CN109486909A - 普鲁兰多糖对于提高核酸扩增特异性的应用 - Google Patents

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Abstract

一种普鲁兰多糖用于提高核酸扩增特异性的应用。所述应用中将普鲁兰多糖与DNA聚合酶、扩增引物、dNTP、Mg2+、扩增模板或待测的靶核酸分子、报告分子中的一种或多种组合成试剂。所述核酸扩增特异性中的核酸扩增方法为热循环扩增方法或等温扩增方法。本发明提出了利用普鲁士多糖来改善等温扩增特异性的创意，并得到了实验验证。

Description

普鲁兰多糖对于提高核酸扩增特异性的应用
技术领域：本发明涉及利用核酸扩增技术进行核酸检测等领域。
背景技术：核酸检测是生物学基础研究、医学临床诊断、食品安全、法医鉴定等领域中的必要手段。核酸检测的高灵敏度是通过对特定的核酸片段进行扩增实现的。最常用的核酸扩增技术包括以热循环为基础的聚合酶链反应方法 (PCR)和等温扩增反应方法。
PCR方法提供了高检测灵敏度和高检测特异性的技术优势。但是PCR方法依赖昂贵的检测仪器和苛刻的实验条件，非常适合在具有较好实验条件的实验室中使用，但是不适用实时(real-time)检测和实地(on-site)检测。
近几年来，在等温条件下进行核酸扩增的方法得到了迅速的发展，例如环介导等温扩增方法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)[1]、指数扩增方法(exponential amplification reactrion，EXPAR)[2]、滚环扩增(rolling circleamplification，RCA)[3]、分枝滚环扩增(branched rolling circle amplification， b-RCA)[4]、解螺旋酶依赖扩增(helicase dependent amplification，HDA)[5]、重组聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)[6]、核酸序列依赖的扩增(nucleicacid sequence based amplification，NASBA)[7]、切割延长扩增(nicking andextension amplification reaction，NEAR)[8]、指数链置换扩增 (exponential stranddisplacement amplification，E-SDA)[9]。
每种扩增方法基于不同的原理，对特定的靶核酸分子(DNA、RNA、小非编码RNA、长非编码RNA等)进行扩增，并在扩增过程中或在扩增过程后对扩增产物进行检测。等温扩增方法的最大特点是核酸检测可以在恒定温度下进行，无需反复的升温-降温过程，凸显了操作简单、无需精密昂贵仪器、对实验环境无特殊要求的优点。有些方法运用了指数扩增的模式，大大地提高了检测灵敏度。但是，高扩增效率不可避免地带来一些非特异性的扩增，例如，在没有靶核酸分子存在的条件下，或者靶核酸分子的核酸序列与非靶核酸分子的相差甚小时(仅有一个或两个核苷酸差异)，扩增结果会产生假阳性(false-positive) 结果，干扰了正常的核酸检测和鉴定。这极大地限制了这些等温扩增方法的实际应用。
具有指数扩增特征的等温扩增荧光曲线具有高度的相似性。它们都是S形曲线，一般由三段组成。首先，从扩增起始点到大约10-20分钟的区间内是荧光值极低的基础值水平线，然后荧光曲线在一个较短时间内快速上升到荧光饱和值的上升阶段，最后是荧光曲线值维持在饱和状态直到反应结束的水平线。其中荧光曲线快速上升阶段的中点定义为转折点T0(turning point)。T0的准确数值可以利用计算机软件处理S形扩增荧光曲线获得。随着样品中待测的靶核酸分子(DNA或RNA)浓度的不断下降，指数扩增的S形荧光曲线逐步向右平移，其转折点T0的数值随之增加。理论而言，阴性对照组(即没有靶核酸分子DNA 或RNA)的扩增荧光曲线应该是一条荧光值极低的平坦直线，不应该出现任何的转折点。但是由于一些未知的原因，阴性对照组的扩增荧光曲线也会出现上升段和转折点。人们希望，阴性对照组转折点的时间出现的越晚越好。
前期的研究表明，有些化学分子或生物分子可以在核酸扩增中有提高核酸扩增特异性的功能。二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、甜菜碱(betaine)、丙三醇(glycerol)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)和单链结合蛋白(single-stranded binding protein，SSB)可以用来改善PCR的扩增效率和扩增特异性[10-14]。在基于EXPAR的检测中，氯化四甲铵(tetramethylammonium chloride,TMAC)、BSA和SSB也表现出了改善检测特异性的能力[15]。此外，人们还发现DMSO可以增加LAMP的特异性[16]。
为了扩大等温扩增的应用范围，我们提出了利用普鲁士多糖来改善等温扩增特异性的创意，并得到了实验验证。
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发明内容：
发明目的：本发明的目的是利用化学分子或生物分子提高核酸扩增特异性。
技术方案：
一种普鲁兰多糖对于提高核酸扩增特异性的应用。
所述的普鲁兰多糖对于提高核酸扩增特异性的应用，其特征在于：所述应用中将普鲁兰多糖与DNA聚合酶、扩增引物、dNTP、Mg2+、扩增模板或待测的靶核酸分子、报告分子中的一种或多种组合成试剂。
所述的普鲁兰多糖对于提高核酸扩增特异性的应用，其特征在于：所述核酸扩增特异性中的核酸扩增方法为热循环扩增方法。
所述的普鲁兰多糖对于提高核酸扩增特异性的应用，其特征在于：所述核酸扩增特异性中的核酸扩增方法为等温扩增方法。
所述的普鲁兰多糖对于提高核酸扩增特异性的应用，其特征在于：所述热循环扩增方法具体为聚合酶链反应。
所述的普鲁兰多糖对于提高核酸扩增特异性的应用，其特征在于：所述等温扩增方法为环介导等温扩增、指数扩增、滚环扩增、分枝滚环扩增、解螺旋酶依赖扩增、重组聚合酶扩增、核酸序列依赖的扩增或切割延长扩增。
所述的普鲁兰多糖对于提高核酸扩增特异性的应用，其特征在于：在所述应用的反应体系中，普鲁兰多糖的比例为0.2％-2.0％质量体积比。
所述的普鲁兰多糖对于提高核酸扩增特异性的应用，其特征在于：反应温度控制在50℃–95℃之间。
所述的普鲁兰多糖对于提高核酸扩增特异性的应用，其特征在于：反应温度控制在30℃–67℃之间。
一种普鲁兰多糖对于制作提高核酸扩增特异性的试剂的应用。
优点及效果：
本发明提出了利用普鲁士多糖来改善等温扩增特异性的创意，并得到了实验验证。扩大了等温扩增的应用范围。
附图说明：
图1利用普鲁兰多糖提高LAMP方法检测结核杆菌TB rpoB基因的扩增特异性的LAMP扩增荧光曲线
图2为表征扩增曲线转折点的柱状图
图3普鲁兰多糖浓度对LAMP方法扩增结核杆菌rpoB基因特异性的影响。不同普鲁兰多糖浓度的LAMP扩增荧光曲线
图4特异性扩增的转折点和非特异性扩增的转折点与普鲁兰多糖浓度之间的相关性
图5利用普鲁兰多糖提高LAMP方法检测嗜酸乳杆菌16SrRNA基因的扩增特异性。
具体实施方式：
下面结合附图和实施例详述本发明。
实施例1：利用普鲁兰多糖提高LAMP方法检测结核杆菌TB rpoB基因的扩增特异性。
A)LAMP方法检测结核杆菌rpoB基因的扩增体系：反应体系为25μL，反应体系包含下列成分：20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4， 8mM Mg2SO4，0.8M甜菜碱，1.4mM dNTP，0.2μM F3，0.2μM B3，0.8μM FIP， 0.8μM BIP，1x SYBR green I，8U Bst DNA聚合酶，普鲁兰多糖浓度为1％(w:v)，反应温度63℃，反应时间60min。
B)结核杆菌rpoB基因的提取
结核杆菌rpoB基因提取采用厦门致善生物科技有限公司提取试剂盒提取：挑取适量结核杆菌菌落加入裂解液中——灭活40min，灭活后的菌液加入DTT 和增强液——混匀后直接放入核酸提取仪中——Nanodrop 2000检测提取核酸浓度，为30ng/μL。
C)扩增结核杆菌rpoB基因的LAMP引物序列：
F3：5’-GGAGTTCTTCGGCACCAG
B3：5’-CCCCTCAGGGGTTTCGA
FIP：5’-AACAGTCGGCGCTTGTGGGCAGCTGAGCCAATTCATGG
BIP：5’-GTCTGTCACGTGAGCGTGCCACATCCGGCCGTAGTGC
实施例2：普鲁兰多糖浓度对LAMP方法扩增结核杆菌rpoB基因特异性的影响。
A)LAMP方法检测结核杆菌rpoB基因的扩增体系：反应体系为25μL，反应体系包含下列成分：20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4， 8mM Mg2SO4，0.8M甜菜碱，1.4mM dNTP，0.2μM F3，0.2μM B3，0.8μM FIP， 0.8μM BIP，1x SYBR green I，8U Bst DNA聚合酶。反应体系中普鲁兰多糖浓度分别为0.5％，1.0％和2.0％(w:v)，扩增温度63℃，反应时间60min。
B)结核杆菌rpoB基因的提取
结核杆菌rpoB基因提取采用厦门致善生物科技有限公司提取试剂盒提取：挑取适量结核杆菌菌落加入裂解液中——灭活40min，灭活后的菌液加入DTT 和增强液——混匀后直接放入核酸提取仪中——Nanodrop 2000检测提取核酸浓度，为30ng/μL。
C)扩增结核杆菌rpoB基因的LAMP引物序列：
F3：5’-GGAGTTCTTCGGCACCAG
B3：5’-CCCCTCAGGGGTTTCGA
FIP：5’-AACAGTCGGCGCTTGTGGGCAGCTGAGCCAATTCATGG
BIP：5’-GTCTGTCACGTGAGCGTGCCACATCCGGCCGTAGTGC
实施例3：利用普鲁兰多糖提高LAMP检测嗜酸乳杆菌16SrRNA基因的扩增特异性。
A)LAMP方法检测嗜酸乳杆菌16SrRNA基因的扩增体系：反应体系为 25μL，反应体系包含下列成分：20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM (NH4)2SO4，8mM Mg2SO4，0.8M甜菜碱，1.4mM dNTP，0.2μM F3，0.2μM B3，0.8μM FIP，0.8μM BIP，1x SYBR green I，8U BstDNA聚合酶，普鲁兰多糖添加浓度为1％(w:v)，反应温度63℃，反应时间60min。
B)扩增嗜酸乳杆菌16SrRNA基因的LAMP引物序列：
F3:5’-TCCTGGCTCAGGACGAAC
B3:5’-GCTGATCATGCGATCTGCTT
FIP:5’-CGTTCCCAACGTCATCACCGAACGGCGTGCCTAATACATGC
BIP:5’-CGGCGGATGGGTGAGTAACACGCACCTGTTTCCAAGTGGTA
以上对本发明专利所提供的进行了初步的描述。以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应该指出，对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明专利原理的前提下，可以对本发明专利进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也在本发明专利权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种普鲁兰多糖对于提高核酸扩增特异性的应用。
2.根据权利要求1所述的普鲁兰多糖对于提高核酸扩增特异性的应用，其特征在于：所述应用中将普鲁兰多糖与DNA聚合酶、扩增引物、dNTP、Mg2+、扩增模板或待测的靶核酸分子、报告分子中的一种或多种组合成试剂。
3.根据权利要求1所述的普鲁兰多糖对于提高核酸扩增特异性的应用，其特征在于：所述核酸扩增特异性中的核酸扩增方法为热循环扩增方法。
4.根据权利要求1所述的普鲁兰多糖对于提高核酸扩增特异性的应用，其特征在于：所述核酸扩增特异性中的核酸扩增方法为等温扩增方法。
5.根据权利要求3所述的普鲁兰多糖对于提高核酸扩增特异性的应用，其特征在于：所述热循环扩增方法具体为聚合酶链反应。
6.根据权利要求4所述的普鲁兰多糖对于提高核酸扩增特异性的应用，其特征在于：所述等温扩增方法为环介导等温扩增、指数扩增、滚环扩增、分枝滚环扩增、解螺旋酶依赖扩增、重组聚合酶扩增、核酸序列依赖的扩增或切割延长扩增。
7.根据权利要求1所述的普鲁兰多糖对于提高核酸扩增特异性的应用，其特征在于：在所述应用的反应体系中，普鲁兰多糖的比例为0.2％-2.0％质量体积比。
8.根据权利要求3所述的普鲁兰多糖对于提高核酸扩增特异性的应用，其特征在于：反应温度控制在50℃–95℃之间。
9.根据权利要求4所述的普鲁兰多糖对于提高核酸扩增特异性的应用，其特征在于：反应温度控制在30℃–67℃之间。
10.一种普鲁兰多糖对于制作提高核酸扩增特异性的试剂的应用。
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