЖИМ СТ ПИТИ ПОТОМ МИТ ДИ ШИТИ ВО з їх з Ес о нн в нн и нн Я МО З яОЛАЄ ее З НН СВ и о В В Пееніквнах о дк МВТ еК умо: ТКрмаувенкове змен: МЕБАТеНОМ: З КУМ.
Віг. йх
ЄС що чиТе а аву сенси СТЕІЕКВНЕЄ клею Юна ЗНСЧННКЯ, З Дер Я а Я ща 5, ВЕК ОВеВе зи ва са ще дДеЕНОКеН УЮ песня, З од ХО СК йо о КК ОН о ОВ нон ОКХ щ хх 5 МУ и Сх у КАЖУ ОК ОН сх. ОО В В я Во КК ВХ У ах. М ше зу КІЛ КК ЗК ПАМ щоді М ОО В Ї КИМ АК КАК УК КК ре сумах МОХ ХК ОМ 5 ши МАКИ КИ КК уквене Б в и с у. ПУЕ ОХІ ПОХОК С се ОК п МКМ ОК ОА АК щи М СК МЖК: ОНКО КК КК ОО о о. ЗУ с КЕ УМ КУ ще Я ж с, х ПМЖ ОКХ ІК. ши и КК ХО ОК КК ОВ БОМ КК УМХ ЖК ОО ЗХ ОК ООН 00 МЕККА ОК КН КЕ ОБО ПАСМ ОО ХО У ОХ КВ А ОМАНУ ОО КО ОК ДК МК ОК ОО З Ки я Ух 5 Кх МКМ КОНЯ ЕК КК КВ ХО ОКУ ХК МОСК КОВО КК но ОК и У Ся хе х З х Я ПО ХХХ ОВ ХО М: ОК КВ ся ПЕК КВК ОККО КУЧМИ МО М З З ОК ХОМ КЕ АК Свпоитиньа хвріденоках пихкх. їз ко и Ох ще СКІМТИЯНЕМХ КІНО НЕ х У зе онікс о п Я, Ж ВДВНДь МОХО ВН: ВЕУВНОК ВЕНУ очка. їх ОДНОЮ ПЕК В КВ КН пок попи ти ди ко ПМ КЕ ПЕК МАХОВІ КА ПМК ЗЕНИК КК, ПЕН ООН В ни Бе Мини в ЕК КК КК ПК ПАК КК КТ пОЦИДІМІ ПИ КО В ХОМ, ВЕЖ ПОН Тен ОО ХК явні МК ОК КК ЕЕ ШИНИ ВІК ОКУ ПК о Он КИ х: КАМ ХМК, ОО НЯ МИТИ АХ ОО ОМ ПІДИНІТИ. патснані : МеВ В ОВ по ОС ПО в Зх КНУ ОО ОК ОК о м ПЕК ПЕжи М, ОКО ПК КОНЯ ПК не КЕ ПІШКЕК Еш ПН МКК ОО Я о о о СИ В ТЕМИ ке а Я СІ ПО о ка ПІК ТЕМИ КВК ПМ КМ ДІ ПММ КИМ ОК о Вони ПЕКИ ЕВ п я ори им СЕН ОВ Ще Ба ПЕД ВМ. ЖЕК ПАМ, ПХКЕІ МИМО ОО я ПО КИМИКИ. ПЕКИ ВИК КВК А Я о р ПУХУ ПК и ВМ ПЕШИМЕ КТ и МК, МКМ ПЕКИ ИМЕНИ ТИМИ КИ ПАХИМИНН ККМ ще ЕК ВН о ОПО ОВНА я ЕВ й КОТ БАКИМКИМНМЕНЯ ПІНКИ МАЕ ИН У ЛИМИМЖТ ПКК Е ВК ЕК Сяивианинна п Я 5 Я З НН В ОВО ЕЕ б кХ ТАНЕ ОДУ оЯ НК КВ, БУ УоДнх кА. ІЗ у х ТИМОШИК. ЛИ КИМИХИ, пли КЕНЕ МЯКОЯ, 5 С. свинок тнком когенно ск й ПЕК Кк ев КК В в Двитоютітнивна наринока нд. Хі демор. ПОЕМ ЕД НЕВЖЕ, ПеЕІПДЕШИМ ММ ЕМ ПКТ КК, ОН ПКП ВВ НВ ПЕКИ ШНЕК ОО и СИ Ми Ми ПЕТШТ НИВИ КІМ, ПП МИ КМИН ДИМИТЬ ПАКТ КК ПЕН В НИ МІШКИ ММ КИМ КК КК КК СОМ ШЕ ПК ОО Я ПМК МКК ПИОЕИ КККНК ПДК СИМ. ЗБ ех Я ПИШИ НВК ПЕК, ча В о НН УКВ М в Я шою КК КВ ОВ ПИВ КМ ВЕК КИ ОН Я З Кавова ВО В Я ОО КОКО З не о ВЯ У К Щ- ОЗ о и я У ПЕНІ ШИ М НИ ПН ЕДЕМ КИ Знтеенани ин М Ве ОМ Ва о : ОН и В МНК СЕНИК ВК, ПЕК НИ ПИ нн У ДМК ПИ КЕ Пани ПЕОМ, пики М, Ве о ОО в У ПИ в м В а в и о НА ОЗНА МОХІВ М ТТ ПММ ЕМ ДІВИ ЛЮИМ ВК ВЖИЛИ ПИ ЕК М ВН КН ПЕК ІЕМ в о я ПО я ПОЕКЕКК НН ооо ВН я ПИ: МО В НИ ПЕН КЕ пОпОДИИ К К ЕМ ЕК МИШІ ШЕ ООН ШИПІВ, оо о ЕТИЧНА МКНЕИННк. 0 МКМ КЕ и НЯ кдоов нет Удома ке : : їх Прожн ЦЕК На Еювацня яечижа ОДН Ваопжа писку ЩІ з ОК и кемуютня р НЕТТО КН ЕК КВК МОЗКУ юх СКО, ПМ ВЕ М ЕЕ МЕ Ду по І ЛУКІВ ВМ секонд ЕШЛІ МК КИ ПЕН М ВИ МАК ПИШУ ПИТ ММ п КК КК, ІНН: ПМК О о ОСПЕНЕНННКМИМИК Я еко ЗАКО пот тинит, с М ПЛІД ОО ОТУМИК еВ ПК У МУХА НАМ ПІІ де МЕМ КОКО ПУЕ А НЕ ОК - ЕН СОБКО ВО НН МО МОЖЕ З пень с ї п хо 0. г ВИДИ В МО КМ ООН в ОХ З ХОМА інеенерунюю Мен Б ВЕ шт ЧИ КК ОН Я ОО К ККК Ух СХ с и Шо оо її : й. МОМ НН ОН Ми ЗМУ ХЕ ХУ КСО ОККО ЕКО ПК В НК АК ОБОВ З ОО ОМ МКМ ПЛИТИ М СО МУ ОК ХХ В но в ОО Ме ШМК ен КК ЛКК ОХ ОУН ПИТИ ХЕ с МТП МИ Ми КОХ ММА ПОЛ а Са ОО ЗУ М Я КОКОН НЯ В М ОККО си ОВ люде пох п АК и я ХОЛ ММ МКК ЕМ МЕТ ин, ПОДУМКИ М МИХ ИЙ кн де ЕРМТИТКИХ ПК НО Ох ях ПАК я ВЕраЖ КК Но Кука ВЕК: ЗИ ОКО сенпокліти ЕКО ЕОАН КК КВК сект п ПОМ ОН сх Ам пк лтннне КЕ ККМ ОК МКК КОНКУ в ОКХ В ОК Пи я о ШО ЕПЖН нм ОК КЕКВ Пе ПОЕМ ОН ОО ЗСЖ ши КК жо ИМЕНИ КО НЯ ЗХ МИ ОК ЗОН Я ПММ СІМКА КВ МЕТА ВИ МК КВ ПОЕМІ К КАМ ПЕКИ КВК ММЛКУМК МИ ТІШИТИ КК. КО Ве НК Х СОЯ КЕЗКОНК КЕ КАК З дівань КЕ я В. о У ПЕТ рано МИШКИ А МАММИХ, ПЕК ОК Я ОН Знеанквкит КОТОВ о З ОО ТИ Коди ня на ління ПИШИ КИНЕ ОЕМ АК ОО ШЕКІХУ ОК ОК КО рей : в в я ва КАН в ОВО ЗЕ ОБО ОО ТО ПИЖМА ЕМ КИМ ЖКО ТАМИ ЕМІКІК МАКОКВІКК М МКМ МНК ОМВО с ПОН во АНЯ В В В Ва ОО ПІШКИ о В м о Я ОН ее о НЯ ПЕК М ТЕ ПО ІІ ПК ПИЖМА ТИМ ОМ КИМ ОН ПЕК ПИКА НК НЕК ВИ КК МЕНЕ ПН ПИКА се р ІМ ЕМШЦТТСОМ МЕТУ ПИВІ ВИ ЕК ПК. ПЕКИ ост - Й й ОК Кв ЗАВ ТОК ПВ КИ: са мет АХ сесжч но КЕПКИ МІУ УКЖИИ ее уиновва межа А ОК деки ІУМИ. МНН. З. ФвгуВакця; й ШЕМВИ В нм ОК УЧНЯ В ще Км Ки їм з о ММК МОМ ОВ НК с. ПМК пн вн пп ІЕМ МОМ ПО ВЕК, п ОЕМ І МУК МК МНК ПК КК КЕ МО ОККО КВ ККУ ОВ ОО УМ КМ Ки Ь ОН У ВО ОК ОВ В КК ЕМ 4 ді ву я ВЕБ НМ Ж ОКО ДИКЕ ПММ ММК ЕК ШИМИ КИ КАК ОО Бони КИЕВ М і МЕ ВОо я ПО но інтен м. М В Я КК ОМ ВК ПЛ ік ще: о В ДЕШЕВО ВВ ОО Я кн В В В Я По ОО ПО кокон, МИШКИ КЕ ПЕОМ КЕ ОККО УК и В Махатияних о ОК пи я ПЕД ВК КК о СН ОВ А А КК НИМ В ОО ОВ ШУ КО КАШ КВК ИН ОВ ЕЕ ПОЕМ по КВ а ПОН, КЕ ОО о о ОК КДИМИ МКК ЗИ о и КО ДЕК в о В КК вх ООН ІП КО ОО оя В и В ПИ М ІМ ИН ШКтК ЕК КК КК СО ТЕТУ ПІУММ МОЖУ МЕ СМИМ ПАК ШИМИ МК о ОН МИКИТИН УНІ МИМКЄКИ МИТИ ИММИИТ,
Фо. га
UAA201609144A 2011-04-01 2012-03-30 Способи ідентифікації раку, який може реагувати на анти-folr1 антитіло або анти-folr1 імунокон'югат UA125636C2 (uk)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161471007P 2011-04-01 2011-04-01

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA125636C2 true UA125636C2 (uk) 2022-05-11

Family

ID=46932392

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201312203A UA113403C2 (xx) 2011-04-01 2012-03-30 Спосіб підвищення ефективності folr1 терапії раку
UAA201609144A UA125636C2 (uk) 2011-04-01 2012-03-30 Способи ідентифікації раку, який може реагувати на анти-folr1 антитіло або анти-folr1 імунокон'югат

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201312203A UA113403C2 (xx) 2011-04-01 2012-03-30 Спосіб підвищення ефективності folr1 терапії раку

Country Status (29)

Country Link
US (4) US8709432B2 (uk)
EP (4) EP2694106B1 (uk)
JP (6) JP6018621B2 (uk)
KR (6) KR102489185B1 (uk)
CN (3) CN103747802B (uk)
AU (4) AU2012236219B2 (uk)
BR (1) BR112013025415B1 (uk)
CA (2) CA3182262A1 (uk)
CY (1) CY1119960T1 (uk)
DK (1) DK2694106T3 (uk)
EA (2) EA201791843A3 (uk)
ES (2) ES2661466T3 (uk)
HK (1) HK1254759A1 (uk)
HR (1) HRP20180358T1 (uk)
HU (1) HUE036172T2 (uk)
IL (5) IL281714B2 (uk)
LT (1) LT2694106T (uk)
ME (1) ME03025B (uk)
MX (3) MX346555B (uk)
MY (2) MY180894A (uk)
NO (1) NO2893540T3 (uk)
PL (1) PL2694106T3 (uk)
PT (1) PT2694106T (uk)
RS (1) RS56916B1 (uk)
SG (2) SG10201602553VA (uk)
SI (1) SI2694106T1 (uk)
TR (1) TR201802659T4 (uk)
UA (2) UA113403C2 (uk)
WO (1) WO2012135675A2 (uk)

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7811572B2 (en) 2005-08-24 2010-10-12 Immunogen, Inc. Process for preparing purified drug conjugates
US20110166319A1 (en) * 2005-02-11 2011-07-07 Immunogen, Inc. Process for preparing purified drug conjugates
RU2765240C2 (ru) 2009-06-03 2022-01-27 Иммьюноджен, Инк. Способы конъюгации
KR20190114019A (ko) 2010-02-24 2019-10-08 이뮤노젠 아이엔씨 엽산염 수용체 1 항체와 면역접합체 및 이들의 용도
TR201902180T4 (tr) 2011-03-29 2019-03-21 Immunogen Inc Tek adimli bi̇r i̇şlem i̇le maytansi̇noi̇d anti̇kor konjugatlarinin hazirlanmasi
KR102489185B1 (ko) 2011-04-01 2023-01-17 이뮤노젠 아이엔씨 Folr1 암 치료의 효능을 증가시키기 위한 방법
SG11201500938XA (en) 2012-08-31 2015-04-29 Immunogen Inc Diagnostic assays and kits for detection of folate receptor 1
RU2661083C2 (ru) 2012-10-04 2018-07-11 Иммуноджен, Инк. Использование пвдф-мембраны для очистки конъюгатов клеточно-связывающий агент - цитотоксический агент
US9353150B2 (en) 2012-12-04 2016-05-31 Massachusetts Institute Of Technology Substituted pyrazino[1′,2′:1 ,5]pyrrolo[2,3-b]-indole-1,4-diones for cancer treatment
WO2014087863A1 (ja) * 2012-12-07 2014-06-12 協和発酵キリン株式会社 抗ｆｏｌｒ１抗体
KR20150119848A (ko) 2012-12-21 2015-10-26 바이오얼라이언스 씨.브이. 친수성 자기-희생 링커 및 그것의 포합체
US20140302037A1 (en) 2013-03-15 2014-10-09 Amgen Inc. BISPECIFIC-Fc MOLECULES
EP2997044A4 (en) * 2013-05-14 2017-03-22 ImmunoGen, Inc. Anti-folr1 immunoconjugate dosing regimens
IL293871A (en) 2013-08-30 2022-08-01 Immunogen Inc Antibodies and assays for the detection of folate receptor 1
MX2016004411A (es) 2013-10-08 2016-07-05 Immunogen Inc Regimenes de dosificacion de inmunoconjugado anti-receptor 1 de folato (folr1).
US20150297744A1 (en) * 2014-03-28 2015-10-22 Immunogen, Inc. Anti-FOLR1 Immunoconjugate Dosing Regimens
AU2015276821A1 (en) * 2014-06-20 2017-01-12 Abgenomics International Inc. Anti-folate receptor aplha (FRA) antibody-drug conjugates and methods of using thereof
KR20240011258A (ko) 2014-09-02 2024-01-25 이뮤노젠 아이엔씨 항체 약물 컨쥬게이트 조성물의 제형화 방법
JP2017527562A (ja) 2014-09-03 2017-09-21 イミュノジェン・インコーポレーテッド 細胞毒性ベンゾジアゼピン誘導体
CN116514903A (zh) 2014-09-03 2023-08-01 伊缪诺金公司 细胞毒性苯并二氮杂䓬衍生物
KR20240024318A (ko) 2014-11-20 2024-02-23 에프. 호프만-라 로슈 아게 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 CD3 ABD 엽산 수용체 1(FolR1) 및 PD-1 축 결합 길항물질의 조합 요법
CN108135902A (zh) * 2015-07-30 2018-06-08 爱科谱迅病理研究公司 用于最优癌症治疗的定量FR-α和GART蛋白质
JP6880006B2 (ja) * 2015-09-17 2021-06-02 イミュノジェン， インコーポレイテッド 抗ｆｏｌｒ１免疫複合体を含む治療組み合わせ
WO2017091745A1 (en) 2015-11-25 2017-06-01 Immunogen, Inc. Pharmaceutical formulations and methods of use thereof
US10472422B2 (en) 2016-01-08 2019-11-12 Abgenomics International Inc. Tetravalent anti-PSGL-1 antibodies and uses thereof
US10918627B2 (en) 2016-05-11 2021-02-16 Massachusetts Institute Of Technology Convergent and enantioselective total synthesis of Communesin analogs
CA3038897A1 (en) 2016-09-28 2018-04-05 Atossa Genetics Inc. Methods of adoptive cell therapy
TWI781145B (zh) 2017-02-28 2022-10-21 美商伊繆諾金公司 具有自分解肽連接子之類美登素衍生物及其結合物
WO2018195243A1 (en) 2017-04-20 2018-10-25 Immunogen, Inc. Cytotoxic benzodiazepine derivatives and conjugates thereof
IT201700087291A1 (it) * 2017-07-28 2019-01-28 Fondazione St Italiano Tecnologia Metodo di imaging di un campione biologico e relativa sonda
US10640508B2 (en) 2017-10-13 2020-05-05 Massachusetts Institute Of Technology Diazene directed modular synthesis of compounds with quaternary carbon centers
US11793885B2 (en) 2017-12-28 2023-10-24 Immunogen, Inc. Substituted benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indoles for the treatment of proliferative disorders
EA202092125A1 (ru) 2018-03-13 2020-12-15 Фейнз Терапьютикс, Инк. Антитела против рецептора фолата 1 и их применения
WO2020191306A1 (en) 2019-03-21 2020-09-24 Immunogen, Inc. Methods of preparing cell-binding agent-drug conjugates
WO2020205564A1 (en) 2019-03-29 2020-10-08 Immunogen, Inc. Cytotoxic bis-benzodiazepine derivatives and conjugates thereof with cell-binding agents for inhibiting abnormal cell growth or for treating proliferative diseases
TW202106691A (zh) 2019-04-26 2021-02-16 美商伊繆諾金公司 喜樹鹼衍生物
WO2020223221A1 (en) 2019-04-29 2020-11-05 Immunogen, Inc. Biparatopic fr-alpha antibodies and immunoconjugates
WO2020247827A1 (en) * 2019-06-06 2020-12-10 Mythic Therapeutics, Inc. Antigen-binding protein constructs and uses thereof
CN111579798A (zh) * 2020-05-29 2020-08-25 深圳市锦欣医疗科技创新中心有限公司 一种评估子宫内膜容受性的试剂盒及其使用方法
TW202306995A (zh) * 2021-06-04 2023-02-16 美商免疫遺傳股份有限公司 治療具有可溶性ＦＲ－α之患者之癌症
WO2023170216A1 (en) * 2022-03-11 2023-09-14 Astrazeneca Ab A SCORING METHOD FOR AN ANTI-FRα ANTIBODY-DRUG CONJUGATE THERAPY
CN117741149A (zh) * 2024-02-19 2024-03-22 卡秋(江苏)生物科技有限公司 一种用于卵巢癌细胞叶酸受体α的检测试剂盒及其应用

Family Cites Families (115)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3939350A (en) 1974-04-29 1976-02-17 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4277437A (en) 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
US4563304A (en) 1981-02-27 1986-01-07 Pharmacia Fine Chemicals Ab Pyridine compounds modifying proteins, polypeptides or polysaccharides
US4957939A (en) 1981-07-24 1990-09-18 Schering Aktiengesellschaft Sterile pharmaceutical compositions of gadolinium chelates useful enhancing NMR imaging
US4472509A (en) 1982-06-07 1984-09-18 Gansow Otto A Metal chelate conjugated monoclonal antibodies
US4938948A (en) 1985-10-07 1990-07-03 Cetus Corporation Method for imaging breast tumors using labeled monoclonal anti-human breast cancer antibodies
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
US20030229208A1 (en) 1988-12-28 2003-12-11 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
JPH049249A (ja) 1990-04-27 1992-01-14 Kusuda:Kk 塗型剤吹き付け機
US6916605B1 (en) 1990-07-10 2005-07-12 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US5965132A (en) 1992-03-05 1999-10-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
ES2193143T3 (es) 1992-03-05 2003-11-01 Univ Texas Uso de inmunoconjugados para la diagnosis y/o terapia de tumores vascularizaos.
US20030148406A1 (en) 1992-03-17 2003-08-07 David John King Multivalent antigen-binding proteins
WO1994029351A2 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Celltech Limited Antibodies
JP2002514895A (ja) 1995-09-28 2002-05-21 アレクション、ファーマスーティカルズ、インコーポレーテッド ブタ細胞相互作用タンパク質
US6596850B1 (en) 1998-01-30 2003-07-22 Ixsys, Incorporated Anti-αv3β3 recombinant human antibodies, nucleic acids encoding same
WO2000023082A1 (en) 1998-10-19 2000-04-27 Yeda Research And Development Co. Ltd. Treatment of systemic lupus erythematosus by down-regulating the autoimmune response to autoantigens
US20040031072A1 (en) 1999-05-06 2004-02-12 La Rosa Thomas J. Soy nucleic acid molecules and other molecules associated with transcription plants and uses thereof for plant improvement
IT1307309B1 (it) 1999-12-30 2001-10-30 Enea Ente Nuove Tec Peptidi stabilizzanti, polipeptidi ed anticorpi che li comprendono.
EP1267918A4 (en) 2000-03-31 2007-06-27 Purdue Research Foundation TREATMENT PROCEDURE USING LIGAND IMMUNOGENIC CONJUGATES
DE10037759A1 (de) 2000-08-03 2002-07-04 Gruenenthal Gmbh Screeningverfahren
CN100404673C (zh) 2001-02-19 2008-07-23 默克专利有限公司 鉴定t细胞表位的方法及制备具有降低的免疫原性的分子的用途
AU2002258518A1 (en) 2001-03-14 2002-09-24 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid molecules and proteins for the identification, assessment, prevention, and therapy of ovarian cancer
CN1635910A (zh) 2001-05-02 2005-07-06 普渡研究基金会 巨噬细胞介导的疾病的治疗和诊断
US7314974B2 (en) 2002-02-21 2008-01-01 Monsanto Technology, Llc Expression of microbial proteins in plants for production of plants with improved properties
AU2003211337A1 (en) 2002-03-01 2003-09-16 Japan Envirochemicals, Ltd. Proteins capable of binding to female sex hormones and process for producing the same
WO2003089475A2 (en) 2002-04-22 2003-10-30 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Antibodies, recombinant antibodies, recombinant antibody fragments and fusions mediated plant disease resistance against fungi
WO2004043989A2 (en) 2002-11-07 2004-05-27 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to heparanase
EP1481993A1 (en) 2003-05-28 2004-12-01 Xerion Pharmaceuticals AG Modulation of the poliovirus receptor function
US20050255114A1 (en) 2003-04-07 2005-11-17 Nuvelo, Inc. Methods and diagnosis for the treatment of preeclampsia
US20050025763A1 (en) 2003-05-08 2005-02-03 Protein Design Laboratories, Inc. Therapeutic use of anti-CS1 antibodies
KR101351122B1 (ko) 2003-05-09 2014-01-14 듀크 유니버시티 Ｃｄ２０-특이적 항체 및 이를 이용한 방법
CN1816356A (zh) 2003-05-14 2006-08-09 免疫原公司 药物缀合物组合物
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
US7276497B2 (en) 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
MXPA05014153A (es) 2003-07-02 2006-07-03 Genentech Inc Composiciones y metodoso para el diagnostico y tratamiento de tumor.
WO2005054469A1 (en) 2003-12-05 2005-06-16 Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Minister Of Health Anti-sars monoclonal antibodies
US20050232919A1 (en) 2004-02-12 2005-10-20 Morphotek, Inc. Monoclonal antibodies that specifically block biological activity of a tumor antigen
EP2259063B1 (en) 2004-04-27 2012-05-23 Galapagos N.V. Compound screening assays for inducing differentiation of undifferentiated mammalian cells into osteoblasts
US7241598B2 (en) 2004-06-29 2007-07-10 The Chinese University Of Hong Kong Frame-shifting PCR for germline immunoglobulin genes retrieval and antibody engineering
EP2465872A3 (en) 2004-10-25 2012-12-19 Merck Sharp & Dohme Corporation Anti-ADDL antibodies and uses thereof
EP2562259B1 (en) 2004-12-21 2016-07-06 Monsanto Technology LLC Transgenic plants with enhanced agronomic traits
BRPI0518994A2 (pt) 2004-12-31 2008-12-02 Biogen Idec Inc anticorpos ou polipeptÍdeos que se ligam a br3, seus usos e formulaÇÕes lÍquidas
CN101146554B (zh) 2005-01-27 2012-10-10 加州大学评议会 中和肉毒杆菌神经毒素的治疗性单克隆抗体
PT2343320T (pt) 2005-03-25 2018-01-23 Gitr Inc Anticorpos anti-gitr e as suas utilizações
US7608413B1 (en) 2005-03-25 2009-10-27 Celera Corporation Kidney disease targets and uses thereof
RU2007139912A (ru) 2005-03-30 2009-05-10 Пердью Рисерч Фаундейшн (Us) Способ прогнозирования течения рака на основе количественного анализа клеточного рецептора витамина фолата
CA2607444C (en) 2005-04-22 2015-03-10 Morphotek, Inc. Antibodies with immune effector activity and that internalize in folate receptor alpha-positive cells
US7786266B2 (en) 2005-05-12 2010-08-31 Oncotherapy Science, Inc. Methods for damaging cells using effector function of anti-DSC2 antibody
JP4991705B2 (ja) 2005-05-20 2012-08-01 ロンザ・バイオロジクス・ピーエルシー 哺乳類宿主細胞における組換え抗体の高レベル発現
JP2009508467A (ja) 2005-05-24 2009-03-05 アベスタゲン リミテッド Ｂ細胞リンパ腫の治療のためのｃｄ２０に対するモノクローナル抗体を生成する方法
WO2007006041A2 (en) 2005-07-05 2007-01-11 Purdue Research Foundation Imaging and therapeutic method using monocytes
US7521195B1 (en) 2005-07-21 2009-04-21 Celera Corporation Lung disease targets and uses thereof
CA2619725C (en) 2005-08-18 2016-06-07 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Single chain antibodies against beta-amyloid peptide
JP5376948B2 (ja) 2005-09-13 2013-12-25 ナショナル リサーチ カウンシル オブ カナダ 腫瘍細胞活性を調節する方法及び組成物
AU2006304605A1 (en) 2005-10-17 2007-04-26 Institute For Systems Biology Tissue-and serum-derived glycoproteins and methods of their use
EP1790664A1 (en) 2005-11-24 2007-05-30 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer
RU2456298C2 (ru) 2005-12-20 2012-07-20 ЭсБиАй БАЙОТЕК КО., ЛТД. Антитело против ilt17
WO2007143561A1 (en) 2006-06-01 2007-12-13 Mayo Foundation For Medical Education And Research Immunity to folate receptors
AU2007262635B2 (en) 2006-06-23 2014-09-11 Adc Therapeutics Sa Polynucleotides and polypeptide sequences involved in cancer
US7910702B2 (en) 2006-07-28 2011-03-22 The Governors Of The University Of Alberta Recombinant antibodies to sclerotinia antigens
AU2007284651B2 (en) 2006-08-09 2014-03-20 Institute For Systems Biology Organ-specific proteins and methods of their use
EP1900752A1 (en) 2006-09-15 2008-03-19 DOMPE' pha.r.ma s.p.a. Human anti-folate receptor alpha antibodies and antibody fragments for the radioimmunotherapy of ovarian carcinoma
EP1900533A1 (de) 2006-09-16 2008-03-19 J. Zimmer Maschinenbau Gesellschaft m.b.H. Vorrichtung zum Auftragen von Substanz auf flächige Substrate
CN103396486A (zh) 2006-10-12 2013-11-20 中外制药株式会社 使用抗ereg抗体的癌症的诊断和治疗
EP2103628A4 (en) 2006-12-14 2012-02-22 Forerunner Pharma Res Co Ltd MONOCLONAL ANTIBODY ANTI-CLAUDIN 3, AND TREATMENT AND DIAGNOSIS OF CANCER USING SUCH ANTIBODY
BRPI0720565A2 (pt) 2006-12-20 2013-09-17 Mmr Information Systems Inc anticorpos e mÉtodos para a sua preparaÇço e seu uso
US20080227704A1 (en) 2006-12-21 2008-09-18 Kamens Joanne S CXCL13 binding proteins
US9216228B2 (en) 2007-02-16 2015-12-22 KTB Tumorforschungsgesellschaft MBM Receptor and antigen targeted prodrug
US20100104626A1 (en) 2007-02-16 2010-04-29 Endocyte, Inc. Methods and compositions for treating and diagnosing kidney disease
WO2008145136A1 (en) 2007-05-30 2008-12-04 Aarhus Universitet Stat3 inactivation by inhibition of the folate receptor pathway
EP3569251A1 (en) 2007-06-25 2019-11-20 Endocyte, Inc. Conjugates containing hydrophilic spacer linkers
AU2008282863A1 (en) 2007-07-31 2009-02-05 Merck Sharp & Dohme Corp. IGF-1R specific antibodies useful in the detection and diagnosis of cellular proliferative disorders
CN101139613B (zh) 2007-08-01 2011-06-08 姜荣锡 抗肿瘤二元多肽及其应用与制备方法
US20090087849A1 (en) 2007-09-06 2009-04-02 Tripath Imaging, Inc. Nucleic acid-based methods and compositions for the detection of ovarian cancer
US20100330572A1 (en) 2007-12-21 2010-12-30 Assaraf Yehuda G Organic compounds
WO2009087978A1 (ja) 2008-01-11 2009-07-16 The University Of Tokyo 抗cldn6抗体
WO2009132081A2 (en) 2008-04-24 2009-10-29 The Research Foundation Of State University Of New York Monoclonal antibody-based targeting of folate receptors
SG189817A1 (en) 2008-04-30 2013-05-31 Immunogen Inc Potent conjugates and hydrophilic linkers
DK2281006T3 (da) 2008-04-30 2017-11-06 Immunogen Inc Tværbindingsmidler og anvendelser deraf
US8383351B2 (en) 2008-06-11 2013-02-26 Oxford Brookes University Antibody to inhibin/ activin β-B subunit
NZ592255A (en) 2008-09-17 2013-07-26 Endocyte Inc Folate receptor binding conjugates of antifolates
US20100092470A1 (en) 2008-09-22 2010-04-15 Icb International, Inc. Antibodies, analogs and uses thereof
JP2012509058A (ja) 2008-11-20 2012-04-19 オンコセラピー・サイエンス株式会社 前立腺癌を診断または治療するための方法
CN101440130B (zh) 2008-11-21 2011-07-27 中国人民解放军第四军医大学 一种抗人IL-13Rα2单克隆抗体的重链和轻链的可变区
EP2995953B1 (en) 2009-03-24 2017-11-29 Biocept, Inc. Devices and methods of cell capture and analysis
DK2462161T3 (en) * 2009-08-06 2017-06-06 Immunas Pharma Inc Antibodies specifically binding to A-beta oligomers and their use
CN102844443B (zh) 2009-09-21 2014-08-06 保罗·沃尔菲什 用于甲状腺癌诊断和治疗的方法和组合物
WO2011100398A1 (en) 2010-02-10 2011-08-18 Immunogen, Inc. Cd20 antibodies and uses thereof
KR20190114019A (ko) 2010-02-24 2019-10-08 이뮤노젠 아이엔씨 엽산염 수용체 1 항체와 면역접합체 및 이들의 용도
KR101931936B1 (ko) 2010-11-05 2018-12-26 에이자이 아이엔씨. 엽산 수용체 알파-발현 암에 대한 진단 및 예후 마커로서의 엽산 수용체 알파
SG193997A1 (en) * 2011-03-29 2013-11-29 Immunogen Inc Process for manufacturing conjugates of improved homogeneity
TR201902180T4 (tr) * 2011-03-29 2019-03-21 Immunogen Inc Tek adimli bi̇r i̇şlem i̇le maytansi̇noi̇d anti̇kor konjugatlarinin hazirlanmasi
CN103619357A (zh) * 2011-03-29 2014-03-05 伊缪诺金公司 用于制造具有改善的同质性的缀合物的方法
KR102489185B1 (ko) 2011-04-01 2023-01-17 이뮤노젠 아이엔씨 Folr1 암 치료의 효능을 증가시키기 위한 방법
US20120282282A1 (en) 2011-04-04 2012-11-08 Immunogen, Inc. Methods for Decreasing Ocular Toxicity of Antibody Drug Conjugates
WO2012145112A2 (en) 2011-04-18 2012-10-26 Immunogen, Inc. Novel maytansinoid derivatives with sulfoxide linker
AU2012284321C1 (en) 2011-07-15 2017-07-13 Eisai R&D Management Co., Ltd. Anti-folate receptor alpha antibodies and uses thereof
SG11201500938XA (en) 2012-08-31 2015-04-29 Immunogen Inc Diagnostic assays and kits for detection of folate receptor 1
US20150306242A1 (en) 2012-10-04 2015-10-29 Immunogen, Inc. Process for preparing stable antibody maytansinoid conjugates
EP2997044A4 (en) 2013-05-14 2017-03-22 ImmunoGen, Inc. Anti-folr1 immunoconjugate dosing regimens
IL293871A (en) 2013-08-30 2022-08-01 Immunogen Inc Antibodies and assays for the detection of folate receptor 1
MX2016004411A (es) * 2013-10-08 2016-07-05 Immunogen Inc Regimenes de dosificacion de inmunoconjugado anti-receptor 1 de folato (folr1).
US20150297744A1 (en) * 2014-03-28 2015-10-22 Immunogen, Inc. Anti-FOLR1 Immunoconjugate Dosing Regimens
AU2015284050A1 (en) 2014-07-01 2017-02-02 Expression Pathology, Inc. SRM assays to chemotherapy targets
KR20240011258A (ko) 2014-09-02 2024-01-25 이뮤노젠 아이엔씨 항체 약물 컨쥬게이트 조성물의 제형화 방법
JP6880006B2 (ja) 2015-09-17 2021-06-02 イミュノジェン， インコーポレイテッド 抗ｆｏｌｒ１免疫複合体を含む治療組み合わせ
TWI781145B (zh) 2017-02-28 2022-10-21 美商伊繆諾金公司 具有自分解肽連接子之類美登素衍生物及其結合物
AU2018269173A1 (en) 2017-05-16 2019-11-28 Immunogen, Inc. Anti-FOLR1 immunoconjugates and anti-PD-1 antibody combinations

Also Published As

Publication number Publication date
AU2012236219A1 (en) 2013-10-10
KR102101160B1 (ko) 2020-04-16
AU2017202927A1 (en) 2017-05-25
IL262956A (en) 2018-12-31
UA113403C2 (xx) 2017-01-25
KR20230013283A (ko) 2023-01-26
AU2012236219B2 (en) 2017-02-23
KR101982317B1 (ko) 2019-05-27
HUE036172T2 (hu) 2018-06-28
JP2016147901A (ja) 2016-08-18
NO2893540T3 (uk) 2018-06-09
KR20210088746A (ko) 2021-07-14
US11135305B2 (en) 2021-10-05
MX2019010336A (es) 2019-10-14
AU2021206842A1 (en) 2021-08-12
US8709432B2 (en) 2014-04-29
IL281714B2 (en) 2023-11-01
IL303208A (en) 2023-07-01
US20120282175A1 (en) 2012-11-08
SG193514A1 (en) 2013-10-30
SI2694106T1 (en) 2018-04-30
ME03025B (me) 2018-10-20
JP2018118997A (ja) 2018-08-02
US20180200383A1 (en) 2018-07-19
JP2014513068A (ja) 2014-05-29
EP2694106B1 (en) 2017-12-13
EP4309671A3 (en) 2024-03-20
IL273614A (en) 2020-05-31
CN103747802B (zh) 2018-06-01
KR20190058696A (ko) 2019-05-29
EP2694106A4 (en) 2015-04-08
MY186591A (en) 2021-07-29
CA3182262A1 (en) 2012-10-04
IL281714A (en) 2021-05-31
HRP20180358T1 (hr) 2018-04-06
US20220143208A1 (en) 2022-05-12
PT2694106T (pt) 2018-03-05
IL281714B1 (en) 2023-07-01
CN114441757A (zh) 2022-05-06
CN103747802A (zh) 2014-04-23
EP3318273B1 (en) 2019-08-21
CN108743965A (zh) 2018-11-06
JP6018621B2 (ja) 2016-11-02
JP2019194257A (ja) 2019-11-07
SG10201602553VA (en) 2016-05-30
IL228538A0 (en) 2013-12-31
ES2965109T3 (es) 2024-04-11
KR20200039843A (ko) 2020-04-16
EA201391351A1 (ru) 2014-11-28
CA2831426C (en) 2023-02-21
EP3636279A1 (en) 2020-04-15
EP3318273A1 (en) 2018-05-09
NZ711375A (en) 2017-02-24
EA201791843A3 (ru) 2018-05-31
PL2694106T3 (pl) 2018-06-29
WO2012135675A3 (en) 2012-12-06
IL262956B (en) 2020-04-30
US20140363453A1 (en) 2014-12-11
JP2022062219A (ja) 2022-04-19
RS56916B1 (sr) 2018-05-31
JP2021006547A (ja) 2021-01-21
KR20240017965A (ko) 2024-02-08
LT2694106T (lt) 2018-04-25
MX2013011098A (es) 2013-12-16
TR201802659T4 (tr) 2018-03-21
KR102489185B1 (ko) 2023-01-17
MX340640B (es) 2016-07-19
AU2019202611B2 (en) 2021-05-06
EA201791843A2 (ru) 2017-12-29
WO2012135675A2 (en) 2012-10-04
EP4309671A2 (en) 2024-01-24
HK1254759A1 (zh) 2019-07-26
AU2019202611A1 (en) 2019-05-02
CY1119960T1 (el) 2018-12-12
EA028805B1 (ru) 2018-01-31
AU2017202927B2 (en) 2019-01-17
MX346555B (es) 2017-03-24
MY180894A (en) 2020-12-11
BR112013025415B1 (pt) 2021-03-16
DK2694106T3 (en) 2018-03-05
NZ615742A (en) 2015-09-25
ES2661466T3 (es) 2018-04-02
EP3636279B1 (en) 2023-09-13
IL228538B (en) 2018-12-31
EP2694106A2 (en) 2014-02-12
CA2831426A1 (en) 2012-10-04
BR112013025415A2 (pt) 2016-12-27
KR20140027969A (ko) 2014-03-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA125636C2 (uk) Способи ідентифікації раку, який може реагувати на анти-folr1 антитіло або анти-folr1 імунокон'югат
JP7279026B2 (ja) Ｎａｐｉ２ｂ標的化療法に対する応答を予測するための組成物および方法
WO2022192134A1 (en) Methods for increasing efficacy of immunoconjugates targeting adam9 for the treatment of cancer
EA041061B1 (ru) Способы идентификации рака как с вероятностью реагирующего на анти-folr1 иммуноконъюгат
EA045779B1 (ru) КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ОТВЕТА НА NaPi2b-ТАРГЕТИРОВАННУЮ ТЕРАПИЮ
NZ711375B2 (en) Methods for increasing efficacy of folr1 cancer therapy