JP2000329738A - 増感型電流測定用具を用いるコレステロールの定量方法 - Google Patents
増感型電流測定用具を用いるコレステロールの定量方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 試料中のコレステロールの定量方法を提供す
ること。 【解決手段】 二本鎖で構成されているＤＮＡ断片がそ
の一端にて電極表面に固定されてなるＤＮＡ修飾電極、
および該ＤＮＡ断片に縫い込まれている電気化学活性縫
い込み型インターカレータからなる増感型電流測定用具
の表面に、電位を付与しながら、コレステロールオキシ
ダーゼの存在下にて、コレステロールを含有する試料溶
液を接触させ、その接触により該測定用具に発生する電
流量を測定することからなる試料溶液中のコレステロー
ルの定量方法。
ること。 【解決手段】 二本鎖で構成されているＤＮＡ断片がそ
の一端にて電極表面に固定されてなるＤＮＡ修飾電極、
および該ＤＮＡ断片に縫い込まれている電気化学活性縫
い込み型インターカレータからなる増感型電流測定用具
の表面に、電位を付与しながら、コレステロールオキシ
ダーゼの存在下にて、コレステロールを含有する試料溶
液を接触させ、その接触により該測定用具に発生する電
流量を測定することからなる試料溶液中のコレステロー
ルの定量方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、増感型電流測定用
具を用いる試料溶液中のコレステロールの定量方法に関
する。
具を用いる試料溶液中のコレステロールの定量方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】コレステロールは、ヒトでは体のほとん
どの細胞に存在し、リポ蛋白や生体膜の構成成分として
細胞の機能を維持し、胆汁酸や各種ホルモンの原料とな
るなどの重要な生理的役割を担っている。コレステロー
ルは、血清中ではリポ蛋白（主に、高比重リポ蛋白およ
び低比重リポ蛋白）の形で存在しており、血清コレステ
ロール値の正常値は、１２０〜２２０ｍｇ／ｄＬである
が、コレステロール含有量の多い食品を食べ過ぎると血
清コレステロール量が増え、動脈硬化を促進する。ま
た、低比重リポ蛋白の値が１７０ｍｇ／ｄＬを超えると
食事指導が必要とされている。
どの細胞に存在し、リポ蛋白や生体膜の構成成分として
細胞の機能を維持し、胆汁酸や各種ホルモンの原料とな
るなどの重要な生理的役割を担っている。コレステロー
ルは、血清中ではリポ蛋白（主に、高比重リポ蛋白およ
び低比重リポ蛋白）の形で存在しており、血清コレステ
ロール値の正常値は、１２０〜２２０ｍｇ／ｄＬである
が、コレステロール含有量の多い食品を食べ過ぎると血
清コレステロール量が増え、動脈硬化を促進する。ま
た、低比重リポ蛋白の値が１７０ｍｇ／ｄＬを超えると
食事指導が必要とされている。
【０００３】全血、血漿、血清、尿、リンパ液、髄液等
に含まれるコレステロールの定量には、他のアナライト
（グルコース、尿素窒素、尿酸、総ビリルビン、アンモ
ニア、ヘモグロビン、中性脂肪、総蛋白等）と同様に、
従来から一般的に湿式法と乾式法とが利用されている。
現在では、測定の簡便性、迅速性の点で乾式法が主流で
ある。乾式法では、発色した色素の濃度を主に比色法に
よって測定し、アナライトを定量する。特開昭６０−１
１１９６０号、特開昭６０−８２８５９号、特開平４−
３２４３４７号、特開平４−３２４３４７号等の各公報
には、乾式法による種々のアナライトの測定方法および
測定用具が開示されており、コレステロールについても
数種類の方法および用具が開示され、そのいくつかは既
に実用化されている。
に含まれるコレステロールの定量には、他のアナライト
（グルコース、尿素窒素、尿酸、総ビリルビン、アンモ
ニア、ヘモグロビン、中性脂肪、総蛋白等）と同様に、
従来から一般的に湿式法と乾式法とが利用されている。
現在では、測定の簡便性、迅速性の点で乾式法が主流で
ある。乾式法では、発色した色素の濃度を主に比色法に
よって測定し、アナライトを定量する。特開昭６０−１
１１９６０号、特開昭６０−８２８５９号、特開平４−
３２４３４７号、特開平４−３２４３４７号等の各公報
には、乾式法による種々のアナライトの測定方法および
測定用具が開示されており、コレステロールについても
数種類の方法および用具が開示され、そのいくつかは既
に実用化されている。
【０００４】しかし、既に実用化されているコレステロ
ールの測定方法においては、何れも測定に専用の測定装
置を必要とする。また、その装置は、個人が家庭で使用
できるような簡易なものではなく、また、その方法の中
には、迅速性や簡便性の点で充分であるとは言い難いも
のもある。
ールの測定方法においては、何れも測定に専用の測定装
置を必要とする。また、その装置は、個人が家庭で使用
できるような簡易なものではなく、また、その方法の中
には、迅速性や簡便性の点で充分であるとは言い難いも
のもある。
【０００５】一方、バイオセンサと呼ばれる、生体の持
つ優れた検知能力を真似したり、直接生体を利用して特
定の化学物質を検出する素子が知られている。バイオセ
ンサの基本構成は、一般的には分子認識能を有する生体
関連物質をその活性を維持させたまま固定した生体機能
性膜と、生体関連物質、微生物等が引き起こす物理化学
的な現象を電気信号に変換するトランスデューサーとか
らなっている。生体関連物質としては、基質、微生物、
酵素、組織・オルガネラ、補酵素、ビタミン、抗生物
質、抗原、抗体等が用いられ、生体機能性膜は、生体関
連物質識別部位と固定膜とからなる。バイオセンサは、
特定成分のみを測定できる選択性、そして簡便性および
迅速性を有し、医療のみならず、食品管理、発酵工業、
環境保全、生化学研究などに広汎に利用されている。
つ優れた検知能力を真似したり、直接生体を利用して特
定の化学物質を検出する素子が知られている。バイオセ
ンサの基本構成は、一般的には分子認識能を有する生体
関連物質をその活性を維持させたまま固定した生体機能
性膜と、生体関連物質、微生物等が引き起こす物理化学
的な現象を電気信号に変換するトランスデューサーとか
らなっている。生体関連物質としては、基質、微生物、
酵素、組織・オルガネラ、補酵素、ビタミン、抗生物
質、抗原、抗体等が用いられ、生体機能性膜は、生体関
連物質識別部位と固定膜とからなる。バイオセンサは、
特定成分のみを測定できる選択性、そして簡便性および
迅速性を有し、医療のみならず、食品管理、発酵工業、
環境保全、生化学研究などに広汎に利用されている。
【０００６】バイオセンサの一つとして、血液中のグル
コース濃度を簡単に測定できる測定用具である、グルコ
ースオキシダーゼを利用するグルコースセンサが既に実
用化されている。グルコースセンサにおいては、グルコ
ースオキシダーゼがグルコースを酸化した際に、グルコ
ン酸と共に生ずる過酸化水素を過酸化水素電極等で電気
信号に変換してグルコース濃度を決定する。また、グル
コースセンサ以外に実用化されているものとしては、ス
クロースセンサ、乳酸センサ、ピルビン酸センサ、Ｌ−
グルタミン酸センサ、尿素センサ、資化糖センサ、酢酸
センサ、エタノールセンサ、ビタミンＢ12センサ、アン
モニアセンサおよびＢＯＤ（生物化学的酸素要求量）セ
ンサがある。しかし、コレステロールセンサについて
は、未だ実用化されているものがない。コレステロール
についても、従来の湿式法あるいは乾式法とは異なった
迅速かつ手軽な定量方法の一つとして、コレステロール
センサおよびコレステロールセンサを用いる定量方法の
開発が求められている。
コース濃度を簡単に測定できる測定用具である、グルコ
ースオキシダーゼを利用するグルコースセンサが既に実
用化されている。グルコースセンサにおいては、グルコ
ースオキシダーゼがグルコースを酸化した際に、グルコ
ン酸と共に生ずる過酸化水素を過酸化水素電極等で電気
信号に変換してグルコース濃度を決定する。また、グル
コースセンサ以外に実用化されているものとしては、ス
クロースセンサ、乳酸センサ、ピルビン酸センサ、Ｌ−
グルタミン酸センサ、尿素センサ、資化糖センサ、酢酸
センサ、エタノールセンサ、ビタミンＢ12センサ、アン
モニアセンサおよびＢＯＤ（生物化学的酸素要求量）セ
ンサがある。しかし、コレステロールセンサについて
は、未だ実用化されているものがない。コレステロール
についても、従来の湿式法あるいは乾式法とは異なった
迅速かつ手軽な定量方法の一つとして、コレステロール
センサおよびコレステロールセンサを用いる定量方法の
開発が求められている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、新規なコレ
ステロールセンサを用いる試料中のコレステロールの定
量方法を提供することにある。
ステロールセンサを用いる試料中のコレステロールの定
量方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者の研究により、
二本鎖で構成されているＤＮＡ断片がその一端にて電極
表面に固定されてなるＤＮＡ修飾電極、および該ＤＮＡ
断片に縫い込まれている電気化学活性縫い込み型インタ
ーカレータからなる増感型電流測定用具の表面に、電位
を付与しながら、コレステロールオキシダーゼの存在下
にて、コレステロールを含有する試料溶液を接触させ、
その接触により該測定用具に発生する電流量を測定する
ことからなる試料溶液中のコレステロールの定量方法が
上記の課題を解決できることが判明した。
二本鎖で構成されているＤＮＡ断片がその一端にて電極
表面に固定されてなるＤＮＡ修飾電極、および該ＤＮＡ
断片に縫い込まれている電気化学活性縫い込み型インタ
ーカレータからなる増感型電流測定用具の表面に、電位
を付与しながら、コレステロールオキシダーゼの存在下
にて、コレステロールを含有する試料溶液を接触させ、
その接触により該測定用具に発生する電流量を測定する
ことからなる試料溶液中のコレステロールの定量方法が
上記の課題を解決できることが判明した。
【０００９】本発明のコレステロールの定量方法の好ま
しい態様は、以下の通りである。 （１）ＤＮＡ修飾電極が、電極上でハイブリダイゼーシ
ョンによって調製されたＤＮＡ断片が電極に固定されて
なるもの、あるいは予め調製されたＤＮＡ断片が電極に
固定されてなるものであることを特徴とするコレステロ
ールの定量方法。 （２）電気化学活性縫い込み型インターカレータが、酸
化還元活性を有するフェロセン修飾電気化学活性縫い込
み型インターカレータであることを特徴とするコレステ
ロールの定量方法。
しい態様は、以下の通りである。 （１）ＤＮＡ修飾電極が、電極上でハイブリダイゼーシ
ョンによって調製されたＤＮＡ断片が電極に固定されて
なるもの、あるいは予め調製されたＤＮＡ断片が電極に
固定されてなるものであることを特徴とするコレステロ
ールの定量方法。 （２）電気化学活性縫い込み型インターカレータが、酸
化還元活性を有するフェロセン修飾電気化学活性縫い込
み型インターカレータであることを特徴とするコレステ
ロールの定量方法。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明は、後述する増感型検出方
法を利用する定量方法である。さらに、この増感型検出
方法は、以下に説明する、増感効果を特に持たない試料
ＤＮＡ断片の検出方法を応用したものである。増感効果
を特に持たない試料ＤＮＡ断片の検出方法を増感型検出
方法と区別するために「ＤＮＡの非増感型検出方法」と
いう。
法を利用する定量方法である。さらに、この増感型検出
方法は、以下に説明する、増感効果を特に持たない試料
ＤＮＡ断片の検出方法を応用したものである。増感効果
を特に持たない試料ＤＮＡ断片の検出方法を増感型検出
方法と区別するために「ＤＮＡの非増感型検出方法」と
いう。
【００１１】「ＤＮＡの非増感型検出方法」として、Ｄ
ＮＡプローブを電極型センサに適用する方法が知られて
いる（第４７回高分子学会予稿集、ｐ３１５５〜３１５
６（１９９８年））。即ち、出力端子を備えた電極表面
に固定されたＤＮＡプローブに、試料ＤＮＡ断片を電気
化学活性縫い込み型インターカレータ（フェロセン化ナ
フタレンジイミド）の存在下に反応させ、該プローブと
試料ＤＮＡ断片とで形成されるハイブリッドＤＮＡに結
合した該インターカレータの応答電流を測定することに
よって、相補性を有する該試料ＤＮＡ断片を検出・定量
する方法である。また、上記の文献には、ＤＮＡの非増
感型検出方法の条件に、さらに基質（グルコース）およ
びその基質との反応によって還元型に変化する酸化酵素
（グルコースオキシダーゼ）を存在させることによっ
て、高い感度での試料ＤＮＡ断片が検出できる増感型検
出方法についても記載されていいる。
ＮＡプローブを電極型センサに適用する方法が知られて
いる（第４７回高分子学会予稿集、ｐ３１５５〜３１５
６（１９９８年））。即ち、出力端子を備えた電極表面
に固定されたＤＮＡプローブに、試料ＤＮＡ断片を電気
化学活性縫い込み型インターカレータ（フェロセン化ナ
フタレンジイミド）の存在下に反応させ、該プローブと
試料ＤＮＡ断片とで形成されるハイブリッドＤＮＡに結
合した該インターカレータの応答電流を測定することに
よって、相補性を有する該試料ＤＮＡ断片を検出・定量
する方法である。また、上記の文献には、ＤＮＡの非増
感型検出方法の条件に、さらに基質（グルコース）およ
びその基質との反応によって還元型に変化する酸化酵素
（グルコースオキシダーゼ）を存在させることによっ
て、高い感度での試料ＤＮＡ断片が検出できる増感型検
出方法についても記載されていいる。
【００１２】図１は、ＤＮＡの増感型検出方法の原理を
示す代表的な模式図である。二本鎖で構成されているＤ
ＮＡ断片（２１）が電極（１１）表面にその一端にて固
定されてなるＤＮＡ修飾電極、および該ＤＮＡ断片（２
１）に縫い込まれている電気化学活性縫い込み型インタ
ーカレータ（３１）からなる増感型電流測定用具に、電
位を付与すると、電流は該インターカレータ（３１）の
フェロセン分子間を流れる。上記の増感型電流測定用具
は、該ＤＮＡ断片（２１）に縫い込まれるべき相当量の
電気化学活性縫い込み型インターカレータ（３１）の縫
い込みが完了していないものであってもよい。増感型電
流測定用具に電位を付与後、ここに、酸化酵素（４１）
およびその対象となるアナライト（５１）を含む試料溶
液を接触させると、アナライト（５１）はその酸化体
（６１）に変換される。電位の付与は、酸化酵素（４
１）およびその対象となるアナライト（５１）を含む試
料溶液を増感型電流測定用具に接触後に行ってもよい。
酸化酵素が還元型に変化すると共に発生する電子がフェ
ロセン分子の方向へ移動することにより、フェロセン分
子間を流れる電流は増幅される。この増幅された電流量
が試料溶液中のアナライト（５１）の量に相当する。
示す代表的な模式図である。二本鎖で構成されているＤ
ＮＡ断片（２１）が電極（１１）表面にその一端にて固
定されてなるＤＮＡ修飾電極、および該ＤＮＡ断片（２
１）に縫い込まれている電気化学活性縫い込み型インタ
ーカレータ（３１）からなる増感型電流測定用具に、電
位を付与すると、電流は該インターカレータ（３１）の
フェロセン分子間を流れる。上記の増感型電流測定用具
は、該ＤＮＡ断片（２１）に縫い込まれるべき相当量の
電気化学活性縫い込み型インターカレータ（３１）の縫
い込みが完了していないものであってもよい。増感型電
流測定用具に電位を付与後、ここに、酸化酵素（４１）
およびその対象となるアナライト（５１）を含む試料溶
液を接触させると、アナライト（５１）はその酸化体
（６１）に変換される。電位の付与は、酸化酵素（４
１）およびその対象となるアナライト（５１）を含む試
料溶液を増感型電流測定用具に接触後に行ってもよい。
酸化酵素が還元型に変化すると共に発生する電子がフェ
ロセン分子の方向へ移動することにより、フェロセン分
子間を流れる電流は増幅される。この増幅された電流量
が試料溶液中のアナライト（５１）の量に相当する。
【００１３】以下、増感型電流測定用具を用いるコレス
テロールの定量方法について詳述する。
テロールの定量方法について詳述する。
【００１４】本発明では、図１に従って、コレステロー
ルの濃度を以下のようにして求めることができる。該Ｄ
ＮＡ修飾電極および該インターカレータからなる増感型
電流測定用具に、アナライトとしてコレステロールを、
酸化酵素としてコレステロールオキシダーゼを接触させ
ることによって、二本鎖ＤＮＡ断片に結合したインター
カレータを流れる電流量Ａ1を測定する。そして、別
に、二本鎖ＤＮＡ断片が固定されてなる電極に、コレス
テロールおよびコレステロールオキシダーゼは接触させ
ず、電気化学活性縫い込み型インターカレータのみを接
触させたときの電流量Ａ2（基本電流量）を測定する。
この基本電流量は、前記記載の非増感型検出方法によっ
て得られる電流量である。よって、電流量Ａ1と電流量
Ａ2との差が、コレステロールオキシダーゼが還元型に
変化したときに発生する電子が運ぶ電流量、即ちコレス
テロールの濃度に対応する電流量Ａ3である。
ルの濃度を以下のようにして求めることができる。該Ｄ
ＮＡ修飾電極および該インターカレータからなる増感型
電流測定用具に、アナライトとしてコレステロールを、
酸化酵素としてコレステロールオキシダーゼを接触させ
ることによって、二本鎖ＤＮＡ断片に結合したインター
カレータを流れる電流量Ａ1を測定する。そして、別
に、二本鎖ＤＮＡ断片が固定されてなる電極に、コレス
テロールおよびコレステロールオキシダーゼは接触させ
ず、電気化学活性縫い込み型インターカレータのみを接
触させたときの電流量Ａ2（基本電流量）を測定する。
この基本電流量は、前記記載の非増感型検出方法によっ
て得られる電流量である。よって、電流量Ａ1と電流量
Ａ2との差が、コレステロールオキシダーゼが還元型に
変化したときに発生する電子が運ぶ電流量、即ちコレス
テロールの濃度に対応する電流量Ａ3である。
【００１５】コレステロール濃度が未知の生物試料（全
血、血漿、血清、尿、リンパ液、髄液等）の濃度を決定
することができる。即ち、濃度が既知の互いに異なる三
点以上の標準液をそれぞれ増感型電流測定用具に付し、
そのときのそれぞれの電流量を測定し、コレステロール
の濃度と電流量Ａ3との関係を示す検量線を作成する。
次いで、測定対象の、濃度が未知のコレステロールを含
む試料溶液の電流量を測定し、この値を上記検量線と照
合することによってコレステロールの濃度を決定するこ
とができる。
血、血漿、血清、尿、リンパ液、髄液等）の濃度を決定
することができる。即ち、濃度が既知の互いに異なる三
点以上の標準液をそれぞれ増感型電流測定用具に付し、
そのときのそれぞれの電流量を測定し、コレステロール
の濃度と電流量Ａ3との関係を示す検量線を作成する。
次いで、測定対象の、濃度が未知のコレステロールを含
む試料溶液の電流量を測定し、この値を上記検量線と照
合することによってコレステロールの濃度を決定するこ
とができる。
【００１６】電極としては、二本鎖ＤＮＡ断片を固定で
きるものであれば何れも用いることができ、金、グラシ
ーカーボン、炭素等を用いることが好ましく、金を用い
ることが特に好ましい。電極の数は、二以上の複数であ
れば特に制限されない。
きるものであれば何れも用いることができ、金、グラシ
ーカーボン、炭素等を用いることが好ましく、金を用い
ることが特に好ましい。電極の数は、二以上の複数であ
れば特に制限されない。
【００１７】二本鎖ＤＮＡ断片としては、電極上で調製
したハイブリッドＤＮＡ、あるいは予め調製した二本鎖
ＤＮＡ断片の何れも用いることができる。ハイブリッド
ＤＮＡとしては、一本鎖ＤＮＡ断片を電極に固定してな
るＤＮＡ修飾電極に、一本鎖の試料ＤＮＡ断片を接触さ
せて得られる。ハイブリッドＤＮＡの二本鎖の形成度は
特に制限されない。予め調製した二本鎖ＤＮＡ断片とし
ては、生物試料から抽出したＤＮＡ、遺伝子操作によっ
て作成したＤＮＡ等を制限酵素で切断し、次いで電気泳
動による分離操作等で精製したＤＮＡ断片を用いること
が好ましい。また、一本鎖の合成オリゴヌクレオチドお
よび該ヌクレオチドと相補性を示す一本鎖の合成オリゴ
ヌクレオチドを用いて二本鎖ＤＮＡ断片を形成させたも
のを用いてもよい。電極に固定されてなる二本鎖ＤＮＡ
断片の濃度は、電極１ｍｍ2当たり１０-11〜１０-10モ
ルの量の範囲にあることが好ましい。
したハイブリッドＤＮＡ、あるいは予め調製した二本鎖
ＤＮＡ断片の何れも用いることができる。ハイブリッド
ＤＮＡとしては、一本鎖ＤＮＡ断片を電極に固定してな
るＤＮＡ修飾電極に、一本鎖の試料ＤＮＡ断片を接触さ
せて得られる。ハイブリッドＤＮＡの二本鎖の形成度は
特に制限されない。予め調製した二本鎖ＤＮＡ断片とし
ては、生物試料から抽出したＤＮＡ、遺伝子操作によっ
て作成したＤＮＡ等を制限酵素で切断し、次いで電気泳
動による分離操作等で精製したＤＮＡ断片を用いること
が好ましい。また、一本鎖の合成オリゴヌクレオチドお
よび該ヌクレオチドと相補性を示す一本鎖の合成オリゴ
ヌクレオチドを用いて二本鎖ＤＮＡ断片を形成させたも
のを用いてもよい。電極に固定されてなる二本鎖ＤＮＡ
断片の濃度は、電極１ｍｍ2当たり１０-11〜１０-10モ
ルの量の範囲にあることが好ましい。
【００１８】一本鎖ＤＮＡ断片、および該断片とハイブ
リダイズする試料ＤＮＡ断片としては、何れも生物試料
から抽出したＤＮＡ、遺伝子操作によって作成したＤＮ
Ａ等を制限酵素で切断し、次いで電気泳動による分離等
で精製したＤＮＡ断片、あるいは化学合成で得られた一
本鎖のＤＮＡ断片を用いることができる。生物試料から
抽出したＤＮＡ等の場合には、熱処理あるいはアルカリ
処理によって、一本鎖のＤＮＡ断片に解離させておくこ
とが好ましい。
リダイズする試料ＤＮＡ断片としては、何れも生物試料
から抽出したＤＮＡ、遺伝子操作によって作成したＤＮ
Ａ等を制限酵素で切断し、次いで電気泳動による分離等
で精製したＤＮＡ断片、あるいは化学合成で得られた一
本鎖のＤＮＡ断片を用いることができる。生物試料から
抽出したＤＮＡ等の場合には、熱処理あるいはアルカリ
処理によって、一本鎖のＤＮＡ断片に解離させておくこ
とが好ましい。
【００１９】制限酵素で切断を受けた試料ＤＮＡ断片
は、複数個の試料ＤＮＡ断片となるが、ＤＮＡ断片との
接触に使用される試料ＤＮＡ断片は、一個であっても複
数個であってもよい。試料ＤＮＡ断片は、ＤＮＡ修飾電
極１ｍｍ2当たり１０-10〜１０ -9モルの範囲の量で用い
ることが好ましい。
は、複数個の試料ＤＮＡ断片となるが、ＤＮＡ断片との
接触に使用される試料ＤＮＡ断片は、一個であっても複
数個であってもよい。試料ＤＮＡ断片は、ＤＮＡ修飾電
極１ｍｍ2当たり１０-10〜１０ -9モルの範囲の量で用い
ることが好ましい。
【００２０】二本鎖ＤＮＡ断片は、電極に固定する。固
定方法としては、公知の方法が用いられる。電極が金で
ある場合、予め調製した二本鎖ＤＮＡ断片の片方の鎖の
５’もしくは３’末端（好ましくは、５’末端）にチオ
ール基を導入し、金とイオウとの配位結合を介して、該
ＤＮＡ断片を電極に固定する。該ＤＮＡ断片にチオール
基を導入する方法は、文献（Ｍ．Ｍａｅｄａ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１８０５〜１８０８（１
９９４）およびＢ．Ａ．Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３，４４８４（１９８
５））に記載されている。電極上で二本鎖ＤＮＡ断片を
調製する場合には、電極に固定されている一本鎖ＤＮＡ
断片の５’もしくは３’末端（好ましくは、５’末端）
にチオール基を導入する。実際には、チオール基を有す
る二本鎖ＤＮＡ断片もしくは一本鎖ＤＮＡ断片を金電極
に滴下し、所定の温度（好ましくは、室温）下で数時間
放置すると二本鎖ＤＮＡ断片もしくは一本鎖ＤＮＡ断片
が電極に固定される。
定方法としては、公知の方法が用いられる。電極が金で
ある場合、予め調製した二本鎖ＤＮＡ断片の片方の鎖の
５’もしくは３’末端（好ましくは、５’末端）にチオ
ール基を導入し、金とイオウとの配位結合を介して、該
ＤＮＡ断片を電極に固定する。該ＤＮＡ断片にチオール
基を導入する方法は、文献（Ｍ．Ｍａｅｄａ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１８０５〜１８０８（１
９９４）およびＢ．Ａ．Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３，４４８４（１９８
５））に記載されている。電極上で二本鎖ＤＮＡ断片を
調製する場合には、電極に固定されている一本鎖ＤＮＡ
断片の５’もしくは３’末端（好ましくは、５’末端）
にチオール基を導入する。実際には、チオール基を有す
る二本鎖ＤＮＡ断片もしくは一本鎖ＤＮＡ断片を金電極
に滴下し、所定の温度（好ましくは、室温）下で数時間
放置すると二本鎖ＤＮＡ断片もしくは一本鎖ＤＮＡ断片
が電極に固定される。
【００２１】電極がグラシーカーボンである場合、グラ
シーカーボンを過マンガン酸カリウムで酸化することに
よって、電極表面にカルボン酸基を導入する。二本鎖Ｄ
ＮＡ断片もしくは一本鎖ＤＮＡ断片は、アミド結合によ
り電極表面に固定される。実際の固定方法については、
文献（Ｋ．Ｍ．Ｍｉｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ
ｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６５，２３１７〜
２３２３（１９９３））に詳細が記載されている。
シーカーボンを過マンガン酸カリウムで酸化することに
よって、電極表面にカルボン酸基を導入する。二本鎖Ｄ
ＮＡ断片もしくは一本鎖ＤＮＡ断片は、アミド結合によ
り電極表面に固定される。実際の固定方法については、
文献（Ｋ．Ｍ．Ｍｉｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ
ｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６５，２３１７〜
２３２３（１９９３））に詳細が記載されている。
【００２２】電気化学活性縫い込み型インターカレータ
は、ＤＮＡ修飾電極を該インターカレータを含む溶液に
浸積する方法、あるいはＤＮＡ修飾電極上に該インター
カレータを含む溶液を滴下する方法によってＤＮＡ修飾
電極に接触させることができる。必要であれば、室温〜
４０℃の温度範囲でインキュベーションを行ってもよ
い。接触後は電極を洗浄し、遊離のインターカレータを
除去しておくことが好ましい。該インターカレータは、
１０ｎＭ〜１０ｍＭの濃度範囲で用いることが好まし
く、０．０５〜５ｍＭの濃度範囲で用いることがさらに
好ましく、０．０５〜０．５ｍＭの濃度範囲で用いるこ
とが特に好ましい。
は、ＤＮＡ修飾電極を該インターカレータを含む溶液に
浸積する方法、あるいはＤＮＡ修飾電極上に該インター
カレータを含む溶液を滴下する方法によってＤＮＡ修飾
電極に接触させることができる。必要であれば、室温〜
４０℃の温度範囲でインキュベーションを行ってもよ
い。接触後は電極を洗浄し、遊離のインターカレータを
除去しておくことが好ましい。該インターカレータは、
１０ｎＭ〜１０ｍＭの濃度範囲で用いることが好まし
く、０．０５〜５ｍＭの濃度範囲で用いることがさらに
好ましく、０．０５〜０．５ｍＭの濃度範囲で用いるこ
とが特に好ましい。
【００２３】電極上でハイブリッドＤＮＡを調製する場
合には、電気活性縫い込み型インターカレータは、一本
鎖のＤＮＡ断片と一本鎖の試料ＤＮＡ断片とのハイブリ
ダイゼーションの速度を促進する効果を有すると共に、
形成されたハイブリッドＤＮＡに高い特異性で結合し、
ハイブリッドＤＮＡを安定化させる効果を有する。この
とき、該インターカレータとハイブリッドＤＮＡとの複
合体は、一次元マトリックスを支持体とした擬ポリフェ
ロセンポリマー（フェロセン分子の擬ポリマー）と見な
される。このポリマー配列化が、還元型に変化したコレ
ステロールオキシダーゼと電極との間の電子移動反応を
可能にしていると考えられる。ハイブリッドＤＮＡが形
成されない場合には、該インターカレータは、一本鎖の
ＤＮＡ断片には結合しないか、あるいは一旦結合しても
すぐに解離して遊離のインターカレータとなる。予め調
製した二本鎖ＤＮＡ断片を用いる場合にも、該インター
カレータが電極に固定された該二本鎖ＤＮＡ断片に結合
することによって、該二本鎖ＤＮＡ断片を安定化し、ま
た、形成したフェロセン分子の擬ポリマーが電子移動反
応を可能にしている点は上記と同様である。
合には、電気活性縫い込み型インターカレータは、一本
鎖のＤＮＡ断片と一本鎖の試料ＤＮＡ断片とのハイブリ
ダイゼーションの速度を促進する効果を有すると共に、
形成されたハイブリッドＤＮＡに高い特異性で結合し、
ハイブリッドＤＮＡを安定化させる効果を有する。この
とき、該インターカレータとハイブリッドＤＮＡとの複
合体は、一次元マトリックスを支持体とした擬ポリフェ
ロセンポリマー（フェロセン分子の擬ポリマー）と見な
される。このポリマー配列化が、還元型に変化したコレ
ステロールオキシダーゼと電極との間の電子移動反応を
可能にしていると考えられる。ハイブリッドＤＮＡが形
成されない場合には、該インターカレータは、一本鎖の
ＤＮＡ断片には結合しないか、あるいは一旦結合しても
すぐに解離して遊離のインターカレータとなる。予め調
製した二本鎖ＤＮＡ断片を用いる場合にも、該インター
カレータが電極に固定された該二本鎖ＤＮＡ断片に結合
することによって、該二本鎖ＤＮＡ断片を安定化し、ま
た、形成したフェロセン分子の擬ポリマーが電子移動反
応を可能にしている点は上記と同様である。
【００２４】電気化学活性縫い込み型インターカレータ
は、酸化還元活性を有する物質であり、かつＤＮＡ断片
の二本鎖に縫い込まれる構造を有する物質であることが
好ましい。酸化還元活性部分としては、フェロセン化合
物、カテコールアミン化合物、金属ビピリジン錯体、金
属フェナントロリン錯体あるいはビオローゲン化合物で
あることが好ましく、フェロセン化合物であることが特
に好ましい。縫い込み型インターカレータ部分として
は、ナフタレンジイミド、アントラセン、アントラキノ
ン等であることが好ましい。従って、電気化学活性縫い
込み型インターカレータは、フェロセンカルボン酸Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミドエステルと対応するアミン体
との反応により合成される、下記式で表されるフェロセ
ン化ナフタレンジイミド誘導体（Ｓ．Ｔａｋｅｎａｋａ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｏｍｍｕ
ｎ．，１１１１（１９９８））であることが好ましい。
は、酸化還元活性を有する物質であり、かつＤＮＡ断片
の二本鎖に縫い込まれる構造を有する物質であることが
好ましい。酸化還元活性部分としては、フェロセン化合
物、カテコールアミン化合物、金属ビピリジン錯体、金
属フェナントロリン錯体あるいはビオローゲン化合物で
あることが好ましく、フェロセン化合物であることが特
に好ましい。縫い込み型インターカレータ部分として
は、ナフタレンジイミド、アントラセン、アントラキノ
ン等であることが好ましい。従って、電気化学活性縫い
込み型インターカレータは、フェロセンカルボン酸Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミドエステルと対応するアミン体
との反応により合成される、下記式で表されるフェロセ
ン化ナフタレンジイミド誘導体（Ｓ．Ｔａｋｅｎａｋａ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｏｍｍｕ
ｎ．，１１１１（１９９８））であることが好ましい。
【００２５】
【化１】
【００２６】また、下記式で表されるフェロセン化ナフ
タレンジイミド誘導体も好ましく用いられる。
タレンジイミド誘導体も好ましく用いられる。
【００２７】
【化２】
【００２８】但し、Ａは下記式で表されるフェロセン誘
導体である。
導体である。
【００２９】
【化３】
【００３０】
【化４】
【００３１】
【化５】
【００３２】
【化６】
【００３３】電気活性縫い込み型インターカレータに
は、酸化還元活性部分と縫い込み型インターカレータ部
分とを繋ぐリンカー部分がある。上記式で表される１，
４−ジプロピルピペラジン基がリンカー部分に相当す
る。このピペラジン基の代わりに、二価の四級アミン基
を導入することもできる。四級アミン基を導入した下記
式で表される化合物は、反応溶液中のｐＨに関わらずカ
チオン性となるために、二本鎖ＤＮＡとより強く結合す
る。リンカー部分に相当する基としては、上記のものに
限定されない。リンカー部分に相当する基の構造によっ
て、フェロセン分子の酸化還元電位が異なる。
は、酸化還元活性部分と縫い込み型インターカレータ部
分とを繋ぐリンカー部分がある。上記式で表される１，
４−ジプロピルピペラジン基がリンカー部分に相当す
る。このピペラジン基の代わりに、二価の四級アミン基
を導入することもできる。四級アミン基を導入した下記
式で表される化合物は、反応溶液中のｐＨに関わらずカ
チオン性となるために、二本鎖ＤＮＡとより強く結合す
る。リンカー部分に相当する基としては、上記のものに
限定されない。リンカー部分に相当する基の構造によっ
て、フェロセン分子の酸化還元電位が異なる。
【００３４】
【化７】
【００３５】電気活性縫い込み型インターカレータとし
て上記のナフタレンジイミド誘導体を用いた場合、ナフ
タレンジイミド誘導体は、二塩基おきに配列して二本鎖
ＤＮＡ断片に飽和している。このことは、ナフタレンジ
イミド誘導体の二つのフェロセン部分が、それぞれ、二
本鎖ＤＮＡ断片の主溝と副溝とに密に並んだ状態（「イ
ンターカレーションモード」という。）を意味してい
る。このため、ナフタレンジイミド誘導体は、二本鎖Ｄ
ＮＡ断片からの解離速度が極めて遅くなる。ここで、ナ
フタレンジイミド誘導体の二本鎖ＤＮＡ断片への結合が
インターカレーションモードであることは、例えば、二
本鎖ＤＮＡ断片にインターカレータを接触させたとき
に、粘度の変化が認められることにより決定することが
できる。実際に、二本鎖ＤＮＡ断片が閉環状プラスミド
（例えば、ウイルスＳＶ４０）である場合、この閉環状
プラスミドにインターカレーションが起こると、超らせ
んの変化に伴って粘度も変化することが知られている。
て上記のナフタレンジイミド誘導体を用いた場合、ナフ
タレンジイミド誘導体は、二塩基おきに配列して二本鎖
ＤＮＡ断片に飽和している。このことは、ナフタレンジ
イミド誘導体の二つのフェロセン部分が、それぞれ、二
本鎖ＤＮＡ断片の主溝と副溝とに密に並んだ状態（「イ
ンターカレーションモード」という。）を意味してい
る。このため、ナフタレンジイミド誘導体は、二本鎖Ｄ
ＮＡ断片からの解離速度が極めて遅くなる。ここで、ナ
フタレンジイミド誘導体の二本鎖ＤＮＡ断片への結合が
インターカレーションモードであることは、例えば、二
本鎖ＤＮＡ断片にインターカレータを接触させたとき
に、粘度の変化が認められることにより決定することが
できる。実際に、二本鎖ＤＮＡ断片が閉環状プラスミド
（例えば、ウイルスＳＶ４０）である場合、この閉環状
プラスミドにインターカレーションが起こると、超らせ
んの変化に伴って粘度も変化することが知られている。
【００３６】コレステロールとの反応によって還元型に
変化するコレステロールオキシダーゼの存在下で、増感
型電流測定用具にコレステロールを含む試料溶液を接触
させるには、コレステロールおよびコレステロールオキ
シダーゼを含有する溶液に増感型電流測定用具を浸積す
ることが好ましい。また、コレステロールオキシダーゼ
を予め増感型電流測定用具に含有させたものを、コレス
テロールを含む試料溶液に浸積してもよい。
変化するコレステロールオキシダーゼの存在下で、増感
型電流測定用具にコレステロールを含む試料溶液を接触
させるには、コレステロールおよびコレステロールオキ
シダーゼを含有する溶液に増感型電流測定用具を浸積す
ることが好ましい。また、コレステロールオキシダーゼ
を予め増感型電流測定用具に含有させたものを、コレス
テロールを含む試料溶液に浸積してもよい。
【００３７】電気化学活性縫い込み型インターカレータ
を含む溶液、およびコレステロールとコレステロールオ
キシダーゼとを含む溶液は、何れもその塩濃度が０．１
〜０．９Ｍの範囲にあることが好ましい。
を含む溶液、およびコレステロールとコレステロールオ
キシダーゼとを含む溶液は、何れもその塩濃度が０．１
〜０．９Ｍの範囲にあることが好ましい。
【００３８】コレステロールオキシダーゼは、Ｎｏｃａ
ｒｄｉａ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｒｉｓ、Ｂｒｅｖｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｍｙｃｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ、スエヒロタケ等由来のものを用いる
ことが好ましく、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｅｒｙｔｈｒｏｐ
ｏｒｉｓ由来のものを用いることが特に好ましい。コレ
ステロールオキシダーゼは、１０〜１０００Ｕの量の範
囲で用いることが好ましい。
ｒｄｉａ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｒｉｓ、Ｂｒｅｖｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｍｙｃｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ、スエヒロタケ等由来のものを用いる
ことが好ましく、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｅｒｙｔｈｒｏｐ
ｏｒｉｓ由来のものを用いることが特に好ましい。コレ
ステロールオキシダーゼは、１０〜１０００Ｕの量の範
囲で用いることが好ましい。
【００３９】本発明は、コレステロールが１〜５００ｍ
Ｍの濃度範囲にある試料溶液について実施することが好
ましい。
Ｍの濃度範囲にある試料溶液について実施することが好
ましい。
【００４０】電流量の測定には、電位をかけて流れる電
流を測定できる方法であれば何れの方法も用いることが
でき、サイクリックボルタンメトリー、リニアスィープ
ボルタンメトリー、デファレンシャルパルスボルタンメ
トリー、ポテンショスタット等を用いることがさらに好
ましく、サイクリックボルタンメトリーを用いることが
特に好ましい。増感型検出方法における電流量の増幅の
割合は、スキャン速度がその一因となるため、スキャン
の速度は、１ｍＶ／ｓｅｃ以下であることが好ましい。
流を測定できる方法であれば何れの方法も用いることが
でき、サイクリックボルタンメトリー、リニアスィープ
ボルタンメトリー、デファレンシャルパルスボルタンメ
トリー、ポテンショスタット等を用いることがさらに好
ましく、サイクリックボルタンメトリーを用いることが
特に好ましい。増感型検出方法における電流量の増幅の
割合は、スキャン速度がその一因となるため、スキャン
の速度は、１ｍＶ／ｓｅｃ以下であることが好ましい。
【００４１】
【実施例】［実施例１］ （１）ＤＮＡ修飾電極の作製 面積が２．２５ｍｍ2の金電極に、５’末端にメルカプ
トヘキシル基を有するチミンの２０量体（ＨＳ−ｄ
Ｔ20）（７５ピコモル／μＬ）の水溶液２μＬを滴下し
た。室温で２時間放置した後、超純水で洗浄し、ＤＮＡ
修飾電極を作製した。滴下前のＨＳ−ｄＴ20の水溶液お
よび放置後に回収したＨＳ−ｄＴ20の水溶液をＨＰＬＣ
（高速液体クロマトグラフィー）に付すことによって、
そのピーク量より、電極２．２５ｍｍ2当たり２０ピコ
モルの量のＨＳ−ｄＴ20が固定されたことを確認した。
ｄＴ20およびＨＳ−ｄＴ20の合成については、文献（特
開平９−２８８０８０号公報）に記載の方法に従って行
った。
トヘキシル基を有するチミンの２０量体（ＨＳ−ｄ
Ｔ20）（７５ピコモル／μＬ）の水溶液２μＬを滴下し
た。室温で２時間放置した後、超純水で洗浄し、ＤＮＡ
修飾電極を作製した。滴下前のＨＳ−ｄＴ20の水溶液お
よび放置後に回収したＨＳ−ｄＴ20の水溶液をＨＰＬＣ
（高速液体クロマトグラフィー）に付すことによって、
そのピーク量より、電極２．２５ｍｍ2当たり２０ピコ
モルの量のＨＳ−ｄＴ20が固定されたことを確認した。
ｄＴ20およびＨＳ−ｄＴ20の合成については、文献（特
開平９−２８８０８０号公報）に記載の方法に従って行
った。
【００４２】（２）フェロセン縫い込み型インターカレ
ータの合成 下記式で表されるフェロセン縫い込み型インターカレー
タは、上記公報に記載の方法に従って合成した。
ータの合成 下記式で表されるフェロセン縫い込み型インターカレー
タは、上記公報に記載の方法に従って合成した。
【００４３】
【化８】
【００４４】（３）試料ＤＮＡ断片の合成 試料ＤＮＡ断片として、アデニンの２０量体（ｄＡ20）
を上記公報に記載の方法に従って合成した。
を上記公報に記載の方法に従って合成した。
【００４５】（４）ＤＮＡ修飾電極上のＤＮＡ断片と試
料ＤＮＡ断片とのハイブリダイゼーション、および電気
化学測定 上記（３）で得られたｄＡ20（２８６ピコモル）および
上記（２）のフェロセン縫い込み型インターカレータ
（５０μＭ）とを含む０．１Ｍ酢酸／酢酸カリウム水溶
液（ｐＨ５．６）−０．１Ｍ塩化カリウム水溶液の混合
液に、（１）のＤＮＡ修飾電極を浸し、２５℃で２０分
間インキュベートした。インキュベート後、該修飾電極
を引き上げ、このものを５秒間、０．１Ｍリン酸二水素
ナトリウム−リン酸水素二ナトリウム水溶液（ｐＨ７．
０）にて洗浄し、遊離のインターカレータおよび未反応
のｄＡ20を除去した。次いで、コレステロール（６４ｍ
ｇ／ｄＬ）およびコレステロールオキシダーゼ（Ｎｏｃ
ａｒｄｉａ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｒｉｓ由来、和光
（株）製）（２０Ｕ）を含む０．１Ｍリン酸二水素ナト
リウム／リン酸水素二ナトリウム水溶液−０．１Ｍ塩化
カリウム水溶液（ｐＨ７．０）の混合液に、遊離のイン
ターカレータおよび未反応のｄＡ20を除去して得られた
上記修飾電極（作用極）、白金電極（対極）および銀／
塩化銀参照電極を浸積して三電極を形成させ、掃引速度
１０ｍＶ／秒においてサイクリックボルタモグラムを測
定した。測定は、スキャン速度１ｍＶ／秒にて行った。
料ＤＮＡ断片とのハイブリダイゼーション、および電気
化学測定 上記（３）で得られたｄＡ20（２８６ピコモル）および
上記（２）のフェロセン縫い込み型インターカレータ
（５０μＭ）とを含む０．１Ｍ酢酸／酢酸カリウム水溶
液（ｐＨ５．６）−０．１Ｍ塩化カリウム水溶液の混合
液に、（１）のＤＮＡ修飾電極を浸し、２５℃で２０分
間インキュベートした。インキュベート後、該修飾電極
を引き上げ、このものを５秒間、０．１Ｍリン酸二水素
ナトリウム−リン酸水素二ナトリウム水溶液（ｐＨ７．
０）にて洗浄し、遊離のインターカレータおよび未反応
のｄＡ20を除去した。次いで、コレステロール（６４ｍ
ｇ／ｄＬ）およびコレステロールオキシダーゼ（Ｎｏｃ
ａｒｄｉａ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｒｉｓ由来、和光
（株）製）（２０Ｕ）を含む０．１Ｍリン酸二水素ナト
リウム／リン酸水素二ナトリウム水溶液−０．１Ｍ塩化
カリウム水溶液（ｐＨ７．０）の混合液に、遊離のイン
ターカレータおよび未反応のｄＡ20を除去して得られた
上記修飾電極（作用極）、白金電極（対極）および銀／
塩化銀参照電極を浸積して三電極を形成させ、掃引速度
１０ｍＶ／秒においてサイクリックボルタモグラムを測
定した。測定は、スキャン速度１ｍＶ／秒にて行った。
【００４６】コレステロールの濃度を１９０、３４０ｍ
ｇ／ｄＬにそれぞれ変える以外は上記と同様な操作を行
い、それぞれのサイクリックボルタモグラムを測定し
た。
ｇ／ｄＬにそれぞれ変える以外は上記と同様な操作を行
い、それぞれのサイクリックボルタモグラムを測定し
た。
【００４７】（５）コレステロールの濃度とピーク応答
電流値との関係を示す検量線の作成 上記（４）おける各サイクリックボルタモグラムより、
それぞれのピーク応答電流の値を求め、コレステロール
の濃度とピーク応答電流値との関係を示す検量線を作成
した（図２）。但し、図２の各応答電流値は、基本電流
の値（コレステロールおよびコレステロールオキシダー
ゼを存在させない以外は、上記（４）と同様の操作を行
って得られた応答電流の値であり、約−０．１μＡであ
る）を差し引いた値である。図２より、６４〜３４０ｍ
Ｍの範囲のコレステロールの濃度とピーク応答電流値と
は良好な直線関係を示すことが分かる。
電流値との関係を示す検量線の作成 上記（４）おける各サイクリックボルタモグラムより、
それぞれのピーク応答電流の値を求め、コレステロール
の濃度とピーク応答電流値との関係を示す検量線を作成
した（図２）。但し、図２の各応答電流値は、基本電流
の値（コレステロールおよびコレステロールオキシダー
ゼを存在させない以外は、上記（４）と同様の操作を行
って得られた応答電流の値であり、約−０．１μＡであ
る）を差し引いた値である。図２より、６４〜３４０ｍ
Ｍの範囲のコレステロールの濃度とピーク応答電流値と
は良好な直線関係を示すことが分かる。
【００４８】上記の結果は、臨床医学検査法として本発
明がコレステロール値の測定に適用できることを示して
おり、正常人のコレステロール値として知られている１
２０〜２２０ｍＭの範囲のコレステロールの濃度が充分
に測定できる。
明がコレステロール値の測定に適用できることを示して
おり、正常人のコレステロール値として知られている１
２０〜２２０ｍＭの範囲のコレステロールの濃度が充分
に測定できる。
【００４９】
【発明の効果】本発明において、実際にコレステロール
を含有する血清を用いれば、血清中のコレステロールを
迅速、かつ簡便に定量することが可能である。従って、
本発明は、臨床医学検査項目として特に重要なコレステ
ロール値の新規な定量方法として充分に利用できるもの
であり、コレステロールオキシダーゼを固定化酵素とす
ることができれば繰り返し使用できる優れたコレステロ
ールセンサの開発に繋がる。
を含有する血清を用いれば、血清中のコレステロールを
迅速、かつ簡便に定量することが可能である。従って、
本発明は、臨床医学検査項目として特に重要なコレステ
ロール値の新規な定量方法として充分に利用できるもの
であり、コレステロールオキシダーゼを固定化酵素とす
ることができれば繰り返し使用できる優れたコレステロ
ールセンサの開発に繋がる。
【図１】電気化学活性縫い込み型インターカレータが、
還元型に変化した酸化酵素とＤＮＡ修飾電極との間の電
子移動反応を仲介する模式図である。
還元型に変化した酸化酵素とＤＮＡ修飾電極との間の電
子移動反応を仲介する模式図である。
【図２】コレステロールの濃度とピーク応答電流との関
係を示す検量線である。
係を示す検量線である。
１１ 電極 ２１ 二本鎖ＤＮＡ断片 ３１ 電気化学活性縫い込み型インターカレータ ４１ 酸化酵素 ５１ アナライト ６１ アナライトの酸化体
Claims (3)
- 【請求項１】 二本鎖で構成されているＤＮＡ断片がそ
の一端にて電極表面に固定されてなるＤＮＡ修飾電極、
および該ＤＮＡ断片に縫い込まれている電気化学活性縫
い込み型インターカレータからなる増感型電流測定用具
の表面に、電位を付与しながら、コレステロールオキシ
ダーゼの存在下にて、コレステロールを含有する試料溶
液を接触させ、その接触により該測定用具に発生する電
流量を測定することからなる試料溶液中のコレステロー
ルの定量方法。 - 【請求項２】 ＤＮＡ修飾電極が、電極上でハイブリダ
イゼーションによって調製されたＤＮＡ断片が電極に固
定されてなるもの、あるいは予め調製されたＤＮＡ断片
が電極に固定されてなるものであることを特徴とする請
求項１に記載のコレステロールの定量方法。 - 【請求項３】 電気化学活性縫い込み型インターカレー
タが、酸化還元活性を有するフェロセン修飾電気化学活
性縫い込み型インターカレータであることを特徴とする
請求項１に記載のコレステロールの定量方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11143599A JP2000329738A (ja) | 1999-05-24 | 1999-05-24 | 増感型電流測定用具を用いるコレステロールの定量方法 |
| US09/477,973 US6261780B1 (en) | 1999-01-06 | 2000-01-05 | Quantitative analysis of biochemical compound utilizing electrochemical reaction |
| EP00100126A EP1018646A3 (en) | 1999-01-06 | 2000-01-07 | Quantitative analysis of biochemical compound utilizing electrochemical reaction |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11143599A JP2000329738A (ja) | 1999-05-24 | 1999-05-24 | 増感型電流測定用具を用いるコレステロールの定量方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000329738A true JP2000329738A (ja) | 2000-11-30 |
Family
ID=15342479
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11143599A Pending JP2000329738A (ja) | 1999-01-06 | 1999-05-24 | 増感型電流測定用具を用いるコレステロールの定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000329738A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10138470B2 (en) | 2014-10-28 | 2018-11-27 | Amano Enzyme Inc. | Mutated enzyme having dehydrogenase activity and use thereof |
-
1999
- 1999-05-24 JP JP11143599A patent/JP2000329738A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10138470B2 (en) | 2014-10-28 | 2018-11-27 | Amano Enzyme Inc. | Mutated enzyme having dehydrogenase activity and use thereof |
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