CN111511384A - 工程化外来体的组合物和负载腔外来体有效负载物的方法 - Google Patents

工程化外来体的组合物和负载腔外来体有效负载物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及使用新鉴定为在外来体腔中富集的蛋白质制备治疗性外来体的方法。具体地，本发明提供将治疗性肽或蛋白质定位在外来体中的方法。所述方法涉及产生腔工程化外来体，所述腔工程化外来体包含浓度较高的外来体蛋白、所述外来体蛋白的修饰物或片段，或所述外来体蛋白与治疗性或货物蛋白的融合蛋白中的一种或多种。

Description

工程化外来体的组合物和负载腔外来体有效负载物的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年11月17日提交的美国临时专利申请62/587,767和2018年2月23日提交的美国临时专利申请62/634,750的权益，所述专利的公开内容出于所有目的特此以其全文并入。
序列表
本申请包括按ASCII格式以电子方式提交并特此通过引用以其全文并入的序列表。2018年11月15日创建的所述ASCII副本命名为41406US_CRF_sequencelisting.txt并且大小为57,837字节。
背景技术
外来体是细胞间通讯的重要中介物。它们也是许多疾病(如癌症)的诊断和预后的重要生物标记物。作为药物递送媒介物，外来体作为一种新的治疗方式在许多治疗领域提供了许多优于传统药物递送方法的优势。
外来体的中心特征是它们能够在其内部空间或腔中含有生物活性有效负载物。众所周知，外来体含有内源性有效负载物(包括mRNA、miRNA、DNA、蛋白质、碳水化合物和脂质)，但是引导所需治疗性有效负载物的特异性负载的能力目前受到限制。外来体可以通过在生产细胞中过表达所需的治疗性有效负载物来负载，但是由于有效负载物随机定位到细胞外来体加工中心，该负载的效率通常有限。可替代地，经纯化的外来体可以通过例如电穿孔来离体负载。这些方法可能遭受低效率的问题或者受限于小有效负载物，如siRNA。因此，需要适合的方法来产生高度有效和定义明确的负载外来体，以更好地实现基于外来体的技术的治疗用途和其他应用。
发明内容
本发明的一个方面涉及负载用于治疗用途的外来体的新方法。具体地，所述方法使用从外来体腔中新鉴定的蛋白质标记物。具体地，鉴定一组蛋白质(例如，豆蔻酰化的富含丙氨酸的蛋白激酶C底物(MARCKS)；豆蔻酰化的富含丙氨酸的蛋白激酶C底物样1(MARCKSL1)；和脑酸溶性蛋白1(BASP1))以在外来体腔中高度富集。此外，BASP1氨基末端的短序列已显示足以将荧光蛋白货物分子的高效负载引导至与全长BASP1蛋白相同的程度。此片段少于十个氨基酸，在工程化外来体负载领域中呈现出显著的进步，并且在无任何额外的离体操作步骤下允许将任何治疗性蛋白货物有效、可重复地负载到外来体腔中。与迄今所述的任何其他基因工程方法相比，使用本文所述的融合蛋白负载外来体产生具有明显更高的货物水平的工程化外来体。
将从外来体新鉴定的蛋白质和肽序列用于本发明的各种实施方案中。例如，一些实施方案涉及通过使外来体蛋白或蛋白质片段与治疗相关蛋白质缀合来产生融合蛋白并且在外来体腔中产生含有融合蛋白的外来体。治疗相关蛋白的天然全长蛋白或生物活性片段可以通过与富集外来体的蛋白质或蛋白质片段缀合而被运输到外来体腔中。
本发明进一步涉及产生或使用腔工程化外来体，该腔工程化外来体被设计成用于在外来体腔中更有效地负载、或用于负载治疗相关蛋白。例如，外来体腔可以经修饰以在腔中含有更高浓度的天然全长外来体蛋白和/或天然外来体蛋白的片段或修饰物的蛋白质。
本发明的一些实施方案涉及一种用于生产这种腔工程化外来体的生产细胞或一种产生所述生产细胞的方法。外源多核苷酸可以被暂时或稳定地引入生产细胞中，以由生产细胞产生表面工程化外来体。
因此，在一个方面，本发明提供一种包含靶蛋白的外来体，其中所述靶蛋白的至少一部分由外源序列表达，并且所述靶蛋白包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段或修饰物。
在一些实施方案中，所述靶蛋白以比不同外来体中的不同靶蛋白更高的密度存在于所述外来体中，其中所述不同靶蛋白包括常规外来体蛋白或其变体。在一些实施方案中，常规外来体蛋白选自由以下组成的组：CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI锚蛋白、乳凝集素、LAMP2、LAMP2B及其片段。
在一些实施方案中，外来体由被遗传修饰以包含所述外源序列的细胞产生，任选地其中所述细胞是HEK293细胞。
在一些实施方案中，所述细胞包含含有外源序列的质粒。
在一些实施方案中，所述外源序列被插入到位于相对于编码MARCKS、MARCKSL1或BASP1的基因组序列的3’或5’的基因组位点中。在一些实施方案中，所述外源序列被插入到编码MARCKS、MARCKSL1或BASP1的基因组序列中。
在一些实施方案中，所述靶蛋白是包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段和治疗性肽的融合蛋白。
在一些实施方案中，治疗性肽选自由以下组成的组：天然肽、重组肽、合成肽或至治疗性化合物的接头。在一些实施方案中，所述治疗性化合物选自由以下组成的组：核苷酸、氨基酸、脂质、碳水化合物和小分子。在一些实施方案中，治疗性肽是抗体或其片段或修饰物。在一些实施方案中，治疗性肽是酶、配体、受体、转录因子或其片段或修饰物。在一些实施方案中，治疗性肽是抗微生物肽或其片段或修饰物。
在一些实施方案中，外来体进一步包含第二靶蛋白，其中所述第二靶蛋白包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段。在一些实施方案中，外来体进一步包含第二靶蛋白，其中所述第二靶蛋白包含PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP转运蛋白或其片段。
在一些实施方案中，所述靶蛋白包含(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(SEQ ID NO:118)的肽。在一些实施方案中，所述靶蛋白包含(M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)的肽，其中每个括号内位置表示氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任何氨基酸，X是任何氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任何氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu)。在一些实施方案中，所述靶蛋白包含(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)的肽，其中每个括号内位置表示氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任何氨基酸，ξ是选自由(Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His、Arg)组成的组的任何氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任何氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu)。
在一些实施方案中，靶蛋白包含SEQ ID NO:4-110中的任一种的肽。在一些实施方案中，所述靶蛋白包含MGXKLSKKK的肽，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO:116)。在一些实施方案中，靶蛋白包含SEQ ID NO:110的肽。在一些实施方案中，靶蛋白包含SEQ ID NO:13的肽。
在一些实施方案中，靶蛋白进一步包含货物肽。
在另一个方面，本发明提供一种包含外来体和赋形剂的药物组合物。
在一些实施方案中，药物组合物基本上不含大分子，其中所述大分子选自核酸、外源蛋白、脂质、碳水化合物、代谢物及其组合。
在又一个方面，本发明提供一种产生本文提供的外来体的细胞群。
在一些实施方案中，细胞群包含编码靶蛋白的外源序列，所述靶蛋白包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段或修饰物。在一些实施方案中，细胞群进一步包含编码第二靶蛋白的第二外源序列，其中所述第二靶蛋白包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段或修饰物。在一些实施方案中，细胞群进一步包含编码第二靶蛋白的第二外源序列，其中所述第二靶蛋白包含PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP转运蛋白或其片段。
在一些实施方案中，外源序列被插入到编码MARCKS、MARCKSL1、或BASP1的基因组序列中，其中所述外源序列和所述基因组序列编码所述靶蛋白。在一些实施方案中，外源序列是在质粒中。
在一些实施方式中，外源序列编码治疗性肽。在一些实施方案中，治疗性肽选自由以下组成的组：天然肽、重组肽、合成肽或至治疗性化合物的接头。在一些实施方案中，所述治疗性化合物选自由以下组成的组：核苷酸、氨基酸、脂质、碳水化合物和小分子。在一些实施方案中，治疗性肽是抗体或其片段或修饰物。在一些实施方案中，治疗性肽是酶、配体、受体、转录因子或其片段或修饰物。在一些实施方案中，治疗性肽是抗微生物肽或其片段或修饰物。
在一些实施方案中，外源序列编码靶向部分。在一些实施方案中，靶向部分对器官、组织或细胞具有特异性。
在一些实施方案中，第二靶蛋白进一步包含靶向部分。在一些实施方案中，靶向部分对器官、组织或细胞具有特异性。
在一个方面，本发明提供一种用于修饰外来体的多肽，其包含以下的序列：(i)(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(SEQ ID NO:118)；(ii)(M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)，其中每个括号内位置表示氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任何氨基酸，X是任何氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任何氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu)；或(iii)(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)，其中每个括号内位置表示氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任何氨基酸，ξ是选自由(Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His、Arg)组成的组的任何氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任何氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu)。
在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO:4-110中的任一种的序列。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO:13的序列。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO:110的序列。在一些实施方案中，多肽包含MGXKLSKKK的序列，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO:116)。
在一些实施方案中，多肽与货物肽融合。在一些实施方案中，多肽与所述货物肽的N末端融合。
在一个方面，本发明提供一种多核苷酸构建体，该多核苷酸构建体包含编码本文提供的多肽的编码序列。在一些实施方案中，编码序列经密码子优化。
在另一个方面中，本发明提供一种制备工程化外来体的方法，其包括以下步骤：a.向细胞中引入编码融合多肽的核酸构建体，所述融合多肽包含(i)编码MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段或修饰物的第一序列，和(ii)编码货物肽的第二序列；b.将所述细胞维持在允许所述细胞表达所述融合多肽的条件下；和c.从所述细胞获得包含所述融合多肽的工程化外来体。
在一些实施方案中，第一序列包含以下的序列：(i)(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(SEQ ID NO:118)；(ii)M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)，其中每个括号内位置表示氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任何氨基酸，X是任何氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任何氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu)；或(iii)(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)，其中每个括号内位置表示氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任何氨基酸，ξ是选自由(Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His、Arg)组成的组的任何氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任何氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu)。
在一些实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:4-110中的任一种的序列。在一些实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:13的序列。在一些实施方案中，多核苷酸包含SEQ IDNO:110的序列。在一些实施方案中，多核苷酸包含MGXKLSKKK的序列，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO:116)。
在一些实施方案中，融合多肽以比不同外来体中的不同靶蛋白更高的密度存在于所述工程化外来体的腔中，其中所述不同靶蛋白包括常规外来体蛋白或其变体。在一些实施方案中，融合多肽以比不同外来体中的不同靶蛋白高超过2倍的密度存在。在一些实施方案中，融合多肽以比不同外来体中的不同靶蛋白高超过4倍、16倍、100倍、或10,000倍的密度存在。
附图说明
附图仅出于说明的目的描绘了本发明的各种实施方案。本领域技术人员将从以下讨论中容易地认识到，在不脱离本文所述的本发明的原理的情况下，可以采用本文示出的结构和方法的可替代实施方案。
图1提供了超速离心后含样品的OptiprepTM密度梯度的图像。标有括号的是含有外来体的顶部级分(“顶部”)、含有细胞碎片的中间级分(“中间”)和含有高密度聚集体和细胞碎片的底部级分(“底部”)。
图2是示出从OptiprepTM超速离心的顶部级分鉴定的蛋白质(Y轴)和从底部级分鉴定的蛋白质(X轴)的点图。虚线上方绘制的蛋白质代表外来体富集的蛋白质(包括MARCKS、MARCHSL1和BASP1)，而虚线下方的蛋白质代表非特异于外来体的蛋白质。
图3提供了MARCKS(SEQ ID NO:1)的胰蛋白酶肽覆盖图。
图4提供了MARCKSL1(SEQ ID NO:2)的胰蛋白酶肽覆盖图。
图5提供了BASP1(SEQ ID NO:3)的胰蛋白酶肽覆盖图。
图6A示出了从HEK293细胞收集的总细胞裂解物(左侧)和纯化外来体群体(右侧)的蛋白质印迹图片。图6A中提供的凝胶的蛋白质印迹显示，MARCKS(图6B)、MARCKSL1(图6C)和BASP1(图6D)位于纯化外来体中，并且在总细胞裂解物中未检测到，或者与外来体相比以显著较低的水平在细胞裂解物中检测到。
图7示出了纯化外来体的荧光强度，所述纯化外来体含有与含有氨基酸1-30、CD81或pDisplay的MARCKS片段融合的GFP。
图8示出了纯化外来体的荧光强度，所述纯化外来体含有与全长MARCKSL1、含有氨基酸1-30、CD81或pDisplay的MARCKSL1片段融合的GFP。
图9示出了纯化外来体的荧光强度，所述纯化外来体含有与全长BASP1、含有氨基酸1-30、CD81或pDisplay的BASP1片段融合的GFP。
图10示出了用于确定足以负载外来体的最小BASP1 N末端序列的融合蛋白的示意图(按出现顺序分别为SEQ ID NO 122-134)。融合蛋白分配有如“pCB”下提供的编号。
图11示出了来自纳米流式细胞术的图，该纳米流式细胞术测量经工程化以表达与GFP融合的BASP1片段的外来体的荧光信号。x轴根据分配给如图10中提供的各种融合蛋白的数字编号。
图12示出了经染色蛋白凝胶的图片，其指示负载有与GFP融合的BASP1片段的外来体的相等负载。虚线箭头指示BASP1融合蛋白的迁移位置。泳道根据分配给如图10中提供的各种融合蛋白的数字编号。
图13示出了用考马斯蓝染色以标记总蛋白的蛋白凝胶的图片。虚线箭头指示BASP1融合蛋白的迁移位置。泳道用分配给如图10中提供的各种融合蛋白的数字标记。
图14示出了来自纯化外来体的抗FLAG蛋白印迹的图片，所述纯化外来体含有与FLAG和GFP融合的BASP1片段。泳道根据分配给如图10中提供的各种融合蛋白的数字编号。
图15示出了来自纯化外来体的抗Alix蛋白印迹的图片，所述纯化外来体含有与FLAG和GFP融合的BASP1片段，从而证实相等的蛋白质负载。泳道根据图10中所示的蛋白质序列编号。
图16A示出了包含与FLAG标签和GFP融合的BASP1片段的融合蛋白的序列(按出现顺序分别为SEQ ID NO 135-142)。图16B示出了从稳定表达图16A中的融合蛋白之一的细胞中纯化外来体的抗FLAG蛋白质印迹结果。
图17A示出了来自与FLAG标签和GFP融合的BASP1片段(1-30)(SEQ ID NO:4)及其修饰物(1-30-S6D、1-30-S6A和1-30-L5Q)的序列(按出现顺序分别为SEQ ID NO 143-145)。图17B示出了从稳定表达图17A中的融合蛋白之一的细胞中纯化外来体的抗FLAG蛋白质印迹结果。
图18示出了考马斯染色的蛋白凝胶的图像，其中外来体样品从稳定表达均与FALG-GFP融合的全长MARCKSL1、BASP1、或MARCKS、MARCKSL1、或BASP1的氨基酸1-30的细胞中纯化。图像上的黑色箭头指示对应于融合蛋白的带。
图19示出了BASP1的前28个氨基酸(保守区1)、MARCKS的氨基酸1-7和152-173(保守区2)以及MARCKSL1的氨基酸1-7和87-110(保守区3)之间的蛋白质序列比对。
图20A示出了BASP1的氨基酸1-30(“BASP1-30”)(SEQ ID NO:4)以及包含与MARCKS或其修饰物的PSD结构域融合的MARCKS或其修饰物的氨基酸1-3的融合蛋白(“MARCKS-MG-PSD”、“MARC KS-MA-PSD”、“MARCKS-MG-PSD-K6S”和“MARCKS-MG-PSD-K6A”)的序列(按出现顺序分别为SEQ ID NO 146-149)。引入MARCKS序列中的点突变是粗体。图20B示出了来自稳定表达包含图20A的氨基酸序列和FLAG的融合蛋白的细胞的纯化外来体的抗FLAG蛋白质印迹结果。
图21示出了源自MARCKS、MARCKSL1和BASP1的功能研究的三个不同共有序列，以及用于将货物负载到外来体腔中的每个序列的氨基酸需求(SEQ ID NO：118)。
图22A示出了天然外来体或从稳定表达与BASP1的氨基酸1-10或1-30融合的Cas9的细胞中纯化外来体的总蛋白(顶部)和抗Cas9蛋白质印迹(底部)，以及减少量的重组Cas9。图22B(顶部)示出了源自图22A的蛋白质印迹结果的Cas9光密度测定法的标准曲线。图22B(底部)进一步提供了基于标准曲线估算的，每个纯化外来体负载的作为与BASP1的1-30氨基酸或1-10氨基酸片段缀合的融合蛋白的Cas9量。
图23A示出了从用表达BASP1 N末端(氨基酸1-10)与卵清蛋白的融合体(“BASP1(1-10)-OVA”)的构建体稳定转染的细胞或用两种构建体稳定转染的细胞中纯化外来体的蛋白凝胶图像，所述两种构建体一种表达BASP1 N末端(氨基酸1-10)与卵清蛋白的融合体，并且另一种表达与跨膜蛋白PTGFRN融合的CD40L(“BASP1(1-10)-OVA；3XCD40L-PTGFRN”)。图23A进一步示出了负载减少量的重组OVA的蛋白凝胶的图像。图23B示出了来自图23A的样品的抗卵清蛋白蛋白质印迹结果。
图24A示出了针对与BASP1的氨基酸1-10和FLAG标签融合的GFP的骆驼纳米抗体的序列(SEQ ID NO:150)。图24B示出了来自稳定表达图24A的融合蛋白(“BASP1(1-10)-纳米抗体”)或缺少BASP1序列的蛋白质(“纳米抗体”)的细胞的纯化外来体的蛋白凝胶和抗FLAG蛋白质印迹结果。
图25示出了外来体mRNA负载体系的示意图，该负载体系包含(i)与FLAG和单体或二聚体MCP变体(1XMCP(V29I)(“815”；SEQ ID NO:111)、1XMCP(V29I/N55K)(“817”；SEQ IDNO:112)、2XMCP(V29I)(“819”；SEQ ID NO:113)或2XMCP(V29I/N55K))(“821”；SEQ ID NO:114)融合的BASP1(1-30)和(ii)含有3x MS2发夹环的荧光素酶mRNA(“荧光素酶-MS2 mRNA”或“811”；SEQ ID NO:115)。
图26A示出了外来体的蛋白凝胶，所述外来体含有图25中所述的mRNA负载构建体、荧光素酶mRNA(811)与各种BASP1融合蛋白(815、817或819)的组合。图26B示出了图26A中的样品的抗FLAG蛋白质印迹结果。
图27A示出了含有图25中所示的mRNA负载构建体的细胞(顶部)或外来体(底部)中萤光素酶mRNA的量的RT-qPCR结果。图27B示出了定量来自图27A中的样品的纯化外来体中荧光素酶mRNA的量的表，该表包括相对于萤光素酶mRNA的随机负载的倍数富集。
图28示出了与MARCKS、MARCKSL1和BASP1的N末端片段融合以允许锚定在外来体腔中的跨膜蛋白的外表面展示的CD40L三聚体的示意图。
图29A示出了在与CD40L表面表达外来体一起孵育的培养物中小鼠B细胞活化的结果，所述外来体与MARCKS、MARCKSL1和BASP1的N末端片段融合。图29B示出了在与CD40L表面表达外来体一起孵育的培养物中人B细胞活化的结果，所述外来体与MARCKS、MARCKSL1和BASP1的N末端片段融合。图29C示出了当与MARCKS、MARCKSL1、BASP1或全长PTGFRN的N末端序列融合时，不同CD40L表面展示外来体的相对效力的图表。
图30提供了从不同来源(HEK293SF，肾；HT1080，结缔组织；K562，骨髓；MDA-MB-231，乳腺；Raji，淋巴母细胞；间充质干细胞(MSC)，骨髓)的各种细胞系纯化外来体中的腔蛋白(MARCKS、MARCKSL1、和BASP 1)和常规外来体蛋白(CD81和CD9)的肽谱匹配(PSM)数。
图31示出了单独的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞来源的外来体，或来自过表达与FLAG-GFP融合的BASP1或BASP1 N末端片段(1-30或1-8)的细胞的外来体的蛋白凝胶(左侧)和抗FLAG蛋白质印迹(右侧)。
具体实施方式
定义
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术性和科学性术语具有本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的含义。如本文所用，以下术语具有以下赋予其的含义。
如本文所用，术语“细胞外囊泡”或“EV”是指细胞衍生的囊泡，其包含封闭内部空间的膜。细胞外囊泡包括所有膜结合囊泡，其直径小于其来源细胞的直径。通常，细胞外囊泡的直径范围为20nm至1000nm，并且可以包含在内部空间内、显示在细胞外囊泡的外表面上和/或跨越膜的各种大分子有效负载物。所述有效负载物可以包括核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质、小分子和/或其组合。作为示例而非限制，细胞外囊泡包括凋亡体、细胞碎片、通过直接或间接操作(例如，通过连续挤压或用碱性溶液处理)从细胞衍生的囊泡、囊泡细胞器和活细胞产生的囊泡(例如，通过直接质膜出芽或晚期内体与质膜融合)。细胞外囊泡可以源自活的或死的生物体、移植的组织或器官和/或培养的细胞。
如本文所用，术语“外来体”是指细胞衍生的小(直径在20-300nm之间，更优选直径在40-200nm之间)囊泡，其包括封闭内部空间的膜，并且由所述细胞通过直接质膜出芽或通过晚期内体与质膜融合而产生。外来体是细胞外囊泡的一种。外来体包含脂质或脂肪酸和多肽，并且任选地包含有效负载物(例如治疗剂)、接收器(例如靶向部分)、多核苷酸(例如核酸、RNA或DNA)、糖(例如单糖、多糖或聚糖)或其他分子。外来体可以源自生产细胞，并且基于其大小、密度、生化参数或其组合从生产细胞中分离。
如本文所用，术语“纳米囊泡”是指细胞衍生的小(直径在20-250nm之间，更优选直径在30-150nm之间)囊泡，其包括封闭内部空间的膜，并且通过直接或间接操作由所述细胞产生，使得在没有所述操作的情况下所述生产细胞将不产生所述纳米囊泡。所述生产细胞的适当操作包括但不限于连续挤压、用碱性溶液处理、超声波处理或其组合。在一些情况下，纳米囊泡的产生可能导致所述生产细胞的破坏。优选地，纳米囊泡的群体基本上不含通过从质膜直接出芽或晚期内体与质膜融合从生产细胞衍生的囊泡。纳米囊泡包含脂质或脂肪酸和多肽，并且任选地包含有效负载物(例如治疗剂)、接收器(例如靶向部分)、多核苷酸(例如核酸、RNA或DNA)、糖(例如单糖、多糖或聚糖)或其他分子。一旦根据所述操作从生产细胞衍生出纳米囊泡，就可以基于其大小、密度、生化参数或其组合从生产细胞中分离出纳米囊泡。
如本文所用，术语“腔工程化外来体”是指内部腔空间的组成被修饰的外来体。例如，腔的蛋白质、脂质、小分子、碳水化合物等组成被修饰。所述组成可以通过化学、物理或生物方法改变，或者通过由先前通过化学、物理或生物方法修饰的细胞产生来改变。具体地，所述组成可以通过基因工程改变，或者通过由先前通过基因工程修饰的细胞产生来改变。
如本文所用，术语蛋白质的“修饰物”是指对蛋白质的非突变氨基酸序列具有至少15％同一性的蛋白质。蛋白质的修饰物包括蛋白质的片段或变体。蛋白质的修饰进一步可以包括对蛋白质的片段或变体的化学或物理修饰。
如本文所用，术语蛋白质的“片段”是指与天然存在的蛋白质相比在N和/或C末端缺失的蛋白质。优选地，MARCKS、MARCKSL1或BASP1的片段保留特异性靶向外来体腔的能力。这种片段也被称为“功能片段”。片段是否是所述意义上的功能片段可以通过任何本领域已知的方法来评估，以确定外来体的蛋白质含量，所述方法包括蛋白质印迹、FACS分析和片段与自体荧光蛋白质例如像GFP的融合。在一个特定的实施方案中，MARCKS、MARCKSL1、或BASP1的片段保留了天然存在的MARCKS、MARCKSL1、或BASP1特异性地靶向外来体的能力的至少50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一个特定的实施方案中，MARCKS、MARCKSL1、BASP1的变体或MARCKS、MARCKSL1、或BASP1的片段的能力分别是MARCKS、MARCKSL1、和BASP1特异性地靶向外来体腔的能力的至少70％、80％、85％、90％、95％或99％。这种能力可以例如通过荧光标记的变体，在实验部分中所述的测定中评估。
如本文所用，术语蛋白质的“变体”是指通过本领域已知的方法比对后与另一蛋白质共享特定氨基酸序列同一性的蛋白质。蛋白质的变体可以包括另一种蛋白质中的取代、插入、缺失、移码或重排。在一个特定的实施方案中，变体是与MARCKS、MARCKSL1、BASP1或MARCKS、MARCKSL1或BASP1的片段具有至少70％同一性的变体。在一些实施方案中，MARCKS的变体或片段变体与根据SEQ ID NO:1的MARCKS或与其功能片段共享至少70％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，MARCKSL1的变体或片段变体与根据SEQ ID NO:2的MARCKSL1或与其功能片段共享至少70％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，BASP1的变体或片段变体与根据SEQ ID NO:3的BASP1或与其功能片段共享至少70％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性。在上述每种情况下，优选变体或片段变体保留特异性地靶向外来体腔的能力。
用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。各种程序和比对算法描述于：Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)；Needleman和Wunsch,J.Mol.Bio.48:443(1970)；Pearson和Lipman,Methods in Mol.Biol.24:307-31(1988)；Higgins和Sharp,Gene 73:15237-44(1988)；Higgins和Sharp,CABIOS 5:151-3(1989)Corpet等人,Nuc.Acids Res.16:10881-90(1988)；Huang等人,Comp.Appl.BioSci.8:155-65(1992)；以及Pearson等人,Meth.Mol.Biol.24:307-31(1994)中。NCBI基本局部比对研究工具(BLAST)[Altschul 20等人,J.Mol.Biol.215:403-10(1990)J可来自若干来源，包括国家生物信息中心(NBCl,Bethesda,Md.)和在因特网上获得以与序列分析程序blastp、blasm、blastx、tblastn和tblastx关联使用。BLAST和如何使用所述程序确定序列同一性的描述可以在NIH(国家卫生研究院)下属的NCBI(国家生物技术信息中心)官方网站上访问。
本文提供的任何蛋白质的叙述涵盖蛋白质的功能变体。术语蛋白质的“功能变体”是指蛋白质的变体，其保留了特异性地靶向外来体腔的能力。在一个特定的实施方案中，MARCKS、MARCKSL1、BASP1的功能变体或MARCKS、MARCKSL1、或BASP1的片段的能力分别是MARCKS、MARCKSL1、和BASP1特异性地靶向外来体腔的能力的至少70％、80％、85％、90％、95％或99％。
如本文所用，术语“生产细胞”是指用于产生外来体的细胞。生产细胞可以是体外培养的细胞，或者体内的细胞。生产细胞包括但不限于已知能有效产生外来体的细胞，例如HEK293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和间充质干细胞(MSC)。
如本文所用，术语“靶蛋白”或“靶肽”是指可以靶向外来体腔的蛋白质或肽。靶蛋白或肽可以是天然地靶向外来体腔的非突变蛋白，或者所述非突变蛋白的片段或修饰物。靶蛋白可以是融合蛋白，其含有flag标签、治疗性肽、靶向部分、或附着到所述非突变蛋白的其他肽，或所述非突变蛋白的修饰物或片段。靶蛋白可以包含修饰，如肉豆蔻酰化、异戊二烯化或棕榈酰化，或通过接头附着到膜内部小叶的可溶性蛋白。
如本文所用，术语“货物蛋白”或“货物肽”是指可以被负载到外来体或工程化外来体中的任何蛋白质或肽，或其片段或修饰物。货物蛋白或肽可以包括作用于与外来体接触的靶标(例如靶细胞)的治疗性肽或蛋白。货物蛋白可以是融合蛋白，其包含如上所述的靶蛋白或肽或其片段或修饰物，使得货物融合蛋白可以靶向外来体腔。
如本文所用，术语“污染蛋白”是指是与外来体不相关的蛋白质。例如，污染蛋白包括未被封闭在外来体中且未附着或结合到外来体膜中的蛋白质。
如本文所用，术语“分离(isolate)”、“分离(isolated)”和“分离(isolating)”或“纯化(purify)”、“纯化(purified)”和“纯化(purifying)”以及“提取(extracted)”和“提取(extracting)”可互换使用，并且是指已经经历一个或多个纯化过程(例如选择或富集期望的外来体制剂)的期望EV的制剂状态(例如，多个已知或未知的量和/或浓度)。在一些实施方案中，如本文所用的分离或纯化是从含有生产细胞的样品中除去、部分除去(例如，一部分)外来体的过程。在一些实施方案中，分离的外来体组合物没有可检测的不期望活性，或者可替代地，不期望活性的水平或量等于或低于可接受的水平或量。在其他实施方案中，分离的外来体组合物具有的所期望外来体的量和/或浓度等于或高于可接受的量和/或浓度。在其他实施方案中，与获得所述组合物的起始材料(例如，生产细胞制剂)相比，分离的外来体组合物富集。与起始材料相比，这种富集可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％、99.999％、或大于99.9999％。在一些实施方案中，分离的外来体制剂基本上不含残留的生物产品。在一些实施方案中，分离的外来体制剂100％不含、99％不含、98％不含、97％不含、96％不含、95％不含、94％不含、93％不含、92％不含、91％不含或90％不含任何污染性生物物质。残留的生物产品可能包括非生物物质(包括化学物质)或不需要的核酸、蛋白质、脂质或代谢物。基本上不含残留生物产物还意指外来体组合物不含可检测的生产细胞，并且仅外来体是可检测的。
术语“赋形剂”或“载体”是指添加到药物组合物中以进一步促进化合物施用的惰性物质。术语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”涵盖美国联邦政府监管机构批准的或美国药典中列出的用于动物(包括人)的任何药剂，以及不会对受试者造成显著刺激且不会消除所施用化合物的生物活性和特性的任何载体或稀释剂。包括赋形剂和载体，它们可用于制备药物组合物，并且通常是安全、无毒和期望的。
如本文所用，术语“有效负载物”是指作用于与EV接触的靶标(例如靶细胞)的治疗剂。可以被引入外来体和/或生产细胞中的有效负载物包括治疗剂，如核苷酸(例如，包含可检测部分或毒素或破坏转录的核苷酸)、核酸(例如，编码多肽如酶的DNA或mRNA分子，或具有调节功能的RNA分子如miRNA、dsDNA、lncRNA和siRNA)、氨基酸(例如，包含可检测部分或毒素或破坏翻译的氨基酸)、多肽(例如，酶)、脂质、碳水化合物、病毒和病毒颗粒(例如，腺相关病毒和病毒颗粒、逆转录病毒、腺病毒等)和小分子(例如，小分子药物和毒素，包括小分子STING激动剂，包括环状二核苷酸，如ML-RR S2和3’-3’cAIMPdFSH)。
如本文所用，“哺乳动物受试者”包括所有哺乳动物，包括但不限于人、家畜(例如狗、猫等)、农场动物(例如牛、羊、猪、马等)和实验室动物(例如猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠等)。
术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用并且是指期望诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者，具体是人。本文所述的方法适用于人疗法和兽医学应用两者。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，并且在其他实施方案中，受试者是人。
如本文所用，术语“基本上不含”意指包含外来体的样品包含质量/体积(m/v)百分比浓度小于10％的大分子。一些级分可能含有小于0.001％、小于0.01％、小于0.05％、小于0.1％、小于0.2％、小于0.3％、小于0.4％、小于0.5％、小于0.6％、小于0.7％、小于0.8％、小于0.9％、小于1％、小于2％、小于3％、小于4％、小于5％、小于6％、小于7％、小于8％、小于9％或小于10％(m/v)的大分子。
如本文所用，术语“大分子”意指核酸、外源蛋白、脂质、碳水化合物、代谢物或其组合。
如本文所用，术语“常规外来体蛋白”意指先前已知在外来体中富集的蛋白质，包括但不限于CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI锚蛋白、乳凝集素LAMP2和LAMP2B、其片段或与其结合的肽。为了避免疑问，PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP转运蛋白或其片段或变体不是常规的外来体蛋白。
其他解释惯例
本文列举的范围应理解为所述范围内的所有值(包括所列举的端点值)的速记法。例如，范围1至50应理解为包括由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50组成的组中的任何数值、数值组合或子范围。
除非另外指明，否则提及具有一个或多个立构中心的化合物是指每种立体异构体及其立体异构体的所有组合。
外来体蛋白
本发明的一些实施方案涉及外来体蛋白的鉴定、使用和修饰，所述外来体蛋白在外来体腔中高度富集。此类外来体蛋白可以通过用质谱或本领域已知的其他方法分析高度纯化外来体来鉴定。
所述蛋白质包括富集在外来体膜上的各种腔蛋白或膜蛋白，如跨膜蛋白、整合蛋白和外周蛋白。具体地，所述蛋白质包括但不限于(1)豆蔻酰化的富含丙氨酸的蛋白激酶C底物(MARCKS)；(2)豆蔻酰化的富含丙氨酸的蛋白激酶C底物样1(MARCKSL1)；和(3)脑酸溶性蛋白1(BASP1)。
根据生产细胞、生产条件、纯化方法或外来体的预期应用，可以选择性地使用本文鉴定的一种或多种外来体蛋白。可以鉴定富集在具有特定大小范围、靶向部分、电荷密度、有效负载物等的某些外来体腔中的外来体蛋白，并且将其用于本发明的一些实施方案中。在一些实施方案中，可以同时或随后使用多于一种的外来体蛋白来产生和分离治疗性外来体。
腔工程化外来体
本发明的另一方面涉及腔工程化外来体的产生和使用。腔工程化外来体具有其组成被修饰的内部空间。例如，可以通过改变腔的蛋白质、脂质或聚糖含量来修饰腔的组成。
在一些实施方案中，腔工程化外来体通过化学和/或物理方法(如PEG诱导的融合和/或超声波融合)产生。
在其他实施方案中，腔工程化外来体由基因工程产生。由遗传修饰的生产细胞或遗传修饰细胞的后代产生的外来体可以含有修饰的腔组合物。在一些实施方案中，腔工程化外来体具有较高或较低密度的外来体蛋白，或者包括外来体蛋白的修饰物或片段。
例如，腔工程化外来体可以由用编码外来体蛋白或外来体蛋白修饰物或片段的外源序列转化的细胞产生。包括由外源序列表达的蛋白质的外来体可以包括修饰的腔蛋白组合物。
外来体蛋白的各种修饰物或片段可以用于本发明的实施方案。例如，可以使用被修饰以更有效地靶向外来体腔的蛋白质。还可以使用被修饰以包含特异性且有效靶向外来体腔所需的最小片段的蛋白质。
还可以使用具有治疗活性的融合蛋白。例如，融合蛋白可以包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其修饰物，特别是其片段或变体，以及治疗性肽或货物蛋白或肽。在一些实施方案中，融合蛋白包含BASP1的氨基末端的片段。
治疗性肽选自由天然肽、重组肽、合成肽或至治疗性化合物的接头组成的组。治疗性化合物可以是核苷酸、氨基酸、脂质、碳水化合物或小分子。治疗性肽可以是抗体、酶、配体、抗原(例如，肿瘤抗原或来自如细菌、病毒、真菌或原生动物的传染原的抗原)、受体、抗微生物肽、转录因子或其片段或修饰物。融合蛋白可以在外来体腔中呈现，并为外来体提供治疗活性。
在一些实施方案中，治疗性肽是基因组编辑复合物的组分。在一些实施方案中，所述基因组编辑复合物是转录激活子样效应因子核酸酶(TAL-效应子核酸酶或TALEN)；锌指核酸酶(ZFN)；重组酶；CRISPR/Cas9复合物、CRISPR/Cpf1复合物、CRISPR/C2c1、C2c2或C2c3复合物、CRISPR/CasY或CasX复合物、或本领域已知的任何其他适当的CRISPR复合物；或本领域已知的任何其他适当的基因组编辑复合物或其任何组合。
在一些实施方案中，治疗性肽是跨膜肽。本文所述的跨膜肽可以表达为与本文所述的任何序列或其任何片段或变体的融合蛋白。在一些实施方案中，跨膜蛋白具有与外来体腔中的腔序列融合的第一末端，和在外来体表面上表达的第二末端。在一些实施方案中，跨膜蛋白包含PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP转运蛋白或其片段或变体。
在一些实施方案中，治疗性肽是核酸结合蛋白。在一些实施方案中，核酸结合蛋白是Dicer(一种Argonaute蛋白)、TRBP、MS2噬菌体外壳蛋白。在一些实施方案中，核酸结合蛋白另外地包含一种或多种RNA或DNA分子。在一些实施方案中，所述一种或多种RNA是miRNA、siRNA、引导RNA、lincRNA、mRNA、反义RNA、dsRNA或其组合。
在一些实施方案中，治疗性肽是蛋白质-蛋白质相互作用系统的一部分。在一些实施方案中，蛋白质-蛋白质相互作用系统包括FRB-FKBP相互作用系统，例如，如Banaszynski等人,J Am Chem Soc.2005年4月6日；127(13):4715-21中所述的FRB-FKBP相互作用系统。
融合蛋白可以靶向外来体腔，并且为外来体提供治疗活性。
在一些实施方案中，使用了具有靶向部分的融合蛋白。例如，融合蛋白可以包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1、或其片段或修饰物、以及靶向部分。靶向部分可以用于将外来体靶向特定器官、组织或细胞，以使用外来体进行治疗。在一些实施方案中，靶向部分是抗体或其抗原结合片段。抗体及其抗原结合片段包括全抗体、多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体、其片段，并且进一步包括单链抗体、人源化抗体、鼠抗体、嵌合抗体、鼠-人抗体、鼠-灵长类动物抗体、灵长类动物-人单克隆抗体、抗独特型抗体、抗体片段，例如像scFv、(scFv)2、Fab、Fab’和F(ab')2、F(ab1)2、Fv、dAb和Fd片段、双抗体和抗体相关多肽。抗体及其抗原结合片段也包括双特异性抗体和多特异性抗体，只要它们表现出所期望的生物活性或功能。
在一些实施方案中，使用了包含病毒蛋白的融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白包含病毒衣壳或包膜蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白允许组装保留在外来体腔中的完整病毒。
在一些实施方案中，与缺少MARCKS、MARCKSL1、BASP1、SEQ ID NO:4-109中的任一种、或其修饰物，特别是其片段或变体的融合蛋白相比，或与包含常规外来体蛋白的融合蛋白相比，包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1、SEQ ID NO:4-109中的任一种或其修饰物，特别是其片段或变体的融合蛋白，导致融合蛋白在外来体中富集。在一些实施方案中，包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1、SEQ ID NO:4-109中的任一种或其片段或修饰物的融合蛋白包含具有序列MGXKLSKKK的肽，其中X是丙氨酸或任何其他氨基酸(SEQ ID NO:117)；或具有序列(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)的肽，其中每个括号内位置表示氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任何氨基酸，ξ是选自由(Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His、Arg)组成的组的任何氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任何氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu)。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含具有序列(M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)的肽，其中每个括号内位置表示氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任何氨基酸，X是任何氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任何氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu)。在一些实施方案中，常规外来体蛋白选自由CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI锚蛋白、LAMP2、LAMP2B及其片段组成的列表。在一些实施方案中，包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1、SEQID NO:4-109中的任一种或其片段或修饰物的融合蛋白在外来体中的富集比缺少MARCKS、MARCKSL1、BASP1、SEQ ID NO:4-109中的任一种或其片段或修饰物的融合蛋白，或比包含常规外来体蛋白的融合蛋白高>2倍、>4倍、>8倍、>16倍、>25倍、>50倍、>100倍、>200倍、>500倍、>750倍、>1,000倍、>2,000倍、>5,000倍、>7,500倍、>10,000倍。在一些实施方案中，SEQID NO:1-109中任一种的蛋白质序列足以用融合蛋白负载外来体。
在一些实施方案中，包含含有外源序列和本文新鉴定的外来体腔蛋白的融合蛋白的腔工程化外来体比包含与本领域已知的常规外来体蛋白(例如CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI锚蛋白、乳凝集素LAMP2和LAMP2B、其片段或与其结合的肽)缀合的外源序列的相似工程化外来体具有更高的融合蛋白密度。在一些实施方案中，与使用常规外来体蛋白类似修饰的其他外来体腔中的融合蛋白相比，所述含有本文新鉴定的外来体蛋白的融合蛋白在外来体腔中以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用常规外来体蛋白类似修饰的其他外来体腔中的融合蛋白相比，所述含有本文新鉴定的外来体蛋白的融合蛋白在外来体腔中以2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更高的密度存在。
在一些实施方案中，与使用CD9类似修饰的外来体相比，包含MARCKS、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用CD63类似修饰的外来体相比，包含MARCKS、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用CD81类似修饰的外来体相比，包含MARCKS、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用PDGFR类似修饰的外来体相比，包含MARCKS、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用GPI锚蛋白类似修饰的外来体相比，包含MARCKS、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用乳凝集素类似修饰的外来体相比，包含MARCKS、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用LAMP2类似修饰的外来体相比，包含MARCKS、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用LAMP2B类似修饰的外来体相比，包含MARCKS、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用常规蛋白类似修饰的外来体相比，包含MARCKS、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用常规外来体蛋白的变体类似修饰的外来体相比，包含MARCKS、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些实施方案中，与使用CD9类似修饰的外来体相比，包含MARCKSL1、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用CD63类似修饰的外来体相比，包含MARCKSL1、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用CD81类似修饰的外来体相比，包含MARCKSL1、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用PDGFR类似修饰的外来体相比，包含MARCKSL1、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用GPI锚蛋白类似修饰的外来体相比，包含MARCKSL1、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用乳凝集素类似修饰的外来体相比，包含MARCKSL1、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用LAMP2类似修饰的外来体相比，包含MARCKSL1、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用LAMP2B类似修饰的外来体相比，包含MARCKSL1、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用常规蛋白类似修饰的外来体相比，包含MARCKSL1、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用常规外来体蛋白的变体类似修饰的外来体相比，包含MARCKSL1、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些实施方案中，与使用CD9类似修饰的外来体相比，包含BASP1、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用CD63类似修饰的外来体相比，包含BASP1、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用CD81类似修饰的外来体相比，包含BASP1、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用PDGFR类似修饰的外来体相比，包含BASP1、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用GPI锚蛋白类似修饰的外来体相比，包含BASP1、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用乳凝集素类似修饰的外来体相比，包含BASP1、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用LAMP2类似修饰的外来体相比，包含BASP1、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用LAMP2B类似修饰的外来体相比，包含BASP1、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用常规蛋白类似修饰的外来体相比，包含BASP1、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用常规外来体蛋白的变体类似修饰的外来体相比，包含BASP1、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些实施方案中，与使用CD9类似修饰的外来体相比，包含SEQ ID NO:1-109中的任一种、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用CD63类似修饰的外来体相比，包含SEQ ID NO:1-109中的任一种、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用CD81类似修饰的外来体相比，包含SEQ ID NO:1-109中的任一种、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用PDGFR类似修饰的外来体相比，包含SEQ ID NO:1-109中的任一种、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用GPI锚蛋白类似修饰的外来体相比，包含SEQID NO:1-109中的任一种、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用乳凝集素类似修饰的外来体相比，包含SEQ ID NO:1-109中的任一种、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用LAMP2类似修饰的外来体相比，包含SEQ ID NO:1-109中的任一种、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用LAMP2B类似修饰的外来体相比，包含SEQ IDNO:1-109中的任一种、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用常规蛋白类似修饰的外来体相比，包含SEQ ID NO:1-109中的任一种、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与使用常规外来体蛋白的变体类似修饰的外来体相比，包含SEQ ID NO:1-109中的任一种、其变体、片段、片段变体、或修饰物的融合蛋白以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。
在一些实施方案中，与本领域已知的腔工程化外来体相比，本文所述的腔工程化外来体展现出优异的特征。例如，通过使用本文提供的新鉴定的外来体蛋白产生的腔工程化外来体与现有技术中的外来体(例如使用常规外来体蛋白产生的那些外来体)相比，在其腔中含有更高度富集的修饰蛋白质。此外，与本领域已知的腔工程化外来体相比，本发明的腔工程化外来体可以具有更大、更特异或更可控的生物活性。例如，包含与本文所述外来体蛋白或其片段(例如BASP1或其片段)融合的治疗性或生物学相关外源序列的腔工程化外来体可以比与本领域已知的支架融合具有更多期望的工程化特征。本领域已知的支架蛋白包括四次跨膜蛋白分子(例如CD63、CD81、CD9等)、溶酶体相关膜蛋白2(LAMP2和LAMP2B)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、GPI锚蛋白、乳凝集素及其片段，以及对这些蛋白质或其片段中的任一种具有亲和力的肽。为了避免疑问，PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP转运蛋白或其片段或变体不是常规的外来体蛋白。先前，外源蛋白的过表达依赖于外源蛋白在外来体中的随机或随意分布来产生腔工程化外来体。这导致外来体中外源蛋白的低水平、不可预测的密度。因此，本文所述的外来体蛋白及其片段在新的外来体组合物及其制备方法方面提供了重要的进展。
本文提供的融合蛋白可以包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段或变体以及附加肽。附加肽可以附着到外来体蛋白或其片段或变体的N末端或C末端。
在一些实施方案中，本文提供的融合蛋白包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段或变体以及两个附加肽。这两个附加肽可以附着到外来体蛋白或其片段或变体的N末端或C末端。在一些实施方案中，两个附加肽中的一个附着到外来体蛋白或其片段或变体的N末端，并且两个附加肽中的另一个附着到C末端。
在一些实施方案中，本文所述的产生腔工程化细胞外囊泡的组合物和方法包含纳米囊泡。
用于生产腔工程化外来体的生产细胞
本发明的外来体可以由体外生长的细胞或受试者的体液产生。当外来体由体外细胞培养物产生时，各种生产细胞，例如HEK293细胞可以用于本发明。可以用于产生本文所述的腔工程化外来体的其他细胞类型包括但不限于间充质干细胞、T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞和癌细胞系。
可以对生产细胞进行遗传修饰，使其包含一个或多个外源序列，以产生腔工程化外来体。遗传修饰的生产细胞可以含有通过瞬时或稳定转化的外源序列。外源序列可以作为质粒转化。外源序列可以在靶位点或随机位点处，稳定地整合到生产细胞的基因组序列中。在一些实施方案中，产生稳定的细胞系用于生产腔工程化外来体。
外源序列可以插入到生产细胞的基因组序列中，位于编码外来体蛋白的内源序列的上游(5’末端)或下游(3’末端)。本领域已知的各种方法可以用于将外源序列引入生产细胞中。例如，使用各种基因编辑方法(例如，使用同源重组、转座子介导系统、loxP-Cre系统、CRISPR/Cas9或TALEN的方法)修饰的细胞在本发明的范围内。
外源序列可以包括编码外来体蛋白或所述外来体蛋白的修饰物或片段的序列。可以引入编码外来体蛋白的序列的额外拷贝，以产生具有更高密度外来体蛋白的腔工程化外来体。可以引入编码外来体蛋白的修饰物或片段的外源序列，以产生含有外来体蛋白的修饰物或片段的腔工程化外来体。可以引入编码亲和标签的外源序列，以产生含有融合蛋白的腔工程化外来体，所述融合蛋白包含附着到外来体蛋白的亲和标签。
在一些实施方案中，与从相同或相似生产细胞类型分离的天然外来体相比，腔工程化外来体具有更高的外来体蛋白密度。在一些实施方案中，与所述天然外来体相比，所述外来体蛋白在所述腔工程化外来体上以2、4、8、16、32、64、100、200、400、800、1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与所述天然外来体相比，所述外来体蛋白在所述腔工程化外来体上以2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与所述天然外来体上的未修饰外来体蛋白相比，包含外来体蛋白的融合蛋白在所述腔工程化外来体上以2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与所述天然外来体上的未修饰外来体蛋白相比，外来体蛋白的片段或变体在所述腔工程化外来体上以2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更高的密度存在。
在特定的实施方案中，与所述天然外来体上的未修饰MARCKS相比，MARCKS、MARCKS的片段或变体或其修饰物在所述腔工程化外来体上以2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与所述天然外来体上的未修饰MARCKSL1相比，MARCKSL1、MARCKSL1的片段或变体或其修饰物在所述腔工程化外来体上以2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更高的密度存在。在一些实施方案中，与所述天然外来体上的未修饰BASP1相比，BASP1、BASP1的片段或变体或其修饰物在所述腔工程化外来体上以2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更高的密度存在。
在一些实施方案中，生产细胞被进一步修饰以包含额外的外源序列。例如，可以包括额外的外源序列来调节内源基因表达，或者产生包含特定多肽作为有效负载物的外来体。在一些实施方案中，生产细胞被修饰以包含两个外源序列，一个编码外来体蛋白或所述外来体蛋白的修饰物或片段，并且另一个编码有效负载物。
更具体地，腔工程化外来体可以由用编码一种或多种外来体腔蛋白的序列转化的细胞产生，所述外来体腔蛋白包括但不限于(1)豆蔻酰化的富含丙氨酸的蛋白激酶C底物(MARCKS)；(2)豆蔻酰化的富含丙氨酸的蛋白激酶C底物样1(MARCKSL1)；和(3)脑酸溶性蛋白1(BASP1)。本文所述的一种或多种外来体腔蛋白中的任一种都可以从质粒、插入到基因组中的外源序列或其他外源核酸如合成信使RNA(mRNA)表达。
在一些实施方案中，所述一种或多种外来体腔蛋白在用编码其全长内源形式的外源序列转化的细胞中表达。在一些实施方案中，这种外源序列编码SEQ ID NO:1的MARCKS蛋白。在一些实施方案中，这种外源序列编码SEQ ID NO:2的MARCKSL1蛋白。在一些实施方案中，这种外源序列编码SEQ ID NO:3的BASP1蛋白。
腔工程化外来体可以由用编码一种或多种外来体腔蛋白片段的序列转化的细胞产生，所述外来体腔蛋白包括但不限于(1)豆蔻酰化的富含丙氨酸的蛋白激酶C底物(MARCKS)；(2)豆蔻酰化的富含丙氨酸的蛋白激酶C底物样1(MARCKSL1)；和(3)脑酸溶性蛋白1(BASP1)。在一些实施方案中，所述序列编码从天然蛋白质的N末端缺失至少5、10、50、100、200、或300个氨基酸的外来体腔蛋白片段。在一些实施方案中，所述序列编码从天然蛋白质的C末端缺失至少5、10、50、100、200、或300个氨基酸的外来体腔蛋白片段。在一些实施方案中，所述序列编码从天然蛋白质的N末端和C末端缺失至少5、10、50、100、200、或300个氨基酸的外来体腔蛋白片段。在一些实施方案中，所述序列编码缺少天然蛋白质的一个或多个功能或结构结构域的外来体腔蛋白片段。在一些实施方案中，融合蛋白包含SEQ IDNO:4-109的肽。在一些实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO:13的肽。在一些实施方案中，融合蛋白包含具有序列MGXKLSKKK的肽，其中X是丙氨酸或任何其他氨基酸(SEQ ID NO:117)。在一些实施方案中，融合蛋白包含具有序列(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)的肽，其中每个括号内位置表示氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任何氨基酸，ξ是选自由(Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His、Arg)组成的组的任何氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任何氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu)。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含具有序列(M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)的肽，其中每个括号内位置表示氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任何氨基酸，X是任何氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任何氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu)。
在一些实施方案中，腔工程化外来体可以由用编码与一种或多种异源蛋白质融合的外来体蛋白或其片段或修饰物的序列转化的细胞产生。在一些实施方案中，将一种或多种异源蛋白质与外来体蛋白或其修饰物，特别是其片段或变体的N末端融合。在一些实施方案中，将一种或多种异源蛋白质与外来体蛋白或其修饰物，特别是其片段或变体的C末端融合。在一些实施方案中，将一种或多种异源蛋白质与外来体蛋白或其修饰物，特别是其片段或变体的N末端和C末端融合。在一些实施方案中，所述一种或多种异源蛋白质是哺乳动物蛋白质。在一些实施方案中，所述一种或多种异源蛋白质是人蛋白质。
在一些实施方案中，腔工程化外来体由用编码与天然外来体腔蛋白的全长或片段相同或相似的序列的多肽的序列转化的细胞产生，所述天然外来体腔蛋白包括但不限于(1)豆蔻酰化的富含丙氨酸的蛋白激酶C底物(MARCKS)；(2)豆蔻酰化的富含丙氨酸的蛋白激酶C底物样1(MARCKSL1)；和(3)脑酸溶性蛋白1(BASP1)。在一些实施方案中，所述多肽与天然外来体腔蛋白的全长或片段50％相同，例如与SEQ ID NO:1-3 50％相同。在一些实施方案中，所述多肽与天然外来体腔蛋白的全长或片段60％相同，例如与SEQ ID NO:1-360％相同。在一些实施方案中，所述多肽与天然外来体腔蛋白的全长或片段70％相同，例如与SEQ ID NO:1-3 70％相同。在一些实施方案中，所述多肽与天然外来体腔蛋白的全长或片段80％相同，例如与SEQ ID NO:1-3 80％相同。在一些实施方案中，所述多肽与天然外来体腔蛋白的全长或片段90％相同，例如与SEQ ID NO:1-3 90％相同。在一些实施方案中，所述多肽与天然外来体腔蛋白的全长或片段95％相同，例如与SEQ ID NO:1-3 95％相同。在一些实施方案中，所述多肽与天然外来体腔蛋白的全长或片段99％相同，例如与SEQ IDNO:1-3 99％相同。在一些实施方案中，所述多肽与天然外来体腔蛋白的全长或片段99.9％相同，例如与SEQ ID NO:1-3 99.9％相同。
在一些实施方案中，由细胞产生的腔工程化外来体包含与脑酸溶性蛋白1(BASP1)的片段相同或相似的序列的多肽。在一些实施方案中，所述多肽与BASP1的全长或片段50％相同，例如与SEQ ID NO:4-109 50％相同。在一些实施方案中，所述多肽与BASP1的全长或片段60％相同，例如与SEQ ID NO:4-109 60％相同。在一些实施方案中，所述多肽与BASP1的全长或片段70％相同，例如与SEQ ID NO:4-10970％相同。在一些实施方案中，所述多肽与BASP1的全长或片段80％相同，例如与SEQ ID NO:4-109 80％相同。在一些实施方案中，所述多肽与BASP1的全长或片段90％相同，例如与SEQ ID NO:4-109 90％相同。在一些实施方案中，所述多肽与BASP1的全长或片段95％相同，例如与SEQ ID NO:4-109 95％相同。在一些实施方案中，所述多肽与BASP1的全长或片段99％相同，例如与SEQ ID NO:4-109 99％相同。在一些实施方案中，所述多肽与BASP1的全长或片段99.9％相同，例如与SEQ ID NO:4-109 99.9％相同。在一些实施方案中，所述多肽与BASP1的片段100％相同，例如与SEQ IDNO:4-109 100％相同。
外来体的表征
在一些实施方案中，本文所述的方法进一步包括表征包含在每个收集级分中的外来体的步骤。在一些实施方案中，可以提取外来体的内容物用于研究和表征。在一些实施方案中，外来体是分离的，并且通过包括但不限于大小、形状、形态或分子组成如核酸、蛋白质、代谢物和脂质的度量来表征。
外来体含量的测量
外来体可以包括蛋白质、肽、RNA、DNA和脂质。总RNA可以使用酸-酚:氯仿萃取法提取。然后，可以在回收含有小RNA的总RNA的条件下，或者在将长度小于200个核苷酸的小RNA物种从较长的RNA物种如mRNA中分离出来的条件下，使用玻璃纤维过滤器纯化RNA。因为RNA以小体积洗脱，所以分离RNA可能不需要醇沉淀步骤。
外显子组合物可以通过本领域已知的方法进行评估，所述方法包括但不限于转录组学、测序、蛋白质组学、质谱或HP-LC。
可以使用本领域技术人员熟知的多种技术(例如定量或半定量RT-PCR、Northern印迹分析、溶液杂交检测)来测量与分离的外来体相关的核苷酸组成(包括RNA和DNA)。在一个特定的实施方案中，通过以下测量至少一种RNA的水平：逆转录来自外来体组合物的RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸，将所述靶寡脱氧核苷酸与一种或多种RNA特异性探针寡核苷酸(例如，包含RNA特异性探针寡核苷酸的微阵列)杂交以提供外来体组合物的杂交谱，并将外来体组合物杂交谱与对照样品产生的杂交谱进行比较。测试样品中至少一种RNA的信号相对于对照样品的改变指示RNA的组成。
另外，可以由已知RNA序列产生的基因特异性寡核苷酸探针制备微阵列。所述阵列可以为每种RNA含有两种不同的寡核苷酸探针，一种含有活性的成熟序列，并且另一种对RNA的前体(例如miRNA和前miRNA)具有特异性。所述阵列还可以含有对照，如一个或多个与人直系同源物仅相差几个碱基的小鼠序列，其可以用作杂交严格性条件的对照。来自两种物种的tRNA和其他RNA(例如rRNA、mRNA)也可以印刷在微芯片上，从而为特异性杂交提供内部的、相对稳定的阳性对照。微芯片上还可以包括一种或多种用于非特异性杂交的适当对照。为此，基于与任何已知RNA没有任何同源性来选择序列。
微阵列可以使用本领域已知的技术制造。例如，适当长度(例如40个核苷酸)的探针寡核苷酸在C6位置处被5’-胺修饰，并使用可商购获得的微阵列系统(例如GeneMachineOmniGrid.TM.100微阵列和Amersham CodeLink.TM)印刷在活化的载玻片上。通过用标记引物逆转录靶RNA来制备对应于靶RNA的标记的cDNA寡聚体。在第一条链合成之后，RNA/DNA杂交体被变性以降解RNA模板。然后在杂交条件下，例如6倍，将如此制备的标记靶cDNA与微阵列芯片杂交。SSPE/30％甲酰胺在25℃下持续18小时，随后以0.75.倍洗涤。TNT在37℃下持续40分钟。在阵列上固定探针DNA识别样品中互补靶cDNA的位置处，杂交发生。标记的靶cDNA标记阵列上发生结合的确切位置，从而允许自动检测和定量。输出由一系列杂交事件组成，从而表明外来体制剂中特定cDNA序列的相对丰度，以及因此对应互补RNA的相对丰度。根据一个实施方案，标记的cDNA寡聚体是生物素标记的cDNA，由生物素标记的引物制备。然后通过使用例如链霉亲和素-Alexa647缀合物直接检测含有生物素的转录物来处理微阵列，并利用常规扫描方法扫描。阵列上每个点的图像强度与外来体中对应RNA的丰度成正比。
数据挖掘工作由生物信息学完成，包括扫描芯片、信号采集、图像处理、归一化、统计处理和数据比较以及路径分析。因此，微阵列可以以高通量性能同时分析成百上千个多核苷酸。mRNA表达的微阵列谱分析成功地为基础研究中的基因表达研究提供了有价值的数据。并且所述技术已在制药工业和临床诊断中得到进一步应用。随着越来越多的miRNA数据的获得，以及miRNA在基因调控中重要性的证据的积累，微阵列成为高通量miRNA研究的有用技术。利用多核苷酸探针分析miRNA水平也可以各种物理形式进行。例如，微量滴定板或自动化的使用可用于促进大量测试样品的处理。
外来体大小的测量
在一些实施方案中，本文所述的方法包括测量纯化级分中包含的外来体和/或外来体群体的大小。在一些实施方案中，外来体大小被测量为最长的可测量尺寸。一般来说，外来体最长的一般尺寸也称为其直径。
可以使用本领域已知的各种方法测量外来体大小，例如纳米粒子跟踪分析、多角度光散射、单角度光散射、尺寸排阻色谱法、分析超速离心、场流分级分离、激光衍射、可调电阻脉冲传感或动态光散射。
可以使用动态光散射(DLS)和/或多角度光散射(MALS)测量外来体大小。使用DLS和/或MALS测量外来体大小的方法是本领域技术人员已知的，并且包括纳米粒子跟踪测定(NTA，例如，使用Malvern Nanosight NS300纳米粒子跟踪装置)。在一个具体实施方案中，使用Malvern NanoSight NS300确定外来体大小。在一些实施方案中，本文所述的外来体具有如由NTA(例如，使用Malvern NanosightNS300)测量的约20-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体具有如由NTA(例如，使用Malvern NanosightNS300)测量的约40-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中90％的所述外来体具有如由NTA(例如，使用Malvern Nanosight NS300)测量的约20-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中95％的所述外来体具有如由NTA(例如，使用Malvern Nanosight NS300)测量的约20-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中99％的所述外来体具有如由NTA(例如，使用Malvern Nanosight NS300)测量的约20-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中90％的所述外来体具有如由NTA(例如，使用MalvernNanosight NS300)测量的约40-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中95％的所述外来体具有如由NTA(例如，使用Malvern NanosightNS300)测量的约40-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中99％的所述外来体具有如由NTA(例如，使用Malvern Nanosight NS300)测量的约40-1000nm的最长尺寸。
可以使用可调电阻脉冲传感(TRPS)测量外来体大小。在一个具体实施方案中，如由TRPS测量的外来体大小是使用iZON qNANO Gold确定的。在一些实施方案中，本文所述的外来体具有如由TRPS(例如，使用iZON qNano Gold)测量的约20-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体具有如由TRPS(例如，iZON qNano Gold)测量的约40-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中90％的所述外来体具有如由TRPS(例如，使用iZON qNano Gold)测量的约20-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中95％的所述外来体具有如由TRPS(例如，使用iZON qNano Gold)测量的约20-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中99％的所述外来体具有如由TRPS(例如，使用iZON qNanoGold)测量的约20-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中90％的所述外来体具有如由TRPS(例如，使用iZON qNano Gold)测量的约40-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中95％的所述外来体具有如由TRPS(例如，使用iZON qNano Gold)测量的约40-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中99％的所述外来体具有如由TRPS(例如，使用iZON qNano Gold)测量的约40-1000nm的最长尺寸。
可以使用电子显微镜测量外来体大小。在一些实施方案中，用于测量外来体大小的电子显微镜方法是透射电子显微镜。在一个具体实施方案中，用于测量外来体大小的透射电子显微镜是TecnaiTMG2Spirit BioTWIN。使用电子显微镜测量外来体大小的方法是本领域技术人员熟知的，并且任何这种方法都可以适用于测量外来体大小。在一些实施方案中，本文所述的外来体具有如由扫描电子显微镜(例如，TecnaiTMG2 Spirit BioTWIN扫描电子显微镜)测量的约20-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体具有如由扫描电子显微镜(例如，TecnaiTMG2 Spirit BioTWIN扫描电子显微镜)测量的约40-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中90％的所述外来体具有如由扫描电子显微镜(例如，TecnaiTMG2 Spirit BioTWIN扫描电子显微镜)测量的约20-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中95％的所述外来体具有如由扫描电子显微镜(例如，TecnaiTMG2Spirit BioTWIN扫描电子显微镜)测量的约20-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中99％的所述外来体具有如由扫描电子显微镜(例如，TecnaiTMG2 Spirit BioTWIN扫描电子显微镜)测量的约20-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中90％的所述外来体具有如由扫描电子显微镜(例如，TecnaiTMG2 SpiritBioTWIN扫描电子显微镜)测量的约40-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中95％的所述外来体具有如由扫描电子显微镜(例如，TecnaiTMG2Spirit BioTWIN扫描电子显微镜)测量的约40-1000nm的最长尺寸。在其他实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中99％的所述外来体具有如由扫描电子显微镜(例如，TecnaiTMG2 Spirit BioTWIN扫描电子显微镜)测量的约40-1000nm的最长尺寸。
个体外来体大小可以通过纳米流式细胞术基于逐个颗粒确定。在一些实施方案中，纳米流式细胞仪是流式纳米分析仪(NanoFCM公司；Xiamen,China)。在一些实施方案中，本文所述的外来体具有如由纳米流式细胞术(例如，使用流式纳米分析仪)测量的约20-1000nm的最长尺寸。在一些实施方案中，本文所述的外来体具有如由纳米流式细胞术(例如，使用流式纳米分析仪)测量的约40-1000nm的最长尺寸。在一些实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中90％的所述外来体具有如由纳米流式细胞术(例如，使用流式纳米分析仪)测量的约20-1000nm的最长尺寸。在一些实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中95％的所述外来体具有如由纳米流式细胞术(例如，使用流式纳米分析仪)测量的约20-1000nm的最长尺寸。在一些实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中99％的所述外来体具有如由纳米流式细胞术(例如，使用流式纳米分析仪)测量的约20-1000nm的最长尺寸。在一些实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中90％的所述外来体具有如由纳米流式细胞术(例如，使用流式纳米分析仪)测量的约40-1000nm的最长尺寸。在一些实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中95％的所述外来体具有如由纳米流式细胞术(例如，使用流式纳米分析仪)测量的约40-1000nm的最长尺寸。在一些实施方案中，本文所述的外来体群体包括群体，其中99％的所述外来体具有如由纳米流式细胞术(例如，使用流式纳米分析仪)测量的约40-1000nm的最长尺寸。
外来体电荷密度的测量
在一些实施方案中，本文所述的方法包括测量纯化级分中包含的外来体和/或外来体群体的电荷密度。在一些实施方案中，电荷密度通过电位滴定、阴离子交换、阳离子交换、等电聚焦、ζ电位、毛细管电泳、毛细管区带电泳或凝胶电泳来测量。
外来体蛋白密度的测量
在一些实施方案中，本文所述的方法包括测量外来体表面上的外来体蛋白密度。表面密度可以计算或表示为每单位面积的质量、每单位面积的蛋白质数量、每个外来体的分子数量或分子信号强度、蛋白质的摩尔量等。表面密度可以通过本领域已知的方法进行实验测量，例如，通过使用生物层干涉测量法(BLI)、FACS、蛋白质印迹法、荧光(例如，GFP-融合蛋白)检测法、纳米流式细胞术、ELISA、αLISA和/或通过测量蛋白凝胶上的带进行测密术。
实施例
提出以下实施例以便向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完全公开和说明，并且不意图限制本发明人看待其发明的范围，也不意图表示以下实验是进行的全部或仅有的实验。虽然已尽力确保所用数字(例如量、温度等)的准确性，但仍应考虑一些实验误差和偏差。除非另外指明，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度以摄氏度计，并且压力是大气压或接近大气压。可以使用标准缩写，例如，bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮微升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；nt，核苷酸；等。
除非另外指明，否则本发明的实施将采用本领域技术内常规的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药学方法。此类技术在文献中有充分说明。参见例如，T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman and Company,1993)；AL.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,当前版本)；Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,1989)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan编辑,Academic Press,Inc.)；Remington's PharmaceuticalSciences,第21版(Easton,Pennsylvania:Mack Publishing Company,2005)；Carey andSundberg Advanced Organic Chemistry第3版(Plenum Press)第A和B卷(l992)。
实施例1：新外来体蛋白的鉴定
外来体的集合
在9天后，从HEK293 SF细胞的高密度悬浮培养物的上清液中收集外来体。过滤上清液，并用阴离子交换色谱进行分级分离，并且在氯化钠的步长梯度中洗脱。蛋白质浓度最高的峰级分含有外来体和污染细胞组分。分离峰级分，并且在OptiprepTM密度梯度上通过超速离心进一步分级分离。
对于OptiprepTM梯度，在SW 41Ti转子的12mL Ultra-Clear(344059)管中，用4mL45％OptiprepTM、3mL 30％OptiprepTM、2mL22.5％OptiprepTM、2mL 17.5％OptiprepTM和1mLPBS制备4层无菌梯度。将外来体级分添加到OptiprepTM梯度中并且在4℃下以200,000x g超速离心16小时，以分离外来体级分。超速离心产生已知含有外来体的顶部级分、含有中等密度细胞碎片的中间级分以及含有高密度聚集体和细胞碎片的底部级分(图1)。然后从管顶部约3mL处轻轻收集外来体层。
将外来体级分在38.5mL Ultra-Clear(344058)管中的约32mL PBS内稀释，并且在4℃下以133,900x g超速离心3小时，以沉淀经纯化的外来体。然后将沉淀的外来体重新悬浮在最小体积的PBS(约200μL)中，并且在4℃下储存。
用于LC-MS/MS分析的样品制备
为了测定对外来体具有特异性的蛋白质，通过液相色谱-串联质谱分析OptiprepTM梯度的顶部级分和底部级分。在分析之前，通过二辛可宁酸(BCA)测定法测定两个样品的总蛋白浓度，之后在PBS缓冲液中将每个样品适当稀释至125μg/mL。接下来，将50.0μL每个样品添加到含有等体积外来体裂解缓冲液(60mM Tris、400mM GdmCl、100mM EDTA、20mMTCEP、1.0％Triton X-100)的单独1.5mL微量离心管中，随后转移2.0μL 1.0％Triton X-100溶液。然后将所有样品在55℃下孵育60分钟。
通过在-20℃下添加1250μL乙醇进行蛋白质沉淀。为了提高效率，将样品剧烈涡旋并且然后在水浴中超声处理5分钟。通过在室温下以15,000g离心5分钟来沉淀沉淀的物质。倾析上清液，并使用氮气彻底干燥沉淀的物质。将沉淀重悬于30.0μL消化缓冲液(30mMTris、1.0M GdmCl、100mM EDTA、50mM TCEP，pH 8.5)中，这也减少了二硫键。通过添加5.0μL烷基化溶液(375mM碘乙酰胺，50mM Tris，pH 8.5)并且在室温下在黑暗中孵育所得溶液至少30分钟来烷基化游离半胱氨酸残基。
在孵育后，使用30.0μL 50mM Tris pH 8.5稀释每个样品，并且通过添加2.0μg胰蛋白酶开始蛋白水解消化。将所有样品混合，并且然后在37℃下孵育过夜。在孵育后，通过加入5.0μL 10％甲酸停止胰蛋白酶活性。在通过LC-MS/MS分析之前，使用Pierce C18旋转柱对每个样品进行脱盐。在该过程结束时，将每个样品干燥并且在75.0μL的95:5水:乙腈中用0.1％甲酸复原，并且转移到HPLC小瓶进行分析。
LC-MS/MS分析
将样品注入UltiMate 3000RSCLnano(Thermo Fisher Scientific)低流量色谱系统中，并且将胰蛋白酶肽以2.500μL/min的流速使用负载流动相(MPL:95％水，5％乙腈，0.1％甲酸)装载到Acclaim PepMap 100C18捕集柱(75μm x 2cm，3μm粒度，
Figure BDA0002481725820000421
孔径，Thermo Fisher Scientific)上。以300nL/min的流速通过EASY-Spray LC C18分析柱(75μmx 25cm，2μm粒度，
Figure BDA0002481725820000422
孔径，Thermo Fisher Scientific)，将肽用流动相A(MPA:水，0.1％甲酸)和流动相B(MPB:乙腈，0.1％甲酸)梯度洗脱和分离。用于洗脱的逐步梯度从5％MPB开始，其中将其在上样过程中保持15分钟。然后MPB百分比在30分钟内从5％增加到17％，在45分钟内又从17％增加到25％，并且最后在5分钟内从25％增加到40％。通过在5分钟内增加到90％MPB，然后在那里保持9分钟来去除最疏水的物质。所述方法的总运行时间为130分钟，并且允许有足够的时间进行柱再平衡。在分析注射之间进行洗涤循环，以最大限度地减少残留。
用Q Exactive Basic(Thermo Fisher Scientific)质谱仪进行质量分析。以70,000的分辨率在400-1600Da的m/z范围内测量前体离子质谱。使用27的碰撞能量选择10个最强的前体离子并且在HCD池中将其片段化，并且以35,000的分辨率在200-2000Da的m/z范围内测量MS/MS谱。选择电荷状态为2-4的离子进行片段化，并将动态排除时间设置为30秒。将含有14种常见聚硅氧烷的排除列表用于最大限度地减少已知污染物的错误识别。
数据处理
首先使用Proteome Discoverer软件(2.1.1.21版，Thermo Fisher Scientific)和Sequest HT算法结合Target Decoy PSM验证器对蛋白质进行鉴定和定量(无标签)。搜索针对完整的Uniprot智人(分类9606版本:127,783个条目)或Swiss-Prot智人(分类9606版本2017-05-10:42,153个条目)参考数据库，以及含有E1a蛋白的自定义Uniprot数据库(7个条目)进行。使用以下搜索参数：酶、胰蛋白酶；最多2处缺失切割；6个残基的最小肽长度；10ppm前体质量公差；和0.02Da片段质量公差。搜索还包括特定的动态修饰(M的氧化；N或Q的脱酰胺；S、T或Y的磷酸化；肽末端E的焦谷氨酸化；以及蛋白质N末端的乙酰化)和静态修饰(C的脲甲基化)。
在Target Decoy PSM验证器中，最大δCn以及严格和宽松的目标假发现率(FDR)都被设置为1，因为使用Scaffold软件(版本4.8.2，Proteome Software Inc.)再次搜索数据。在Scaffold中，也使用X！串联开源算法来搜索数据，以使用99.0％的蛋白质阈值、最少2个肽和95％的肽阈值来鉴定蛋白质。
为了确定新的外来体特异性蛋白质的身份，对OptiprepTM梯度顶部外来体级分相对于较低级分那些中发现的蛋白质进行了总肽谱匹配(PSM)比较。如图2所示，顶部级分蛋白质(Y轴)和底部级分蛋白质(X轴)之间的相关性很弱。虚线上方绘制的蛋白质代表外来体-富集的蛋白质，而虚线下方的那些代表污染物-富集的蛋白质。重要的是，鉴定出许多缺少跨膜结构域并且在外来体级分中高度富集的蛋白质，包括(1)豆蔻酰化的富含丙氨酸的蛋白激酶C底物(MARCKS)；(2)豆蔻酰化的富含丙氨酸的蛋白激酶C底物样1(MARCKSL1)；和(3)脑酸溶性蛋白1(BASP1)。如图3-5中胰蛋白酶肽覆盖图所示，质谱研究导致MARCKS(图3)、MARCKSL1(图4)和BASP1(图5)的广泛覆盖。因为预测这些蛋白质都不具有跨膜结构域，所以表明它们在外来体腔中以可溶性蛋白富集。总之，这些结果表明，存在许多在经纯化的外来体群体中富集的腔蛋白，它们可以用作产生工程化外来体的有效负载物支架。
实施例2：腔蛋白表达的验证
为了证实质谱研究中鉴定的外来体特异性蛋白质在外来体腔中高度富集，对来自HEK293细胞的总细胞裂解物和经纯化的外来体群体进行了蛋白质印迹。如图6A中所示，将来自细胞裂解物(左侧)和经纯化的外来体(右侧)的等量的总蛋白上样到变性聚丙烯酰胺凝胶上。MARCKS(图6B)、MARCKSL1(图6C)和BASP1(图6D)的蛋白质印迹表明，代表新腔蛋白的带容易在外来体中检测到，但在细胞裂解物中未检测到，从而证明这些蛋白质高度富集在外来体中，并且在总外来体裂解物中可以目测到。表明这些腔蛋白在外来体中高度表达和富集为产生腔修饰的外来体提供了机会，这些腔修饰的外来体含有与这些新蛋白中的任何一种以高水平融合的异源蛋白。
实施例3：使用新蛋白作为支架的腔负载的验证
为了证实MARCKS、MARCKSL1和/或BASP1作为腔负载支架的效用，将每种蛋白质与GFP的N末端融合。另外，还将这些蛋白质中每一种的前30个氨基酸与GFP融合，以确定较短的蛋白质片段是否可以驱动工程化外来体的负载。经工程化以含有与GFP融合的CD81(充分建立的外来体标记物)或PDGFR(具有中等外来体负载效率的跨膜蛋白)外来体用作参考标准。
稳定地选择含有每种表达构建体的工程化的HEK293SF细胞，并使其在200ml培养物中生长至高密度。收集上清液并且通过如实施例1中所述的OptiprepTM密度梯度超速离心纯化。在Synergy H1读板仪
Figure BDA0002481725820000451
上以96孔形式测量所得的含GFP的外来体。如图7中所示，与GFP融合的MARCKS的前30个氨基酸(“MARCKS(aa 1-30)”)不足以以高于CD81-GFP(“CD81”)或PDGFR-GFP(“pDisplay”)的水平负载外来体。相似地，与CD81-GFP(“CD81”)相比，与GFP融合的MARCKSL1的前30个氨基酸(“MARCKSL1(aa 1-30)”)不足以增加外来体负载，但全长MARCKSL1-GFP融合体(“MARCKSL1”)导致信号明显高于CD81-GFP(图8)。形成鲜明对比的是，与CD81-GFP(“CD81”)或PDGFR-GFP(“pDisplay”)相比，全长BASP1-GFP融合体(“BASP1”)和与GFP融合的BASP1的前30个氨基酸(“BASP1(aa1-30)”)均导致大得多的GFP负载(图9)。这些结果表明BASP1(全长或N末端)和全长MARCKSL1可以是适用于外来体货物蛋白的腔表达的支架。
实施例4：足以负载腔外来体有效负载物的最小蛋白质序列的鉴定
实施例3中的结果表明BASP1的N末端序列足以将蛋白货物负载到外来体腔中。为了确定具有该活性的最小肽序列，通过产生多种与GFP的N末端融合的BASP1截短并且测量它们负载到外来体中的程度来进行工程化GFP负载实验。图10示出了用于该实验中的一系列融合蛋白，指示了BASP1序列的片段和修饰物、用于蛋白质印迹检测的FLAG标签、GFP的前几个氨基酸，以及每个区域之间的甘氨酸/丝氨酸接头。
已报道BASP1经肉豆蔻酰化，这可能在其向外来体腔的定位中起作用。为了测试肉豆蔻酰化在BASP1负载中的作用，还在GFP负载实验中测试了预测的肉豆蔻酰化位点处的甘氨酸到丙氨酸点突变。BASP1 1-30(pCB 540)包含位置2(序列pCB 692)、位置3(pCB 693)处的单突变或双重突变(pCB 694)，并且用含有BASP1的各种截短(pCB 683-691)的融合蛋白进行了测试。
在嘌呤霉素存在下转染并选择HEK293SF细胞以稳定表达编码图10中每个序列的质粒，并且如实施例1中所述纯化外来体。通过纳米流式细胞术(Flow NanoAnlyzer,NanoFCM,Inc.)分析经纯化的外来体的GFP荧光以确定GFP负载程度。如图11中所示，来自未转染细胞(即缺少GFP)的外来体显示出非常低的信号(WT EXO)。含有BASP1 G2A-GFP(pCB692)或BASP1 G2A/G3A-GFP(pCB 694)的外来体显示出相似的低水平GFP信号，而BASP1G3A-GFP(pCB 693)显示出高得多的水平，从而指示BASP1的位置二的甘氨酸对于将BASP1片段负载到外来体中至关重要，这可能归因于肉豆蔻酰化。BASP1截短pCB683-689也显示出高水平的GFP信号，而较短的片段pCB690-691与WT EXO相似。这些结果表明，九个氨基酸的片段pCB689足以以非常高的水平将蛋白货物驱动到外来体腔中。
为了证实图11中所示的结果，通过蛋白质印迹分析了BASP1片段-GFP外来体。将等量的蛋白质上样到SDS-PAGE迷你-
Figure BDA0002481725820000461
TGX无污染凝胶(Bio-Rad,Inc.)上以测量总外来体蛋白(图12)。在约30kDa(虚线箭头)处，BASP1-GFP片段可以在蛋白质凝胶的几个泳道中检测到。该可视化方法依赖于凝胶中的荧光分子与蛋白质的色氨酸残基的结合，但是每种BASP1-GFP融合蛋白中只有单一色氨酸残基，可能是低估了每个泳道中BASP1片段的丰度。为了实现对BASP1-GFP负载到外来体中的无偏测量，用考马斯蓝(InvitrogenSimplyBlue SafeStain)对含有外来体样品的蛋白凝胶染色(图13)。染色凝胶的带模式允许清楚地鉴定BASP1-GFP融合蛋白(虚线箭头)，并且证实每个样品中等量的输入蛋白，与图12中所示的结果相关。
用抗FLAG抗体(M2单克隆抗体，Millipore-Sigma)进行的蛋白质印迹显示pCB540(氨基酸1-30)和pCB683-689中等量的BASP1-GFP(图14)，从而进一步显示BASP1负载腔外来体货物的能力。较短片段pCB690-691的抗FLAG信号显著降低或缺失。BASP1G2A-GFP(pCB692)或BASP1 G2A/G3A-GFP(pCB 694)也缺少信号，而BASP1 G3A-GFP(pCB 693)以与pCB540相似的水平表达。这些结果与图11中的纳米流式细胞术数据一致并且证实pCB689足以将蛋白货物负载至外来体。用针对已确定的外来体蛋白Alix的抗体进行的蛋白质印迹显示在所有样品中均相等的信号，从而指示BASP1-GFP过表达不会破坏内源性外来体蛋白的表达模式或以其他方式破坏外来体生物发生或组成(图15)。这些结果共同表明，九个氨基酸的标签(MGGKLSKKK-SEQ ID NO:13)可以表达为与异源蛋白的融合体并且驱动该蛋白质进入外来体腔内。另外，外来体负载需要序列的位置二，而序列的位置三是非必需的。因此，序列MGAKLSKKK(SEQ ID NO:110)或更一般地，MGXKLSKKK(SEQ ID NO:116)也可以用于将任何目标蛋白质负载到外来体腔中。
为了鉴定如上所示的促进负载的十二个氨基酸截短与未能促进负载的六个氨基酸截短之间的最小BASP1氨基酸序列，在HEK293SF细胞中产生并且稳定表达与FLAG标签和GFP融合的BASP1的N末端的单个截断突变体(图16A)。如上所述，从稳定的细胞培养物中纯化外来体。七个到十二个氨基酸的BASP1序列能够以高密度将GFP负载到外来体中，而前六个氨基酸则不能(图16B)。这些数据表明，在位置六之后的至少一个赖氨酸残基是用BASP1的N末端进行外来体腔负载所需的。
BASP1位置6处的丝氨酸在物种中以及MARCKS和MARCKSL1中高度保守。为了确定该氨基酸是否是货物负载到外来体中所需的，将HEK293SF细胞用编码包括点突变体的BASP11-30-FLAG-GFP或BASP1 1-30-FLAG-GFP的表达质粒稳定转染，用天冬氨酸(S6D；极性带电荷取代)或丙氨酸(S6A；小的非极性取代)置换丝氨酸六。另外，使位置五处的赖氨酸突变为谷氨酸(L5Q)，以测试该位置在调节肉豆蔻酰化、棕榈酰化和几种膜相关蛋白的其他膜功能中的潜在作用(Gottlieb-Abraham等人,Mol.Biol.Cell.2016Dec1；27(24):3926-3936)(图17A)。BASP1 S6D完全消除了GFP负载到外来体中，而S6A并没有改变负载。BASP1L5Q也不影响腔负载，从而指示位置六处的负电荷破坏了负载，而位置五处的极性氨基酸取代耐受良好(图17B)。
BASP1的前三十个氨基酸含有上文鉴定的N末端前导序列，其后是富含赖氨酸的氨基酸段。为了理解MARCKS和MARCKSL1 N末端是否可以类似于BASP1负载外来体，用与FLAG-GFP融合的MARCKS和MARCKSL1全长蛋白或氨基酸1-30稳定转染HEK293SF细胞。通过SDSPAGE和考马斯染色分析经纯化的外来体以确定负载的程度。全长MARCKS和MARCKSL1能够与GFP一起负载外来体，但氨基酸1-30不如全长蛋白，这表明在MARCKS和MARCKSL1蛋白质的远端区域中还有负载所需的额外结构或序列特征(图18)。MARCKS和MARCKSL1的序列分析揭示了与BASP1的N末端具有潜在序列同源性的区域。MARCKS的氨基酸152-173和MARCKSL1的氨基酸87-110富含赖氨酸，散布有苯丙氨酸和丝氨酸残基，并且被预测为磷酸化位点结构域(PSD)或效应子结构域(ED)(图19)。用使MARCKS的氨基酸1-3与PSD结构域融合的质粒构建体(MG-PSD)稳定转染HEK293SF细胞。在预测的肉豆蔻酰化位点(MA-PSD)和位置六(K6S和K6A)处产生单独点突变以确定这些残基在负载外来体中的作用(图20A)。经纯化的外来体的蛋白质印迹表明，与BASP1 1-30的阳性对照相比，MG-PSD和MA-PSD均无法有效负载外来体。有趣的是，K6A和K6S突变导致负载改善，从而表明位置6处的正电荷阻止外来体货物的负载，并且MARCKS的PSD可以在功能上与内源性N末端序列互补(图20B)。总之，这些研究允许鉴定出足以将货物负载到外来体中的几个基序(图21)。
最窄的基序基序1允许(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(SEQ ID NO:118)的蛋白质序列，其中每个括号内字母或字母组是氨基酸位置，并且其中另外位置五不能为带正电荷的氨基酸(K/R/H)且位置六不能为带负电荷的氨基酸(D/E)。基序1的子基序包括但不限于以下蛋白质序列：(M)(G)(G)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)、(M)(G)(A)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)、(M)(G)(S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)、(M)(G)(G/A/S)(K)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)、(M)(G)(G/A/S)(Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)、(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L)(S/A)(K)(K)、(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(F)(S/A)(K)(K)、(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(S)(S/A)(K)(K)、(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(Q)(S/A)(K)(K)、(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S)(K)(K)和(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(A)(K)(K)，其中位置五不能是带正电荷的氨基酸(K/R/H)，并且位置六不能是带负电荷的氨基酸(D/E)。
更广泛基序基序2可以表达为(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)，其中每个括号内位置表示氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任何氨基酸，ξ是选自由(Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His、Arg)组成的组的任何氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任何氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu)。
最广泛基序基序3可以表达为(M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)，其中每个括号内位置表示氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任何氨基酸，X是任何氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任何氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu)。在基序1-3的所有情况下，该序列可以被一个氨基酸截短为长度为七个总氨基酸(即，按基序1-3所呈现的顺序由氨基酸1-7组成)。源自基序1、2或3(或缺少氨基酸7的这些基序)中任一种的任何序列均可用于将货物负载到外来体中，其程度与全长BASP1或BASP1的天然截短序列相同或相当。氨基酸序列-结构-功能的这种深入分析为通过生产细胞将生物表达的货物导入外来体中的需求提供了新的见解。
实施例5：BASP1的N末端足以负载不同种类的蛋白质
实施例4中的结果表明，BASP1的N末端可以是用于直接从生产细胞产生腔负载外来体的有用的工程化支架。为了验证该假设，生成了稳定的HEK293SF细胞以表达与BASP1的氨基酸1-30或1-10融合的密码子优化的全长Cas9蛋白(如Zetsche B,Volz SE,Zhang F.Asplit-Cas9 architecture for inducible genome editing and transcriptionmodulation.Nat Biotechnol.2015年2月；33(2):139-42中所述)。如上所述从细胞培养物中纯化外来体并且使用抗Cas9抗体(Abcam；目录号ab191468，克隆7A9-3A3)通过SDS-PAGE和蛋白质印迹进行分析。如图22A中所示，BASP1 1-30和1-10都足以在外来体中负载Cas9。重组Cas9蛋白用作蛋白质印迹的阳性对照。来自蛋白质印迹实验的各种量的重组Cas9和BASP1-Cas9外来体泳道的测密术定量和比较显示，外来体负载有每个外来体4-5个Cas9分子(图22B)。与上文所示的GFP实验相比，这种Cas9酶的质量为约160kDa，代表货物尺寸的显著增加。
作为可以作为与BASP1的N末端的融合体负载的货物蛋白的多样性的额外验证，卵清蛋白在HEK293SF细胞中稳定表达为与BASP1的氨基酸1-10的融合体(“BASP1(1-10)-OVA”)。使用第二选择标记物，用相同的质粒和第二质粒(编码与外来体特异性表面糖蛋白PTGFRN融合的三聚体CD40L(“3xCD40L-PTGFRN”))共同转染单独的细胞系。从两种转染的细胞培养物中纯化外来体，并且通过SDS-PAGE(图23A)和抗卵清蛋白蛋白质印迹(Abcam；目录号ab17293，克隆6C8)进行分析(图23B)。作为对照，将重组卵清蛋白(InvivoGen；目录号vac-pova)在单独的凝胶中滴定。当与BASP1的氨基酸1-10融合作为单一构建体时，或与其他过表达质粒组合(3xCD40L-PTGFRN)时，将卵清蛋白稳健地负载到外来体中。该结果表明，外来体可以与腔货物和与来自单独转录物的同时表面货物(例如PTGFRN)进行组合工程化。
在治疗性外来体背景下可能有用的另一类蛋白质是抗体和抗体片段。靶向GFP的单链骆驼纳米抗体(如Caussinus E,Kanca O,Affolter M.Fluorescent fusion proteinknockout mediated by anti-GFP nanobody.Nat Struct Mol Biol.2011年12月11日；19(1):117-21中所述)在HEK293SF细胞中稳定表达为与BASP1的氨基酸1-10和FLAG标签(“BASP1(1-10)-纳米抗体”)或单独FLAG标签(“纳米抗体”)的融合蛋白(图24A)。通过SDS-PAGE和抗FLAG蛋白质印迹分析经纯化的外来体，表明当纳米抗体与BASP1的N末端融合时，在相等量的总负载蛋白下存在大量纳米抗体富集(图24B)。这些结果表明，使用源自BASP1的N末端的非常短的蛋白质序列，各种类别的蛋白质货物可以由生产细胞表达并且包装到外来体中。
实施例6：BASP1的N末端可以用于在外来体腔中负载核酸
核酸，并且特别是RNA(例如，mRNA、siRNA、miRNA)是一类有吸引力的将被负载在治疗性外来体腔中的治疗性货物。RNA的外来体负载可以保护RNA免于在细胞外环境中降解，并且可以通过额外水平的外来体工程化(例如靶向构建体的表面表达)将负载的外来体定向到某些细胞和/或组织。为了理解上文鉴定的外来体蛋白(或蛋白质片段)是否可以用于产生负载mRNA的外来体，产生了组合工程化外来体。如图25中所示，BASP1的氨基酸1-30被表达为与FLAG和噬菌体蛋白MCP的变体的融合体。MCP识别并结合至称为MS2的mRNA茎环，该mRNA茎环可以表达为与mRNA和其他RNA的转录融合体，从而驱动MCP融合蛋白与目标MS2融合RNA之间的物理缔合。突变分析先前鉴定了MCP中的两个位置，这些位置增加了对MS2的亲和力；在位置29处缬氨酸取代为异亮氨酸(V29I；Lim&Peabody,RNA.Nucleic AcidsRes.1994年9月11日；22(18):3748-52)和在位置55处天冬酰胺取代为赖氨酸(N55K；Lim等人,J Biol Chem.1994年3月25日；269(12):9006-10)。BASP1 1-30与单体或二聚体MCP变体融合，其中每个MCP均为V29I或双重突变的V29I/N55K。荧光素酶报道基因构建体表达为与来自单独质粒的3个MS2茎环的融合体。单独的荧光素酶-MS2(#811)或与每种BASP1-MCP变体(#815、817、819或821)组合，产生了五个稳定的HEK293SF细胞系(图25)。作为额外的对照，用FLAG标记的BASP1 1-27稳定转染HEK293SF细胞。分离外来体并且用
Figure BDA0002481725820000521
处理以去除任何外部相关的mRNA，并根据上文方法纯化。通过SDS-PAGE(图26A)和抗FLAG蛋白质印迹(图26B)分析经纯化的外来体，这表明每种外来体制剂中等量的总蛋白和相当的BASP1-FLAG融合体水平。重要的是，BASP1-MCP融合体表达与缺少MCP蛋白的BASP1 1-27FLAG融合体相当的水平，这表明添加MCP单体或二聚体不会破坏BASP1介导的蛋白质在外来体中的负载。
分离稳定表达BASP1-MCP和荧光素酶-MS2 mRNA的细胞并且通过RT-qPCR(FWD引物：5’-TGGAGGTGCTCAAAGAGTTG-3’(SEQ ID NO:119)；REV引物：5’-TTGGGCGTGCACTTGAT-3’(SEQ ID NO:120)；探针：5’-/56-FAM/CAGCTTTCC/ZEN/GGGCATTGGCTTC/3IABkFQ/-3’(SEQID NO:121))定量总荧光素酶mRNA。未转染的细胞表达比所有811-表达细胞更低的萤光素酶水平，所述811-表达细胞表达相当的荧光素酶水平(图27A，顶部)。还通过RT-qPCR分析来自每个稳定细胞系的经纯化的外来体。天然外来体不具有可检测水平的萤光素酶MS2，而仅表达811的细胞则具有可检测但非常低水平的荧光素酶MS2。重要的是，每种BASP1-MCP融合蛋白均含有更大量的萤光素酶-MS2 mRNA，这表明MCP与MS2之间的结合促进将mRNA负载到外来体中的重要性(图27A，底部)。各组之间相对mRNA的定量表明，相比于单独的811，对于所有的BASP1-MCP融合体，富集约30至60倍(图27B)。预测含有二聚体MCP V29I/N55K的BASP1-MCP构建体821对MS2 mRNA具有最大的亲和力，并且在该实验中确实含有最大量的萤光素酶-MS2。这些结果表明，BASP1片段是用于向外来体腔负载包括核酸的各种货物的稳健而多功能的支架蛋白。
实施例7：BASP1、MARCKS和MARCKSL1可以用于产生表面装饰的外来体
先前实验中的结果表明，MARCKS、MARCKSL1和BASP1的全长和N末端区域可以用于产生腔负载的外来体。为了进一步探索这些蛋白对于外来体工程化的潜力，将MARCKS、MARCKSL1和BASP1的氨基酸1-30或BASP1的氨基酸1-10与表达为同源三聚体的CD40L的内源性跨膜区融合。为CD40L的人和小鼠序列制备构建体，因为配体不会与其他物种上的同源受体交叉反应(图28)。从用一种CD40L表达构建体稳定转染的HEK293SF细胞中纯化外来体并且将其在小鼠或人B细胞中孵育。通过CD40L ELISA(用于测量人CD40L，R&D Systems，目录号DCDL40，批号P168248；和用于测量小鼠CD40L，Abcam，目录号ab119517，批号GR3218850-2)定量外来体上的输入CD40L的量，使用B细胞标记物CD19对B细胞定量，并且通过对CD69显阳性的门控细胞的百分比来测量B细胞活化。在物种匹配的培养物中，小鼠(图29A)或人(图29B)外来体CD40L的剂量滴定曲线显示了构建体之间基于颗粒-与-颗粒(左图和下表)或彼此比较相当的活性以及基于CD40L摩尔等量的重组蛋白(右图和下表)。当CD40L构建体也表达为单体时，观察到相当的活性，并且其效力仅略微低于在高密度外来体展示支架PTGFRN的N末端上表达的三聚体CD40L(参见例如国际专利申请号PCT/US2018/048026)(图29C)。这些结果表明，MARCKS、MARCKSL1和BASP1是可用于产生各种类别的工程化外来体以用于人类和动物应用的不同、稳健的支架。
实施例8：不同细胞类型表达BASP1、MARCKS和/或MARCKSL1
使来自不同来源组织的细胞系(HEK293，肾；HT1080，结缔组织；K562，骨髓；MDA-MB-231，乳腺；Raji，淋巴母细胞)生长至对数期，并转移至补充有外来体耗竭血清的培养基中约6天，HEK293细胞除外，其在化学限定培养基中生长。使骨髓源性间充质干细胞(MSC)在3D微载体上生长五天，并且在无血清培养基中补充三天。分离来自每种细胞系培养物的上清液，并且使用上述OptiprepTM密度梯度超速离心法纯化外来体。如上所述通过LC-MS/MS分析每种纯化外来体制剂，并且对BASP1、MARCKS和MARCKSL1以及两种广泛研究的外来体蛋白(CD81和CD9)的肽谱匹配数(PSM)进行定量。在大多数纯化的外来体群体中，可检测到四次跨膜蛋白CD81和CD9，但在一些情况下，它们等于或低于腔外来体蛋白(例如，将CD9与BASP1或MARCKSL1进行比较)(图30)。该发现指示，新鉴定的腔外来体标记物可以是合适的融合蛋白，用于从源自不同组织的几种不相关细胞系中产生工程化的外来体。
实施例9：过表达BASP1的非人类细胞产生腔工程化外来体
实施例8中的结果表明，许多人来源的细胞天然地表达BASP1和实施例1中鉴定的其他新的外来体蛋白。为了确定BASP1是否可以用作通用的外来体支架蛋白，用表达与FLAG标签和GFP融合的全长BASP1(“BASP1-GFP-FLAG”)的质粒、表达与FLAG标签和GFP融合的BASP1的氨基酸1-30(“BASP1(1-30)-GFP-FLAG”)的质粒或表达与FLAG标签和GFP融合的BASP1的氨基酸1-8(“BASP1(1-8)-GFP-FLAG”)的质粒稳定转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。使用实施例1中所述的方法，从野生型CHO细胞和用三种BASP1质粒之一转染的CHO细胞中纯化外来体。如图31A-B中所示，BASP1和BASP1片段融合蛋白在CHO细胞中成功地过表达并且负载到外来体中，如通过无染色PAGE(图31A)和用针对FLAG的抗体的蛋白质印迹(图31B)所检测。该结果表明非人细胞(如CHO细胞)可以产生过表达人BASP1片段的外来体并且这种过表达可以将货物蛋白以高密度驱使到外来体腔中。该结果指示BASP1是一种用于从许多不同的细胞类型和物质中产生工程化外来体的通用支架蛋白。
实施例10：产生腔工程化外来体
通过引入编码外来体蛋白或外来体蛋白的修饰物或片段的外源序列来制备产生腔工程化外来体的生产细胞。外来体蛋白是包含上文实施例4中公开的BASP1片段和货物蛋白的融合蛋白。瞬时转染编码外来体蛋白的质粒以诱导外来体蛋白在外来体腔中的高水平表达。
将编码外来体蛋白、外来体蛋白修饰物或片段的多核苷酸，或编码治疗性肽、货物肽或靶向部分的外源序列稳定地转化到生产细胞中，以产生腔工程化外来体。将编码治疗性肽、货物肽或靶向部分的外源序列插入到编码外来体蛋白的基因组位点中，以产生包含附接到外来体蛋白的治疗性肽或货物肽的融合蛋白。将编码修饰的外来体蛋白的多核苷酸敲入编码外来体蛋白的基因组位点。
通过稳定地转染至少两种多核苷酸产生生产细胞系，每种多核苷酸编码外来体蛋白、外来体蛋白的修饰物或片段、或外源肽(例如靶向部分、治疗性肽)。将两个或多个外源序列插入到编码外来体蛋白的基因组序列之内或附近的多个基因组位点中，以产生包含多种修饰的外来体蛋白的腔工程化外来体。多种修饰的外来体蛋白中的每一种都靶向外来体腔。
通过引用并入
出于所有目的将本申请中引用的所有公布、专利、专利申请以及其他文献以引用的方式整体特此并入，其程度正如出于所有目的将每个单独的公布、专利、专利申请或其他文献单独地指明以便以引用的方式并入。
等效方案
本公开尤其提供含有修饰的外源蛋白和肽的外来体组合物，其用于使外源蛋白在外来体中富集。本公开还提供产生富集的外来体的方法和方法。虽然已经示出和描述了各种具体实施方案，但上述说明不是限制性的。应理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种变化。在阅读本说明书之后，许多变化对于本领域技术人员而言将为显而易见的。
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Met Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala
1 5 10 15
Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val Ala Ser Ser Pro Ser Lys Ala Asn
20 25 30
Gly Gln Glu Asn Gly His Val Lys Val Asn Gly Asp Ala Ser Pro Ala
35 40 45
Ala Ala Glu Ser Gly Ala Lys Glu Glu Leu Gln Ala Asn Gly Ser Ala
50 55 60
Pro Ala Ala Asp Lys Glu Glu Pro Ala Ala Ala Gly Ser Gly Ala Ala
65 70 75 80
Ser Pro Ser Ala Ala Glu Lys Gly Glu Pro Ala Ala Ala Ala Ala Pro
85 90 95
Glu Ala Gly Ala Ser Pro Val Glu Lys Glu Ala Pro Ala Glu Gly Glu
100 105 110
Ala Ala Glu Pro Gly Ser Pro Thr Ala Ala Glu Gly Glu Ala Ala Ser
115 120 125
Ala Ala Ser Ser Thr Ser Ser Pro Lys Ala Glu Asp Gly Ala Thr Pro
130 135 140
Ser Pro Ser Asn Glu Thr Pro Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe
145 150 155 160
Lys Lys Ser Phe Lys Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys
165 170 175
Glu Ala Gly Glu Gly Gly Glu Ala Glu Ala Pro Ala Ala Glu Gly Gly
180 185 190
Lys Asp Glu Ala Ala Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu Ala Gly
195 200 205
Ala Ala Ser Gly Glu Gln Ala Ala Ala Pro Gly Glu Glu Ala Ala Ala
210 215 220
Gly Glu Glu Gly Ala Ala Gly Gly Asp Pro Gln Glu Ala Lys Pro Gln
225 230 235 240
Glu Ala Ala Val Ala Pro Glu Lys Pro Pro Ala Ser Asp Glu Thr Lys
245 250 255
Ala Ala Glu Glu Pro Ser Lys Val Glu Glu Lys Lys Ala Glu Glu Ala
260 265 270
Gly Ala Ser Ala Ala Ala Cys Glu Ala Pro Ser Ala Ala Gly Pro Gly
275 280 285
Ala Pro Pro Glu Gln Glu Ala Ala Pro Ala Glu Glu Pro Ala Ala Ala
290 295 300
Ala Ala Ser Ser Ala Cys Ala Ala Pro Ser Gln Glu Ala Gln Pro Glu
305 310 315 320
Cys Ser Pro Glu Ala Pro Pro Ala Glu Ala Ala Glu
325 330
<210> 2
<211> 195
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Met Gly Ser Gln Ser Ser Lys Ala Pro Arg Gly Asp Val Thr Ala Glu
1 5 10 15
Glu Ala Ala Gly Ala Ser Pro Ala Lys Ala Asn Gly Gln Glu Asn Gly
20 25 30
His Val Lys Ser Asn Gly Asp Leu Ser Pro Lys Gly Glu Gly Glu Ser
35 40 45
Pro Pro Val Asn Gly Thr Asp Glu Ala Ala Gly Ala Thr Gly Asp Ala
50 55 60
Ile Glu Pro Ala Pro Pro Ser Gln Gly Ala Glu Ala Lys Gly Glu Val
65 70 75 80
Pro Pro Lys Glu Thr Pro Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe Lys Lys
85 90 95
Pro Phe Lys Leu Ser Gly Leu Ser Phe Lys Arg Asn Arg Lys Glu Gly
100 105 110
Gly Gly Asp Ser Ser Ala Ser Ser Pro Thr Glu Glu Glu Gln Glu Gln
115 120 125
Gly Glu Ile Gly Ala Cys Ser Asp Glu Gly Thr Ala Gln Glu Gly Lys
130 135 140
Ala Ala Ala Thr Pro Glu Ser Gln Glu Pro Gln Ala Lys Gly Ala Glu
145 150 155 160
Ala Ser Ala Ala Ser Glu Glu Glu Ala Gly Pro Gln Ala Thr Glu Pro
165 170 175
Ser Thr Pro Ser Gly Pro Glu Ser Gly Pro Thr Pro Ala Ser Ala Glu
180 185 190
Gln Asn Glu
195
<210> 3
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp
1 5 10 15
Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala Thr Glu
20 25 30
Glu Glu Gly Thr Pro Lys Glu Ser Glu Pro Gln Ala Ala Ala Glu Pro
35 40 45
Ala Glu Ala Lys Glu Gly Lys Glu Lys Pro Asp Gln Asp Ala Glu Gly
50 55 60
Lys Ala Glu Glu Lys Glu Gly Glu Lys Asp Ala Ala Ala Ala Lys Glu
65 70 75 80
Glu Ala Pro Lys Ala Glu Pro Glu Lys Thr Glu Gly Ala Ala Glu Ala
85 90 95
Lys Ala Glu Pro Pro Lys Ala Pro Glu Gln Glu Gln Ala Ala Pro Gly
100 105 110
Pro Ala Ala Gly Gly Glu Ala Pro Lys Ala Ala Glu Ala Ala Ala Ala
115 120 125
Pro Ala Glu Ser Ala Ala Pro Ala Ala Gly Glu Glu Pro Ser Lys Glu
130 135 140
Glu Gly Glu Pro Lys Lys Thr Glu Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Gln
145 150 155 160
Glu Thr Lys Ser Asp Gly Ala Pro Ala Ser Asp Ser Lys Pro Gly Ser
165 170 175
Ser Glu Ala Ala Pro Ser Ser Lys Glu Thr Pro Ala Ala Thr Glu Ala
180 185 190
Pro Ser Ser Thr Pro Lys Ala Gln Gly Pro Ala Ala Ser Ala Glu Glu
195 200 205
Pro Lys Pro Val Glu Ala Pro Ala Ala Asn Ser Asp Gln Thr Val Thr
210 215 220
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225
<210> 4
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 4
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1 5 10 15
Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala
20 25 30
<210> 5
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 5
Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp
1 5 10 15
Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu
20 25
<210> 6
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 6
Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp
1 5 10 15
Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys
20
<210> 7
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 7
Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp
1 5 10 15
Glu Lys Ala Lys Glu
20
<210> 8
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 8
Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp
1 5 10 15
Glu Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 9
Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn
1 5 10 15
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 10
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1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 11
Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 12
Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 13
Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys
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<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 14
Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys
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<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 15
Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys
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<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 16
Met Gly Gly Lys Leu Ala Lys Lys
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<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 17
Met Gly Gly Lys Phe Ser Lys Lys
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<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 18
Met Gly Gly Lys Phe Ala Lys Lys
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<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 19
Met Gly Gly Lys Ser Ser Lys Lys
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 20
Met Gly Gly Lys Ser Ala Lys Lys
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 21
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 22
Met Gly Gly Lys Gln Ala Lys Lys
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<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 23
Met Gly Gly Gln Leu Ser Lys Lys
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<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 24
Met Gly Gly Gln Leu Ala Lys Lys
1 5
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 25
Met Gly Gly Gln Phe Ser Lys Lys
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 26
Met Gly Gly Gln Phe Ala Lys Lys
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<211> 8
<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 27
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<211> 8
<212> PRT
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<220>
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<400> 28
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<212> PRT
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<220>
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<400> 29
Met Gly Gly Gln Gln Ser Lys Lys
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 30
Met Gly Gly Gln Gln Ala Lys Lys
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 31
Met Gly Ala Lys Leu Ser Lys Lys
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<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 32
Met Gly Ala Lys Leu Ala Lys Lys
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<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 33
Met Gly Ala Lys Phe Ser Lys Lys
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 34
Met Gly Ala Lys Phe Ala Lys Lys
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<210> 35
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 35
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<211> 8
<212> PRT
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<220>
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<400> 36
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 37
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 38
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<212> PRT
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<220>
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<400> 39
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<211> 8
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 40
Met Gly Ala Gln Leu Ala Lys Lys
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 41
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<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 42
Met Gly Ala Gln Phe Ala Lys Lys
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<210> 43
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 43
Met Gly Ala Gln Ser Ser Lys Lys
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<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 44
Met Gly Ala Gln Ser Ala Lys Lys
1 5
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 45
Met Gly Ala Gln Gln Ser Lys Lys
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<211> 8
<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 46
Met Gly Ala Gln Gln Ala Lys Lys
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 47
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 48
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 49
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<211> 8
<212> PRT
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<220>
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<400> 50
Met Gly Ser Lys Phe Ala Lys Lys
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 51
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<211> 8
<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 52
Met Gly Ser Lys Ser Ala Lys Lys
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 53
Met Gly Ser Lys Gln Ser Lys Lys
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 54
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<211> 8
<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 55
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<210> 56
<211> 8
<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 56
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 57
Met Gly Ser Gln Phe Ser Lys Lys
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 58
Met Gly Ser Gln Phe Ala Lys Lys
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<210> 59
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 59
Met Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys
1 5
<210> 60
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 60
Met Gly Ser Gln Ser Ala Lys Lys
1 5
<210> 61
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 61
Met Gly Ser Gln Gln Ser Lys Lys
1 5
<210> 62
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 62
Met Gly Ser Gln Gln Ala Lys Lys
1 5
<210> 63
<211> 7
<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 63
Met Gly Gly Lys Leu Ala Lys
1 5
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<211> 7
<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 64
Met Gly Gly Lys Phe Ser Lys
1 5
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 65
Met Gly Gly Lys Phe Ala Lys
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<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 66
Met Gly Gly Lys Ser Ser Lys
1 5
<210> 67
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 67
Met Gly Gly Lys Ser Ala Lys
1 5
<210> 68
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 68
Met Gly Gly Lys Gln Ser Lys
1 5
<210> 69
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 69
Met Gly Gly Lys Gln Ala Lys
1 5
<210> 70
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 70
Met Gly Gly Gln Leu Ser Lys
1 5
<210> 71
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 71
Met Gly Gly Gln Leu Ala Lys
1 5
<210> 72
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 72
Met Gly Gly Gln Phe Ser Lys
1 5
<210> 73
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 73
Met Gly Gly Gln Phe Ala Lys
1 5
<210> 74
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 74
Met Gly Gly Gln Ser Ser Lys
1 5
<210> 75
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 75
Met Gly Gly Gln Ser Ala Lys
1 5
<210> 76
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 76
Met Gly Gly Gln Gln Ser Lys
1 5
<210> 77
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 77
Met Gly Gly Gln Gln Ala Lys
1 5
<210> 78
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 78
Met Gly Ala Lys Leu Ser Lys
1 5
<210> 79
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 79
Met Gly Ala Lys Leu Ala Lys
1 5
<210> 80
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 80
Met Gly Ala Lys Phe Ser Lys
1 5
<210> 81
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 81
Met Gly Ala Lys Phe Ala Lys
1 5
<210> 82
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 82
Met Gly Ala Lys Ser Ser Lys
1 5
<210> 83
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 83
Met Gly Ala Lys Ser Ala Lys
1 5
<210> 84
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 84
Met Gly Ala Lys Gln Ser Lys
1 5
<210> 85
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 85
Met Gly Ala Lys Gln Ala Lys
1 5
<210> 86
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 86
Met Gly Ala Gln Leu Ser Lys
1 5
<210> 87
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 87
Met Gly Ala Gln Leu Ala Lys
1 5
<210> 88
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 88
Met Gly Ala Gln Phe Ser Lys
1 5
<210> 89
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 89
Met Gly Ala Gln Phe Ala Lys
1 5
<210> 90
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 90
Met Gly Ala Gln Ser Ser Lys
1 5
<210> 91
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 91
Met Gly Ala Gln Ser Ala Lys
1 5
<210> 92
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 92
Met Gly Ala Gln Gln Ser Lys
1 5
<210> 93
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 93
Met Gly Ala Gln Gln Ala Lys
1 5
<210> 94
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 94
Met Gly Ser Lys Leu Ser Lys
1 5
<210> 95
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 95
Met Gly Ser Lys Leu Ala Lys
1 5
<210> 96
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 96
Met Gly Ser Lys Phe Ser Lys
1 5
<210> 97
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 97
Met Gly Ser Lys Phe Ala Lys
1 5
<210> 98
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 98
Met Gly Ser Lys Ser Ser Lys
1 5
<210> 99
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 99
Met Gly Ser Lys Ser Ala Lys
1 5
<210> 100
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 100
Met Gly Ser Lys Gln Ser Lys
1 5
<210> 101
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 101
Met Gly Ser Lys Gln Ala Lys
1 5
<210> 102
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 102
Met Gly Ser Gln Leu Ser Lys
1 5
<210> 103
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 103
Met Gly Ser Gln Leu Ala Lys
1 5
<210> 104
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 104
Met Gly Ser Gln Phe Ser Lys
1 5
<210> 105
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 105
Met Gly Ser Gln Phe Ala Lys
1 5
<210> 106
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 106
Met Gly Ser Gln Ser Ser Lys
1 5
<210> 107
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 107
Met Gly Ser Gln Ser Ala Lys
1 5
<210> 108
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 108
Met Gly Ser Gln Gln Ser Lys
1 5
<210> 109
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 109
Met Gly Ser Gln Gln Ala Lys
1 5
<210> 110
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 110
Met Gly Ala Lys Leu Ser Lys Lys Lys
1 5
<210> 111
<211> 167
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 111
Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp
1 5 10 15
Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala Ser Gly
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly
35 40 45
Ser Gly Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly
50 55 60
Gly Thr Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Ile
65 70 75 80
Ala Glu Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr
85 90 95
Cys Ser Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys
100 105 110
Val Glu Val Pro Lys Gly Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu
115 120 125
Thr Ile Pro Ile Phe Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys
130 135 140
Ala Met Gln Gly Leu Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile
145 150 155 160
Ala Ala Asn Ser Gly Ile Tyr
165
<210> 112
<211> 167
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 112
Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp
1 5 10 15
Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala Ser Gly
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly
35 40 45
Ser Gly Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly
50 55 60
Gly Thr Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Ile
65 70 75 80
Ala Glu Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr
85 90 95
Cys Ser Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Lys Arg Lys Tyr Thr Ile Lys
100 105 110
Val Glu Val Pro Lys Gly Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu
115 120 125
Thr Ile Pro Ile Phe Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys
130 135 140
Ala Met Gln Gly Leu Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile
145 150 155 160
Ala Ala Asn Ser Gly Ile Tyr
165
<210> 113
<211> 296
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 113
Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp
1 5 10 15
Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala Ser Gly
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly
35 40 45
Ser Gly Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly
50 55 60
Gly Thr Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Ile
65 70 75 80
Ala Glu Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr
85 90 95
Cys Ser Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys
100 105 110
Val Glu Val Pro Lys Gly Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu
115 120 125
Thr Ile Pro Ile Phe Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys
130 135 140
Ala Met Gln Gly Leu Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile
145 150 155 160
Ala Ala Asn Ser Gly Ile Tyr Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
165 170 175
Gly Ser Gly Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn
180 185 190
Gly Gly Thr Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly
195 200 205
Ile Ala Glu Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val
210 215 220
Thr Cys Ser Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile
225 230 235 240
Lys Val Glu Val Pro Lys Gly Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu
245 250 255
Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val
260 265 270
Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala
275 280 285
Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile Tyr
290 295
<210> 114
<211> 296
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 114
Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp
1 5 10 15
Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala Ser Gly
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly
35 40 45
Ser Gly Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly
50 55 60
Gly Thr Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Ile
65 70 75 80
Ala Glu Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr
85 90 95
Cys Ser Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Lys Arg Lys Tyr Thr Ile Lys
100 105 110
Val Glu Val Pro Lys Gly Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu
115 120 125
Thr Ile Pro Ile Phe Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys
130 135 140
Ala Met Gln Gly Leu Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile
145 150 155 160
Ala Ala Asn Ser Gly Ile Tyr Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
165 170 175
Gly Ser Gly Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn
180 185 190
Gly Gly Thr Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly
195 200 205
Ile Ala Glu Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val
210 215 220
Thr Cys Ser Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Lys Arg Lys Tyr Thr Ile
225 230 235 240
Lys Val Glu Val Pro Lys Gly Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu
245 250 255
Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val
260 265 270
Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala
275 280 285
Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile Tyr
290 295
<210> 115
<211> 680
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 115
augaagccca ccgagaacaa cgaagacuuc aacaucgugg ccguggccag caacuucgcg 60
accacggauc ucgaugcuga ccgcgggaag uugcccggca agaagcugcc gcuggaggug 120
cucaaagagu uggaagccaa ugcccggaaa gcuggcugca ccaggggcug ucugaucugc 180
cugucccaca ucaagugcac gcccaagaug aagaaguuca ucccaggacg cugccacacc 240
uacgaaggcg acaaagaguc cgcacagggc ggcauaggcg aggcgaucgu cgacauuccu 300
gagauuccug gguucaagga cuuggagccc uuggagcagu ucaucgcaca ggucgaucug 360
uguguggacu gcacaacugg cugccucaaa gggcuugcca acgugcagug uucugaccug 420
cucaagaagu ggcugccgca acgcugugcg accuuugcca gcaagaucca gggccaggug 480
gacaagauca agggggccgg uggugacuaa ggauccaucg auaagcuuca ucgaaacaug 540
aggaucaccc auaucugcag ucgacaucga aacaugagga ucacccaugu cugcagucga 600
caucgaaaca ugaggaucac ccaugucugc agucgacauc gaaacaugag gaucacccau 660
gucugcaguc gacaucgaaa 680
<210> 116
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 任何氨基酸
<400> 116
Met Gly Xaa Lys Leu Ser Lys Lys Lys
1 5
<210> 117
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 任何氨基酸
<220>
<223> 有关取代和优选实施方案的详细描述，参见所提交的说明书
<400> 117
Met Gly Xaa Lys Leu Ser Lys Lys Lys
1 5
<210> 118
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Gly、Ala或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Lys或Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Leu、Phe、Ser或Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Ser或Ala
<220>
<223> 有关取代和优选实施方案的详细描述，参见所提交的说明书
<400> 118
Met Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Lys
1 5
<210> 119
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 119
tggaggtgct caaagagttg 20
<210> 120
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 120
ttgggcgtgc acttgat 17
<210> 121
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成探针
<400> 121
gggcattggc ttc 13
<210> 122
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 122
Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp
1 5 10 15
Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala Ser Ala
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly
50 55 60
<210> 123
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 123
Met Ala Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp
1 5 10 15
Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala Ser Ala
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly
50 55 60
<210> 124
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 124
Met Gly Ala Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp
1 5 10 15
Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala Ser Ala
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly
50 55 60
<210> 125
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 125
Met Ala Ala Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp
1 5 10 15
Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala Ser Ala
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly
50 55 60
<210> 126
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 126
Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp
1 5 10 15
Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Ser Ala Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val
35 40 45
Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly
50 55
<210> 127
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 127
Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp
1 5 10 15
Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp
20 25 30
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser Lys Gly
35 40 45
Glu Glu Leu Phe Thr Gly
50
<210> 128
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 128
Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp
1 5 10 15
Glu Lys Ala Lys Glu Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp
20 25 30
Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu
35 40 45
Phe Thr Gly
50
<210> 129
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 129
Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp
1 5 10 15
Glu Lys Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp
20 25 30
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly
35 40 45
<210> 130
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 130
Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Ser
1 5 10 15
Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly
35 40 45
<210> 131
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 131
Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Ser Ala Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly
35 40
<210> 132
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 132
Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser Lys
20 25 30
Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly
35
<210> 133
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 133
Met Gly Gly Lys Leu Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys
1 5 10 15
Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser Lys Gly Glu Glu
20 25 30
Leu Phe Thr Gly
35
<210> 134
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 134
Met Gly Gly Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp
1 5 10 15
Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr
20 25 30
Gly
<210> 135
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 135
Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp
1 5 10 15
Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala Ser Ala
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Val Ser Lys Gly
50
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<211> 36
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 136
Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Ser Ala Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Val Ser Lys Gly
35
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<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 137
Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Ser Ala Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val
20 25 30
Ser Lys Gly
35
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 138
Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Ser Ala Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser
20 25 30
Lys Gly
<210> 139
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 139
Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser Lys
20 25 30
Gly
<210> 140
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 140
Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp
1 5 10 15
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser Lys Gly
20 25 30
<210> 141
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 141
Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr
1 5 10 15
Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser Lys Gly
20 25 30
<210> 142
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 142
Met Gly Gly Lys Leu Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys
1 5 10 15
Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser Lys Gly
20 25 30
<210> 143
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 143
Met Gly Gly Lys Leu Asp Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp
1 5 10 15
Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala
20 25 30
<210> 144
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 144
Met Gly Gly Lys Leu Ala Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp
1 5 10 15
Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala
20 25 30
<210> 145
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 145
Met Gly Gly Lys Gln Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp
1 5 10 15
Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala
20 25 30
<210> 146
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 146
Met Gly Ala Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe
1 5 10 15
Lys Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys Glu Ala
20 25 30
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 147
Met Ala Ala Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe
1 5 10 15
Lys Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys Glu Ala
20 25 30
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<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 148
Met Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe
1 5 10 15
Lys Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys Glu Ala
20 25 30
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 149
Met Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Pro Phe
1 5 10 15
Lys Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys Glu Ala
20 25 30
<210> 150
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 150
Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Ser Ala Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly
20 25 30
Ser Gly Phe Glu Met Asp Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala
35 40 45
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
50 55 60
Phe Pro Val Asn Arg Tyr Ser Met Arg Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly
65 70 75 80
Lys Glu Arg Glu Trp Val Ala Gly Met Ser Ser Ala Gly Asp Arg Ser
85 90 95
Ser Tyr Glu Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp
100 105 110
Ala Arg Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
115 120 125
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Val Asn Val Gly Phe Glu Tyr Trp Gly
130 135 140
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
145 150

Claims (60)

1.一种包含靶蛋白的外来体，其中所述靶蛋白的至少一部分由外源序列表达，并且所述靶蛋白包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段或修饰物。
2.如权利要求1所述的外来体，其中所述靶蛋白以比不同外来体中的不同靶蛋白更高的密度存在于所述外来体中，其中所述不同靶蛋白包括常规外来体蛋白或其变体。
3.如权利要求2所述的外来体，其中所述常规外来体蛋白选自由以下组成的组：CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI锚蛋白、乳凝集素、LAMP2、LAMP2B及其片段。
4.如权利要求1-3中任一项所述的外来体，其中所述外来体由被遗传修饰成包含所述外源序列的细胞产生，任选地其中所述细胞是HEK293细胞。
5.如权利要求4所述的外来体，其中所述细胞包含含所述外源序列的质粒。
6.如权利要求4所述的外来体，其中所述细胞包含插入到所述细胞的基因组中的所述外源序列。
7.如权利要求6所述的外来体，其中所述外源序列被插入到位于相对于编码MARCKS、MARCKSL1或BASP1的基因组序列的3’或5’的基因组位点中。
8.如权利要求6所述的外来体，其中所述外源序列被插入到编码MARCKS、MARCKSL1或BASP1的基因组序列中。
9.如权利要求1-8中任一项所述的外来体，其中所述靶蛋白是包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段和治疗性肽的融合蛋白。
10.如权利要求9所述的外来体，其中所述治疗性肽选自由以下组成的组：天然肽、重组肽、合成肽或连向治疗性化合物的接头。
11.如权利要求9所述的外来体，其中所述治疗性化合物选自由以下组成的组：核苷酸、氨基酸、脂质、碳水化合物和小分子。
12.如权利要求9所述的外来体，其中所述治疗性肽是抗体或其片段或修饰物。
13.如权利要求9所述的外来体，其中所述治疗性肽是酶、配体、受体、转录因子或其片段或修饰物。
14.如权利要求9所述的外来体，其中所述治疗性肽是抗微生物肽或其片段或修饰物。
15.如权利要求1-14中任一项所述的外来体，其进一步包含第二靶蛋白，其中所述第二靶蛋白包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段。
16.如权利要求1-14中任一项所述的外来体，其进一步包含第二靶蛋白，其中所述第二靶蛋白包含PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP转运蛋白或其片段。
17.如权利要求1-15中任一项所述的外来体，其中所述靶蛋白包含(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(SEQ ID NO:118)的肽。
18.如权利要求1-15中任一项所述的外来体，其中所述靶蛋白包含(M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)的肽，其中每个括号内位置表示氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任何氨基酸，X是任何氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任何氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu)。
19.如权利要求1-15中任一项所述的外来体，其中所述靶蛋白包含(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)的肽，其中每个括号内位置表示氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任何氨基酸，ξ是选自由(Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His、Arg)组成的组的任何氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任何氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu)。
20.如权利要求17-19中任一项所述的外来体，其中所述靶蛋白包含SEQ ID NO:4-110中的任一种的肽。
21.如权利要求17-19中任一项所述的外来体，其中所述靶蛋白包含MGXKLSKKK的肽，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO:116)。
22.如权利要求21所述的外来体，其中所述靶蛋白包含SEQ ID NO:110的肽。
23.如权利要求20所述的外来体，其中所述靶蛋白包含SEQ ID NO:13的肽。
24.如权利要求1-23中任一项所述的外来体，其中所述靶蛋白进一步包含货物肽。
25.一种药物组合物，其包含如权利要求1-24中任一项所述的外来体和赋形剂。
26.如权利要求25所述的药物组合物，其基本上不含大分子，其中所述大分子选自核酸、外源蛋白、脂质、碳水化合物、代谢物及其组合。
27.一种细胞群，其用于产生如权利要求1-24中任一项所述的外来体。
28.如权利要求27所述的细胞群，其包含编码所述靶蛋白的外源序列，所述靶蛋白包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段或修饰物。
29.如权利要求28所述的细胞群，其进一步包含编码第二靶蛋白的第二外源序列，其中所述第二靶蛋白包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段或修饰物。
30.如权利要求28所述的细胞群，其进一步包含编码第二靶蛋白的第二外源序列，其中所述第二靶蛋白包含PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP转运蛋白或其片段。
31.如权利要求27-30中任一项所述的细胞群，其中所述外源序列被插入到编码MARCKS、MARCKSL1，或BASP1的基因组序列中，其中所述外源序列和所述基因组序列编码所述靶蛋白。
32.如权利要求27-30中任一项所述的细胞群，其中所述外源序列是在质粒中。
33.如权利要求27-32中任一项所述的细胞群，其中所述外源序列编码治疗性肽。
34.如权利要求33所述的细胞群，其中所述治疗性肽选自由以下组成的组：天然肽、重组肽、合成肽或连向治疗性化合物的接头。
35.如权利要求33所述的细胞群，其中所述治疗性化合物选自由以下组成的组：核苷酸、氨基酸、脂质、碳水化合物和小分子。
36.如权利要求33所述的细胞群，其中所述治疗性肽是抗体或其片段或修饰物。
37.如权利要求33所述的细胞群，其中所述治疗性肽是酶、配体、受体、转录因子或其片段或修饰物。
38.如权利要求33所述的细胞群，其中所述治疗性肽是抗微生物肽或其片段或修饰物。
39.如权利要求31所述的细胞群，其中所述外源序列编码靶向部分。
40.如权利要求39所述的细胞群，其中所述靶向部分对器官、组织或细胞具有特异性。
41.如权利要求30所述的细胞群，其中所述第二靶蛋白进一步包含靶向部分。
42.如权利要求41所述的细胞群，其中所述靶向部分对器官、组织或细胞具有特异性。
43.一种用于修饰外来体的多肽，其包含以下的序列：(i)(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(SEQ ID NO:118)；(ii)(M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)，其中每个括号内位置表示氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任何氨基酸，X是任何氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任何氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任何氨基酸，并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu)；或(ii)(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)，其中每个括号内位置表示氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任何氨基酸，ξ是选自由(Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His、Arg)组成的组的任何氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任何氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任何氨基酸，并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu)。
44.如权利要求43所述的多肽，其包含SEQ ID NO:4-110中的任一种的序列。
45.如权利要求43所述的多肽，其包含SEQ ID NO:13的序列。
46.如权利要求43所述的多肽，其包含SEQ ID NO:110的序列。
47.如权利要求43所述的多肽，其包含MGXKLSKKK的序列，其中X是任何氨基酸(SEQ IDNO:116)。
48.如权利要求43-47中任一项所述的多肽，其中所述多肽与货物肽融合。
49.如权利要求48所述的多肽，其中所述多肽与所述货物肽的N末端融合。
50.一种多肽构建体，其包含编码如权利要求43-49中任一项所述的多肽的编码序列。
51.如权利要求50所述的多肽构建体，其中所述编码序列是经密码子优化的。
52.一种制备工程化外来体的方法，其包括以下步骤：
a.向细胞中引入编码融合多肽的核酸构建体，所述融合多肽包含(i)编码MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段或修饰物的第一序列，和(ii)编码货物肽的第二序列；
b.将所述细胞维持在允许所述细胞表达所述融合多肽的条件下；以及
c.从所述细胞获得包含所述融合多肽的所述工程化外来体。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述第一序列包含以下的序列：(i)(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(SEQ ID NO:118)；(ii)(M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)，其中每个括号内位置表示氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任何氨基酸，X是任何氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任何氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任何氨基酸，并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu)；或(ii)(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)，其中每个括号内位置表示氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任何氨基酸，ξ是选自由(Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His、Arg)组成的组的任何氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任何氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任何氨基酸，并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(Asp或Glu)。
54.如权利要求52-53中任一项所述的方法，其中所述第一序列包含SEQ ID NO:4-110中的任一种。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述第一序列包含SEQ ID NO:13。
56.如权利要求54所述的方法，其中所述第一序列包含SEQ ID NO:110。
57.如权利要求53所述的方法，其中所述第一序列包含MGXKLSKKK，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO:116)。
58.如权利要求52-57中任一项所述的方法，其中所述融合多肽以比不同外来体中的不同靶蛋白更高的密度存在于所述工程化外来体的腔中，其中所述不同靶蛋白包括常规外来体蛋白或其变体。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述融合多肽以比所述不同外来体中的所述不同靶蛋白高超过2倍的密度存在。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述融合多肽以比所述不同外来体中的所述不同靶蛋白高超过4倍、16倍、100倍，或10,000倍的密度存在。
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