JP4381819B2 - 核酸プローブとその合成および使用 - Google Patents
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Description
Mc−NR’−C(=O)−X−(Ar)n−(L)m−R (XI)
式中、Mcは、メタロセニル基であって、各環は個別に置換されていても無置換でも。良く、このメタロセニル基は、鉄、クロム、コバルト、オスミウム、ルテニウム、ニッケルおよびチタンからなる群から選ばれる金属イオンを含み、
R’は、Hまたは低級アルキルであり、
Xは、NR’またはOの何れかであり、
Arは、置換されたまたは無置換のアリール基であり、
nは、0または1であり、
Lは、リンカー基であり、
mは、0または1であり、
Rは、標識される原子団を示し、脱離基(a leaving group)を含む原子団である。
材料と方法−オリゴヌクレオチドの調製と検定
オリゴヌクレオチドは、シグマジェンソシス(Sigma Gensosys)から入手した。オリゴヌクレオチドは全て脱塩されたものを用い、それ以上の精製は行わなかった。N,N’−ジメチルホルムアミド(DMF)(99.8%A.C.S.試薬)および酢酸亜鉛二水和物(99.999%)は、アルドリッチ(Aldrich)から入手した。
ブドウ糖−6−ホスファターゼと、中位鎖のアシルCoAデヒドロゲナーゼプライマーとプローブのオリゴヌクレオチド配列は、2000年刊行のクニヒロフジイ、ヨーイチマツバラ、ジュンアカヌマ、カズトシタカハシ、シゲオクレ、ヨーイチスズキ、マスエイマイズミ、カズイエイイヌマ、オサムサカツメ、ピエロ・リナルド(Piero Rinaldo)、クニアキナリサワ著、「ヒト突然変異(Human Mutation)」の189〜196頁に開示されている。
プローブ
BAPR:ATG CCC TCC CCC ATG CCA TCC TGC GT
C9-T1BAPR:T(C9)G CCC TCC CCC ATG CCA TCC TGC GT
(T(C9)=C9リンカーを持つアミノ変性チミン、式IV)
プライマー
BAF:CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ATG G
BAR:TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT ACG A
BAFR:CAG GTC CCG GCC AGC CAG
プローブ
C282YP:ATA TAC GTG CCA GGT GGA
プライマー
C282YF:CTG GAT AAC TTG GCT GTA C
C282YR:TCA GTC ACA TAC CCC AGA T
プローブ
H63DP:ATA TAC GTG CCA GGT GGA
プライマー
H63DF:CTT GGT CTT TCC TTG TTT GAA G
H63DR:ACA TCT GGC TTG AAA TTC TAC T
プライマー
CFT01:AGG CCT AGT TGT CTT ACA GTC CT
CFT03:TGC CCC CTA ATT TGT TAC TTC
プローブ
GSDPR:TGT GGA TGT GGC TGA AAG TTT CTG AAC
プライマー
GSDw:CCG ATG GCG AAG CTG AAC
GSDcom:TGC TTT CTT CCA CTC AGG CA
プローブ
MC11PR:CTA GAA TGA GTT ACC AGA GAG GAG CTT GG
プライマー
MC11w:GCT GGC TGA AAT GGC AAT GA
MC11com:CTG CAC AGC ATC AGT AGC TAA CTG A
reHP:CAG AAT ACA GCA GGT GCT CGC CCG GGC GAG CAC
CTG TAT TCT G
reBAF:CAG AAT ACA GCA GGT TCA CCC ACA CTG TGC CCA
TCT ACG A
以下の電極と小容量セルは、英国、チェシャー、コンレントン(Congleton, Cheshire,UK)のBASから入手した。
本実施例は、以下の実施例3〜5および8〜10で採用する循環式ボルタンメトリー法(cyclic voltammetry method)を説明する。
フェロセンカルボン酸(303mg、1.32mmol)と、N−ヒドロキシスクシンイミド(170mg、1.47mmol)をジオキサン(15ml)に溶解し、この溶液を、ジオキサン(3ml)にジシクロヘキシルカルボジイミド(305mg、1.48mmol)を溶かした溶液に攪拌下に加える。得られた混合物を室温で24時間攪拌して沈殿物を生成させた。沈殿物を濾過して除去し、濾液から溶剤を真空除去し、残った固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに掛け、ワセリン対酢酸エチル=8:2で溶離させて精製した。収量は320gで、収率は74%であった。
凍結乾燥させたアミノ変性オリゴヌクレオチドを正確な量のK2CO3/KHCO3緩衝液(500mM、pH9.0)で再水和し、オリゴヌクレオチド濃度を0.5nmol/μlとした。このアミノ変性オリゴヌクレオチド(40μl、0.5nmol/μl)を、フェロセンカルボン酸のN−ヒドロキシスクシンイミドエステルのDMF(40μl、375mM)溶液に、渦状にゆっくり添加した。次に、この溶液を室温で一晩振盪した。その後、これを酢酸アンモニウム(920μl、100mM、pH7.0)で稀釈し、2個のNAP10カラムを使用し、最初に酢酸アンモニウム(100mM、pH7.0)で溶離し、次に高圧滅菌脱イオン水で溶離することで精製した。フェロセニルオリゴヌクレオチドをNAP10カラムで部分的に精製して、塩類と低分子量フェロセン種を除去し、フェロセン標識されたオリゴヌクレオチドと、標識されていないオリゴヌクレオチドの混合物を得た。使用前にこれ以上の精製を行わなかった。
構造および付着部位が異なる4種のリンカー構造、すなわち、C7、C6、C12、T(C9)を有するアミノ変性オリゴヌクレオチドを、標識化反応に使用した。C6、C12およびT(C9)リンカーは、末端のリン酸エステルまたは塩基を介して、オリゴヌクレオチドの5’末端に付着した。C7リンカーは、末端のリン酸エステルを介してオリゴヌクレオチドの3’末端に付着した。それらの構造を式I〜IVに示す。溶出液のオリゴヌクレオチド濃度は、260nmでの吸光度を計測して測定した。フェロセン標識の存在は、ボルタンメトリック分析で確認された。
S1ヌクレア−ゼの消化
オリゴヌクレオチドの消化反応液(100μl)には、オリゴヌクレオチド(3.5〜9μM、濃度は後述)、酢酸アンモニウム(250mM、pH6.5)、酢酸亜鉛(4.5mM)およびS1ヌクレア−ゼ(0.4U/μl)が含まれていた。消化反応は、37℃で1時間インキュベートした。オリゴヌクレオチドの完全消化は、粗製の反応混合物のアリコット10μlをポリアクリルアミドゲルで分析して確認した。ボルタンメトリック分析に先立って、複数回の反応液を蓄積し、最終容量を200μlとした。
比較のため、反応混合物からS1ヌクレア−ゼを除去した以外は、上と同様な"無酵素"の消化実験を行った。また、予め95℃で15分間加熱して熱変性させたS1ヌクレア−ゼを使用した上と同様な比較実験も行った。
オリゴヌクレオチド:7炭素スペーサー原子団を持つフェロセンによって、3’末端が標識化されたBAPRオリゴヌクレオチド(式I)
オリゴヌクレオチドの濃度:7.0μM
ボルタンメトリー条件:間隔時間を0.09s、変調時間が0.5sと変更した以外は、表1と同じ。
オリゴヌクレオチド:6炭素スペーサー原子団を持つフェロセンによって5’末端で標識化されたBAPRオリゴヌクレオチド(式II)
オリゴヌクレオチドの濃度:7.0μM
ボルタンメトリー条件:間隔時間を0.09s、変調時間を0.5sとした以外は、表1と同じ。
オリゴヌクレオチド:9炭素スペーサー原子団を持つフェロセンによって3’末端で標識化されたTIBAPRオリゴヌクレオチド(式IV)
オリゴヌクレオチドの濃度:8.8μM
ボルタンメトリー条件:表1と同じ
オリゴヌクレオチド:12炭素スペーサー原子団を持つフェロセンによって5’末端で標識化されたBAPRオリゴヌクレオチド(式III)
オリゴヌクレオチドの濃度:7.0μM
ボルタンメトリー条件:間隔時間を0.09s、変調時間を0.5sとした以外は表1と同じ
オリゴヌクレオチド:12炭素スペーサー原子団を持つフェロセンによって5’末端で標識化されたGSDPRオリゴヌクレオチド(式III)
オリゴヌクレオチドの濃度:3.5μM
ボルタンメトリー条件:表1と同じ
オリゴヌクレオチド:12炭素スペーサー原子団を持つフェロセンによって5’末端で標識化されたMCllPRオリゴヌクレオチド(式III)
オリゴヌクレオチドの濃度:3.5μM
ボルタンメトリー条件:表1と同じ
オリゴヌクレオチド:無標識のBAFR
オリゴヌクレオチドの濃度:8.8μM
ボルタンメトリー条件:表1と同じ
オリゴヌクレオチド:9炭素スペーサー原子団を持つフェロセンによって5’末端で標識化されたTlBAPRオリゴヌクレオチド(式IV)
オリゴヌクレオチドの濃度:8.8μM
ボルタンメトリー条件:表1と同じ
ヒトゲノムDNA(100μl反応につき40ng)またはゲル精製PCRアンプリコンからPCR増幅を行った。後続の増幅に使用したPCRアンプリコンは、提供されている手順書に従い、ヌクレオスピン抽出セット(Nucleospin Extract kits)(マチェリー・ナゲル:Macherey-Nagel)を用いてアガロースゲルで精製した。全てのフェロセニルオリゴヌクレオチドプローブは、3’位でリン酸エステル化されていた。
オリゴヌクレオチド:12炭素スペーサー原子団の5’末端が標識化されたBAPRオリゴヌクレオチド(式III)
陽性反応:(βアクチン)テンプレート:βアクチンPCRアンプリコン;プライマー:BAF、BAR
陰性反応:(嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子)テンプレート:嚢胞性線維症PCRアンプリコン;プライマー:CFT01、CFT03
ボルタンメトリー条件:表1と同じ
図10a 陰性反応、陰極掃引、ピークは観察されなかった
図10b 陽性反応、陰極掃引、ピーク位置:493mV、ピーク高さ:19.4nA
図10c 陰性反応、陽極掃引、ピークは観察されなかった
図10d 陽性反応、陽極掃引、ピーク位置:373mV、ピーク高さ:27.3nA
オリゴヌクレオチド:12炭素スペーサー原子団の5’末端が標識化されたMCllPRオリゴヌクレオチド(式III)
陽性反応:(中位鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼ)テンプレート:MCADPCRアンプリコンまたはゲノムテンプレート;プライマー:MC11w、MC11com
陰性反応:(グルコース−6−リン酸ホスファターゼ)テンプレート:グルコース−6−リン酸ホスファターゼPCRアンプリコン;プライマー:GSDw、GSDcom
図11a 陰性反応、陽極掃引、ピーク位置:429mV、ピーク高さ:1.84nA
図11b 陽性反応(PCRアンプリコンテンプレート)、陽極掃引、ピーク位置:388mV、ピーク高さ:7.62nA
図11c 陽性反応(ゲノムテンプレート)、陽極掃引、ピーク位置:409mV、ピーク高さ:8.11nA
オリゴヌクレオチド:9炭素スペーサー原子団の5’末端が標識化されたTlBAPRオリゴヌクレオチド
陽性反応:(βアクチン)テンプレート:ヒトゲノムDNA;プライマー:BAF、BAR
陰性反応:(グルコース−6−リン酸ホスファターゼ)テンプレート:ヒトゲノムDNA;プライマー:GSDw、GSDcom
ボルタンメトリー条件:表1と同じ
図12a 陰性反応、陽極掃引
図12b 陽性反応、陽極掃引、ピーク位置:429mV、ピーク高さ:36nA
図12c 陰性反応、陰極掃引
図12d 陽性反応、陰極掃引、ピーク位置:498mV、ピーク高さ:14nA
オリゴヌクレオチド:12炭素スペーサー原子団の5’末端が標識化されたGSDPRオリゴヌクレオチド
陽性反応:(グルコース−6−リン酸ホスファターゼ)テンプレート:ヒトゲノムDNA;プライマー:GSDw、GSDcom
陰性反応:(βアクチン)テンプレート:ヒトゲノムDNA;プライマー:BAF、BAR
図13a 性反応、陽極掃引
図13b 陽性反応、陽極掃引、ピーク位置:439mV、ピーク高さ:23nA
図13c 陰性反応、陰極掃引
図13d 陽性反応、陰極掃引
フェロセンカルボン酸を塩化オキサリルとアジ化ナトリウムに反応させてフェロセンカルボニルアジドを調製した。
ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)(194mg、0.939mmol、1.14当量)を、無水1,4−ジオキサン(2ml)に溶解し、これを窒素雰囲気下で清浄な丸底フラスコに収め、さらに、N−ヒドロキシスクシンイミド(108mg、0.939mmol、1.14当量)を加えた。4−(3’−フェロセニルウレイド)−1−安息香酸(300mg、0.823mmol、1.0当量)を、無水1,4−ジオキサン(13ml)に溶解し、前記のフラスコに滴下し、溶液を23時間室温で攪拌した。赤/オレンジの反応混合物からブフナー濾過で少量の薄褐色結晶を除去した。反応混合物に水(100ml)と酢酸エチル(50ml)を加え、酢酸エチル相を分離し、水相を酢酸エチル(100ml)で抽出した。2つ酢酸エチル相を併せて、硫酸ナトリウムで乾燥し、真空で濃縮することで、オレンジ色のオイル状粗製生成物を得た。シリカフラッシュクロマトグラフィーを用い、酢酸エチル60/石油エーテル(bp40〜60℃)40から酢酸エチルへの勾配系にて、前記の粗製生成物を精製した。真空乾燥により、4−(3’−フェロセニルレイド)−1−安息香酸のN−ヒドロキシスクシンイミドエステルを、オレンジ色の微細結晶(237mg、66%)の形で得た。Rf(酢酸エチル/石油エーテル5:1(bp=40〜60℃)=0.41、1H−NMRδ(300MHz,d6−DSMO)、2.88(4H,s,Hh)、3.98(2H,t,J=1.8Hz,Hc)、4.16(5H,s,Ha)、4.55(2H,t,J=1.8Hz,Hb)、7.68(2H,m,Hf)、8.00(2H,m,Hg)、8.11(1H,s,Hd)、9.16(1H,s,He)、13C−NMRδ(75.5MHz,d6−DSMO)、25.9(Cl)、61.1、64.2(CbとCc)、69.1(Ca)、117.7(Cg)、131.9(Ch)、170.9(Ck)、MS(FAB+m/z)462.07[M+H]。
5nmol/μl濃度のオリゴヌクレオチドを得るのに適量のK2CO3/KHCO3緩衝液(500mM、pH9.0)にて、凍結乾燥したアミノ変性変異オリゴヌクレオチドを再水和した。アミノ変性オリゴヌクレオチド(40μl、0.5nmolμl−1)を、フェロセン活性エステルのDMSO溶液(40μl、375mM)に、渦巻状に徐々に添加した。得られた溶液を室温で一晩攪拌し、その後、酢酸アンモニウム(920μl、100mM、pH7.0)で稀釈し、2個のNAP10カラムを使用して精製(提示された手順に従う)し、初めに酢酸アンモニウム(100mM、pH7.0)で溶離させ、次に加圧滅菌した脱イオン水で溶離させた。溶離液のオリゴヌクレオチド濃度は260nmで吸光度を測定した。ボルタンメトリック分析でフェロセン標識の存在を確認した。
4−(3’−フェロセニルウレイド)−1−安息香酸標識化基質/プローブと、表2に記載のボルタンメトリーパラメーターを用いて、実施例4と実施例5を繰り返した。試薬濃度は全て、実施例4、5に記載したものと同じである。4−(3’−フェロセニルレウイド)−1−安息香酸ヌクレオチドのピーク電位は、フェロセン標識化ヌクレオチドと比較して低い。これにより電気化学的マーカーの検出感度が高まる。実施例8の実験では、従って、実施例4と5で行った試料の濃縮を行う必要はなく、手順は大幅に簡素化された。実施例8の結果(記載省略)は、試料の濃縮プロセスを省いても、高感度であることを示すものであった。
200μlのヘアピンオリゴヌクレオチドと、200μlの一本鎖オリゴヌクレオチドを、それぞれ濃度7μMの1xT7反応緩衝液を充填した別々の反応チューブに添加した。T7酵素を各チューブに添加し(5μl、2U/μl)、混合物を25℃で1時間インキュベートした。オリゴは両方とも予めC12リンカーを介してフェロセンで標識化されている。
図16aのラインA ヘアピンオリゴヌクレオチド二本鎖の消化
図16aのラインB ヘアピンオリゴヌクレオチド、無酵素対照
図16bのラインA 一本鎖オリゴヌクレオチドの消化
図16bのラインB 一本鎖オリゴヌクレオチドの無酵素対照
実施例10(a) 5’フェロセン化プライマー及びT7エクソヌクレアーゼ消化を用いるPCR増幅
ヒトゲノムDNA(100μl反応につきl40ng)からPCR増幅を実行した。個々の反応で使用するプライマー、テンプレートおよびプローブは、結果の欄に詳述する。100μlの反応液に含まれたのは、トリスHCl(15mM、pH8.0)、塩化カリウム(50mM)、塩化マグネシウム(3.5mM)、dATP、TTP、dCTP、dGTP(各200μM)、5’フェロセン化フォワードプライマー(0.5μM)、リバースプライマー(0.5μM)、アンプリタックゴールドポリメラーゼ(0.1Uμl−1)、BSA(0.1mgμl−1)である。各試料は95℃で10分間インキュベートされ(初期変性および酵素活性)、その後、95℃で15秒間の変性と、60℃で1分間のプライマーのアニーリングおよび伸長を40サイクル繰り返した。試料を即座に25℃に冷却し、25℃で5分間インキュベートした。T7エクソヌクレアーゼ(5μl、2Uμl−1)を粗製のPCR混合物に添加してさらに20分間インキュベートした。
100μl反応液を2つ調製し、ボルタンメトリック分析に先駆けてプールした。
フォワードプライマー:C12リンカーを介してフェロセン化されたMW11w
リバースプライマー:MC11com
図17aのラインA MCAD PCR増幅陽性
図17aのラインB MCAD PCR無タック陰性対照
図17bのラインAおよびB 基線修正データを付した以外は、図17aと同じ
PCR増幅を上述したとおりに行った。PCRを完成させるのに、試料を95℃で2分間加熱し、この間にフェロセン化したオリゴヌクレオチドプローブを添加した(最終濃度0.5μM)。試料を25℃に冷却し、25℃で5分間インキュベートした。T7エクソヌクレアーゼ(5μl、2Uμl−1)を粗製PCR混合物に添加し、試料をさらに20分間インキュベートした。
100μl反応を2つ調製し、ボルタンメトリック分析に先駆けてプールした。
βアクチンPCR増幅
ラインAは、陽性PCR標的増幅反応を示し、ラインBは、全て無標的増幅対照を示す。
プローブ:C12リンカーを介してフェロセン化したBAPR
フォワード標的増幅プライマー:BAF
リバース標的増幅プライマー:BAR
フォワード無標的増幅プライマー:GSDF
リバース無標的増幅プライマー:GSDR
図18a 標準データ、陽極掃引
図18b 基線修正データ、陽極掃引
ラインAは、陽性PCR標的増幅反応を示し、ラインBは、全て無標的増幅対照を示す。
プローブ:C12リンカーを介してフェロセン化したH63DP
フォワード標的増幅プライマー:H63DF
リバース標的増幅プライマー:H63DR
フォワード無標的増幅プライマー:C282YF
リバース無標的増幅プライマー:C282YR
図19a 標準データ、陽極掃引
図19b 基線修正データ、陽極掃引
ラインAは、陽性PCR標的増幅反応を示し、ラインBは全て、無標的増幅対照を示す。
プローブ:C12リンカーを介してフェロセン化したC282YP
フォワード標的増幅プライマー:C282YF
リバース標的増幅プライマー:C282YR
フォワード無標的増幅プライマー:H63DF
リバース無標的増幅プライマー:H63DR
図20a 標準データ、陽極掃引
図20b 基線修正データ、陽極掃引
アンプリタックゴールドDNAポリメラーゼおよび供給緩衝液を、アンプリタックDNAポリメラーゼシュトッフェルフラグメントおよび供給緩衝液に変更した以外、前項で述べたとおりにPCR、プローブアニーリングおよびT7エクソヌクレアーゼ消化を行った。
HFE遺伝子PCR増幅
ラインAは陽性、PCR標的増幅反応を示し、ラインBは全て、無標的増幅対照を示す。
プローブ:C12リンカーを介してフェロセン化したC282YP
フォワード標的増幅プライマー:C282YF
リバース標的増幅プライマー:C282YR
フォワード無標的増幅プライマー: H63DF
リバース無標的増幅プライマー:H63DR
図21a 標準データ、陽極掃引
図21b 基線修正データ、陽極掃引
アンプリタックゴールドDNAポリメラーゼを使用して実施例9cで述べたとおりにPCRおよびプローブアニーリングを行った。T7エクソヌクレアーゼはPCR混合物に添加しなかった。
結果は以下のとおりである:
HFE遺伝子PCR増幅
ラインAは、陽性PCR標的増幅反応を示し、ラインBは全て、無標的増幅対照を示す。
プローブ:C12リンカーを介してフェロセン化したC282YP
フォワード標的増幅プライマー:C282YF
リバース標的増幅プライマー:C282YR
フォワード無標的増幅プライマー: H63DF
リバース無標的増幅プライマー:H63DR
図22a 標準データ、陽極掃引
図22b 基線修正データ、陽極掃引
10%のDMSOを含む100mMの塩化ナトリウム水溶液を使用して、濃度10μMと濃度1μMのフェロセンカルボン酸溶液を調製し、同様にして、濃度10μMと、濃度1μMの4−(3’−フェロセニルレイド)−1−安息香酸溶液を調製した。各試料200μlについて、金の作用電極を用い、実施例1に記載した装置にて差分パルス分析を行った。差分パルスの条件は表3に示したものと同じである。ボルタンモグラムを図23に示すが、図23(a)および図23(b)はそれぞれ、10μMおよび1μMのフェロセンカルボン酸のボルタンモグラムである。図23(c)および23(d)はそれぞれ、10μMおよび1μMの4−(3’−フェロセニルレイド)−1−安息香酸のボルタンモグラムを示す。
実施例4に詳述したところに従って、3つのオリゴヌクレオチド消化反応を実施した。反応(a)では、12炭素スペーサー原子団(2.5μM)を持つフェロセンによって5’末端が標識化されたBAPRオリゴヌクレオチドと、12炭素スペーサー原子団(1.5μM)を持つ4−(3’−フェロセニルレイド)−1−安息香酸によって5’末端が標識化されたMC11wオリゴヌクレオチドとを基質に使用した。反応(b)では、12炭素スペーサー原子団(2.5μM)を持つフェロセンによって5’末端が標識化されたBAPRオリゴヌクレオチドを基質に用いた。反応(c)では、12炭素スペーサー原子団(1.5μM)を持つ4−(3’−フェロセニルウレイド)−1−安息香酸によって5’末端が標識化されたMCllwオリゴヌクレオチドを基質に使用した。
Claims (47)
- 核酸溶液を電気化学的に活性なマーカーで標識されたオリゴヌクレオチドプローブと接触させ、
前記プローブが核酸溶液中に存在する相補的標的配列と少なくとも部分的にハイブリッド形成する条件を用意し、
ハイブリッド形成された核酸プローブ、部分的にハイブリッド形成された核酸プローブまたはハイブリッド形成されていない核酸プローブの何れかを、酵素にて選択的に分解し、
電気化学的に活性なマーカーに関係する情報を電気化学的に測定することを包含する核酸の探索方法。 - 前記のマーカーに関係する情報を、少なくとも1つの核酸種の有無に関する情報を導くために使用する請求項1に記載の方法。
- 分解プローブと非分解プローブの相対的な比率の定量に電気化学的技法を使用する請求項1または2に記載の方法。
- 一本鎖の非ハイブリッド核酸を選択的に消化するために選ばれた酵素にて、うまくハイブリッド形成されなかった核酸プローブを消化する請求項1〜3の何れかに記載の方法。
- 前記の酵素がエンドヌクレアーゼである請求項4に記載の方法。
- 前記の酵素がリボヌクレアーゼである請求項4または5に記載の方法。
- 前記の酵素がデオキシリボヌクレアーゼである請求項4または5に記載の方法。
- 前記の酵素がS1デオキシリボヌクレアーゼである請求項4〜7の何れかに記載の方法。
- 前記の酵素がエキソヌクレアーゼである請求項4、5または7に記載の方法。
- 前記の酵素がT7エキソヌクレアーゼである請求項9に記載の方法。
- 二本鎖ハイブリッド核酸の少なくとも一方の鎖を選択的に消化するために選ばれた酵素にて、うまくハイブリッド形成された核酸プローブを消化する請求項1〜3の何れかに記載の方法。
- 前記の酵素が5'ヌクレアーゼである請求項11に記載の方法。
- 5'ヌクレアーゼがDNAポリメラーゼである請求項12に記載の方法。
- 5'ヌクレアーゼ/DNAポリメラーゼが、熱的に安定な酵素である請求項13に記載の方法。
- 前記の熱的に安定な酵素がタックポリメラーゼである請求項14に記載の方法。
- 反応混合物がDNAポリメラーゼによる伸長に適した一対のプライマーをも含有する請求項14または15に記載の方法。
- 反応条件と温度サイクルが、プローブの5'ヌクレアーゼ消化を併発させるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に適している請求項16に記載の方法。
- 電気化学的に活性なマーカーで標識された第1オリゴヌクレオチドプローブの完全なるハイブリッド形成を、第2オリゴヌクレオチドとの競争によって阻害し、得られた部分的にハイブリッド形成した第1オリゴヌクレオチドプローブを、標的核酸とハイブリッド形成した2個のオリゴヌクレオチドの立体配置を明細に認識する酵素によって開裂することを包含し、その開裂が電気化学的に活性なマーカーが付着するオリゴヌクレオチド部分を効率的に短くする開裂である請求項1〜3の何れかに記載の方法。
- 第1オリゴヌクレオチドプローブの完全なるハイブリッド形成が、第2オリゴヌクレオチドとの競争によって阻害され、その結果得られる部分的にハイブリッド形成した第1オリゴヌクレオチドプローブが、標的核酸とハイブリッド形成した2個のオリゴヌクレオチドの立体配置を明細に認識する酵素によって開裂され、開裂生成物が認識カセットで認識され、その認識カセットは少なくとも1個のオリゴヌクレオチドを含み、しかも第1開裂生成物とハイブリッド形成してオリゴヌクレオチド立体配置を形成し、その立体配置は電気化学的に活性なマーカーで標識される認識カセット領域を開裂する酵素によって認識可能である請求項1〜3の何れかに記載の方法。
- 核酸多型を検出する請求項1〜19の何れかに記載の方法。
- 対立遺伝子の多型性を検出する請求項1〜19の何れかに記載の方法。
- 単一ヌクレオチド多型を検出する請求項1〜19の何れかに記載の方法。
- 核酸種を定量化する請求項1〜19の何れかに記載の方法。
- 遺伝子発現を定量化する請求項1〜19の何れかに記載の方法。
- プライマーの設計および/またはプローブの設計、熱サイクルおよび/または電気化学活性マーカーの検出を、自動的に、あるいは、ソフトウェア指示によるマイクロプロセッサの力を借りて実行する請求項16〜24の何れかに記載の方法。
- タンパク質溶液を電気化学的に活性なマーカーで標識したオリゴヌクレオチドプローブと接触させ、
そのプローブが溶液中に存在する特異なタンパク質またはタンパク質群と結合できる条件を保持し、
ハイブリッド形成されない核酸プローブを酵素によって選択的に分解し、
溶液中の特異な標的タンパク質またはタンパク質群の有無、あるいは、相対量または絶対量に関する情報を得るために、前記のマーカーに関する情報を電気化学的に測定することを包含する特異なタンパク質またはタンパク質群を検出する方法。 - オリゴヌクレオチドプローブ配列が、インビボのタンパク質認識部位と実質的に類似し、検出されるタンパク質またはタンパク質群が、核酸結合タンパク質であると通常みなせる請求項26に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドプローブが、特異なタンパク質またはタンパク質群に結合するように選択されたアプタマー(aptamer)を含んでいる請求項26に記載の方法。
- 前記の酵素がエンドヌクレアーゼである請求項26〜28の何れかに記載の方法。
- 前記の酵素がリボヌクレアーゼである請求項26〜29の何れかに記載の方法。
- 前記の酵素がデオキシリボヌクレアーゼである請求項26〜30の何れかに記載の方法。
- 前記の酵素がS1デオキシリボヌクレアーゼである請求項26〜31の何れかに記載の方法。
- タンパク質多型を検出する請求項26〜32の何れかに記載の方法。
- タンパク質発現を定量化する請求項26〜33の何れかに記載の方法。
- 電気化学的方法がボルタンメトリーである請求項1〜34の何れかに記載の方法。
- 電気化学的技法が電流測定技法である請求項1〜34の何れかに記載の方法。
- 定量化方法が差分パルスボルタンメトリーである請求項34に記載の方法。
- 電気化学的技法に、選択的に透過性の膜で機能的に囲まれた1つまたは複数の電極を使用する請求項1〜37の何れかに記載の方法。
- 前記の膜が分子の大きさを基準に選択的に透過性である請求項38に記載の方法。
- 前記の膜が電荷を基準に選択的に透過性である請求項38または39に記載の方法。
- 前記の膜が疎水性または親水性に基準に選択的に透過性である請求項38〜40の何れかに記載の方法。
- 遺伝病または遺伝病担体の状態、もしくは病気の遺伝的素因の検出における請求項1〜41の何れかに記載の方法の使用。
- 試料中の病原体を検出または識別するための請求項1〜42の何れかに記載の方法の使用。
- 治療薬または毒剤に対する生体反応を予測するための請求項1〜42の何れかに記載の方法の使用。
- 請求項1〜41の何れか1つまたは複数の方法を実施するための装置であって、1つまたはそれ以上の試料を受け取るための1つまたはそれ以上の試料受け部と、熱サイクラーと、ボルタンメトリーが実施できる手段とを備えて前記の装置。
- 2個またはそれ以上のオリゴヌクレオチドプローブが使用され、各プローブが異なる電気化学的活性マーカーで標識されている請求項1〜41の何れかに記載の方法。
- 2個またはそれ以上の電気化学的活性マーカーが、ボルタンモグラムトレースにおいて、互いに分解可能なピークを有する請求項46に記載の方法。
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