CN111110654B - 一种携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111110654B
CN111110654B CN202010064860.7A CN202010064860A CN111110654B CN 111110654 B CN111110654 B CN 111110654B CN 202010064860 A CN202010064860 A CN 202010064860A CN 111110654 B CN111110654 B CN 111110654B
Authority
CN
China
Prior art keywords
klak
protein
hsp
carrying
tumor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010064860.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111110654A (zh
Inventor
关新刚
夏薇
王冬梅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beihua University
Original Assignee
Beihua University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beihua University filed Critical Beihua University
Priority to CN202010064860.7A priority Critical patent/CN111110654B/zh
Publication of CN111110654A publication Critical patent/CN111110654A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111110654B publication Critical patent/CN111110654B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5169—Proteins, e.g. albumin, gelatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒及其制备方法和应用；制备方法为：根据pET25b(+)‑HSP16.5表达载体的基因序列，合成促凋亡肽KLAK肽对应的单链DNA序列，退火处理后产物与载体进行HindⅢ和XhoⅠ双酶切，凝胶回收酶切产物，将KLAK序列与载体连接，连接产物转化至DH5a大肠杆菌感受态中，挑取单克隆菌落过夜摇菌，提取质粒测序；将测序正确的pET25b(+)‑HSP‑KLAK质粒转化至BL21大肠杆菌感受态中，扩大培养，超声破碎菌体得到相应粗产物，然后纯化，透析浓缩冻干后得到HSP‑KLAK蛋白；本发明的携带抗肿瘤肽的热休克蛋白纳米颗粒可以被肿瘤细胞快速摄取，在溶酶体中释放后，靶向线粒体发挥肿瘤杀伤功能，而药物载体本身蛋白质可被细胞快速降解，达到良好的肿瘤治疗效果。

Description

一种携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
癌症，又称恶性肿瘤，是由于多因素引发、多基因突变、多阶段发展的多发病，传统化疗药物在临床使用过程中产生的严重毒副作用和肿瘤细胞的多重耐药性等问题严重限制了它们在肿瘤治疗中的应用。
多肽是由少量氨基酸(10～100个)组成的小“蛋白”，具有分子量小、易改造修饰、结构清楚、作用机制明确、活性接近蛋白等优点，集化学药和蛋白药优势于一身，因此成为当前抗癌药研发的热点领域之一。
抗肿瘤肽(KLAKLAK)2(KLAK)是一种合成的抗菌肽，只对肿瘤细胞有杀伤作用，研究发现其可在表面形成具有阳离子氨基酸的α-螺旋，破坏真核线粒体膜和原核膜的完整性，使细胞程序性死亡。但由于亲水性，使其不能有效内化到肿瘤细胞中，所以它必须与细胞穿透部分的受体或配体偶联，通过受体非依赖性和依赖性机制进入靶细胞，才能发挥促凋亡特性。
因此，对游离肽进行改造和修饰，开发一种有效进入肿瘤细胞、增强药物对肿瘤细胞的杀伤特性和降低药物的毒副作用的抗肿瘤药物变得尤为重要。
发明内容
针对上述问题，本发明旨在提供一种携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒及其制备方法和应用，本发明的携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒可以被肿瘤细胞快速摄取，在溶酶体中释放后靶向线粒体发挥肿瘤杀伤功能，而药物载体本身蛋白质可被细胞快速降解，达到良好的肿瘤治疗效果。
为了达到上述的目的，本发明所采用的技术方案是：
一种携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒，具体为HSP-KLAK纳米颗粒，其氨基酸序列如下：GPLGLAGKLAKLAKKLAKLAK。
进一步的，所述HSP-KLAK纳米颗粒的粒径为35-45nm。
进一步的，所述携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)pET25b-HSP16.5-KLAK表达载体的构建：
A：合成KLAK的DNA片段：
上游引物：
5’CCCAAGCTTGGACCATTAGGATTAGCAGGAAAACTGGCGAAACTGGCGAAAAAACTGGCGAAACTGGCGAAAGCGGCCGCACTCGAGCGG 3’；
下游引物：
5’CCGCTCGAGTGCGGCCGCTTTCGCCAGTTTCGCCAGTTTTTTCGCCAGTTTCGCCAGTTTTCCTGCTAATCCTAATGGTCCAAGCTTGGG 3’；
根据上述序列，合成单链DNA片段，通过PCR反应扩增得到KLAK的DNA片段；
B：将KLAK的DNA片段和载体pET25b-HSP16.5分别进行双酶切，然后核酸电泳，凝胶回收得到酶切产物，将酶切后的KLAK的DNA片段和酶切后的载体pET25b-HSP16.5进行连接，构建重组质粒；
C：将所述重组质粒转化入DH5a大肠杆菌感受态细胞中，进行氨苄抗性筛选，然后测序，测序正确的重组质粒为pET25b(+)-HSP-KLAK质粒；
(2)pET25b(+)-HSP-KLAK质粒表达菌株的构建：
将pET25b(+)-HSP-KLAK质粒转化至BL21大肠杆菌的感受态细胞中，并将转化后的菌株保存于甘油；
(3)pET25b(+)-HSP-KLAK质粒在BL21大肠杆菌中的诱导表达及纯化：
A：诱导表达：将步骤(2)制得的菌株接种于LB中培养，通过IPTG诱导表达，诱导4h-6h，然后离心分离，得上清液和沉淀，分别通过SDS-PAGE全蛋白电泳，HSP-KLAK蛋白表达成功的为HSP-KLAK蛋白包涵体沉淀；
B：纯化：收集步骤A中HSP-KLAK蛋白包涵体沉淀，继续离心去上清液，添加包涵体洗涤液洗涤两次，离心去上清液，然后添加包涵体裂解液，冰浴过夜，制得裂解蛋白液，将其离心留上清液，加入蛋白复性液，制得复性蛋白液，最后透析浓缩后冻干，取冻干蛋白进行SDS-PAGE电泳，检测蛋白质纯度及分子量，制得HSP-KLAK纳米颗粒。
进一步的，步骤(1)中步骤A的PCR反应包括以下步骤：将20μl Nuclease-FreeWater，10μl DNA寡核苷酸退火缓冲液(5×)以及10μl上游引物和10μl下游引物依次混合，于95℃条件下退火5min，缓慢冷却至室温，制得KLAK的DNA片段。
进一步的，步骤(1)中步骤B双酶切所用的核酸内切酶是Hind III和XhoI。
进一步的，步骤(1)中步骤B的双酶切体系为50μl：8μl合成的KLAK片段或载体pET25b-HSP16.5，5μl 10X酶切缓冲液，2μl限制性内切酶(各1μl)，H2O 35μL，37℃酶切4h，核酸电泳后回收凝胶，分别制得酶切后的KLAK的DNA片段和酶切后的载体pET25b-HSP16.5。
载体pET25b-HSP16.5由常规生物学方法制备，运用Nde1以及BamH1双酶切，回收凝胶得到所需片段即可。
进一步的，步骤(1)中步骤B的连接体系为30μl，载体pET25b-HSP16.5 5ul，KLAK的DNA片段8.5ul，2×Buffer 15ul，T4 DNA连接酶1.5ul，25℃连接1小时。
进一步的，步骤(2)中转化后的菌株保存于甘油，于-80℃条件下保存。
进一步的，步骤(3)中步骤A的诱导表达的步骤具体为：将步骤(2)制得的菌液接种于含有500μl氨苄青霉素(浓度为100mg/ml)、1％葡萄糖的20mlLB培养基中，于37℃摇床过夜培养，转速为160-170rpm；将过夜的20ml菌液加入1L LB培养基(含1％葡萄糖)中，于37℃、转速200rpm条件下扩大培养，当OD600达到0.45-0.8时，向菌液中加入2ml IPTG(终浓度为1mM)，并在37℃、转速为180-220rpm的摇床中诱导4h；然后在4℃以4500rpm离心10min，弃去上清液，将沉淀置于冰上加入bindingbuffer(20mM Tris-HCl，500mMNaCl，20mMimidazole，8M尿素，1mM PMSF)超声，重复两次，分离上清液与沉淀，沉淀中继续加bindingbuffer重悬；取上清液与沉淀进行SDS-PAGE检测。
进一步的，步骤(3)中步骤B的纯化步骤具体为：经SDS-PAGE验证，HSP-KLAK蛋白主要存在于包涵体沉淀中，所以将步骤A制得的包涵体沉淀于4500rpm条件下离心15min后去上清液，包涵体沉淀用包涵体洗涤液(50mM Tris-HCl，5mM EDTA，0.15M NaCl，2M尿素，pH8.0)洗涤两次后，离心去上清液，沉淀称重，以每30mg沉淀加1ml包涵体裂解液(50mMTris-HCl，5mM EDTA，0.15M NaCl，8M尿素，pH8.0)在4℃环境中冰浴过夜，将制得的裂解蛋白液离心留上清液，在4℃时分三次加入蛋白复性液(50mM Tris-HCl(pH8.0)，5mM EDTA，0.15mM NaCl，1M尿素，0.15M L-Arg，2m M GSH，0.5m M GSSG，pH8.0)中，每次间隔6h，制得复性蛋白液，三次所加蛋白复性液的总和与复性蛋白液体积比为1：8，最后在4℃时放入透析袋透析，PEG20000浓缩后冻干，取冻干蛋白进行SDS-PAGE电泳，检测蛋白质纯度及分子量。
进一步的，步骤(3)中步骤B的包涵体洗涤液包括50mM Tris-HCl，5mM EDTA，0.15MNaCl和2M尿素；包涵体洗涤液的pH为8.0。
进一步的，步骤(3)中步骤B的包涵体裂解液包括50mM Tris-HCl，5mM EDTA，0.15MNaCl和8M尿素；包涵体裂解液的pH为8.0。
进一步的，步骤(3)中步骤B的蛋白复性液包括50mM Tris-HCl，5mM EDTA，0.15mMNaCl，1M尿素，0.15M L-Arg，2m M GSH和0.5m M GSSG；Tris-HCl的pH为8.0，蛋白复性液的pH为8.0。
进一步的，所述携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒在抗肿瘤药物中的应用，所述蛋白纳米颗粒用于静脉注射。
增强药物对肿瘤细胞的杀伤特性和降低药物的毒副作用是提高肿瘤治疗效果的两个关键问题，本发明以小热休克蛋白(HSP16.5)为载体，利用其自组装为球形纳米笼的特性，担载只对肿瘤细胞有杀伤作用的促凋亡肽KLAK，形成稳定的纳米级载药系统HSP-KLAK，利用纳米载体的被动靶向，改善药物在肿瘤组织的蓄积，利用多肽的促凋亡特性达到肿瘤治疗的目的，既可避免损害机体免疫系统，又可以杀伤肿瘤细胞的方案，能获得较好的抗肿瘤效果。
本发明的有益效果：
本发明提供的携带抗肿瘤肽的热休克蛋白纳米颗粒可以被肿瘤细胞快速摄取，在溶酶体中释放后，促凋亡肽KLAK靶向线粒体发挥肿瘤杀伤功能，而药物载体本身蛋白质可被细胞快速降解，达到良好的肿瘤治疗效果；增强药物对肿瘤细胞的杀伤特性和降低药物的毒副作用。
附图说明
图1为pET25b(+)-HSP-KLAK质粒的测序结果；
图2为HSP-KLAK蛋白在菌体裂解液中上清液和沉淀的分布，M：蛋白分子量标准；1，2：HSP-KLAK重组菌体的两次超声后上清液；沉淀：HSP-KLAK重组菌体的超声后沉淀；
图3为HSP-KLAK蛋白的蛋白纯化结果；M：蛋白分子量标准；1：纯化的HSP-KLAK蛋白；
图4和5为制备的携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒的粒径表征图；
图6，7，11为携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒的激光共聚焦成像分析图；
图8为游离的HSP、KLAK肽与制备的携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒的细胞存活率对比图；
图9和10为游离KLAK肽与携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒的流式细胞仪分析对比图。
具体实施方式
为了进一步说明本发明的技术效果，下面通过实施例对本发明进行具体描述。
本发明基于促调亡肽(KLAK)的促凋亡特性及小热休克蛋白(HSP16.5)在生理条件下(0℃-70℃，PH 5-11)即可自组装成纳米笼的特性，设计开发担载KLAK肽的纳米笼载药体系，设计的HSP-KLAK纳米颗粒的具体氨基酸序列如下所示：GPLGLAGKLAKLAKKLAKLAK。
pET25b-HSP16.5-KLAK表达载体的构建：
合成与KLAK对应的DNA片段：
上游引物：
5’CCCAAGCTTGGACCATTAGGATTAGCAGGAAAACTGGCGAAACTGGCGAAAAAACTGGCGAAACTGGCGAAAGCGGCCGCACTCGAGCGG 3’；
下游引物：
5’CCGCTCGAGTGCGGCCGCTTTCGCCAGTTTCGCCAGTTTTTTCGCCAGTTTCGCCAGTTTTCCTGCTAATCCTAATGGTCCAAGCTTGGG 3’；
根据上述序列，合成单链DNA片段，然后将20μl Nuclease-Free Water,10μl DNA寡核苷酸退火缓冲液(5×)以及10μl Sense单链和10μlAntisense链依次混合，95℃退火5min，缓慢冷却至室温后，制得KLAK的DNA片段，将其和载体pET25b-HSP16.5进行HindⅢ和XhoⅠ双酶切，双酶切体系为50μl：8μl合成的KLAK片段/载体pET25b-HSP16.5，5μl 10X酶切缓冲液，2μl限制性内切酶(各1μl)，H2O 35μL；37℃酶切4h，核酸电泳后回收凝胶，并将回收产物连接，体系为30μl，载体pET25b-HSP16.5 5ul，KLAK的DNA片段8.5ul，2×Buffer 15ul，T4 DNA连接酶1.5ul，25℃连接1小时，然后转化入DH5a大肠杆菌感受态，进行氨苄抗性筛选挑选连接成功的菌株，挑取单克隆于含入氨苄的LB管中，于37℃，转速160rpm的条件下摇菌过夜，进行测序，图1为测序结果。
将测序正确的pET25b(+)-HSP-KLAK质粒转化至BL21大肠杆菌的感受态中，并将转化的大肠肝菌保存于甘油储存液，于-80℃保存菌液。
将菌液接种于含有500μl浓度为100mg/ml氨苄青霉素、1％葡萄糖的20ml LB培养基中，于37℃摇床过夜培养，转速为160-170rpm；将过夜20ml菌液加入1L LB培养基(含1％葡萄糖)中，于37℃、转速200rpm的条件下扩大培养，当OD600达到0.45-0.8时，向菌液中加入2ml IPTG(终浓度为1mM),并在37℃、转速为180-220rpm的摇床中诱导4h，然后在4℃以4500rpm转速离心10min，弃去上清液，将沉淀置于冰上加入bindingbuffer(20mM Tris-HCl，500mMNaCl，20mM imidazole，8M尿素，1mM PMSF)超声，重复两次，分离上清液与沉淀，沉淀中继续加binding buffer重悬；取上清液与沉淀进行SDS-PAGE检测。
电泳结果如图2所示，确定所需HSP-KLAK蛋白存在于包涵体沉淀中，4500rpm离心15min后去上清液，用包涵体洗涤液(50mM Tris-HCl，5mM EDTA，0.15M NaCl，2M尿素，pH8.0)洗涤两次后，离心去上清液，沉淀称重，以每30mg沉淀加1ml包涵体裂解液(50mMTris-HCl，5mM EDTA，0.15M NaCl，8M尿素，pH8.0)的比例在4℃环境中冰浴过夜，然后将裂解蛋白液离心留上清液，在4℃时分三次加入蛋白复性液(50mM Tris-HCl(pH8.0)，5mMEDTA，0.15mM NaCl，1M尿素，0.15M L-Arg，2m M GSH，0.5m M GSSG，pH8.0)中，每次间隔6h，制得复性蛋白液，三次所加蛋白复性液的总和与复性蛋白液体积比为1：8，最后将其在4℃时放入透析袋透析，PEG20000浓缩后冻干，取冻干蛋白进行SDS-PAGE电泳，检测蛋白质纯度及分子量，结果如图3。
对携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒进行表征。采用动态光散射(DLS)法测定HSP-KLAK纳米粒的粒径，测定前，将冻干蛋白溶解在pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中，经0.22μm滤膜过滤后，使用Zeta电位，室温下测HSP-KLAK粒径，如图4所示，纳米粒子直径约为40nm。
为了进一步验证粒径，使用透射电子显微镜拍摄冷冻TEM图像。如图5，HSP-KLAK为40nm的圆球形颗粒，与DLS测量结果一致。
对携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒进行性能测试，具体如下：
(1)将小鼠黑色素瘤B16F0细胞接种于含有玻璃片的24孔板内，培养24小时，用荧光素-5-马来酰亚胺标记的携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒(HSP-KLAK)(5μM/L)分别处理细胞1小时和4小时，弃去培养液后，使用4％多聚甲醛固定，用DAPI染色液37℃染色10min，PBS洗涤三次后，进行激光共聚焦成像分析，结果如图6所示。由图6可知，共孵育1h后纳米颗粒即可进入细胞，且随着时间的延长，绿色荧光强度增强，表明随着时间的延长，携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒(HSP-KLAK)的在细胞内积聚的越多，具有较好的细胞摄取效率。
(2)将小鼠黑色素瘤B16F0细胞接种于含有玻璃片的24孔板内，培养24小时，用荧光素-5-马来酰亚胺标记的携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒(HSP-KLAK)(5μM/L)分别处理细胞1小时和4小时，弃去培养液后，用溶酶体红色探针Lyso-Tracker Red(750nM)染色，4％多聚甲醛固定细胞，用DAPI染核，进行激光共聚焦成像分析，结果如图7所示。由图7可知，携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒由细胞摄取后可快速进入溶酶体，与溶酶体共定位，且共孵育时间越长，共定位越明显。
(3)用MTT法检测细胞毒性。将小鼠黑色素瘤B16F0细胞以3.5*103个细胞/孔的密度接种于含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基的96孔板中，培养24小时后，加入不同浓度的HSP、KLAK和HSP-KLAK(分别为1μM/L、2μM/L、5μM/L、7.5μM/L、10μM/L)各100ul，继续培养72小时后加入MTT试剂检测细胞存活率，所有实验一式三份进行。结果如图8所示，本发明设计的携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒对肿瘤细胞的杀伤效果明显优于游离KLAK肽，显示出HSP-KLAK的优秀的杀伤作用。
(4)将小鼠黑色素瘤B16F0细胞接种于12孔板内，24小时后分别加入10μM/L的KLAK和携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒(HSP-KLAK)，在37℃的环境下孵育细胞1小时后，弃去培养液，消化细胞，用PBS洗涤后离心去上清，用AnnexinV-PE缓冲液重悬，加入AnnexinV-PE染色，使用流式细胞仪测定阳性细胞。如图9分别为KLAK作用1h的细胞早凋情况，图10为HSP-KLAK作用1h的细胞早凋情况，表明HSP-KLAK的促凋亡作用更强。
(5)将小鼠黑色素瘤B16F0细胞接种于含有玻璃片的24孔板内，培养24小时，用荧光素-5-马来酰亚胺标记的携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒(HSP-KLAK)(5μM/L)处理细胞8小时后，用线粒体红色探针Mito-Tracker Red染色，固定细胞后，用DAPI染核，进行激光共聚焦成像分析，结果如图11所示。由图11可知，共孵育8h后，携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒与线粒体共定位，表明纳米粒子由细胞摄取后，经过溶酶体逃逸，最终进入线粒体，与KLAK肽作用一致，有效破坏线粒体膜，诱导线粒体凋亡，从而达到杀伤肿瘤的目的。
增强药物对肿瘤细胞的杀伤特性和降低药物的毒副作用是提高肿瘤治疗效果的两个关键问题，本发明以小热休克蛋白(HSP16.5)为载体，利用其自组装为球形纳米笼的特性，担载只对肿瘤细胞有杀伤作用的促凋亡肽KLAK，形成稳定的纳米级载药系统HSP-KLAK，利用纳米载体的被动靶向，改善药物在肿瘤组织的蓄积，利用多肽的促凋亡特性达到肿瘤治疗的目的，既可避免损害机体免疫系统，又可以杀伤肿瘤细胞的方案，获得较好的抗肿瘤效果，本发明对开发安全、高效的纳米级载药系统的研究具有重要意义。
最后需要说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，本领域技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。
序列表
<110> 北华大学
<120> 一种携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒及其制备方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 1
Gly Pro Leu Gly Leu Ala Gly Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu
1 5 10 15
Ala Lys Leu Ala Lys
20
<210> 2
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificaial Sequence
<400> 2
cccaagcttg gaccattagg attagcagga aaactggcga aactggcgaa aaaactggcg 60
aaactggcga aagcggccgc actcgagcgg 90
<210> 3
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificaial Sequence
<400> 3
ccgctcgagt gcggccgctt tcgccagttt cgccagtttt ttcgccagtt tcgccagttt 60
tcctgctaat cctaatggtc caagcttggg 90

Claims (10)

1.一种携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒，其特征在于，具体为HSP-KLAK纳米颗粒，其氨基酸序列如下：GPLGLAGKLAKLAKKLAKLAK。
2.根据权利要求1所述携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒，其特征在于，所述HSP-KLAK纳米颗粒的粒径为35-45nm。
3.根据权利要求1所述携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)pET25b-HSP16.5-KLAK表达载体的构建：
A：合成KLAK的DNA片段：
上游引物：
5’CCCAAGCTTGGACCATTAGGATTAGCAGGAAAACTGGCGAAACTGGCGAAAAAACTGGCGAAACTGGCGAAAGCGGCCGCACTCGAGCGG 3’；
下游引物：
5’CCGCTCGAGTGCGGCCGCTTTCGCCAGTTTCGCCAGTTTTTTCGCCAGTTTCGCCAGTTTTCCTGCTAATCCTAATGGTCCAAGCTTGGG 3’；
根据上述序列，合成单链DNA片段，通过PCR反应扩增得到KLAK的DNA片段；
B：将KLAK的DNA片段和载体pET25b-HSP16.5分别进行双酶切，然后核酸电泳，凝胶回收得到酶切产物，将酶切后的KLAK的DNA片段和酶切后的载体pET25b-HSP16.5进行连接，构建重组质粒；
C：将所述重组质粒转化入DH5a大肠杆菌感受态细胞中，进行氨苄抗性筛选，然后测序，测序正确的重组质粒为pET25b(+)-HSP-KLAK质粒；
(2)pET25b(+)-HSP-KLAK质粒表达菌株的构建：将pET25b(+)-HSP-KLAK质粒转化至BL21大肠杆菌的感受态细胞中，并将转化后的菌株保存于甘油；
(3)pET25b(+)-HSP-KLAK质粒在BL21大肠杆菌中的诱导表达及纯化：A：诱导表达：将步骤(2)制得的菌株接种于LB中培养，通过IPTG诱导表达，诱导4h-6h，然后离心分离，得上清液和沉淀，分别通过SDS-PAGE全蛋白电泳，HSP-KLAK蛋白表达成功的为HSP-KLAK蛋白包涵体沉淀；
B：纯化：收集步骤A中HSP-KLAK蛋白包涵体沉淀，继续离心去上清液，添加包涵体洗涤液洗涤两次，离心去上清液，然后添加包涵体裂解液，冰浴过夜，制得裂解蛋白液，将其离心留上清液，加入蛋白复性液，制得复性蛋白液，最后透析浓缩后冻干，取冻干蛋白进行SDS-PAGE电泳，检测蛋白质纯度及分子量，制得HSP-KLAK纳米颗粒。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中步骤A的PCR反应包括以下步骤：将Nuclease-Free Water，DNA寡核苷酸退火缓冲液以及上游引物和下游引物依次混合，于95℃条件下退火5min，缓慢冷却至室温，制得KLAK的DNA片段。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中步骤B双酶切所用的核酸内切酶是Hind III和Xho I。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中步骤B的包涵体洗涤液包括50mM Tris-HCl，5mM EDTA，0.15M NaCl和2M尿素，包涵体洗涤液的pH为8.0。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中步骤B的包涵体裂解液包括50mM Tris-HCl，5mM EDTA，0.15M NaCl和8M尿素；包涵体裂解液的pH为8.0。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中步骤B的蛋白复性液包括50mM Tris-HCl，5mM EDTA，0.15mM NaCl，1M尿素，0.15M L-Arg，2m M GSH和0.5m M GSSG；Tris-HCl的pH为8.0，蛋白复性液的pH为8.0。
9.根据权利要求1-2任一项所述携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.根据权利要求9所述携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述蛋白纳米颗粒用于静脉注射。
CN202010064860.7A 2020-01-20 2020-01-20 一种携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒及其制备方法和应用 Active CN111110654B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010064860.7A CN111110654B (zh) 2020-01-20 2020-01-20 一种携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010064860.7A CN111110654B (zh) 2020-01-20 2020-01-20 一种携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111110654A CN111110654A (zh) 2020-05-08
CN111110654B true CN111110654B (zh) 2022-03-15

Family

ID=70492679

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010064860.7A Active CN111110654B (zh) 2020-01-20 2020-01-20 一种携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111110654B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106220735A (zh) * 2015-09-11 2016-12-14 中山大学 一种组织蛋白酶b激活式靶向抗肿瘤多肽的制备与应用
CN106727313A (zh) * 2017-01-06 2017-05-31 国家纳米科学中心 一种载药聚合物纳米胶束及其制备方法和应用
CN109553684A (zh) * 2017-09-25 2019-04-02 中国科学院过程工程研究所 一种纳米载体蛋白及其制备方法和应用
CN109803642A (zh) * 2016-07-15 2019-05-24 韩国科学技术研究院 新型纳米笼及其用途

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106220735A (zh) * 2015-09-11 2016-12-14 中山大学 一种组织蛋白酶b激活式靶向抗肿瘤多肽的制备与应用
CN109803642A (zh) * 2016-07-15 2019-05-24 韩国科学技术研究院 新型纳米笼及其用途
CN106727313A (zh) * 2017-01-06 2017-05-31 国家纳米科学中心 一种载药聚合物纳米胶束及其制备方法和应用
CN109553684A (zh) * 2017-09-25 2019-04-02 中国科学院过程工程研究所 一种纳米载体蛋白及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Double-Chambered Ferritin Platform: Dual-Function Payloads of Cytotoxic Peptides and Fluorescent Protein";Soyoun Kim等;《Biomacromolecules》;20151209;第17卷;12-19页 *
"融合聚精氨酸九肽的小热休克蛋白原核表达及蛋白纯化";常愉等;《北华大学学报（自然科学版）》;20190131;第20卷(第1期);第51-54页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111110654A (zh) 2020-05-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
He et al. Cell-penetrating peptides meditated encapsulation of protein therapeutics into intact red blood cells and its application
CN109593693B (zh) 一株大肠杆菌Nissle 1917抗肿瘤靶向工程菌及其构建方法与应用
EP2204378A1 (en) A inhibiting agent for inhibition of angiogenesis, a method for preparing the agent, a method for modifying the agent and its use for manufacturing a medicament for treating tumor
CN104072581B (zh) 具有脑肿瘤靶向和肿瘤组织穿透能力的d构型多肽及其基因递释系统
US20220202949A1 (en) Ligand-targeted cell conjugate (ltcc)-based anti-tumor immune cell, as well as preparation method and use thereof
CN109620956B (zh) 一种智能巨噬细胞肿瘤靶向治疗系统及其制备方法和应用
CN103002879A (zh) 来自细胞原生质体的微泡及其应用
CN112933219B (zh) 一种dna-多肽可逆共价偶联分子的制备方法及其用途
CN110023333B (zh) 高亲和力的可溶性pd-1分子
EP3020724A1 (en) Cell-penetrating peptide and conjugate comprising same
CN106519040B (zh) 一种含肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的融合蛋白和其制备方法及由该蛋白自组装的纳米粒
CN111110654B (zh) 一种携带抗肿瘤肽的蛋白纳米颗粒及其制备方法和应用
US20230144488A1 (en) Cell-penetrating peptide and use thereof
CN108558990A (zh) 肿瘤靶向肽f3修饰的豇豆褪绿斑驳病毒样颗粒的构建、表达及其应用
JP2022541507A (ja) 自己集合型ワクチン及びがん治療用併用療法
CN105504063B (zh) 一类防御素-白蛋白的抗肿瘤融合蛋白及其制备和应用
CN106084063A (zh) 一种新型基因工程重组trail融合蛋白及制备方法和用途
CN110759986A (zh) 一种可逆自组装蛋白的高效制备方法
KR102274876B1 (ko) 신규한 세포 투과성 펩타이드 및 이의 용도
CN101851294B (zh) 细胞穿透肽(Arg)9与力达霉素融合蛋白(Arg)9-LDP及其应用
CN108383912A (zh) 人工融合蛋白及其用途
CN102114239A (zh) 细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗癌药物的应用
CN101880327A (zh) 蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体及其获得方法
CN110101868A (zh) 一种环境刺激响应性蛋白质高分子偶联物自组装体及其制备方法与应用
CN113817071B (zh) 一种egfr靶向的trail融合蛋白及其制备方法和用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant