ES2310125B1 - Metodo para la deteccion electroquimica de secuencias de acidos nucleicos. - Google Patents
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Abstract
Método para la detección electroquímica de
secuencias de ácidos nucleicos.
Es objeto de la presente invención un nuevo
compuesto derivado de rutenio, de fórmula (I), denominado complejo
de pentamin rutenio
[3-(2-fenantren-9-il-vinil)piridina],
así como su empleo como indicador electroquímico de hibridación en
un método para la detección de hibridación entre secuencias de
ácidos nucleicos, para la cuantificación de dichas secuencias, así
como la detección de la presencia de una base desapareada y su
posición dentro de una secuencia de ácido nucleico.
Description
Método para la detección electroquímica de
secuencias de ácidos nucleicos.
La presente invención se refiere a un método
para la detección de la hibridación de ácidos nucleicos mediante
métodos electroquímicos. Más concretamente, la presente invención se
refiere a un método para la detección de una secuencia de ADN
determinada, la presencia de un desapareamiento en dicha secuencia,
así como su posición, basado en el empleo de un compuesto derivado
de rutenio de fórmula general (I) como indicador de hibridación en
biosensores electroquímicos.
El diagnóstico molecular basado en el análisis
de secuencias cortas de ADN ofrece métodos sensibles y
cuantitativos para la detección temprana de enfermedades infecciosas
producidas por patógenos (Garg, S. K. et al. Clin. Lab.
Anal. 2003, 17(5), 155-163; Vernet, G. Virus
Res. 2002, 82(1-2),
65-71).
La hibridación del ADN es el proceso más común
para analizar y detectar un gen particular o un segmento de un
ácido nucleico. Entre los métodos basados en hibridación se
encuentran aquellos basados en resonancias de plasmón superficial
(Mullet, W. M. et al. Methods 2000, 22, 77-91;
Sawata, S. et al. Biosens. Bioelectron. 1999, 14,
397-404; Livache, T. et al Synth. Met. 2001, 121,
1443-1444; Wood, S. J. Microchem. J. 1993, 47,
330-337), fluorescencia (Piunno, P. A. E. et
al. Anal. Chim. Acta, 1994, 288, 205-214; Fodor, S.
et al Science, 1991, 251, 767-773), gravimetría
(Okahata, Y. et al. Am. Chem. Soc. 1992, 114,
8299-8300; Minnuni, M. et al. Anal Chim. Acta,
2003, 481, 55-64) o marcaje con radioisótopos
(Séller, G. H. et al DNA Probes, 2nd ed. Stockton Press: New
York, 1993; pp 149-213). El método más empleado
es el uso de fragmentos de ADN o ARN marcados radiactivamente,
conocidos como sondas. De hecho, esta metodología es la base de la
amplificación controlada de ADN conocida como PCR (Reacción en
Cadena de la Polimerasa) que se utiliza para la clonación y
secuenciación de ADN.
Entre los métodos basados en hibridación, los
biosensores de ADN presentan ventajas en comparación con los
métodos citados. Una de las ventajas de estos métodos es la
posibilidad de desarrollar dispositivos portátiles simples para este
tipo de diagnóstico. Además, el acoplamiento entre estos
biosensores de ADN y las técnicas de amplificación por PCR pueden
proporcionar una gran sensibilidad para la detección de secuencias
de ácidos nucleicos (Meric, B. et al. Talanta 2002,
56(5), 837-846). El uso de
oligonucleótidos marcados con fluorescencia inmovilizados sobre una
superficie ha permitido el desarrollo de arrays de ADN de alta
densidad para el análisis de secuencias específicas de ADN y de
expresión génica. Sin embargo, estos métodos requieren el marcaje
del ADN diana (Berre, V. L. et al. Nucleic Acids Res. 2003, 31,
e88; Dolan, P. L. et al. Nucleic Acids Res. 2001, 29, 107).
Como el ADN posee unas bandas nucleicas
electroactivas, también se han desarrollado sistemas
electroquímicos de detección sacando partido de esta propiedad para
detectar directamente el ADN hibridado, sin tener que hacer
intervenir un marcador (Park, S. et al. Science, 2002, 295,
1503-1506; Drummond, T.G. et al. Nat. Biotech.,
2003, 21, 1192-1199). De manera general, el ADN
se inmoviliza sobre un electrodo, y la diferencia de corriente
eléctrica medida antes y después de la hibridación está relacionada
con la cantidad de ADN fijado sobre el electrodo (WO93/20230). Sin
embargo, esta detección directa sin marcador no es muy
sensible.
Con la finalidad de mejorar la sensibilidad, se
han desarrollado diferentes aproximaciones que emplean una molécula
sonda electroactiva o un marcador electroactivo. Así, Palanti et
al. (1996, Analytical Letters, 29, pp. 2309-31)
describen diferentes compuestos electroactivos, que pueden
asociarse con el ADN y así ser detectados por
oxidación-reducción aplicando un potencial al
electrodo. Así, se han empleado complejos de metales de transición,
antibióticos, colorantes de acridina o de benzamida y otros agentes
intercalantes del ADN.
Como estas sondas o marcadores electroactivos
poseen mejores propiedades de oxidorreducción que el ADN, su
utilización permite obtener una relación señal/ruido superior y una
mejor sensibilidad.
Se han empleado también como indicadores
electroquímicos compuestos derivados del salophen (Revenga
Parra, M. et al. "Comprehensive study of the interactions
between DNA and new Schiff base ligands containing quinone
functional groups" Biosensors and Bioelectronics.
Volumen: 22; Págs 2675-2681) y complejos de
Osmio (Del Pozo, M. V. et al. Anal. Chem. 2005a.77 (8),
2550-2557). En el documento CA02524263 se
emplean complejos de rutenio como indicadores de hibridación, que
se incorporan a la doble cadena a circuito abierto.
Ahora, los autores de la presente invención han
desarrollado un método que permite mejorar la sensibilidad de la
detección electroquímica de secuencias de ácidos nucleicos gracias
al empleo de un nuevo complejo de rutenio, preparado "in
situ", denominado complejo de pentamin rutenio
[3-(2-fenantren-9-il-vinil)piridina]
(referido como RuL), como indicador de hibridación en biosensores
electroquímicos.
El complejo RuL, formado por la unión entre el
complejo pentamin rutenio (Ru) y el ligando
3-(2-fenantren-9-il-vinil)piridina
(L), es totalmente novedoso, así como su empleo con esta
finalidad.
La alta sensibilidad y especificidad conseguida
con el método desarrollado permite detectar y cuantificar, sin
necesidad de ningún tipo de marcaje, no sólo una secuencia
determinada de ácido nucleico, sino también un único desapareamiento
en una base de dicha secuencia, así como su posición dentro de la
secuencia específica del ácido nucleico, suponiendo además un
sistema de detección mucho más rápido y económico que los clásicos
PCR.
Figura 1. a) Voltamogramas diferenciales de
pulsos (DPVs) de RuL acumulado en un electrodo de oro modificado
con SEQ ID Nº 1 antes (2) y después de la hibridación con la cadena
complementaria (SEQ ID NO 2) (1) y no complementaria (SEQ ID Nº 3)
(3). b) Ampliación del DPVs de -0,6 a 0 V del barrido de
potencial.
Figura 2. Voltamogramas diferenciales de pulsos
(DPVs) de RuL acumulado en un electrodo de oro modificado con (SEQ
ID Nº 1): después de la hibridación con una secuencia desapareada
en una base en el medio (SEQ ID Nº 4) (2) después de la hibridación
con una secuencia desapareada (próxima al extremo 5' de la
secuencia, (SEQ ID Nº 5), (3) después de la hibridación con una
secuencia desapareada próxima al extremo 3' de la secuencia, (SEQ
ID Nº 6), (4) y después de la hibridación con una secuencia no
complementaria (SEQ ID Nº 3) (1).
Es objeto de la presente invención un nuevo
compuesto derivado de rutenio de fórmula (I), denominado complejo
de pentamin rutenio
[3-(2-fenantren-9-il-vinil)piridina].
Es también objeto de la invención un método para
la detección de hibridación entre una sonda y una secuencia diana
de ácido nucleico basado en el empleo de dicho complejo de fórmula
I como indicador de la hibridación.
Finalmente, es objeto de la presente invención
el empleo del compuesto derivado de rutenio de fórmula (I) como
indicador electroquímico de hibridación entre secuencias de ácidos
nucleicos.
Los autores de la presente invención han
obtenido, tras un importante trabajo de investigación, un nuevo
compuesto derivado de rutenio cuya estructura permite su empleo
como indicador del proceso de hibridación entre secuencias de ácidos
nucleicos en biosensores electroquímicos para la detección del
desapareamiento de una sola base, así como su posición dentro de la
secuencia.
Así, un aspecto principal de la invención se
refiere a un nuevo compuesto derivado de rutenio de fórmula
(I):
Este nuevo complejo, denominado pentamin rutenio
[3-(2-fenantren-9-il-vinil)piridina]
(referido como RuL), preparado in situ, presenta, gracias a
su estructura, una doble función. Por un lado, la estructura planar
de los grupos aromáticos del ligando
3-(2-fenantren-9-il-vinil)
piridina (L) confiere un carácter intercalativo al complejo y le
permite, por tanto, unirse a ácidos nucleicos de doble cadena. Esta
propiedad le diferencia de los complejos utilizados en el estado de
la técnica, cuya forma principal de unión al ADN es electrostática
(una unión mucho menos específica que la que se produce vía
intercalación), lo que da lugar a una unión más específica al ADN,
permitiendo obtener mejores resultados. Por otro lado, el centro
redox del metal (Ru) sirve de indicador electroquímico para
detectar el evento de hibridación.
En base a las ventajas derivadas de este nuevo
compuesto, se ha desarrollado un método para la detección
electroquímica del proceso de hibridación entre secuencias de
ácidos nucleicos, basado en el empleo de dicho compuesto como
indicador de la hibridación, que permite la detección de una sola
base desapareada, y su posición en la secuencia nucleotídica.
Así, en otro aspecto principal de la invención,
se contempla un método para la detección de hibridación entre una
sonda y una secuencia diana de ácido nucleico que comprende las
siguientes fases:
- a)
- inmovilizar la sonda de ácido nucleico sobre la superficie de un electrodo,
- b)
- incubar el electrodo, modificado con la sonda de ácido nucleico, con una solución susceptible de comprender la secuencia diana para que tenga lugar la hibridación,
- c)
- sumergir el electrodo tras la incubación en una disolución que comprende el compuesto derivado de rutenio de fórmula (I),
- d)
- aplicar barridos cíclicos de potencial para incorporar el compuesto derivado de rutenio a la doble cadena de ácido nucleico formada en la hibridación, y
- e)
- detectar electroquímicamente la hibridación entre la sonda y la secuencia diana del ácido nucleico.
\vskip1.000000\baselineskip
La detección del proceso de hibridación permite
la detección de secuencias específicas de ácido nucleico, la
cuantificación de secuencias de ácido nucleico, la detección de un
desapareamiento en una secuencia de ácido nucleico o la detección de
la posición de dicho desapareamiento.
En la presente invención se define
"sonda" como un fragmento de ácido nucleico que posee
una especificidad de hibridación en unas condiciones determinadas
para hibridar con un ácido nucleico diana.
En una realización preferida se define ácido
nucleico como fragmentos de ADN y/o ARN, en base a lo cual, la
hibridación puede detectarse entre secuencias de
ADN-ADN, ADN-ARN y
ARN-ARN.
Como se ha mencionado anteriormente, el complejo
de rutenio de fórmula (I), debido a los anillos aromáticos del
ligando (L), se intercala preferentemente entre las bases apiladas
de la doble cadena de ácido nucleico, inmovilizada sobre la
superficie del electrodo, formada tras la hibridación entre la
secuencia sonda inmovilizada y la secuencia diana presente en la
disolución.
Al aplicar a dicho electrodo un potencial
adecuado, la oxidación del centro redox del rutenio da lugar a una
corriente faradaica directamente relacionada con el evento de
hibridación. Esto permite detectar secuencias específicas
(secuencias diana) de ácido nucleico.
Además, la intensidad de la corriente faradaica
aumenta de forma proporcional a la extensión de la hibridación lo
que permite la cuantificación de secuencias de ácidos
nucleicos.
Finalmente, la sensibilidad y especificidad
obtenidas con este método, gracias al empleo del compuesto RuL como
indicador de la hibridación, permiten la detección de
desapareamientos en una sola base de una secuencia determinada, así
como la posición de dichos desapareamientos dentro de la
secuencia.
En una realización preferida, el ácido nucleico,
tanto de la sonda como de la secuencia diana, es ADN.
El electrodo empleado en el método descrito
puede ser de diferentes tipos (carbón, oro, etc). En una
realización particular, el electrodo empleado es de oro.
La incorporación del complejo de rutenio (RuL) a
la doble cadena se lleva a cabo mediante barridos de potencial, lo
cual proporciona una mayor sensibilidad al método, en comparación
con aquellos métodos que realizan la incorporación a circuito
abierto, en los que no hay control sobre la incorporación del
material.
En una realización preferida los barridos
cíclicos de potencial se aplican 200 veces, entre -0.5 y 0.1 V.
La hibridación se detecta a través de los
cambios en la electroactividad del complejo RuL empleando
Voltamperametría Diferencial de Pulsos (DPV). Esto ocurre a un
potencial de aproximadamente -0.30 V, lo que hace que este complejo
sea particularmente atractivo por su bajo potencial redox, que
evita posibles interferencias de oxidaciones de otros
compuestos.
En otra realización preferida, la detección
electroquímica se lleva a cabo a una velocidad de barrido de 10
Mv/s, una amplitud de pulso de 50 mV y una anchura de pulso de 0.2
s.
Finalmente, en otro aspecto principal de la
invención se contempla el empleo del compuesto RuL de fórmula (I)
como indicador electroquímico de hibridación entre secuencias de
ácidos nucleicos.
En una realización particular, el empleo del
compuesto RuL como indicador de hibridación permite la detección de
una secuencia específica de ácido nucleico (secuencia diana).
En otra realización particular, el empleo del
compuesto RuL permite la cuantificación de secuencias de ácidos
nucleicos.
En otra realización particular, el empleo del
compuesto RuL permite la detección de una base desapareada en una
secuencia de ácido nucleico.
En otra realización particular, el empleo del
compuesto RuL permite la detección de la posición de una base
desapareada en una secuencia de ácido nucleico.
En realizaciones preferidas, el ácido nucleico
es ADN.
Los ejemplos que siguen a continuación ilustran
la presente invención, pero no deben ser considerados como
limitación a los aspectos esenciales del objeto de la misma, tal
como han sido expuestos en los apartados de esta descripción.
Se mezcló directamente en disolución 80 \mul 2
mM de Ru (NH_{3})_{5}(H_{2}O) con 80 \mul de 2
mM del ligando,
(L=3-(2-fenantren-9-il-vinil)-piridina).
El ligando
3-(2-fenantren-9-il-vinil)-piridin
se sintetizó siguiendo el siguiente procedimiento: 15 ml de
N,N,N',N'-tetrametilendiamina se purgó con
nitrógeno seco prepurificado, se añadieron 2.6093 g de
9-bromofenantreno, 1,3 ml de
4-vinilpiridina, 24.2 mg de acetato de paladio y
0.1118 mg de trifenilfosfina y la mezcla se purgó durante 15
minutos. Se mantuvo a reflujo secando con nitrógeno previamente
purificado durante 40 horas. Después se añadió a la mezcla 250 ml de
HCl 0.1M, apareciendo un precipitado amarillo brillante. El
precipitado se filtró y lavó con EtOH y CH_{2}Cl_{2}.
Posteriormente el precipitado se neutralizó con H_{2}O/NaOH 0.1M y
se extrajo con CH_{2}Cl_{2}. Después se reprecipitó con HCl y
el sólido amarillo se recristalizó con H_{2}O/NaOH obteniéndose
la forma básica (color beige claro) del ligando. El
Ru(NH_{3})_{5}(H_{2}O) se sintetizó según
el procedimiento descrito por C.G. Kehuen and H. Taube (Kuehn,
C. C.; Taube, H. Journal of the American Chemical Society, 1976,
98(3), 689-702).
Se preparó mediante inmovilización de la
secuencia de ADN sonda sobre electrodos de oro por absorción
directa durante 1h a temperatura ambiente. Los electrodos
modificados se sumergieron en agua destilada durante 30 minutos
para eliminar posibles restos de ADN no adsorbido. Antes de la
inmovilización, los electrodos se pulieron y se acondicionaron
según un procedimiento previamente descrito (Widrig, C. A.;
Chung, C.; Porter, M. D. J. Electroanal. Chem. 1991, 310,
335-359). El área microscópica de los
electrodos era de 1,7 mm^{2}.
Los electrodos de oro modificados con la sonda
de ADN, se incubaron durante 1h a 40ºC con las secuencias de ADN
complementaria, no complementaria y secuencias con un
desapareamiento, todas ellas preparadas en tampón de hibridación
(fosfato 10 mM, pH 7.0, con 0.4M NaCl). Tras la hibridación, los
electrodos se sumergieron en una disolución 20 \muM de RuL en
KNO_{3} 5 Mm y se barrió el potencial cíclicamente 200 veces,
entre -0.5 y 0.1 V. Antes de su utilización los electrodos se
aclararon con agua destilada.
Se utilizó una célula electroquímica de tres
bocas, de fabricación propia, con un electrodo auxiliar de platino
y un electrodo de calomelanos de NaCl saturado, también de
fabricación propia, como electrodo de referencia. Antes de cada
medida electroquímica las disoluciones se purgaron con N_{2} y se
mantuvo la atmósfera de nitrógeno durante toda la medida. Se
utilizó KNO_{3} como electrolito soporte. Los parámetros de medida
de la voltamperometría diferencial de pulsos (DPV) fueron:
velocidad de barrido: 10 Mv/s; amplitud de pulso: 50 mV; anchura de
pulso: 0.2 s.
El sistema desarrollado, que vale como prototipo
para la detección de cualquier secuencia, se aplicó a la detección
de secuencias específicas de Helicobacter pylori. Una
secuencia tiolada sintética de 25-mer de esta
bacteria (SEQ ID Nº 1) se inmovilizó sobre un electrodo de oro
(densidad de inmovilización: 9.0 pmol/cm^{2}) a través de los
grupos tiol. En el primer ensayo de hibridación, se utilizaron la
secuencia complementaria (SEQ ID Nº 2) y la no complementaria (SEQ
ID Nº 3) como secuencias diana. La inmovilización de la secuencia
sonda (SEQ ID Nº 1), las hibridaciones y las mediciones de corriente
se realizaron según los procedimientos y condiciones descritas
anteriormente. La Figura 1 muestra los voltamogramas de diferencial
de pulsos (DPVs) de 20 \muM RuL acumulado en un electrodo
modificado con (SEQ ID Nº 1) obtenidos antes (2) y después de la
hibridación con la cadena complementaria (SEQ ID Nº 2) (1) y no
complementaria (SEQ ID Nº 3) (3).
Se observó que tras la hibridación de (SEQ ID Nº
1) con la cadena complementaria (SEQ ID Nº 2) en la superficie del
biosensor, se obtenía un aumento en la intensidad de corriente de
pico del voltamograma, debido a la oxidación del rutenio del
complejo intercalado en la doble cadena. A partir de la relación de
los recubrimientos superficiales se pudo estimar que se incluían 5
moléculas del complejo de rutenio por cada 25 pares de bases de
ADN. Sin embargo, cuando la hibridación se realizó con la secuencia
no complementaria (SEQ ID Nº 3) no se observó ningún cambio en la
corriente (comparar la curva 2 y la curva 3 de la Figura 1). Por
tanto, los cambios ocasionados en las corrientes de pico y en el
potencial indican que el complejo (RuL) sirve como indicador
electroquímico para detectar el proceso de hibridación entre
fragmentos del ADN del Helicobacter pylori y por tanto el
reconocimiento de determinados fragmentos presentes en una muestra.
Además, la intensidad de corriente a -0.260 V aumentó de forma
proporcional a la extensión de la hibridación, es decir, al aumentar
la cantidad de la secuencia inmovilizada en el electrodo (sonda).
Las variaciones de electrodo a electrodo se pueden corregir
mediante la representación gráfica de la corriente normalizada
(i-i0/i0) vs la cantidad de la sonda, donde i0 e i
representan la corriente antes y después de la hibridación para una
determinada cantidad de SEQ ID NO 2 complementaria. La corriente
normalizada (i-i0/i0) medida a -0.260 V mostró una
excelente correlación lineal (coeficiente de correlación lineal, r
= 0.995) con el aumento de la secuencia complementaria SEQ ID Nº 2
en el intervalo de 106 a 708 pmol. El límite de detección,
calculado como la señal correspondiente a la secuencia sonda (SEQ ID
Nº 1) más tres veces la desviación estándar, fue de 92 ± 4pmol de
la secuencia complementaria (SEQ ID Nº2) y la reproducibilidad de
la determinación del 94%.
Se evaluó la selectividad del biosensor
analizando secuencias que contenían una única base desapareada en
diferentes posiciones: en el medio (SEQ ID Nº 4) y en los extremos
(SEQ ID Nº 5) y (SEQ ID Nº 6), como se indica en el esquema de la
Figura 2, bajo las mismas condiciones de hibridación empleadas para
la secuencia totalmente complementaria (SEQ ID Nº 2). La doble
hélice distorsionada que se forma tras la hibridación de la sonda
(SEQ ID Nº 1) con la secuencia desapareada en una base, acumuló una
menor cantidad de RuL y como resultado, la intensidad de corriente
obtenida tras su oxidación fue menor que la obtenida tras la
hibridación con una secuencia totalmente complementaria (SEQ ID Nº
2). La figura 2 (curvas 2, 3 y 4) muestra los voltamogramas
diferenciales de pulsos (DPVs) obtenidos con un electrodo de oro
modificado con la sonda (SEQ ID Nº1) tras la hibridación con
diferentes secuencias con un desapareamiento en distintas
posiciones, usando RuL como indicador electroquímico. En todos los
casos se produjo una disminución significativa en la corriente de
pico comparándola con la respuesta obtenida cuando la sonda SEQ ID
Nº1 hibridaba con su secuencia totalmente complementaria (SEQ ID Nº
2) (Figura 1, curva 1). Además, la corriente obtenida cuando el
desapareamiento estaba en el medio de la secuencia, fue menor (ver
curva 2 de la Figura 2) que la obtenida cuando el desapareamiento
estaba en los extremos (Figura 2, curva 3 y 4 respectivamente), y
fue mayor (50%) que la obtenida con una secuencia totalmente no
complementaria (ver curva 1 de la Figura 2). Esto permitió detectar
de forma inequívoca la presencia de un desapareamiento en una
secuencia determinada y la posición de este.
En conclusión, los resultados pusieron de
manifiesto la validez del sistema desarrollado, basado en la
utilización del complejo de rutenio (RuL) como indicador de
hibridación en un biosensor electroquímico para la detección de
secuencias de ADN, para su cuantificación y para la detección de
una base desapareada y la posición de ésta.
Claims (12)
1. Compuesto derivado de rutenio de fórmula
(I):
2. Método para la detección de hibridación entre
una sonda y una secuencia diana de ácido nucleico
caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
- a.
- inmovilizar la sonda de ácido nucleico sobre la superficie de un electrodo,
- b.
- incubar el electrodo, modificado con la sonda de ácido nucleico, con una solución susceptible de comprender la secuencia diana para que tenga lugar la hibridación,
- c.
- sumergir el electrodo, tras la etapa b) de incubación en una disolución que comprende el compuesto derivado de rutenio de la reivindicación 1,
- d.
- aplicar barridos cíclicos de potencial para incorporar el compuesto derivado de rutenio a la doble cadena de ácido nucleico formada en la hibridación,
- e.
- detectar electroquímicamente la hibridación entre la sonda y la secuencia diana del ácido nucleico,
donde la detección de hibridación permite la
detección de una secuencia de ácido nucleico, la cuantificación de
secuencias de ácido nucleico, la detección de una base desapareada
en una secuencia de ácido nucleico o la detección de la posición de
dicho base desapareada.
3. Método según la reivindicación 2,
caracterizado porque el ácido nucleico de la sonda y la
secuencia diana es ADN.
4. Método según la reivindicación 3,
caracterizado porque el electrodo empleado es de oro.
5. Método, según la reivindicación 4,
caracterizado porque los barridos cíclicos de potencial se
aplican 200 veces, entre -0.5 y 0.1 V.
6. Método, según la reivindicación 4,
caracterizado porque la detección electroquímica se lleva a
cabo por voltamperametría diferencial de pulsos a una velocidad de
barrido de 10 Mv/s, una amplitud de pulso de 50 mV y una anchura de
pulso de 0.2 s.
7. Empleo del compuesto, según la reivindicación
1, como indicador electroquímico de hibridación entre secuencias de
ácidos nucleicos.
8. Empleo del compuesto, según la reivindicación
7, para la detección de una secuencia de ácido nucleico.
9. Empleo del compuesto, según la reivindicación
7, para la cuantificación de secuencias de ácidos nucleicos.
10. Empleo del compuesto, según la
reivindicación 7, para la detección de una base desapareada en una
secuencia de ácido nucleico.
11. Empleo del compuesto, según la
reivindicación 7, para la detección de la posición de una base
desapareada en una secuencia de ácido nucleico.
12. Empleo del compuesto, según cualquiera de
las reivindicaciones 7-11, donde el ácido nucleico
es ADN.
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