JPH07157497A - ビオチン誘導体により遺伝子を非放射標識する方法 - Google Patents
ビオチン誘導体により遺伝子を非放射標識する方法Info
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- JPH07157497A JPH07157497A JP33003493A JP33003493A JPH07157497A JP H07157497 A JPH07157497 A JP H07157497A JP 33003493 A JP33003493 A JP 33003493A JP 33003493 A JP33003493 A JP 33003493A JP H07157497 A JPH07157497 A JP H07157497A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】ＤＮＡ又はＲＮＡをラベルしてその検出を行う
従来の方法は放射標識法か高価な試薬を必要とする非放
射標識法である。本発明は安価に実施できる遺伝子の非
放射標識法を提供することを目的とする。 【構成】 【化１】 で表されるカルボジイミド基を有するビオチン誘導体を
一本鎖としたＤＮＡ又はＲＮＡと反応させＤＮＡ又はＲ
ＮＡをビオチン化することにより遺伝子を非放射標識す
る。使用するビオチン誘導体は比較的簡便かつ安価に製
造でき、かつ容易にＤＮＡ又はＲＮＡと反応し、更にこ
の反応生成物は発色して容易に他の化合物やラベルされ
ていないＤＮＡ又はＲＮＡから識別できる。
従来の方法は放射標識法か高価な試薬を必要とする非放
射標識法である。本発明は安価に実施できる遺伝子の非
放射標識法を提供することを目的とする。 【構成】 【化１】 で表されるカルボジイミド基を有するビオチン誘導体を
一本鎖としたＤＮＡ又はＲＮＡと反応させＤＮＡ又はＲ
ＮＡをビオチン化することにより遺伝子を非放射標識す
る。使用するビオチン誘導体は比較的簡便かつ安価に製
造でき、かつ容易にＤＮＡ又はＲＮＡと反応し、更にこ
の反応生成物は発色して容易に他の化合物やラベルされ
ていないＤＮＡ又はＲＮＡから識別できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、放射性物質を使用せず
にＤＮＡやＲＮＡの遺伝子を標識するための方法に関す
る。
にＤＮＡやＲＮＡの遺伝子を標識するための方法に関す
る。
【０００２】
【従来技術及びその問題点】分子生物学の分野において
は、サザーンハイブリダイゼイション法、ノーザンハイ
ブリダイゼイション法によるＤＮＡやＲＮＡに含まれる
目的とした遺伝子配列の検出法は現在必要不可欠であ
る。これを行うには現在では多くの場合目的とした遺伝
子配列に対応する放射標識された相補鎖をプローベとし
て使用している。このプローベを調製するにはＤＮＡを
鋳型として放射標識されたヌクレオチドトリリン酸を用
いて酵素的に合成することが必要であるが、放射性物質
を取り扱わなければならず、作業者の健康に対する影響
が懸念されかつ放射性物質を取り扱う施設が限定され
る。これを解決するために従来から放射性物質を使用し
ない遺伝子標識の方法があり、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ
の塩基部分をビオチン化した２’−デオキシチミジント
リリン酸誘導体を基質として用い相補性のあるＤＮＡを
鋳型として酵素的にプローベを合成する方法がある
（Ｐ．Ｒ．ランガー(1981)Proc. Nattl. Acad. Sci.,
USA 78, 6633-6637)。しかしこの方法は大変高価な基質
を用いなければならず、更に酵素的にプローベを合成し
なければならないため煩雑で経済性に欠ける。他には、
プローベとして用いるＤＮＡ鎖に対して光反応により直
接ビオチン化する方法がある（Ａ．Ｃ．フォスター (19
85) NucleicAcids Res. 13, 745-761)。この方法はア
ジド基を有するビオチン誘導体を強力な可視光により前
記アジドを光分解し、反応活性に富むナイトレンを生成
させこれによりＤＮＡ鎖をビオチン化する方法であり、
酵素を用いない利点はあるものの、光反応を行うための
高価な光源装置が必要である。従来より１−シクロヘキ
シル−３−〔２−（４−モルホリニル）エチル〕−カル
ボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホナートは一本鎖の
ＤＮＡ及びＲＮＡ中のチミン、グアニン、ウラシルと反
応することが知られている（Ｐ．Ｔ．ギルハム(1962)
J. Am. Chem. Soc., 84, 687-688 , Biochemistry (196
7) ６，3632−3639) 。しかしこの反応により生ずる化
合物は標識手段がなく遺伝子の非放射標識方法とは成り
得ない。
は、サザーンハイブリダイゼイション法、ノーザンハイ
ブリダイゼイション法によるＤＮＡやＲＮＡに含まれる
目的とした遺伝子配列の検出法は現在必要不可欠であ
る。これを行うには現在では多くの場合目的とした遺伝
子配列に対応する放射標識された相補鎖をプローベとし
て使用している。このプローベを調製するにはＤＮＡを
鋳型として放射標識されたヌクレオチドトリリン酸を用
いて酵素的に合成することが必要であるが、放射性物質
を取り扱わなければならず、作業者の健康に対する影響
が懸念されかつ放射性物質を取り扱う施設が限定され
る。これを解決するために従来から放射性物質を使用し
ない遺伝子標識の方法があり、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ
の塩基部分をビオチン化した２’−デオキシチミジント
リリン酸誘導体を基質として用い相補性のあるＤＮＡを
鋳型として酵素的にプローベを合成する方法がある
（Ｐ．Ｒ．ランガー(1981)Proc. Nattl. Acad. Sci.,
USA 78, 6633-6637)。しかしこの方法は大変高価な基質
を用いなければならず、更に酵素的にプローベを合成し
なければならないため煩雑で経済性に欠ける。他には、
プローベとして用いるＤＮＡ鎖に対して光反応により直
接ビオチン化する方法がある（Ａ．Ｃ．フォスター (19
85) NucleicAcids Res. 13, 745-761)。この方法はア
ジド基を有するビオチン誘導体を強力な可視光により前
記アジドを光分解し、反応活性に富むナイトレンを生成
させこれによりＤＮＡ鎖をビオチン化する方法であり、
酵素を用いない利点はあるものの、光反応を行うための
高価な光源装置が必要である。従来より１−シクロヘキ
シル−３−〔２−（４−モルホリニル）エチル〕−カル
ボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホナートは一本鎖の
ＤＮＡ及びＲＮＡ中のチミン、グアニン、ウラシルと反
応することが知られている（Ｐ．Ｔ．ギルハム(1962)
J. Am. Chem. Soc., 84, 687-688 , Biochemistry (196
7) ６，3632−3639) 。しかしこの反応により生ずる化
合物は標識手段がなく遺伝子の非放射標識方法とは成り
得ない。
【０００３】
【発明の目的】本発明は上記問題点に鑑み、比較的安価
に製造できる化合物を使用してＤＮＡ又はＲＮＡを非放
射標識するための方法を提供することを目的とする。
に製造できる化合物を使用してＤＮＡ又はＲＮＡを非放
射標識するための方法を提供することを目的とする。
【０００４】
【問題点を解決するための手段】本発明方法は、（化
１）（Ｒ1 は炭素数１〜６のアルキル基又はシクロアル
キル基、Ｒ2 は炭素数１〜６のアルキレン基、Ｒ3 及び
Ｒ4 は同一又は異なる炭素数１〜３のアルキル基、Ｘ-
は塩素イオン、臭素イオン及びヨウ素イオンから選択さ
れる１種類のハロゲンイオンをそれぞれ示す）で表され
るカルボジイミド基を有するビオチン誘導体を一本鎖と
したＤＮＡ又はＲＮＡと反応させＤＮＡ又はＲＮＡをビ
オチン化することにより遺伝子を非放射標識する方法で
ある。
１）（Ｒ1 は炭素数１〜６のアルキル基又はシクロアル
キル基、Ｒ2 は炭素数１〜６のアルキレン基、Ｒ3 及び
Ｒ4 は同一又は異なる炭素数１〜３のアルキル基、Ｘ-
は塩素イオン、臭素イオン及びヨウ素イオンから選択さ
れる１種類のハロゲンイオンをそれぞれ示す）で表され
るカルボジイミド基を有するビオチン誘導体を一本鎖と
したＤＮＡ又はＲＮＡと反応させＤＮＡ又はＲＮＡをビ
オチン化することにより遺伝子を非放射標識する方法で
ある。
【０００５】以下、本発明の詳細について説明する。本
発明による遺伝子ＤＮＡ又はＲＮＡの非放射標識は、該
ＤＮＡ等を直接（化１）の化合物と反応させることによ
り容易に行うことができ、簡便かつ安価に非放射標識さ
れたＤＮＡ又はＲＮＡを提供できる。ＤＮＡ又はＲＮＡ
と（化１）の化合物との反応はＤＮＡ等の塩基部と（化
１）の化合物のカルボジイミドの部分の間の共有結合が
形成されることにより進行する。（化１）の化合物中の
Ｒ1 は炭素数１〜６のアルキル基つまりメチル、エチ
ル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブ
チル、ｓｅｃ−ブチル、ｎ−ペンチル及びｎ−ヘキシル
基等であり、Ｒ2 は炭素数４〜６の置換又は未置換のシ
クロアルキル基つまりシクロブチル、シクロペンチル及
びシクロヘキシル基等であり、Ｒ3 及びＲ4 は通常同一
であるが異なっても良い炭素数１〜３のアルキル基つま
りメチル、エチル、ｎ−プロピル及びイソプロピル基で
あり、Ｘ- は塩素イオン、臭素イオン及びヨウ素イオン
等のハロゲンイオンである。ＤＮＡ等の遺伝子と（化
１）の化合物との反応は特に限定されないが、例えば次
のような反応により行うことができる。
発明による遺伝子ＤＮＡ又はＲＮＡの非放射標識は、該
ＤＮＡ等を直接（化１）の化合物と反応させることによ
り容易に行うことができ、簡便かつ安価に非放射標識さ
れたＤＮＡ又はＲＮＡを提供できる。ＤＮＡ又はＲＮＡ
と（化１）の化合物との反応はＤＮＡ等の塩基部と（化
１）の化合物のカルボジイミドの部分の間の共有結合が
形成されることにより進行する。（化１）の化合物中の
Ｒ1 は炭素数１〜６のアルキル基つまりメチル、エチ
ル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブ
チル、ｓｅｃ−ブチル、ｎ−ペンチル及びｎ−ヘキシル
基等であり、Ｒ2 は炭素数４〜６の置換又は未置換のシ
クロアルキル基つまりシクロブチル、シクロペンチル及
びシクロヘキシル基等であり、Ｒ3 及びＲ4 は通常同一
であるが異なっても良い炭素数１〜３のアルキル基つま
りメチル、エチル、ｎ−プロピル及びイソプロピル基で
あり、Ｘ- は塩素イオン、臭素イオン及びヨウ素イオン
等のハロゲンイオンである。ＤＮＡ等の遺伝子と（化
１）の化合物との反応は特に限定されないが、例えば次
のような反応により行うことができる。
【０００６】まず標識すべきＤＮＡ又はＲＮＡを95〜10
0 ℃で５〜10分加熱して１本鎖にする。このＤＮＡ又は
ＲＮＡをｐＨが約8.0 で0.01〜10μｇ／μｌの0.1 Ｍホ
ウ酸ナトリウム緩衝液に溶解し、別に（化１）の化合物
をｐＨが約8.0 の0.1 Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液に１〜
100 μｇ／μｌとなるように溶解する。両溶液を等体積
混合し10〜40℃で１〜10時間反応させ、その後通常のエ
タノール沈澱によりビオチン化されたＤＮＡ又はＲＮＡ
を分離する。該反応ではプローベとしてザザーンハイブ
リダイゼイション法やノーザンハイブリダイゼイション
法を直接用いるができる。このように非放射標識された
ＤＮＡ又はＲＮＡの検出はニトロセルロース上等での発
色により行うことができ、１ｐｇ程度の感度まで検出す
ることができる。この発色は（化１）の化合物に独特の
発色であり、非放射標識された前記ＤＮＡ又はＲＮＡを
他の反応生成物や（化１）の化合物でラベルされていな
い他のＤＮＡ又はＲＮＡから本発明により非放射標識さ
れたＤＮＡ又はＲＮＡを容易に標識することができる。
0 ℃で５〜10分加熱して１本鎖にする。このＤＮＡ又は
ＲＮＡをｐＨが約8.0 で0.01〜10μｇ／μｌの0.1 Ｍホ
ウ酸ナトリウム緩衝液に溶解し、別に（化１）の化合物
をｐＨが約8.0 の0.1 Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液に１〜
100 μｇ／μｌとなるように溶解する。両溶液を等体積
混合し10〜40℃で１〜10時間反応させ、その後通常のエ
タノール沈澱によりビオチン化されたＤＮＡ又はＲＮＡ
を分離する。該反応ではプローベとしてザザーンハイブ
リダイゼイション法やノーザンハイブリダイゼイション
法を直接用いるができる。このように非放射標識された
ＤＮＡ又はＲＮＡの検出はニトロセルロース上等での発
色により行うことができ、１ｐｇ程度の感度まで検出す
ることができる。この発色は（化１）の化合物に独特の
発色であり、非放射標識された前記ＤＮＡ又はＲＮＡを
他の反応生成物や（化１）の化合物でラベルされていな
い他のＤＮＡ又はＲＮＡから本発明により非放射標識さ
れたＤＮＡ又はＲＮＡを容易に標識することができる。
【０００７】次に（化１）の化合物は（化２）の化合物
と（化３）の化合物をほぼ１：１のモル比で極性溶媒中
で反応させることにより製造することができる。
と（化３）の化合物をほぼ１：１のモル比で極性溶媒中
で反応させることにより製造することができる。
【０００８】
【化２】 ここでＲ1 は炭素数１〜６のアルキル基又はシクロアル
キル基、Ｒ2 は炭素数１〜６のアルキレン基、Ｒ3 及び
Ｒ4 は同一又は異なる炭素数１〜３のアルキル基示す。
この（化２）のカルボジイミド化合物はＪ．Ｃ．シーハ
ンらの方法〔J.Org. Chem. 2525 26 (1961)]により合
成できる。
キル基、Ｒ2 は炭素数１〜６のアルキレン基、Ｒ3 及び
Ｒ4 は同一又は異なる炭素数１〜３のアルキル基示す。
この（化２）のカルボジイミド化合物はＪ．Ｃ．シーハ
ンらの方法〔J.Org. Chem. 2525 26 (1961)]により合
成できる。
【０００９】
【化３】 ここでＸ- は塩素イオン、臭素イオン及びヨウ素イオン
から選択される１種類のハロゲンイオンを示す。このビ
オチン誘導体はウィルケックらの方法〔Methods of Bio
chemical Analysis, vol 26, p 1 (1980)]により合成で
きる。
から選択される１種類のハロゲンイオンを示す。このビ
オチン誘導体はウィルケックらの方法〔Methods of Bio
chemical Analysis, vol 26, p 1 (1980)]により合成で
きる。
【００１０】
【実施例】次の本発明に使用するビオチン誘導体の製造
例及び該誘導体による遺伝子の非放射標識に関する実施
例を記載するが、これらの製造例及び実施例は本発明を
限定するものではない。
例及び該誘導体による遺伝子の非放射標識に関する実施
例を記載するが、これらの製造例及び実施例は本発明を
限定するものではない。
【製造例１】ビオチニルブロモアセチルヒドラジドの製造 ビオチンヒドラジド（260 ｍｇ）を0.5 Ｍ炭酸水素ナト
リウム10ミリリットルに溶解し、この溶液を０℃に維持
しながら、４ミリリットルのジオキサンに溶解した無水
ブロモ酢酸を添加した。15分後に生成した沈澱を濾過し
水から再結晶した。収量は227.4 ｍｇであった。
リウム10ミリリットルに溶解し、この溶液を０℃に維持
しながら、４ミリリットルのジオキサンに溶解した無水
ブロモ酢酸を添加した。15分後に生成した沈澱を濾過し
水から再結晶した。収量は227.4 ｍｇであった。
【００１１】
【製造例２】１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミドの製造 エーテル200 ミリリットルにエチルイソシアネート17.1
ｇ（0.24モル）を溶解し、この溶液にＮ，Ｎ−ジメチル
−プロパンジアミン24.8ｇ（0.24モル）を100ミリリッ
トルのエーテルに溶解した液を冷却下で徐々に滴下し
た。室温で２時間攪拌した後、減圧下でエーテルを除去
した。黄色の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）尿素41.9ｇが残留した。
ボジイミドの製造 エーテル200 ミリリットルにエチルイソシアネート17.1
ｇ（0.24モル）を溶解し、この溶液にＮ，Ｎ−ジメチル
−プロパンジアミン24.8ｇ（0.24モル）を100ミリリッ
トルのエーテルに溶解した液を冷却下で徐々に滴下し
た。室温で２時間攪拌した後、減圧下でエーテルを除去
した。黄色の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）尿素41.9ｇが残留した。
【００１２】この化合物に750 ミリリットルの塩化メチ
レン及び130 ミリリットルのトリエチルアミンを加えて
溶解し、この溶液に91.3ｇ（0.48モル）のｐ−トルエン
スルホニルクロライドの塩化メチレン溶液500 ミリリッ
トルを液温が５℃を越えないように注意しながら滴下し
た。次いで還流温度に加熱して３時間還流を続けた。得
られた反応混合物を冷却後、各200 ミリリットルの40％
炭酸カリウムで３回洗浄し、塩化メチレン層を分離し、
次いで塩化メチレンを減圧下に除去した。残留物をエー
テルで抽出し、エーテルを減圧下に除去し、次いで残留
物を減圧蒸留して１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミド19.3ｇ（収率51％）を得た
（沸点53〜54℃、0.60ｍｍＨｇ）。
レン及び130 ミリリットルのトリエチルアミンを加えて
溶解し、この溶液に91.3ｇ（0.48モル）のｐ−トルエン
スルホニルクロライドの塩化メチレン溶液500 ミリリッ
トルを液温が５℃を越えないように注意しながら滴下し
た。次いで還流温度に加熱して３時間還流を続けた。得
られた反応混合物を冷却後、各200 ミリリットルの40％
炭酸カリウムで３回洗浄し、塩化メチレン層を分離し、
次いで塩化メチレンを減圧下に除去した。残留物をエー
テルで抽出し、エーテルを減圧下に除去し、次いで残留
物を減圧蒸留して１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミド19.3ｇ（収率51％）を得た
（沸点53〜54℃、0.60ｍｍＨｇ）。
【００１３】
【製造例３】１−エチル−３−｛〔ビオニチルヒドラジノオキソメチ
ル）ジメチルアンモノ〕プロピル｝カルボジイミドブロ
ミドの製造 （３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド19.3ｇ
（収率 製造例１で得られたビオチニル−ブロモアセチルヒドラ
ジド0.76ｇと、製造例２で得られた１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド0.31ｇ
をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド10ミリリットル中に注
ぎ、生成した沈澱を濾過し、少量のエーテルで洗浄し
た。生成物を減圧下で乾燥すると、融点115℃を示す白
色沈澱1.07ｇ（収率100 ％）が得られた。分析結果は次
の通りであり、目的とする１−エチル−３−｛〔ビオニ
チルヒドラジノオキソメチル）ジメチルアンモノ〕プロ
ピル｝カルボジイミドブロミド〔（化１）においてＲ1
＝エチル、Ｒ2 ＝ (ＣＨ2 ）3 、Ｒ3 ＝Ｒ4 ＝メチル、
Ｘ＝Ｂｒ〕が得られたことが判った。
ル）ジメチルアンモノ〕プロピル｝カルボジイミドブロ
ミドの製造 （３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド19.3ｇ
（収率 製造例１で得られたビオチニル−ブロモアセチルヒドラ
ジド0.76ｇと、製造例２で得られた１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド0.31ｇ
をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド10ミリリットル中に注
ぎ、生成した沈澱を濾過し、少量のエーテルで洗浄し
た。生成物を減圧下で乾燥すると、融点115℃を示す白
色沈澱1.07ｇ（収率100 ％）が得られた。分析結果は次
の通りであり、目的とする１−エチル−３−｛〔ビオニ
チルヒドラジノオキソメチル）ジメチルアンモノ〕プロ
ピル｝カルボジイミドブロミド〔（化１）においてＲ1
＝エチル、Ｒ2 ＝ (ＣＨ2 ）3 、Ｒ3 ＝Ｒ4 ＝メチル、
Ｘ＝Ｂｒ〕が得られたことが判った。
【００１４】元素分析：Ｃ20０Ｈ36６Ｎ7 Ｏ3 ＳＢｒと
して 計算値（％）： Ｃ44.94 Ｈ6.79 Ｎ18.34 Ｓ6.00
Ｂｒ14.95 分析値（％）： Ｃ45.01 Ｈ6.85 Ｎ18.41 Ｓ6.11
Ｂｒ15.01 ＩＲ：2050ｃｍ-1に強い吸収を示す。
して 計算値（％）： Ｃ44.94 Ｈ6.79 Ｎ18.34 Ｓ6.00
Ｂｒ14.95 分析値（％）： Ｃ45.01 Ｈ6.85 Ｎ18.41 Ｓ6.11
Ｂｒ15.01 ＩＲ：2050ｃｍ-1に強い吸収を示す。
【００１５】
【実施例１】Ｍ13ｍｐ18の一本鎖ＤＮＡ５μｇをｐＨ8.
0 の0.1 Ｍホウ酸緩衝液に１μｇ／μｌとなるように溶
解した（全量５μｌ）。製造例３で製造したカルボジイ
ミド基を有するビオチン誘導体を同じくｐＨ8.0 の0.1
Ｍホウ酸緩衝液に50μｇ／μｌとなるように溶解し、こ
の溶液５μｌと前述のＭ13ｍｐ18の一本鎖ＤＮＡ溶液５
μｌを混合し、37℃で２時間反応させた。反応終了後５
Ｍの酢酸アンモニウム溶液10μｌを加え、続いてエタノ
ール60μｌを加えて通常のエタノール沈澱処理を行って
ビオチンされたＤＮＡを沈澱させ濾過した後、このビオ
チン化されたＤＮＡを水10μｌに溶解した。このＤＮＡ
量を260 ｎｍの紫外線吸収により測定したところ4.5 μ
ｇのＤＮＡとして回収されたことが判った（回収率95
％）。
0 の0.1 Ｍホウ酸緩衝液に１μｇ／μｌとなるように溶
解した（全量５μｌ）。製造例３で製造したカルボジイ
ミド基を有するビオチン誘導体を同じくｐＨ8.0 の0.1
Ｍホウ酸緩衝液に50μｇ／μｌとなるように溶解し、こ
の溶液５μｌと前述のＭ13ｍｐ18の一本鎖ＤＮＡ溶液５
μｌを混合し、37℃で２時間反応させた。反応終了後５
Ｍの酢酸アンモニウム溶液10μｌを加え、続いてエタノ
ール60μｌを加えて通常のエタノール沈澱処理を行って
ビオチンされたＤＮＡを沈澱させ濾過した後、このビオ
チン化されたＤＮＡを水10μｌに溶解した。このＤＮＡ
量を260 ｎｍの紫外線吸収により測定したところ4.5 μ
ｇのＤＮＡとして回収されたことが判った（回収率95
％）。
【００１６】この水に溶解した回収ＤＮＡを使用して、
その濃度が１ｐｇ／μｌから128 ｐｇ／μｌまで濃度が
２倍ずつ増加するようにした計８種類の濃度の前記ＤＮ
Ａの水溶液を調製し、各８種類の水溶液を別個にニトロ
セルロースフィルター上にそれぞれ１μｌずつスポット
した。その後このニトロセルロースフィルターを通常の
方法〔Ｆ．Ｍ．アウスベル、Current Protocols in Mol
ecular Biology (1990) 3, 18.3, ジョン・ウイリー・
アンド・サンズ社）〕によりストレプトアジピンアルカ
リフォスファターゼマンジュゲイトと反応させ更にＮＢ
Ｔ、ＢＣＩＰにより発色させたところ、前述のスポット
は青色に発色し、少なくとも１ｐｇ／μｌのレベルまで
明確に発色により検出できることが判った。
その濃度が１ｐｇ／μｌから128 ｐｇ／μｌまで濃度が
２倍ずつ増加するようにした計８種類の濃度の前記ＤＮ
Ａの水溶液を調製し、各８種類の水溶液を別個にニトロ
セルロースフィルター上にそれぞれ１μｌずつスポット
した。その後このニトロセルロースフィルターを通常の
方法〔Ｆ．Ｍ．アウスベル、Current Protocols in Mol
ecular Biology (1990) 3, 18.3, ジョン・ウイリー・
アンド・サンズ社）〕によりストレプトアジピンアルカ
リフォスファターゼマンジュゲイトと反応させ更にＮＢ
Ｔ、ＢＣＩＰにより発色させたところ、前述のスポット
は青色に発色し、少なくとも１ｐｇ／μｌのレベルまで
明確に発色により検出できることが判った。
【００１７】
【実施例２】Ｍ13mp18の一本鎖ＤＮＡをパン酵母により
抽出精製したｔＲＮＡに代えたこと以外は実施例１と同
一条件で反応させ発色テストを行った。実施例１と同様
に１ｐｇのレベルまでｔＲＮＡの検出を行うことができ
た。
抽出精製したｔＲＮＡに代えたこと以外は実施例１と同
一条件で反応させ発色テストを行った。実施例１と同様
に１ｐｇのレベルまでｔＲＮＡの検出を行うことができ
た。
【００１８】
【実施例３】正常Ａ型アルドラーゼ遺伝子を持つプラス
ミドＰＨＡＡ47〔向井ら、Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 84, 8623 (1987)]を制限酵素ＰstＩで消化し、786
個の塩基対から成るＤＮＡ断片をアガロース電気泳動に
より回収した。同じく制限酵素ＰstＩで消化したＭ13ｍ
ｐ18ＲＦＤＮＡにライゲースの存在の下に前述のＤＮＡ
断片をＭ13mp18のマルチクローニングサイトに挿入し
た。このとき挿入方向は両方向に入る。これらのプラス
ミドを単離し、２本鎖ＤＮＡを制限酵素ＨＩＮＤ III，
ＮＣＯＩにより消化し、アクリルアミド電気泳動により
分離された断片の長さにより方向を決定した。それぞれ
の方向のＤＮＡ断片を入れたＭ13mp18の一本鎖ＤＮＡを
通常の方法により単離した。
ミドＰＨＡＡ47〔向井ら、Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 84, 8623 (1987)]を制限酵素ＰstＩで消化し、786
個の塩基対から成るＤＮＡ断片をアガロース電気泳動に
より回収した。同じく制限酵素ＰstＩで消化したＭ13ｍ
ｐ18ＲＦＤＮＡにライゲースの存在の下に前述のＤＮＡ
断片をＭ13mp18のマルチクローニングサイトに挿入し
た。このとき挿入方向は両方向に入る。これらのプラス
ミドを単離し、２本鎖ＤＮＡを制限酵素ＨＩＮＤ III，
ＮＣＯＩにより消化し、アクリルアミド電気泳動により
分離された断片の長さにより方向を決定した。それぞれ
の方向のＤＮＡ断片を入れたＭ13mp18の一本鎖ＤＮＡを
通常の方法により単離した。
【００１９】これらは挿入したＤＮＡ鎖部分については
相補性となっている。このため一方をニトロセルロース
フィルターに実施例１と同様に１〜128 ｐｇ／μｌまで
ドットプロットし、他の方向のＤＮＡを含む一本鎖ＤＮ
Ａを実施例１の方法によりビオチン化しこれをプローベ
としてサザーンハイブリダイゼイション法を行った
〔Ａ．Ｃ．フォスター (1985) Nucleic Acids Res. 1
3, 745-761]。
相補性となっている。このため一方をニトロセルロース
フィルターに実施例１と同様に１〜128 ｐｇ／μｌまで
ドットプロットし、他の方向のＤＮＡを含む一本鎖ＤＮ
Ａを実施例１の方法によりビオチン化しこれをプローベ
としてサザーンハイブリダイゼイション法を行った
〔Ａ．Ｃ．フォスター (1985) Nucleic Acids Res. 1
3, 745-761]。
【００２０】ＤＮＡをドットプロットしたニトロセルロ
ースフィルターを４時間プレハイブリダイゼイション緩
衝液（50％v/v 脱イオン化ホルムアミド、５×ＳＳＣ、
50ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ6.5 、0.25ｍｇ／ｍｌソニ
フィケイテッドディネイチャーサーモンスパームＤＮ
Ａ、0.2 ｍｇＳＤＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ、0.2 ｍｇ／ｍ
ｌポリビニルヒロリドン）に42℃で浸漬した。その後ハ
イブリダイゼイション緩衝液４体積に対して１体積の硫
酸デキストリン0.5 ｇ／ｍｌとビオチン化ＤＮＡが100
ｎｇ／ｍｌとなるようにハイブリダイゼイション緩衝液
を調製し、これにプレハイブリダイゼイションを終了し
たフィルターを55℃で20時間浸漬した。この後、２×Ｓ
ＳＣ、0.1 ％ＳＤＳにて室温で15分ずつ３回洗浄し、更
に0.1 ×ＳＳＣ、0.1 ％ＳＤＳで55℃20分ずつ３回洗浄
した。この後実施例１と同様の方法によりストレプトア
ジピンアルカリホスファターゼコンジュゲイト、ＮＢ
Ｔ、ＢＣＩＰにより発色反応を行った。８ｐｇＤＮＡま
で検出可能であった。これによりサザーンハイブリダイ
ゼイション法におけるプローベＤＮＡの非放射標識が可
能であることが判った。
ースフィルターを４時間プレハイブリダイゼイション緩
衝液（50％v/v 脱イオン化ホルムアミド、５×ＳＳＣ、
50ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ6.5 、0.25ｍｇ／ｍｌソニ
フィケイテッドディネイチャーサーモンスパームＤＮ
Ａ、0.2 ｍｇＳＤＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ、0.2 ｍｇ／ｍ
ｌポリビニルヒロリドン）に42℃で浸漬した。その後ハ
イブリダイゼイション緩衝液４体積に対して１体積の硫
酸デキストリン0.5 ｇ／ｍｌとビオチン化ＤＮＡが100
ｎｇ／ｍｌとなるようにハイブリダイゼイション緩衝液
を調製し、これにプレハイブリダイゼイションを終了し
たフィルターを55℃で20時間浸漬した。この後、２×Ｓ
ＳＣ、0.1 ％ＳＤＳにて室温で15分ずつ３回洗浄し、更
に0.1 ×ＳＳＣ、0.1 ％ＳＤＳで55℃20分ずつ３回洗浄
した。この後実施例１と同様の方法によりストレプトア
ジピンアルカリホスファターゼコンジュゲイト、ＮＢ
Ｔ、ＢＣＩＰにより発色反応を行った。８ｐｇＤＮＡま
で検出可能であった。これによりサザーンハイブリダイ
ゼイション法におけるプローベＤＮＡの非放射標識が可
能であることが判った。
【００２１】
【発明の効果】本発明は、（化１）で表されるカルボジ
イミド基を有するビオチン誘導体を一本鎖としたＤＮＡ
又はＲＮＡと反応させＤＮＡ又はＲＮＡをビオチン化す
ることににより遺伝子を非放射標識する方法である。
（化１）のビオチン誘導体は一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと
反応してこのＤＮＡ等を非放射標識する。この（化１）
のビオチン誘導体は比較的安価に製造することができ、
かつ容易にＤＮＡ又はＲＮＡと反応して非放射標識され
たＤＮＡ又はＲＮＡを生成する。又該非放射標識された
ＤＮＡ等は独特の発色により他の化合物やＤＮＡ等から
標識することができる。従って本発明方法による遺伝子
の非放射標識方法は容易かつ経済的に実施できるＤＮＡ
又はＲＮＡの標識方法である。
イミド基を有するビオチン誘導体を一本鎖としたＤＮＡ
又はＲＮＡと反応させＤＮＡ又はＲＮＡをビオチン化す
ることににより遺伝子を非放射標識する方法である。
（化１）のビオチン誘導体は一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと
反応してこのＤＮＡ等を非放射標識する。この（化１）
のビオチン誘導体は比較的安価に製造することができ、
かつ容易にＤＮＡ又はＲＮＡと反応して非放射標識され
たＤＮＡ又はＲＮＡを生成する。又該非放射標識された
ＤＮＡ等は独特の発色により他の化合物やＤＮＡ等から
標識することができる。従って本発明方法による遺伝子
の非放射標識方法は容易かつ経済的に実施できるＤＮＡ
又はＲＮＡの標識方法である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4Ｂ
Claims (1)
- 【請求項１】 【化１】 （Ｒ1 は炭素数１〜６のアルキル基又はシクロアルキル
基、Ｒ2 は炭素数１〜６のアルキレン基、Ｒ3 及びＲ4
は同一又は異なる炭素数１〜３のアルキル基、Ｘ- は塩
素イオン、臭素イオン及びヨウ素イオンから選択される
１種類のハロゲンイオンをそれぞれ示す）で表されるカ
ルボジイミド基を有するビオチン誘導体を一本鎖とした
ＤＮＡ又はＲＮＡと反応させＤＮＡ又はＲＮＡをビオチ
ン化することにより遺伝子を非放射標識する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33003493A JPH07157497A (ja) | 1993-12-01 | 1993-12-01 | ビオチン誘導体により遺伝子を非放射標識する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33003493A JPH07157497A (ja) | 1993-12-01 | 1993-12-01 | ビオチン誘導体により遺伝子を非放射標識する方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07157497A true JPH07157497A (ja) | 1995-06-20 |
Family
ID=18228038
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33003493A Pending JPH07157497A (ja) | 1993-12-01 | 1993-12-01 | ビオチン誘導体により遺伝子を非放射標識する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07157497A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0806431A3 (en) * | 1996-05-08 | 1999-04-07 | Nisshinbo Industries, Inc. | Carbodiimide group-containing digoxigenin derivatives |
-
1993
- 1993-12-01 JP JP33003493A patent/JPH07157497A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0806431A3 (en) * | 1996-05-08 | 1999-04-07 | Nisshinbo Industries, Inc. | Carbodiimide group-containing digoxigenin derivatives |
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