JP2000146894A

JP2000146894A - Ｄｎａの増感型検出方法

Info

Publication number: JP2000146894A
Application number: JP10328872A
Authority: JP
Inventors: Shigeori Takenaka; 繁織竹中; Makoto Takagi; 誠高木
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1998-11-04
Filing date: 1998-11-04
Publication date: 2000-05-26

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、プローブＤＮＡと試料ＤＮＡと
を、インターカレータ存在下に接触させ、電極の電流を
測定することによって、特定の配列を有するＤＮＡを検
出する方法を応用し、より検出感度の高い方法を提供す
ることにある。【解決手段】電極に固定されてなるプローブＤＮＡと
一本鎖に解離させた試料ＤＮＡとを、基質、その基質と
の反応によって還元型に変化する酸化酵素、および電気
活性縫い込み型インターカレータの存在下に接触させ、
該プローブＤＮＡと該試料ＤＮＡとによって形成された
ハイブリッドＤＮＡに結合した該インターカレータに流
れる電流を、還元型に変化した酸化酵素と電極との間の
電子移動によって増幅させ、その電流を測定することに
よって特定の塩基配列を有するＤＮＡを検出することか
らなるＤＮＡの増感型検出方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試料ＤＮＡから特
定の配列を有するＤＮＡを検出する方法に関するもの
で、ハイブリダイゼーション法を利用した発明である。

【０００２】

【従来の技術】生物学、医学分野での遺伝子解析におい
ては、特定の配列を有するＤＮＡを検出する方法とし
て、ハイブリダイゼーション法が用いられている。

【０００３】この中でも特に、目的とする遺伝子を特異
的に検出する方法として、サザンハイブリダイゼーショ
ン法（サザンブロッティング法）が一般的に用いられて
いる。サザンハイブリダイゼーション法では、まず試料
ＤＮＡを一種類以上の制限酵素でフラグメントとし、ア
ガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミドゲル
電気泳動にかけてその分子量サイズによって分画ごとに
分離する。次に、分離した試料ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに
変性した後、ナイロン・フィルターもしくはニトロセル
ロース・ペーパー等に固定化する。そして、その変性さ
れた一本鎖ＤＮＡと、放射性同位元素（以下、ＲＩとい
う）でラベルされた塩基対を形成する相補的な一本鎖Ｄ
ＮＡ（以下、プローブＤＮＡという）とをハイブリダイ
ズさせた後、フィルターを洗浄する。洗浄後、該フィル
ター等をオートラジオグラフにかけ、現像することによ
ってプローブＤＮＡとハイブリダイズする特定の配列を
有するＤＮＡを検出することができる。

【０００４】しかし、上記のサザンハイブリダイゼーシ
ョン法を含めた従来法は、何れも標識としてＲＩを用い
るため、放射性物質取り扱い施設とその維持管理に多大
な費用と労力を要するばかりでなく、取り扱い者の健康
の点で問題がある。また、オートラジオグラフによっ
て、バンドとして検出するためには、２４時間以上の長
時間を必要とし、試料ＤＮＡの量が少ない場合には、さ
らに時間を要し、バンドが不明確となる等の問題点を有
する。

【０００５】一方、サザンハイブリダイゼーション法に
おいて、ＲＩの代わりに蛍光を用いる方法も知られてい
る。この方法は、安全性と迅速さにおいてＲＩより優れ
ている。また、蛍光法による、スライドガラスやシリコ
ン等の基板に多数のＤＮＡ分子を整列させたＤＮＡチッ
プ技術も既に実用化されている。しかし、励起光による
褪色が起こること、測定には専用の蛍光測定装置が必要
であること、蛍光の内部消光のために一定量以上の蛍光
物質を導入することは困難であること等の欠点を有す
る。

【０００６】また、発光にてＤＮＡを検出する方法も実
用されているが、蛍光法と同様に測定に専用の発光測定
装置が必要とされる。

【０００７】上記の問題点を解決する方法として、プロ
ーブＤＮＡを電極型センサに適用する方法が開示されて
いる（特開平９−２８８０８０号公報および第５７回分
析化学討論会予稿旨集、ｐ１３７〜１３８（１９９６
年））。即ち、出力端子を備えた電極であって、プロー
ブＤＮＡが固定されてなる電極と試料ＤＮＡ（断片化が
不要）とを、インターカレータの存在下に反応させ、反
応後の電極の電流を測定することにより、プローブＤＮ
Ａと試料ＤＮＡとで形成されるハイブリッドＤＮＡの存
在を検出あるいはハイブリッドＤＮＡの量を測定する方
法（以下、ＤＮＡセンサ法という）である。インターカ
レータとしては、特に、酸化還元活性を持ったフェロセ
ン化合物が用いられ、これは、ハイブリッドＤＮＡに特
異的に結合することが知られている。

【０００８】上記のＤＮＡセンサ法では、リアルタイム
でハイブリッドＤＮＡの検出が簡便に高感度で行える。
分画処理も不要で、蛍光色素の褪色という問題もない。
本方法の装置は、プローブＤＮＡが固定されてなる電極
が一個のみである。即ち、そのプローブＤＮＡが固定さ
れてなる電極に、一本鎖に解離させた試料ＤＮＡを添加
し、プローブＤＮＡと反応させ、相補性を判断するもの
である。

【０００９】しかし、遺伝子発現のモニタリング、ＤＮ
Ａ塩基配列の決定、遺伝子変異解析、遺伝子多型解析等
を効率的に行うためには、上記のＤＮＡセンサ法では、
実用化レベルを十分満足するとは言い難い。従って、該
ＤＮＡセンサ法をＤＮＡチップ技術に近づけることが一
つの解決策である。また、実用化レベルを満足するため
には、そのＤＮＡセンサ法よりさらに高い感度を有する
ＤＮＡの検出方法の開発が望まれている。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、プローブＤ
ＮＡと試料ＤＮＡとを、インターカレータ存在下に接触
させ、プローブＤＮＡと試料ＤＮＡとの結合で形成され
たハイブリッドＤＮＡに結合しているインターカレータ
に流れる電流を測定することにより接触後の電極の電流
を測定することにより、特定の塩基配列を有するＤＮＡ
を検出する方法を応用して、より検出感度の高いＤＮＡ
の検出方法を提供することにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者の研究により、
電極に固定されたプローブＤＮＡと一本鎖に解離させた
試料ＤＮＡとを、基質、その基質との反応によって還元
型に変化する酸化酵素、および電気化学活性縫い込み型
インターカレータの存在下に接触させ、該プローブＤＮ
Ａと該試料ＤＮＡとの結合によって形成されたハイブリ
ッドＤＮＡに結合した該インターカレータに流れる電流
を、還元型に変化した酸化酵素と電極との間の電子移動
によって増幅させ、その電流を測定することによって特
定の塩基配列を有するＤＮＡを検出することからなるＤ
ＮＡの増感型検出方法が上記の課題を解決できることが
判明した。

【００１２】また、ハイブリッドＤＮＡに、基質、その
基質との反応によって還元型に変化する酸化酵素、およ
び電気化学活性縫い込み型インターカレータを接触さ
せ、ハイブリッドＤＮＡに結合した該インターカレータ
に流れる電流を、還元型に変化した酸化酵素と電極との
間の電子移動によって増幅させ、その電流を測定するこ
とによってハイブリダイズした試料ＤＮＡの相補性を検
出することからなるＤＮＡの増感型検出方法も上記の課
題を解決できることが判明した。

【００１３】ＤＮＡの増感型検出方法の好ましい態様
は、以下の通りである。（１）プローブＤＮＡの塩基配列が既知であって、その
プローブＤＮＡを使用することを特徴とするＤＮＡの増
感型検出方法。（２）基質がグルコースもしくはコレステロールであっ
て、その基質との反応によって還元型に変化する酸化酵
素がそれぞれグルコースオキシダーゼ、コレステロール
オキシダーゼであることを特徴とするＤＮＡの増感型検
出方法。（３）電気化学活性縫い込み型インターカレータが、酸
化還元活性を有する化合物であることを特徴とするＤＮ
Ａの増感型検出方法。（４）電気化学活性縫い込み型インターカレータが、フ
ェロセン修飾電気化学活性縫い込み型インターカレータ
であることを特徴とするＤＮＡの増感型検出方法。（５）一本鎖に解離させた試料ＤＮＡが、１０^-18 モル
乃至１０^-12 モルの範囲の量で使用することを特徴とす
るＤＮＡの増感型検出方法。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明のＤＮＡの増感型検出方法
は、以下に説明する、増感効果を特に持たないＤＮＡの
検出方法を応用したものである。増感効果を特に持たな
いＤＮＡの検出方法を本発明のＤＮＡの増感型検出方法
と区別するために、「ＤＮＡの非増感型検出方法」とい
う。

【００１５】ＤＮＡの非増感型検出方法の特徴は、電極
表面にプローブＤＮＡが固定されてなるＤＮＡセンサ上
にて、プローブＤＮＡと一本鎖に解離させた試料ＤＮＡ
とを電気化学活性縫い込み型インターカレータ存在下に
接触させ、形成したハイブリッドＤＮＡに結合している
該インターカレータに流れる電流を測定することによっ
て、特定の塩基配列を有するＤＮＡを検出することであ
る。電極上で既にハイブリッドＤＮＡが形成されている
ものに、該インターカレータを接触させてもよい。

【００１６】ＤＮＡの増感型検出方法は、上記のＤＮＡ
の非増感型検出方法の条件にさらに基質およびその基質
との反応によって還元型に変化する酸化酵素を存在させ
ることによって、ハイブリッドＤＮＡに結合した電気化
学活性縫い込み型インターカレータに流れる電流を、還
元型に変化した酸化酵素と電極との間の電子移動によっ
て増幅させ、その電流を測定するという点が非増感型検
出方法と異なる。

【００１７】また、既に形成されているハイブリッドＤ
ＮＡに、酸化酵素、基質、および電気化学活性縫い込み
型インターカレータを接触させ、該インターカレータに
流れる電流を還元型に変化した酸化酵素と電極との間の
電子移動によって増幅させ、その電流を測定することに
よってハイブリダイズした試料ＤＮＡの相補性を検出す
ることも本発明のＤＮＡの増感型検出方法が非増感型検
出方法と異なる点である。

【００１８】以下、本発明のＤＮＡの増感型検出方法に
ついて詳細に説明する。

【００１９】図１は、電気化学活性縫い込み型インター
カレータ（３）が、還元型に変化した酸化酵素とハイブ
リッドＤＮＡ（２）が結合した電極（１）との間の電子
移動反応を仲介する模式図である。即ち、電極（１）に
チオール基を介して固定されてなるプローブＤＮＡと試
料ＤＮＡとで形成されたハイブリッドＤＮＡ（２）に、
電気化学活性縫い込み型インターカレータ（３）が二つ
のフェロセン分子を二本鎖の外側に突出した状態で結合
している。電流は、結合したインターカレータ（３）の
フェロセン分子間を流れる。ここに、酸化酵素（４）お
よびその対象となる基質（ＳＵ）を存在させると、基質
はその酸化体（ＯＳ）に変換される。発生する電子がフ
ェロセン分子の方向へ流れると電流は増幅する。即ち、
該インターカレータ（３）は、還元型に変化した酸化酵
素と電極との間の電子移動反応を仲介している。

【００２０】電極としては、ＤＮＡを固定できるものが
好ましい。金、グラシーカーボンもしくは炭素を用いる
ことが好ましい。電極の数は、二以上の複数であれば特
に制限されない。

【００２１】プローブＤＮＡとしては、生物試料から抽
出したＤＮＡを制限酵素で切断し、電気泳動による分離
等で精製したＤＮＡあるいは化学合成で得られた一本鎖
のＤＮＡを用いることができる。生物試料から抽出した
ＤＮＡの場合には、熱処理あるいはアルカリ処理によっ
て、一本鎖のＤＮＡに解離させておくことが好ましい。
これらの一本鎖のＤＮＡの配列は、周知のＤＮＡ配列決
定法により、予め決定しておくことが好ましい。

【００２２】上記の一本鎖のＤＮＡは、電極に固定す
る。固定化方法としては、公知の方法が用いられる。電
極が金である場合、該ＤＮＡの５’−もしくは３’−末
端（好ましくは、５’−末端）にチオール基を導入し、
金とイオウとの配位結合を介して、該ＤＮＡが電極に固
定される。該ＤＮＡにチオール基を導入する方法は、文
献（Ｍ．Ｍａｅｄａｅｔａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ
ｔ．，１８０５〜１８０８（１９９４）およびＢ．Ａ．
Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅ
ｓ．，１３，４４８４（１９８５））に記載されてい
る。即ち、上記の方法によって得られたチオール基を有
する該ＤＮＡを金電極に滴下し、低温下で数時間放置す
ることにより該ＤＮＡが電極に固定され、プローブＤＮ
Ａが作成される。

【００２３】電極がグラシーカーボンである場合、グラ
シーカーボンを過マンガン酸カリウムで酸化することに
よって、電極表面にカルボン酸基を導入する。次いで、
該ＤＮＡは、アミド結合により電極表面に固定される。
実際の固定化方法については、文献（Ｋ．Ｍ．Ｍｉｌｌ
ａｎｅｔａｌ．，ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ，６５，２３１７〜２３２３（１９９３））
に詳細が記載されている。

【００２４】ハイブリダイゼーションは、電気活性縫い
込み型インターカレータの存在下に行うことが好まし
い。該インターカレータは、数ｎＭ〜数ｍＭの濃度範囲
で用いることが好ましい。該インターカレータは、プロ
ーブＤＮＡと試料ＤＮＡとのハイブリダイゼーションの
速度を促進すると共に、形成されたハイブリッドＤＮＡ
に高い特異性で結合し、該ハイブリッドＤＮＡを安定化
する。このとき、該インターカレータとハイブリッドＤ
ＮＡとの複合体は、一次元マトリックスを支持体とした
擬ポリフェロセンポリマー（フェロセン分子の擬ポリマ
ー）と見なせる。このポリマー配列化が、還元型に変化
したグルコースオキシダーゼと電極との間の電子移動反
応の仲介を可能にしている。ハイブリッドＤＮＡが形成
されない場合には、該インターカレータは、一本鎖のＤ
ＮＡには結合しないか、あるいは一旦結合してもすぐに
解離して遊離のインターカレータとなる。

【００２５】電気化学活性縫い込み型インターカレータ
は、酸化還元活性を有する物質であり、かつハイブリッ
ドＤＮＡの二本鎖に縫い込まれる構造を有する物質であ
ることが好ましい。酸化還元活性部分として好ましく
は、フェロセン化合物、カテコールアミン化合物、金属
ビピリジン錯体、金属フェナンスリン錯体もしくはビオ
ローゲン化合物である。さらに好ましくは、フェロセン
化合物である。縫い込み型インターカレータ部分として
好ましくは、ナフタレンジイミド、アントラセン、アン
トラキノン等である。よって、好ましく用いられる該イ
ンターカレータは、フェロセンカルボン酸Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステルと対応するアミン体との反応
により合成される下記式で表されるフェロセン化ナフタ
レンジイミド誘導体（Ｓ．Ｔａｋｅｎａｋａｅｔａ
ｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｏｍｍｕｎ．，１１
１１（１９９８））である。

【００２６】

【化１】

【００２７】また、下記式で表されるフェロセン化ナフ
タレンジイミド誘導体も好ましく用いられる。

【００２８】

【化２】

【００２９】但し、Ａは下記式で表されるフェロセン誘
導体である。

【００３０】

【化３】

【００３１】

【化４】

【００３２】

【化５】

【００３３】

【化６】

【００３４】電気活性縫い込み型インターカレータに
は、酸化還元活性部分と縫い込み型インターカレータ部
分とを繋ぐリンカー部分がある。上記式で表される１，
４−ジプロピルピペラジン基がリンカー部分に相当す
る。このピペラジン基の代わりに、二価の四級アミン基
を導入することもできる。四級アミン基を導入した下記
式で表される化合物は、反応溶液中のｐＨに依らずカチ
オン性となるために、ハイブリッドＤＮＡとの結合がよ
り強くなる。リンカー部分に相当する基としては上記の
ものに限定されない。リンカー部分に相当する基の構造
の違いより、フェロセン分子の酸化還元電位が異なる。

【００３５】

【化７】

【００３６】電気活性縫い込み型インターカレータとし
て上記のナフタレンジイミド誘導体を用いた場合、ナフ
タレンジイミド誘導体は、二塩基おきに配列してハイブ
リッドＤＮＡに飽和している。このことは、ナフタレン
ジイミド誘導体の二つのフェロセン部分が、それぞれ、
ハイブリッドＤＮＡの主溝と副溝とに密に並んだ状態を
意味している。このため、ナフタレンジイミド誘導体
は、ハイブリッドＤＮＡからの解離速度が極めて遅くな
る。ここで、ナフタレンジイミド誘導体のハイブリッド
ＤＮＡへの結合がインターカレーションモードであるこ
とは、アレイにインターカレータおよび試料ＤＮＡを添
加したときに、粘度の変化が認められたことにより決定
した。閉環状プラスミド（例えば、ウイルスＳＶ４０）
の場合、インターカレーションが起こると超らせんの変
化に伴って粘度も変化することが知られている。

【００３７】試料ＤＮＡは、嚢胞性線維症等の遺伝病の
患者より抽出したＤＮＡを、熱処理あるいはアルカリ処
理によって、一本鎖のＤＮＡに解離させて使用すること
が好ましい。必要であれば、制限酵素で切断し、電気泳
動による分離等で精製してもよい。制限酵素で切断を受
けた試料ＤＮＡは、複数個のＤＮＡ断片となるが、プロ
ーブＤＮＡとの接触に使用されるＤＮＡ断片は、一つで
あっても複数個であってもよい。試料ＤＮＡは、数１０
^-18 〜数１０^-10 モルの範囲の量で用いられることが好
ましい。数１０^-18 〜数１０^-12 モルの範囲の量で用い
られることがさらに好ましい。

【００３８】酸化酵素として用いる酵素は、酸素から過
酸化水素を生じる２電子還元を行う酵素であれば特に制
限されない。グルコースオキシダーゼ、コレステロール
オキシダーゼ、ウリカーゼ、アミンオキシダーゼ等を好
ましく使用することができる。グルコースオキシダーゼ
によって過酸化水素を発生する基質としては、グルコー
スを使用する。コレステロールオキシダーゼの場合に
は、基質としてコレステロールを使用する。

【００３９】グルコースオキシダーゼは、Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒもしくはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕ
ｍｎｏｔａｔｕｍ由来のものを用いることが好まし
い。コレステロールオキシダーゼは、Ｎｏｃａｒｄｉａ
ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｒｉｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ等から得られたものを用いることが好ましい。

【００４０】ハイブリダイゼーション終了後、電極を洗
浄し、遊離のインターカレータを除去しておくことが好
ましい。

【００４１】プローブＤＮＡと試料ＤＮＡとの反応の結
果は、電極に流れる電気量を測定することにより判断す
る。電気量の測定には、電位をかけて流れる電流を測定
できる方法であれば何れの方法も用いることができる。
サイクリックボルタンメトリー、デファレンシャルパル
スボルタンメトリー、ポテンショスタット等が好ましく
用いられる。

【００４２】ＤＮＡの増感型検出方法では、グルコース
およびグルコースオキシダーゼの存在によって電極に流
れる電流量は、存在させない場合に比較して２０〜１０
０倍に増幅する。反応に使用する緩衝液あるいはスキャ
ン速度を変えることにより、１００倍以上の電流量の増
幅も可能である。

【００４３】

【実施例】［実施例１］（１）プローブＤＮＡが固定されてなる電極の作成面積が２．２５ｍｍ² の金電極に、５’−末端にメルカ
プトヘキシル基を有する１５０ピコモルのチミジンの２
０量体（ｄＴ₂₀）；５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−
３’ の水溶液２μＬを滴下し、プローブＤＮＡを作成した。
この金電極には、電極２ｍｍ² 当たり２０ピコモルのｄ
Ｔ₂₀が固定されたことになる。ｄＴ₂₀の合成および固定
化については、文献（特開平９−２８８０８０号公報）
に従って行った。（２）フェロセン縫い込み型インターカレータの合成合成は、文献（同公報）に従って合成した。（３）試料ＤＮＡの合成試料ＤＮＡとして、下記式で表されるアデニンの２０量
体（ｄＡ₂₀）；５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ−
３’ を合成した。合成法については、上記文献に従った。（４）試料ＤＮＡの相補性の検出上記（３）で得られたｄＡ₂₀（２８６ピコモル）、下記
式で表されるフェロセン縫い込み型インターカレータ
（５０μＭ）、グルコース（１０ｍＭ）およびグルコー
スオキシダーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ
由来、和光（株）製（２００Ｕ）とを含む０．１Ｍ酢酸
−酢酸カリウム水溶液（ｐＨ５．６）−０．１Ｍ塩化カ
リウム水溶液の混合液に、ｄＴ₂₀が固定された金電極を
浸し、２５℃で２０分間インキュベートさせた。インキ
ュベート後、電極を引き上げ、電極を５秒間、０．１Ｍ
リン酸二水素ナトリウム−リン酸水素二ナトリウム水溶
液（ｐＨ７．０）にて洗浄し、遊離のインターカレー
タ、未反応のｄＡ₂₀、グルコースおよびグルコースオキ
シダーゼを除去した。この洗浄処理後の電極のサイクリ
ックボルタモグラムを測定した（図２）。測定は、スキ
ャン速度２５ｍＶ／秒にて行った。

【００４４】

【化８】

【００４５】［比較例１］グルコースおよびグルコース
オキシダーゼを存在させなかった以外は、実施例１と同
様にして試料ＤＮＡの相補性の検出を行った（図２）。

【００４６】図２より、グルコースおよびグルコースオ
キシダーゼの存在下で増幅された電流（実線サイクリッ
クボルタモグラム）は、電位５１４ｍＶにおいて、−
２．９μＡであったのに対し、存在させない場合の電流
（点線サイクリックボルタモグラム）は、−０．１μＡ
であった。即ち、前者は、後者の２９倍であることが分
かった。

【００４７】［実施例２］試料ＤＮＡ（ｄＡ₂₀）の濃度
を変える以外は、実施例１と同様にして電極の性能の評
価を行った（図３）。測定は、電位４８０ｍＶにおいて
行った。棒グラフ（４１）は、試料ＤＮＡ（ｄＡ₂₀）の
濃度が１０ピコモルであるときの電流値（３．２μＡ）
を、棒グラフ（４２）は、濃度が２０ピコモルであると
きの電流値（３．６μＡ）を示す。棒グラフ（４１’）
および棒グラフ（４２’）は、それぞれ、グルコースお
よびグルコースオキシダーゼを存在させない場合におけ
る、試料ＤＮＡ（ｄＡ₂₀）の濃度が１０ピコモルの電流
値（０．４μＡ）、２０ピコモルの電流値（０．６μ
Ａ）を示す。

【００４８】図３より、試料ＤＮＡ（ｄＡ₂₀）の濃度が
２０ピコモルの場合には、グルコースおよびグルコース
オキシダーゼを存在させると、存在させない場合に比べ
ると６０〜８０倍の範囲で増幅された電流値を示し、試
料ＤＮＡ（ｄＡ₂₀）の濃度を１０ピコモルにしても、同
様な効果が認められた。従って、グルコースおよびグル
コースオキシダーゼを存在させることにより、試料ＤＮ
Ａの濃度を下げても、高い検出感度で試料ＤＮＡの検出
を行えることが分かった。

【００４９】よって、図２および図３は、ハイブリッド
ＤＮＡに結合したインターカレータが、還元型に変化し
た酸化酵素と電極との間の電子移動を仲介したことによ
り電流が増幅されたことを示している。

【００５０】

【発明の効果】本発明のＤＮＡの増感型検出方法は、基
質およびその基質との反応によって還元型に変化する酸
化酵素を存在させない方法に比べて、２０〜１００倍の
範囲の高い検出感度を達成することができた。また、用
いる試料ＤＮＡの濃度が数１０^-18 〜数１０^-12 モルの
範囲の量であっても、試料ＤＮＡの定性・定量が充分に
行えることが明らかとなった。

【図面の簡単な説明】

【図１】電気化学活性縫い込み型インターカレータが、
還元型に変化した酸化酵素とハイブリッドＤＮＡが結合
している電極との間の電子移動反応を仲介する模式図で
ある。

【図２】グルコースおよびグルコースオキシダーゼ存在
下のサイクリックボルタモグラム、並びにグルコースお
よびグルコースオキシダーゼが共に非存在下のサイクリ
ックボルタモグラムである。

【図３】グルコースおよびグルコースオキシダーゼ在下
での試料ＤＮＡの濃度とピーク電流値との関係を示す棒
グラフ、並びにグルコースおよびグルコースオキシダー
ゼが共に非存在下での試料ＤＮＡの濃度とピーク電流値
との関係を示す棒グラフである。

【符号の説明】

１電極２ハイブリッドＤＮＡ３電気化学活性縫い込み型インターカレータ４酸化酵素

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】電極に固定されたプローブＤＮＡと一本
鎖に解離させた試料ＤＮＡとを、基質、その基質との反
応によって還元型に変化する酸化酵素、および電気化学
活性縫い込み型インターカレータの存在下に接触させ、
該プローブＤＮＡと該試料ＤＮＡとの結合によって形成
されたハイブリッドＤＮＡに結合した該インターカレー
タに流れる電流を、還元型に変化した酸化酵素と電極と
の間の電子移動によって増幅させ、その電流を測定する
ことによって特定の塩基配列を有するＤＮＡを検出する
ことからなるＤＮＡの増感型検出方法。
【請求項２】ハイブリッドＤＮＡに、基質、その基質
との反応によって還元型に変化する酸化酵素、および電
気化学活性縫い込み型インターカレータを接触させ、ハ
イブリッドＤＮＡに結合した該インターカレータに流れ
る電流を、還元型に変化した酸化酵素と電極との間の電
子移動によって増幅させ、その電流を測定することによ
ってハイブリダイズした試料ＤＮＡの相補性を検出する
ことからなるＤＮＡの増感型検出方法。
【請求項３】プローブＤＮＡの塩基配列が既知であっ
て、そのプローブＤＮＡを使用することを特徴とする請
求項１に記載の増感型ＤＮＡの検出方法。
【請求項４】基質がグルコースもしくはコレステロー
ルであって、その基質との反応によって還元型に変化す
る酸化酵素がそれぞれグルコースオキシダーゼ、コレス
テロールオキシダーゼであることを特徴とする請求項１
もしくは２の内の何れかの項に記載のＤＮＡの増感型検
出方法。
【請求項５】電気化学活性縫い込み型インターカレー
タが、酸化還元活性を有する化合物であることを特徴と
する請求項１もしくは２の内の何れかの項に記載のＤＮ
Ａの増感型検出方法。
【請求項６】電気化学活性縫い込み型インターカレー
タが、フェロセン修飾電気化学活性縫い込み型インター
カレータであることを特徴とする請求項１、２もしくは
４の内の何れかの項に記載のＤＮＡの増感型検出方法。
【請求項７】一本鎖に解離させた試料ＤＮＡを、１０
^-18 モル乃至１０^-1 ² モルの範囲の量で使用することを
特徴とする請求項１に記載のＤＮＡの増感型検出方法。