JP2000199754A - 増感型電流測定用具を用いるアナライトの定量方法 - Google Patents
増感型電流測定用具を用いるアナライトの定量方法Info
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- JP2000199754A JP2000199754A JP11001111A JP111199A JP2000199754A JP 2000199754 A JP2000199754 A JP 2000199754A JP 11001111 A JP11001111 A JP 11001111A JP 111199 A JP111199 A JP 111199A JP 2000199754 A JP2000199754 A JP 2000199754A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、検体中のアナライト、特にグルコ
ース、コレステロール、乳酸、フルクトシルアミノ酸も
しくはＬ−グリセロールリン酸の定量方法を提供するこ
と。 【解決手段】 二本鎖で構成されているＤＮＡ断片がそ
の一端にて電極に固定されてなるＤＮＡ修飾電極、およ
び電気化学活性縫い込み型インターカレータからなる増
感型電流測定用具に、電位を付与しながら、該測定用具
表面に、アナライトとの反応によって還元型に変化する
酸化酵素の存在下にて、アナライトを含有する試料溶液
を接触させ、その接触により該測定用具に発生する電流
量を測定することからなる試料溶液中のアナライトの定
量方法。
ース、コレステロール、乳酸、フルクトシルアミノ酸も
しくはＬ−グリセロールリン酸の定量方法を提供するこ
と。 【解決手段】 二本鎖で構成されているＤＮＡ断片がそ
の一端にて電極に固定されてなるＤＮＡ修飾電極、およ
び電気化学活性縫い込み型インターカレータからなる増
感型電流測定用具に、電位を付与しながら、該測定用具
表面に、アナライトとの反応によって還元型に変化する
酸化酵素の存在下にて、アナライトを含有する試料溶液
を接触させ、その接触により該測定用具に発生する電流
量を測定することからなる試料溶液中のアナライトの定
量方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、増感型電流測定用
具を用いるアナライトの定量方法に関する。
具を用いるアナライトの定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】生物液体試料（全血、血漿、血清、尿、
リンパ液、髄液等）に含まれるアナライト（グルコー
ス、総コレステロール、尿素窒素、尿酸、総ビリルビ
ン、アンモニア、ヘモグロビン、中性脂肪、総蛋白等）
の定量分析には、従来から一般的にに液体法と乾式法と
が利用されている。現在では、測定の簡便性、迅速性の
点で乾式法が多く利用されている。乾式法では、発色し
た色素の濃度を主に比色法によって測定し、アナライト
を定量する。
リンパ液、髄液等）に含まれるアナライト（グルコー
ス、総コレステロール、尿素窒素、尿酸、総ビリルビ
ン、アンモニア、ヘモグロビン、中性脂肪、総蛋白等）
の定量分析には、従来から一般的にに液体法と乾式法と
が利用されている。現在では、測定の簡便性、迅速性の
点で乾式法が多く利用されている。乾式法では、発色し
た色素の濃度を主に比色法によって測定し、アナライト
を定量する。
【０００３】乾式法による、種々の特徴を有したアナラ
イトの定量用試験具が報告さている（特開昭６０−１１
１９６０号公報、特開昭６０−８２８５９号、公報特開
平４−３２４３４７号公報、特開平４−３２４３４７号
公報等）。これらの試験具を用いる定量方法は、全血を
直接、試料として使用したときに従来問題となってい
た、ヘモグロビンによる赤色色素の妨害、血液中のカタ
ラーゼ等の過酸化水素分解活性物質による分析精度の低
下、酸化酵素に働く酸素の供給などの問題を解決してい
る。
イトの定量用試験具が報告さている（特開昭６０−１１
１９６０号公報、特開昭６０−８２８５９号、公報特開
平４−３２４３４７号公報、特開平４−３２４３４７号
公報等）。これらの試験具を用いる定量方法は、全血を
直接、試料として使用したときに従来問題となってい
た、ヘモグロビンによる赤色色素の妨害、血液中のカタ
ラーゼ等の過酸化水素分解活性物質による分析精度の低
下、酸化酵素に働く酸素の供給などの問題を解決してい
る。
【０００４】比色法以外では、試料中に含まれるナトリ
ウム、カリウム、塩素等の定量に、乾式法による示差電
位法も利用されている。
ウム、カリウム、塩素等の定量に、乾式法による示差電
位法も利用されている。
【０００５】しかし、既に実用化されている液体法、乾
式法等では、何れの場合にも測定に専用の測定装置が必
要とされる。また、それらの方法の中には、迅速性や簡
便性の点で充分であるとは言い難いものもある。
式法等では、何れの場合にも測定に専用の測定装置が必
要とされる。また、それらの方法の中には、迅速性や簡
便性の点で充分であるとは言い難いものもある。
【０００６】一方、生物活性物質の機能を利用して、各
種のバイオセンサが開発されている。バイオセンサは、
各種の生体、生理活性物質および測定結果を電気的信号
に変換するためのトランスデューサからなっているが、
この活性物質の固定膜として導電性物質を用いることに
より、酵素センサ、免疫センサ、微生物センサ、オルガ
ネラセンサ等が検討されている。例えば、酵素センサで
は、酵素を固定した膜に種々の物質からなる液体が接触
すると、固定されている酵素とのみ反応する物質（基
質）が選ばれ、酵素反応が生ずる。この反応で生成する
物質が電極で反応すれば、電気信号として取り出すこと
ができる。酵素センサの例として、グルコースセンサが
知られている。グルコースセンサは、グルコースオキシ
ダーゼがグルコースを酸化すると、グルコン酸と共に過
酸化水素を生ずるため、この過酸化水素を過酸化水素電
極等で電気信号に変換してグルコース濃度を決定するも
のである。糖尿病患者が多くなって以来、このグルコー
スセンサはますます重要となっている。
種のバイオセンサが開発されている。バイオセンサは、
各種の生体、生理活性物質および測定結果を電気的信号
に変換するためのトランスデューサからなっているが、
この活性物質の固定膜として導電性物質を用いることに
より、酵素センサ、免疫センサ、微生物センサ、オルガ
ネラセンサ等が検討されている。例えば、酵素センサで
は、酵素を固定した膜に種々の物質からなる液体が接触
すると、固定されている酵素とのみ反応する物質（基
質）が選ばれ、酵素反応が生ずる。この反応で生成する
物質が電極で反応すれば、電気信号として取り出すこと
ができる。酵素センサの例として、グルコースセンサが
知られている。グルコースセンサは、グルコースオキシ
ダーゼがグルコースを酸化すると、グルコン酸と共に過
酸化水素を生ずるため、この過酸化水素を過酸化水素電
極等で電気信号に変換してグルコース濃度を決定するも
のである。糖尿病患者が多くなって以来、このグルコー
スセンサはますます重要となっている。
【０００７】従って、グルコース濃度の測定は、医療機
関等で行われる場合だけでなく、特定の糖尿病患者にと
っては自身で定期的あるいは頻繁に行う場合もある。コ
レステロール、フルクトシルアミノ酸、Ｌ−グリセロー
ルリン酸および乳酸についても成人病等の観点から重要
な測定対象成分である。そのため、従来の測定方法とは
異なった、迅速、廉価、簡易および正確のすべての点を
満足する測定法、およびその測定具の開発が求められて
いる。
関等で行われる場合だけでなく、特定の糖尿病患者にと
っては自身で定期的あるいは頻繁に行う場合もある。コ
レステロール、フルクトシルアミノ酸、Ｌ−グリセロー
ルリン酸および乳酸についても成人病等の観点から重要
な測定対象成分である。そのため、従来の測定方法とは
異なった、迅速、廉価、簡易および正確のすべての点を
満足する測定法、およびその測定具の開発が求められて
いる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、検体中のア
ナライト、特にグルコース、コレステロール、乳酸、フ
ルクトシルアミノ酸もしくはＬ−グリセロールリン酸の
定量方法を提供することにある。
ナライト、特にグルコース、コレステロール、乳酸、フ
ルクトシルアミノ酸もしくはＬ−グリセロールリン酸の
定量方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者の研究により、
二本鎖で構成されているＤＮＡ断片がその一端にて電極
に固定されてなるＤＮＡ修飾電極、および電気化学活性
縫い込み型インターカレータからなる増感型電流測定用
具に、電位を付与しながら、該測定用具表面に、アナラ
イトとの反応によって還元型に変化する酸化酵素の存在
下にて、アナライトを含有する試料溶液を接触させ、そ
の接触により該測定用具に発生する電流量を測定するこ
とからなる試料溶液中のアナライトの定量方法が上記の
課題を解決できることが判明した。
二本鎖で構成されているＤＮＡ断片がその一端にて電極
に固定されてなるＤＮＡ修飾電極、および電気化学活性
縫い込み型インターカレータからなる増感型電流測定用
具に、電位を付与しながら、該測定用具表面に、アナラ
イトとの反応によって還元型に変化する酸化酵素の存在
下にて、アナライトを含有する試料溶液を接触させ、そ
の接触により該測定用具に発生する電流量を測定するこ
とからなる試料溶液中のアナライトの定量方法が上記の
課題を解決できることが判明した。
【００１０】アナライトの定量方法の好ましい態様は、
以下の通りである。 （１）ＤＮＡ修飾電極が、電極上でハイブリダイゼーシ
ョンによって調製されたＤＮＡ断片が電極に固定されて
なるもの、あるいは予め調製されたＤＮＡ断片が電極に
固定されてなるものであることを特徴とするアナライト
の定量方法。 （２）アナライトがグルコースであって、そのアナライ
トとの反応によって還元型に変化する酸化酵素がグルコ
ースオキシダーゼであることを特徴とするアナライトの
定量方法。 （３）試料溶液中のグルコースが、１乃至３５ｍＭの濃
度範囲にあることを特徴とするアナライトの定量方法。 （４）電気化学活性縫い込み型インターカレータが、酸
化還元活性を有する化合物であることを特徴とするアナ
ライトの定量方法。 （５）電気化学活性縫い込み型インターカレータが、フ
ェロセン修飾電気化学活性縫い込み型インターカレータ
であることを特徴とするアナライトの定量方法。
以下の通りである。 （１）ＤＮＡ修飾電極が、電極上でハイブリダイゼーシ
ョンによって調製されたＤＮＡ断片が電極に固定されて
なるもの、あるいは予め調製されたＤＮＡ断片が電極に
固定されてなるものであることを特徴とするアナライト
の定量方法。 （２）アナライトがグルコースであって、そのアナライ
トとの反応によって還元型に変化する酸化酵素がグルコ
ースオキシダーゼであることを特徴とするアナライトの
定量方法。 （３）試料溶液中のグルコースが、１乃至３５ｍＭの濃
度範囲にあることを特徴とするアナライトの定量方法。 （４）電気化学活性縫い込み型インターカレータが、酸
化還元活性を有する化合物であることを特徴とするアナ
ライトの定量方法。 （５）電気化学活性縫い込み型インターカレータが、フ
ェロセン修飾電気化学活性縫い込み型インターカレータ
であることを特徴とするアナライトの定量方法。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明では、後述するＤＮＡの増
感型検出方法を利用する。さらに、この増感型検出方法
は、以下に説明する、増感効果を特に持たないＤＮＡの
検出方法を応用したものである。増感効果を特に持たな
いＤＮＡの検出方法をＤＮＡの増感型検出方法と区別す
るために、「ＤＮＡの非増感型検出方法」という。「Ｄ
ＮＡの非増感型検出方法」については、文献に開示され
ている（特開平９−２８８０８０号公報および第５７回
分析化学討論会予稿集、ｐ１３７〜１３８（１９９６
年））。
感型検出方法を利用する。さらに、この増感型検出方法
は、以下に説明する、増感効果を特に持たないＤＮＡの
検出方法を応用したものである。増感効果を特に持たな
いＤＮＡの検出方法をＤＮＡの増感型検出方法と区別す
るために、「ＤＮＡの非増感型検出方法」という。「Ｄ
ＮＡの非増感型検出方法」については、文献に開示され
ている（特開平９−２８８０８０号公報および第５７回
分析化学討論会予稿集、ｐ１３７〜１３８（１９９６
年））。
【００１２】ＤＮＡの非増感型検出方法の特徴は、電極
表面にプローブＤＮＡが固定されてなるＤＮＡ修飾電極
上にて、プローブＤＮＡと一本鎖に解離させた試料ＤＮ
Ａとを電気化学活性縫い込み型インターカレータ存在下
に接触させ、形成したハイブリッドＤＮＡに結合してい
る該インターカレータに流れる電流を測定することによ
って、試料ＤＮＡの相補性を検出することである。電極
上で既にハイブリッドＤＮＡが形成されているものに、
該インターカレータを接触させてもよい。
表面にプローブＤＮＡが固定されてなるＤＮＡ修飾電極
上にて、プローブＤＮＡと一本鎖に解離させた試料ＤＮ
Ａとを電気化学活性縫い込み型インターカレータ存在下
に接触させ、形成したハイブリッドＤＮＡに結合してい
る該インターカレータに流れる電流を測定することによ
って、試料ＤＮＡの相補性を検出することである。電極
上で既にハイブリッドＤＮＡが形成されているものに、
該インターカレータを接触させてもよい。
【００１３】ＤＮＡの増感型検出方法は、上記のＤＮＡ
の非増感型検出方法の条件に、さらに基質およびその基
質との反応によって還元型に変化する酸化酵素を存在さ
せることによって、高い感度でのＤＮＡの検出を可能と
した（第４７回高分子学会予稿集、ｐ３１５５〜３１５
６（１９９８年））点が非増感型検出方法と異なる。
の非増感型検出方法の条件に、さらに基質およびその基
質との反応によって還元型に変化する酸化酵素を存在さ
せることによって、高い感度でのＤＮＡの検出を可能と
した（第４７回高分子学会予稿集、ｐ３１５５〜３１５
６（１９９８年））点が非増感型検出方法と異なる。
【００１４】また、既に形成されているハイブリッドＤ
ＮＡに、酸化酵素、基質、および電気化学活性縫い込み
型インターカレータを接触させ、該インターカレータに
流れる電流を還元型に変化した酸化酵素と電極との間の
電子移動によって増幅させ、その電流を測定する点もＤ
ＮＡの増感型検出方法が非増感型検出方法と異なる点で
ある。
ＮＡに、酸化酵素、基質、および電気化学活性縫い込み
型インターカレータを接触させ、該インターカレータに
流れる電流を還元型に変化した酸化酵素と電極との間の
電子移動によって増幅させ、その電流を測定する点もＤ
ＮＡの増感型検出方法が非増感型検出方法と異なる点で
ある。
【００１５】本発明は、二本鎖で構成されているＤＮＡ
断片がその一端にて電極に固定されてなるＤＮＡ修飾電
極、および電気化学活性縫い込み型インターカレータか
らなる増感型電流測定用具に電位をかけながら、アナラ
イトに対応する酸化酵素の存在下にて、該測定用具表面
にアナライトを接触させ、該電流測定用具に発生する電
流量を測定することによって、試料溶液中のアナライト
を定量する方法である。
断片がその一端にて電極に固定されてなるＤＮＡ修飾電
極、および電気化学活性縫い込み型インターカレータか
らなる増感型電流測定用具に電位をかけながら、アナラ
イトに対応する酸化酵素の存在下にて、該測定用具表面
にアナライトを接触させ、該電流測定用具に発生する電
流量を測定することによって、試料溶液中のアナライト
を定量する方法である。
【００１６】以下、増感型電流測定用具を用いる定量方
法について詳述する。
法について詳述する。
【００１７】図１は、電気化学活性縫い込み型インター
カレータ（３１）が、還元型に変化した酸化酵素と二本
鎖で構成されているＤＮＡが結合した電極（１１）との
間の電子移動反応を仲介する模式図である。電極上に固
定されてなるＤＮＡは、二本鎖であればハイブリダイゼ
ーションによって作成されたものでなくてもよい。電極
（１１）にチオール基を介して固定されている二本鎖Ｄ
ＮＡ（２１）に、電気化学活性縫い込み型インターカレ
ータ（３１）が二つのフェロセン分子を二本鎖の外側に
突出した状態で結合している。電流は、結合したインタ
ーカレータ（３１）のフェロセン分子間を流れる。ここ
に、酸化酵素（４１）およびその対象となるアナライト
（５１）を存在させると、アナライト（５１）は酸化さ
れたアナライト（６１）に変換される。発生する電子が
フェロセン分子の方向へ流れると電流は増幅される。即
ち、インターカレータ（３１）は、還元型に変化した酸
化酵素と電極（１１）との間の電子移動反応を仲介して
いる。
カレータ（３１）が、還元型に変化した酸化酵素と二本
鎖で構成されているＤＮＡが結合した電極（１１）との
間の電子移動反応を仲介する模式図である。電極上に固
定されてなるＤＮＡは、二本鎖であればハイブリダイゼ
ーションによって作成されたものでなくてもよい。電極
（１１）にチオール基を介して固定されている二本鎖Ｄ
ＮＡ（２１）に、電気化学活性縫い込み型インターカレ
ータ（３１）が二つのフェロセン分子を二本鎖の外側に
突出した状態で結合している。電流は、結合したインタ
ーカレータ（３１）のフェロセン分子間を流れる。ここ
に、酸化酵素（４１）およびその対象となるアナライト
（５１）を存在させると、アナライト（５１）は酸化さ
れたアナライト（６１）に変換される。発生する電子が
フェロセン分子の方向へ流れると電流は増幅される。即
ち、インターカレータ（３１）は、還元型に変化した酸
化酵素と電極（１１）との間の電子移動反応を仲介して
いる。
【００１８】本発明では、上記の増幅された電流量Ａを
測定する。そして、別に、二本鎖ＤＮＡが固定されてな
る電極に、アナライトおよび酸化酵素は接触させず、電
気化学活性縫い込み型インターカレータのみを接触させ
たときに、二本鎖ＤＮＡに結合したインターカレータを
流れる電流量Ａ’（基本電流量）を測定する。この基本
電流量は、前記の非増感型検出方法によって得られる電
流量である。よって、電流量Ａと電流量Ａ’との差が、
酸化酵素が還元型に変化したときに発生する電子が運ぶ
電流量、即ちアナライトの濃度に対応する電流量Ｂであ
る。
測定する。そして、別に、二本鎖ＤＮＡが固定されてな
る電極に、アナライトおよび酸化酵素は接触させず、電
気化学活性縫い込み型インターカレータのみを接触させ
たときに、二本鎖ＤＮＡに結合したインターカレータを
流れる電流量Ａ’（基本電流量）を測定する。この基本
電流量は、前記の非増感型検出方法によって得られる電
流量である。よって、電流量Ａと電流量Ａ’との差が、
酸化酵素が還元型に変化したときに発生する電子が運ぶ
電流量、即ちアナライトの濃度に対応する電流量Ｂであ
る。
【００１９】例えば、アナライトとしてグルコースおよ
びその酸化酵素としてグルコースオキシダーゼを存在さ
せたときに電極に流れる電流量は、存在させない場合に
比較して約２０〜１００倍に増幅する。反応に使用する
緩衝液あるいはスキャン速度を変えることにより、１０
０倍以上の電流量の増幅も可能である。
びその酸化酵素としてグルコースオキシダーゼを存在さ
せたときに電極に流れる電流量は、存在させない場合に
比較して約２０〜１００倍に増幅する。反応に使用する
緩衝液あるいはスキャン速度を変えることにより、１０
０倍以上の電流量の増幅も可能である。
【００２０】電流量Ｂとアナライトの濃度との関係を示
す検量線を作成しておけば、濃度が未知のアナライトに
ついて、アナライトおよびその酸化酵素を増感型電流測
定用具に接触させ、電極の電流量を測定することによっ
て、その電流量からアナライトの濃度を求めることがで
きる。
す検量線を作成しておけば、濃度が未知のアナライトに
ついて、アナライトおよびその酸化酵素を増感型電流測
定用具に接触させ、電極の電流量を測定することによっ
て、その電流量からアナライトの濃度を求めることがで
きる。
【００２１】電極としては、二本鎖ＤＮＡを固定できる
ものが好ましい。金、グラシーカーボンもしくは炭素を
用いることが好ましい。電極の数は、二以上の複数であ
れば特に制限されない。
ものが好ましい。金、グラシーカーボンもしくは炭素を
用いることが好ましい。電極の数は、二以上の複数であ
れば特に制限されない。
【００２２】二本鎖ＤＮＡとしては、電極上で調製した
ハイブリッドＤＮＡ、あるいは予め調製した二本鎖ＤＮ
Ａを用いることができる。ハイブリッドＤＮＡとして
は、一本鎖ＤＮＡを電極に固定してなるプローブＤＮＡ
に、一本鎖の試料ＤＮＡを接触させて得られるＤＮＡを
用いる。二本鎖の形成度は特に制限されない。予め調製
した二本鎖ＤＮＡとしては、生物試料から抽出したＤＮ
Ａあるいは遺伝子操作によって作成したＤＮＡを制限酵
素で切断し、次いで電気泳動による分離等で精製したＤ
ＮＡを用いることが好ましい。また、一本鎖の合成オリ
ゴヌクレオチドおよび該ヌクレオチドと相補する一本鎖
の合成オリゴヌクレオチドを用いて二本鎖ＤＮＡを形成
させてもよい。電極に固定されてなる二本鎖ＤＮＡの濃
度は、１０〜２０ピコモルの範囲にあることが好まし
い。
ハイブリッドＤＮＡ、あるいは予め調製した二本鎖ＤＮ
Ａを用いることができる。ハイブリッドＤＮＡとして
は、一本鎖ＤＮＡを電極に固定してなるプローブＤＮＡ
に、一本鎖の試料ＤＮＡを接触させて得られるＤＮＡを
用いる。二本鎖の形成度は特に制限されない。予め調製
した二本鎖ＤＮＡとしては、生物試料から抽出したＤＮ
Ａあるいは遺伝子操作によって作成したＤＮＡを制限酵
素で切断し、次いで電気泳動による分離等で精製したＤ
ＮＡを用いることが好ましい。また、一本鎖の合成オリ
ゴヌクレオチドおよび該ヌクレオチドと相補する一本鎖
の合成オリゴヌクレオチドを用いて二本鎖ＤＮＡを形成
させてもよい。電極に固定されてなる二本鎖ＤＮＡの濃
度は、１０〜２０ピコモルの範囲にあることが好まし
い。
【００２３】プローブＤＮＡを構成するＤＮＡ、および
プローブＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡ（以下、試
料ＤＮＡという）としては、生物試料から抽出したＤＮ
Ａを制限酵素で切断し、電気泳動による分離等で精製し
た一本鎖のＤＮＡあるいは化学合成で得られた一本鎖の
ＤＮＡを用いることができる。生物試料から抽出したＤ
ＮＡの場合には、熱処理あるいはアルカリ処理によっ
て、一本鎖のＤＮＡに解離させておくことが好ましい。
プローブＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡ（以下、試
料ＤＮＡという）としては、生物試料から抽出したＤＮ
Ａを制限酵素で切断し、電気泳動による分離等で精製し
た一本鎖のＤＮＡあるいは化学合成で得られた一本鎖の
ＤＮＡを用いることができる。生物試料から抽出したＤ
ＮＡの場合には、熱処理あるいはアルカリ処理によっ
て、一本鎖のＤＮＡに解離させておくことが好ましい。
【００２４】制限酵素で切断を受けた試料ＤＮＡは、複
数個のＤＮＡ断片となるが、プローブＤＮＡとの接触に
使用されるＤＮＡ断片は、一個であっても複数個であっ
てもよい。試料ＤＮＡは、数１０-18〜数１０-10モルの
範囲の量で用いられることが好ましい。数１０-18〜数
１０-12モルの範囲の量で用いられることがさらに好ま
しい。
数個のＤＮＡ断片となるが、プローブＤＮＡとの接触に
使用されるＤＮＡ断片は、一個であっても複数個であっ
てもよい。試料ＤＮＡは、数１０-18〜数１０-10モルの
範囲の量で用いられることが好ましい。数１０-18〜数
１０-12モルの範囲の量で用いられることがさらに好ま
しい。
【００２５】二本鎖ＤＮＡは、電極に固定する。固定化
方法としては、公知の方法が用いられる。電極が金であ
る場合、予め調製した二本鎖ＤＮＡの片方の鎖の５’−
もしくは３’−末端（好ましくは、５’−末端）にチオ
ール基を導入し、金とイオウとの配位結合を介して、該
ＤＮＡが電極に固定される。該ＤＮＡにチオール基を導
入する方法は、文献（Ｍ．Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．，
Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１８０５〜１８０８（１９９
４）およびＢ．Ａ．Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３，４４８４（１９８
５））に記載されている。電極上で二本鎖ＤＮＡを調製
する場合には、プローブＤＮＡを構成する一本鎖ＤＮＡ
の５’−もしくは３’−末端（好ましくは、５’−末
端）にチオール基を導入する。実際には、チオール基を
有する二本鎖ＤＮＡもしくは一本鎖ＤＮＡを金電極に滴
下し、低温下で数時間放置すると二本鎖ＤＮＡもしくは
一本鎖ＤＮＡが電極に固定される。
方法としては、公知の方法が用いられる。電極が金であ
る場合、予め調製した二本鎖ＤＮＡの片方の鎖の５’−
もしくは３’−末端（好ましくは、５’−末端）にチオ
ール基を導入し、金とイオウとの配位結合を介して、該
ＤＮＡが電極に固定される。該ＤＮＡにチオール基を導
入する方法は、文献（Ｍ．Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．，
Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１８０５〜１８０８（１９９
４）およびＢ．Ａ．Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３，４４８４（１９８
５））に記載されている。電極上で二本鎖ＤＮＡを調製
する場合には、プローブＤＮＡを構成する一本鎖ＤＮＡ
の５’−もしくは３’−末端（好ましくは、５’−末
端）にチオール基を導入する。実際には、チオール基を
有する二本鎖ＤＮＡもしくは一本鎖ＤＮＡを金電極に滴
下し、低温下で数時間放置すると二本鎖ＤＮＡもしくは
一本鎖ＤＮＡが電極に固定される。
【００２６】電極がグラシーカーボンである場合、グラ
シーカーボンを過マンガン酸カリウムで酸化することに
よって、電極表面にカルボン酸基を導入する。二本鎖Ｄ
ＮＡもしくは一本鎖ＤＮＡは、アミド結合により電極表
面に固定される。実際の固定化方法については、文献
（Ｋ．Ｍ．Ｍｉｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔ
ｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６５，２３１７〜２３
２３（１９９３））に詳細が記載されている。
シーカーボンを過マンガン酸カリウムで酸化することに
よって、電極表面にカルボン酸基を導入する。二本鎖Ｄ
ＮＡもしくは一本鎖ＤＮＡは、アミド結合により電極表
面に固定される。実際の固定化方法については、文献
（Ｋ．Ｍ．Ｍｉｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔ
ｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６５，２３１７〜２３
２３（１９９３））に詳細が記載されている。
【００２７】電気活性縫い込み型インターカレータは、
ＤＮＡ修飾電極を該インターカレータを含む溶液に浸積
する方法、あるいはＤＮＡ修飾電極上に該インターカレ
ータを含む溶液を滴下する方法によってＤＮＡ修飾電極
に接触させることができる。該インターカレータは、１
０ｎＭ〜１０ｍＭの濃度範囲で用いることが好ましい。
ハイブリダイゼーション終了後、電極を洗浄し、遊離の
インターカレータを除去しておくことが好ましい。
ＤＮＡ修飾電極を該インターカレータを含む溶液に浸積
する方法、あるいはＤＮＡ修飾電極上に該インターカレ
ータを含む溶液を滴下する方法によってＤＮＡ修飾電極
に接触させることができる。該インターカレータは、１
０ｎＭ〜１０ｍＭの濃度範囲で用いることが好ましい。
ハイブリダイゼーション終了後、電極を洗浄し、遊離の
インターカレータを除去しておくことが好ましい。
【００２８】電極上でハイブリッドＤＮＡを調製する場
合には、該インターカレータは、プローブＤＮＡと試料
ＤＮＡとのハイブリダイゼーションの速度を促進すると
共に、形成されたハイブリッドＤＮＡに高い特異性で結
合し、該ＤＮＡを安定化する。このとき、該インターカ
レータと該ＤＮＡとの複合体は、一次元マトリックスを
支持体とした擬ポリフェロセンポリマー（フェロセン分
子の擬ポリマー）と見なすことができる。このポリマー
配列化が、還元型に変化した酸化酵素と電極との間の電
子移動反応の仲介を可能にしている。該ＤＮＡが形成さ
れない場合には、該インターカレータは、一本鎖のＤＮ
Ａには結合しないか、あるいは一旦結合してもすぐに解
離して遊離のインターカレータとなる。予め調製した二
本鎖ＤＮＡを用いる場合にも同様である。
合には、該インターカレータは、プローブＤＮＡと試料
ＤＮＡとのハイブリダイゼーションの速度を促進すると
共に、形成されたハイブリッドＤＮＡに高い特異性で結
合し、該ＤＮＡを安定化する。このとき、該インターカ
レータと該ＤＮＡとの複合体は、一次元マトリックスを
支持体とした擬ポリフェロセンポリマー（フェロセン分
子の擬ポリマー）と見なすことができる。このポリマー
配列化が、還元型に変化した酸化酵素と電極との間の電
子移動反応の仲介を可能にしている。該ＤＮＡが形成さ
れない場合には、該インターカレータは、一本鎖のＤＮ
Ａには結合しないか、あるいは一旦結合してもすぐに解
離して遊離のインターカレータとなる。予め調製した二
本鎖ＤＮＡを用いる場合にも同様である。
【００２９】電気化学活性縫い込み型インターカレータ
は、酸化還元活性を有する物質であり、かつＤＮＡの二
本鎖に縫い込まれる構造を有する物質であることが好ま
しい。酸化還元活性部分として好ましくは、フェロセン
化合物、カテコールアミン化合物、金属ビピリジン錯
体、金属フェナントロリン錯体もしくはビオローゲン化
合物である。さらに好ましくは、フェロセン化合物であ
る。縫い込み型インターカレータ部分として好ましく
は、ナフタレンジイミド、アントラセン、アントラキノ
ン等である。よって、好ましく用いられる該インターカ
レータは、フェロセンカルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステルと対応するアミン体との反応により合
成される下記式で表されるフェロセン化ナフタレンジイ
ミド誘導体（Ｓ．Ｔａｋｅｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｏｍｍｕｎ．，１１１１
（１９９８））である。
は、酸化還元活性を有する物質であり、かつＤＮＡの二
本鎖に縫い込まれる構造を有する物質であることが好ま
しい。酸化還元活性部分として好ましくは、フェロセン
化合物、カテコールアミン化合物、金属ビピリジン錯
体、金属フェナントロリン錯体もしくはビオローゲン化
合物である。さらに好ましくは、フェロセン化合物であ
る。縫い込み型インターカレータ部分として好ましく
は、ナフタレンジイミド、アントラセン、アントラキノ
ン等である。よって、好ましく用いられる該インターカ
レータは、フェロセンカルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステルと対応するアミン体との反応により合
成される下記式で表されるフェロセン化ナフタレンジイ
ミド誘導体（Ｓ．Ｔａｋｅｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｏｍｍｕｎ．，１１１１
（１９９８））である。
【００３０】
【化１】
【００３１】また、下記式で表されるフェロセン化ナフ
タレンジイミド誘導体も好ましく用いられる。
タレンジイミド誘導体も好ましく用いられる。
【００３２】
【化２】
【００３３】但し、Ａは下記式で表されるフェロセン誘
導体である。
導体である。
【００３４】
【化３】
【００３５】
【化４】
【００３６】
【化５】
【００３７】
【化６】
【００３８】電気活性縫い込み型インターカレータに
は、酸化還元活性部分と縫い込み型インターカレータ部
分とを繋ぐリンカー部分がある。上記式で表される１，
４−ジプロピルピペラジン基がリンカー部分に相当す
る。このピペラジン基の代わりに、二価の四級アミン基
を導入することもできる。四級アミン基を導入した下記
式で表される化合物は、反応溶液中のｐＨに依らずカチ
オン性となるために、二本鎖ＤＮＡとの結合がより強く
なる。リンカー部分に相当する基としては上記のものに
限定されない。リンカー部分に相当する基の構造の違い
より、フェロセン分子の酸化還元電位が異なる。
は、酸化還元活性部分と縫い込み型インターカレータ部
分とを繋ぐリンカー部分がある。上記式で表される１，
４−ジプロピルピペラジン基がリンカー部分に相当す
る。このピペラジン基の代わりに、二価の四級アミン基
を導入することもできる。四級アミン基を導入した下記
式で表される化合物は、反応溶液中のｐＨに依らずカチ
オン性となるために、二本鎖ＤＮＡとの結合がより強く
なる。リンカー部分に相当する基としては上記のものに
限定されない。リンカー部分に相当する基の構造の違い
より、フェロセン分子の酸化還元電位が異なる。
【００３９】
【化７】
【００４０】電気活性縫い込み型インターカレータとし
て上記のナフタレンジイミド誘導体を用いた場合、ナフ
タレンジイミド誘導体は、二塩基おきに配列して二本鎖
ＤＮＡに飽和している。このことは、ナフタレンジイミ
ド誘導体の二つのフェロセン部分が、それぞれ、二本鎖
ＤＮＡの主溝と副溝とに密に並んだ状態を意味してい
る。このため、ナフタレンジイミド誘導体は、二本鎖Ｄ
ＮＡからの解離速度が極めて遅くなる。ここで、ナフタ
レンジイミド誘導体の二本鎖ＤＮＡへの結合がインター
カレーションモードであることは、二本鎖ＤＮＡにイン
ターカレータを接触させたときに、粘度の変化が認めら
れたことにより決定した。閉環状プラスミド（例えば、
ウイルスＳＶ４０）の場合、インターカレーションが起
こると超らせんの変化に伴って粘度も変化することが知
られている。
て上記のナフタレンジイミド誘導体を用いた場合、ナフ
タレンジイミド誘導体は、二塩基おきに配列して二本鎖
ＤＮＡに飽和している。このことは、ナフタレンジイミ
ド誘導体の二つのフェロセン部分が、それぞれ、二本鎖
ＤＮＡの主溝と副溝とに密に並んだ状態を意味してい
る。このため、ナフタレンジイミド誘導体は、二本鎖Ｄ
ＮＡからの解離速度が極めて遅くなる。ここで、ナフタ
レンジイミド誘導体の二本鎖ＤＮＡへの結合がインター
カレーションモードであることは、二本鎖ＤＮＡにイン
ターカレータを接触させたときに、粘度の変化が認めら
れたことにより決定した。閉環状プラスミド（例えば、
ウイルスＳＶ４０）の場合、インターカレーションが起
こると超らせんの変化に伴って粘度も変化することが知
られている。
【００４１】アナライトとの反応によって還元型に変化
する酸化酵素の存在下で、増感型電流測定用具にアナラ
イトを含む試料溶液を接触させるには、該酸化酵素およ
びアナライトを含有する溶液に増感型電流測定用具を浸
積させることが好ましい。また、アナライトとの反応に
よって還元型に変化する酸化酵素を予め増感型電流測定
用具に含有させた後、該測定用具を該アナライトを含有
する溶液に浸積してもよい。
する酸化酵素の存在下で、増感型電流測定用具にアナラ
イトを含む試料溶液を接触させるには、該酸化酵素およ
びアナライトを含有する溶液に増感型電流測定用具を浸
積させることが好ましい。また、アナライトとの反応に
よって還元型に変化する酸化酵素を予め増感型電流測定
用具に含有させた後、該測定用具を該アナライトを含有
する溶液に浸積してもよい。
【００４２】アナライトは、グルコース、コレステロー
ル、乳酸、Ｌ−グリセロールリン酸もしくはフルクトシ
ルアミノ酸であることが好ましい。この他に、アルコー
ル、コリン、ピルビン酸、シュウ酸、Ｌ−アスコルビン
酸、尿酸、ピラノース等も定量することができる。グル
コースもしくはコレステロールであることがさらに好ま
しい。グルコースであることが特に好ましい。アナライ
トの濃度は、１〜１０ｍＭの範囲にあることが好まし
い。
ル、乳酸、Ｌ−グリセロールリン酸もしくはフルクトシ
ルアミノ酸であることが好ましい。この他に、アルコー
ル、コリン、ピルビン酸、シュウ酸、Ｌ−アスコルビン
酸、尿酸、ピラノース等も定量することができる。グル
コースもしくはコレステロールであることがさらに好ま
しい。グルコースであることが特に好ましい。アナライ
トの濃度は、１〜１０ｍＭの範囲にあることが好まし
い。
【００４３】酸化酵素は、上記のアナライトに対してそ
れぞれ、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキ
シダーゼ、乳酸オキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オ
キシダーゼ、Ｌ−グリセロールリン酸オキシダーゼ、ア
ルコールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、ピルビン
酸オキシダーゼ、シュウ酸オキシダーゼ、Ｌ−アスコル
ビン酸オキシダーゼ、ウリカーゼ、ピラノースオキシダ
ーゼを使用する。酸化酵素の濃度は、１００〜１０００
Ｕの範囲にあることが好ましい。
れぞれ、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキ
シダーゼ、乳酸オキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オ
キシダーゼ、Ｌ−グリセロールリン酸オキシダーゼ、ア
ルコールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、ピルビン
酸オキシダーゼ、シュウ酸オキシダーゼ、Ｌ−アスコル
ビン酸オキシダーゼ、ウリカーゼ、ピラノースオキシダ
ーゼを使用する。酸化酵素の濃度は、１００〜１０００
Ｕの範囲にあることが好ましい。
【００４４】グルコースオキシダーゼは、Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒもしくはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕ
ｍ ｎｏｔａｔｕｍ等由来のものを用いることが好まし
い。
ｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒもしくはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕ
ｍ ｎｏｔａｔｕｍ等由来のものを用いることが好まし
い。
【００４５】コレステロールオキシダーゼは、Ｎｏｃａ
ｒｄｉａ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｒｉｓ、Ｂｒｅｖｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｍｙｃｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ、スエヒロタケ等から得られたものを
用いることが好ましい。
ｒｄｉａ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｒｉｓ、Ｂｒｅｖｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｍｙｃｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ、スエヒロタケ等から得られたものを
用いることが好ましい。
【００４６】乳酸オキシダーゼは、Ａｅｒｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｖｉｒｉｄａｎｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ
等から得られたものを用いることが好ましい。他の酸化
酵素の起源については略すが、それぞれ最適な微生物等
から得られたものを用いることが好ましい。
ｓ ｖｉｒｉｄａｎｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ
等から得られたものを用いることが好ましい。他の酸化
酵素の起源については略すが、それぞれ最適な微生物等
から得られたものを用いることが好ましい。
【００４７】電流量の測定には、電位をかけて流れる電
流を測定できる方法であれば何れの方法も用いることが
できる。サイクリックボルタンメトリー、デファレンシ
ャルパルスボルタンメトリー、ポテンショスタット等が
好ましく用いられる。
流を測定できる方法であれば何れの方法も用いることが
できる。サイクリックボルタンメトリー、デファレンシ
ャルパルスボルタンメトリー、ポテンショスタット等が
好ましく用いられる。
【００４８】
【実施例】［実施例１］ （１）プローブＤＮＡが固定されてなる電極の作成 面積が２．２５ｍｍ2の金電極に、５’−末端にメルカ
プトヘキシル基を有する１５０ピコモルのチミジンの２
０量体（ｄＴ20）； ５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−
３’ の水溶液２μＬを滴下し、プローブＤＮＡを作成した。
実際には、電極２ｍｍ2当たり２０ピコモルのｄＴ20が
固定されたことになる。ｄＴ20の合成および固定化につ
いては、文献（特開平９−２８８０８０号公報）に従っ
て行った。 （２）フェロセン縫い込み型インターカレータの合成 下記式で表されるフェロセン縫い込み型インターカレー
タは、文献（上記公報）に従って合成した。
プトヘキシル基を有する１５０ピコモルのチミジンの２
０量体（ｄＴ20）； ５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−
３’ の水溶液２μＬを滴下し、プローブＤＮＡを作成した。
実際には、電極２ｍｍ2当たり２０ピコモルのｄＴ20が
固定されたことになる。ｄＴ20の合成および固定化につ
いては、文献（特開平９−２８８０８０号公報）に従っ
て行った。 （２）フェロセン縫い込み型インターカレータの合成 下記式で表されるフェロセン縫い込み型インターカレー
タは、文献（上記公報）に従って合成した。
【００４９】
【化８】
【００５０】（３）プローブＤＮＡにハイブリダイズさ
せるＤＮＡの合成 ハイブリダイズさせるＤＮＡとして、下記式で表される
アデニンの２０量体（ｄＡ20）； ５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ−
３’ を合成した。合成法については、上記文献に従った。 （４）グルコース濃度と電流量との関係を示す検量線の
作成 上記（３）で得られたｄＡ20（２８６ピコモル）および
上記式で表されるフェロセン縫い込み型インターカレー
タ（５０μＭ）とを含む０．１Ｍ酢酸／酢酸カリウム水
溶液（ｐＨ５．６）−０．１Ｍ塩化カリウム水溶液の混
合液に、ｄＴ20が固定された金電極を浸し、２５℃で２
０分間インキュベートさせた。インキュベート後、電極
を引き上げ、電極を５秒間、０．１Ｍリン酸二水素ナト
リウム−リン酸水素二ナトリウム水溶液（ｐＨ７．０）
にて洗浄し、遊離のインターカレータおよび未反応のｄ
Ａ20を除去した。次いで、グルコース（１０ｍＭ）およ
びグルコースオキシダーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｇｅｒ由来、和光（株）製（２００Ｕ）を含む０．
１Ｍリン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム
水溶液−０．１Ｍ塩化カリウム水溶液（ｐＨ７．０）の
混合液に、遊離のインターカレータおよび未反応のｄＡ
20を除去して得られた金電極、白金電極および銀／塩化
銀参照電極を浸積して三電極を形成させ、掃引速度１０
ｍＶ／ｓにおいて金電極のサイクリックボルタモグラム
を測定した。この結果を図２に示す。測定は、電位５１
４ｍＶ、スキャン速度２５ｍＶ／秒にて行った。
せるＤＮＡの合成 ハイブリダイズさせるＤＮＡとして、下記式で表される
アデニンの２０量体（ｄＡ20）； ５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ−
３’ を合成した。合成法については、上記文献に従った。 （４）グルコース濃度と電流量との関係を示す検量線の
作成 上記（３）で得られたｄＡ20（２８６ピコモル）および
上記式で表されるフェロセン縫い込み型インターカレー
タ（５０μＭ）とを含む０．１Ｍ酢酸／酢酸カリウム水
溶液（ｐＨ５．６）−０．１Ｍ塩化カリウム水溶液の混
合液に、ｄＴ20が固定された金電極を浸し、２５℃で２
０分間インキュベートさせた。インキュベート後、電極
を引き上げ、電極を５秒間、０．１Ｍリン酸二水素ナト
リウム−リン酸水素二ナトリウム水溶液（ｐＨ７．０）
にて洗浄し、遊離のインターカレータおよび未反応のｄ
Ａ20を除去した。次いで、グルコース（１０ｍＭ）およ
びグルコースオキシダーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｇｅｒ由来、和光（株）製（２００Ｕ）を含む０．
１Ｍリン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム
水溶液−０．１Ｍ塩化カリウム水溶液（ｐＨ７．０）の
混合液に、遊離のインターカレータおよび未反応のｄＡ
20を除去して得られた金電極、白金電極および銀／塩化
銀参照電極を浸積して三電極を形成させ、掃引速度１０
ｍＶ／ｓにおいて金電極のサイクリックボルタモグラム
を測定した。この結果を図２に示す。測定は、電位５１
４ｍＶ、スキャン速度２５ｍＶ／秒にて行った。
【００５１】次に、グルコースおよびグルコースオキシ
ダーゼを存在させなかった以外は、上記記載の方法と同
様にして金電極のサイクリックボルタモグラムを測定し
た。この結果を図２に示す。
ダーゼを存在させなかった以外は、上記記載の方法と同
様にして金電極のサイクリックボルタモグラムを測定し
た。この結果を図２に示す。
【００５２】図２より、グルコースおよびグルコースオ
キシダーゼの存在下で増幅された電流値（実線サイクリ
ックボルタモグラム）は、電位５１４ｍＶにおいて、−
２．９μＡであったのに対し、存在させない場合の電流
（点線サイクリックボルタモグラム）は、−０．１μＡ
（基本電流とする）であった。従って、還元型に変化し
たグルコースオキシダーゼと電極との間の電子移動によ
って増幅した電流は、−２．８μＡであることが分かっ
た。
キシダーゼの存在下で増幅された電流値（実線サイクリ
ックボルタモグラム）は、電位５１４ｍＶにおいて、−
２．９μＡであったのに対し、存在させない場合の電流
（点線サイクリックボルタモグラム）は、−０．１μＡ
（基本電流とする）であった。従って、還元型に変化し
たグルコースオキシダーゼと電極との間の電子移動によ
って増幅した電流は、−２．８μＡであることが分かっ
た。
【００５３】そこで、グルコース濃度を２、４および６
ｍＭにそれぞれ変える以外は、上記と同様にして、それ
ぞれのサイクリックボルタモグラムを測定した。但し、
電位４８０ｍＶでの電流をピーク電流とし、グルコース
濃度が１０ｍＭである場合についてもサイクリックボル
タモグラムを測定し、電位４８０ｍＶでの電流を求め
た。そして、各グルコース濃度とピーク電流との関係を
示す検量線を作成した。この検量線を図３に示す。
ｍＭにそれぞれ変える以外は、上記と同様にして、それ
ぞれのサイクリックボルタモグラムを測定した。但し、
電位４８０ｍＶでの電流をピーク電流とし、グルコース
濃度が１０ｍＭである場合についてもサイクリックボル
タモグラムを測定し、電位４８０ｍＶでの電流を求め
た。そして、各グルコース濃度とピーク電流との関係を
示す検量線を作成した。この検量線を図３に示す。
【００５４】図３より、２〜１０ｍＭの範囲のグルコー
ス濃度とピーク電流とは良好な直線関係を示すことが分
かった。尚、ピーク電流は、上記の基本電流を差し引い
た値である。この直線関係は、Ｘをグルコース濃度（ｍ
Ｍ）、Ｙをピーク電流（μＡ）とすると下記式（１）： （１） Ｙ＝−１．９４８７−０．１５８２３×（Ｘ） で表され、相関係数は０．９９８６７であった。
ス濃度とピーク電流とは良好な直線関係を示すことが分
かった。尚、ピーク電流は、上記の基本電流を差し引い
た値である。この直線関係は、Ｘをグルコース濃度（ｍ
Ｍ）、Ｙをピーク電流（μＡ）とすると下記式（１）： （１） Ｙ＝−１．９４８７−０．１５８２３×（Ｘ） で表され、相関係数は０．９９８６７であった。
【００５５】上記の結果は、実際に検体を使ってアナラ
イトの定量は行っていないが、臨床医学検査法として血
糖値測定に適用できることを示している。正常人の血糖
値の範囲として知られている４．２〜５．６ｍＭの範囲
のグルコース濃度が充分に測定可能である。
イトの定量は行っていないが、臨床医学検査法として血
糖値測定に適用できることを示している。正常人の血糖
値の範囲として知られている４．２〜５．６ｍＭの範囲
のグルコース濃度が充分に測定可能である。
【００５６】
【発明の効果】本発明により、試料中のグルコースを定
量することができる。本発明は、グルコース以外のアナ
ライト、例えばコレステロール、乳酸、フルクトシルア
ミノ酸、Ｌ−グリセロールリン酸等の定量にも適用する
ことができる。本発明の試料として検体を用いれば、検
体中のグルコース、コレステロール、乳酸、フルクトシ
ルアミノ酸もしくはＬ−グリセロールリン酸に限らず、
過酸化水素を発生する種々のアナライトの定量を行うこ
とも可能であると考えられる。従って、本発明は、臨床
医学検査項目として特に重要な血糖値あるいはコレステ
ロール値の新規な定量方法として利用できる。
量することができる。本発明は、グルコース以外のアナ
ライト、例えばコレステロール、乳酸、フルクトシルア
ミノ酸、Ｌ−グリセロールリン酸等の定量にも適用する
ことができる。本発明の試料として検体を用いれば、検
体中のグルコース、コレステロール、乳酸、フルクトシ
ルアミノ酸もしくはＬ−グリセロールリン酸に限らず、
過酸化水素を発生する種々のアナライトの定量を行うこ
とも可能であると考えられる。従って、本発明は、臨床
医学検査項目として特に重要な血糖値あるいはコレステ
ロール値の新規な定量方法として利用できる。
【図１】電気化学活性縫い込み型インターカレータが、
還元型に変化した酸化酵素と二本鎖ＤＮＡが結合してい
る電極との間の電子移動反応を仲介する模式図である。
還元型に変化した酸化酵素と二本鎖ＤＮＡが結合してい
る電極との間の電子移動反応を仲介する模式図である。
【図２】グルコースおよびグルコースオキシダーゼ存在
下のサイクリックボルタモグラム、並びにグルコースお
よびグルコースオキシダーゼが共に非存在下のサイクリ
ックボルタモグラムである。
下のサイクリックボルタモグラム、並びにグルコースお
よびグルコースオキシダーゼが共に非存在下のサイクリ
ックボルタモグラムである。
【図３】グルコース濃度とピーク電流との関係を示す検
量線である。
量線である。
１１ 電極 ２１ 二本鎖ＤＮＡ ３１ 電気化学活性縫い込み型インターカレータ ４１ 酸化酵素 ５１ アナライト ６１ 酸化されたアナライト
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 27/327 Ｇ０１Ｎ 27/30 ３５１ 27/416 27/46 ３３８ Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QA19 QQ68 QR03 QR32 QR41 QR76 QR84 QS24 QS39 QX04
Claims (6)
- 【請求項１】 二本鎖で構成されているＤＮＡ断片がそ
の一端にて電極に固定されてなるＤＮＡ修飾電極、およ
び電気化学活性縫い込み型インターカレータからなる増
感型電流測定用具に、電位を付与しながら、該測定用具
表面に、アナライトとの反応によって還元型に変化する
酸化酵素の存在下にて、アナライトを含有する試料溶液
を接触させ、その接触により該測定用具に発生する電流
量を測定することからなる試料溶液中のアナライトの定
量方法。 - 【請求項２】 ＤＮＡ修飾電極が、電極上でハイブリダ
イゼーションによって調製されたＤＮＡ断片が電極に固
定されてなるもの、あるいは予め調製されたＤＮＡ断片
が電極に固定されてなるものであることを特徴とする請
求項１に記載のアナライトの定量方法。 - 【請求項３】 アナライトがグルコースであって、その
アナライトとの反応によって還元型に変化する酸化酵素
がグルコースオキシダーゼであることを特徴とする請求
項１に記載のアナライトの定量方法。 - 【請求項４】 試料溶液中のグルコースが、１乃至３５
ｍＭの濃度範囲にあることを特徴とする請求項３に記載
のアナライトの定量方法。 - 【請求項５】 電気化学活性縫い込み型インターカレー
タが酸化還元活性を有する化合物であることを特徴とす
る請求項１に記載のアナライトの定量方法。 - 【請求項６】 電気化学活性縫い込み型インターカレー
タが、フェロセン修飾電気化学活性縫い込み型インター
カレータであることを特徴とする請求項１に記載のアナ
ライトの定量方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11001111A JP2000199754A (ja) | 1999-01-06 | 1999-01-06 | 増感型電流測定用具を用いるアナライトの定量方法 |
| US09/477,973 US6261780B1 (en) | 1999-01-06 | 2000-01-05 | Quantitative analysis of biochemical compound utilizing electrochemical reaction |
| EP00100126A EP1018646A3 (en) | 1999-01-06 | 2000-01-07 | Quantitative analysis of biochemical compound utilizing electrochemical reaction |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11001111A JP2000199754A (ja) | 1999-01-06 | 1999-01-06 | 増感型電流測定用具を用いるアナライトの定量方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000199754A true JP2000199754A (ja) | 2000-07-18 |
Family
ID=11492371
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11001111A Pending JP2000199754A (ja) | 1999-01-06 | 1999-01-06 | 増感型電流測定用具を用いるアナライトの定量方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000199754A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006506644A (ja) * | 2002-11-15 | 2006-02-23 | アプレラ コーポレイション | 核酸配列検出 |
-
1999
- 1999-01-06 JP JP11001111A patent/JP2000199754A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006506644A (ja) * | 2002-11-15 | 2006-02-23 | アプレラ コーポレイション | 核酸配列検出 |
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