CN111040981A - 表达重组IL-2的重组大肠杆菌Nissle 1917及其功能验证方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种表达重组IL‑2的重组大肠杆菌Nissle 1917及其功能验证方法。该技术方案首先将重组IL‑2的编码基因通过酶切酶连的方法与pet28c载体连接，再利用所得的重组质粒转化至大肠杆菌Nissle 1917中，从而得到重组大肠杆菌Nissle 1917。本发明中采用的重组IL‑2去除了天然IL‑2的α亚基，因而避免了毒副作用；在此基础上，利用大肠杆菌Nissle 1917在肿瘤内聚集的特性，使其位点特异性地实现重组IL‑2蛋白的表达，从而更准确地杀伤肿瘤细胞，降低对机体正常细胞的损伤。在此基础上，本发明提供了考察该重组菌抗肿瘤功效的一种实验方法，将活化后的菌株采用尾静脉注射的方式处理黑色素瘤动物模型，再考察其肿瘤体积的变化。

Description

表达重组IL-2的重组大肠杆菌Nissle 1917及其功能验证 方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，进一步涉及生物制药及肿瘤医学技术，具体涉及一种表达重组IL-2的重组大肠杆菌Nissle 1917及其功能验证方法。

背景技术

目前针对肿瘤的治疗有化学、物理和生物方法等，但上述疗法始终未能达到治疗肿瘤的理想效果，因此探索更安全、更有效地新型肿瘤治疗方法迫在眉睫。自WilliamColey首次利用细菌治疗肿瘤以来，细菌靶向治疗肿瘤己成为近年国际研究的热点，多种细菌被发现可特异性的侵入机体肿瘤组织并大量繁殖，利用活菌治疗肿瘤的设想就随之产生。

靶向治疗是指抗肿瘤药物能针对性地与肿瘤的特异性位点结合，从而对肿瘤细胞起到杀伤效果，而对健康组织基本无影响，是目前较为理想的治疗模式，也代表着肿瘤治疗的未来趋势。其主要分为单克隆抗体药和抗体药物偶联物(Antibody Drug Conjugates，ADC)。ADC药物是一类新颖的治疗药物，正日益受到全球制药公司的关注。ADC药物由单克隆抗体和强效毒性药物(toxic drug)通过生物活性连接器(linker)偶联而成，是一种定点靶向癌细胞的强效抗癌药物。由于其对靶点的准确识别性及非癌细胞不受影响性，极大地提高了药效并减少了毒副作用。

白细胞介素-2(IL-2)又被称为T细胞生长因子(TCGF)，1976年Morgan等用丝裂原刺激T淋巴细胞首次发现了这种细胞因子。天然人白细胞介素-2主要是由T淋巴细胞产生的，后来的研究发现树突状细胞、B淋巴细胞等都分泌有IL-2。IL-2是分子量为15.5kd的蛋白质分子，由133个氨基酸残基组成，并包括有20个氨基酸所组成的信号肽，可在分泌时被切除。研究发现IL-2有多重生物学功能，例如促进T细胞生长、增殖及分化；调节NK细胞并保持它的自然杀伤力；诱导细胞毒性T细胞的增殖和产生；促进B淋巴细胞的增殖作用；与其他细胞因子的协同作用等。IL-2的多重免疫学功能使其在多领域被广泛研究，特别是随着调节性T细胞的发现，更加速了IL-2在免疫调节中作用的研究。研究表明CD4+CD25+Treg细胞可与效应T细胞竞争性结合IL-2，导致效应细胞停止增殖而抑制免疫应答。IL-2和Treg细胞一同维持机体的免疫平衡，调控CD8+T细胞的免疫应答效应。

白细胞介素2受体(interleukin-2receptor，IL-2R)是一个异源三聚体蛋白，表达于一些免疫细胞如淋巴细胞的表面。IL-2R由三个亚基α(CD25)，β(CD122)和γ(CD132)以非共价的形式组成。γ和β亚基参与IL-2的结合，激活T细胞，产生IL-2的治疗效果，α亚基(CD25)介导了IL-2的毒作用，同时促进IL-2与γ和β亚基的结合。

现有技术研究表明，IL-2具有确切的抗肿瘤活性。IL-2的抗肿瘤机制为：IL-2作为一种细胞因子，不仅能激活NK细胞和细胞毒性T细胞(CTL)，而且能诱导其他免疫细胞产生IFN、TNF、CSF等协同增强NK细胞活性。研究表明，IL-2及血凝素激活的CTL在体外能有效破坏肿瘤细胞，NK细胞可直接杀伤血液循环的肿瘤细胞及肿瘤组织。此外，IL-2能诱导产生特异性杀伤肿瘤细胞的LAK细胞。癌细胞膜表面存在一种能被LAK细胞识别的抗原决定簇，而正常细胞缺少这种决定簇，因而LAK细胞可以选择性杀伤肿瘤细胞。据报道，LAK细胞对治疗黑色素瘤有效率平均为18％，肾细胞癌平均27％，结肠癌平均9％。因而，IL-2的抗肿瘤效应主要是通过诱导和激活免疫活性细胞NK、CTL、LAK等产生杀肿瘤效应的。由于恶性肿瘤病人体内的IL-2水平低，以此为基础的免疫活性细胞不能被诱导和增殖，造成免疫监视功能低下，肿瘤细胞得以逃逸，因此通过提供外源性IL-2，帮助病人完成免疫监视，调节和改善机体免疫功能，从而清除肿瘤细胞是IL-2治疗肿瘤的主要机制。

然而，如前文所述，由α亚基介导的毒性在一定程度上影响了其治疗范围，那么，如何通过结构修饰或基因重组等手段缓解IL-2的毒副作用，成为亟待解决的技术问题。此外，尽管对肿瘤具有确切的治疗作用，但常规给药方式下IL-2无法在肿瘤内特异性聚集，使其靶向性有待提升。在这种情况下，如果能对IL-2进行结构改进，以实现其对实体肿瘤或肿瘤细胞的专一性，那么则有望进一步提升IL-2的抗肿瘤效果。然而，要实现这一目的，采用化学偶联方法还是微生物重组方法、选择怎样的载体、二者如何实现分子水平的连接，诸多问题尚有待解决。

非致病性大肠杆菌Nissle 1917作为一种益生元在欧洲己经获得治疗肠病的认证长达九十余年，大量的试验、临床依据表明，这种细菌药物是有效和安全的。有研究表明大肠杆菌对血清敏感，对实体瘤具有偏好性且可在实体瘤内大量增殖，鉴于这一特性，人们尝试以其为宿主菌构建可表达外源基因药物的工程菌来特异性的治疗癌症。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种表达重组IL-2的重组大肠杆菌Nissle 1917及其功能验证方法，以解决天然IL-2存在由CD25介导的毒副作用的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是，常规IL-2无法在肿瘤内特异性聚集。

本发明要解决的再一技术问题是，对实体肿瘤具有偏好性的大肠杆菌Nissle1917，无法在肿瘤中表IL-2，以实现抗肿瘤作用。

本发明要解决的又一技术问题是，对于携带有基因药物的重组微生物，如何验证其抗肿瘤功效。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

表达重组IL-2的重组大肠杆菌Nissle 1917，该重组大肠杆菌Nissle 1917是由以下方法构建的：

1)将IL-2的编码基因片段通过酶切酶连的方法连接到pet28c质粒中，得到pet28c-IL-2重组质粒；

2)将所述pet28c-IL-2重组质粒转化至大肠杆菌Nissle 1917中，得到重组大肠杆菌pet28c-IL-2-Nissle 1917，即为所述表达重组IL-2的重组大肠杆菌Nissle 1917。

作为优选，步骤1)中IL-2的编码基因片段是核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的DNA片段。

作为优选，步骤1)中IL-2的编码基因片段是由人工合成获得的。

作为优选，步骤1)中IL-2的编码基因片段是以核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQID No.3所示的DNA片段为引物，由PCR扩增获得的。进一步优选的，所述PCR扩增的模板是重组载体puc-57-IL-2；所述重组载体puc-57-IL-2可以是由人工合成获得的。

作为优选，步骤2)中所使用的pet28c-IL-2重组质粒，是先将步骤1)所得的pet28c-IL-2重组质粒转入E.coli DH5α中，而后培养扩增获得的。

作为优选，步骤1)所述的酶切酶连，是以Nco I和Xho I双酶切，酶切产物纯化后，采用T4连接酶连接到pet28c质粒中。

作为优选，步骤2)包括：将所述pet28c-IL-2重组质粒与感受态的Nissle 1917混合冰浴30min，42℃热激60s，冰浴2min；而后通过卡那霉素抗性筛选出阳性克隆，即得到重组大肠杆菌pet28c-IL-2-Nissle 1917，即为所述表达重组IL-2的重组大肠杆菌Nissle1917。

作为优选，所述感受态的Nissle 1917，是通过以下方法制备的：将大肠杆菌Nissle 1917划线接种于无抗性的LB平板，37℃培养过夜；挑取单个菌落接种于5mL LB培养基中，37℃振荡培养12h；按1:100比例接种于100mL LB培养基中振荡培养至细菌OD值为0.4；冰上放置10min，然后于4℃下3000g离心10min；弃去上清，用预冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液10mL悬浮细胞，冰上放置15～30min，而后在4℃下3000g离心10min；弃去上清，加入4mL预冷且含15％甘油的、0.1mol/L的CaCl₂溶液，悬浮细胞，冰上放置1～10min，即得到所述感受态的Nissle1917。

作为优选，所述pet28c质粒是核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的DNA分子。

在以上技术方案的基础上，本发明进一步提供了上述重组大肠杆菌Nissle 1917的抗肿瘤功能验证方法，该方法是将活化后的重组大肠杆菌pet28c-IL-2-Nis sle 1917，以10⁵CFU的剂量注射黑色素瘤模型小鼠，而后记录肿瘤体积。

在以上技术方案的基础上，本发明进一步提供了上述重组大肠杆菌Nissle 1917的抗肿瘤功能验证方法，该方法包括以下步骤：

1)将重组大肠杆菌pet28c-IL-2-Nissle 1917用LB培养基活化；

2)将黑色素瘤细胞B16-F10以2×10⁶的数量接种于C57BL/6小鼠皮下；

3)将步骤1)活化后的重组大肠杆菌pet28c-IL-2-Nissle 1917以10⁵CFU的剂量注射至步骤2)造模成功黑色素瘤模型小鼠中，而后记录肿瘤体积。

本发明提供了一种表达重组IL-2的重组大肠杆菌Nissle 1917及其功能验证方法。该技术方案首先将重组IL-2的编码基因通过酶切酶连的方法与pet28c载体连接，再利用所得的重组质粒转化至大肠杆菌Nissle 1917中，从而得到重组大肠杆菌Nissle 1917。本发明中采用的重组IL-2去除了天然IL-2的α亚基，因而避免了毒副作用；在此基础上，利用大肠杆菌Nissle 1917在肿瘤内聚集的特性，使其位点特异性地实现重组IL-2蛋白的表达，从而更准确地杀伤肿瘤细胞，降低对机体正常细胞的损伤。在此基础上，本发明提供了考察该重组菌抗肿瘤功效的一种实验方法，将活化后的菌株采用尾静脉注射的方式处理黑色素瘤动物模型，再考察其肿瘤体积的变化。

该技术方案采用了重组的IL-2编码基因用于实验，该基因表达产物不具有亚基α(CD25)，但没有改变IL-2的功能，因此在保留了IL-2既有治疗作用的前提下去除了毒副作用；在此基础上，构建了pet28c-IL-2重组质粒，并以大肠杆菌Nissle 1917作为治疗载体，综合应用了大肠杆菌Nissle 1917特异性聚集在实体瘤中的性质，进一步扩大了本发明中肿瘤杀伤的特异性。本发明结合前期实验基础，为ADC药物治疗肿瘤的发展提供了一定的理论基础和数据支撑。

本发明利用已得到的重组IL-2，结合大肠杆菌Nissle1917的肿瘤内特异性聚集及胞内侵袭的特性，携带重组IL-2来刺激体内T淋巴细胞、NK细胞等免疫细胞活化增殖，达到杀伤肿瘤的效果。其技术优势集中体现在以下方面：表达产物不具有亚基α(CD25)，但没有改变IL-2的功能，因此在保留了IL-2既有治疗作用的前提下去除了毒副作用；同时利用肠杆菌Nissle1917在实体瘤中侵袭、聚集特性，结合IL-2的免疫监视功能以及调节和改善机体免疫功能作用，对肿瘤细胞进行杀伤和清除，属于抗体偶联药物，这种新型治疗药物，能更好地实现特异性杀伤肿瘤细胞效果并可降低对机体正常细胞的损伤。本发明采用大肠杆菌Nissle1917为药物表达载体，介导原核质粒表达，大幅降低了药物成本；且大肠杆菌Nissle1917是益生菌，安全无毒；大肠杆菌Nissle1917属胞外菌，比胞内细菌更易被抗生素清除；大肠杆菌Nissle1917基因组和遗传背景相对清楚，更易于改造；大肠杆菌Nissle1917为兼性厌氧菌在肿瘤的选择方面受肿瘤大小及肿瘤内微环境等因素的限制较小等优点，使其具有更大的应用价值。

附图说明

图1是本发明实施例1中，不同实验组肿瘤体积随时间的变化曲线图。图中：M组为空白组；M+Nissle 1917为注射常规大肠杆菌Nissle 1917的实验组；M+pet28c-IL-2-Nissle 1917为注射本发明重组大肠杆菌Nissle 1917的实验组。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

以下实验中所采用的原始质粒pet28c、E.coli Top10、大肠杆菌Nissle 1917、限制性内切酶、T4DNA连接酶、LB固体培养基及液体培养基，均为常规生化实验材料，均自市面购得。

实施例1

1、以puc57-IL-2为模板，以SEQ ID No.2和SEQ ID No.3序列为引物，PCR扩增获得SEQ ID No.1所示的重组IL-2编码基因片段。其中，puc57-IL-2是由生工生物工程(上海)股份有限公司合成的。以上所获得的重组IL-2编码基因片段，也可直接根据其序列通过人工合成方式获得。

2、已获得的重组IL-2编码基因片段和质粒pet28c，经Nco I和Xho I双酶切，酶切产物纯化后，采用T4连接酶连接到pet28c(SEQ ID No.4)质粒中，重组质粒命名为pet28c-IL-2。

3、将-80℃保存的大肠杆菌Nissle 1917划线接种于无抗性的LB平板，37℃培养过夜；挑取单个菌落于5mL LB中，37℃振荡培养12h；按1:100比例接种于100mL LB中振荡培养至细菌OD＝0.4左右；冰上放置10min，然后于4℃下3000g离心10min；弃去上清，用预冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液10mL轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30min后，4℃下3000g离心10min；弃去上清，加入4ml预冷含15％甘油的0.1mol/L的CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。制成Nissle 1917感受态分装后-80℃留存备用。

4、将已获得的重组质粒pet28c-IL-2转化进入大肠杆菌Nissle 1917中，酶连产物和Nissle 1917感受态冰浴30min，42℃热激60秒，冰浴2min。通过卡那霉素抗性筛选出阳性克隆，获得重组大肠杆菌Nissle 1917，命名为pet28c-IL-2-Nissle 1917。

5、将活化好的重组大肠杆菌pet28c-IL-2-Nissle 1917通过尾静脉注射10⁵CFU至造模成功的黑色素瘤模型小鼠中，记录黑色素瘤模型肿瘤大小。实验结果如图1所示，与空白组及常规大肠杆菌Nissle 1917组相比，注射本发明重组大肠杆菌pet28c-IL-2-Nissle1917后，实体肿瘤体积增速显著降低，表现出了确切的肿瘤抑制效果。

实施例2

表达重组IL-2的重组大肠杆菌Nissle 1917，该重组大肠杆菌Nissle 1917是由以下方法构建的：

1)将IL-2的编码基因片段通过酶切酶连的方法连接到pet28c质粒中，得到pet28c-IL-2重组质粒；

2)将所述pet28c-IL-2重组质粒转化至大肠杆菌Nissle 1917中，得到重组大肠杆菌pet28c-IL-2-Nissle 1917，即为所述表达重组IL-2的重组大肠杆菌Nissle 1917。

其中，步骤1)中IL-2的编码基因片段是核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的DNA片段。

步骤1)中IL-2的编码基因片段是由人工合成获得的。

步骤2)中所使用的pet28c-IL-2重组质粒，是先将步骤1)所得的pet28c-IL-2重组质粒转入E.coli DH5α中，而后培养扩增获得的。

步骤1)所述的酶切酶连，是以Nco I和Xho I双酶切，酶切产物纯化后，采用T4连接酶连接到pet28c质粒中。

步骤2)包括：将所述pet28c-IL-2重组质粒与感受态的Nissle 1917混合冰浴30min，42℃热激60s，冰浴2min；而后通过卡那霉素抗性筛选出阳性克隆，即得到重组大肠杆菌pet28c-IL-2-Nissle 1917，即为所述表达重组IL-2的重组大肠杆菌Nissle 1917。

所述感受态的Nissle 1917，是通过以下方法制备的：将大肠杆菌Nissle 1917划线接种于无抗性的LB平板，37℃培养过夜；挑取单个菌落接种于5mL LB培养基中，37℃振荡培养12h；按1:100比例接种于100mL LB培养基中振荡培养至细菌OD值为0.4；冰上放置10min，然后于4℃下3000g离心10min；弃去上清，用预冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液10mL悬浮细胞，冰上放置15～30min，而后在4℃下3000g离心10min；弃去上清，加入4mL预冷且含15％甘油的、0.1mol/L的CaCl₂溶液，悬浮细胞，冰上放置1～10min，即得到所述感受态的Nissle1917。

接下来，可采用以下方法A或B对重组大肠杆菌Nissle 1917的抗肿瘤功能进行验证：

方法A：将活化后的重组大肠杆菌pet28c-IL-2-Nissle 1917，以10⁵CFU的剂量注射黑色素瘤模型小鼠，而后记录肿瘤体积。

方法B：

1)将重组大肠杆菌pet28c-IL-2-Nissle 1917用LB培养基活化；

2)将黑色素瘤细胞B16-F10以2×10⁶的数量接种于C57BL/6小鼠皮下；

3)将步骤1)活化后的重组大肠杆菌pet28c-IL-2-Nissle 1917以10⁵CFU的剂量注射至步骤2)造模成功黑色素瘤模型小鼠中，而后记录肿瘤体积。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南昌大学

<120> 表达重组IL-2的重组大肠杆菌Nissle 1917及其功能验证方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 314

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

ccatggggcc gaaaaagaaa attcagctgc atgcagaaca tgcactgtat gatgcactga 60

tgattctgaa tattgttaaa accaatagcc cgccggcaga agaaaaactg gaagattatg 120

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<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

cttcccatgg agtctagaat ggccttacc 29

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

tattctcgag gcgagggggc agggcctgca t 31

<210> 4

<211> 5367

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

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tgaaccaggc cagccacgtt tctgcgaaaa cgcgggaaaa agtggaagcg gcgatggcgg 900

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ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct 3420

gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag 3480

ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 3540

cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 3600

cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 3660

gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag 3720

aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg 3780

tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca 3840

gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc 3900

tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgaaca ataaaactgt 3960

ctgcttacat aaacagtaat acaaggggtg ttatgagcca tattcaacgg gaaacgtctt 4020

gctctaggcc gcgattaaat tccaacatgg atgctgattt atatgggtat aaatgggctc 4080

gcgataatgt cgggcaatca ggtgcgacaa tctatcgatt gtatgggaag cccgatgcgc 4140

cagagttgtt tctgaaacat ggcaaaggta gcgttgccaa tgatgttaca gatgagatgg 4200

tcagactaaa ctggctgacg gaatttatgc ctcttccgac catcaagcat tttatccgta 4260

ctcctgatga tgcatggtta ctcaccactg cgatccccgg gaaaacagca ttccaggtat 4320

tagaagaata tcctgattca ggtgaaaata ttgttgatgc gctggcagtg ttcctgcgcc 4380

ggttgcattc gattcctgtt tgtaattgtc cttttaacag cgatcgcgta tttcgtctcg 4440

ctcaggcgca atcacgaatg aataacggtt tggttgatgc gagtgatttt gatgacgagc 4500

gtaatggctg gcctgttgaa caagtctgga aagaaatgca taaacttttg ccattctcac 4560

cggattcagt cgtcactcat ggtgatttct cacttgataa ccttattttt gacgagggga 4620

aattaatagg ttgtattgat gttggacgag tcggaatcgc agaccgatac caggatcttg 4680

ccatcctatg gaactgcctc ggtgagtttt ctccttcatt acagaaacgg ctttttcaaa 4740

aatatggtat tgataatcct gatatgaata aattgcagtt tcatttgatg ctcgatgagt 4800

ttttctaaga attaattcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa 4860

ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg aaattgtaaa cgttaatatt 4920

ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa atcagctcat tttttaacca ataggccgaa 4980

atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca 5040

gtttggaaca agagtccact attaaagaac gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc 5100

gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg 5160

aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg 5220

ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg 5280

gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg 5340

ccgctacagg gcgcgtccca ttcgcca 5367

Claims (10)

1.表达重组IL-2的重组大肠杆菌Nissle 1917，其特征在于该重组大肠杆菌Nissle1917是由以下方法构建的：

1)将IL-2的编码基因片段通过酶切酶连的方法连接到pet28c质粒中，得到pet28c-IL-2重组质粒；

2)将所述pet28c-IL-2重组质粒转化至大肠杆菌Nissle 1917中，得到重组大肠杆菌pet28c-IL-2-Nissle 1917，即为所述表达重组IL-2的重组大肠杆菌Nissle 1917。

2.根据权利要求所述的表达重组IL-2的重组大肠杆菌Nissle 1917，其特征在于步骤1)中IL-2的编码基因片段是核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的DNA片段。

3.根据权利要求2所述的表达重组IL-2的重组大肠杆菌Nissle 1917，其特征在于步骤1)中IL-2的编码基因片段是由人工合成获得的。

4.根据权利要求2所述的表达重组IL-2的重组大肠杆菌Nissle 1917，其特征在于步骤1)中IL-2的编码基因片段是以核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的DNA片段为引物，由PCR扩增获得的。

5.根据权利要求1所述的表达重组IL-2的重组大肠杆菌Nissle 1917，其特征在于步骤2)中所使用的pet28c-IL-2重组质粒，是先将步骤1)所得的pet28c-IL-2重组质粒转入E.coli DH5α中，而后培养扩增获得的。

6.根据权利要求1所述的表达重组IL-2的重组大肠杆菌Nissle 1917，其特征在于步骤1)所述的酶切酶连，是以Nco I和Xho I双酶切，酶切产物纯化后，采用T4连接酶连接到pet28c质粒中。

7.根据权利要求1所述的表达重组IL-2的重组大肠杆菌Nissle 1917，其特征在于步骤2)包括：将所述pet28c-IL-2重组质粒与感受态的Nissle 1917混合冰浴30min，42℃热激60s，冰浴2min；而后通过卡那霉素抗性筛选出阳性克隆，即得到重组大肠杆菌pet28c-IL-2-Nissle 1917，即为所述表达重组IL-2的重组大肠杆菌Nissle 1917。

8.根据权利要求7所述的表达重组IL-2的重组大肠杆菌Nissle 1917，其特征在于所述感受态的Nissle 1917，是通过以下方法制备的：将大肠杆菌Nissle 1917划线接种于无抗性的LB平板，37℃培养过夜；挑取单个菌落接种于5mL LB培养基中，37℃振荡培养12h；按1:100比例接种于100mL LB培养基中振荡培养至细菌OD值为0.4；冰上放置10min，然后于4℃下3000g离心10min；弃去上清，用预冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液10mL悬浮细胞，冰上放置15～30min，而后在4℃下3000g离心10min；弃去上清，加入4mL预冷且含15％甘油的、0.1mol/L的CaCl₂溶液，悬浮细胞，冰上放置1～10min，即得到所述感受态的Nissle 1917。

9.权利要求1～8任一项所述重组大肠杆菌Nissle 1917的抗肿瘤功能验证方法，其特征在于该方法是将活化后的重组大肠杆菌pet28c-IL-2-Nissle 1917，以10⁵CFU的剂量注射黑色素瘤模型小鼠，而后记录肿瘤体积。

10.权利要求1～8任一项所述重组大肠杆菌Nissle 1917的抗肿瘤功能验证方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

1)将重组大肠杆菌pet28c-IL-2-Nissle 1917用LB培养基活化；

2)将黑色素瘤细胞B16-F10以2×10⁶的数量接种于C57BL/6小鼠皮下；

3)将步骤1)活化后的重组大肠杆菌pet28c-IL-2-Nissle 1917以10⁵CFU的剂量注射至步骤2)造模成功黑色素瘤模型小鼠中，而后记录肿瘤体积。

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