CN103002879A - 来自细胞原生质体的微泡及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及来自原生质体的微泡，该原生质体来自诸如去除细胞壁的细菌、古细菌、真菌、植物细胞等。本发明来自原生质体的微泡能够自由负载诊断、治疗、疫苗、靶向诱导、细胞膜与靶细胞融合、减少体内外副作用、改善稳定性等必要的物质，并允许治疗物质、诊断物质和/或疫苗物质特异性递送至特定组织或细胞。

Description

来自细胞原生质体的微泡及其应用

技术领域

本发明涉及来自细胞（诸如细菌、古细菌、真菌、植物细胞等）原生质体的微泡，及其在治疗、诊断和/或疫苗递送物质到靶细胞和靶组织中的应用。

背景技术

在药物疗法中，药物递送系统(DDS)的目的是辅助药物递送到体内的靶位点以起到治疗效果。如果由于药物的吸收率或生物利用率低，所以药物从体内排泄过快，DDS可用于改变药物释放曲线。只有具有严重副作用的药物需要递送至靶组织或细胞。例如，许多当前市售的抗癌药物表现出对正常细胞及癌细胞的细胞毒性。抗癌药物大量递送至癌细胞或组织会降低给癌症患者在治疗期间带来的痛苦和不便。

20世纪60年代首次使用脂质体以来，已广泛研究其在DDS中的应用。已取得脂质体研究的进展，其与诸如聚乙二醇(PEG)的聚合物共轭散布在膜外，也就是所谓的隐形脂质体，其可以避开人体免疫系统的检测。PEG涂层允许药物递送机制具有更长的循环半衰期。实际上，已研发出了DOXIL，阿霉素的聚乙二醇化的脂质体包裹形式。然而，脂质体及隐形脂质体本身不能将药物递送至靶细胞或靶组织，因为它们不能识别靶细胞或靶组织。为了使脂质体结合至特异性靶标，最近的研究针对将靶向配体给予脂质体，所述配体诸如单克隆抗体，但其都未通过临床试验且并未成功地商业化。

由脂质、自然存在的细胞膜组成的代替人工合成的脂质体已用于研发递送系统。使用在含有药物的介质中生长的微生物分泌的小细胞的药物递送方法已公开[WO 2005/079854，“通过来自细菌的完整小细胞将靶向体外及体内药物递送到哺乳动物细胞的组合物及方法”]。小细胞，通常包括细菌细胞膜，有可能含有有毒物质，例如，来自革兰氏阴性菌存在于外膜的内毒素类(脂多糖类)或来自革兰氏阳性菌存在于细胞壁的肽聚糖，所以这些微细胞可能引起各种副作用，诸如全身性炎症、败血症等。

原生质体是完全去除细胞壁的细菌、古细菌、真菌、植物细胞。细胞壁的去除可通过酶，诸如细菌或古细菌细胞的溶菌酶，真菌细胞的壳多糖酶及植物细胞的纤维素酶、果胶酶和/或木糖聚酶。原生质体可用于研究膜生物学，包括大分子及病毒的摄取。另外，原生质体应用于DNA转化以获得转基因生物。使用称为原生质体融合的技术，原生质体还可用于植物育种。然而，迄今为止还未报道来自原生质体的微泡及其应用。

发明内容

技术问题

根据本发明，本发明人进行了DDS的精细及深入研究，目的是克服现有技术中遇到的问题，发现了来自已去除其细胞壁的细菌、古细菌、真菌或植物细胞的微泡，可用于有效地递送治疗物质及诊断物质或疫苗至特异性细胞或组织。

因此本发明的一个目的在于提供包括来自细胞原生质体的微泡的组合物。本发明的另一个目的在于提供包括微泡的药物组合物，所述微泡负载用于诊断、治疗、接种疫苗、靶向或与靶细胞的细胞膜融合，及减少副作用及改善体内外稳定性的必要的物质。本发明的另一个目的在于提供用于递送治疗物质、诊断物质和/或疫苗物质的组合物，所述组合物包括来自细胞原生质体的微泡。本发明的还一个目的在于提供使用微泡、包含微泡的物质递送系统，及诊断疾病的包含微泡的试剂盒递送物质至特异性靶标的方法。

然而，在本发明中实现的技术目标不限于上述那些，且本领域技术人员可从以下描述中清楚地理解其他目的。

技术方案

根据一方面，本发明提供了包括来自细胞原生质体的微泡的组合物。本发明可用的细胞可选自由细菌细胞、古细菌细胞、真菌细胞和植物细胞组成的组。

根据另一方面，本发明提供了包括来自原生质体的微泡的药物组合物，所述微泡负载治疗物质或诊断物质。

根据另一方面，本发明提供了包括原生质体微泡的药物组合物，所述微泡负载疫苗物质。

本发明的微泡能够将治疗物质、诊断物质和/或疫苗物质运送至特定组织或细胞，其可用于预防、治疗和/或诊断目的疾病。对微泡内负载的物质没有赋予特别限制。负载的治疗物质、诊断物质和/或疫苗物质可自然表达或通过细胞中转化用作微泡的来源，或从细胞外导入。

根据还一方面，本发明提供了用于递送疾病的诊断、治疗和/或疫苗物质的组合物，所述组合物包括来自原生质体的微泡。

根据还另一方面，本发明提供了疾病的诊断、治疗和/或疫苗物质的递送系统，所述系统包括来自原生质体的微泡。

根据又另一方面，本发明提供了一种来自原生质体的微泡的制备方法，所述方法包括：去除细胞的细胞壁以提供原生质体；在细胞悬浮液中构建微泡；及从悬浮液中分离微泡。

根据另一方面，本发明提供了一种负载疾病的治疗物质、诊断物质或疫苗物质的来自原生质体的微泡的制备方法，所述方法包括：外部加载治疗物质、诊断物质或疫苗物质至细胞中，接着去除细胞的细胞壁以提供原生质体；在原生质体悬浮液中构建微泡；及从悬浮液中分离微泡。

根据还另一方面，本发明提供了一种负载疾病的治疗物质、诊断物质或疫苗物质的来自原生质体的微泡的制备方法，所述方法包括：去除细胞的细胞壁以提供原生质体；外部加载治疗物质、诊断物质或疫苗物质至原生质体；在负载物质的原生质体悬浮液中构建微泡；及从悬浮液中分离微泡。

根据还一方面，本发明提供了一种负载疾病的治疗物质、诊断物质或疫苗物质的来自原生质体的微泡的制备方法，所述方法包括：去除细胞的细胞壁以提供原生质体；将治疗物质、诊断物质或疫苗物质添加到原生质体悬浮液以构建微泡；及从悬浮液中分离微泡。

根据另一方面，本发明提供了一种负载疾病的治疗物质、诊断物质或疫苗物质的来自原生质体的微泡的制备方法，所述方法包括：去除细胞的细胞壁以提供原生质体；在原生质体悬浮液中构建微泡；将治疗物质、诊断物质或疫苗物质添加到包括微泡的悬浮液，并允许治疗物质、诊断物质或疫苗物质负载于微泡中；及从悬浮液中分离负载治疗物质、诊断物质或疫苗物质的微泡。

根据另一方面，本发明提供了一种负载疾病的治疗物质、诊断物质或疫苗物质的来自原生质体的微泡的制备方法，所述方法包括：去除细胞的细胞壁以提供原生质体；在原生质体悬浮液中构建微泡；从悬浮液中分离微泡；及将治疗物质、诊断物质或疫苗物质添加到含有微泡的悬浮液，并允许治疗物质、诊断物质或疫苗物质负载于微泡中。

根据还另一方面，本发明提供了一种递送治疗物质、诊断物质或疫苗物质至特定细胞或组织的方法，所述方法包括使用负载治疗物质、诊断物质或疫苗物质的来自原生质体的微泡。

根据还另一方面，本发明提供了一种治疗疾病和/或诊断疾病的方法，所述方法包括使用负载治疗物质或诊断物质的来自原生质体的微泡，递送诊断物质或治疗物质至特定细胞或组织。

根据又一方面，本发明提供了一种预防和/或治疗疾病的方法，所述方法包括使用负载疫苗物质的来自原生质体的微泡，递送疫苗物质至特定细胞或组织。

根据又另一方面，本发明提供了诊断疾病的试剂盒，所述试剂盒包括来自原生质体的、亚原生质体大小的微泡，所述微泡负载有诊断疾病所需的引物、探针、反义核酸或抗体。

有益效果

微生物或更高级生物体细胞的致病能力经常与胞外壁和细胞膜的特定组分有关，其包括位于细胞外膜内的内毒素类、位于革兰氏阴性菌细胞壁的肽聚糖与脂蛋白、古细菌中的假肽聚糖及位于真菌细胞和植物细胞细胞壁的几丁质和纤维素。这些组分可能触发免疫应答，同时产生严重症状。本发明的微泡来自通过去除细菌、古细菌、真菌或植物细胞细胞壁而构建的原生质体，所述微泡自身不触发免疫应答。此外，来自原生质体的微泡优势在于其负载治疗物质和/或诊断物质、或疫苗物质，且可以大规模生产。

治疗物质、诊断物质和/或疫苗物质如果负载于本发明的来自原生质体的微泡，可以不指向非靶细胞或组织而递送至靶细胞或靶组织。因此，本发明的来自原生质体的微泡可选择性递送诸如药物的治疗剂至目的细胞或组织，且副作用显著减少，从而缓解患者的不便和疼痛。另外，由于其精确的靶向能力，当本发明的来自原生质体的微泡负载诊断物质时，其可用于准确地诊断疾病，及当所述微泡负载免疫物质时，其可有效地给受试者接种预防，且不产生副作用。

此外，如果微泡来自表达治疗物质、诊断物质、和/或疫苗物质的细胞的原生质体，因为生产时不需要纯化物质，所以所述微泡具有工业及经济优势。

此外，根据本发明的负载治疗和/或诊断物质的微泡及其制备方法可用于体外和/或体内治疗、诊断或试验。

附图说明

图1是说明来自原生质体的微泡的制备过程的示意图。

图2说明了来自细菌细胞的原生质体的正确构建。

图3示出了来自革兰氏阴性原生质体的微泡的TEM图像。

图4示出了来自革兰氏阳性原生质体的微泡的TEM图像。

图5示出了来自革兰氏阴性原生质体的微泡粒径的图表。

图6示出了来自革兰氏阳性原生质体的微泡粒径的图表。

图7示出了来自革兰氏阴性原生质体的微泡没有引起副作用的图表。

图8示出了来自革兰氏阳性原生质体的微泡没有引起副作用的图表。

图9示出了来自革兰氏阴性原生质体的微泡在小鼠中没有引起副作用的图表。

图10示出了来自革兰氏阳性原生质体的微泡在小鼠中没有诱导IL-6产生的图表。

图11示出了来自原生质体的微泡能够负载质粒的图示。

图12示出了负载于来自原生质体的微泡的质粒完整性的图示。

图13示出来自原生质体的微泡-介导的递送质粒至细菌的图示。

图14示出了负载抗原的来自原生质体的微泡诱导特异于小鼠内抗原的IgG抗体产生的能力的图表。

图15示出了负载抗原的来自原生质体的微泡诱导特异于小鼠内抗原的IgE抗体产生的能力的图表。

图16示出了负载抗原的来自原生质体的微泡诱导特异于小鼠内抗原的记忆性T细胞产生的能力的说明图。

图17示出了来自原生质体的微泡能够负载包涵体的图示。

图18示出了来自原生质体的微泡能够负载Omp蛋白的图示。

图19示出了负载OmpA抗原的来自原生质体的微泡诱导小鼠中OmpA-特异性IgG抗体产生的图表。

图20示出了负载Omp抗原的微泡用作细菌的疫苗的图表。

图21示出了黑素瘤抗原Mart-1负载于来自原生质体的微泡的图。

图22示出了负载Mart-1的来自原生质体的微泡对黑素瘤的免疫效应的图表。

图23示出了EGF融合蛋白负载于来自原生质体的微泡的图示。

图24示出了EGF融合蛋白负载于来自原生质体的微泡表面同时保持正确的拓扑结构的图示。

图25示出了负载于微泡的EGF融合蛋白选择性递送至目的细胞的图表。

图26示出了在EGF引导下递送负载于微泡的EGF融合蛋白的说明图。

图27示出了通过负载EGF融合蛋白的微泡的EGF信号转导的说明图。

图28示出了负载EGF融合蛋白的微泡-介导的递送阿霉素至小鼠内目的癌组织的说明图。

图29示出了负载EGF融合蛋白的微泡诱导小鼠内EGF-特异性抗体的图表。

图30说明了EGF受体融合蛋白负载于来自原生质体的微泡。

图31示出了负载EGF受体融合蛋白的微泡对EGF的亲和性的图表。

图32示出了组氨酸标签(His-tag)融合蛋白负载于来自原生质体的微泡的图。

图33示出了负载阿霉素的来自原生质体的微泡诱导血管内皮细胞中细胞凋亡的图表。

图34示出了负载阿霉素的来自原生质体的微泡诱导小鼠结肠癌细胞中细胞死亡的图表。

图35示出了负载阿霉素的来自原生质体的微泡抑制小鼠中癌组织生长的图表。

发明的实施方式

根据一方面，本发明涉及包括来自细胞原生质体的微泡的组合物。

本发明中可使用的细胞的例子包括具有细胞壁的细菌、古细菌、真菌、植物细胞、L型细菌(或细胞壁缺陷型(CWD)细菌，但不限于此。细菌可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性的。例如，可以使用大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)，其分别为革兰氏阴性和革兰氏阳性。

另外，本发明中可使用的细胞是“天然存在的细胞”及“转化细胞”。

如本文所使用的术语“天然存在的细胞”是指包括可引导至特定细胞或组织的细胞，表达特定物质的细胞。

如本文所使用的术语“转化细胞”是指包括，但不限于，已转化的具有减弱的毒性或细胞壁合成抑制的细胞；已转化的表达诊断、治疗、接种疫苗、靶向或细胞膜与靶细胞融合（融合剂）所需物质的细胞；及其混合物。

此外，“转化细胞”包括已转化两次或多次的细胞，及以防止细胞表达特定蛋白的方式转化的细胞。

在本发明的一个实施方案中，转化细胞可被转化以表达物质，所述物质选自细胞粘附分子、抗体、靶向蛋白、融合剂及融合蛋白组成的组。

关于“细胞转化”，可通过将外源基因导入细胞，用物质处理细胞，或向细胞施加物理/化学/生物/电/机械刺激而完成。

如本文所使用的术语“原生质体”涉及细胞壁完全去除或部分去除的细菌、古细菌、真菌或植物细胞，其脂双层膜裸露，因此包括完全去除细胞壁的原生质体，只有部分细胞壁去除的球状体，及“L型细菌”，但不限于此。

“L型细菌”包括天然存在的细胞和转化细胞，但不限于此。

如本文所使用的术语“来自原生质体的微泡”是指亚原生质体大小的囊泡，其内部与外部环境只通过脂双层膜分离，所述脂双层膜由细胞膜脂质、膜蛋白和细胞质成分组成。

本发明中使用的“来自原生质体的微泡”的例子包括，但不限于，原生质体自发分泌的微泡，使用物理、机械、电气或化学方法由原生质体人工合成的微泡，及通过特定物质处理或通过转化制备的微泡，所述处理或转化诱导原生质体分泌微泡。

在本发明的一个实施方案中，微泡可与作为来源的质膜保持相同的膜拓扑结构。

在本发明的另一个实施方案中，微泡可包括，但不限于，包涵体。

在本发明的另一个实施方案中，微泡还可包括除了来自作为来源的原生质体细胞膜的组分以外的膜内组分。

除了来自细胞膜的组分以外的组分可包括靶标分子、融合剂、环糊精及聚乙二醇，但不限于此。另外，可使用多种方法加入除了来自细胞膜的组分以外的组分，所述方法包括细胞膜的化学改性。

根据本发明的另一实施方案，微泡的膜组分可以化学改性。例如，其可用巯基(-SH)或胺基(-NH₂)化学改性，或通过将靶标分子、融合剂或聚乙二醇与膜结合而化学改性。

根据另一方面，本发明涉及包括微泡的药物组合物，所述微泡负载诊断、治疗、接种疫苗、靶向、细胞膜与靶细胞融合或减少副作用及改善体内外稳定性所需的物质。

如本文所使用的，“负载”物质到来自原生质体的微泡中是指诊断、治疗、接种疫苗、靶向、细胞膜与靶细胞融合或减少副作用及改善体内外稳定性所需的一种或多种物质显露在微泡表面或包囊于微泡内，但本发明不限于此。

负载于来自原生质体的微泡的物质可来自作为微泡来源的细胞(包括天然存在的细胞和转化细胞)。也就是说，本发明中使用的细胞包括天然表达治疗物质、诊断物质或疫苗物质的细胞或被转化以表达所述物质的细胞。

在本发明的一个实施方案中，可使用已转化的表达物质的细胞以负载靶向蛋白于来自原生质体的微泡内，所述物质选自细胞粘附分子、抗体、靶向蛋白、融合剂及融合蛋白组成的组，但不限于此。靶向蛋白可显露于来自原生质体的微泡上或封闭于其中。

细胞转化可通过刺激细胞或向细胞导入外源基因以改性，例如，上调或下调目的蛋白的表达而完成。导入外源基因可能诱导或抑制目的蛋白的表达。

在这方面，使用磷酸钙沉淀法、脂质体介导、电穿孔、显微注射或其他本领域已知的方法将质粒DNA、RNA或病毒导入细胞中。在原生质体被转化以表达蛋白或抗体后，可从细胞中构建微泡，所述蛋白或抗体能够单独地结合癌细胞、组织或血管或炎症组织或作为其表面的融合蛋白与之结合。

可使用miRNA、siRNA或反义RNA下调目的蛋白的表达。当由细胞原生质体构建的微泡朝向两个靶标时，细胞可以这种方式转化，其中抑制一种或多种特定蛋白的蛋白以降低细胞至两个靶标中的一个的引导，意味着递送用于来自转化细胞的微泡的物质的特异性增加。可选地，可使用经过两轮或更多轮转化的细胞。例如，初级转化株在用作构建微泡的原生质体来源前可经过次级转化。

在单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞及干细胞至特定组织的引导中涉及多种质膜蛋白。例如，包括整合素的细胞粘附分子存在于单核细胞表面，所述整合素诸如LFA-1(白细胞功能相关的抗原-1)和Mac-1(巨噬细胞-1抗原)。这些细胞粘附分子可在血管细胞上结合其他细胞粘附分子，诸如ICAM-1(细胞间粘附分子-1)和VCAM-1(血管细胞粘附分子-1)。LFA-1和ICAM-1之间的相互作用使得单核细胞通过血管内皮细胞以将单核细胞引导至炎症组织或癌组织。当细胞被转化了表达特异于癌症或目的组织的质膜蛋白时，细胞可被引导至各种组织包括癌组织或炎症组织。例如，细胞膜蛋白ERBB2在乳腺癌细胞表面过表达。通过转化T细胞以表达改性细胞受体(TCR)使T细胞靶向癌细胞。如果转化T细胞以表达融合蛋白，T细胞可朝向乳腺癌组织，在所述融合蛋白中TCR在其外部区域与识别ERBB2的抗体融合并在其胞质域与负责细胞内信号转导的CD3ζ(zeta)融合。此外，如果转化T细胞以表达融合蛋白，可将T细胞引导至大肠癌、胰腺癌及肺癌组织，在所述融合蛋白中识别癌组织中大量存在的癌胚抗原的抗体与CD3ζ融合。可将由表达蛋白或融合蛋白的细胞中构建的来自原生质体的微泡引导至目的组织，但靶标分子不限于上述说明的蛋白或融合蛋白。

在本发明的另一个实施方案中，微泡可由适于表达物质的细胞制备，所述物质选自由细胞因子、生长因子、细胞粘附分子、抗体、受体及其组合组成的组。

负载于来自原生质体的微泡的物质可以不来自源细胞，而是细胞外源的。负载物质可以是同源的或异源的。

使用下列方法之一，本发明的微泡可负载不是来自源细胞而是细胞外源的物质：负载物质1)直接于细胞中；2)在原生质体来自细胞后；3)构建微泡后；及4)构建来自原生质体的微泡后。

此外，可使用但不限于，物理、化学和/或生物方法将物质负载于微泡表面。

详细地，各种外源物质可如下所示负载于本发明的微泡：

首先，由已负载各种目的治疗物质、诊断物质和/或疫苗物质的细胞制备微泡。例如，当细胞在含有目的治疗物质或诊断物质的培养基中培养时，细胞其中可含有该物质。可选地，可通过电穿孔将物质导入细胞。通过超声波降解、挤压或机械降解从含有所述物质的细胞自发脱落的或由细胞构建的微泡负载所述物质。

接着，可由已负载各种目的治疗物质、诊断物质和/或疫苗物质的原生质体制备微泡。例如，当原生质体从细胞中转化后，在含有目的治疗或诊断物质的培养基中培养，原生质体可能含有所述物质。可选地，可通过电穿孔将物质导入原生质体中。通过超声波降解、挤压或机械降解从含有所述物质的原生质体自发脱落的或由原生质体构建的微泡负载所述物质。

一方面，所述物质可在微泡的构建过程中负载于微泡中。例如，当含有目的物质的原生质体悬浮液通过亚原生质体大小的过滤器挤压时，形成了负载所述物质的微泡。

在另一个替代方案中，由原生质体构建或形成微泡后，微泡负载目的物质。例如，可通过培养具有所述物质的微泡悬浮液或将所述物质电穿孔至已制备的微泡完成负载。

然而，本领域技术人员应理解的是目的物质负载于微泡不限于上述说明的方法。

能够负载于本发明的来自原生质体的微泡的治疗和/或诊断物质是抗癌剂、抗炎剂、血管生成抑制剂、肽、蛋白质、毒素、核酸、小珠、微粒及纳米粒子，但本发明不限于此。

抗癌剂是抑制癌细胞生长和转移而使用的药物的通用术语。多数抗癌剂用作阻止癌细胞的复制、转录和/或翻译。不赋予本发明中使用的抗癌剂种类特殊限制。根据一般原则选则抗癌剂，其中考虑癌细胞种类、抗癌剂的吸收率(治疗的持续时间、给药途径等)、肿瘤位置、肿瘤大小等。本发明中使用的抗癌剂的例子包括DNA烷化剂，诸如二氯甲基二乙胺、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸、芥子、环磷酰胺、异环磷酰胺、亚硝脲氮芥(BCNU)、环己亚硝脲(CCNU)、链脲菌素、二甲磺酸丁酯、三胺硫膦、顺铂及卡铂，抗癌抗生素，诸如更生霉素(放线菌素D)、多柔比星(阿霉素)、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、普卡霉素、丝裂霉素及C博来霉素及植物生物碱，诸如长春新碱、长春碱、紫杉醇、多西紫杉醇、柔红霉素、红豆杉醇、长春新碱、泼尼松、顺铂、赫赛汀、利妥昔单抗、依托泊苷、替尼泊苷、拓扑替康及伊立替康。同样，可使用本领域已知的放射性物质。然而，本发明中使用的抗癌剂不限于上述例子。

此外，负载于本发明的来自原生质体的微泡的抗炎剂选自由地塞米松、甲强龙、阿司匹林、吲哚美辛、布洛芬、氯倍他索丙酸酯、二氟拉松双乙酸盐、卤倍他索丙酸酯、安西奈德、醋酸氟轻松、糠酸莫米松、去羟米松、双氯芬酸及吡罗昔康组成的组，但不限于此。

如本文所使用的术语“癌症”涉及一组不同疾病，其特征在于由于程序性细胞凋亡的破坏引起的不受调控的细胞生长并浸润到临近组织。根据本发明待处理的靶标可选自下列癌症，但不限于此，源于上皮细胞的癌症，诸如肺癌、咽喉癌、胃癌、大肠癌/直肠癌、肝癌、胆囊癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、肾癌、皮肤癌等，源于结缔组织细胞的肉瘤，诸如骨癌、肌肉癌、脂肪癌、纤维细胞癌等，来自造血细胞的血癌，诸如白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤等，及神经瘤，神经组织肿瘤。

如本文所使用的术语“血管病”涉及一组不同疾病，其中由于代谢性、感染性、毒性或免疫原因引起血管或血管壁内出现功能异常。根据本发明待处理的靶标可选自下列血管病，但不限于此，动脉硬化（或粥样硬化）、心绞痛、急性心肌梗死、中风、血管性痴呆、代谢性血管病，诸如缺血性血管病，及传染性、毒性或免疫血管病，诸如败血症、弥漫性血管内凝血、血栓栓塞、血管炎、肾炎、急性呼吸窘迫综合征、肺气肿等。

如本文所使用的术语“炎症”涉及包括水肿（因体液在组织中异常积累），由于血管扩张引起的充血，由热原及血管扩张增加的热量，及花生四烯酸代谢导致的疼痛的综合症或症状。根据时间，炎症可分为急性炎症、亚急性炎症和慢性炎症，根据病理生理条件，炎症可分为传染性炎症、过敏性炎症、自身免疫性炎症、毒性炎症、代谢性炎症和创伤性炎症。根据本发明待处理的靶标可选自以下组成的组中，但不限于此，呼吸道炎症性疾病，诸如鼻炎、鼻窦炎、中耳炎、鼻咽炎、喉炎、支气管炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张、细支气管炎、肺炎、肺纤维化等，消化系统的炎症性疾病，诸如口腔炎、食管炎、胃炎、胃溃疡、肠易激综合征、溃疡性结肠炎、胆囊炎、胆管炎、胰腺炎、肝炎等，皮肤炎症，诸如过敏性皮炎、牛皮癣等，心血管炎症疾病，诸如心内膜炎、心肌炎、心包炎、脉管炎、动脉硬化症、败血症等，内分泌系统的炎症性疾病，诸如甲状腺炎、甲状旁腺炎、糖尿病等，泌尿生殖系统的炎症性疾病，诸如肾炎、肾病、间质性肾炎、睾丸炎、卵巢炎、子宫内膜炎、阴道炎等，肌肉骨骼系统的炎症性疾病，诸如类风湿关节炎、椎关节炎、骨关节炎、痛风、系统性红斑狼疮、系统性硬化症、肌病、干燥综合征和白塞氏病，及神经系统的炎症性疾病，诸如血管性痴呆、阿尔茨海默氏病、神经退行性疾病、抑郁症、精神分裂症等。

如本文所使用的术语“血管生成抑制剂”涉及功能为抑制新血管从已存在的血管生长的药物。多数血管生成抑制剂具有抑制肿瘤生长和转移及炎症反应的功能。不赋予作为本发明的治疗物质的血管生成抑制剂的种类特殊限制。

负载于本发明的来自原生质体的微泡的治疗或诊断物质可包括蛋白质或肽类。举例来说，可使用生长因子，诸如VEGF(血管内皮生长因子)和EGF(表皮生长因子)，细胞因子，诸如IL-1(白介素-1)、干扰素(IFN)-γ和IL-10，抗体疗法，脱氧核糖核酸酶，及各种抑制癌细胞生长和转移及炎症反应的蛋白质或肽，但不限于此。

所述蛋白质或肽类可在细胞内表达或显露在质膜上。此外，其全部或活性位点可单独表达或作为融合蛋白。已知由于具有较高的局部浓度，蛋白质或肽显露在质膜上时蛋白质或肽的活性高于其在细胞内表达的活性。因此，负载于微泡表面的蛋白质或肽可作为配体显露以触发信号，如细胞粘附分子、生长因子、细胞因子、或其融合等；或作为配体捕获抑制各种配体的功能，如抗体、受体，或其融合体。然而，在本发明中用作配体显露或配体捕获的蛋白质或肽不限于上述例子。

此外，负载于本发明的来自原生质体的微泡的治疗物质或诊断物质可包括毒素。术语“毒素”涉及在活细胞或生物体内产生的毒性物质，与机体组织接触或被机体组织吸收时其能够导致疾病。使用毒素可诱导细胞死亡。不赋予用作本发明治疗物质的毒素的种类特殊限制。

负载于来自原生质体的微泡的核酸可选自由DNA、RNA、适配体、LNA(锁定核酸)、PNA(肽核酸)及吗啉寡聚核苷酸组成的组。详细地，核酸的例子包括DNA、miRNA、siRNA、反义RNA、正义RNA，及核酸同系物，诸如LNA、PNA、吗啉代等，但不限于此。这些核酸可用于引发正义效应、反义效应、RNA干扰或抑制蛋白质功能。

在本发明中，可将负载编码荧光蛋白或具有各种荧光的核酸的来自原生质体的微泡用于诊断。设计为靶向特定细胞或组织的来自原生质体的微泡负载携带编码荧光蛋白的基因的质粒DNA并导入体内时，从荧光蛋白发射的荧光信号使得能识别靶细胞或靶组织的存在。此外，荧光量子点或其他各种荧光可负载于来自原生质体的微泡并用于检测体内靶细胞和靶组织的位置。即，靶细胞或靶组织产生的荧光可用于诊断。另外，因为其诱导细胞凋亡，所以荧光发光的量子点可用于治疗疾病。

除了荧光的治疗物质或诊断物质可负载于来自原生质体的微泡，还可负载于来自原生质体的微泡的例子为微粒或纳米粒子。所述例子包括氧化铁颗粒、金颗粒和碳纳米管，但不限于此。磁珠可用作治疗物质或诊断物质并负载于微泡。磁性粒子诸如氧化铁可用作MRI的图像对比剂。此外，也可以使用与纳米颗粒结合的核酸或蛋白质。还可以使用诊断性的放射性物质。

根据另一方面，本发明涉及包括负载疫苗物质的来自原生质体的微泡的药物组合物。

可负载于本发明的来自原生质体的微泡的疫苗物质的例子可包括抗原、免疫增强剂及免疫调节剂。也可使用其他各种疫苗物质，而无限制。

抗原可以来自病毒或细菌且可以是蛋白质抗原或非蛋白抗原，诸如脂质/碳水化合物。此外，抗原可以是来自特定癌细胞的蛋白质。抗原可以是同源的或是两种或多种不同抗原的组合。例如，两种或多种不同的细菌抗原可负载于微泡。可选地，可同时负载细菌抗原、来自癌细胞的抗原及病毒抗原。

本发明中使用的细菌抗原可来自，但不限于，肠杆菌属(产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）和阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）)、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiellapneumonia）、鲍氏不动杆菌（Acinetobacter baumannii）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）及粪肠杆菌（Enterococcus faecalis）。

负载于本发明微泡的病毒抗原可来自，但不限于，人类免疫缺陷性病毒(HIV)、人乳头瘤病毒(HPV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)或流感病毒。

另外，抗原可来自细胞自身，不论细胞是天然存在的还是转化的，其作为构建来自原生质体的微泡的来源，或者抗原可以是细胞外源的物质。例如，来自病毒、细菌、癌细胞或癌组织的组分的全部或部分可作为外源抗原负载于微泡。

作为增强抗体应答或T细胞免疫应答的免疫增强剂，可负载双链RNA(dsRNA)、霍乱毒素和/或明矾。为了增加抗原特异性免疫应答的负载的免疫调节剂是细胞因子，诸如IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、IL-17和IFN-γ，及生长因子，诸如VEGF和成纤维细胞生长因子(FGF)-2。

除了选自抗癌剂、抗炎剂、血管生成抑制剂、肽类、蛋白质、毒素、核酸、小珠、微粒、纳米粒子及其组合之外，本发明的药物组合物可包含药学上可接受的载体，例如，盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、环糊精、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇、脂质体或其组合。如果必要，所述药物组合物还可进一步包含典型的添加剂，诸如抗氧化剂、缓冲剂等。另外，借助稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和/或润滑剂，所述药物组合物可配制成注射液，诸如水溶液、悬浮液、乳化液等，丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂。此外，根据本领域众所周知的方法或Remington's Pharmaceutical Science,Mack Publishing Company,Easton PA中公开的方法，所述药物组合物可配制成合适的剂型。不赋予药物组合物的制剂特殊限制。优选地，所述药物组合物可配制成注射或吸入形式。

不赋予本发明药物组合物的施用以特殊限制。所述药物组合物可口服或肠胃外施用，诸如静脉内、皮下、腹腔内，经由吸入或局部地施用。在本发明药物组合物中活性成分的量可依据各种因素变化，所述因素包括患者体重、年龄、性别和健康情况、饮食、给药时间、给药途径、排泄速率、疾病严重程度等。术语“日剂量”是指本发明治疗有效成分的量，当施用于需要的受试者时其足够缓解病情。本发明药物组合物中活性成分的合适剂量取决于负载化合物的种类、疾病严重程度、需要治疗的受试者的情况，并由本领域技术人员决定。例如，本发明组合物的合适剂量可依据患者体重、年龄、性别和健康情况、给药途径和疾病严重程度变化，对于体重70kg的成年患者通常的剂量变化范围为0.1至1000mg/天，且优选地1至500mg/天。本发明药物组合物的总有效量可以单剂量施用于患者，或通过分级的治疗方案施用，其中在更长时间内多剂量施用。

如本文所使用的术语“受试者”涉及需要治疗癌症、血管疾病或炎症疾病的动物，包括人类、非人哺乳动物诸如灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马、牛等。

根据还一方面，本发明考虑的是用于递送治疗物质、诊断物质和/或疫苗物质的组合物，其包括本发明的来自原生质体的微泡。

根据还另一方面，本发明考虑的是用于递送治疗物质、诊断物质和/或疫苗物质的系统，其包括本发明的来自原生质体的微泡。

治疗物质、诊断物质和/或疫苗物质如上所述。

根据又另一方面，本发明涉及负载治疗物质、诊断物质和/或疫苗物质的来自原生质体的微泡的制备方法。

所述微泡可以是从细胞自然脱落的微泡或人工合成的微泡。

可使用各种机械、电气或化学方法构建根据本发明的来自原生质体的微泡。所述方法的例子包括使用渗透作用、电穿孔、超声处理、均质化、洗涤剂处理、冻融、挤压、机械降解和化学处理的细胞溶解，但不限于此。在机械降解方法中，细胞溶液与金属、陶瓷或足够坚硬的塑料球一起振摇。在挤压的情况下，强制细胞按顺序地通过过滤器，开始孔径较大并下降到较小孔径。例如，细胞按顺序地通过三个过滤器，其孔径分别为10μm→5μm→1μm以形成微泡。

在一个实施方案中，根据本发明的制备方法包含以下步骤：去除细胞的细胞壁以提供原生质体；在原生质体悬浮液中构建微泡；及从悬浮液中分离微泡。

在另一个实施方案中，根据本发明的制备方法包含以下步骤：外部加载治疗物质、诊断物质或疫苗物质至细胞中并去除细胞的细胞壁以提供原生质体；在原生质体悬浮液中构建微泡；及从悬浮液中分离微泡。

在另一个实施方案中，根据本发明的制备方法包含以下步骤：去除细胞的细胞壁以提供原生质体；外部加载治疗物质、诊断物质或疫苗物质至原生质体；在负载物质的原生质体悬浮液中构建微泡；及从悬浮液中分离微泡。

在另一个实施方案中，根据本发明的制备方法包含以下步骤：去除细胞的细胞壁以提供原生质体；在存在治疗物质、诊断物质或疫苗物质的原生质体悬浮液中构建微泡；及从悬浮液中分离微泡。

在另一个实施方案中，根据本发明的制备方法包含以下步骤：去除细胞的细胞壁以提供原生质体；在原生质体悬浮液中构建微泡；将治疗物质、诊断物质或疫苗物质添加到微泡悬浮液以将所述物质负载于微泡；及从悬浮液中分离负载治疗物质、诊断物质或疫苗物质的微泡。

在另一个实施方案中，根据本发明的制备方法包含以下步骤：去除细胞的细胞壁以提供原生质体；在原生质体悬浮液中构建微泡；从悬浮液中分离微泡；并将治疗物质、诊断物质或疫苗物质添加到分离的微泡悬浮液中以使所述物质负载于微泡。

所述方法还可能包含从微泡悬浮液中分离负载治疗物质、诊断物质或疫苗物质的微泡。

可使用选自由超速离心、密度梯度、过滤、透析和自由流动电泳组成的组中的方法进行分离。

区分具有不同密度的材料最流行的方法之一密度梯度法，可应用于本发明的微泡分离，因为其密度与游离分子的密度不同。在密度梯度方法中，使用的介质可选自，但不限于聚蔗糖、甘油、蔗糖及OptiPrep^TM。负载或未负载治疗或诊断物质的微泡可利用其密度差异相互分离。密度梯度方法还可用于与离心或电泳组合。微泡还可通过凝胶过滤或超滤作用分离。可采用透析替代过滤去除小分子。另外，自由流动电泳可用于分离本发明的微泡。

根据用途，可在使用前选择在一定尺寸范围之内的微泡。可在治疗物质或诊断物质负载之前、之间或之后进行选择在一定尺寸范围之内的微泡。

负载于来自原生质体的微泡的治疗物质、诊断物质和/或疫苗物质如上所述，且不附加特殊限制。

例如，负载于来自原生质体的微泡的物质可来自作为来自原生质体的微泡的来源的细胞，或可是细胞外源的。所述物质可以是单一的物质或一种或几种不同物质的组合。将治疗物质、诊断物质和/或疫苗物质负载于来自原生质体的微泡是指所述物质显露于来自原生质体的微泡表面或将所述物质封闭在微泡内，但本发明不限于此。

在本发明的另一个实施方案中，制备方法可进一步包含改性部分膜组分。改性细胞膜组分具有各种方法。例如，当由融合蛋白和细胞的混合物构建微泡时，融合蛋白显露于微泡上。用聚乙二醇涂层微泡可将微泡转化为隐身微泡。加入环糊精至微泡可降低微泡的非特异性靶向。当同时显示亲水性和疏水性的环糊精附着于微泡表面时，可用作阻断脂质之间的非特异性结合。微泡可被化学改性。例如，从膜蛋白或跨膜蛋白暴露外面的细胞构建微泡后，各种分子可在蛋白质的暴露区域与半胱氨酸残基的硫醇基化学结合。还可通过各种分子与膜蛋白的胺基结合完成化学改性。

根据本发明的另一个实施方案，制备方法可进一步包含去除膜拓扑结构与来源的原生质体不同的微泡。在构建微泡后，根据用途来选择与源细胞具有相同膜拓扑结构的微泡。使用识别膜蛋白胞质区的抗体，可去除胞质区暴露于外部的微泡。即，质膜内朝外的微泡被去除，只保留膜蛋白胞外区被定位以朝向外部的微泡。

根据又一方面，本发明涉及递送治疗物质、诊断物质和/或疫苗物质至特定细胞或组织的方法，其包括使用负载所述物质的来自原生质体的微泡。

详细地，递送治疗物质、诊断物质和/或疫苗物质至特定细胞或组织的方法包含使用来自原生质体的膜的微泡，所述微泡尺寸小于原生质体且负载所述物质。如果必要，负载靶分子和/或融合剂的来自原生质体的微泡可用于递送治疗物质、诊断物质和/或疫苗物质至特定细胞或组织。

对特定细胞或组织不施加限制。例如，特定细胞可以是内皮细胞、癌细胞、炎症细胞或免疫细胞。特定组织包括血管、癌组织和炎症组织。另外，治疗物质、诊断物质和/或疫苗物质如上所述。

在本发明的一个实施方案中，两种或多种不同物质可递送至特定细胞或组织。

在本发明的另一个实施方案中，两种或多种不同微泡可用于递送所述物质，所述微泡选自负载一种物质的微泡、负载两种或多种物质的微泡，及其组合。例如，两种或多种不同微泡可同时施用。

在本发明的另一个实施方案中，两种或多种不同微泡按可顺序地施用，所述微泡选自负载一种物质的微泡、负载两种或多种物质的微泡，及其组合。

详细地，同时负载两种或多种不同物质的微泡可用于递送物质。可选地，单独或组合地负载不同物质的微泡组合使用，以递送两种或多种不同物质。为了递送三种不同物质，例如，第一、第二和第三微泡可分别负载三种不同物质。另一方面，同时负载两种不同物质的第四微泡及负载另一种不同物质的第五微泡可用于递送三种不同物质。第一、第二和第三微泡可同时或顺序地使用。同样地，第四和第五微泡可同时或顺序地使用。

如果必要，在构建来自原生质体的微泡期间，可使用核酸酶以从微泡去除对递送治疗物质、诊断物质和/或疫苗物质不必要的核酸。

根据另一方面，本发明设想了用于治疗物质和/或诊断疾病的方法，包括使用负载诊断或治疗物质的来自原生质体的微泡来递送所述物质至特定细胞或组织。即，微泡可用于递送诊断或治疗物质至靶细胞、组织或血液。

从细胞原生质体，微泡可容易地构建成各种尺寸，如脂质体，并负载各种需递送的治疗物质、诊断物质或疫苗物质。因此，微泡可单独或组合用于治疗或诊断或同时治疗与诊断(治疗诊断，药物诊断)。在这方面，当递送的物质被封闭时其存在于微泡内，当所述物质与受体结合时其存在于微泡表面，或当所述物质包埋或嵌入其中（像跨膜蛋白）时其存在于脂质双分子层内。

由于EPR(增强性渗透和滞留)效应，通常尺寸为100nm或更大的分子在癌组织中比其在正常组织中积累时间更长。因此，负载尺寸为100nm或更大的微泡的药物有利于诊断和治疗，因为药物能够在癌组织中停留更长时间，因此提高治疗或诊断效果。在另一方面，当吸入时，由于肺组织的结构特点，只有尺寸1μm或更小的颗粒允许到达肺泡。一种物质，例如，用于治疗哮喘的炎症抑制剂，如果其负载于尺寸小于1μm的微泡可将所述炎症抑制剂递送至肺组织。如所描述的，可依据负载的物质应用的组织构建各种尺寸的微泡。优选地，本发明微泡的尺寸范围为10nm至10μm。

根据另一方面，本发明考虑的是用于预防和/或治疗疾病的方法，包括使用负载疫苗物质的来自原生质体的微泡递送疫苗物质至特定细胞或组织。疫苗物质如上所述。

根据另一方面，本发明涉及用于诊断疾病的试剂盒，其包括来自原生质体的、亚原生质体大小的微泡，所述微泡负载诊断所需的作为活性成分的引物、探针、反义核酸或抗体。

根据本发明的负载治疗物质和/或诊断物质的来自原生质体的微泡及其制备方法可应用于递送所述物质至体外和/或体内的靶细胞或靶组织。例如，负载酶、治疗物质、诊断物质或疫苗物质的来自原生质体的微泡及其制备方法可应用于体外实验。此外，基于通过体外实验获得的数据，微泡及其制备方法可应用于体内以将病变细胞改变成可医治的细胞，但本发明不限于此。

通过以下说明的实施例可更好地理解本发明，但所述实施例不应解释为对本发明的限制。

具体实施例

实施例1:通过用溶菌酶处理的来自革兰氏阴性菌的原生质体的制 备

参照图1，其示出了通过溶菌酶水解制备来自革兰氏阴性菌的原生质体，并从所述原生质体分离微泡，在每个步骤中向原生质体或微泡负载药物的示意图。

根据图1，由革兰氏阴性菌制备原生质体。关于这方面，在LB培养基中使革兰氏阴性菌大肠杆菌E.coli w3110msbB生长至O.D₆₀₀=1.0，并以3,000×g离心10分钟。由此获得的细胞微球重悬于10mL的原生质体缓冲液中，然后缓慢加入EDTA，至终浓度为0.01M，接着在37°C下以100rpm震荡培养40分钟。以3,000×g离心10分钟后，由此获得的细胞微球重悬于100mL的含有0.02M MgCl₂的原生质体缓冲液中。

在37°C下，存在2mg/mL的溶菌酶的条件下，以100rpm震荡培养悬浮液2小时，并以5,000×g离心10分钟从而获得作为微球的原生质体和含有外膜和细胞壁的上清液。原生质体微球悬浮于3mL的含有0.02M浓度的CaCl₂和MgCl₂的TBS（Tris缓冲盐水）。

为了验证制备的原生质体，用生物素标记细菌细胞，并且原生质体由标记有生物素的细菌细胞制备。以5,000×g离心10后，从含有蛋白质的上清液中分离完整的细胞。从制备的原生质体中去除来自样品的含有蛋白质的上清液，以及含有外膜和细胞壁的上清液后，将其单独与5x上样染料（250mM Tris-HCl、10%SDS、0.5%溴酚蓝、50%甘油）混合，使用的量为将上样染料的浓度稀释为1x。混合物在100°C下煮沸5分钟，并上样到8%的聚丙烯酰胺凝胶中。以80V电泳2小时后，蛋白质在400mA电流下转移2小时，到PVDF（聚偏二氟乙烯）膜上。该膜在3%的PBS的脱脂乳溶液中封闭2小时，在4°C下与过氧化物酶结合的抗生物素抗体一起培养12小时，并用PBS清洗30分钟，接着用ECL底物（增强的化学发光，Amersham Co.No.RPN2106）显影。结果如图2所示。

如图2所示，在细菌中检测到对生物素的抗体反应，而在原生质体中没有检测到该反应。同样地，在含有生物素酰化的外膜和细胞壁中观察到了对于生物素的抗体反应，这表明通过溶菌酶处理，已经去除了外膜和细胞壁。从这个结果来看，显而易见的是通过溶菌酶水解制备了不含外膜和细胞壁的原生质体。

实施例2:通过挤压构建来自革兰氏阴性菌的原生质体的微泡

根据图1所示的方案步骤，制备来自原生质体的微泡。根据图1中的要求，选择挤压和密度梯度。

在实施例1中制备的革兰氏阴性菌的原生质体通过膜过滤器过滤三次，膜过滤器的孔径按顺序依次为10μm、5μm和1μm。在5mL超速离心管中，按顺序地放置来自膜过滤器的1mL的50%OptiPrep,1mL的5%OptiPrep和3mL的细胞悬浮液流出物。以100,000×g超速离心2小时，在50%OptiPrep和5%OptiPrep之间形成微泡层。

实施例3:来自革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的原生质体的微泡的性 质

根据实施例1和2中的方法，由来自革兰氏阴性菌大肠杆菌（E.coli）和革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的原生质体构建微泡。

每个微泡在辉光放电碳包覆铜载网中吸附3分钟。用蒸馏水清洗该铜载网，并用2%的乙酸铀酰染色，然后在JEM101电子显微镜（Jeol,Japan）下观察。图3和4示出了电子显微镜图像。

图3和图4分别是来自革兰氏阴性菌大肠杆菌（E.coli）和革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌的原生质体的微泡的TEM(透射电子显微镜)图像。从图3和图4的TEM图像可以看出，通过挤压细菌细胞的原生质体而构建的微泡由脂质双层组成，并且来自革兰氏阴性菌的基本上是100~200nm大小的球形，来自革兰氏阳性菌的基本上是50~100nm大小的球形.

将每种微泡稀释成在1mL的PBS中的浓度为5μg/ml的稀释液，然后将其置于比色杯中，使用动态光散射（DLS）粒度分析器分析粒度。结果如图5和6所示。

图5和图6分别示出了由革兰氏阴性菌大肠杆菌（E.coli）和革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌的原生质体构建的微泡的粒径分布。如图5和6所示，来自革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的原生质体的微泡其粒径范围分别是100~200和50~100nm。

实施例4：来自细菌细胞和细菌原生质体的微泡的体外副作用比较

使用实施例1和2中描述的方法，由来自革兰氏阴性菌大肠杆菌（E.coli）和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（S.aureus）的原生质体制备微泡。分别地，使用常规方法制备来自革兰氏阴性菌的微泡[Proteomics.2007Sep;7(17):3143-53]和来自革兰氏阳性菌的微泡[Proteomics.2009Dec;9(24):5425-36]。

做一个检测以观察微泡是否激发免疫应答。为此，用来自细菌细胞和细菌原生质体的微泡处理巨噬细胞，使用ELISA定量分析由巨噬细胞分泌的促炎性细胞因子TNF-α。

在小鼠巨噬细胞(Raw 264.7)中，使用1,000ng/mL浓度的每种微泡以诱导免疫应答。处理16小时后，获得条件培养基，以500×g离心5分钟，从而获得上清。分别地，抗-TNF-α抗体涂覆的96孔板每孔用100μl的1%BSA/PBS封闭1小时。将条件培养基的上清稀释10倍，并将稀释液涂布于培养皿中，在室温下培养2小时。与生物素结合的TNF-α的检测抗体共同培养2小时后，用PBS中的0.05%吐温-20清洗培养皿。用链酶辛和素-POD处理20分钟，接着用BM-POD底物显影。

图7示出了存在衍生自革兰氏阴性菌的细胞或革兰氏阳性菌的原生质体的微泡的情况下，巨噬细胞分泌的TNF-α水平。图8示出了用衍生自革兰氏阳性菌的细胞或革兰氏阴性菌的原生质体的微泡处理的巨噬细胞分泌的TNF-α水平。

由图7的数据可以看出，来自革兰氏阴性菌细胞的微泡含有外膜和细胞壁，其激活了免疫应答，从而增加TNF-α分泌，而来自革兰氏阴性菌原生质体的微泡不含外膜和细胞壁，没有诱导TNF-α分泌，与对照组相同。

另外，如图8所示，来自革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌细胞的微泡以上升的水平诱导巨噬细胞分泌TNF-α，而在存在来自不含细胞壁的原生质体的微泡时，TNF-α分泌降低。

这些数据暗示，来自细菌原生质体的微泡以显著的低水平激发免疫应答，而且与来自细菌细胞的微泡相比，具有最小的副作用。

实施例5：来自细菌细胞和细菌原生质体的微泡的体内副作用比较

使用实施例1和2中描述的方法，制备来自革兰氏阴性菌大肠杆菌（E.coli）的原生质体的微泡。同样，制备来自革兰氏阴性菌细胞的微泡。

给小鼠腹腔内注射25μg的来自细菌细胞的微泡，或500μg的来自细菌原生质体的微泡，随着时间的推移，检查存活情况。结果如图9所示。

如图9所示，10只小鼠中有8只小鼠在注射来自细菌细胞的微泡48小时后死亡，而即使以20倍高剂量注射来自细菌原生质体的微泡后，也没有小鼠死亡。

给小鼠腹腔内注射5μg的来自细菌细胞或来自细菌原生质体的微泡6小时后，从小鼠中采集血样，并用于检测是否小鼠被诱导表达炎性细胞因子IL-6。为此，血样储存在室温下30分钟，然后在4°C下冷冻1小时以分离血清。血细胞以1,300×g离心20分钟。分别地，抗-IL-6抗体涂覆的96孔板每孔用100μl的1%BSA/PBS封闭1小时。将上清稀释4倍，并且将稀释液涂布于培养皿中，在室温下培养2小时。与生物素结合的IL-6的检测抗体共同培养2小时后，用PBS中的0.05%吐温-20清洗培养皿。用链酶辛和素-POD处理20分钟，接着用BM-POD底物显影。结果如图10所示。

由图10的结果可以看出，注射来自细菌细胞的微泡6小时以后，血液中的促炎性细胞因子IL-6增加，而在施用来自细菌原生质体的微泡的小组中，没有观察到变化。

上述获得的数据表明，当注射来自细菌细胞的微泡时，诱导全身性炎症反应，而即使施用高浓度的来自细菌原生质体的微泡时，也没有任何副作用。

实施例6：制备负载有细菌质粒的微泡

将用重组载体pMSCV-EGFP转染的DH5α或没有进行转染的DH5α进行培养，并使用与实施例1和2中相同的方法制备来自原生质体的微泡。使用EGFP引物，以微泡为模板，进行PCR(聚合酶链反应)。由此扩增的DNA通过琼脂糖凝胶电泳（TBE缓冲液,1%）验证，结果如图11所示。所述EGFP引物如下所示：

正向引物:5'-GGAATTCCATATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3'

反向引物:5'-ACGCGTCGACTTACTTGTACACCTCGTCCAT-3'

如图11所示，在负载有携带EGFP基因的质粒的微泡的琼脂糖凝胶中观察到了用EGFP引物扩增的基因，而在不含EGFP基因的微泡的泳道中没有检测到用EGFP引物扩增的基因。

为了检测负载至微泡的质粒的完整性，使用Geneall小量提取试剂盒GENEALL cat.#101-102)从微泡中提取质粒。提取的质粒通过热击转化到大肠杆菌（E.coli）BL21中。将该大肠杆菌菌株在37°C下于1mL的LB中培养1小时，并在37°C下在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养皿培养生长16小时。在培养皿中出现菌落后，使其在37°C下在含有氨苄青霉素的LB培养基中生长到O.D₆₀₀=1.0，之后使用Geneall小量提取试剂盒提取质粒。提取的质粒用限制性内切酶处理，以从pMSCV载体中分离EGFP基因，并通过琼脂糖凝胶（TBE缓冲液,1%）电泳检测。酶切图谱如图12所示。

如图12所示，从微泡中提取的pMSCV质粒携带有EGFP基因，与重组载体pMSCV-EGFP相同。

从该结果可以明显的看出，细菌质粒能够完整的负载于微泡中。

实施例7:制备负载有细菌质粒并能够将质粒输送到细菌的微泡

通过将质粒输送到细菌的能力检测来自细菌原生质体的微泡转移细菌的能力。首先，使用EGFP表达质粒构建绿色荧光细菌。为此，基于EGFP的DNA序列，设计带有质粒限制性内切酶位点的引物：

正向引物:5'-GGAATTCCATATGGGTGAGCAAGGGC GAGGA-3'

反向引物:5'-AGGCGTCGACTTACTTGTACAGCTCG TCCAT-3'

(粗体字母表示NdeI和SalI的限制性内切酶位点)

在引物存在下，在携带有GFP基因的基因组DNA上进行PCR，使用Quiaquick凝胶纯化试剂盒(QIAGEN,cat.#28104)纯化从PCR条带中获得的PCR产物。纯化的产物在37°C下，用限制性内切酶NdeI和SalI消化8小时，并且用Quiaquick PCR纯化试剂盒再次纯化，之后连接到用相同的酶消化的pHCE载体上。获得的重组载体命名为"pHCE-GFP"。

用重组载体pHCE-GFP通过热击转化大肠杆菌DH5α，并在37°C下于1mL的LB培养基中培养1小时，并在37°C下在含有氨苄青霉素的LB琼脂平板培养生长16小时。该转化结果通过菌落PCR和酶切图谱进行验证。

使用实施例1和2所公开的方法，从具有或没有重组载体pHCE-GFP的革兰氏阴性菌大肠杆菌构建分别负载有pHCE-GFP和没有pHCE-GFP的微泡。

用pHCE载体转化的细菌能够在琼脂平板上生长，是因为载体携带有抗氨苄青霉素的基因。当然，用pHCE-GFP转化的细菌出现绿色荧光，是因为在质粒中存在EGFP基因。

在37°C下，在常规LB板中培养大肠杆菌DH5α16小时，并且用10μg的负载有pHCE-GFP质粒的微泡涂覆。然后，随着时间推移，将细胞在含有氨苄青霉素的琼脂板上划线培养，接着检测绿色荧光的表达。

结果如图13所示，负载pHCE-GFP质粒的微泡将质粒递送到细胞，从而完成转化。

数据表明来自细菌原生质体的微泡能够负载质粒，并将其递送到细菌。

实施例8：负载细菌抗原蛋白的微泡的递送能力和免疫应答诱导

进行以下实验，以检测来自细菌原生质体的微泡是否能够用作抗原载体，以诱导抗体形成。为此，使用本身不能诱导抗体的EGFP检验微泡是否能够诱导EGFP抗体形成。

使用实施例1和2中公开的方法，分别构建负载pHCE-GFP或未负载pHCE-GFP的微泡，验证来自革兰氏阴性菌的大肠杆菌，是否转了实施例7中的重组载体pHCE-GFP。

进行如下实验，以验证微泡诱导抗体形成和引起免疫应答的能力。每隔7天，给小鼠腹腔内分别注射三次PBS，5μg的微泡、5μg的负载EGFP的微泡或相当于5μg的负载EGFP的微泡的2.5μg的EGFP。每组包括5只小鼠，最后一次注射七天后，从小鼠的眼睛抽取血样，并在室温下培养30分钟，4°C下储存1小时，以1,300×g离心20分钟。收集不含细胞的上清液。

按如下方法证实小鼠中的EGFP的特异性抗体的形成：用100ng的EGFP蛋白涂覆96孔板的每孔，并用100μl的3%BSA/PBS封闭1小时。将从小鼠血液中获得的上清稀释1000倍，加入到每孔中，并在室温下培养2小时，接着与HRP结合的抗鼠IgG抗体或抗鼠IgE抗体共同培养1小时。在用PBS中的0.05%吐温-20清洗之后用BM-POD底物显影。

在图14和15中，分别示出了特异于EGFP的IgG和IgE的RLU值。RLU值代表EGFP特异性抗体的相对量。如图14和15所示，当注射来自大肠杆菌的原生质体的携带有EGFP的微泡时，小鼠产生抗EGFP的IgG和IgE，但是当注射EFGP或不含EGFP的微泡时，不产生任何EGFP的抗体。

同样地，按如下方法检查记忆T细胞的形成：最后注射微泡三天后切除脾脏，碾碎脾脏获得细胞，并悬浮于DMEM缓冲液中的2.5%FBS中。以1,000rpm离心5分钟，获得微球形式的细胞。细胞微球重悬于5mL的RBC裂解液（0.15M NH₄Cl、10mM KHCO₃、0.1mM Na₂EDTA，pH 7.2）中以使红细胞裂解。再次以1,000rpm离心悬浮液5分钟，从而形成脾细胞微球。这些脾细胞以1x10⁵细胞/孔的密度播种于48孔板中，该板在前一天涂覆有1μg/ml的抗CD3和CD28抗体。在37°C下培养诱导T细胞因子表达12小时。此后，以800×g离心10分钟，并且再以3,000×g离心20分钟，收集不含细胞的上清液。

对上清液进行以下实验以检测在接种疫苗的小鼠中是否形成记忆T细胞。用T细胞因子IL-4、IFN-γ、IL-10和IL-17涂覆96孔板的每孔，并用100μl的1%BSA/PBS封闭1小时。将条件培养基的上清液稀释10倍，并将稀释液放置到培养皿中并在室温下培养2小时。与生物素结合的细胞因子的检测抗体共同培养2小时后，用PBS中的0.05%吐温-20清洗培养皿。用链酶辛和素-POD处理20分钟，接着用BM-POD底物显影。

在图16中，根据显影的RLU值分析的细胞因子的水平。从图16中的数据看以看出，当注射来自大肠杆菌的原生质体的负载有EGFP的微泡时，表达IL-4、IFN-γ、IL-10和IL-17，伴随有负责记忆免疫应答的记忆T细胞的产生。

结果表明微泡能够将其包裹的蛋白质（抗原）输送到免疫细胞中，并诱导体内抗原特异性免疫应答。

实施例9:制备负载细菌包涵体的微泡

当人工地过度表达后，发现细菌外膜蛋白OmpA为细胞内的包涵体。因此，人工地过度表达的OmpA能够作为指示剂，以指示微泡是否负载有包涵体。

将OmpA基因插入到pET-30a(+)中以构建重组的载体，将其命名为"pET-30a(+)-OmpA-His6"。

通过热击，用pET-30a(+)-OmpA-His6转化大肠杆菌BL21，在37°C下与1mL的LB培养基中培养1小时，并在37°C下于含有卡那霉素的LB琼脂板中生长16小时。一旦在琼脂板中形成菌落，将其挑出并进行测试，测试其是否含有pET-30a(+)-OmpA-His6。将菌落接种于含有卡那霉素的20mL的LB培养基中，并在37°C下生长至O.D₆₀₀=0.4，此时，将细胞在37°C下，在存在1mM的IPTG（异丙基β-D-硫代半乳糖苷）的情况下，培养3小时，以过度表达融合蛋白。也就是说，在转化的细菌中获得过度表达的OmpA-Histag。

使用实施例1和2公开的方法构建负载OmpA-Histag或未负载OmpA-Histag的微泡。此后，20μg的每种微泡单独地与5x的上样染料混合，使用的量为将上样染料的浓度稀释为1x。混合物在100°C下煮沸5分钟，并上样到12%的聚丙烯酰胺凝胶中。以80V电泳2小时后，蛋白质在400mA电流下转移2小时，到PVDF膜上。该膜在4°C下，在3%的PBS的脱脂乳溶液中封闭12小时，并在室温下用抗-Hig-tag抗体处理2小时，并用PBS清洗两次，在室温下与过氧化物酶结合的二级抗体一起培养1小时，再用PBS清洗30分钟，接着用ECL底物显影。结果如图17所示。

如图17所示，在来自OmpA-Histag-过度表达的细菌的原生质体的微泡中检测了到抗His-tag的抗体，而在不含OmpA-Histag的原生质体的微泡中没有检测到Histag蛋白。

因此，从该结果显而易见的是，包涵体负载到了微泡中。

实施例10:制备负载细菌外膜蛋白的微泡

用与实施例9相似的方法转化大肠杆菌，以过度表达OmpA、OmpC或OmpF。使用实施例1和2公开的方法，转化的细菌以1:1:1的比例混合，并用于构建来自原生质体的负载OmpA、OmpC和OmpF的微泡。

为了检测来自原生质体的微泡是否负载所有的OmpA、OmpC和OmpF，并且检测OmpA、OmpC和OmpF在微泡中的位置，进行了以下实验。首先，用胰蛋白酶处理来自细菌原生质体的微泡，从而消化膜蛋白的胞间域。在高温下使胰蛋白酶变性后，裂解微泡，从而向溶液中释放膜内和膜外蛋白，然后用各自融合了OmpA、OmpC和OmpF的His6tag特异性抗体处理。结果如图18所示。

基于事实上胰蛋白酶不能跨越原生质体，在裂解之前或之后，用胰蛋白酶处理微泡，以检测OmpA、OmpC和OmpF蛋白表达的位置。如果蛋白位于微泡外，因为蛋白被消化了，所以它们不能与抗体反应。另一方面，如果蛋白位于微泡内，即使用胰蛋白处理微泡后，蛋白仍然能与抗体反应。

从图18中的数据可以看出，甚至在用胰蛋白酶处理后，仍然检测到了抗原-抗体复合物，意味着几乎所有的OmpA、OmpC和OmpF都位于微泡内。这一结果表明了这样一种可能性，如果施用的同时被原生质体保护，OmpA、OmpC和OmpF可能避开炎性应答，而诱导免疫应答，从而发挥安全的疫苗作用。

实施例11：负载细菌外膜蛋白的微泡的疫苗活性

检测负载细菌外膜蛋白的微泡的疫苗活性。以40μg的剂量，每隔七天向小鼠腹腔内注射负载OmpA、OmpC和OmpF的来自原生质体的微泡三次。使用PBS作为对照。检验OmpA的特异性抗体的形成。最后一次注射七天后，从小鼠的眼睛抽取血样，并在室温下培养30分钟，4°C下储存1小时，以1,300×g离心20分钟。收集不含细胞的上清液。

用50ng的OmpA蛋白涂覆的96孔板的每孔，并用100μl的3%BSA/PBS封闭2小时。将从小鼠血液中获得的上清稀释1000倍，加入到每孔中，在室温下培养2小时，接着与HRP结合的抗鼠抗体培养1小时。在用PBS中的0.05%吐温-20清洗之后，用BM-POD底物显影。

在图19中，示出了根据显影的RLU值分析的OmpA特异性抗体的水平。

如图19所示，当注射来自原生质体的负载Omp蛋白的微泡时，小鼠产生OmpA的抗体。

另外，做以下实验以检测由微泡诱导的免疫应答是否对细菌具有疫苗效应。使大肠杆菌C4生长至O.D=1.0，并在PBS中稀释10倍。最后一次注射微泡七天后，在PBS中的细菌稀释液以100μl的剂量腹腔内注射到小鼠中。每6小时计算死亡的小鼠数目。

图20是注射细菌细胞后，随着时间推移的小鼠存活率曲线。从该曲线中可以看出，所有用微泡接种的小鼠存活，而用PBS组接种的小鼠，90%死亡，这表明来自原生质体的微泡可以用作递送抗原的载体，并在随后的细菌感染时诱导有效的免疫效应。

实施例12:制备负载黑素瘤抗原的微泡

进行以下实验，以检查是否来自细菌原生质体的微泡能够作为致癌的抗原载体，通过激发对癌细胞的免疫应答用于抗癌疫苗中。用编码Mart-1的基因转化细菌细胞，该基因已知为引起黑素瘤的致癌蛋白。

为了扩增Mart-1基因，基于Mart-1基因的碱基序列，合成了如下所示的具有特异性质粒限制性内切酶位点的引物：

正向引物:5'-GGAATTCCATATGCCCCAAGAAGAC-3'

反向引物:5'-AGGCGTCGACTCAGGGTGAATAAGG-3'

(粗体字母表示NdeI和SalI的限制性内切酶位点)

使用上述引物，并用鼠黑素瘤细胞B16BL6的基因组DNA作为模板，进行PCR。通过使用Quiaquick凝胶纯化试剂盒纯化由此获得的PCR产物。接着，纯化的产物在37°C下，用限制性内切酶NdeI和SalI消化8小时，随后用Quiaquick PCR纯化试剂盒再次纯化，之后将扩增的基因连接到用相同的酶消化的pET-30a(+)载体上。获得的重组载体命名为""pET-30a(+)-Mart-1-His6"。

通过热击，将重组载体pET-30a(+)-Mart-1-His6转化到大肠杆菌BL21中，然后在37°C下于1mL的LB培养基中培养1小时，并在37°C下在含有卡那霉素的LB琼脂板培养生长16小时。一旦在琼脂板中形成菌落，挑取一个菌落并进行测试，测试其是否含有pET-30a(+)-Mart-1-His6。该菌落接种于含有卡那霉素的20mL的LB培养基，并在37°C下生长至O.D600=0.4，此时，将细胞在37°C下，在存在1mM的IPTG（异丙基β-D-硫代半乳糖苷）的情况下，培养3小时。

使用实施例1和2中公开的方法构建负载Mart-1蛋白的微泡。

进行如下实验，以检测在微泡内Mar-1蛋白的翻译。为此，20μg的每种B16BL6细胞系的全细胞裂解物、负载Mart-1的微泡、和未负载Mart-1的微泡分别与5x的上样染料混合，使用的量为将上样染料的浓度稀释为1x。混合物在100°C下煮沸5分钟，并上样到12%的聚丙烯酰胺凝胶中。以80V电泳2小时后，蛋白质在400mA电流下转移2小时，到PVDF膜上。该膜在4°C下，在3%的PBS的脱脂乳溶液中封闭12小时，该膜在室温下用抗-Mart-1抗体处理2小时，并用PBS清洗两次，在室温下与过氧化物酶结合的二级抗体一起反应1小时，再用PBS清洗30分钟，接着用ECL底物显影。结果如图21所示。

如图21所示，在来自Mart-过度表达的细菌的原生质体的微泡中检测到了抗Mart-1的抗体，而在不含Mart-1的原生质体的微泡中没有检测到Mart-1蛋白。

实施例13：负载黑素瘤抗原的微泡对黑素瘤的免疫效果

以25μg的剂量，每隔七天向小鼠腹腔内注射实施例12中制备的负载Mart-1的微泡三次。第三次注射七天后，以1×10⁶细胞的剂量给小鼠皮下注射鼠黑素瘤细胞系(B16BL6)。从小鼠中切除形成了20天的癌组织，并称重。

结果如图22所示，从注射负载Mart-1蛋白的微泡的小鼠切除的癌组织的重量小于用PBS注射的小鼠中切除的癌组织。

根据上述结果，显而易见的是来自原生质体的微泡能够作为致癌抗原的载体，从而激发对癌症的免疫应答。

实施例14：制备来自细菌原生质体的负载EGF融合蛋白的微泡

通过使用细菌内膜蛋白PrsA将人EGF蛋白加载到原生质体的表面。为此，使用不含终止密码子的引物扩增从N末端到PrsA氨基酸序列第290位的编码多肽的基因，该引物基于已知的PrsA碱基序列进行合成，其中设置有限制性内切酶位点，所述引物如下所示：

正向引物:5'-CATATGAAGAAAATCGCAATAGCAG-3'

反向引物:5'-TCTAGATTTAGAATTGCTTGAAGATGAAG-3'

(粗体字母表示NdeI和XbaI的限制性内切酶位点)

在引物存在下，在枯草芽孢杆菌因的基因组DNA上进行PCR，使用Quiaquick凝胶纯化试剂盒纯化从PCR条带中获得的PCR产物。纯化的产物在37°C下，用限制性内切酶NdeI和XbaI消化8小时，并且用Quiaquick PCR纯化试剂盒再次纯化，之后连接到用相同的酶消化的pHCE载体上。获得的重组载体命名为“pHCE-prsA”。

为了使其融合到pHCE-prsA载体中，使用基于人EGF基因的碱基序列合成的引物扩增人EGF基因，该引物设置有特异性限制性内切酶位点，如下所示：

正向引物:5'-GCTCTAGAAATACTGACTCTGA ATGTCCC-3'

反向引物:5'-CAAGCTTTCAGCGCAGTTCC CACCACTTC-3'

（粗体字母表示XbaI和HindII的限制性内切酶位点）

在引物存在下，在人非小细胞癌细胞系A549的基因组DNA上进行PCR，使用Quiaquick凝胶纯化试剂盒纯化从PCR条带中获得的PCR产物。纯化的产物在37°C下，用限制性内切酶XbaI和HindIII消化8小时，并且用Quiaquick PCR纯化试剂盒再次纯化，之后连接到用相同的酶消化的pHCE-prsA载体上。获得的重组载体命名为“pHCE-prsA-EGF”。

用pHCE-prsA-EGF载体通过热击转化大肠杆菌DH5α之后，在37°C下于1mL的LB中培养1小时，并在37°C下在含有氨苄青霉素的LB琼脂板培养生长16小时。一旦在培养皿中形成菌落，挑取一个菌落并进行菌落PCR检测和限制性内切酶切测试，以检测其是否含有pHCE-prsA-EGF。

使用实施例1和2公开的方法，用pHCE-prsA-EGF载体转化的来自革兰氏阴性菌大肠杆菌或未转化的来自革兰氏阴性菌大肠杆菌，构建负载EGF融合蛋白的微泡或未负载EGF融合蛋白的微泡。此后，20μg的每种微泡单独地与5x的上样染料混合，使用的量为将上样染料的浓度稀释为1x。混合物在100°C下煮沸5分钟，并上样到12%的聚丙烯酰胺凝胶中。以80V电泳2小时后，蛋白质在400mA电流下转移2小时，到PVDF膜上。膜在4°C下，在3%的PBS的脱脂乳溶液中封闭2小时，该膜在4℃下用抗-EGF抗体处理12小时，并用PBS清洗两次，在室温下与过氧化物酶结合的二级抗体一起反应1小时，再用PBS清洗30分钟，接着用ECL底物显影。结果如图23所示。

如图23所示，在来自EGF融合蛋白-过度表达的细菌的原生质体的微泡中检测到了抗EGF的抗体，而在不含EGF融合蛋白的细菌的原生质体的微泡中没有检测到EGF蛋白。

该结果表明正确构建了负载EGF融合蛋白的微泡。

使用胰蛋白酶检测EGF融合蛋白是否位于微泡的外表面。基于事实上胰蛋白酶不能跨越原生质体，在检测EGF融合蛋白的活性之前，用胰蛋白酶处理微泡，消化细胞膜蛋白的胞间区域。在高温下使胰蛋白酶变性后，裂解微泡，从而向溶液中释放膜内和膜外蛋白，然后用EGF特异性抗体处理。结果如图24所示。

在图24中，“+”和“-”分别代表用胰蛋白酶处理和不用胰蛋白酶处理。

如图24所示，用胰蛋白酶消化后，没有检测到EGF抗体，可以推断EGF融合蛋白的EGF域指向微泡外部，并且负载有EGF融合蛋白的微泡特异性地靶向表达EGF受体的细胞。

实施例15：负载EGF融合蛋白的微泡的细胞特异性递送的体外试 验

为了检测负载EGF融合蛋白的微泡的体外细胞特异性递送，以2×10⁴细胞/孔的密度将人非小细胞肺癌细胞系A549播种到24孔板中，然后培养24小时。在A549细胞中，在细胞膜上发现大量EGF受体。

由实施例10中制备的来自大肠杆菌或表达EGF的大肠杆菌的原生质体，使用实施例1和2公开的方法制备微泡。DiI（1,1'-双十八烷基-3,3,3'3'-四甲基吲哚羰基氰基高氯酸盐,Invitrogen,No.V22885）以5μM的终浓度加入到来自大肠杆菌的原生质体的微泡中，并在室温下培养30分钟。DiI是一种红色荧光染料。

细胞用PBS清洗两次，将500μl的培养基加入到培养皿的每孔中，其中细胞在培养皿中涂覆，接着与10μg/ml的DiI标记的微泡培养20分钟。

细胞再次用PBS清洗，500μl不含血清的培养基和细胞跟踪溶液以5μM的终浓度加入到每孔中，之后培养30分钟。细胞再次用PBS清洗，并在每孔500μl的补充有血清的培养基中培养30分钟。在室温下，每孔中，用500μl的4%的低聚甲醛固定盖玻片10分钟，并在聚焦显微镜下观察。观察到DiI标记的微泡在罗丹明波长下，出现红色荧光，而具有GFP的细胞在FITC波长下，出现可视的绿色荧光。对细胞和微泡进行计数，并计算每孔的微泡数量。结果如图25所示。

如图25所示，当其来自不含EGF的大肠杆菌的原生质体时，结合A549细胞的微泡数量大约为每细胞1.2个，但是当其是来自负载EGF的大肠杆菌原生质体时，数量增加为约每孔7.9个。

从结果可以推断，负载EGF的微泡能选择性地融合细胞膜上表达EGF受体的细胞，像A549。

另外，进行如下实验以检测微泡与细胞的结合是否是由于EGF-EGF受体的特异性的相互作用而发生。将小鼠结肠癌细胞系CT26以2×10⁶细胞/孔的密度播种与12孔板中，并培养24小时。CT26在细胞膜上表达鼠EGF受体，并能够与人EGF结合。细胞用PBS清洗两次，将500μl的培养基加入到培养皿的每孔中，接着用100ng/ml EGF培养30分钟，从而去除未结合的EGF受体。过量的EGF蛋白用PBS洗脱，并且细胞用10μg/ml DiI标记的微泡培养20分钟。

细胞再次用PBS清洗，在每孔500μl补充有血清的培养基中培养30分钟。室温下，每孔用500μl的4%的低聚甲醛固定盖玻片10分钟，观察到DiI标记的微泡在罗丹明波长下，在荧光显微镜下出现红色荧光。

当EGF受体已经被游离的EGF蛋白占据时，如图26所示，红色荧光信号表明进入细胞的微泡消失，与EGF受体不提前用不含EGF蛋白处理的情况相反。

上述获得的数据表明通过EGF和EGF受体的相互作用，负载EGF融合蛋白的微泡特异性与表达EGF受体的细胞融合。

实施例16：负载EGF融合蛋白的微泡的细胞内信号转导

以1×10⁵细胞/孔的密度将人非小细胞肺癌细胞系A549播种到6孔板中，然后培养16小时。细胞用PBS清洗两次，并在不含血清的培养基中培养16小时。然后，细胞与实施例14中制备的10μg/ml的负载EGF融合蛋白的微泡或未负载EGF融合蛋白的微泡一起培养10分钟。用PBS清洗A549细胞两次，并在每孔含有磷酸抑制剂的150μl的M-PER(Pierce)中裂解，以获得全细胞裂解物。

此后，20μg的每种全细胞裂解物分别地与5x的上样染料混合，使用的量为将上样染料的浓度稀释为1x。混合物在100°C下煮沸5分钟，并上样到10%的聚丙烯酰胺凝胶中。以80V电泳2小时后，蛋白质在400mA电流下转移2小时，到PVDF膜上。膜在3%的PBS的脱脂乳溶液中封闭2小时，在4°C下，该膜用EGF受体抗体、磷EGF受体抗体和Erk抗体或磷Erk抗体处理12小时，并用PBS清洗两次，在室温下与过氧化物酶结合的二级抗体一起反应1小时，再用PBS清洗30分钟，接着用ECL底物显影。结果如图27所示。

如图27所示，用负载EGF融合蛋白的微泡处理，通过诱导EGF受体的磷酸化，触发了EGF信号转导途径，其刺激下游信号级联，例如，Erk的磷酸化。使用Erk受体和Erk蛋白作为对照。

这些结果可以推断负载EGF融合蛋白的微泡能够与EGF受体结合。

实施例17：制备同时负载抗癌药物和EGF融合蛋白的微泡以及选 择性递送的体内实验

根据实施例14的方法制备负载EGF融合蛋白的微泡，充分混合，并在4°C下与400μg/ml阿霉素、抗癌药物一起培养12小时。此后，以100,000×g超速离心悬浮液2小时。微球重新悬浮于TBS中从而获得负载阿霉素的微泡。

过度表达EGF受体的人肺癌细胞系A431以1x 10⁶的剂量给小鼠皮下注射，并培养7天。移植癌细胞七天后，通过尾静脉给小鼠注射PBS、含有50μg的负载阿霉素的微泡的PBS、含有50μg负载阿霉素和EGF融合蛋白的微泡、或含有80μg阿霉素的PBS。注射后6小时从小鼠中切除癌组织。并在4%低聚甲醛中固定24小时。为了脱水，将固定的组织浸没在70%的乙醇中1次，95%的乙醇中4次，100%的乙醇中3次，以及100%的二甲苯中3次，所有的情况下，每次均浸没1小时。此后，用石蜡包埋该组织，切成4μm厚的切片，并固着到载玻片上。通过在60°C下培养1小时融化石蜡。为了水化，组织浸没在100%的二甲苯中3次，100%的乙醇中4次，95%的乙醇中3次，所有的情况下，每次均浸没1分钟，接着在流动水中放置5分钟。

水化后，对组织进行免疫组织化学研究。关于这方面，使用微波法进行抗原回收。将组织置于10mM的柠檬酸钠缓冲液(Sigma,No.S4641)中，并用微波辐射三次，每次5分钟。使用流动水使组织冷却，并用含5%的马血清和0.02%的Triton X-100的TBS（Tris缓冲盐溶液）封闭2小时。将识别内皮标记物CD31的抗体(SantaCruz,No.SC1506)以1:200的比例与含5%的马血清和0.02%的Triton X-100的TBS混合，接着在4°C下培养12小时。用含0.02%Triton X-100的TBS清洗组织三次，并在室温下与绿色荧光Alexa 488结合的二级抗体一起培养1小时。之后，用含0.02%Triton X-100的TBS清洗三次，并用5μM的主（host）染料染色10分钟。用TBS清洗组织5次，并将盖玻片置于载玻片之上，在共聚焦显微镜下观察。在该图像中，测定染成绿色的区域。

图28示出了小鼠组中的癌组织的显微图像。如图28所示，在注射了负载EGF融合蛋白和阿霉素的小鼠体内分离的癌组织观察到阿霉素，表明EGF融合蛋白在将阿霉素选择性地递送到癌细胞的过程中至关重要。

总之，上述获得的数据表明负载EGF融合蛋白的微泡特异性地靶向表达EGF受体的癌细胞。

实施例18：负载EGF融合蛋白的微泡诱导抗体形成的能力

使用实施例14的方法制备负载EGF融合蛋白的微泡，并以20μg的剂量给小鼠注射，用PBS作为对照。注射七天后，进行以下实验以检测特异于EGF蛋白的抗体的形成。从小鼠的眼睛抽取血样，并在室温下培养30分钟，4°C下储存1小时，并以1,300×g离心20分钟。收集不含细胞的上清液。

用50ng的EGFP蛋白涂覆的96孔板的每孔，并用100μl的1%BSA/PBS封闭2小时。将从小鼠血液中获得的上清稀释1000倍，加入到每孔中，在室温下培养2小时，接着与HRP结合的抗鼠抗体共同培养1小时。在用PBS中的0.05%吐温-20清洗之后，用BM-POD底物显影。

在图29中，示出了特异于EGF特异性抗体的RLU值。RLU值代表EGFP特异性抗体的相对量。如图29所示，当注射来自原生质体的负载EGF融合蛋白时，小鼠产生抗EGF抗体。

这些结果表明，当来自原生质体的微泡将其运载物递送至细胞时，无论该运载物是负载在微泡表面还是微泡内部，都可以作为抗原发挥作用，从而激发抗体形成。

实施例19：制备来自细菌原生质体的负载EGF受体融合蛋白的微 泡

通过使用细菌内膜蛋白PrsA将人EGF蛋白加载到原生质体的表面。为此，使用在实施例14中制备的pHCE-prsA，其携带从N末端到PrsA氨基酸序列第290位的编码多肽的基因。

为了用于融合pHCE-prsA载体，使用基于人EGF基因的碱基序列合成的引物扩增人EGF基因，其中设置有限制性内切酶位点，所述引物如下所示：

正向引物:5'-GCCTCTAGACTGGAGGAAAAGAAAGTTTGC-3'

反向引物:5'-CCAAGCTTCAGGACGGGATCTTAGGC-3'

（粗体字母表示XbaI和HindII的限制性内切酶位点）

在引物存在下，在人非小细胞癌细胞系A549的基因组DNA上进行PCR，使用Quiaquick凝胶纯化试剂盒纯化从PCR条带中获得的PCR产物。纯化的产物在37°C下，用限制性内切酶XbaI和HindIII消化8小时，并且用Quiaquick PCR纯化试剂盒再次纯化，之后连接到用相同的酶消化的pHCE-prsA载体上。获得的重组载体命名为“pHCE-prsA-EGFR”。

通过热击，用pHCE-prsA-EGFR载体转化大肠杆菌DH5α之后，在37°C下于1mL的LB中培养1小时，并在37°C下在含有氨苄青霉素的LB琼脂板培养生长16小时。一旦在培养皿中形成菌落，挑取一个菌落并进行菌落PCR检测和限制性内切酶切测试，以检测其是否含有pHCE-prsA-EGFR。

使用实施例1和2公开的方法，用pHCE-prsA-EGFR载体转化的来自革兰氏阴性菌Ecoil或未被转化的来自革兰氏阴性菌Ecoil，构建负载EGF融合蛋白的微泡或未负载EGF融合蛋白的微泡。此后，20μg的每种微泡单独地与5x的上样染料混合，使用的量为将上样染料的浓度稀释为1x。混合物在100°C下煮沸5分钟，并上样到12%的聚丙烯酰胺凝胶中。以80V电泳2小时后，蛋白质在400mA电流下转移2小时，到PVDF膜上。该膜在4°C下，在3%的PBS的脱脂乳溶液中封闭2小时，该膜在室温下用抗-EGF抗体处理12小时，并用PBS清洗两次，在室温下与过氧化物酶结合的二级抗体一起反应1小时，再用PBS清洗30分钟，接着用ECL底物显影。结果如图30所示。

如图30所示，在来自EGF受体融合蛋白-过度表达的细菌的原生质体的微泡中检测到了抗EGF受体的抗体，而在不含EGF受体融合蛋白的原生质体的微泡中没有检测到EGF受体融合蛋白。

该结果表明正确构建了负载EGF受体融合蛋白的微泡。

实施例20：EGF与来自细菌原生质体的负载EGF受体融合蛋白的 微泡的结合

构建实施例19中制备的负载EGF受体融合蛋白的微泡和未负载EGF受体融合蛋白的微泡。每种微泡以0、25或100ng/孔的密度置于96孔板中，并在室温下培养12小时或更长时间，从而使其附着于孔上。在每孔细胞用100μl的1%BSA/PBS固定1小时后，与生物素结合的EGF以100ng/ml的量加入，并培养2小时，用PBS中的0.05%吐温-20清洗培养皿。用链酶辛和素-POD处理20分钟，接着用BM-POD底物显影。

在图31中，示出了根据显影的RLU值分析的EGF结合微泡的水平。从图31中的数据可以看出，与未负载EGF受体融合蛋白的微泡相比，在与EGF结合的负载EGF受体融合蛋白的微泡中检测到RLU值更高。

这些结果表明，负载EGF受体融合蛋白的微泡能够与EGF结合。

实施例21：制备来自细菌原生质体的负载组氨酸标签融合蛋白的微 泡

通过使用细菌内膜蛋白PrsA将组氨酸标签蛋白负载到原生质体的表面。为此，在37°C下，用限制性内切酶NdeI和HindIII消化8小时，并且用Quiaquick凝胶纯化试剂盒纯化消化的产物，之后插入到携带组氨酸标签的pET-30a(+)载体中，该载体之前用相同的限制性内切酶处理过。获得的重组载体命名为“pET-30a(+)-prsA-His6”。

通过热击，用pET-30a(+)-prsA-His6载体转化大肠杆菌DH5α之后，在37°C下于1mL的LB中培养1小时，并在37°C下在含有卡那霉素的LB琼脂板培养生长16小时。一旦在培养皿中形成菌落，挑取一个菌落并进行菌落PCR检测和限制性内切酶切测试，以检测其是否含有pET-30a(+)-prsA-His6。从细菌中扩增并制备质粒，并通过热击转化到大肠杆菌BL21中。转化的大肠杆菌在37°C下于1mL的LB中培养1小时，并在37°C下在含有卡那霉素的LB琼脂板培养生长16小时。将由此形成的一个菌落接种于5mL的LB培养基中，并在37°C下生长至O.D₆₀₀=0.4，此时，在1mM IPTG存在下，在37°C下诱导细胞3小时以过度表达融合蛋白。

使用实施例1和2公开的方法，用pET-30a(+)-prsA-His6载体转化的来自革兰氏阴性菌大肠杆菌或未被转化的来自革兰氏阴性菌大肠杆菌，构建负载有组氨酸标签融合蛋白的微泡或未负载组氨酸标签融合蛋白的微泡。此后，20μg的每种微泡单独地与5x的上样染料混合，使用的量为将上样染料的浓度稀释为1x。混合物在100°C下煮沸5分钟，并上样到12%的聚丙烯酰胺凝胶中。在以80V电泳2小时后，蛋白质在400mA电流下转移2小时，到PVDF膜上。该膜在4°C下，在3%的PBS的脱脂乳溶液中封闭12小时，该膜在室温下用抗组氨酸标签抗体处理2小时，并用PBS清洗两次，在室温下与过氧化物酶结合的二级抗体一起培养反应1小时，再用PBS清洗30分钟，接着用ECL底物显影。结果如图32所示。

如图32所示，在来自组氨酸标签融合蛋白-过度表达的细菌的原生质体的微泡中检测了到抗组氨酸标签抗体，而在不含组氨酸标签融合蛋白的原生质体的微泡中没有检测到组氨酸标签融合蛋白。

该结果表明正确构建了负载组氨酸标签融合蛋白的微泡。

实施例22：来自细菌原生质体的微泡体外药物递送以及血管内皮细 胞的细胞凋亡诱导

将6孔板置于涂覆有0.1%的明胶的盖玻片上，然后HUVEC以1×105细胞/盖玻片的密度播种，接着培养16小时。细胞用PBS清洗两次，并在每孔含有来自革兰氏阴性菌的原生质体的微泡的2mL培养基中培养24小时，该微泡在实施例1和2中制备，或者在每孔含有来自革兰氏阳性菌的原生质体负载阿霉素的微泡的2mL培养基中，培养24小时，该微泡在实施例17中制备，微泡的浓度分别为0、0.5、1或2μg/ml。细胞再次用PBS清洗，并且将2mL的不含血清的培养基加入到每孔中，之后与5μM细胞跟踪物一起培养30分钟。细胞再次用PBS清洗，并且在每孔具有2mL的补充有血清的培养基中培养30分钟。盖玻片用每孔2mL的4%的低聚甲醛固定10分钟，并在共聚焦显微镜下观察。计算活细胞的数目，结果如图33所示。

在图33中，Y轴上的“对照%”表示用每个浓度的微泡处理后，细胞存活的数量百分比，相对于用0μg/ml的微泡处理后，细胞存活的数量百分比，结果通过以下等式计算

对照%=每个浓度的活细胞计数/在0μg/ml的活细胞计数x100

与0μg/ml的对照相比，在给定浓度的对照更高的百分比意味着诱导的细胞凋亡较少。

如图33所示，本身来自细菌原生质体的微泡对HUVEC的凋亡没有影响，其中来自细菌的原生质体的负载阿霉素的微泡诱导HUVEC细胞经历细胞凋亡。

这些结果表明负载来自原生质体的阿霉素的微泡被递送到HUVEC细胞，然后诱导其经历细胞凋亡。

实施例23：在结肠癌中，通过来自细菌原生质体的负载阿霉素的微 泡体外诱导的细胞凋亡

将24孔板置于涂覆有0.1%的明胶的盖玻片上，然后小鼠结肠26细胞系以2×10⁴细胞/盖玻片的密度播种，接着培养16小时。

细胞用PBS清洗两次，并在每孔含有来自革兰氏阳性菌的原生质体的微泡的500μl培养基中培养24小时，该微泡在实施例1和2中制备，或者在每孔含有来自革兰氏阳性菌的原生质体的负载阿霉素的微泡的500μl培养基中，培养24小时，该微泡在实施例17中制备，微泡的浓度分别为0、1.25、2.5或5μg/ml。

细胞再次用PBS清洗，并且将500μl的不含血清的培养基加入到每孔中，之后与5μM细胞跟踪物一起培养30分钟。细胞再次用PBS清洗，并且在每孔具有500μl的补充有血清的培养基中培养30分钟。盖玻片用每孔500μl的4%的低聚甲醛固定10分钟，并在共聚焦显微镜下观察。计算活细胞的数目，结果如图34所示。

在图34中，计算用给定浓度微泡处理后的细胞存活数，其表示为对照的百分比，也就是说计算相对于用0μg/ml浓度的微泡处理后，细胞存活的数量百分比，结果通过以下等式计算

对照%=每个浓度的活细胞计数/在0μg/ml的活细胞计数x100

如图34所示，与未负载阿霉素的来自原生质体的微泡本身相比，负载阿霉素的、来自原生质体的微泡非常有效地诱导结肠癌细胞经历细胞凋亡。

这些结果表明负载阿霉素的来自原生质体的微泡被递送到结肠癌细胞，并诱导其经历细胞凋亡。

实施例24：在癌症中，来自细菌原生质体的负载阿霉素的微泡体内 诱导的细胞凋亡

以1×10⁶细胞的剂量将小鼠结肠26细胞系皮下注射到小鼠体内，并培养5天。此后，将含有负载0μg、1μg或5μg的阿霉素，来自革兰氏阴性菌的原生质体的微泡的PBS溶液，以100μl的剂量每周两次通过尾静脉注射给小鼠，该微泡在实施例17中制备。监测癌组织的大小，结果如图35所示，癌组织的体积用等式v=ls²/2计算，其中l是肿瘤的最长轴的长度，s是与最长轴垂直的轴线长度。

如图35所示，与仅注射PBS的小鼠相比，注射负载阿霉素的微泡的小鼠，肿瘤增长缓慢，以5μg负载阿霉素的微泡的剂量注射的小鼠中观察到了最小的癌组织。

该结果表明抗癌药物阿霉素能够通过来自原生质体的微泡递送到癌组织。

尽管本发明的优选的实施方式已经出于说明的目的进行公开，但是本领域技术人员应该理解各种改变、增加和替代都是可能的，而不脱离本发明的附属的权利要求书所公开的范围和精神。

工业实用性

通过从细菌、真菌或植物细胞中去除细胞壁，构建的来自原生质体的本发明的微泡其自身并不触发免疫应答。此外，来自原生质体的微泡其优势在于，它们能够容易地负载有治疗物质和/或诊断物质物质、或疫苗物质，其可用于工业生产。此外，如果微泡来自表达治疗、诊断和/或疫苗物质的细胞的原生质体中，那么它们具有工业化和经济优势，因为它们可以不经纯化而进行生产。

Claims (86)

1.一种包括来自细胞原生质体的微泡的组合物。

2. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述细胞选自由细菌细胞、古细菌细胞、真菌细胞、植物细胞和L型细菌细胞组成的组。

3. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述细胞表达治疗物质、诊断物质或疫苗物质。

4. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述细胞是天然存在的细胞或转化细胞。

5. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述微泡来自细胞原生质体，所述细胞被转化以表达细胞膜融合物质。

6. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述微泡来自细胞原生质体，所述细胞被转化以被引导至靶细胞或靶组织。

7. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述微泡来自细胞原生质体，所述细胞被转化以表达治疗物质、诊断物质或疫苗物质。

8. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述微泡来自细胞原生质体，所述细胞被转化以被引导至靶细胞或靶组织并表达治疗物质、诊断物质或疫苗物质。

9. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述微泡来自细胞原生质体，所述细胞被转化以表达至少一种物质，所述物质选自由细胞粘附分子、抗体、靶向蛋白、细胞膜融合蛋白本身及其融合蛋白组成的组。

10. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述微泡来自细胞原生质体，所述细胞被转化以表达至少一种物质，所述物质选自由显示配体的蛋白、显示配体的多肽及其融合蛋白组成的组。

11. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述微泡来自细胞原生质体，所述细胞被转化以表达至少一种物质，所述物质选自由捕获配体的蛋白、捕获配体的多肽及其融合蛋白组成的组。

12. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述微泡是具有包涵体的微泡。

13. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述微泡与用作微泡来源的原生质体的膜具有相同的拓扑结构。

14. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述微泡还包含细胞质膜以外的组分。

15. 根据权利要求14所述的组合物，其中所述细胞质膜以外的组分是环糊精或聚乙二醇。

16. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述微泡具有化学改性的膜组分。

17. 根据权利要求16所述的组合物，其中所述膜组分由硫醇基或胺基化学改性。

18. 一种药物组合物，其包括来自细胞原生质体并负载治疗物质、诊断物质或疫苗物质的微泡。

19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述治疗物质、诊断物质或疫苗物质来自细胞。

20.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述治疗物质、诊断物质或疫苗物质从细胞外部导入。

21.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述治疗物质、诊断物质或疫苗物质为至少一种物质，其选自由抗癌剂、抗炎剂、血管生成抑制剂、肽类、蛋白质、毒素、核酸、小珠、微粒或纳米颗粒组成的组。

22. 根据权利要求21所述的药物组合物，其中所述核酸选自由DNA、RNA、适配体、LNA (锁定核酸)、PNA(肽核酸)及吗啉寡聚核苷酸组成的组。

23. 根据权利要求21所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒选自由氧化铁颗粒、金颗粒、碳纳米管及磁珠组成的组。

24. 根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述治疗物质或诊断物质发射荧光。

25. 根据权利要求24所述的药物组合物，其中所述发射荧光的物质是荧光蛋白或荧光量子点。

26. 根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述疫苗物质至少是一种物质，其选自由抗原、免疫增强剂和免疫调节剂组成的组。

27. 根据权利要求26所述的药物组合物，其中抗原选自由病毒蛋白、致病细菌蛋白和来自癌细胞的蛋白组成的组。

28. 根据权利要求26所述的药物组合物，其中所述抗原是至少两种物质，其选自由病毒蛋白、致病细菌蛋白和来自癌细胞的蛋白组成的组。

29. 根据权利要求26所述的药物组合物，其中所述免疫增强剂选自由双链RNA (dsRNA)、霍乱毒素和明矾组成的组。

30. 根据权利要求26所述的药物组合物，其中所述免疫调节剂选自由白介素 (IL)-2、IL-4、IL-6、IL-12、IL-17、干扰素γ(IFN-γ)、血管内皮生长因子(VEGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)-2组成的组。

31. 根据权利要求18所述的药物组合物, 其中所述治疗物质、诊断物质或疫苗物质至少是一种物质，其选自由显示配体的蛋白、显示配体的多肽、捕获配体的蛋白、捕获配体的多肽及其融合蛋白组成的组。

32. 一种用于递送治疗物质、诊断物质或疫苗物质的组合物，其包括来自细胞原生质体的微泡。

33. 一种用于递送治疗物质、诊断物质或疫苗物质的系统，其包括来自细胞原生质体的微泡。

34. 一种来自细胞原生质的微泡的制备方法，包括： 

(a) 去除细胞的细胞壁以提供原生质体； 

(b) 在原生质体悬浮液中构建微泡；以及

(c) 从悬浮液中分离构建的微泡。

35. 一种负载治疗物质、诊断物质或疫苗物质的来自细胞原生质体的微泡的制备方法，包括： 

(a) 外部加载治疗物质、诊断物质或疫苗物质至细胞中，随后去除细胞的细胞壁以提供原生质体；

(b) 在原生质体悬浮液中构建微泡；以及

(c) 从悬浮液中分离构建的微泡。

36. 一种负载治疗物质、诊断物质或疫苗物质的来自细胞原生质体的微泡的制备方法，包括：

(a) 去除细胞的细胞壁以提供原生质体；

(b) 外部加载治疗物质、诊断物质或疫苗物质至所述原生质体；

(c) 在负载所述物质的所述原生质体悬浮液中构建微泡；以及

(d) 从所述悬浮液中分离构建的所述微泡。

37. 一种负载治疗物质、诊断物质或疫苗物质的来自细胞原生质体的微泡的制备方法，包括： 

(a) 去除细胞的细胞壁以提供原生质体；

(b) 将所述治疗物质、诊断物质或疫苗物质添加到所述原生质体悬浮液以构建微泡；以及

(c) 从所述悬浮液中分离构建的所述微泡。

38. 一种负载治疗物质、诊断物质或疫苗物质的来自细胞原生质体的微泡的制备方法，包括：

（a）去除细胞的细胞壁以提供原生质体； 

(b) 在所述原生质体悬浮液中构建微泡；

(c) 将治疗物质、诊断物质或疫苗物质添加到含有所述微泡的所述悬浮液，以将治疗物质、诊断物质或疫苗物质负载于所述微泡中；以及 

(d) 从所述悬浮液中分离所述负载治疗物质、诊断物质或疫苗物质的微泡。

39. 一种负载治疗物质、诊断物质或疫苗物质的来自细胞原生质体的微泡的制备方法，包括： 

(a) 去除细胞的细胞壁以提供原生质体； 

(b) 在所述原生质体悬浮液中构建微泡； 

(c) 从所述悬浮液中分离构建的所述微泡；以及

(d) 将治疗物质、诊断物质或疫苗物质添加到含有所述微泡的所述悬浮液，以将治疗物质、诊断物质或疫苗物质负载于所述微泡中。

40. 根据权利要求39所述的方法，其还包括将所述负载治疗物质、诊断物质或疫苗物质的所述微泡从含有所述微泡的悬浮液中分离。

41. 根据权利要求34至40中任一项所述的方法，其中使用以下方法进行分离步骤，所述方法选自由密度梯度、超速离心、过滤和自由流动电泳组成的组。

42. 根据权利要求34至39中任一项所述的方法，其中所述细胞选自由细菌细胞、古细菌细胞、真菌细胞、植物细胞和L型细菌细胞组成的组。

43. 根据权利要求34至39中任一项所述的方法，其中所述细胞是天然存在的细胞或转化细胞。

44. 根据权利要求34至39中任一项所述的方法，其中所述细胞表达治疗物质、诊断物质或疫苗物质。

45. 根据权利要求34至39中任一项所述的方法，其中所述转化细胞是被转化以表达细胞膜融合物质的细胞。

46. 根据权利要求34至39中任一项所述的方法，其中所述转化细胞是被转化以被引导至靶细胞或靶组织的细胞。

47. 根据权利要求34至39中任一项所述的方法，其中所述转化细胞是被转化以表达治疗物质、诊断物质或疫苗物质的细胞。

48. 根据权利要求34至39中任一项所述的方法，其中所述转化细胞是被转化以被引导至靶细胞或靶组织并表达治疗物质、诊断物质或疫苗物质的细胞。

49. 根据权利要求34至39中任一项所述的方法，其中所述转化细胞被转化以表达至少一种物质的细胞，所述物质选自由细胞粘附分子、抗体、靶向蛋白、细胞膜融合蛋白本身及其融合蛋白组成的组。

50. 根据权利要求34至39中任一项所述的方法，其中所述细胞是被转化以表达至少一种物质的细胞，所述物质选自由显示配体的蛋白、显示配体的多肽及其融合蛋白组成的组。

51. 根据权利要求34至39中任一项所述的方法，其中所述细胞是被转化以表达至少一种物质的细胞，所述物质选自由捕获配体的蛋白、捕获配体的多肽及其融合蛋白组成的组。

52. 根据权利要求34至39中任一项所述的方法，其中所述治疗物质、诊断物质或疫苗物质是至少一种物质，其选自由抗癌剂、抗炎剂、血管生成抑制剂、肽类、蛋白质、毒素、核酸、小珠、微粒和纳米粒子组成的组。

53. 根据权利要求52所述的方法，其中所述核酸选自由DNA、RNA、适配体、LNA (锁定核酸)、PNA (肽核酸)及吗啉寡聚核苷酸组成的组。

54. 根据权利要求52所述的方法，其中所述纳米颗粒选自由氧化铁颗粒、金颗粒、碳纳米管及磁珠组成的组。

55. 根据权利要求34至39中任一项所述的方法，其中所述治疗物质或诊断物质发射荧光。

56. 根据权利要求55所述的方法，其中发所述射荧光的物质是荧光蛋白或荧光量子点。

57. 根据权利要求35至39中任一项所述的方法，其中所述疫苗物质选自由抗原、免疫增强剂和免疫调节剂组成的组。

58. 根据权利要求57所述的方法，其中所述抗原选自由病毒蛋白、致病细菌蛋白和来自癌细胞的蛋白组成的组。

59. 根据权利要求57所述的方法，其中所述抗原是至少两种物质，其选自由病毒蛋白、致病细菌蛋白和来自癌细胞的蛋白组成的组。

60. 根据权利要求57所述的方法，其中所述免疫增强剂选自由双链  RNA (dsRNA)、霍乱毒素和明矾组成的组。

61. 根据权利要求57所述的方法，其中所述免疫调节剂选自由白介素 (IL)-2、IL-4、IL-6、IL-12、IL-17、干扰素γ(IFN-γ)、血管内皮生长因子(VEGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)-2组成的组。

62. 根据权利要求34至39中任一项所述的方法，其还包括去除膜的拓扑结构与细胞膜不同的微泡。

63. 根据权利要求34至39中任一项所述的方法，其还包括添加除原生质体质膜外的组分至微泡膜。

64. 根据权利要求63，其中所述组分是环糊精或聚乙二醇。

65. 一种递送治疗物质、诊断物质或疫苗物质至靶细胞或靶组织的方法，其包括使用来自细胞原生质体并负载所述治疗物质、诊断物质或疫苗物质的微泡。

66. 根据权利要求65所述的方法，其中递送两种或多种所述治疗物质、诊断物质及疫苗物质。

67. 根据权利要求66所述的方法，其中两种或多种所述治疗物质、诊断物质及疫苗物质一起负载于微泡。

68. 根据权利要求65所述的方法，其中使用两种或多种不同微泡，所述微泡负载治疗物质、诊断物质或疫苗物质。

69. 根据权利要求68所述的方法，其中同时施用两种或多种不同微泡。

70. 根据权利要求65所述的方法，其中两种或多种不同微泡选自由负载一种物质的微泡、负载两种或多种物质的微泡及其组合组成的组，且其可顺序地施用，所述物质是治疗物质、诊断物质或疫苗物质。

71. 一种疾病的治疗或诊断方法，其包括使用来自细胞原生质体并负载治疗或诊断物质的微泡递送治疗或诊断物质至靶细胞或靶组织。

72. 一种疾病的预防或治疗方法，其包括使用来自细胞原生质体并负载疫苗的微泡递送疫苗物质至靶细胞或靶组织。

73. 根据权利要求71或72所述的方法，其中所述细胞选自由细菌细胞、古细菌细胞、真菌细胞、植物细胞核L型细菌细胞组成的组。

74. 根据权利要求71或72所述的方法，其中所述细胞是天然存在的细胞或转化细胞。

75. 根据权利要求71或72所述的方法，其中所述细胞表达治疗物质、诊断物质或疫苗物质。

76. 根据权利要求71或72所述的方法，其中所述细胞被转化以表达细胞膜融合物质。

77. 根据权利要求71或72所述的方法，其中所述细胞被转化以被引导至靶细胞或靶组织。

78. 根据权利要求71或72所述的方法，其中所述细胞被转化以表达治疗物质、诊断物质或疫苗物质。

79. 根据权利要求71或72所述的方法，其中所述细胞被转化以被引导至靶细胞或靶组织并表达治疗物质、诊断物质或疫苗物质。

80. 根据权利要求71或72所述的方法，其中所述治疗物质、诊断物质或疫苗物质来自细胞。

81. 根据权利要求71或72所述的方法，其中治疗物质、诊断物质或疫苗物质从细胞外部导入。

82. 根据权利要求71或72所述的方法，其中所述治疗物质、诊断物质或疫苗物质是至少一种物质，其选自由显示配体的蛋白、显示配体的多肽、捕获配体的蛋白、捕获配体的多肽及其融合蛋白组成的组。

83. 根据权利要求71所述的方法，其中所述治疗物质或诊断物质是至少一种物质，其选自由抗癌剂、抗炎剂、血管生成抑制剂、肽类、蛋白质、毒素、核酸、小珠、微粒和纳米粒子组成的组。

84. 根据权利要求71所述的方法，其中所述治疗物质或诊断物质发射荧光。

85. 根据权利要求72所述的方法，其中所述疫苗物质是至少一种物质，选自由抗原、免疫增强剂和免疫调节剂组成的组。

86. 一种诊断疾病的试剂盒，其包括来自细胞原生质体并负载作为活性成分的引物、探针、反义核酸或抗体的微泡。

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