JP3665707B2 - Dnaセンサおよびdnaの検出方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、電極型DNAセンサおよび該電極型DNAセンサを用いて試料DNAから特定の塩基配列を有するDNAの存在の有無を検出する方法に関する。
【従来の技術】
生物学、医学分野での遺伝子解析においては、特定の塩基配列を有するDNAを検出する方法として、ハイブリダイゼーション法が用いられている。
【0002】
この中でも特に、目的とする遺伝子を特異的に検出する方法として、サザンハイブリダイゼーション法(サザンブロッティング法)が一般的に用いられている。サザンハイブリダイゼーション法では、まず試料DNAを一種類以上の制限酵素でフラグメントとし、アガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけてその分子量サイズによって分画ごとに分離する。次に、分離した試料DNAを一本鎖DNAに変性した後、ナイロン・フィルターもしくはニトロセルロース・ペーパー等に固定化する。そして、その変性された一本鎖DNAと、放射性同位元素(以下、RIという)でラベルされた塩基対を形成する相補的な一本鎖DNA(以下、プローブDNAという)とをハイブリダイズさせた後、フィルターを洗浄する。洗浄後、該フィルター等をオートラジオグラフにかけ、現像することによってプローブDNAとハイブリダイズする特定の配列を有するDNAを検出することができる。
【0003】
しかし、上記のサザンハイブリダイゼーション法を含めた従来法は、何れも標識としてRIを用いるため、放射性物質取り扱い施設とその維持管理に多大な費用と労力を要するばかりでなく、取り扱い者の健康の点で問題がある。また、オートラジオグラフによって、バンドとして検出するためには、24時間以上の長時間を必要とし、試料DNAの量が少ない場合には、さらに時間を要し、バンドが不明確となる等の問題点を有する。
【0004】
一方、サザンハイブリダイゼーション法において、RIの代わりに蛍光を用いる方法も知られている。この方法は、安全性と迅速さにおいてRIより優れている。また、蛍光法による、スライドガラスやシリコン等の基板に多数のDNA分子を整列させたDNAチップ技術も既に実用化されている。
しかし、励起光による褪色が起こること、測定には専用の蛍光測定装置が必要であること、蛍光の内部消光のために一定量以上の蛍光物質を導入することは困難であること等の欠点を有する。
【0005】
また、発光にてDNAを検出する方法も実用されているが、蛍光法と同様に測定に専用の発光測定装置が必要とされる。
【0006】
上記の問題点を解決する方法として、プローブDNAを電極型センサに適用する方法が開示されている(特開平9−288080号公報および第57回分析化学討論会予稿集、p137〜138(1996年))。即ち、出力端子を備えた電極であって、プローブDNAが固定された電極と試料DNA(断片化が不要)とを、インターカレータ存在下に反応させ、反応後の電極の電流を測定することにより、プローブDNAと試料DNAとで形成されるハイブリッドDNAの存在を検出あるいはハイブリッドDNAの量を測定する方法である。インターカレータとしては、特に、酸化還元活性を持ったフェロセン化合物が用いられ、これは、ハイブリッドDNAに特異的に結合することが知られている。
【0007】
上記のインターカレータ型DNAセンサでは、リアルタイムでハイブリッドDNAの検出が簡便に高感度で行える。分画処理も不要で、蛍光色素の褪色という問題もない。本方法の装置は、プローブDNAが固定されてなる電極が一個のみである。即ち、そのプローブDNAが固定されてなる電極に、一本鎖に解離させた試料DNAを添加し反応させ、相補性を判断するものである。
しかし、遺伝子発現のモニタリング、DNA塩基配列の決定、遺伝子変異解析、遺伝子多型解析等を効率的に行うためには、上記の電極型センサでは、実用化レベルを十分満足するとは言い難い。そこで、上記の電極型センサ法をDNAチップ技術に近づけることが一つの解決策である。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、インターカレータ型DNAセンサであって、同時に複数個の特定の塩基配列を有するプローブDNAと相補性を有する試料DNAを検出することが可能なDNAセンサ、およびその相補性DNAの存在の有無の検出方法を提供することにある。
【0009】
【課題を解決するための手段】
本発明者の研究により、各々外部に出力する端子を備えた二以上の電極表面の各々に互いに異なる塩基配列部位を有し、導電性物質で修飾されていないプローブDNAが固定されてなることを特徴とする、電気化学的活性縫い込み型インターカレータと組合せて用いて該プローブDNAに相補性を有する一本鎖のDNAの存在の有無を電気化学的に検出するDNAの検出方法に用いるためのDNAセンサが上記の問題を解決できることが判明した。
【0010】
また、各々外部に出力する端子を備えた二以上の電極表面の各々に互いに異なる塩基配列部位を有し、導電性物質で修飾されていないプローブDNAが固定されてなるDNAセンサおよび電気化学的活性縫い込み型インターカレータからなるDNA検出キットも上記の課題を解決できることが分かった。
【0011】
さらに、各々外部に出力する端子を備えた二以上の電極表面の各々に互いに異なる塩基配列部位を有し、導電性物質で修飾されていないプローブDNAが固定されてなるDNAセンサ上にて、該プローブDNAと一本鎖に解離させた試料DNAとを電気化学活性縫い込み型インターカレータの存在下に結合させ、該プローブDNAと該試料DNAとによって形成されたハイブリッドDNAに縫い込まれた該インターカレータに流れる電流を測定することによって、あるいは該プローブDNAと該試料DNAとでハイブリッドさせたDNAに該インターカレータを結合させ、ハイブリッドDNAに縫い込まれた該インターカレータに流れる電流を測定することによって、試料DNAを検出するDNA中のプローブDNAに相補性を有するDNAの存在の有無の検出方法によっても上記の課題を解決できることが分かった。
【0012】
DNAの検出方法の好ましい態様は、以下の通りである。
(1)プローブDNAの塩基配列が既知であって、そのプローブDNAを使用することを特徴とするDNAの検出方法。
(2)電気化学活性縫い込み型インターカレータが、酸化還元活性を有する物質であることを特徴とするDNAの検出方法。
(3)電気化学活性縫い込み型インターカレータが、フェロセン修飾電気化学活性縫い込み型インターカレータであることを特徴とするDNAの検出方法。
【0013】
【発明の実施の形態】
図1は、各々外部に出力する端子を備えた二以上の電極表面の各々に互いに異なる塩基配列部位を有し、導電性物質で修飾されていないプローブDNAが固定されてなるDNAセンサである。
図1に示すように、本発明のDNAセンサは、外部に出力する端子(3)を備えた一つの電極(1)表面の各々に、一本鎖のプローブDNA(2)が固定されており、このような電極(1)が一定面積上に二つ以上並んでなることを特徴とする。各々の電極(1)表面に固定されている一本鎖のプローブDNA(2)は、互いに異なる塩基配列部位を有している。
【0014】
電極としては、DNAを固定できるものが好ましい。金、グラシーカーボンもしくは炭素を用いることがさらに好ましい。電極の面積は、一定であることが好ましい。電極の数は、二以上の複数であれば特に制限されない。
【0015】
プローブDNAとしては、生物試料から抽出したDNAを制限酵素で切断し、電気泳動による分離等で精製したDNAあるいは化学合成で得られた一本鎖のDNAを用いることができる。生物試料から抽出したDNAの場合には、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖のDNAに解離させておくことが好ましい。これらの一本鎖のDNAの配列は、周知のDNA配列決定法により、予め決定しておくことが好ましい。
【0016】
上記の一本鎖のDNAは、電極に固定する。固定化方法としては、公知の方法が用いられる。電極が金である場合、該DNAの5’−もしくは3’−末端(好ましくは、5’−末端)にチオール基を導入し、金とイオウとの配位結合を介して、該DNAが電極に固定される。該DNAにチオール基を導入する方法は、文献(M.Maeda et al.,Chem.Lett.,1805〜1808(1994)およびB.A.Connolly,Nucleic AcidsRes.,13,4484(1985))に記載されている。即ち、上記の方法によって得られたチオール基を有する該DNAを金電極に滴下し、低温下で数時間放置することによって該DNAが電極に固定され、プローブDNAが作製される。
電極がグラシーカーボンである場合、グラシーカーボンを過マンガン酸カリウムで酸化することによって、電極表面にカルボン酸基を導入する。次いで、該DNAはアミド結合により電極表面に固定される。実際の固定化方法については、文献(K.M.Millan et al.,Analytical Chemistry,65,2317〜2323(1993))に詳細が記載されている。
【0017】
本発明は、図2に示すように、二以上のアレイから構成されるDNAセンサおよび電気化学活性縫い込み型インターカレータ(4)からなるDNA検出キットと考えることもできる。よって、該DNA検出キットに、遺伝病等の検体として、試料DNA(5)を添加することにより検体の遺伝子を迅速に定性もしくは定量することが可能となる。
【0018】
本発明のDNAの検出方法では、一本鎖に解離させた試料DNA(5)と各々のプローブDNA(2)とのハイブリダイゼーションを、アレイの数だけ、同時に行うことができる。ハイブリダイゼーションは、電気活性縫い込み型インターカレータ(4)の存在下に行うことが好ましい。
【0019】
あるいは、本発明のDNAの検出方法では、一本鎖に解離させた試料DNA(5)と各々のプローブDNA(2)とで予めハイブリッドさせておいたDNAに、電気化学活性縫い込み型インターカレータ(4)を結合させることも好ましく行われる。
【0020】
電気化学活性縫い込み型インターカレータ(4)は、数nM〜数mMの濃度範囲で用いられることが好ましい。該インターカレータ(4)は、該プローブDNA(2)と該試料DNA(5)とのハイブリダイゼーションの速度を促進すると共に、形成されたハイブリッドDNAに高い特異性で結合し、該ハイブリッドDNAを安定化する。ハイブリッドDNAが形成されない場合には、該インターカレータ(4)は、一本鎖のままの遊離のDNA(7)に結合しないかあるいは一旦結合してもすぐに解離して、遊離のインターカレータ(6)となる。
【0021】
電気化学活性縫い込み型インターカレータは、酸化還元活性を有する物質であり、かつハイブリッドDNAの二本鎖に縫い込まれる構造を有する物質であることが好ましい。
酸化還元活性部として好ましくは、フェロセン化合物、カテコールアミン化合物、金属ビピリジン錯体、金属フェナンスリン錯体もしくはビオローゲン化合物である。さらに好ましくは、フェロセン化合物である。
縫い込み型インターカレータ部分として好ましくは、ナフタレンジイミド、アントラセン、アントラキノン等である。
よって、好ましく用いられる該インターカレータは、フェロセンカルボン酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステルと対応するアミン体との反応により合成される下記式で表されるフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体(S.Takenaka et al.,J.Chem.Soc.,Commun.,1111(1998))である。
【0022】
【化1】
【0023】
また、下記式で表されるフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体も好ましく用いられる。
【0024】
【化2】
【0025】
但し、Aは下記式で表されるフェロセン誘導体である。
【0026】
【化3】
【0027】
【化4】
【0028】
【化5】
【0029】
【化6】
【0030】
電気活性縫い込み型インターカレータには、酸化還元活性部分と縫い込み型インターカレータ部分とを繋ぐリンカー部分がある。上記式で表される1,4−ジプロピルピペラジン基がリンカー部分に相当する。このピペラジン基の代わりに、二価の四級アミン基を導入することもできる。四級アミン基を導入した下記式で表される化合物は、反応溶液中のpHに依らずカチオン性となるために、ハイブリッドDNAとの結合がより強くなる。
【0031】
【化7】
【0032】
電気活性縫い込み型インターカレータとして上記のナフタレンジイミド誘導体を用いた場合、ナフタレンジイミド誘導体は、二塩基おきに配列してハイブリッドDNAに飽和している。このことは、ナフタレンジイミド誘導体の二つのフェロセン部分が、それぞれ、ハイブリッドDNAの主溝と副溝とに密に並んだ状態を意味している。このため、ナフタレンジイミド誘導体は、ハイブリッドDNAからの解離速度が極めて遅くなる。ここで、ナフタレンジイミド誘導体のハイブリッドDNAへの結合がインターカレーションモードであることは、アレイにインターカレータおよび試料DNAを添加したときに、粘度の変化が認められたことにより決定した。閉環状プラスミド(例えば、ウイルスSV40)の場合、インターカレーションが起こると超らせんの変化に伴って粘度も変化することが知られている。
【0033】
試料DNAは、嚢胞性線維症等の遺伝病の患者より抽出したDNAを、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖のDNAに解離させて使用することが好ましい。必要であれば、制限酵素で切断し、電気泳動による分離等で精製してもよい。制限酵素で切断を受けた試料DNAは、複数個のDNA断片となるが、プローブDNAとの接触に使用されるDNA断片は、一つであっても複数個であってもよい。試料DNAは、数10-18 〜数10-10 モルの範囲で用いられることが好ましく、数10-15 〜数10-12 モルの範囲で用いられることが特に好ましい。
【0034】
ハイブリダイゼーション終了後、電極を洗浄し、遊離のインターカレータを除去しておくことが好ましい。
【0035】
プローブDNAと試料DNAとの反応の結果は、電極に流れる電気量を測定することにより判断する。電気量の測定には、電位をかけて流れる電流を測定できる方法であれば何れの方法も用いることができる。サイクリックボルタンメトリー、デファレンシャルパルスボルタンメトリー、ポテンショスタット等が好ましく用いられる。
【0036】
【実施例】
[実施例1]プローブDNAが固定されてなる電極の作成
二つのアレイよりなるDNAセンサを作成した。面積が2.25mm2 の各々の電極に固定されるDNAとしては、それぞれ下記式で表される、正常遺伝子の18量体(N)および嚢胞性線維症の患者の遺伝子の18量体(A)を用いた。
ここで用いた嚢胞性線維症の原因遺伝子は、塩素イオン・チャンネルであり、嚢胞性線維症の患者では、508番目のフェニルアラニンの欠損という嚢胞性線維症膜貫通型調節蛋白の突然変異が認められている遺伝子である。
各18量体のチオール化および金電極表面への固定化は、文献(B.A.Connolly,Nucleic Acids Res.,13,4484(1985)、特開平9−288080号公報)に従って行い、それぞれ、プローブDNA(pN)、プローブDNA(pA)を得た。
【0037】
正常遺伝子の18量体(N):
5’−GAA−ACA−CCA−ATG−ATG−ATA−3’
【0038】
嚢胞性線維症の患者の遺伝子の18量体(A):
5’−GAA−ACA−CCA−ATG−ATA−TTT−3’
【0039】
[実施例2]ハイブリッドDNAの検出
(1)下記式のフェロセン修飾縫い込み型インターカレータは、特開平9−288080号公報に従って合成した。
【0040】
【化8】
【0041】
(2)実施例1で得られたプローブDNA(pN)およびプローブDNA(pA)のそれぞれの電極を、0.5mMのフェロセン修飾縫い込み型インターカレータおよび29ピコモルの一本鎖の異常遺伝子(sA)を含む30%DMSO(ジメチルスルホキシド)−41mM酢酸カリウム/酢酸緩衝液(pH5.2)の混合液に浸し、40℃にて10分間インキュベートさせた。但し、一本鎖の異常遺伝子(sA)は、実施例1と同じ遺伝子を用いた。
【0042】
(3)反応終了後、上記の各々の電極表面を5秒間、30%DMSO−41mM酢酸カリウム/酢酸緩衝液(pH5.2)の混合液で洗浄し、遊離のインターカレータおよび一本鎖の異常遺伝子(sA)を除去した。
【0043】
(4)(3)により洗浄処理した各々の電極のサイクリックボルタモグラムを測定した。測定は、30%DMSO−41mM酢酸カリウム/酢酸緩衝液(pH5.2)の混合液中で、スキャン速度100mV/秒の条件で行った。その結果、プローブDNA(pA)に一本鎖の異常遺伝子(sA)が結合した電極のインターカレータに由来する619mVの増加電流は、0.15μAであることが認められた。また、プローブDNA(pN)の電極では、増加電流は認められなかった。従って、プローブDNA(pA)と該異常遺伝子(sA)とがハイブリッドDNAを形成したことが分かった。
【0044】
実施例2より、試料として用いた異常遺伝子(sA)の配列は、下記式で表される配列の一部を含んでいることが分かった。
【0045】
3’−CTT−TGT−GGT−TAC−TAT−AAA−5’
【0046】
また、塩基配列の異なったプローブDNAを固定させたアレイの数をさらに増やすことによって、構造が未知である遺伝病等の遺伝子の、プローブDNAに対する相補性を、数多くの場合について一度に決定することが可能になる。
【0047】
【発明の効果】
本発明の二以上の電極表面にDNAが固定されてなるDNAセンサにより、効率的に遺伝子発現のモニタリング、DNA塩基配列の決定等を行うことが可能になる。本発明のDNAセンサを用いるDNAの検出方法は、生物学、医学分野での遺伝子解析において、特定の配列を有するDNAを検出する手段としては、実用化レベルを満足すると言える。
【図面の簡単な説明】
【図1】二以上の電極表面に互いに異なる塩基配列部位を有するプローブDNAが固定されてなるDNAセンサの模式図である。
【図2】形成されたハイブリッドDNAに電気化学活性縫い込み型インターカレータが結合した模式図、あるいはハイブリッドDNAが形成されなかった場合に試料DNAおよび該インターカレータが遊離している模式図である。
【符号の説明】
1 電極
2 プローブDNA
3 出力する端子
4 電気活性縫い込み型インターカレータ
5 試料DNA
6 遊離のインターカレータ
7 遊離の試料DNA
Claims (6)
- 各々外部に出力する端子を備えた二以上の電極表面の各々に互いに異なる塩基配列部位を有し、導電性物質で修飾されていないプローブDNAが固定されてなることを特徴とする、電気化学的活性縫い込み型インターカレータと組合せて用いて該プローブDNAに相補性を有する一本鎖のDNAの存在の有無を電気化学的に検出するDNAの検出方法に用いるためのDNAセンサ。
- 各々外部に出力する端子を備えた二以上の電極表面の各々に互いに異なる塩基配列部位を有し、導電性物質で修飾されていないプローブDNAが固定されてなるDNAセンサおよび電気化学活性縫い込み型インターカレータからなるDNA検出キット。
- 各々外部に出力する端子を備えた二以上の電極表面の各々に互いに異なる塩基配列部位を有し、導電性物質で修飾されていないプローブDNAが固定されてなるDNAセンサ上にて、該プローブDNAと一本鎖に解離させた試料DNAとを電気化学活性縫い込み型インターカレータの存在下に結合させ、該プローブDNAと該試料DNAとによって形成されたハイブリッドDNAに縫い込まれた該インターカレータに流れる電流を測定することによって、あるいは該プローブDNAと該試料DNAとでハイブリッドさせたDNAに該インターカレータを結合させ、ハイブリッドDNAに縫い込まれた該インターカレータに流れる電流を測定することによって、試料DNA中のプローブDNAに相補性を有するDNAの存在の有無を検出するDNAの検出方法。
- プローブDNAの塩基配列が既知であって、そのプローブDNAを使用することを特徴とする請求項3に記載のDNAの検出方法。
- 電気化学活性縫い込み型インターカレータが、酸化還元活性を有する物質であることを特徴とする請求項4に記載のDNAの検出方法。
- 電気化学活性縫い込み型インターカレータが、フェロセン修飾電気化学活性縫い込み型インターカレータであることを特徴とする請求項4に記載のDNAの検出方法。
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