KR102098710B1 - 헤어핀 프로브 기반 등온 핵산 증폭을 이용한 표적핵산 검출 방법 - Google Patents

헤어핀 프로브 기반 등온 핵산 증폭을 이용한 표적핵산 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 헤어핀 프로브 기반 등온 핵산증폭기술(Hairpin probe-assisted Isothermal Probe Amplification, HIPAmp)을 이용한 표적핵산을 검출하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 기존의 등온 핵산증폭기술인 EXPAR 기술이 가지고 있던 표적핵산의 제한적 활용 문제를 해결하여 범용적인 표적핵산에 대하여 검출을 수행할 수 있는 효과가 있다.

Description

헤어핀 프로브 기반 등온 핵산 증폭을 이용한 표적핵산 검출 방법 {Method for Detecting Target Nucleic Acid Using Isothermal Nucleic Acid Amplication Basd on Hairpin Probe}
본 발명은 헤어핀 프로브 기반 등온 핵산증폭기술(Hairpin probe-assisted Isothermal Probe Amplification, HIPAmp)을 이용한 표적핵산을 검출하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 표적핵산과 특이적으로 결합가능한 염기서열을 가지는 헤어핀 고리, 프라이머와 결합가능한 염기서열을 가지고, 서로 상보적으로 결합가능한 헤어핀 줄기, 트리거 프로브(TP)와 상보적인 서열을 가지는 cTP 및 cTP와 줄기사이에 위치하는 절단효소 인식 염기서열을 포함하는 헤어핀 프로브를 사용하는 것을 특징으로 하는 핵산증폭기술을 이용한 표적핵산의 검출방법에 관한 것이다.
중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, 이하 PCR) 기술은 표적핵산의 증폭 및 검출을 위해 가장 널리 사용되는 기술이다. 하지만, PCR 반응을 구현하기 위해서는 정교한 온도 조절이 필수적으로 요구되며, 이를 위한 온도 조절 장치의 탑재로 인해 PCR 장비의 부피가 커지고 가격이 비싸진다는 단점을 가지고 있다. 이러한 기존 PCR 기술의 단점을 해결하기 위한 대체 기술로서 다양한 등온 핵산 증폭 기술들 (strand displacement amplification (SDA); loop-mediated amplification (LAMP); nucleic acid sequence-based amplification (NASBA); signal-mediated amplification of RNA technology (SMART); rolling circle amplification (RCA); helicase-dependent amplification (HDA); isothermal chain amplification (ICA); 및 recombinase polymerase amplification (RPA) 등)의 개발이 활발히 진행되고 있는 실정이다.
현재까지 개발된 등온 핵산 증폭 기술들 중 EXPAR 기술은 빠른 검출 시간 및 높은 민감도를 보유한 대표적인 등온 핵산 증폭 기술로서 많은 관심을 받고 있으며, EXPAR 반응을 기반으로 한 다양한 생체 물질 검출 기술의 개발 또한 이루어지고 있다. 상기 EXPAR 기술은 절단효소 및 DNA 중합효소의 연쇄 반응을 기반으로 하며, 표적핵산과 특이적으로 결합 가능한 주형(template)을 사용하여 표적핵산을 검출하는 기술이다(Van Ness et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 100, 4504, 2003).
보다 구체적으로, 상기 주형은 절단효소 인식 염기서열 및 상기 절단효소 인식 염기서열의 양 말단과 연결된 2개의 표적핵산과 상보적인 동일 염기서열로 구성된 것을 특징으로 할 수 있다. 표적핵산이 존재할 경우, 상기 주형과 표적핵산의 결합 반응이 이루어지고, 이후, DNA 중합효소의 활성에 의해 상기 주형과 결합된 표적핵산으로부터 새로운 DNA의 합성 반응이 진행되며, 최종적으로, 상기 주형으로부터 dsDNA 산물이 생성된다. 또한, 상기 생성된 dsDNA 산물에 포함된 절단효소 인식 염기서열을 기반으로, 절단효소 및 DNA 중합효소의 연쇄 반응에 의해 DNA 가닥이 지속적으로 생성된다. 상기 생성된 DNA 가닥은 표적핵산과 동일한 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있으며, 반응에 참여하지 않은 주형과 결합하여 dsDNA 산물 생성 반응을 유도할 수 있기 때문에, 결과적으로, 상기 dsDNA 산물의 지수함수적 증폭 반응이 구현되는 것을 특징으로 할 수 있다. 하지만, 상기 언급된 EXPAR 반응을 구현하기 위해서는 표적핵산에 특이적인 주형의 합성이 필수적으로 요구될 뿐만 아니라, 표적핵산이 직접적으로 DNA 중합효소의 활성에 의한 DNA 합성 반응의 기질로서 사용되기 때문에, 상기 EXPAR 기술은 짧은 DNA 가닥 (이하 DNA fragment)의 검출에만 제한적으로 사용이 가능하다는 단점을 가지고 있다.
상기 EXPAR 기술의 활용 범위를 증대시키기 위해 길이가 긴 표적핵산으로부터 상기 언급된 EXPAR 반응의 기질로서 사용될 수 있는 DNA fragment를 생성해내는 기술(이하 fingerprinting reaction)이 고안되었다. 보다 구체적으로, 상기 fingerprinting reaction은 절단효소 및 DNA 중합효소의 연쇄 반응을 기반으로, 표적핵산 내부에 존재하는 절단효소 인식 염기서열 및 상기 절단효소 인식 염기서열을 포함하는 주변 염기서열로부터 DNA fragment를 생성하는 반응이며, 본 기술의 개발을 통해 기존 EXPAR 기술의 활용 범위가 증대되었다. 하지만, 상기 fingerprinting reaction은 표적핵산 내부의 절단효소 인식 염기서열이 필수적으로 요구되는 반응이기 때문에 기술의 적용에 제한이 있으며, 따라서, 상기 EXPAR 기술의 제한적 활용 문제를 완벽히 해결하지는 못하고 있는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 앞서 기술한 종래 기술의 문제점을 해결함으로써, 기존 EXPAR 기술이 가지고 있던 제한적 활용 문제를 극복할 수 있는 기술을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 기존 EXPAR 기술에서 사용되는 선형 (linear)의 주형을 대신하여 표적핵산 내부의 특정 염기서열과 특이적으로 결합 가능한 헤어핀 구조의 프로브를 기반으로 하여, 핵산을 등온증폭시키는 경우, 표적핵산이 DNA 중합효소 반응의 직접적인 기질로서 사용되지 않기 때문에, 표적핵산 내부에 절단효소 인식 서열이 없더라도 증폭이 가능하므로, 제한없이 범용적으로 표적핵산 검출이 가능하다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 표적핵산 내부의 특정 염기서열과 특이적으로 결합 가능한 헤어핀 구조를 가지는 헤어핀 프로브를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 헤어핀 프로브를 사용하는 것을 특징으로 하는 표적핵산의 검출방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (i) 표적핵산과 특이적으로 결합가능한 염기서열을 가지는 헤어핀 고리;
(ii) 상기 헤어핀 고리의 양 말단과 연결되고, 프라이머와 결합가능한 염기서열을 가지고, 서로 상보적으로 결합가능한 양 말단의 헤어핀 줄기;
(iii) 상기 (b)의 헤어핀 줄기의 양 말단과 연결되고, 트리거 프로브(TP)와 상보적인 서열을 가지는 cTP; 및
(iv) 상기 헤어핀 프로브 5' 말단의 cTP와 줄기사이에 위치하는 절단효소 인식 염기서열을 포함하는 표적핵산 검출을 위한 헤어핀 프로브를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 표적핵산 함유 시료, 상기 헤어핀 프로브, 상기 헤어핀 프로브의 줄기에 결합가능한 프라이머, DNA 중합효소 및 dNTP를 포함하는 조성물을 반응시켜, dsDNA를 증폭하는 단계; 및 (d) 상기 증폭된 dsDNA를 분석하여 표적핵산을 검출하는 단계를 포함하는 표적핵산의 검출방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 표적핵산 함유 시료, 상기 헤어핀 프로브, 상기 헤어핀 프로브의 줄기에 결합가능한 프라이머, DNA 중합효소 및 dNTP를 포함하는 표적핵산 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 기존의 등온 핵산증폭기술인 EXPAR 기술이 가지고 있던 표적핵산의 제한적 활용 문제를 해결하여 범용적인 표적핵산에 대하여 검출을 수행할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 HIPAmp 기술의 반응을 도식화한 것으로, (A)는 표적핵산으로부터 IP 1이 생성되는 반응을 나타낸 것이고, (B)는 상기 (A)에서 생성된 IP 1으로부터 dsDNA 산물의 생성 및 검출 반응을 나타낸 것이며, (C)는 헤어핀 프로브 및 상기 (B)에서 생성된 TP의 결합 반응에 의해 유도되는 dsDNA 산물의 생성 및 검출 반응을 나타낸 것이다.
도 2는 여러 반응 조건 (1: 헤어핀 프로브 및 프라이머가 첨가되지 않은 반응 조건; 2: 헤어핀 프로브가 첨가되지 않은 반응 조건; 3: 프라이머가 첨가되지 않은 반응 조건; 4: 헤어핀 프로브 및 프라이머가 모두 첨가된 반응 조건; 및 5: 표적핵산이 첨가되지 않은 반응 조건)에 따른 본 발명의 HIPAmp 반응 결과를 실시간 형광 신호 및 전기영동을 통해 확인한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 HIPAmp 기술의 표적핵산 검출 민감도 실험 결과를 나타낸 것으로, (a)는 다양한 표적핵산 농도를 포함하는 반응 시료로부터 발생하는 실시간 형광 신호를 나타낸 것이고, (b)는 threshold time (이하 tTHR)과 표적핵산 농도 사이의 선형 관계를 나타낸 것이다.
도 4는 degree of tTHR decrease 값을 기반으로 한 본 발명의 HIPAmp 기술의 표적핵산 검출 선택도 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 HIPAmp 기술의 표적핵산 검출 실용성 확인을 위해 다양한 길이 (46, 208, 및 895 bp)의 표적핵산(2nM)을 포함하는 시료의 실시간 형광 신호 측정 실험 결과를 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서 제공하는 헤어핀 프로브 기반 등온 핵산증폭기술(Hairpin probe-assisted Isothermal Probe Amplification, 이하, HIPAmp)기술을 이용한 표적핵산 검출 방법은 종래의 EXPAR 기술이 가지고 있던 단점을 해결할 수 있는 검출 방법이다. 보다 구체적으로, 기존 EXPAR 기술은 표적핵산에 특이적인 주형의 합성이 필수적으로 요구될 뿐만 아니라, 표적핵산이 직접적으로 DNA 중합효소 활성에 의한 DNA 합성 반응의 기질로서 사용되기 때문에, DNA fragment의 검출에만 제한적으로 사용이 가능하며, 결과적으로, 기술의 활용이 제한적이라는 단점을 보유하고 있다. 하지만, 본 발명에 따른 HIPAmp 기술에서는 기존 EXPAR 기술에서 사용되는 선형의 주형을 대신하여 표적핵산 내부의 특정 염기서열과 특이적으로 결합 가능한 헤어핀 프로브를 도입함으로써, 기존 EXPAR 기술의 제한적 활용 문제를 해결하였다. 보다 구체적으로, 상기 헤어핀 프로브를 기반으로 한 반응 시스템의 경우 표적핵산을 효소 반응의 직접적인 기질로서 사용하지 않으며, 헤어핀 프로브와 표적핵산의 결합을 통해 상기 헤어핀 프로브의 구조 변형이 발생하게 될 경우, 이후의 dsDNA 산물 생성 반응 시스템이 구동되는 것을 특징으로 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 HIPAmp 기술은 기존 EXPAR 기술이 가지고 있던 제한적 활용 문제를 해결 가능한 신개념 등온 핵산 증폭 기술이라는 측면에서 본 발명의 의의가 있다.
따라서, 일 관점에서 본 발명은 (i) 표적핵산과 특이적으로 결합가능한 염기서열을 가지는 헤어핀 고리; (ii) 상기 헤어핀 고리의 양 말단과 연결되고, 프라이머와 결합가능한 염기서열을 가지고, 서로 상보적으로 결합가능한 양 말단의 헤어핀 줄기; (iii) 상기 (b)의 헤어핀 줄기의 양 말단과 연결되고, 트리거 프로브(TP)와 상보적인 서열을 가지는 cTP; 및 (iv) 상기 헤어핀 프로브 5' 말단의 cTP와 줄기사이에 위치하는 절단효소 인식 염기서열을 포함하는 표적핵산 검출을 위한 헤어핀 프로브에 관한 것이다.
본 발명의 HIPAmp 기술에서는 기존 EXPAR 기술에서 사용되는 선형의 주형을 대신하여 표적핵산 내부의 특정 염기서열과 특이적으로 결합 가능한 헤어핀 프로브가 도입되었다. 상기 헤어핀 프로브는 표적핵산과 특이적으로 결합 가능한 헤어핀 고리, 상기 헤어핀 고리의 양쪽에 연결되면서, 프라이머 쌍의 각각의 프라이머와 결합 가능하며, 서로 상보적으로 결합 가능한 헤어핀 줄기 및 상기 헤어핀 줄기 말단과 연결되고, TP(트리거 프로브)와 결합 가능한 염기서열(complementary TP, 이하 cTP)로 구성되어 있으며, 5' 말단의 cTP와 헤어핀 줄기 사이에 절단효소 인식 염기서열이 첨가되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 표적핵산이 존재할 경우, 상기 헤어핀 프로브의 고리 부분과 표적핵산의 결합 반응에 의해 헤어핀 프로브 줄기 간의 결합이 풀리게 된다. 이러한 헤어핀 프로브의 구조 변형에 의해, 시료 내에 포함되어 있는 프라이머가 상기 구조가 변형된 헤어핀 프로브의 줄기 부분과 결합하게 된다.
이후, DNA 중합효소의 활성에 의해 상기 결합된 프라이머로부터 새로운 DNA의 합성 반응이 진행되고, 첫 번째 반응 중간 산물인 IP 1이 생성된다. 절단효소 및 DNA 중합효소의 연쇄 반응에 의해 상기 생성된 IP 1으로부터 TP가 생성되고, 상기 생성된 TP는 IP 1의 단일가닥 부분과 다시 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. DNA 중합효소의 활성에 의해 상기 IP 1과 결합한 TP로부터 새로운 DNA가 합성되고, 결과적으로, dsDNA 산물이 생성된다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, (a) 표적핵산 함유 시료, 상기 헤어핀 프로브, 상기 헤어핀 프로브의 줄기에 결합가능한 프라이머, DNA 중합효소 및 dNTP를 포함하는 조성물을 반응시켜, dsDNA를 증폭하는 단계; 및 (d) 상기 증폭된 dsDNA를 분석하여 표적핵산을 검출하는 단계를 포함하는 표적핵산의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명의 상기 표적핵산 검출방법은 하기의 과정에 따라 진행된다:
(a) 상기 헤어핀 프로브의 헤어핀 고리와 표적핵산이 결합하고, 상기 헤어핀 프로브의 줄기에 프라이머가 결합하여, 헤어핀 프로브/표적핵산/프라이머 복합체가 형성되는 단계;
(b) DNA 중합효소에 의해 상기 프라이머로부터 새로운 DNA가 합성되면서, 헤어핀 프로브/표적핵산/프라이머 복합체에서 표적핵산이 분리되고, dsDNA인 중간산물 1 (intermediate product 1, IP 1)이 생성되는 단계;
(c) 상기 (b)에서 분리된 표적핵산이 반응에 참여하지 않은 헤어핀 프로브와 결합하고, 상기 (a) - (b) 단계가 반복되면서, dsDNA인 IP 1 생성이 증폭되는 단계; 및
(d) 상기 IP1의 생성을 확인하여, 표적핵산을 검출하는 단계.
본 발명에 있어서, DNA 중합효소는 주형과 결합되어 있는 DNA를 밀어내는(strand displacement) 활성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 검출은 IP1을 dsDNA와 특이적으로 결합하는 형광물질과 결합시켜 형광신호를 확인하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 dsDNA 산물 생성 반응 과정에서 두 번째 반응 중간 산물인 IP 2가 생성되고, 상기 IP 2는 반응에 참여하지 않은 헤어핀 프로브와 결합하여 IP 1을 생성한다.
본 HIPAmp 기술에서 사용되는 DNA 중합효소는 DNA 합성 반응 과정에서 주형과 결합되어있는 DNA를 밀어내는 활성 (strand displacement activity)을 가지고 있다. 따라서, 상기 DNA 중합효소의 활성을 기반으로 표적핵산 및 반응 중간 산물 (IP 1 & IP 2)을 재활용하는 반응 시스템의 구현이 가능해지고, 결과적으로, dsDNA 산물 생성 반응의 효율이 증대되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 표적 핵산의 검출방법은 하기 단계를 거처 진행될 수도 있다:
(a) 상기 헤어핀 프로브의 헤어핀 고리와 표적핵산이 결합하고, 상기 헤어핀 프로브의 줄기에 프라이머가 결합하여, 헤어핀 프로브/표적핵산/프라이머 복합체가 형성되는 단계;
(b) DNA 중합효소에 의해 상기 프라이머로부터 새로운 DNA가 합성되면서, 헤어핀 프로브/표적핵산/프라이머 복합체에서 표적핵산이 분리되고, dsDNA인 중간산물 1 (intermediate product 1, IP 1)이 생성되는 단계;
(c) 상기 (b)에서 분리된 표적핵산이 반응에 참여하지 않은 헤어핀 프로브와 결합하고, 상기 (a) - (b) 단계가 반복되면서, IP 1 생성이 증폭되는 단계;
(d) 절단효소에 의하여, 상기 IP로부터 트리거 프로브(TP)가 지속적으로 생성되는 단계;
(e) 상기 생성된 TP가 IP 1의 단일가닥 부분과 결합하여, DNA 중합효소에 의해, TP로부터 DNA 합성 반응이 진행되고, dsDNA 산물이 생성됨과 동시에 dsDNA 산물 중 새롭게 생성된 DNA 가닥인 IP2(중간산물 2)가 IP1으로부터 분리되는 단계;
(f) 절단효소 및 DNA 중합효소에 의해 상기 (e)에서 생성된 dsDNA 산물로부터 TP가 지속적으로 생성되는 단계;
(g) 상기 (e)에서 생성된 IP 2가 반응에 참여하지 않은 헤어핀 프로브와 결합하고, 상기 (e) - (f)의 반응이 반복적으로 진행됨으로써, dsDNA 산물 생성이 증폭되는 단계; 및
(h) 상기 dsDNA를 확인하여, 표적핵산을 검출하는 단계.
본 발명에 있어서, DNA 중합효소는 주형과 결합되어 있는 DNA를 밀어내는(strand displacement) 활성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 검출은 dsDNA와 특이적으로 결합하는 형광물질과 결합시켜 형광신호를 확인하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 상기 반응에서 생성된 TP가 반응에 참여하지 않은 헤어핀 프로브와 직접적으로 결합할 수 있으며, DNA 중합효소에 의해 상기 헤어핀 프로브와 결합된 TP로부터 DNA 합성 반응이 진행될 경우 dsDNA 산물이 생성되는 것을 특징으로 할 수 있다.
따라서, 본 발명의 검출방법은 하기의 방법으로 진행될 수 있다:
(a) 상기 헤어핀 프로브의 헤어핀 고리와 표적핵산이 결합하고, 상기 헤어핀 프로브의 줄기에 프라이머가 결합하여, 헤어핀 프로브/표적핵산/프라이머 복합체가 형성되는 단계;
(b) DNA 중합효소에 의해 상기 프라이머로부터 새로운 DNA가 합성되면서, 헤어핀 프로브/표적핵산/프라이머 복합체에서 표적핵산이 분리되고, dsDNA인 중간산물 1 (intermediate product 1, IP 1)이 생성되는 단계;
(c) 상기 (b)에서 분리된 표적핵산이 반응에 참여하지 않은 헤어핀 프로브와 결합하고, 상기 (a) - (b) 단계가 반복되면서, IP 1 생성이 증폭되는 단계;
(d) 절단효소에 의하여, 상기 IP로부터 트리거 프로브(TP)가 지속적으로 생성되는 단계;
(e) 상기 생성된 TP가 반응에 참여하지 않은 헤어핀 프로브와 결합하고, DNA 중합효소에 의해 상기 TP로부터 DNA가 합성되어 dsDNA 산물이 생성되는 단계;
(f) 절단효소 및 DNA 중합효소에 의해 상기 (e)의 dsDNA 산물로부터 TP가 지속적으로 생성되는 단계;
(g) 상기 (f)에서 생성된 TP가 반응에 참여하지 않은 헤어핀 프로브와 결합하고, 상기 (e) - (g)의 반응이 반복적으로 진행됨으로써, dsDNA 산물 생성이 증폭되는 단계; 및
(h) 상기 dsDNA를 확인하여, 표적핵산을 검출하는 단계.
본 발명에 있어서, DNA 중합효소는 주형과 결합되어 있는 DNA를 밀어내는(strand displacement) 활성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 검출은 IP1을 dsDNA와 특이적으로 결합하는 형광물질과 결합시켜 형광신호를 확인하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 표적핵산 함유 시료, 상기 헤어핀 프로브, 상기 헤어핀 프로브의 줄기에 결합가능한 프라이머, DNA 중합효소 및 dNTP를 포함하는 표적핵산 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, DNA 중합효소는 주형과 결합된 DNA를 밀어내는 활성 (strand displacement activity)을 가지는 DNA 중합효소라면 제한없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 클레나우 단편 등을 사용할 수 있다.
본 발명에서 DNA 절단효소는 제한효소(nicking endonuclease)를 사용할 수 있으며, DNA 염기서열의 특정 인식부위를 인식하여 절단하는 효소라면 제한없이 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 헤어핀 프로브 기반 등온 핵산 증폭 기술을 이용한 표적핵산 검출 기술 반응 조건 확립
본 발명의 HIPAmp 반응 용액 제조 과정은 다음과 같으며, 이에 한정되지는 않는다. 본 실시예에서 사용한 반응 용액 (최종 50μL)은 dNTPs (2.5 mM each) 2μL, 헤어핀 프로브 (5μM) 1μL, 프라이머 (500nM) 1μL, SYBR Green I (50X) 1μL, 및 표적핵산 1μL를 반응 완충 용액에 첨가하여 제작하였으며, 상기 반응 완충 용액은 10mM Tris-HCl (pH 7.9), 50 mM NaCl, 10mM MgCl2, 0.1mM DTT, 11.4%, 및 90μg/mL BSA를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이와 같이 제작된 반응 용액을 37℃에서 20분 동안 예열한 후, 상기 반응 용액에 klenow fragment (3'→5' exo-) (2 unit/μL) 1μL 및 Nt.AlwI (6 unit/μL) 0.5μL를 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 반응을 진행시킨다. 상기 반응이 진행되는 동안 dsDNA 산물과 결합한 SYBR Green I으로부터 발생하는 형광 신호를 30초 간격으로 측정하여 dsDNA 산물의 생성량을 실시간으로 분석하였다.
본 실시예에서, 사용한 DNA의 염기서열 정보는 다음과 같으며, 이에 한정되지는 않는다.
헤어핀 프로브: 5'-CTG TTC TGC CCC TTC TTT TGA T CC GGT TGA GCT GCT GAG AGT CCA AGA GTG CTC AAC CGG CTG TTC TGC CCC TTC-3'(서열번호 1)
상기 헤어핀 프로브 염기서열에 있어서, 밑줄, 기울임, 볼드체로 표시된 염기서열은 각각 cCP, 절단효소 인식부위, 줄기의 염기서열을 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다.
프라이머: 5'-CCG GTT GAG C-3'(서열번호 2)
표적핵산: 5'-GGT CTT ACA CAA GAG GAC TCT TGG ACT CTC AGC AAT GTC AAC GAC C-3'(서열번호 3)
실시예 2. 헤어핀 프로브 기반 등온 핵산 증폭 기술을 이용한 신개념 표적핵산 검출 기술 반응 시스템 검증
실시예 1에서 언급된 반응 조건을 이용하여 HIPAmp 기술의 반응 시스템 검증 실험을 진행하였다.
하기 5가지 반응조건으로 실험을 수행하였다.
1: 헤어핀 프로브 및 프라이머가 첨가되지 않은 반응 조건;
2: 헤어핀 프로브가 첨가되지 않은 반응 조건;
3: 프라이머가 첨가되지 않은 반응 조건;
4: 헤어핀 프로브 및 프라이머가 모두 첨가된 반응 조건; 및
5: 표적핵산이 첨가되지 않은 반응 조건
헤어핀 프로브 및 프라이머의 첨가 여부에 따른 형광 신호 발생 여부를 확인해본 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 헤어핀 프로브와 프라이머가 모두 첨가된 시료에서만 높은 형광 신호가 발생함을 확인하였다.
또한, 표적핵산이 존재하지 않는 경우에는 헤어핀 프로브와 프라이머가 모두 첨가되었음에도 불구하고 형광 신호가 발생하지 않는 것을 확인하였다. 전기영동을 이용한 반응 시스템 검증 실험에서도 상기 형광 신호를 기반으로 한 반응 시스템 검증 실험 결과와 동일한 경향성이 나타나는 것을 확인하였다.
실시예 3. 헤어핀 프로브 기반 등온 핵산 증폭 기술을 이용한 신개념 표적핵산 검출 기술 민감도 검증
실시예 1에서 사용한 반응 조건을 이용하여 HIPAmp 기술의 민감도 검증 실험을 진행하였다. 다양한 농도 (20 fM~2nM)의 표적핵산을 포함하는 분석 시료를 제조한 후 HIPAmp 반응을 수행한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 본 기술의 표적핵산 검출 한계 (limit of detection, LOD)는 0.33 fM인 것을 확인하였다.
실시예 4. 헤어핀 프로브 기반 등온 핵산 증폭 기술을 이용한 표적핵산 검출 기술 선택도 검증
실시예 1에서 사용한 반응 조건을 이용하여 HIPAmp 기술의 선택도 검증 실험을 진행하였다. 본 선택도 검증 실험에서는 여러 종류의 표적핵산이 포함된 시료로부터 측정된 degree of tTHR decrease 값을 비교한 것을 특징으로 할 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.
Mismatch가 존재하는 표적핵산을 포함하는 분석 시료를 제조한 후 HIPAmp 반응을 수행한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, degree of tTHR decrease 값이 현저히 감소하는 것을 확인하였으며, 본 실험 결과를 통해, 본 발명에서 제안하는 HIPAmp 기술은 표적핵산 내에 포함된 single base mismatch까지도 검출 가능함을 확인하였다.
상기 degree of tTHR decrease는 다음의 관계식을 통해 정의되는 것을 특징으로 할 수 있다.
Degree of tTHR decrease = (tTHR.NC - tTHR.T)/(tTHR.NC - tTHR.PM)
상기 관계식에 사용된 각각의 변수는 다음과 같이 정의된다. tTHR.NC: 비상보적 (non-complementary) 표적핵산을 포함하는 시료의 tTHR 측정값; tTHR.PM: 상보적 (perfectly-matched) 표적핵산을 포함하는 시료의 tTHR 측정값; 및 tTHR.T: 서로 다른 종류의 표적핵산 (non-complementary, mismatched, 및 perfectly-matched)를 포함하는 시료의 tTHR 측정값.
실시예 5. 헤어핀 프로브 기반 등온 핵산 증폭 기술을 이용한 표적핵산 검출 기술 실용성 검증
HIPAmp 기술의 실용성을 검증하기 위해 서로 다른 길이의 표적핵산이 포함된 시료로부터 측정되는 tTHR 값을 비교하였다. 서로 다른 길이 (46, 208, 및 895 bp)의 표적핵산 (2nM)이 포함된 시료를 제작한 후 HIPAmp 반응을 수행한 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 각 시료의 tTHR 측정값이 거의 일치하는 것을 확인하였다. 본 실험 결과를 통해, 본 발명에서 제안하는 HIPAmp 기술이 기존 EXPAR 기술의 표적핵산 길이 제한의 문제점을 해결할 수 있음을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology BioNano Health Guard Research Center <120> Method for Detecting Target Nucleic Acid Using Isothermal Nucleic Acid Amplication Basd on Hairpin Probe <130> P18-B016 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hairpin probe <400> 1 ctgttctgcc ccttcttttg atccggttga gctgctgaga gtccaagagt gctcaaccgg 60 ctgttctgcc ccttc 75 <210> 2 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ccggttgagc 10 <210> 3 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target nucleic acid <400> 3 ggtcttacac aagaggactc ttggactctc agcaatgtca acgacc 46

Claims (5)

  1. 다음 구성요소를 포함하는 표적핵산 검출을 위한 헤어핀 프로브;
    (i) 표적핵산과 특이적으로 결합가능한 염기서열을 가지는 헤어핀 고리;
    (ii) 상기 헤어핀 고리의 양 말단과 연결되고 프라이머와 결합가능한 염기서열을 가지며 서로 상보적으로 결합가능한 양 말단의 헤어핀 줄기;
    (iii) 상기 (ii)의 헤어핀 줄기의 양 말단과 연결되고 트리거 프로브(TP)와 상보적인 서열을 가지는 cTP; 및
    (iv) 상기 헤어핀 프로브 5' 말단의 cTP와 줄기사이에 위치하는 절단효소 인식 염기서열.
  2. 다음 단계를 포함하는 표적핵산의 검출방법:
    (a) 표적핵산 함유 시료, 제1항의 헤어핀 프로브, 상기 헤어핀 프로브의 줄기에 결합가능한 프라이머, DNA 중합효소 및 dNTP를 포함하는 조성물을 반응시켜, dsDNA를 증폭하는 단계; 및
    (b) 상기 증폭된 dsDNA를 분석하여 표적핵산을 검출하는 단계.
  3. 제2항에 있어서, DNA 중합효소는 주형과 결합되어 있는 DNA를 밀어내는(strand displacement) 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 검출은 dsDNA와 특이적으로 결합하는 형광물질과 결합시켜 형광신호를 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 표적핵산 함유 시료, 제1항의 헤어핀 프로브, 상기 헤어핀 프로브의 줄기에 결합가능한 프라이머, DNA 중합효소 및 dNTP를 포함하는 표적핵산 검출용 조성물.


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