CN107478700A - 用于提高核酸检测灵敏度的电化学信号增强剂及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是一种用于提高核酸检测灵敏度的电化学信号增强剂，该增强剂是经过化学修饰的富含赖氨酸的多肽链；所述多肽链羧基末端的α‑COOH共价连接了具有苯环平面结构的化学分子，所述多肽链的赖氨酸侧链的ε‑NH2共价连接了电化学指示剂二茂铁；还包括该信号增强剂的使用方法，步骤为：（1）将电化学核酸传感器电极与含有待测核酸片段的样品溶液共孵育，使电极上的单链核酸探针与单链的待测核酸片段形成杂交双链；（2）将电化学信号增强剂溶液与电化学核酸传感器电极上的杂交双链共孵育；（3）进行电化学检测。

Description

用于提高核酸检测灵敏度的电化学信号增强剂及使用方法
技术领域：本发明涉及基于电化学原理的核酸检测的领域。
背景技术：利用电化学传感器检测DNA和RNA具有检测速度快、方法简便、性价比高的特点。目前，人们在电化学核酸传感器方面的研究和开发多集中在寻找更好的电极修饰方法以获得更大的电极有效表面积、合成能够更有效地区分DNA单双链的杂交指示剂以及设计特异性更强的核酸探针上，而在提高电化学电极本身的特性以及改善电化学指示剂灵敏度方面的研究则少有关注。因此，电化学核酸传感器的灵敏度较低一直是其实际应用的一个巨大障碍。
影响电化学核酸传感器灵敏度的主要因素有：(1)传感电极表面积与电极表面结构：传感电极的表面结构极大地影响传感器的灵敏度，大的电极有效表面积有助于获得高的灵敏度；(2)指示剂的选择：指示剂对双链DNA(dsDNA)以及单链DNA(ssDNA)的选择性结合能力影响传感器的精度；(3)杂质的干扰：如果杂交指示剂在电极表面或者与DNA本身具有非特异性吸附将产生很强的背景信号；(4)探针特性：探针的序列、稳定性对生物传感器有巨大的影响。因此改善电化学DNA传感器的灵敏度多集中在寻找更好的电极修饰方法以获得更大的电极有效表面积、合成更能区分DNA单双链的杂交指示剂以及设计更加特异的探针上，而对于改善电化学指示剂本身的灵敏度方面还很少有人关注。
发明内容：
发明目的：本发明的目的在于提供一种可以提高电化学核酸传感器检测灵敏度的信号增强剂。该信号增强剂以富含赖氨酸的多肽链(lysine-rich peptide，简称LRP)为基本骨架。在LRP的羧基端共价连接了一个平面结构的功能团，从而该LRP可以有效地插入在核酸双链(DNA/DNA双链、RNA/RNA双链、DNA/RNA双链)相邻的两个碱基对之间。在LRP上的每个赖氨酸残基的末端共价连接了电化学信号指示剂二茂铁，使得每一个LRP都成为了一个高效的电化学信号源。
技术方案：
一种用于提高核酸检测灵敏度的电化学信号增强剂，其特征在于：
该增强剂是经过化学修饰的富含赖氨酸的多肽链；所述多肽链羧基末端的α-COOH共价连接了具有苯环平面结构的化学分子，所述多肽链的赖氨酸侧链的ε-NH2共价连接了电化学指示剂二茂铁；
其化学结构为：
所述的用于提高核酸检测灵敏度的电化学信号增强剂，其特征在于：所述苯环平面结构特异性地嵌入在杂交双链的相邻两个互补碱基对之间。
电化学信号增强剂的使用方法，其特征在于：
该方法包括如下步骤：
(1)将电化学核酸传感器电极与含有待测核酸片段的样品溶液共孵育，使电极上的单链核酸探针与单链的待测核酸片段形成杂交双链；
(2)将电化学信号增强剂溶液与电化学核酸传感器电极上的杂交双链共孵育；
(3)进行电化学检测。
所述的电化学信号增强剂的使用方法，其特征在于：所述步骤(1)中的电化学核酸传感器包括：
参比电极；
辅助电极；
工作电极；
所述工作电极的电极表面固定有单链核酸探针；
所述单链核酸探针以共价键固定在工作电极表面上。
所述的电化学信号增强剂的使用方法，其特征在于：所述的待测核酸片段为线性的核酸片段或环状的核酸片段或DNA片段或RNA片段；
单链核酸探针与样品溶液中的待测核酸片段形成杂交双链。
所述的电化学信号增强剂的使用方法，其特征在于：所述步骤(3)中的电化学检测具体为电化学分析仪进行的检测，电化学检测采用三电极系统，其中工作电极为共价连接单链核酸探针的电极、参比电极为银/氯化银饱和电极、辅助电极为铂片电极。
附图说明：
图1：利用电化学信号增强剂实施电化学检测的流程图。
图2：电化学信号增强剂的制备流程图。
图3：LRP的蛋白免疫印迹分析。
图4：信号增强剂的电泳分析。
图5：不同浓度靶核酸片段的DPV峰电流曲线。
图6：DPV的峰电流与靶核酸片段浓度的相关性(0.02pM–2.0pM)。
图7：不同长度的LRP作为介质的电化学信号增强剂的DPV曲线。
图8：不同长度的LRP作为介质的电化学信号增强剂的DPV的峰电流。
图中标注：1可以共价连接单链核酸探针的电极；2带有-NH2聚苯胺纳米纤维；3单链核酸探针；4待测靶核酸单链；5电化学信号增强剂；6未采用电化学信号增强剂的DPV检测结果；7采用电化学信号增强剂的DPV检测结果；8电化学信号增强剂的示意图。
具体实施方式：
本发明是一种用于提高核酸检测灵敏度的电化学信号增强剂，该增强剂是经过化学修饰的富含赖氨酸的多肽链；所述多肽链羧基末端的α-COOH共价连接了具有苯环平面结构的化学分子，所述多肽链的赖氨酸侧链的ε-NH2共价连接了电化学指示剂二茂铁；
其化学结构为：
所述苯环平面结构可以特异性地嵌入在杂交双链的相邻两个互补碱基对之间。
上文所述的电化学信号增强剂的使用方法，其特征在于：
该方法包括如下步骤：
(1)将电化学核酸传感器电极与含有待测核酸片段的样品溶液共孵育，使电极上的单链核酸探针与单链的待测核酸片段形成杂交双链；
(2)将电化学信号增强剂溶液与电化学核酸传感器电极上的杂交双链共孵育；
(3)进行电化学检测。
上述步骤(1)中的电化学核酸传感器包括：
参比电极；
辅助电极；
工作电极；
所述工作电极的电极表面固定有单链核酸探针；
所述单链核酸探针以共价键固定在工作电极表面上。
所述的待测核酸片段为线性的核酸片段或环状的核酸片段或DNA片段或RNA片段；
单链核酸探针与样品溶液中的待测核酸片段形成杂交双链。
所述步骤(3)中的电化学检测具体为电化学分析仪进行的检测，电化学检测采用三电极系统，其中工作电极为可以共价连接单链核酸探针的电极、参比电极为银/氯化银饱和电极、辅助电极为铂片电极。
下面结合附图和实施例详述本发明。
实施例1：利用信号增强剂提高电化学检测灵敏度的实验
1.利用基因工程技术制备富含赖氨酸的多肽链(LRP)。表1是五种LRP的氨基酸序列、赖氨酸残基数目、赖氨酸残基数目百分比的信息。图2是制备电化学信号增强剂的流程图。
表1
图3为纯化后的不同长度的LRP的蛋白免疫印迹结果，其中1-5分别为LRP-1–LRP-5。
2.制备电化学信号增强剂(FLAA1–FLAA5)。将五种不同的LRP分别制备成为五种不同的电化学信号增强剂。本次实施例中是利用苯胺和二茂铁甲酸制备电化学信号增强剂。
a)苯胺与LRP羟基的连接：
6-氨基己酸与苯胺的连接(AA的合成)
2M的6-氨基己酸溶液与苯胺按体积比1:5比例混合后，37℃，150rpm，反应过夜。10000rpm离心后取水相，此即为AA溶液。
LRP与AA的连接(LAA的合成)
LRP与AA溶液按体积比1:1比例混合后，37℃，金属浴过夜。3KD截留的超滤离心管14000g离心20min，截留部分即为LAA溶液。
b)二茂铁甲酸与6-氨基己酸的连接
饱和二茂铁甲酸溶液中加入6-氨基己酸，使其终浓度为2M，37℃，金属浴过夜，此即为FA溶液。
c)二茂铁甲酸与LRP上赖氨酸残基的连接：
FA溶液与LAA溶液按体积比5:1比例混合，37℃，金属浴过夜。3KD截留的超滤离心管14000g离心20min，截留部分即为FLAA溶液。
d)将制备得到的电化学信号增强剂FLAA1、作为对照的不含有二茂铁的LAA1和LRP1分别与125bps的DNA孵育后进行电泳，结果显示LRP1+DNA泳道的迁移率没有变化，而加入FLAA1和LAA1的泳道均显示有明显的迁移率改变，其中FLAA1组的改变更显著。如图4，其中1分子大小标记物(Marker)；2 125bps DNA片段；3 125bps DNA片段+LRP1；4 125bps DNA片段+FLAA1；5 125bps DNA片段+LAA1。
3.制备工作电极
a)设计固定在工作电极上的核酸探针和模拟的靶核酸片段(表2)；
表2
b)将单链核酸探针共价连接电化学工作电极的表面。
将修饰了一维导电聚苯胺纳米阵列的DNA电化学传感器的电极浸入到含有2pM的靶核酸片段的溶液中，孵育1小时(57℃)，利用含0.1％SDS的PBS溶液冲洗电极，以除去电极表面通过非特异性吸附作用残留的靶核酸片段，冲洗三次，每次5分钟。
4.利用DPV模式检测样品中的靶核酸片段。
a)工作电极的核酸探针与五种不同浓度的靶核酸片段杂交：
靶核酸片段浓度：0.02、0.1、0.5、1.0、2.0pM。
杂交条件：杂交缓冲液为PBS缓冲液(pH7.4)，杂交温度为57℃，杂交时间为1小时。用含0.1％SDS的PBS溶液冲洗电极，以除去电极表面通过吸附作用残留的靶核酸片段，冲洗三次，每次5分钟。
b)电化学信号增强剂与杂交双链的反应：
电化学信号增强剂为FLAA1。
孵育条件：孵育缓冲液为PBS缓冲液(pH7.4)，孵育温度为57℃，孵育时间为1小时。
c)电化学检测：
靶核酸片段浓度与DPV信号峰电流呈现良好的线性度(R2＝0.9891)。线性方程为y＝-0.2999x-0.0618,其中x为靶核酸片段浓度(pM)；y为阴极还原峰电流(μA)如图5和图6所示，图5中曲线1为2pM；2为1pM；3为0.5pM；4为0.1pM；5为0.02pM。
我们考察了不同的FLAA作为电化学指示剂时的峰电流。在相同条件下利用同一传感器分别对1pM目的片段进行测定，结果显示这五种信号增强剂(FLAA1–FLAA5)的DPV峰电流之间的差异不明显，如图7和图8所示，图7中(1)72aa；(2)62aa；(3)53aa(4)44aa；(5)36aa；图8中(1)72aa；(2)62aa；(3)53aa(4)44aa；(5)36aa。
以上对本发明专利所提供的进行了初步的描述。以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应该指出，对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明专利原理的前提下，可以对本发明专利进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也在本发明专利权利要求的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种用于提高核酸检测灵敏度的电化学信号增强剂，其特征在于：
该增强剂是经过化学修饰的富含赖氨酸的多肽链；所述多肽链羧基末端的α-COOH共价连接了具有苯环平面结构的化学分子，所述多肽链的赖氨酸侧链的ε-NH2共价连接了电化学指示剂二茂铁；
其化学结构为：
2.根据权利要求1所述的用于提高核酸检测灵敏度的电化学信号增强剂，其特征在于：所述苯环平面结构特异性地嵌入在杂交双链的相邻两个互补碱基对之间。
3.如权利要求1所述的电化学信号增强剂的使用方法，其特征在于：
该方法包括如下步骤：
(1)将电化学核酸传感器电极与含有待测核酸片段的样品溶液共孵育，使电极上的单链核酸探针与单链的待测核酸片段形成杂交双链；
(2)将电化学信号增强剂溶液与电化学核酸传感器电极上的杂交双链共孵育；
(3)进行电化学检测。
4.根据权利要求3所述的电化学信号增强剂的使用方法，其特征在于：所述步骤(1)中的电化学核酸传感器包括：
参比电极；
辅助电极；
工作电极；
所述工作电极的电极表面固定有单链核酸探针；
所述单链核酸探针以共价键固定在工作电极表面上。
5.根据权利要求3所述的电化学信号增强剂的使用方法，其特征在于：所述的待测核酸片段为线性的核酸片段或环状的核酸片段或DNA片段或RNA片段；
单链核酸探针与样品溶液中的待测核酸片段形成杂交双链。
6.根据权利要求3所述的电化学信号增强剂的使用方法，其特征在于：所述步骤(3)中的电化学检测具体为电化学分析仪进行的检测，电化学检测采用三电极系统，其中工作电极为共价连接单链核酸探针的电极、参比电极为银/氯化银饱和电极、辅助电极为铂片电极。
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