KR101126674B1 - 단백질 분해효소의 활성 측정용 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드 및 이를 이용한 단백질 분해효소의 활성 측정방법 - Google Patents

단백질 분해효소의 활성 측정용 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드 및 이를 이용한 단백질 분해효소의 활성 측정방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101126674B1
KR101126674B1 KR1020090088526A KR20090088526A KR101126674B1 KR 101126674 B1 KR101126674 B1 KR 101126674B1 KR 1020090088526 A KR1020090088526 A KR 1020090088526A KR 20090088526 A KR20090088526 A KR 20090088526A KR 101126674 B1 KR101126674 B1 KR 101126674B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
protease
oligonucleotide
peptide
activity
measuring
Prior art date
Application number
KR1020090088526A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20110030880A (ko
Inventor
정봉현
김중현
Original Assignee
한국생명공학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국생명공학연구원 filed Critical 한국생명공학연구원
Priority to KR1020090088526A priority Critical patent/KR101126674B1/ko
Publication of KR20110030880A publication Critical patent/KR20110030880A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101126674B1 publication Critical patent/KR101126674B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/50—Other enzymatic activities
    • C12Q2521/537—Protease

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 단백질 분해효소에 의하여 절단됨으로써 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단편을 생성하는 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드 및 상기 절단된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단편을 이용하여 단백질 분해효소의 활성을 간편하고, 신속하게 측정할 수 있는 단백질 분해효소의 활성 측정방법에 관한 것이다. 상기 방법을 이용하면, 소량의 단백질 분해효소의 활성도 신속하게 측정할 수 있다. 따라서, 암, 관절염 등 다양한 질병과 관련된 소량의 단백질 분해효소의 활성을 빠른 시간 안에 측정할 수 있으므로, 질병을 조기에 진단하는 진단법이나 단백질 분해효소의 활성을 억제하는 제어제와 같은 의약품 개발 산업에 유용하다.
단백질 분해효소, 단백질 분해효소 활성 측정, 펩타이드, 올리고뉴클레오티드, DNA, RNA

Description

단백질 분해효소의 활성 측정용 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드 및 이를 이용한 단백질 분해효소의 활성 측정방법{Oligonucleotide Conjugated Peptide for Measuring Activity of Protease and Method for Measuring Activity of Protease Using the Same}
본 발명은 단백질 분해효소의 활성 측정용 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드 및 이를 이용한 단백질 분해효소의 활성 측정방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 단백질 분해효소에 의하여 절단됨으로써, 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단편을 생성하는 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드 및 상기 절단된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단편을 이용하여 단백질 분해효소의 활성을 간편하고, 신속하게 측정할 수 있는 단백질 분해효소의 활성 측정방법에 관한 것이다.
프로테아제(Protease)는 단백질을 분해하는 효소로써 인체의 생리학적 진행 (단백질 이화작용, 혈액응고, 세포성장과 이동, 단백질의 활성화, 세포조절과 신호, 조직의 발달) 및 병리학적 진행(염증, 암의 발생과 전이, 바이러스 감염)에 있어 핵심적인 역할을 수행 한다(Thomas J. Wilson et al, Biochimica et Biophysica Acta, 1785, 85, 2008; E. Reich et al, Protease and Biological Control, Cold Srpring Harbor Lab, Press, Plainvew, NY, 1975; S.S. Abdel, in Handbook of Experimental Phamacology, eds. K. von der Helm et al, Spring, New York, 140). 따라서 단백질 분해효소의 활성을 측정하여 질병을 조기에 진단하거나 질병관련 단백질 분해효소의 활성을 저해하는 저해제를 의약품으로 개발할 수 있다.
단백질 분해효소의 활성을 측정하는 방법은 크게 기질의 종류에 따라 측정하고자 하는 단백질 분해효소의 특정 단백질 전체를 이용하는 법과 단백질 분해효소에 의해 분해되는 특정 아미노산 서열을 가진 합성 펩타이드를 이용하는 법으로 나눌 수 있다. 단백질 분해효소의 기질 단백질 전체를 이용하는 방법은 단백질 분해효소에 의해 분해된 단백질의 양을 대부분 HPLC나 Gel electrophoresis로 정량화 해야하므로 대량의 시료를 처리하기에는 적합하지 않으며, 민감도가 낮기 때문에 장시간의 활성측정 시간을 필요로 한다(Carine Lombard et al, Biochimie, 87, 265, 2005).
펩타이드를 기질로 이용하는 방법은 특정 단백질 분해효소에 의해 펩타이드가 분해되면서 발생하는 시료의 색 변화 또는 형광의 증감 정도를 UV-Vis spectrophotometer나 Fluorometer로 측정하기 때문에 대량의 시료를 처리하기에 가장 적합한 방법이다. 상기의 단백질 분해효소 활성 측정법은 기질 펩타이드의 염기서열에 따라 측정 감도의 차이가 있으나 최대 나노몰 농도(10-9 M)의 측정 민감도를 나타낸다(J. Peppard, Assay and Drug Development Technologies, 1, 425, 2003). 따라서 단백질 분해효소 활성 측정 민감도를 피코몰 농도(10-12 M)로 향상시 키고 측정 시간을 단축하고자 하는 연구가 시도되고 있다. 대표적으로 루시퍼라제(luciferase)(H. Yao, Angewandte Chmie International Edition, 46, 4346, 2007)나, 형광 고분자전해질(Fluorescent conjugated polyelectrolytes) (Mauricio R. Pinto et al, Proceedings of the National Academy and Sciences, 101, 7505, 2004)을 이용하여 형광의 세기를 증폭하는 방법이 있으나, 루시퍼라제를 이용하는 단백질 분해효소 활성 측정법은 피코몰 농도(10-12 M) 수준의 민감도를 얻기 위하여 24시간 이상의 측정 시간을 필요로 한다. 형광 고분자전해질을 이용하는 방법은 양의 전하를 갖는 기질 펩타이드를 음의 전하를 갖는 형광 고분자전해질에 정전기적 결합력을 이용하여 고정화 시킨 후, 단백질 분해효소의 활성에 의해 펩타이드가 분해되어 고분자전해질(polyelectrolytes)로부터 분리되면서 증감하는 형광의 세기를 측정하기 때문에 펩타이드의 전하가 중성에 가깝거나 시료의 염의 농도가 높은 경우에는 단백질 분해효소 활성 측정에 적합하지 않은 문제점을 가지고 있다.
이에 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 노력한 결과, 단백질 분해효소의 기질 펩타이드와 올리고뉴클레오티드를 결합시켜 제조한 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드에 단백질 분해효소를 처리하면, 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단편이 생성되며, 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단편을 이용하여 측정신호를 증폭시키면 단백질 분해효소의 활성을 향상된 민감도를 가지고, 신속하게 측정할 수 있다는 사실을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었 다.
따라서 본 발명의 목적은 단백질 분해효소의 활성 측정용 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드를 이용하여 단백질 분해효소의 활성을 측정하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 단백질 분해효소의 기질 펩타이드에 올리고뉴클레오티드가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 단백질 분해효소의 활성 측정용 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드에 단백질 분해효소를 처리하여, 상기 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드를 구성하는 단백질 분해효소의 기질 펩타이드를 절단시키는 단계; 및 (b) 상기 절단된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단편의 올리고뉴클레오티드를 증폭하여, 단백질 분해효소의 활성을 측정하는 단계를 포함하는 단백질 분해효소의 활성 측정방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 고체 지지체에 고정화되어 있는 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드에 단백질 분해효소를 처리하여, 상기 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드를 구성하는 단백질 분해효소의 기질 펩타이드를 절단시키는 단계; 및 (b) 상기 절단된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단편의 올리고뉴클레오티드를 증폭하여, 단 백질 분해효소의 활성을 측정하는 단계를 포함하는 단백질 분해효소의 활성 측정방법을 제공한다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드를 이용하면, 단백질 분해효소에 의하여 절단된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단편의 올리코뉴클레오티드를 증폭시킴으로써, 소량의 단백질 분해효소의 활성을 신속하게 측정할 수 있다. 따라서, 암, 관절염 등 다양한 질병과 관련된 소량의 단백질 분해효소의 활성을 빠른 시간 안에 측정할 수 있으므로, 질병을 조기에 진단하는 진단법이나 단백질 분해효소의 활성을 억제하는 제어제와 같은 의약품 개발 산업에 유용하다.
본 발명에서는 단백질 분해효소의 기질 펩타이드에 올리고뉴클레오티드가 결합되어 있는 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드에 단백질 분해효소를 처리하면, 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단편이 생성되고, 생성된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단편을 이용하여 측정신호를 증폭시키면 단백질 분해효소의 활성을 향상된 민감도를 가지고, 신속하게 측정할 수 있다는 사실을 확인하고자 하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는, MMP-2(Matrix metallopeptidase-2)의 활성을 측정하기 위하여, MMP-2의 기질 펩타이드에 신호 증폭용 올리고뉴클레오티드(DNA)를 결합시킨 복합 펩타이드를 고체 지지체(금 나노입자) 표면에 고정화시킨 후, MMP-2를 처리하고, 절단된 DNA를 포함하는 단편과 RNase H를 이용한 형광증폭 법으로 형광신호를 증폭시킴으로써, MMP-2의 활성을 고감도로 신속하게 측정할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 단백질 분해효소의 기질 펩타이드에 올리고뉴클레오티드가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 단백질 분해효소의 활성 측정용 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드에 관한 것이다. 도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 분해효소의 기질 펩타이드에 올리고뉴클레오티드가 결합된 단백질 분해효소의 활성 측정용 복합 펩타이드의 구조를 나타낸 도면이다.
상기 올리고뉴클레오티드는 DNA, RNA 또는 DNA/RNA를 예시할 수 있으며, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 단백질 분해효소의 기질 펩타이드의 양 말단 즉 N-말단 또는 C-말단에 결합되거나, 펩타이드의 아미노산 잔기에 결합될 수 있으며, 상기 단백질 분해효소의 기질 펩타이드와 올리고뉴클레오티드의 결합수에는 제한이 없다.
상기 단백질 분해효소의 기질 펩타이드는 상기 단백질 분해효소에 의해 분해되는 펩타이드 결합을 1개 또는 그 이상을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질 분해효소의 기질 펩타이드는 고체 지지체에 고정화되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
따라서, 상기 단백질 분해효소의 기질 펩타이드에 올리고뉴클레오티드가 결합된 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드는 고체 지지체에 고정화되어 있으므로, 단백질 분해효소에 의한 기질 펩타이드의 분해정도에 비례하여 올리고뉴클레오티드를 정량화하고, 배경신호를 최소화시킴으로써, 단백질 분해효소의 활성을 측정할 수 있다. 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 고체 지지체에 고정화된 복합 펩타이드가 단백질 분해효소에 의하여 절단되어 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단편과 분리되는 과정을 나타낸 도면이다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질 분해효소의 기질 펩타이드는 화학결합, 자기 조립법, 링커를 통한 결합 및 전기적 결합으로 구성된 군에서 선택되는 고정화 방법에 의하여 상기 고체 지지체에 고정화되어 있는 특징으로 할 수 있다.
상기 화학결합으로는 통상적으로 알려진 이온결합, 공유결합, 배위결합 등이 있으며, 상기 자기조립법은 단백질 등 생체 고분자가 적당한 환경조건에서 그 자신이 조립하여 생리적으로 의미있는 고차 구조를 형성하는 현상으로서, 기질 펩타이드의 말단기가 시트레이트 등에 의하여 음의 전하를 가지고 있는 고체지지체에 자기조립될 수 있다. 상기 기질 펩타이드의 말단기는 아민기, 티올기, 카르복실기, 알데하이드기, 에폭시기, 말레이마이드기 등을 예시할 수 있다.
상기 링커를 통한 결합으로는 Biotin-Streptavidin, Biotin-Avidin 결합 등을 예시할 수 있다.
상기 고체 지지체의 화학조성, 크기, 모양 등에 대한 제약은 없으며, 유리, 실리콘, 금속, 반도체, 플라스틱 등을 예시할 수 있으며, 더욱 상세하게는 금 나노입자, 자성 나노입자, 폴리머 마이크로 비드(Bead) 등을 예시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 관점에서, (a) 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드에 단백질 분해효소를 처리하여, 상기 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드를 구성하는 단백질 분해효소의 기질 펩타이드를 절단시키는 단계; 및 (b) 상기 절단된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단편의 올리고뉴클레오티드를 증폭하여, 단백질 분해효소의 활성을 측정하는 단계를 포함하는 단백질 분해효소의 활성 측정방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 고체 지지체에 고정화되어 있는 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드에 단백질 분해효소를 처리하여, 상기 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드를 구성하는 단백질 분해효소의 기질 펩타이드를 절단시키는 단계; 및 (b) 상기 절단된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단편의 올리고뉴클레오티드를 증폭하여, 단백질 분해효소의 활성을 측정하는 단계를 포함하는 단백질 분해효소의 활성 측정방법에 관한 것이다.
앞서 설명한 바와 같이, 상기 단백질 분해효소의 기질 펩타이드는 상기 단백질 분해효소에 의해 분해되는 펩타이드 결합을 1개 또는 그 이상을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 단백질 분해효소의 기질 펩타이드는 화학결합, 자기 조립법, 링커를 통한 결합 및 전기적 결합으로 구성된 군에서 선택되는 고정화 방법에 의하여 상기 고체 지지체에 고정화될 수 있다.
상기 고체 지지체의 종류, 상기 올리고뉴클레오티드의 종류, 상기 올리고뉴클레오티드와 상기 고체 지지체에 고정화된 단백질 분해효소의 기질 펩타이드의 결 합방법 등은 앞서 기재한 바와 동일하다.
다음으로, 상기 고체 지지체에 고정화되어 있는 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드가 제조되면, 상기 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드에 단백질 분해효소를 처리하여, 상기 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드를 구성하는 기질 펩타이드의 1개 또는 그 이상을 절단시킨다.
상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단편은 물리적 분리법, 화학적 분리법, 및 자기적 분리법으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의하여, 분리되는 것을 특징으로 할 수 있다. 즉, 상기 단백질 분해효소를 고체 지지체에 고정화되어 있는 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드에 처리하면, 상기 단백질 분해효소의 기질 펩타이드가 상기 단백질 분해효소에 의해 분해되어, 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단편이 생성되는데, 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단편은 고체 지지체의 특성, 고체 지지체와의 복합펩타이드와의 결합방식에 따라 적절한 방법으로 분리할 수 있다. 예를들면, 원심분리를 통한 비중의 차이, 자석을 이용한 자성여부, 특정물질과의 특이적인 결합능 등을 이용하여 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단편을 분리할 수 있다.
끝으로, 상기 분리법에 의하여 분리된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단편의 올리고뉴클레오티드를 증폭함으로써, 단백질 분해효소의 활성을 측정할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 증폭방법은 증폭대상에 따라 올리고뉴클레오티드를 직접 증폭시키는 표적증폭법(target amplification), 올리고뉴클레오티드 검출에 이 용되는 탐침을 증폭시키는 탐침증폭법(probe amplification), 검출신호를 증폭시키는 신호증폭법(signal amplification)을 모두 포함할 수 있다.
상기 표적증폭법 및 탐침증폭법으로는 중합효소연쇄반응법(PCR), 신호증폭법으로는 RNase H를 이용한 형광증폭법 등을 대표적으로 예시할 수 있다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시 예 1: 복합 펩타이드의 고체 지지체에 고정화
직경이 대략 13nm인 금 나노입자를 시트레이트 환원법(C. K Grabar et al, Analytical Chemistry, 67, 735, 1995)으로 제작하였다.
하기 서열번호 1의 아미노산 서열(Jo. L. Seltzer, The Journal of Biological Chemistry. Vol. 265, p. 20409, 1990)을 포함하는 MMP-2(Matrix metalloproteases-2) 기질 펩타이드(Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg-Gly)에 서열번호 2의 DNA가 결합된 "TATTGAAGCGGAGATT-Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg-Gly(OCH2CH2)3-Cys(amide)"의 복합 펩타이드 4μM과 금 나노입자 20nM을 1ml의 10mM Phosphate Buffer(pH 7.0)에서 12시간 이상 반응시켰다. 그 결과 복합펩타이드의 말단의 Cysteine 잔기의 SH와 금 나노입자 표면간의 결합으로 복합펩타이드는 자기조리법 에 의해 금 나노입자 표면에 고정화된다.
[서열번호 1]: Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg-Gly
[서열번호 2]: TATTGAAGCGGAGATT
이후 0.1M NaCl를 첨가하여 48시간 이상 반응시키고 금 나노입자 반응물을 10,000 RCF(Relative Centrifugal Force)에서 30분간 원심분리하여 상층 액을 제거한 후, 3번 이상 반복하여 금 나노입자에 고정화되지 않은 복합 펩타이드를 제거시켰다.
상기 금 나노입자에 고정화된 복합 펩타이드의 합성 유무는 전기영동을 통하여 확인하였다. 상기 시트레이트 환원법으로 제조된 금 나노입자는 음의 전하를 가지고 있어 전기연동 결과 양극 (도 3의 아랫방향)으로 이동하게 된다. 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 분해효소의 활성 측정용 복합 펩타이드를 1% Agarose gel에서 100mV 조건으로 전기연동을 실시한 결과를 나타낸 사진이다. 도 3에서 레인 1은 펩타이드 고정화에 사용된 금 나노입자, 레인 2는 기질 펩타이드만 고정화된 금 나노입자, 레인 3은 복합 펩타이드가 고정화된 금 나노입자를 의미하며, 상기 전기연동 결과로부터 금 나노입자 표면에 고정화된 펩타이드의 분자량에 비례하여 금 나노입자의 크기가 증가함으로써 양극으로 이동하는 속도가 감소되었음을 확인하였다.
실시 예 2: 복합 펩타이드를 이용한 MMP-2의 활성 측정
2-1: 단백질 분해효소의 처리
실시 예 1에서 제조된 복합 펩타이드(DNA + MMP-2의 기질펩타이드)가 고정화된 금 나노입자 20nM을 포함하는 완충용액(50mM Tris-HCl, pH7.6, 200mM NaCl, 5mM CaCl2, 1mM ZnCl2, 0.01% Brij 35, 0.02% Poly(ethylene glycol) MW: 20KD) 20㎕에 MMP-2를 1pM에서 100nM까지 첨가하여, 37℃에서 2시간동안 반응시킨 후, 12,500 RCF에서 20분간 원심분리하여, 상층액(DNA를 포함하는 단편)을 분리하였다.
2-2: DNA를 포함하는 단편의 증폭 및 MMP-2의 민감도 확인
MMP-2에 의하여 금 나노입자로부터 분리된 DNA를 포함하는 단편을 하기 기재된 RNase H를 이용한 형광증폭법(J.H.Kim et al, Chemical Communication, 42, 4342, 2007)으로 증폭시켜, 각각의 농도에 따른 MMP-2의 활성 민감도를 측정하였다.
실시예 1과 동일한 방법으로 하기 서열번호 3의 서열을 포함하는 RNA 결합체(5'-SH-(CH2)6-UUUUUUUUUAAUCUCCGCUUCAAUA-3'FITC) 4μM과 금 나노입자 20nM을 1ml의 10mM Phosphate Buffer(pH 7.0)에서 반응시켜, RNA가 고정화된 금 나노입자를 합성하였다.
[서열번호 3]: UUUUUUUUUAAUCUCCGCUUCAAUA
상기 2-1에서 분리한 DNA를 포함하는 단편 10㎕를 상기 RNA가 고정화된 금 나노입자 0.5nM 및 0.043unit/㎕의 RNase H를 포함하는 90㎕ 완충용액(50mM Trish-HCl, pH 8.2, 75mM KCl, 5mM MgCl2)에 첨가하고, 37℃에서 1시간 반응시키고, 50㎕의 완충용액을 보충하여 형광세기를 측정하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 즉, 도 4는 2시간동안 37℃에서 배양된 MMP-2와 복합 펩타이드가 고정화되어 있는 금 나노입자 혼합물에서 복합 펩타이드로부터 떨어져 나온 DNA 단편을 이용하여 형광신호를 1시간동안 증폭한 결과이다. 도 4로부터 MMP-2의 농도(활성)가 증가함에 따라 형광 신호의 증폭도 함께 증가하는 것을 확인하였다.
MMP-2의 민감도를 확인하기 위하여 각각의 MMP-2의 농도에 해당하는 형광의 세기를 MMP-2를 첨가하지 않은 시료에서 측정한 형광의 세기로 나누어 Signal/Background 값을 계산하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5로부터, 10pM의 MMP-2에서 대략 2 이상의 Signal/Background를 얻을 수 있음을 확인 하였다. 민감도는 기질 펩타이드의 아미노산 서열에 따라 달라질 수 있을 것으로 예측된다.
실시예 3: 복합 펩타이드를 이용한 MMP-2의 활성 측정에 소요되는 최저시간 조사
실시예 2에서 MMP-2와 복합 펩타이드가 고정화된 금 나노입자 반응 시간을 2시간 대신 20분으로 단축한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 MMP-2에 의하여 금 나노입자에 고정화된 복합 펩타이드로부터 떨어져 나온 DNA를 포함하는 단편을 이용하여 형광신호를 증폭시켜, MMP-2의 민감도를 실시간으로 확인하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6으로부터, Background 신호의 2배가 되는 시간을 기준으로 하였을 때, 10nM과 100nM MMP-2의 활성은 1분 이내에 1nM MMP-2의 활성은 20분 이내에 측정할 수 있음을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 분해효소의 기질 펩타이드에 올리고뉴클레오티드가 결합된 단백질 분해효소의 활성 측정용 복합 펩타이드의 구조를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 고체 지지체에 고정화된 복합 펩타이드가 단백질 분해효소에 의하여 절단되어 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단편과 분리되는 과정을 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 분해효소의 활성 측정용 복합 펩타이드의 전기연동 결과를 나타낸 사진이다(1: 금 나노입자, 2: 기질 펩타이드가 고정화된 금 나노입자, 3: 복합펩타이드가 고정화된 금 나노입자).
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 각 농도별로 단백질 분해효소를 처리하여 금 나노입자에 고정화된 복합 펩타이드로부터 떨어져 나온 DNA를 포함하는 단편을 이용하여 형광신호를 증폭한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 도 4의 결과를 MMP-2가 없는 경우에 발생된 형광의 세기로 나눈 Signal/Background를 MMP-2의 농도별로 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 단백질 분해효소를 처리하여 금 나노입자에 고정화된 복합 펩타이드로부터 떨어져 나온 DNA를 포함하는 단편을 이용하여 형광신호를 증폭한 결과를 실시간으로 나타낸 그래프이다.
< 도면의 주요 부호에 대한 설명 >
1. 올리고뉴클레오티드 2. 기질 펩타이드
3. 고체 지지체 4. 링커(linker)
5. 단백질 분해효소
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Oligonucleotide Conjugated Peptide for Measuring Activity of Protease and Method for Measuring Activity of Protease Using the Same <130> P09-B035 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> MMP-2(Matrix metalloproteases-2) substrate peptide <400> 1 Gly Pro Leu Gly Val Arg Gly 1 5 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial DNA <400> 2 tattgaagcg gagatt 16 <210> 3 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial RNA <400> 3 uuuuuuuuua aucuccgcuu caaua 25

Claims (14)

  1. 단백질 분해효소의 기질 펩타이드 말단에 올리고뉴클레오티드가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 단백질 분해효소의 활성 측정용 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 DNA, RNA 및 DNA/RNA로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단백질 분해효소의 기질 펩타이드는 상기 단백질 분해효소에 의해 분해되는 펩타이드 결합을 1개 또는 그 이상을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단백질 분해효소의 기질 펩타이드는 고체 지지체에 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 단백질 분해효소의 기질 펩타이드는 화학결합, 자기 조립법, 링커를 통한 결합 및 전기적 결합으로 구성된 군에서 선택되는 고정화 방법에 의하여 상기 고체 지지체에 고정화되어 있는 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드.
  6. 제4항에 있어서, 상기 고체 지지체는 유리, 실리콘, 금속, 반도체 및 플라스틱으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드.
  7. 다음 단계를 포함하는 단백질 분해효소의 활성 측정방법:
    (a) 제1항의 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드에 단백질 분해효소를 처리하여, 상기 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드를 구성하는 단백질 분해효소의 기질 펩타이드를 절단시키는 단계; 및
    (b) 상기 절단된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단편의 올리고뉴클레오티드를 증폭하여, 단백질 분해효소의 활성을 측정하는 단계.
  8. 다음 단계를 포함하는 단백질 분해효소의 활성 측정방법:
    (a) 제4항의 고체 지지체에 고정화되어 있는 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드에 단백질 분해효소를 처리하여, 상기 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드를 구성하는 단백질 분해효소의 기질 펩타이드를 절단시키는 단계; 및
    (b) 상기 절단된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단편의 올리고뉴클레오티드를 증폭하여, 단백질 분해효소의 활성을 측정하는 단계.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 단백질 분해효소의 기질 펩타이드는 상기 단백질 분해효소에 의해 분해되는 펩타이드 결합을 1개 또는 그 이상을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 분해효소의 활성 측정방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 단백질 분해효소의 기질 펩타이드는 화학결합, 자기 조립법, 링커를 통한 결합 및 전기적 결합으로 구성된 군에서 선택되는 고정화 방법에 의하여 상기 고체 지지체에 고정화되어 있는 특징으로 하는 단백질 분해효소의 활성 측정방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 고체 지지체는 유리, 실리콘, 금속, 반도체 및 플라스틱으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 단백질 분해효소의 활성 측정 방법.
  12. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 DNA, RNA 및 DNA/RNA로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 단백질 분해효소의 활성 측정방법.
  13. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 단백질 분해효소에 의하여 절단되어, 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단편은 물리적 분리법, 화학적 분리법, 전기적 분리법 및 자기적 분리법으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의하여, 분리되는 것을 특징으로 하는 단백질 분해효소의 활성 측정방법.
  14. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 절단된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단편의 올리고뉴클레오티드의 증폭은 올리고뉴클레오티드를 직접 증폭시키는 표적증폭법(target amplification), 올리고뉴클레오티드 검출에 이용되는 탐침을 증폭시키는 탐침증폭법(probe amplification) 및 검출신호를 증폭시키는 신호증폭법(signal amplification)으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의하여 증폭되는 것을 특징으로 하는 단백질 분해효소의 활성 측정방법.
KR1020090088526A 2009-09-18 2009-09-18 단백질 분해효소의 활성 측정용 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드 및 이를 이용한 단백질 분해효소의 활성 측정방법 KR101126674B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020090088526A KR101126674B1 (ko) 2009-09-18 2009-09-18 단백질 분해효소의 활성 측정용 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드 및 이를 이용한 단백질 분해효소의 활성 측정방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020090088526A KR101126674B1 (ko) 2009-09-18 2009-09-18 단백질 분해효소의 활성 측정용 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드 및 이를 이용한 단백질 분해효소의 활성 측정방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20110030880A KR20110030880A (ko) 2011-03-24
KR101126674B1 true KR101126674B1 (ko) 2012-03-29

Family

ID=43936261

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020090088526A KR101126674B1 (ko) 2009-09-18 2009-09-18 단백질 분해효소의 활성 측정용 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드 및 이를 이용한 단백질 분해효소의 활성 측정방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101126674B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101705892B1 (ko) 2016-03-09 2017-02-13 농업회사법인 주식회사 미력 발아곡물 발효 복합활성효소액 제조방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
논문 1: Anal. Biochem.

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101705892B1 (ko) 2016-03-09 2017-02-13 농업회사법인 주식회사 미력 발아곡물 발효 복합활성효소액 제조방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR20110030880A (ko) 2011-03-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230039899A1 (en) In situ rna analysis using probe pair ligation
JP5964746B2 (ja) Ｄｎａ−細胞コンジュゲート
KR100574759B1 (ko) 생화학 반응 검출에 사용되는 분자 구조물 및 그 사용방법
CA2616259C (en) Electrocatalytic nucleic acid hybridization detection
CN111511384A (zh) 工程化外来体的组合物和负载腔外来体有效负载物的方法
EP3192804B1 (en) Mutant lysenin pores
US20100285601A1 (en) Method of electrically detecting a nucleic acid molecule
EP3369828B1 (en) Bioprobes and methods of use thereof
Zhu et al. Solid-state nanopore single-molecule sensing of DNAzyme cleavage reaction assisted with nucleic acid nanostructure
Lin et al. Target-driven assembly of DNAzyme probes for simultaneous electrochemical detection of multiplex microRNAs
Liu et al. Switchable ‘on–off–on’electrochemical technique for direct detection of survivin mRNA in living cells
US20170233723A1 (en) Method For Affinity Purification
Jin et al. Spacer matters: All-peptide-based ligand for promoting interfacial proteolysis and plasmonic coupling
JP2006514826A (ja) 核酸を分析するためのラボ・オン・チップシステム
CN107478700A (zh) 用于提高核酸检测灵敏度的电化学信号增强剂及使用方法
KR101126674B1 (ko) 단백질 분해효소의 활성 측정용 올리고뉴클레오티드 복합 펩타이드 및 이를 이용한 단백질 분해효소의 활성 측정방법
EP2864786B1 (en) Protein detection using fet
Li et al. Highly sensitive protein detection based on DNAzyme cycling activated surface assembly of peptide decorated nanoparticles
Li et al. An ultrasensitive colorimetric aptasensor for ATP based on peptide/Au nanocomposites and hemin–G-quadruplex DNAzyme
KR100877187B1 (ko) 질병마커 인지 에피토프와 연결된 단백질 나노입자를포함하는 진단용 단백질 칩과 그의 초고감도 검출 방법
Tkac et al. Chapter Perspectives in Glycomics and Lectin Engineering
JP5759351B2 (ja) ボロン酸基固定化支持体を用いたピロリン酸検出法
KR102533260B1 (ko) 가분해성 프로브 및 이를 이용한 미생물을 검출 또는 동정하는 방법
KR101737450B1 (ko) 단일 세포 내 마이크로 rna의 고해상도 시각화 방법
KR102684067B1 (ko) DNA 및 RNA 동시 검출을 위한 Cas 복합체 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150109

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160308

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170208

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170802

Year of fee payment: 18