CN109593693B - 一株大肠杆菌Nissle 1917抗肿瘤靶向工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

一株大肠杆菌Nissle 1917抗肿瘤靶向工程菌及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

一株大肠杆菌Nissle 1917抗肿瘤靶向工程菌及其构建方法与应用，该大肠杆菌Nissle 1917抗肿瘤靶向工程菌株于2018年6月26日在中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2018403；其分类命名为大肠杆菌EcN（Tum 5‑p53），拉丁文学名Escherichia coli Nissle（Tum 5‑p53）。本发明构建的大肠杆菌EcN（Tum 5‑p53），含有抗肿瘤低氧表达载体pET28a‑Pvhb‑SUMO‑Tum 5‑MMP‑p53，能高效表达双功能蛋白Tum 5‑p53，能将抗血管生成因子Tum‑5和肿瘤抑制蛋白p53传递至实体瘤，发挥良好的抗肿瘤疗效。该株抗肿瘤靶向工程菌对荷人肝癌SMMC‑7721裸鼠的肿瘤抑制率高达69.47%。

Description

一株大肠杆菌Nissle 1917抗肿瘤靶向工程菌及其构建方法 与应用
技术领域
本发明涉及一株抗肿瘤靶向工程菌，具体涉及一株大肠杆菌Nissle 1917抗 肿瘤靶向工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
癌症严重威胁人类生命健康。传统的癌症治疗方法，如手术治疗、放疗和化 疗，通常不能完全消除肿瘤厌氧微环境中的肿瘤细胞。利用靶向传递载体将抗癌 基因或抗肿瘤药物递送到肿瘤低氧区域进行癌症治疗，是近年来迅速发展的一种 最具有临床应用前景的癌症治疗方法。
E.coli Nissle 1917(EcN)最初由军人外科医生AlfredNissle从一名士兵的 粪便中分离出来，该士兵在严重的志贺氏菌病爆发期间没有出现腹泻。近年来， 肠道益生菌EcN已被制备成药物用来治疗腹泻和溃疡性结肠炎疾病 (BiochemistryBiokhimiia.2010；75(4):481-485)。Zhang等利用EcN用作基 因治疗的传递载体，将EcN静脉注射荷瘤小鼠，解剖小鼠获得肺、肝、脾、肾、 心脏和肿瘤组织后研磨涂平板，发现EcN能特异性地靶向肿瘤区域(Applied and Environmental Microbiology.2012；78(21):7603-7610)。Jochen等以静脉注 射、腹腔注射和瘤内注射三种不同的注射方式，将EcN注射荷瘤小鼠以研究其 靶向性，研究结果显示，无论以哪种注射方式，EcN都能在肿瘤区域定殖和生长，而在其它内脏器官中未发现细菌的存在(International Journal ofMedicalMicrobiology Ijmm.2007；297(3):151-162)。鉴于EcN高度的肿瘤靶向特性， 及其在脾脏和肝脏组织能及时被机体有效清除，所以选择EcN作为靶向传递抗 肿瘤蛋白的载体，传送抗肿瘤活性蛋白至肿瘤区，在未来癌症治疗中将是一个有 前景的肿瘤治疗途径。
CN 107574138A公开了一株大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株及其构建方法与 应用，其所述大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株，即Escherichia coliNissle 1917 (Tum-5)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2017345。 该抗肿瘤靶向工程菌含有抗肿瘤分泌表达载体pET28a-Pvhb-SUMO-Tum 5，能可 溶性表达和分泌性表达肿瘤抑素Tumstatin的抗肿瘤血管生成活性区域Tum-5； 该株抗肿瘤靶向工程菌对荷B16黑色素瘤C57BL/6小鼠的肿瘤抑制率为52.95％。
目前，大肠杆菌EcN虽然对实体瘤具有高度靶向性，能在肿瘤低氧区域特 异性定殖，可作为传输载体传送抗肿瘤活性蛋白至肿瘤区域；但真核抗肿瘤蛋白 在原核细菌中表达时存在困难：蛋白可溶性表达情况欠佳、容易形成包涵体蛋白、 难以获得具有正常空间结构的活性蛋白；另外，由于肿瘤细胞发展的抗药性可能 使药物再次使用时治疗效果差；单一基因治疗肿瘤时也存在疗效持续性差等缺陷。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一株肿 瘤靶向性较高、经济性较好和安全性高的大肠杆菌Nissle 1917抗肿瘤靶向工程 菌。
本发明进一步要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一 种大肠杆菌Nissle 1917抗肿瘤靶向工程菌的构建方法。
本发明解决其技术问题采用的技术方案如下：一株大肠杆菌Nissle 1917抗肿瘤靶向工程菌于2018年6月26日在中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏号为CCTCC NO：M2018403。该大肠杆菌Nissle 1917抗肿瘤靶向工程菌株分类命名为大肠杆菌EcN（Tum 5-p53）；拉丁文学名Escherichia coli EcN（Tum 5-p53）。
进一步，所述EcN(Tum 5-p53)含有抗肿瘤低氧表达载体 pET28a-Pvhb-SUMO-Tum5-MMP-p53，高效表达双功能蛋白Tum 5-p53同时能 特异性地靶向肿瘤低氧区域，将抗血管生成因子Tum-5和肿瘤抑制蛋白p53传 递至实体瘤。
本发明进一步解决其技术问题所采用的技术方案是：一种大肠杆菌Nissle 1917抗肿瘤靶向工程菌的构建方法，包括以下步骤：
(一)利用重叠PCR构建Tum 5-p53融合表达载体；
(二)Tum 5-p53融合蛋白的诱导表达、纯化及鉴定；
(三)Tum 5-p53融合蛋白的体外抗肿瘤活性检测；
(四)EcN(Tum 5-p53)的构建；
(五)EcN(Tum 5-p53)在荷瘤裸鼠体内的定殖情况分析；
(六)EcN(Tum 5-p53)的抗肿瘤分析；
(七)EcN(Tum 5-p53)的安全性检测。
进一步，步骤(一)中，所述Tum 5-p53融合表达载体是以基质金属蛋白酶 (MMP)酶切位点(PLGLWA)为融合基因连接臂，利用PCR扩增出带连接臂 的Tum-5片段和带连接臂的p53片段，再利用重叠PCR获得Tum 5-MMP-p53 片段。
进一步，步骤(四)中，所述EcN(Tum 5-p53)的构建是将低氧启动子Pvhb、 SUMO促溶标签、抗血管生成因子Tum-5和抗癌蛋白p53四段基因序列，以基 质金属蛋白酶(MMP)酶切位点(PLGLWA)为融合基因连接臂，通过重叠PCR 技术获得包含四段基因序列的PCR产物，再利用酶切连接的方法将包含四段基 因序列的PCR产物连接到载体pET-28a，通过电击转化Escherichia coli Nissle 1917，即得到大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株Escherichiacoli Nissle 1917(Tum 5-p53)。
本发明还包括大肠杆菌Nissle 1917抗肿瘤靶向工程菌在制备用于治疗肝癌 和宫颈癌的靶向抗肿瘤药物中的应用。
进一步，所述肝癌和宫颈癌肿瘤细胞系为肝癌SMMC-7721细胞和人宫颈癌 HeLa细胞。
本发明是采用联合基因治疗手段，构建能诱导细胞凋亡和抑制肿瘤区域血管 生成的双功能蛋白，同时，该蛋白在肿瘤靶向菌中能够高效表达。利用重叠PCR 拼接获得了四个Tum 5和p53融合表达的载体，转入大肠杆菌BL21(DE3)进 行诱导表达。蛋白可溶性分析结果表明，当Tum-5蛋白位于融合蛋白的N端， 且在SUMO标签存在的情况下，以部分可溶的形式存在。
将本发明的大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌EcN(Tum 5-p53)发酵后菌体蛋白 和溶解蛋白进行SDS-PAGE检测和Westernblot检测，结果表明，Tum 5-p53双 功能蛋白已成功在EcN中实现高效表达；将野生型EcN注射于荷人肝癌 SMMC-7721裸鼠后，活体成像系统观察到EcN能特异性地在实体瘤区域定殖， 其它器官中的细菌能及时被动物机体清除；免疫组化结果表明，Tum 5-p53蛋白 成功在实体瘤中表达；用本发明方法构建的大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌EcN (Tum 5-p53)治疗荷人肝癌裸鼠，结果表明，该抗肿瘤靶向工程菌能显著地抑 制肿瘤的生长，对BALB/c荷瘤裸鼠的肿瘤抑制率高达69.47％，且对正常小鼠 基本无毒性作用。
概而言之，本发明具有以下有益效果：(1)抗肿瘤效果：大肠杆菌抗肿瘤靶 向工程菌EcN(Tum 5-p53)对人肝癌SMMC-7721肿瘤有明显的抗肿瘤作用， 实验证明EcN(Tum 5-p53)对肿瘤体积和重量的抑制率分别达到69.47％和62.5％； (2)没有任何毒副作用：荷瘤小鼠注射大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌EcN(Tum 5-p53)后，与其它处理组相比，小鼠的体重、肝脾重量和组织形态学都没有任 何明显的变化；(3)对环境的安全性：大肠杆菌Nissle1917为肠道益生菌，已 用于治疗腹泻及其他胃肠道疾病，对环境是安全的。
微生物保藏情况说明
本发明之大肠杆菌Nissle 1917抗肿瘤靶向工程菌于2018年6月26日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址：中国武汉 武汉大学保藏），菌种保藏号为 CCTCCNO：M 2018403；该大肠杆菌Nissle 1917抗肿瘤靶向工程菌株分类命名为大肠杆菌EcN（Tum5-p53）；拉丁文学名Escherichia coli EcN（Tum 5-p53）。
附图说明
图1是Tum 5和p53融合表达载体的构建示意图；
图2是p53-MMP-Tum 5片段扩增产物的电泳分析图；
图3是pET28a-p18-p53-MMP-Tum 5和pET22b-p18-p53-MMP-Tum 5质粒的 酶切分析结果图；
图4是Tum 5-MMP-p53片段扩增产物的电泳分析图；
图5是pSmartI-p18-p53-MMP-Tum 5和pSmatI-Tum 5-MMP-p18-p53质粒的 酶切分析结果图；
图6是SDS-PAGE检测融合蛋白的可溶性表达结果图；
图7是Western Blot检测融合蛋白结果图；
图8是重组Tum 5-p53蛋白对人肝癌SMMC-7721细胞和人宫颈癌HeLa细 胞形态影响的显微镜放大图；
图9是重组Tum 5-p53蛋白对人肝癌SMMC-7721细胞和人宫颈癌HeLa细 胞的抑制作用的统计图；
图10是低氧表达载体pET28a-Pvhb-SUMO-Tum 5-MMP-p53的构建流程图；
图11是PCR扩增Pvhb和Tum 5-MMP-p53片段电泳分析图；
图12是PCR扩增Pvhb-SUMO-Tum 5-MMP-p53片段电泳分析图；
图13是大肠杆菌GB2005中pET-28a-Pvhb-SUMO-Tum 5-MMP-p53的酶切 鉴定图；
图14是SDS-PAGE检测Tum 5-p53蛋白在本发明工程菌中的表达结果图；
图15是Western blot检测Tum 5-p53蛋白在工程菌中的表达结果图；
图16是小动物活体成像系统观察大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌EcN(Tum 5-p53)在人肝癌荷瘤裸鼠中的定位情况图；
图17是小动物活体成像系统观察大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌EcN(Tum 5-p53)在人肝癌荷瘤裸鼠脏器中的定位情况图；
图18是大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌EcN(Tum 5-p53)抑制人肝癌 SMMC-7721肿瘤的生长统计图；
图19是大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌EcN(Tum 5-p53)对荷人肝癌 SMMC-7721裸鼠肿瘤重量的影响统计图；
图20是免疫组化检测重组Tum 5-p53蛋白在肿瘤区域的表达结果图；
图21是H&E染色观察不同处理的小鼠肿瘤组织显微镜放大图；
图22是免疫荧光检测Caspase-3在肿瘤区域的表达结果图；
图23是免疫荧光检测Ki-67在肿瘤区域的表达结果图；
图24是大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌EcN(Tum 5-p53)对荷人肝癌BALA/c 裸鼠体重和肝肾脾的重量影响统计图(A：小鼠体重；B：肝肾脾进行称重；C： 肝、肾、脾、肺、心脏经4％多聚甲醛固定用于H&E染色)。
具体实施方式
以下结合附图及实施例对本发明作进一步详细说明。
本发明之大肠杆菌Nissle 1917抗肿瘤靶向工程菌株，即Escherichia coliNissle 1917(Tum 5-p53)，缩写为EcN(Tum 5-p53)，保藏于中国典型培养物 保藏中心，菌种保藏号为CTCC NO：M 2018403。
所述大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株(Escherichia coli Nissle 1917(Tum 5-p53) 的构建方法实施例包括以下步骤：
(一)利用PCR拼接获得Tum-5基因
本实施例所用菌株和质粒如表1所示，所用引物如表2所示。
表1本实施例所用菌株和质粒
Figure BDA0001756258550000051
Figure BDA0001756258550000061
表2本实施例所用引物
Figure BDA0001756258550000062
将p53和Tum-5以不同的排列顺序，利用不同的质粒构建四个诱导表达载 体(如图1所示)。以pET28a-p18-p53质粒DNA为模板，p53-F-Hind III和 p53-PLGLWA-R为引物扩增带连接臂的p53片段；以pET28-Tum 5质粒DNA为 模板，PLGLWA-Tum 5-F和Tum 5-R-Xho I为引物扩增带连接臂的Tum-5片段； 回收带连接臂的p53和Tum-5片段，以此为模板，p53-F-HindⅢ和Tum 5-R-Xho I为引物，利用重叠PCR扩增p53-MMP-Tum 5片段(如图2所示)。将回收后的 p53-MMP-Tum 5产物与pET28a-p18、pET22b-p18经过HindⅢ+Xho I双酶切后， 用T4DNALigase 16℃连接过夜，热转E.coli GB2005。挑取转化子提取质粒， 用HindⅢ+Xho I进行酶切鉴定以获取阳性转化子，构建 pET28a-p18-p53-MMP-Tum 5和pET22b-p18-p53-MMP-Tum 5质粒(如图3所示)。
以p53-MMP-Tum 5为模板，BamH I-p18-F和Tum 5-R-Xho I为引物，PCR 扩增p53-MMP-Tum 5片段。将回收后的p53-MMP-Tum 5产物与质粒pSmartI经 过BamH I+Xho I双酶切后，用T4DNAligase 16℃连接过夜，热转E.coli GB2005。 挑取转化子提取质粒，用BamH I+Xho I进行酶切鉴定以获取阳性转化子，构建 pSmartI-p18-p53-MMP-Tum 5质粒(如图5所示)。
以pSmartI-Tum 5质粒DNA为模板，Tum 5-F-BamH I和Tum 5-PLGLWA-R 为引物扩增带连接臂的Tum-5片段；以pET28-p18-p53质粒DNA为模板， PLGLWA-p18-p53和p53-R-XhoI为引物扩增带连接臂的p53片段；回收带连接 臂的Tum 5和p53片段，以此为模板，Tum 5-F-BamH I和p53-R-Xho I为引物， 利用重叠PCR扩增Tum 5-MMP-p53片段(如图4所示)。将回收后的Tum 5-MMP-p53产物与pSmartI经过BamH I+Xho I双酶切后，用T4DNALigase 16℃连接过夜，热转E.coli GB2005。挑取转化子提取质粒，用HindⅢ+Xho I进行酶 切鉴定以获取阳性转化子，构建pSmatI-Tum 5-MMP-p18-p53质粒(如图5所示)。
(二)融合蛋白的诱导表达和纯化
1、融合蛋白的可溶性分析
将测序正确的重组质粒分别电转入E.coli BL21(DE3)，获得四株诱导表 达菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-p18-p53-MMP-Tum 5、BL21(DE3)/pET 22b-p18-p53-MMP-Tum5、BL21(DE3)/pSmartI-p18-p53-MMP-Tum 5、BL21 (DE3)/pSmatI-Tum 5-MMP-p18-p53，菌株过夜活化后，IPTG诱导目的蛋白的 表达，超声破碎后收集菌液上清和沉淀，进行SDS-PAGE检测，以确定融合蛋 白在不同载体上的可溶性表达情况(如图6所示)。
2、融合蛋白的纯化和鉴定
将IPTG诱导表达后的菌体加入适量的Ni-Native-0后超声破碎离心收集上清 液，用0.22μm滤膜过滤上清液后进行Ni-NTA柱纯化。利用Western blot检测 Tum 5-p53蛋白的脱盐产物(如图7所示)，并用Bradford法测定蛋白，-80℃保 存。
(三)Tum 5-p53融合蛋白的体外抗肿瘤活性检测
培养人肝癌SMMC-7721和人宫颈癌HeLa细胞，待其铺满培养皿底70-80％ 时，加入500μL胰酶37℃消化后，每皿细胞加入1mL细胞培养基终止消化， 将细胞吹散至单细胞悬液，收集细胞后1000rpm离心5min，弃上清，用培养基 将细胞重悬后计数，将细胞浓度调整成8000细胞/100μL，接种到96孔板，5％ CO2，37℃培养10h左右至细胞完全贴壁，分别向各孔加入不同浓度梯度的重 组蛋白，每个浓度3～5个重复。37℃继续培养细胞，待培养至48～72h，倒置 显微镜观察细胞形态的变化(如图8所示)。每孔加入10μL CCK-8溶液避免在孔中生成气泡，将96孔板置于细胞培养箱2～4h后，用酶标仪测定各孔在450nm 处的吸光度，计算Tum 5-p53蛋白对人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein EndothelialCells，HUVEC)的抑制率(如图9所示)；
(四)低氧表达载体pET28a-Pvhb-Tum 5-p53的构建
以pET28a-Pvhb-asp为模板，VHB-F-Apa I和VHB-R-SUMO为引物扩增Pvhb 片段(如图11所示)；以pSmartI-Tum 5-MMP-p18-p53质粒DNA为模板，SUMO-F 和p53-R-Xho I为引物扩增SUMO-Tum 5-MMP-p18-p53片段(如图11所示)； 回收Pvhb和SUMO-Tum 5-MMP-p18-p53片段，以SUMO-Tum 5-MMP-p18-p53 片段为模板，VHB-F-Apa I和p53-R-Xho I为引物，采用重叠PCR扩增得到 SUMO-Tum 5-MMP-p18-p53片段(如图12所示)。将此片段经酶切后连接至pET28a载体上，挑取转化子经HindⅢ+Xho I酶切鉴定(如图13所示)，并送至 上海生工测序(质粒构建流程如图10所示)。
(五)表达Tum 5-p53的抗肿瘤靶向工程菌的构建
将质粒pET28a-Pvhb-SUMO-Tum 5-MMP-p18-p53电转入Escherichia coli Nissle1917(缩写为EcN)，挑取转化子，提质粒酶切鉴定，获得阳性转化子 Escherichia coliNissle 1917(Tum 5-p53)，缩写为EcN(Tum 5-p53)。
(六)融合蛋白在EcN中的表达情况分析
将EcN(Tum 5-p53)转接到LB液体培养基，按2％v/v接种量转接到新鲜 的LB液体培养基，培养10h后，8000rpm离心10min，得到此工程菌菌体， 取1ml菌体用双蒸水洗涤后进行SDS-PAGE分析(如图14所示)。以EcN和 EcN(pET-28a)为对照，离心收集的菌体用双蒸水洗涤3次后，重悬在PBS缓 冲溶液(pH＝7.4)中，超声破碎菌体后离心获得菌体上清溶解蛋白。通过Western blot检测Tum 5-p53蛋白在EcN中的可溶性表达情况(如图15所示)。
(七)人肝癌SMMC-7721细胞荷瘤裸鼠模型的建立
本实施例中的动物实验严格遵守国际实验动物福利伦理标准，并在湖南师范 大学动物伦理委员会监督下执行。BALB/c裸鼠饲养于SPF环境的动物房约7天 使其适应新环境。培养SMMC-7721细胞，待其铺满培养皿底70～80％后用0.25％ 胰酶消化，每个培养皿加入2mL细胞完全培养基终止消化，反复吹打将细胞打 散至单细胞悬液后，1000rpm离心5min收集细胞，弃上清，用PBS缓冲溶液 将细胞重复洗涤3次以除去胎牛血清和培养基，用不含胎牛血清的细胞培养基将 细胞重悬后计数，将细胞浓度调整成1×108个/mL，置于冰上待用。1×107/100μL SMMC-7721细胞被注射于小鼠右前肢的背部靠腋窝位置，构建人肝癌荷瘤裸鼠 模型。
(八)EcN在荷瘤裸鼠体内的定殖情况分析
建模15天后，当小鼠肿瘤长至合适大小后，将5×106CFU/100μL的EcN (Lux)尾静脉注射荷瘤裸鼠和正常裸鼠，通过小动物活体成像系统检测EcN (Lux)在裸鼠体内的分布情况(如图16所示)。细菌注射裸鼠后72h处死动物， 解剖获得正常裸鼠和荷瘤裸鼠的肿瘤、肝、肾、脾、肺、心脏、肠、皮肤，检测 细菌在各脏器的分布情况(如图17所示)。
(九)工程菌的抗肿瘤活性分析
建模15天后，当小鼠肿瘤长至合适大小后，将荷瘤裸鼠随机分为5组，每 组5～6只。将EcN、EcN(Tum-5)、EcN(p53)、EcN(Tum 5-p53)过夜活化 后，按2％v/v接种量转接至LB液体培养基，37℃培养5h后收集菌体，用无 菌PBS洗涤菌体三次后将菌液浓度稀释至5×106CFU/100μL。PBS组、EcN组、 EcN(Tum-5)组、EcN(p53)组、EcN(Tum 5-p53)组的小鼠分别通过尾静脉 注射100μL的无菌PBS、5×106CFU/100μL EcN、5×106CFU/100μL EcN (Tum-5)、5×106CFU/100μL EcN(p53)、5×106CFU/100μL EcN(Tum 5-p53)， 每7天一次，共注射3次。在整个实验过程中，每三天对各组小鼠进行称重(小 鼠体重如图24A)，并用千分游标卡尺测量并记录小鼠肿瘤最长径和垂直最大直 径(如图18所示)，根据公式计算出肿瘤体积和肿瘤抑制率。
实验结束后处死老鼠，解剖分离小鼠的肿瘤、肝、肾、脾、肺、心脏，对各 组小鼠的肿瘤(肿瘤重量如图19所示)和肝肾脾进行称重(如图24B所示)。 各组小鼠的肿瘤经4％多聚甲醛固定用于H&E染色(如图21所示)、免疫组化 (如图20所示)和免疫荧光(如图22和图23所示)；肝、肾、脾、肺、心脏经 4％多聚甲醛固定用于H&E染色(如图24C所示)。
表3荷人肝癌SMMC-7721裸鼠肿瘤体积和肿瘤重量的比较
Figure BDA0001756258550000101
注：表中“*”表示与EcN存在显著性差异。
本实施例大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌EcN(Tum 5-p53)与现有的抗肿瘤药 物相比具有以下优点：
(1)抗肿瘤效果：大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌EcN(Tum 5-p53)对人肝癌 SMMC-7721肿瘤有明显的抗肿瘤作用。试验表明，对肿瘤体积和重量的抑制率 分别达到69.47％和62.5％；
(2)没有任何毒副作用：荷瘤小鼠注射大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌EcN(Tum 5-p53)后，与其它处理组相比，小鼠的体重、肝脾重量和组织形态学都没有任 何明显的变化；
(3)对环境的安全性：大肠杆菌Nissle 1917为肠道益生菌，已用于治疗腹泻及 其他胃肠道疾病，对环境是安全的。
Figure BDA0001756258550000111
Figure BDA0001756258550000121
序列表
<110> 湖南师范大学
<120> 一株大肠杆菌Nissle 1917抗肿瘤靶向工程菌株及其构建方法与应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 1518
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttttcttttc tttttgtaca aggaaatcaa cgagcccacg gacaagacct tggaactctt 60
ggcagctgcc tgcagcgatt taccacaatg ccattcttat tctgcaatgt caatgatgta 120
tgtaattttg catctcgaaa tgattattca tactggctgt caacaccagc tctgatgcca 180
atgaacatgg ctcccattac tggcagagcc cttgagcctt atataagcag atgcactgtt 240
tgtgaaggtc ctgcgatcgc cccattagga ttatgggcac tgagcaccgc cgccgacatg 300
cagggcgtgg tcaccgacgg catggcttcc ggcaagctta tggaggagcc gcagtcagat 360
cctagcgtcg agccccctct gagtcaggaa acattttcag acctatggaa actacttcct 420
gaaaacaacg ttctgtcccc cttgccgtcc caagcaatgg atgatttgat gctgtccccg 480
gacgatattg aacaatggtt cactgaagac ccaggtccag atgaagctcc cagaatgcca 540
gaggctgctc cccccgtggc ccctgcacca gcagctccta caccggcggc ccctgcacca 600
gccccctcct ggcccctgtc atcttctgtc ccttcccaga aaacctacca gggcagctac 660
ggtttccgtc tgggcttctt gcattctggg acagccaagt ctgtgacttg cacgtactcc 720
cctgccctca acaagatgtt ttgccaactg gccaagacct gccctgtgca gctgtgggtt 780
gattccacac ccccgcccgg cacccgcgtc cgcgccatgg ccatctacaa gcagtcacag 840
cacatgacgg aggttgtgag gcgctgcccc caccatgagc gctgctcaga tagcgatggt 900
ctggcccctc ctcagcatct tatccgagtg gaaggaaatt tgcgtgtgga gtatttggat 960
gacagaaaca cttttcgaca tagtgtggtg gtgccctatg agccgcctga ggttggctct 1020
gactgtacca ccatccacta caactacatg tgtaacagtt cctgcatggg cggcatgaac 1080
cggaggccca tcctcaccat catcacactg gaagactcca gtggtaatct actgggacgg 1140
aacagctttg aggtgcgtgt ttgtgcctgt cctgggagag accggcgcac agaggaagag 1200
aatctccgca agaaagggga gcctcaccac gagctgcccc cagggagcac taagcgagca 1260
ctgcccaaca acaccagctc ctctccccag ccaaagaaga aaccactgga tggagaatat 1320
ttcacccttc agatccgtgg gcgtgagcgc ttcgagatgt tccgagagct gaatgaggcc 1380
ttggaactca aggatgccca ggctgggaag gagccagggg ggagcagggc tcactccagc 1440
cacctgaagt ccaaaaaggg tcagtctacc tcccgccata aaaaactcat gttcaagaca 1500
gaagggcctg actcagac 1518
<210> 2
<211> 142
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tagcttacag gacgctgggg ttaaaagtat ttgagttttg atgtggatta agttttaaga 60
ggcaataaag attataataa gtgctgctac accatactga tgtatggcaa aaccataata 120
atgaacttaa agaggaagat at 142
<210> 3
<211> 492
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgacagatg taacgattaa aacgctggcc gcagagcgac agacctccgt ggaacgcctg 60
gtacagcaat ttgctgatgc aggtatccgg aagtctgctg acgactctgt gtctgcacaa 120
gagaaacaga ctttgattga ccacctgaat cagaaaaatt caggcccgga caaattgacg 180
ctgcaacgta aaacacgcag cacccttaac attcctggta ccggtggaaa aagcaaatcg 240
gtacaaatcg aagtccgcaa gaaacgcacc tttgtgaaac gcgatccgca agaggctgaa 300
cgccttgcag cggaagagca agcgcagcgt gaagcggaag agcaagcccg tcgtgaggca 360
gaagaatcgg ctaaacgcga ggcgcaacaa aaagctgaac gtgaggccgc agaacaagct 420
aagcgtgaag ctgctgaaca agcgaaacgt gaagctgcgg aaaaagacaa agtggaaaac 480
ctgtattttc ag 492

Claims (2)

1.一株大肠杆菌Nissle 1917抗肿瘤靶向工程菌，其特征在于，所述工程菌为Escherichia coli EcN（Tum 5-p53），其保藏编号为 CCTCC NO：M 2018403。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌Nissle 1917抗肿瘤靶向工程菌在制备用于治疗肝癌和宫颈癌的靶向抗肿瘤药物中的应用。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021005059A1 (en) * 2019-07-08 2021-01-14 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Modified escherichia coli strain nissle and treatment of gastrointestinal disorder
CN111088204A (zh) * 2019-12-26 2020-05-01 南昌大学 表达Caspase-3重组scFv78的重组大肠杆菌及其功能验证方法
CN111139209B (zh) * 2019-12-26 2022-11-08 南昌大学 表达HER2单链抗体的重组大肠杆菌Nissle 1917及其功能验证方法
CN111040981A (zh) * 2019-12-26 2020-04-21 南昌大学 表达重组IL-2的重组大肠杆菌Nissle 1917及其功能验证方法
CN112481181A (zh) * 2020-12-04 2021-03-12 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 具有肿瘤抑制效应的产sting激动剂的工程益生菌

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102168058A (zh) * 2010-11-30 2011-08-31 湖南师范大学 一种抗肿瘤靶向工程菌和菌剂及其制备方法
CN103497926A (zh) * 2013-10-21 2014-01-08 深圳大学 表达分泌人类p53蛋白的重组BCG活菌菌株、活菌疫苗及其构建方法和应用
CA3011283A1 (en) * 2016-01-11 2017-07-20 Synlogic Operating Company, Inc. Microorganisms programmed to produce immune modulators and anti-cancer therapeutics in tumor cells
CN107574138A (zh) * 2017-07-28 2018-01-12 湖南师范大学 一株大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株及其构建方法与应用
CN108060135A (zh) * 2017-12-26 2018-05-22 东莞赛尔生物科技有限公司 一种高效表达p53抑癌蛋白的t细胞、制备方法及应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102168058A (zh) * 2010-11-30 2011-08-31 湖南师范大学 一种抗肿瘤靶向工程菌和菌剂及其制备方法
CN103497926A (zh) * 2013-10-21 2014-01-08 深圳大学 表达分泌人类p53蛋白的重组BCG活菌菌株、活菌疫苗及其构建方法和应用
CA3011283A1 (en) * 2016-01-11 2017-07-20 Synlogic Operating Company, Inc. Microorganisms programmed to produce immune modulators and anti-cancer therapeutics in tumor cells
CN107574138A (zh) * 2017-07-28 2018-01-12 湖南师范大学 一株大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株及其构建方法与应用
CN108060135A (zh) * 2017-12-26 2018-05-22 东莞赛尔生物科技有限公司 一种高效表达p53抑癌蛋白的t细胞、制备方法及应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Escherichia coli Nissle 1917 engineered to express Tum-5 can restrain murine melanoma growth;Lian He et al;《Oncotarget》;20170824;第8卷(第49期);第85772-85780页 摘要，结果，讨论，材料与方法部分 *
以MMP酶切位点为连接臂构建Vasostatin和TRAIL的融合蛋白及其生物学活性分析;郭爱云 等;《中国生物化学与分子生物学报》;20081020;第24卷(第10期);第925-929页 摘要，第1-3节 *
利用转座子构建靶向侵袭性抗肿瘤工程菌;白利明 等;《中国科学：生命科学》;20151231;第45卷(第2期);第200-209页 *

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