CN101139613B - 抗肿瘤二元多肽及其应用与制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种抗肿瘤二元多肽的基因、重组质粒和多肽。将编码抗体模拟物的基因与重组炭疽杆菌蛋白抗原基因可操作地连接，从而获得表达重组抗肿瘤二元多肽的基因。将如上所述的编码抗体模拟物的基因经双链寡聚核苷酸点突变技术插入重组炭疽杆菌蛋白抗原基因即形成本发明的重组质粒。将获得的重组质粒转染入大肠杆菌BL-21工程菌中而获得可产生抗肿瘤二元多肽的工程菌细胞；大量增菌、离心沉淀菌体、超声破碎、高速离心沉淀破碎菌体、取上清进行处理即可得到抗肿瘤二元多肽。此种抗肿瘤二元多肽具有特异的靶向性，特异杀灭实体肿瘤的效率高于传统抗肿瘤药物，且不会攻击正常细胞，其毒性和不良反应远低于传统抗肿瘤药物。

Description

抗肿瘤二元多肽及其应用与制备方法

技术领域

本发明涉及一种抗肿瘤二元多肽的基因、重组质粒、多肽及其应用与制备方法，所述肿瘤为人非小细胞肺癌、小细胞肺癌或卵巢癌。

背景技术

非小细胞肺癌、小细胞肺癌或卵巢癌等恶性肿瘤是对人类健康的巨大威胁。全世界每年死于恶性肿瘤的患者约有七百万人，其中中国就占了六分之一。现有抗肿瘤药物在肿瘤治疗中占重要地位，虽然对一些肿瘤已取得一定的疗效，但仍存在着对肿瘤细胞选择性差，免疫抑制及不良反应多而严重，产生耐药性等缺陷。

近年来肿瘤基础和临床研究取得很大的进展，其中开发新型抗肿瘤药物最重要的努力方向之一就是发展靶向杀伤肿瘤细胞的药物。许多肿瘤细胞的表面都具有一些抗原，人们也找到了多种肿瘤细胞表面抗原的相关抗体，然而这些抗原的特异性并不是如人们想像的那样完美：在部分正常细胞上，往往也有类似的抗原分布。这就极大地限制了这些抗体的应用价值，致使杀伤肿瘤细胞的药物也会杀伤部分正常细胞。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种抗肿瘤二元多肽的基因、重组质粒和多肽，此种抗肿瘤二元多肽能特异的杀灭非小细胞肺癌、小细胞肺癌或卵巢癌等实体肿瘤及转移的肿瘤细胞，却不会伤害正常的细胞。本发明的再一个目的是提供上述重组抗肿瘤二元多肽的制备方法。

本发明的发明人构建了一种抗体的简化模拟物，它对抗原的亲和力只相当于原抗体的1/10至1/100，该削弱了的亲和力迫使构建的抗体模拟物只能识别带有大量相关抗原的细胞——肿瘤细胞，而对带有较小量的相关抗原的细胞，却因为其亲和力太弱而无法识别。编码抗体模拟物的基因为序列表中SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.18所述的核苷酸序列，上述编码抗体模拟物的核苷酸序列是分别以ATCC HB-8627杂交瘤细胞产生的抗人非小细胞肺癌细胞表面抗原抗体，或抗人卵巢癌folate结合蛋白抗体(NCBI CAA68252和CAA68252)的重链CDR1区，重链FR2连接段和轻链CDR3区的基因为蓝本构建而成。

具有高度生物危险性的炭疽杆菌毒素是一种二元毒素，其生物杀伤性极强。炭疽毒素由两种成分构成：1)蛋白抗原(protective antigen，PA)和2)坏死因子和水肿因子(lethal factor，LF；edema factor，EF)。动物实验表明，蛋白抗原与坏死因子联合使用，可迅速引起细胞坏死，但分别单独给予动物则不引起反应。

若将炭疽杆菌毒素用于杀伤肿瘤细胞，首先必须设法去除炭疽毒素对正常细胞的毒性。本发明中，使用了两种手段来去除炭疽杆菌外毒素对正常细胞的毒性：1)在蛋白抗原的羧基端连接上述抗体模拟物，2)将蛋白抗原中负责识别靶细胞上相关受体的氨基酸残基突变掉。具体技术方案如下：

将编码突变炭疽杆菌蛋白抗原的基因与野生型炭疽杆菌蛋白抗原基因(见序列表中的SEQ ID NO.1)可操作地连接，从而获得表达重组炭疽杆菌蛋白抗原基因的核苷酸序列。编码突变炭疽杆菌蛋白抗原的基因为序列表中SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4或SEQID NO.8所述的核苷酸序列。在本发明的优选实施例中，将上述突变炭疽杆菌蛋白抗原的基因SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4与野生型炭疽杆菌蛋白抗原基因SEQ ID NO.1连接形成如序列表中SEQ ID NO.6所述的核苷酸序列；将上述突变炭疽杆菌蛋白抗原的基因SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.4与野生型炭疽杆菌蛋白抗原基因SEQ ID NO.1连接形成如序列表中SEQ ID NO.10所述的核苷酸序列。

将编码抗体模拟物的基因分别与上述重组炭疽杆菌蛋白抗原基因可操作地连接，从而获得表达重组抗肿瘤二元多肽的核苷酸序列。在本发明的优选实施例中，将上述抗体模拟物的基因SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.18分别与重组炭疽杆菌蛋白抗原基因SEQ IDNO.6的羧基端基因连接，形成如序列表中SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.20所述的核苷酸序列。

本发明所述重组质粒，是将如上所述的突变炭疽杆菌蛋白抗原基因的核苷酸序列经双链寡聚核苷酸点突变技术插入野生型炭疽杆菌蛋白抗原(SEQ ID NO.1)的基因中形成重组炭疽杆菌蛋白抗原基因(SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.10)，再将如上所述的抗体模拟物的核苷酸序列经双链寡聚核苷酸点突变技术插入重组炭疽杆菌蛋白抗原的羧基端基因而形成。

本发明所述抗肿瘤二元多肽，由上述重组质粒表达而成。

本发明的又一方面，提供本发明所述抗肿瘤二元多肽的制备方法。将序列表中的SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.18所述的编码抗体模拟物的基因与装载了重组炭疽杆菌蛋白抗原基因的pET22b质粒可操作地连接获得编码重组抗肿瘤二元多肽的基因，将获得的基因导入到表达系统中进行表达，经His-tag柱(Ni Sepharose High Performance柱)分离纯化即获得本发明所述的抗肿瘤二元多肽。

本发明所述抗肿瘤二元多肽可在制备治疗或预防非小细胞肺癌、小细胞肺癌及卵巢癌的药中应用。可以通过将本发明中的多肽添加药学上可接受的载体或赋形剂或可选的其它成分而制成适于临床使用的药物组合物。其机理是：本发明所述的重组抗肿瘤二元多肽与相应靶肿瘤细胞膜受体结合后被裂解成PA₂₀和PA₆₃两个组分，然后七个PA₆₃单体在靶肿瘤细胞膜上组成一个七聚体跨膜孔道。加入的野生型炭疽杆菌坏死因子可识别该七聚体并与之结合，穿过七聚体跨膜孔道进入细胞，从而达到杀死肿瘤细胞的目的。

本发明所述的抗肿瘤二元多肽相较于传统抗肿瘤药物的优点在于，其具有特异的靶向性，因而在治疗过程中不会攻击正常细胞，所以其毒性和不良反应远低于传统抗肿瘤药物。再由于它是进入肿瘤细胞内杀伤肿瘤细胞，因此与传统抗肿瘤药物相较，肿瘤细胞对其产生耐药性的概率要低得多。再由于它可在体液和血液中游动，因此它将是对抗转移过程中肿瘤细胞的利器。需要特别说明的是，它是一种二元药物，其优点在于可先只给患者标记的第一元多肽(本发明的重组抗肿瘤二元多肽)，观察第一元多肽在体内肿瘤和体内器官的分布来评估治疗效果和预后，再考虑要否给予第二元多肽(炭疽杆菌的野生型坏死因子)来杀伤肿瘤。这样的二元药物，将给有效治疗和防止不良预后带来极大的操作余地，同时其安全性远远超过了现有的任何药物。

附图说明

图1是含有编码抗体模拟物的基因SEQ ID NO.12和重组炭疽杆菌蛋白抗原基因SEQ ID NO.6重组质粒pCHCPA1的结构示意图。

图2是含有抗人非小细胞肺癌表面抗原抗体模拟物和重组G342SN682SD683K炭疽杆菌蛋白抗原的重组抗肿瘤二元多肽1的结构示意图。Mimetic，抗人非小细胞肺癌表面抗原抗体模拟物，G342S和N682SD683K，炭疽杆菌蛋白抗原基因中被突变位点。

图3是含有编码抗体模拟物的基因SEQ ID NO.12和重组炭疽杆菌蛋白抗原基因SEQ ID NO.10重组质粒pCHCPA2的结构示意图。

图4是含有抗人非小细胞肺癌表面抗原抗体模拟物和重组G342KN682SD683K炭疽杆菌蛋白抗原的重组抗肿瘤二元多肽2的结构示意图。Mimetic，抗人非小细胞肺癌表面抗原抗体模拟物，G342K和N682SD683K，炭疽杆菌蛋白抗原基因中被突变位点。

图5是含有编码抗体模拟物的基因SEQ ID NO.18和重组炭疽杆菌蛋白抗原基因SEQ ID NO.6重组质粒pCHCPA3的结构示意图。

图6是含有抗人卵巢癌folate结合蛋白抗体模拟物和重组G342SN682SD683K炭疽杆菌蛋白抗原的重组抗肿瘤二元多肽3的结构示意图。Mimetic，人卵巢癌folate结合蛋白抗体模拟物，G342S和N682SD683K，炭疽杆菌蛋白抗原基因中被突变位点。

图7是野生型炭疽杆菌蛋白抗原及含有抗体模拟物的重组炭疽杆菌蛋白抗原对小鼠的毒性作用比较。图7a是小鼠经野生型炭疽杆菌蛋白抗原及含有抗体模拟物的重组炭疽杆菌蛋白/坏死因子处理后的生存曲线，横坐标为生存天数，纵坐标为小鼠生存数量。图7a中的曲线1为腹腔注射野生型炭疽杆菌蛋白抗原/野生型坏死因子组，曲线2为腹腔注射含肺癌抗体模拟物的野生型炭疽杆菌蛋白抗原/野生型坏死因子组，曲线3为腹腔注射含肺癌抗体模拟物的突变N682SD683K炭疽杆菌蛋白抗原/野生型坏死因子组，曲线4为腹腔注射重组抗肿瘤二元多肽1/野生型坏死因子组，曲线5为腹腔注射重组抗肿瘤二元多肽2/野生型坏死因子组。图7b、图7c、图7d、图7e分别为小鼠经野生型炭疽杆菌蛋白抗原/野生型坏死因子处理后的肺、肝、肾、肠的组织切片。图7f、图7g、图7h、图7i分别为小鼠经抗肿瘤二元多肽2/野生型坏死因子处理后的肺、肝、肾、肠的组织切片。

图8为本发明所述抗肿瘤二元多肽1对体外培养非小细胞肺癌细胞的杀伤效应图。图中各组分别为a)对照组，b)野生型炭疽杆菌蛋白抗原/野生型坏死因子组，c)抗肿瘤二元多肽1组/野生型坏死因子组。各实验组的药物用量均为5μg/ml培养液。

图9为本发明所述抗肿瘤二元多肽1和野生型炭疽杆菌蛋白抗原经FITC标记后，分别腹腔注射入荷人非小细胞肺癌的裸鼠，3小时后处死小鼠，取所荷肿瘤、肝、肾、肠、肺、肌肉等，沿矢状切面剖开后观察其在肿瘤和重要脏器内的集聚情况。a注射FITC标记野生型炭疽杆菌蛋白抗原，b注射FITC标记抗肿瘤二元多肽1。

图10为本发明所述抗肿瘤二元多肽对免疫缺陷裸鼠体内由非小细胞肺癌细胞长出的实体肿瘤的杀伤效应图。图中各组分别为a)对照组，b)野生型炭疽杆菌蛋白抗原/野生型坏死因子组、c)抗肿瘤二元多肽2组/野生型坏死因子组和d)抗肿瘤二元多肽1组/野生型坏死因子组。e)对照组，f)专利号ZL01128836.1所述多肽对种植于BALB/C裸鼠体内的人非小细胞肺癌腹腔注射14天后的杀伤效应图。

图11是各组生长肿瘤鼠药物处理20日后取非小细胞肺癌肿瘤标本的光镜观察图。图中各组分别为a对照组，200x；b抗肿瘤二元多肽1组，200x；c对照组，400x；d抗肿瘤二元多肽1组，400x。

图12是本发明所述抗肿瘤二元多肽1对免疫缺陷裸鼠体内由小细胞肺癌细胞长出的实体肿瘤的杀伤效应图。图中各组分别为a)对照组，b)抗肿瘤二元多肽1组/野生型坏死因子组。

图13是本发明所述抗肿瘤二元多肽3抑制正常大鼠腹腔内接种的大鼠恶性卵巢癌生长效应图。图中各组分别为a对照组；b抗肿瘤二元多肽3组；c-f)抗肿瘤二元多肽3处理21天后的大鼠肺、肝、肾、肠切片。生长于大鼠小肠表面的恶性卵巢癌结节，g)4x，h)200x。

具体实施方式

实施例1表达抗肿瘤二元多肽的质粒的构建和重组抗肿瘤多肽的制备

原始质粒为装载了野生型炭疽杆菌蛋白抗原基因SEQ ID NO.1的pET22b质粒(质粒大小7.6kb，Harvard Univ.Dr.J.Collier提供)，经双链寡聚核苷酸点突变技术(QuickChange^TMKit，Strategene公司)在氨基端插入六个组氨酸的基因-CACCACCACCACCACCAC-后，分别将编码突变炭疽杆菌蛋白抗原的基因SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.8与野生型炭疽杆菌蛋白抗原基因可操作地连接，从而获得表达重组炭疽杆菌蛋白抗原基因的核苷酸序列SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.10。再分别将编码抗体模拟物的基因SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.18插入到重组炭疽杆菌蛋白抗原基因的羧基端G734位点后，就制备出了抗肿瘤二元多肽的三种重组质粒pCHCPA1、pCHCPA2、pCHCPA3(见图1、图3、图5)。分别将上述三种重组质粒转染入E.coli BL-21(DE3)工程菌里制备多肽，获得序列表中SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.21所述的抗肿瘤二元多肽。其中，SEQ ID NO.15所述的抗肿瘤二元多肽由重组质粒pCHCPA1表达(在继后的实施例中称为“重组抗肿瘤二元多肽1”)，SEQ IDNO.17所述的抗肿瘤二元多肽由重组质粒pCHCPA2表达(在继后的实施例中称为“重组抗肿瘤二元多肽2”)，SEQ ID NO.21所述的抗肿瘤二元多肽由重组质粒pCHCPA3表达(在继后的实施例中称为“重组抗肿瘤二元多肽3”)。

突变程序按Strategene QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit(catalog#200518)药箱手册进行：

1、准备点突变反应物

5ul10x buffer

2ul(10ng)野生型炭疽杆菌蛋白抗原质粒

1.25ul(125ng)设计的5’-3’寡聚核苷酸引物

1.25ul(125ng)设计的3’-5’寡聚核苷酸引物

1ul dNTP

双蒸水50ul

1ul pfu

(除质粒，引物和双蒸水外，均为药箱所备试剂)

2、进行PCR扩增，扩增条件：变性95℃，35秒，退火53℃，70秒，延伸68℃，17分共20个循环；

3、加入Dpn1内切酶1ul消化母体DNA链后(37℃，1小时)，取1ul反应物与XL1-Blue感受态细胞50ul冰孵30分钟，行热冲击42℃，45秒，再置入冰中2分钟；

4、加入NZY培基0.5ml后220rpm，37℃摇菌1小时后，取50-100ul反应物铺板(LB培基加1％琼脂加50—100ug/ml氨苄青霉素，37℃过夜)；

5、18小时后挑菌，循Qiagene，Gibco等公司的各种商用提取质粒药箱提取质粒均可，测序确定突变成功；

6、将质粒50ng与制备的BL-21(DE3)工程菌感受态细胞50ul冰孵5分，42℃，30秒热冲击，取50-100ul反应物加入LB培基0.5ml，220rpm，37℃摇菌1小时后铺板(LB培基加1％琼脂加50ug/ml氨苄青霉素)37℃孵育，18小时后挑取菌落；

7、大量增菌，8-16升LB培基，220rpm，37℃，3小时，加入1M IPTG1ml/升LB培基后，将温度降为28℃，220rpm生长5小时，离心沉淀菌体，4℃，4000g，15分钟，取4℃，20％蔗糖，20mM Tris，1mM EDTA，1mM PMSF300ml悬浮菌体，冰孵8min，4℃，8000g，20分钟离心后，倒去上清，加入4℃，5mM MgSO₄，1mM PMSF200ml悬浮沉淀，冰孵10min，4℃，10000g，10分钟离心后，取上清装入分子量10,000的透析袋于4℃，20mMTris，0.15M NaCl，5mM咪唑缓冲液5升透析过夜后(换液两次)，将上清上样于His-tag柱(4℃)，经1M咪唑，20mM Tris，0.15M NaCl缓冲液洗脱，再用20mM Tris，0.15M NaCl，1mM EDTA缓冲液5升透析去掉咪唑后即可得到重组抗肿瘤二元多肽(见图2、图4、图6)。

突变上述质粒中N682S和D683K所设计的寡聚核苷酸序列：

1、5’-3’

gat ttt aaa aaa tat TCTAAA aaa tta ccg tta

2、3’-5’

tta cgg taa ttt TTT AGA ata ttt ttt aaa atc

突变上述质粒中G342S所设计的寡聚核苷酸序列：

1、5’-3’

ttt aaa aaa ta aat TCT aaa tta ccg tta tat

2、3’-5’

ata taa cgg taa ttt AGA att ata ttt ttt aaa

突变上述质粒中G342K所设计的寡聚核苷酸序列：

1、5’-3’

ttt aaa aaa ta aat AAA aaa tta ccg tta tat

2、3’-5’

ata taa cgg taa ttt TTT att ata ttt ttt aaa

制备上述质粒中抗非小细胞肺癌表面抗原抗体模拟物基因所设计的寡聚核苷酸序列：

1、5’-3’

aaa aaa ggc tat gag ata gga GAT TAC TAT TTA CAT TGG GTA AAA CAG AGAtaa tga

ctc gag cac cac cac

2、3’-5’

gtg gtg gtg ctc gag tca tta TCT CTG TTT TAC CCA ATG TAA ATA GTA ATC tcc tat ctc

ata gcc ttt ttt

3、5’-3’

tta cat tgg gta aaa cag aga ACA GAA CAG GGT TTA GAG TGG ATC GGT taa tga ctc

gag cac cac cac

4、3’-5’

gtg gtg gtg ctc gag tca tta ACC GAT CCA CTC GAA ACC CTG TTC TGT tct ctg ttt tac

cca atg taa

5、5’-3’

cag ggt tta gag tgg atc ggt CAG CATATT CGC GAA TTA ACA AGA TCT taa tga ctc

gag cac cac cac

6、3’-5’

gtg gtg gtg ctc gag tca tta AGA TCT TGT TAA TTC GCG AAT ATG CTG acc gat cca

ctc gaa acc ctg

制备上述质粒中抗人卵巢癌表面抗原抗体模拟物基因所设计的寡聚核苷酸序列：

1、5’-3’

aaa aaa ggc tat gag ata gga GGG TAT TTT ATG AAC TGG GTT AAA CAG taa tga ctc

gag cac cac cac

2、3’-5’

gtg gtg gtg ctc gag tca tta CTG TTT AAC CCA GTT CAT AAA ATA CCC tcc tat ctc ata

gcc ttt ttt

3、5’-3’

ttt atg aac tgg gtt aaa cag TCT CAT GGA AAA TCA CTG GAA TGG ATC GGT taa tga

ctc gag cac cac cac

4、3’-5’

gtggtg gtg ctc gag tca tta ACC GAT CCA TTC CAG TGA TTT TCC ATG AGA ctg ttt

aac cca gtt cat aaa

5、5’-3’

aaa tca ctg gaa tgg atc ggt CAG CAA TCC AGA GAA TAT CCG TAC ACC taa tga ctc

gag cac cac cac

6、3’-5’

gtg gtg gtg ctc gag tca tta GGT GTA CGG ATA TTC TCT GGA TTG CTG acc gat cca

ttc cag tga ttt

实施例2：本发明所述抗肿瘤二元多肽与野生型炭疽杆菌蛋白抗原对小鼠的毒性作用比较

受试鼠为左腋下接种了人非小细胞肺癌细胞(ATCC CCL-185)的BALB/c免疫缺陷裸鼠，分为5个试验组，每个试验组均为5只。

试验组1：腹腔注射野生型炭疽杆菌蛋白抗原/野生型坏死因子组，注射量为2μg/2μg/日。

试验组2：腹腔注射含肺癌抗体模拟物的野生型炭疽杆菌蛋白抗原/野生型坏死因子组，注射量为2μg/2μg/日。

试验组3：腹腔注射含肺癌抗体模拟物的突变N682SD683K炭疽杆菌蛋白抗原/野生型坏死因子组，注射量为2μg/2μg/日。

试验组4：腹腔注射实施例1制备的抗肿瘤二元多肽1/野生型坏死因子，注射量为20μg/20μg/日。

试验组5：腹腔注射实施例1制备的抗肿瘤二元多肽2/野生型坏死因子，注射量为20μg/20μg/日。

各试验组小鼠的生存状况见图7a，从图7a可以看出，试验组1中的野生型炭疽杆菌蛋白抗原和试验组2中的含肺癌抗体模拟物的野生型炭疽杆菌蛋白抗原毒性作用最大，小剂量使用即可在2—4日内造成小鼠全部死亡(见图7a中的曲线1和曲线2)。试验组3中的肺癌抗体模拟物的突变N682SD683K炭疽杆菌蛋白抗原的毒性作用有所减弱，小剂量使用后仍可有10—20％的动物存活(见图7a中的曲线3)。试验组4中的抗肿瘤二元多肽1的毒性作用进一步减弱，大剂量使用后仅造成约10％的动物死亡(见图7a中的曲线4)。试验组5中的抗肿瘤二元多肽2的毒性作用几乎消失，大剂量使用后全部小鼠均可存活(见图7a中的曲线5)。

观察试验组1和试验组5的小鼠的肺、肝、肾和肠切片(HE染色，常规光镜100x)从图7b-i可以看出，野生型炭疽杆菌蛋白抗原/野生型坏死因子处理造成肺出血性损伤，肝、肾和肠组织变性，坏死；而抗肿瘤二元多肽2/野生型坏死因子处理几乎未在上述重要脏器造成损害。

实施例3：本发明所述抗肿瘤二元多肽与野生型炭疽杆菌蛋白抗原对人非小细胞肺癌细胞体外杀伤作用比较

人非小细胞肺癌细胞：为美国ATCC标准细胞株CCL-185。

细胞培养：取出0.1ml复苏培养的CCL-185细胞悬浮液，缓缓加入含3ml1640液体培养基(加10％血清)的培养皿中(稀释比例为1:30)，混合均匀，放入37℃CO₂培养箱中培养。受试细胞共分3组，第一组为空白组，即加入重组抗肿瘤多肽空白保存液(10mMPB+0.2M NaCI磷酸盐缓冲液(pH8.0))。第二组为加入10μg/ml的野生型炭疽杆菌蛋白抗原及10μg/ml的炭疽杆菌野生型坏死因子。第三组为加入10μg/ml的抗肿瘤二元多肽1及10μg/ml的炭疽杆菌野生型坏死因子。

细胞在培养24小时后，分别加入上述各组处理物于培养皿中，在加入处理物后的第24小时分别加入50uMol FITC20ul及50uMol Rodamin-12320ul两种荧光染料。10分钟后在荧光显微镜下观察。受试细胞株的空白组肺癌细胞均生长良好，胞体(染为绿色)，胞核(染为淡绿色)及线粒体(染为红色)结构清晰，无细胞肿胀。但重组抗肿瘤二元多肽组中绝大部分肺癌细胞出现线粒体及胞核结构消失，明显肿胀和坏死。野生型炭疽杆菌蛋白抗原组也有部分肺癌细胞死亡。从细胞死亡数量来比较，重组抗肿瘤二元多肽1对抗肺癌细胞显然比野生型炭疽杆菌蛋白抗原有效得多，结果见图8。

实施例4：FITC标记野生型炭疽杆菌蛋白抗原和重组抗肿瘤多肽在荷瘤裸鼠体内分布的观察

BALB/C裸体小鼠由中国科学院上海生命科学院动物中心提供，按裸鼠饲养要求，水、垫草和饲料均经高温或紫外线灭菌。在相对无菌条件下饲养一周，无异常后进行接种实验。

收集指数生长期的人非小细胞肺癌细胞(ATCC标准细胞株CCL-185)悬液于50毫升离心管中，离心弃上清后，用1640液体培养基(加小牛血清)重悬细胞，使之达到1×10⁸/ml个细胞左右。在裸鼠右腋处皮下注射人非小细胞肺癌细胞悬液0.3-0.4ml。

肿瘤生长4周后，将荷瘤裸鼠随机分为a)FITC标记野生型炭疽杆菌蛋白抗原组，b)FITC标记重组抗肿瘤多肽1组。在荷瘤裸鼠腹腔内分别注射50μgFITC标记野生型炭疽杆菌蛋白抗原或重组抗肿瘤多肽1，3小时后处死小鼠，取所荷肿瘤、肝、肾、肠、肺、肌肉，将沿矢状切面剖开的肿瘤和脏器置于活体荧光观察系统(LT-99D2IllumatoolDual Light System，excitation470nm，emission515nm，Lighttools Research，USA)下观察其在肿瘤和重要脏器内的集聚情况。请见图9a)，野生型炭疽杆菌蛋白抗原几乎无选择地集聚在肝(Lv)、肾(K)、肠(In)、肺(L)、肌肉(M)和肿瘤(Ca)内；图9b)重组抗肿瘤多肽1主要集聚在肿瘤内，与野生型炭疽杆菌蛋白抗原的集聚状况相比较，重组抗肿瘤多肽1在肝、肾、肠、肺和肌肉内几乎无集聚。该结果说明重组抗肿瘤多肽1已丧失了母本—野生型炭疽杆菌蛋白抗原固有的靶向性，而表现出了被抗体模拟物赋予的新靶向性—针对肿瘤的靶向性。

实施例5：本发明所述抗肿瘤二元多肽对人非小细胞肺癌细胞种植到裸鼠体内生长出的实体肿瘤的杀伤作用

BALB/C裸体小鼠由中国科学院上海生命科学院动物中心提供，按裸鼠饲养要求，水、垫草和饲料均经高温或紫外线灭菌。在相对无菌条件下饲养一周，无异常后进行接种实验。

收集指数生长期的人非小细胞肺癌细胞(ATCC标准细胞株CCL-185)悬液于50毫升离心管中，离心弃上清后，用1640液体培养基(加小牛血清)重悬细胞，使之达到1×10⁸/ml个细胞左右。在裸鼠右腋处皮下注射人非小细胞肺癌细胞悬液0.3-0.4ml。

注射细胞后1—2日，将荷瘤裸鼠随机分为(A组)重组抗肿瘤二元多肽空白保存液(10mM PBS+0.2M NaCI磷酸盐缓冲液(pH8))为对照组，(B组)突变N682SD683KG342K炭疽杆菌蛋白抗原/野生型坏死因子组，(C组)重组抗肿瘤二元多肽2/野生型坏死因子组，(D组)重组抗肿瘤二元多肽1/野生型坏死因子组，每组5只荷瘤裸鼠。每天观察裸鼠活动情况并作记录。该实验重复三次。鼠处死后采集肿瘤及脏器标本制作病理组织切片。

给药方式为腹腔注射，每天注射2次，每次10μg/10μg，连续给药14天，总量280/280μg。如附图10所示，对照组5只肿瘤总重2200mg，突变炭疽杆菌蛋白抗原组5只肿瘤总重1894mg，为对照组的86％；重组抗肿瘤二元多肽1组5只肿瘤总重450mg，为对照组的20.4％；重组抗肿瘤二元多肽2组5只肿瘤总重576mg，为对照组的26.1％。显然，重组抗肿瘤二元多肽1的抑制肿瘤生长的作用最强，其5只鼠瘤块总重仅为对照组5只鼠瘤块总重的20.4％；重组抗肿瘤二元多肽2的抑制肿瘤生长的作用次之，其5只鼠瘤块总重为对照组5只鼠瘤块总重的26.1％；突变N682SD683KG342K炭疽杆菌蛋白抗原对鼠肿瘤生长几乎无作用，其5只鼠瘤块总重为对照组5只鼠瘤块总重的86％。

在上述相同实验条件下，用专利号ZL01128836.1公开的人工组合的抗菌工程多肽对种植于BALB/C裸鼠体内的人非小细胞肺癌处理14天，每日用量为1050μg，14天后，5只肿瘤总重884mg(见图10f)，为对照组(见图10e，5只肿瘤总重1611mg)的54.8％。本发明所述抗肿瘤二元多肽1、抗肿瘤二元多肽2每日用量为20μg，仅为专利号ZL01128836.1公开的人工组合的抗菌工程多肽用量的1/52，但抑制肿瘤生长的效率却比专利号ZL01128836.1公开的人工组合的抗菌工程多肽高出2.6倍。因此，本发明所述抗肿瘤二元多肽的抗实体肿瘤效力比专利号ZL01128836.1公开的人工组合的抗菌工程多肽的抗实体肿瘤效力至少强100倍以上。

实施例6：体内实体肿瘤消除试验的病理观察

瘤体病理组织学观察：实施例5实验到期后处死动物，取出瘤体于10％福尔马林中固定，石蜡切片，HE染色常规光镜200x和400x观察。

镜下观对照组鼠和突变N682SD683KG342K炭疽杆菌蛋白抗原组的实体肿瘤增殖旺盛；抗肿瘤二元多肽1组鼠的实体肿瘤细胞团中几乎均为坏死的肿瘤细胞。病理组织学结果提示抗肿瘤二元多肽杀灭了实体肿瘤中的大部分肿瘤细胞，结果请见图11。

实施例7：本发明所述抗肿瘤二元多肽对人小细胞肺癌细胞种植到裸鼠体内生长出的实体肿瘤的杀伤作用

BALB/C裸体小鼠由中国科学院上海生命科学院动物中心提供，按裸鼠饲养要求，水、垫草和饲料均经高温或紫外线灭菌。在相对无菌条件下饲养一周，无异常后进行接种实验。

收集指数生长期的人小细胞肺癌细胞(ATCC标准细胞株NCI-H449)悬液于50毫升离心管中，离心弃上清后，用1640液体培养基(加小牛血清)重悬细胞，使之达到1×10⁸/ml个细胞左右。在裸鼠右腋处皮下注射人非小细胞肺癌细胞悬液0.3ml。

注射细胞后1—2日，将荷瘤裸鼠随机分为(A组)重组抗肿瘤二元多肽空白保存液(10mM PBS+0.2M NaCI磷酸盐缓冲液(pH8))为对照组，(B组)重组抗肿瘤二元多肽1/野生型坏死因子组，每组5只荷瘤裸鼠。每天观察裸鼠活动情况并作记录。该实验重复三次。鼠处死后采集肿瘤及脏器标本制作病理组织切片。

给药方式为腹腔注射，每天注射2次，每次10ug/10ug，连续给药14天，总量280/280ug。如图12所示，对照组5只肿瘤总重1059mg，重组抗肿瘤二元多肽1组5只肿瘤总重189mg，为对照组的17.85％。

实施例8：本发明所述抗肿瘤二元多肽对大鼠恶性卵巢癌细胞种植到大鼠体内生长出的实体肿瘤的杀伤作用

F344大鼠由中国科学院上海生命科学院动物中心提供，鼠饲养一周观察无异常后进行接种实验。

收集指数生长期的大鼠恶性卵巢癌细胞Nutu-19悬液于50毫升离心管中，离心弃上清后，用1640液体培养基(加小牛血清)重悬细胞，使之达到1.0×10^7-8/ml个细胞。在大鼠腹腔注射大鼠恶性卵巢癌细胞悬液1ml。

注射细胞后1—2日，将荷瘤大鼠随机分为(A组)为对照组，腹腔注射重组抗肿瘤二元多肽空白保存液(10mM PBS+0.2MNaCI磷酸盐缓冲液(pH8))；(B组)重组抗肿瘤二元多肽3(质粒为pCHCPA3)/野生型坏死因子组，腹腔注射重组抗肿瘤二元多肽/野生型坏死因子200μg/400μg/日，每组11只荷瘤大鼠。每天观察大鼠活动情况并作记录。

给药方式为腹腔注射，每天注射2次，每次100ug/200ug，连续给药21天，总量4.2mg/8.44mg。各组鼠麻醉后处死，计数肠道生长的肿瘤结节以比较重组抗肿瘤多肽对肿瘤生长的抑制作用，采集肿瘤及脏器标本制作病理组织切片，HE染色常规光镜200x观察。

结果显示：重组抗肿瘤二元多肽3组鼠肿瘤生长明显受到抑制，11只鼠肠道生长的肿瘤结节总数52个；对照组11只鼠肠道生长的肿瘤结节总数213个；重组抗肿瘤二元多肽3组的肿瘤结节总数为对照组鼠肿瘤结节总数的24.4％。在连续给药21天后，重组抗肿瘤二元多肽3组鼠的肺、肝、肾和肠等易受炭疽毒素损伤的脏器组织切片未见任何炭疽毒素病损征象。特别要强调的是：该实施例采用的实验体系是具有正常免疫功能的大鼠，接种的是同种系动物的恶性肿瘤。该实施例证明本发明的重组抗肿瘤二元多肽在具有正常免疫功能的动物体内连续使用了21天之后，既未诱发动物的超敏反应，其抗肿瘤效应也未被动物的正常免疫功能中和掉。该实施例的学术意义与实用价值比采用免疫缺陷小鼠接种人恶性肿瘤的实施例要高若干个数量级；应属于更接近于临床实际情况的抗肿瘤结果。结果请见图13。

SEQUENCE LISTING

<110>丘小庆

<120>抗肿瘤二元多肽及其应用与制备方法

<160>21

<170>PatentIn Version3.2

<210>1

<211>2211

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<220>

<221>misc_feature

<222>(1).....(2211)

<223>野生型炭疽杆菌蛋白抗原基因

<400>1

<210>2

<211>3

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1).....(3)

<223>编码突变炭疽杆菌蛋白抗原基因G342S序列

<400>2

tct3

<210>3

<211>1

<212>PRT

<213>人工序列

<223>编码突变炭疽杆菌蛋白抗原G342S氨基酸序列

<400>3

<210>4

<211>6

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1).....(6)

<223>编码突变炭疽杆菌蛋白抗原基因N682S-D683K序列

<400>4

<210>5

<211>2

<212>PRT

<213>人工序列

<223>编码突变炭疽杆菌蛋白抗原N682S-D683K氨基酸序列

<400>5

<210>6

<211>2211

<212>DNA

<213>人工序列

<222>(1).....(2211)

<223>编码重组炭疽杆菌蛋白抗原G342S和N682S-D683K基因

<400>6

<210>7

<211>734

<212>PRT

<213>人工序列

<223>编码重组炭疽杆菌蛋白抗原G342S和N682S-D683K氨基酸序列

<400>7

<210>8

<211>3

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1).....(3)

<223>编码突变炭疽杆菌蛋白抗原基因G342K序列

<400>8

<210>9

<211>1

<212>PRT

<213>人工序列

<223>编码突变炭疽杆菌蛋白抗原G342K氨基酸序列

<400>9

<210>10

<211>2211

<212>DNA

<213>人工序列

<222>(1).....(2211)

<223>编码重组炭疽杆菌蛋白抗原G342K和N682S-D683K基因

<400>10

<210>11

<211>734

<212>PRT

<213>人工序列

<223>编码重组炭疽杆菌蛋白抗原G342K和N682S-D683K氨基酸序列

<400>11

<210>12

<211>84

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1).....(84)

<223>编码抗人非小细胞肺癌表面抗原抗体模拟物序列

<400>12

<210>13

<211>28

<212>PRT

<213>人工序列

<223>编码抗人非小细胞肺癌表面抗原抗体模拟物氨基酸序列

<400>13

<210>14

<211>2295

<212>DNA

<213>人工序列

<222>(1).....(2295)

<223>编码抗肿瘤二元多肽1基因

<400>14

<210>15

<211>762

<212>PRT

<213>人工序列

<223>编码抗肿瘤二元多肽1氨基酸序列

<400>15

<210>16

<211>2295

<212>DNA

<213>人工序列

<222>(1).....(2295)

<223>编码抗肿瘤二元多肽2基因

<400>16

<210>17

<211>762

<212>PRT

<213>人工序列

<223>编码抗肿瘤二元多肽2氨基酸序列

<400>17

<210>18

<211>84

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1).....(84)

<223>编码抗人卵巢癌folate结合蛋白抗体模拟物序列

<400>18

<210>19

<211>28

<212>PRT

<213>人工序列

<223>编码抗人卵巢癌folate结合蛋白抗体模拟物氨基酸序列

<400>19

<210>20

<211>2295

<212>DNA

<213>人工序列

<222>(1).....(2295)

<223>编码抗肿瘤二元多肽3基因

<400>20

<210>21

<211>762

<212>PRT

<213>人工序列

<223>编码抗肿瘤二元多肽3氨基酸序列

<400>21

Claims (12)

1.编码抗肿瘤二元多肽的基因，其特征在于：该基因由核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的编码重组炭疽杆菌蛋白抗原的基因与核苷酸序列如SEQ ID NO.12或SEQ IDNO.18所示的编码抗体模拟物的基因连接而成，或者该基因由核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示的编码重组炭疽杆菌蛋白抗原的基因与核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的编码抗体模拟物的基因连接而成。

2.根据权利要求1所述的编码抗肿瘤二元多肽的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.14所示。

3.根据权利要求1所述的编码抗肿瘤二元多肽的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.16所示。

4.根据权利要求1所述的编码抗肿瘤二元多肽的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.20所示。

5.抗肿瘤二元多肽的重组质粒，其特征在于它含有权利要求1至4之一所述的基因。

6.抗肿瘤二元多肽，其特征在于它由权利要求5所述的重组质粒表达而成。

7.根据权利要求6所述的抗肿瘤二元多肽，其特征在于它具有序列表中SEQ IDNO.15所述的氨基酸序列。

8.根据权利要求6所述的抗肿瘤二元多肽，其特征在于它具有序列表中SEQ IDNO.17所述的氨基酸序列。

9.根据权利要求6所述的抗肿瘤二元多肽，其特征在于它具有序列表中SEQ IDNO.21所述的氨基酸序列。

10.权利要求7所述抗肿瘤二元多肽在制备治疗非小细胞肺癌、小细胞肺癌的药中的应用。

11.权利要求8所述抗肿瘤二元多肽在制备治疗非小细胞肺癌的药中的应用。

12.权利要求9所述抗肿瘤二元多肽在制备治疗卵巢癌的药中的应用。 

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