JPH07503947A - Ｄｎａプローブ分析用の改良された電気化学ルミネッセンス標識 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＤＮＡプローブ分析用の改良された電気化学ルミネッセンス標識発明の分野 本発明は、ホスホルアミダイト化学を用いるオリゴヌクレオチドの新規な電気化 学ルミネッセンス（Ｅ　ＣＬ）標識に関する。更に具体的には、本発明はトリス （２，２−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）１体であるビス（２，２−ビピリジ ン）　［４−＋４−　（２−シアノエトキシ−Ｎ、　Ｎ−ジイソプロピルアミノ ）ホスフィノキシブチル）−４′−メチル］−２，２−ビピリジンルテニウム（ ■りジヘキサフルオロホスフエートであって、自動ＤＮＡ合成の際に標識を直接 取り込むことができるものに関する。

幾つかの刊行物を、本明細書では括弧内のアラビア数字で示す。これらの文献の 全部の引用は、請求の範囲の直前の明細書の終わりに示している。これらの文献 は、本発明が関係する技術の状況について説明している。

発明の背景 生化学的および生物学的物質中での目的とする分析物質を検出し、定量するため の多くの方法および装置が開発されてきた。痕跡量の微生物、医薬品、ホルモン 、ウィルス、抗体、核酸および他のタンパク質を測定することができる方法およ び装置は、研究者や医師にとって極めて重要である。

当該技術のほとんどは、周知の結合反応、例えば抗原−抗体反応、核酸のハイブ リダイゼーション技術およびタンパク質−リガント系に基づいて開発されてきた 。多くの生化学および生物学的結合系では特異性が高いため、多くの分析法およ び系が研究や診断に重要となってきた。典型的には、目的とする分析物質は、１ 種類以上の結合物質に結合した観察可能な「標識」の存無によってその存在が示 される。特に興味深いのは、光化学、化学および電気化学的手段によって発光さ せることができる標識である。

「ホトルミネッセンス」は、物質が電磁線を吸収して誘発されて発光することに よる過程である。螢光および燐光はホトルミネッセンスの一種である。「化学ル ミネッセンス」過程は、エネルギーの化学的転移による発光種の生成を伴う。

「電気化学ルミネッセンスｊは、電気化学的な発光種の生成を伴う。目的とする 分析物質を含む試料を化学ルミネッセンス標識で標識した反応物と混合を行う多 くの化学ルミネッセンス分析法が開発されてきた。反応混合物をインキュベージ コンすると、標識した反応物の幾分かが分析物質に結合する。インキュベージコ ンの後に、混合物の結合画分と未結合画分とを分離し、一方または両方の両分中 の標識の濃度を化学ルミネッセンス法によって測定することができる。一方また は両方の百分で測定した化学ルミネッセンスの程度は、生物学的試料中の目的と する分析物質の量を示している。

電気化学ルミネッセンス（ＥＣＬ）分析法は、他の分析法と比較して改良された ものである。この方法では、目的とする分析物質の存在および濃度を高感度で精 確に測定される。このような方法では、インキュベーションした試料をポルタン メトリーの作用電極に暴露して、ルミネッセンスを誘発させるのである。適正な 化学的環境では、このような電気化学的ルミネッセンスは特定の時間および特定 の方法で作用電極に加えられた電圧によって誘発される。標識によって生成され る光を測定して、分析物質の存在または量を示すのである。このようなＥＣＬ法 を更に詳細に説明するため、ＰＣＴ公表出願番号ＵＳ８５１０１２５３　（ＷＯ ８６１０２７３４）号明細書、ＰＣＴ公表出願番号ＵＳ８７１００９８７　（Ｗ Ｏ８７１０６７０６）号明細書およびＰＣＴ公表出願番号ＵＳ　８８１０３９４ ７（ＷＯ８９１０４３０２）号明細書を引用する。前記出願明細書の開示内容を 参考として本明細書に引用する。

また、米国特許出願連続番号第２６７．５０９号明細書および米国特許出願連続 番号第２６６．９１４号明細書は好ましい分析組成物に関するものであり、米国 特許第５，０６１，４４５号明細書および米国特許出願連続番号第７４４，８９ ０号明細書には、ＥＣＬに基づいた分析を行うための好ましい装置が教示されて おり、米国特許出願連続番号第６５２，４２７号明細書にはＥＣＬに基づいた分 析を行うための好ましい方法および装置が記載されている。これらの特許明細書 および出願明細書の開示内容も、参考として本明細書に引用される。ＰＣＴ公表 出願番号ＵＳ８９１０４９１９　（Ｗ０９０１０５３０１）号明細書に教示され ている方法では、研究および臨床での設定で行われる各種の分析において微量の 分析物質を検出し、定量することができる。しかしながら、研究者や臨床医の要 求により、これらの方法によって行われる分析の検出限界を低くし、これらの分 析法の感度を増加させ、これらの方法を行うことができる速度を増加させること か常にめられている。

詳細には、この要求はＤＮＡプローブ分析法を改良することにある。これに関し て、本出願人らは、目的とする分析物質を特異的な標識された化合物を用いて検 出できることを見出した。これらの標識化合物のあるものは既知であり、例えば ＡＵ３３３４３／８９号明細書およびパンワース（Ｂａｎｎｗａｒｔｈ）ら著［ 非放射性標識分子としてのバソフェナンドロリン・Ｒｕ”錯体によるオリゴヌク レオチドの簡単な特異的標識Ｊ　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、第 ３０巻、１２号、１５１３〜＋５１６頁、１９８９年に記載されており、他のも のは新規である。

発明の目的 したがって、本発明の主な目的は、試料中に含まれる目的とする核酸分析物質を 特異的標識化合物を用いて検出する方法を提供することである。

本発明のもう一つの関連した目的は、ポリメラーゼ連鎖反応または他のプライマ ーに対する反応を行い、反応で特異的な標識化合物を取り込むことによって反応 の増幅生成物中に目的とする核酸を検出する方法を提供することである。

本発明の更にもう一つの関連した目的は、ポリメラーゼ連鎖反応またはプライマ ーに対する反応の生成物中の目的とする核酸分析物質を、反応における少なくと も１個の核酸を特異的な標識化合物で標識することによって検出する方法を提供 することである。

これらおよび他の本発明の目的は、下記の説明および請求の範囲から８昌に明ら かになるであろう。

発明の要約 一つの態様では、本発明の目的は、式 （式中、ＭはＲｕ、ＯｓおよびＲｅから成る群から選択され、ｕ−ｔ＝ｖであり 、Ｕは１または２であり、ｔは１または２であり、Ｌ＋、Ｒ２およびＬ！は同一 でもまたは異なっていてもよく、それぞれであり、但し、Ｒ１，Ｒ２、Ｒ−、Ｒ ４、ＲｓおよびＲ，は同一でもまたは異なっていてもよ（、それぞれＨ１１〜５ 個の炭素原子を有するアルキル基、てあり、Ｒ＋　、Ｒｚ　、Ｒ−、Ｒ４、Ｒｅ およびＲ６の少なくとも一つはてあり、ｎは１〜２０の範囲の整数であり、Ｘは ０、ｓ、ｓｏ２、ｃｏｏおよびＣ０ＮＨから成る群から選択され、ａおよびｂは −Ｎ　（ＣＨ（ＣＨ−）ｔ　）ｓ、−ＮＨ−ＣＨ−（ＣＨｓ）ｚ　、Ｏ−（ＣＨ ２）ｉ−ＣＮ、０−ＣＨＩまたはモルホリノであり、但しａおよびｂは同一では なく、１　ＺはＭと会合する対イオンであり、リガンドＬ、、Ｌ、およびり、は 化合物が電気化学ルミネッセンスが可能であるように選択される）を存する化合 物を用いて達成される。

第二の懸様では、本発明の目的は、式 ［式中、Ｍ、Ｌ、、Ｌ、およびり、は前記で定義した通りであり、但し、Ｌｌ、 Ｒ２およびり、の定義に含まれる基Ｒ１〜Ｒ６の一つは、式・　（式中、ｎおよ びＸは…Ｉ記て定義した通りであり、ｙは１〜２０の整数であり、Ｚは０または ｌである）を有するリンカ−であり、Ｂは生体分子またはその合成類似体であり 、ホスホジエステル基はこの生体分子に結合している］を有する化合物であって 、電気化学ルミネッセンスが可能であるものを用いて達成される。

もう一つの態様では、本発明の目的は、式（式中、Ｍ、Ｒ＋　、Ｒｔ　、Ｒ１、 Ｒａ　、Ｒｅ　、ｎ、Ｘ、　ｙおよびＺは前記で定義した通りであり、ｍはｌ− １０００の整数であり、ＮＡＢは修飾されていてもまたは修飾されていなくとも よい核酸塩基である）を有し、電気化学的ルミネッセンスが可能な特異的な化合 物を用いて達成される。

更にもう一つの態様では、試料に含まれる目的とする核酸分析物質を検出する方 法の本発明の目的は、前記のプローブが目的とする分析物質に選択的に結合して 目的とする分析物質−プローブ錯体を形成する条件下”Ｃ１前記試料を式！１１ のプローブと接触させ、この錯体の電気化学ルミネッセンスを測定することによ って達成される。

更にもう一つの態様では、ポリメラーゼ連鎖反応または他のプライマーに対する 反応を行って、このポリメラーゼ連鎖反応または他のプライマーに対する反応の 増幅生成物中に目的とする核酸を検出するようにする方法において、（ａ）前記 のポリメラーゼ連鎖反応または他のプライマーに対する反応に前記の式Ｉｌ＋の プライマーを取り込み、 （ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応または他のプライマー−に対する反応を行い、（Ｃ ）目的とする増幅した核酸の電気化学ルミネッセンスを測定することによって、 本発明の目的が達成される。

もう一つの態様では、ポリメラーゼ連鎖反応または他のプライマーに対する反応 の生成物中で目的とする核酸を検出する方法の本発明の目的は、（ａ）前記の反 応における少なくとも１個の核酸を前記の式ＩＩＩの化合物で標識し、 （ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応または他のプライマーに対する反応を行って、前記 の核酸を増幅生成物中に取り込み、 （Ｃ）目的とする前記核酸の電気化学ルミネッセンスを測定することによって達 成される。

本発明を更に明確に理解するため、幾つかの用語の一般的定義を下記に示す。

「ヌクレオチド」とは、アデニン、シトシン、グアニンおよびチミン（ＤＮＡ） またはウラシル（ＲＮＡ）十糖（ＤＮＡではデオキシリボース、ＲＮＡではリボ ース）＋リン酸である４種の塩基の一つである。ＤＮＡ重合反応のモノマーを提 供するには、典型的にはデオキシヌクレオチド三リン酸の４種類総てが必要であ る。本明細書で定義されるヌクレオチドには、鋳型上でのポリメラーゼの作用を 改良するのに用いられる５−メチル−ｄＣＴＰおよび７−ジアザ−ｄＧＴＰのよ うな修飾された塩基を含むこともできる。本明細書で用いられるヌクレオチドと いう用語は、ビオチンおよびジゴキシゲニンに連結した塩基（ジゴキシゲニン、 ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）製、イ ンディアナポリス、インディアナ州）、およびビオチン−２１−ＵＴＰおよびア ミノ−７−ｄＵＴＰ（クロンチク（Ｃ１ｏｎｔｅｃｂ）、パローアルト（Ｐａｌ ｏ　Ａｌｔｏ）　、カリフォルニア州）も包含し、プライマーに直接にまたは増 幅の際にプライマー伸張生成物に取り込み、増幅した配列の選択した結合を提供 することもできる。

「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも２個のヌクレオチドから形成される配列 である。

［ポリヌクレオチＩ・」は長いオリゴヌクレオチドであり、ＲＮＡまたはＤＮＡ のいずれでもよい。

オリゴヌクレオチドという用語は、通常は当該技術分野で小さな核酸鎖を表ずの に用いられ、「ポリヌクレオチド」とは通常は当該技術分野でＤＮＡまたはＲＮ Ａ染色体またはそのフラグメントのような大きな核酸鎖を表すのに用いられ、本 明細書でのいずれかの用語の使用は、大きさを明らかに述べるものでなければ、 大きさを制限しまたは説明するものではない。

［核酸Ｊという用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ染色体またはそのフラグメントのよ うな任意の長さのポリヌクレオチドであって、前記のような修飾された塩基をイ ｆするまたは含まないものを指すことも当該技術分野では周知である。

［配列Ｊ　（例えば、配列、遺伝子配列、ポリヌクレオチド配列、核酸配列）は 、５′から３′方向へと読むポリヌクレオチド鎖に含まれる実際に列挙される塩 基（リボースまたはデオキシリボース）を指す。

「特異的または選択された」ヌクレオチド配列は、他の異なる配列とは区別され る特定の配列（例えば、ハイブリダイゼーション分析による）を指す（例えば、 特異的ヌクレオチド配列５’−ＡＴＧＣＣＣ−３’は５’　−ＡＡＧＣＣＣ−３ ’とは同じ配列ではない）。

「プローブ」とは、目的とする標的核酸配列に相補性配列を有し、ブローブー標 的二本鎖を検出することができる何らかの追加的特徴を有する一本鎖または二本 鎖核酸である。当業者であれば、プローブおよび／または標的が二本鎖であれば 、二本鎖核酸はハイブリダイゼーションが起こる前に鎖の分離を行わなければな らないことを理解するであろう。

プローブをタグまたはマーカーを取り付けることによって検出可能にする。プロ ーブに連結したタグまたはマーカーには、螢光または発光タグ、同位体（例えば 、放射性同位体または磁気共鳴）標識、染料マーカー、酵素マーカー、抗体によ って検出可能な抗原決定基、または結合残基、例えばストレプトアビジンをコー ティングしたビーズのようなもう一つのインディケータ−残基をプローブに特異 的に結合させることかできるビオチンを挙げることができる。標識したまたはタ グを付けたブローブー標的二本鎖を形成させるときには、この二本鎖はタグまた は標識の特性によって検出することができる。または、下記の実施例でＥＣＬ分 析法について説明されるように、結合残基を有するプローブはハイブリダイゼー ションまたは二本鎖形成によって標識した標的を補足し、標識または他の当該技 術分野で知られている手段によって検出することができる。

「標識」または核酸に適用したときに「標識した」という用語は、問題の核酸が ある残基に連結し、これがその特性によって検出可能であることを意味し、発光 、電気化学発光、同定する化学物質の触媒作用、放射能、または特異的結合特性 を挙げることができる。したがって、「標識」という用語としては、特に断らな いかぎりリガント残基か挙げられる。

「プライマー」とは、目的とする配列の一部に相補性のオリゴヌクレオチドの比 較的短いセグメントである（目的とする配列は、大きな核酸配列内部のサブフラ グメントであることができる）。プライマーは、生成する伸張生成物の５′末端 を表す。鋳型鎖車の目的とする配列に対して３′末端で相補性のプライマーは、 この３′末端に鋳型に対するハイブリダイゼーション時にポリメラーゼを作用さ せることができる。３′末端を修飾するとオリゴヌクレオチドがプライマーとし て機能する能力に影響を与えることは周知である。−例は、ＤＮＡ配列決定にお いてジデオキシヌクレオチドを取り込むことによって、ＤＮＡポリメラーゼの作 用防止することである。プライマーの長さは特定の用とによって変わるが、２０ 〜３０塩基対が通常の大きさであることは周知である。公知のように、プライマ ーは、ハイブリダイゼーションを良好に起こすには完全な相補体である必要はな い。プライマーが不完全補体であるどきには、プライマー配列を取り込む伸張生 成物が生じ、後のサイクルにおいて、プライマー配列に対する相補体は鋳型配列 に取り込まれる。したがって、鋳型の相補体の配列から変化した配列を有する適 当に選択されたプライマーを用いてイン・ビトロで突然変異を誘発させることが できることは周知である。プライマーは、前記で定義した任意の当該技術分野で 知られている修飾したまたは標識した塩基などの任意の当該技術分野で知られて いる核酸塩基を取り込み、プライマー伸張生成物がこれらの特徴を取り込み、プ ライマー伸張生成物を分離し、検出することができるようにすることができる。

プライマーに有利に連結したタグまたはマーカーとしては、螢光または発光タグ 、同位体（例えば、放射性同位体または磁気共鳴）標識、染料マーカー、酵素マ ーカー、抗体によって検出可能な抗原決定基、または結合残基、例えばストレプ トアビジンをコーティングしたビーズのようなもう一つのインディケータ−残基 をプローブに特異的に結合させることができるビオチンを挙げることができる。

標識したまたはタグを付けた増幅生成物を形成させるときには、この増幅生成物 はタグまたは標識の特性によって検出することができる。

特異的または選択されたプライマーは、（プライマーに対して）相補性のアダプ ター末端配列が結合している任意のＤＮＡ配列に無差別にアニールする「普遍プ ライマー」とは区別される。普遍プライマーでは、目的とする核酸を単離し、あ るいは目的とする所望なりＮＡ配列にだけライゲーション処理を指示し、含まれ ている総ての核酸配列にアダプターが無作為に結合するのを避けるように留意し なければならない。「単一プライマー」という用語は、目的とする標的の核酸配 列と選択的にハイブリダイゼーションするように設計された単一で、不対の、特 異的または選択されたプライマーを意味する。

［単一プライマー増幅」とは、目的とする配列の一部に相補性である単一で不対 のプライマーだけを用いて核酸を増幅する方法である。

［ハイブリダイゼーション」とは、相補性の一本鎖核酸から二本鎖または二重核 酸を形成することを表している。ハイブリダイゼーションは、相補性の高い一本 鎖ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの間て起き、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡま たはＲＮＡ−ＲＮＡを形成することができる。

「アニーリング」とは、一本ｊ！核酸を含む溶液の温度が融点または変性温度以 下に低下するとき、相補性の一本鎖核酸間のハイブリダイゼーションを指す。

ＤＮＡのイン・ビトロでの増幅は、ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される。

多くの種類のＤＮＡポリメラーゼが当該技術分野に知られている。それらは、一 般的に、プライマーがアニールされている一本鎖の鋳型を用いる二本鎖のＤＮＡ 配列の合成を触媒する共通の特性を存している。はとんどの生体から抽出される ＤＮＡポリメラーゼは、核酸の熱変性に必要な温度では不活性になる。したがっ て、熱に感受性のある酵素を用いるときには、それぞれの熱サイクルの開始時に 酵素を置換しまたは熱不活性化を防止することができる因子を添加する必要があ る。イン・ビトロてのＰＣＲに好ましいＤＮＡポリメラーゼは、高温で成長し、 したがって耐熱性である（二本ｌＤＮＡを変性する温度で触媒活性を喪失しない ）生体から誘導される。

ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応は当該技術分野に知られており、本 明細書ではｒＤＮＡポリメラーゼ反応」と表わす。この反応では、本明細書で修 飾されるときには、当該技術分野で知られているような緩衝液、ＤＮＡ鋳型（目 的とするＤＮＡ配列）の供給物、４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸（前記 のような修飾した塩基を含むことができる）の幾つかまたは総て、鋳型の３′末 端にまたは付近でハイブリダイゼーションするように設計された単一の特異的プ ライマーであって、目的とする核酸に対して１０００：１のモル過剰量で好まし く用いられるもの、および環状鎖の分離の手段を必要とする。鎖の分離は、好ま しくはアニーリング温度と変性温度との間で熱サイクリングによって行われる。

逆転写酵素はＲＮＡのＤＮＡへの複写並びにＤＮＡのＤＮＡへの複写を媒介する ことが知られている。したがって、任意の数の既知の酵素が、連鎖反応を触媒す ることになる。

［電気化学ルミネッセンス（ＥＣＬ）標識」は、電気化学的に作用するときに発 光種となるものである。それらは、目的とする分析物質の存在および濃度を、高 感度で精確に測定する。この技術では、試料をポルタンメトリーによる作用電極 に暴露して、ルミネッセンスを誘発させる。標識によって生じる光を測定し、分 析物質の存在または量を測定し、示すのである。このようなＥＣＬ法は、バード （Ｂａｒｄ）ら（ＰＣＴ　ＵＳ８５１０２１５３．ＷＯ３６１０２７３４号明細 書）およびマッセイ（Ｍａｓｓｅｙ）ら（ＰＣＴ　ＵＳ８７１００９８７．　Ｗ Ｏ８７１０６７０６号明細書）のＰＣＴ公表出願明細書に記載されている。

ｒＥＣＬＥＣ縁衝剤」どは、ＥＣＬ分析装置の電極上での電気化学反応に必要な トリプロピルアミンを含む通常の希釈液である。

ｒＥｃＬ希釈液」とは、保存用の不安定な二分子を含む希釈溶液中で用いられる 希釈試薬である。

「検出」および「定量」という用語は、「測定Ｊを表わし、定量には対照組成物 およびギヤリプレージョンの調製が必要なことがある。

ｒＥＣＬ装置」は、電気化学ルミネッセンスに基づいた分析を行うための任意の 装置である。

タグＮＨ３（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）およびタグホスホルアミダイト はＥＣＬタグの例である。タグーＮＨＳエステルは、ＮＨＳエステルと反応して アミド結合を形成することができる有利のアミノ基を含む物質を標識するのに有 用である。（例えば、ＷＯ３６１０２７３４号明細書を参照されたい）。タグホ スホルアミダイトは、ホスホ−結合、特にホスホジエステル結合を形成する遊離 のアミ人スルフヒドリルまたはヒドロキシル基を含む物質を標識するのに存ＤＮ Ａプローブ分析法の改良がめられ続けている。高感度の核酸プローブ分析法は、 特異的な標識化合物を用いて行うことができることが見出された。

特に、高感度の核酸プローブ分析法は、式（式中、Ｍｌ、ｔＲｕ、ＯｓおよびＲ ｅから成る群から選択され、ｕ−ｔ＝Ｖであり、Ｕは１または２であり、ｔは］ または２であり、Ｌ、、Ｌ、およびＬ３は同一でもまたは異なっていてもよく、 それぞれであり、但し、Ｒ，、Ｒ，、Ｒ，、Ｒ，、ＲｓおよびＲ６は同一でもま たは異なっていてもよく、それぞれＨ，１〜５個の炭素原子を存するアルキル基 、であり、Ｒ＋　、Ｒｘ　、Ｒｓ　、Ｒａ　、ＲｓおよびＲ１の少なくとも一つ はであり、ｎは１〜２０の範囲の整数であり、Ｘは０、ｓ、ｓｏ、、ｃｏｏおよ びＣ０ＮＨから成る群から選択され、ａおよびｂは−Ｎ　（ＣＨ−（ＣＨＬ）＊ 　）！　。

−ＮＨ−ＣＨ−（ＣＨｓ）ｉ　、Ｏ−（ＣＨ２）！−ＣＮ、０−ＣＨ，またはモ ルホリノであり、但しａおよびｂは同一てはなく、ＺはＭと会合する対イオンで あり、リガンドＬ＋、Ｌｔおよびり、は化合物が電気化学ルミネッセンスか可能 であるように選択される）を有する化合物を用いて達成される。

一つの態様では、前記の式（１）の化合物であって、Ｌ、、Ｌ、およびり、が総 て置換されたまたは未置換のビピリジルであり、ｎが４〜７である化合物を高感 度核酸プローブ分析法に用いる。

特に好ましい懸様では、トリス（２，２−ビピリジン）ルテニウム（Ｉ　Ｉ）錯 体であるビス（２，２−ビピリジン）［４−（４−（２−シアノエトキシ−Ｎ。

Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスフィノキシブチル）−４′−メチル］−２，２ −ビピリジンルテニウム（ＩＩ）ジヘキサフルオロホスフエートであって、自動 ＤＮＡ合成の際に標識を直接取り込むことができるものを用いる。同様な結果は 、オスミウムおよびレニウムの錯体でも得られる。

本発明の分析法は、はとんど総ての生体分子またはその合成類似体を検出するの にも用いることができるのは勿論である。しかしながら、この分析法は、試料中 に含まれる目的とする核酸分析物質、具体的には核酸配列を検出するのに特に作 用である。目的とする分析物質は、プローブに選択的に結合することができ、ま たはポリメラーゼ連鎖反応または他のプライマーに対する反応の生成物であるこ とができる。

同様な化合物は、例えばＡＵ３３３４３／８９号明細書に教示されている。しか しながら、こわらの化合物は、ＤＮＡのような核酸と好ましくない非特異的相互 作用を行う。更に、文献中の好まし、い化合物はバソフェナンドロリン・Ｒｕ” およびベンズバソフェナンドロリン・Ｒｕ目錯体である。これらの化合物の問題 点としては、その大きさおよび水溶性の欠如が挙げられる。また、この錯体上の アリール置換基には大きさの問題点があり、ＥＣＬ分析の際に電極を干渉するこ とがある。この文献は螢光だけに関するものである。螢光は、分子が光線を吸収 した後、分子から直接放出される光線である（１０−’秒のオーダー）。時間に よ５って決定される螢光は、様々な螢光発色団が螢光を発するのに要する時間に 基づいている。寿命が長い（０，１〜ｌ０ＸＩＯ−’秒）螢光発色団は、寿命が 短い（１Ｑ〜ｌＸｌ０−’秒）普通の（試料や容器中の混入物のような）ものと は容易に分離される。

ルミネッセンスが放射エネルギーを吸収することによって生じる螢光とは異なり 、ＥＣＬによって生じるルミネッセンスは、電極の界面での電気化学によって生 じる。例えば、本発明のある種の化合物では、Ｒｕ”はＲｕ”へ酸化された後、 ｌ・リブロピルアミンの電気化学的酸化生成物と反応して、Ｒｕ”の励起状態を 生じ、こｔｌがそのエネルギーを光として放出するのである。この種の励起の酸 化−還元機溝は、螢光の場合に起こる励起とは著しい対照を示している。、二の 差は、例えば本発明の化合物およびＡＵ３３４３／８９号明細書に教示されてい る化合物の螢光およびＥＣＬ容量を比較している下記の図表に示されている。特 に、この図表は、ビピリジルおよびバソフェナ二ノトロリンＲｕｇ体の間の螢光 およびＥＣＬ容量を比較している。

化合物　分−Ｔ４ｋ　を麩’　相対螢光強度８　相対ＥＣＬ強度３Ｒｕ　（Ｂｐ ｙ）ｓ　７４８　６］５ｎｍ　１．０　＋、０・６　（Ｈｚ　０） Ｒｕ　（Ａ）　ｔ　Ｂ　Ｉ　６９０　６３０　９．２　０．００３Ｒｕ　（Ａ） 　ｚ　Ｃ’　！　８５０　６３０　７．３　０．０９６Ｒｕ　（Ａ）２Ｄ　１８ ７８　６３０　７．３　０．０８０１＝４５０ｎｍで励起。

２＝緩衝液放射について補正。

コニ緩衝液ＥＣＬについて補も 化合物の相対的ＥＬＣ８ｉは、成体分子またはその類似体に結合したときに実質 的にはその化合物によって示される。

本発明において特に興味深い化合物は、この化合物の相対ＥＣＬ容量とビビリ、 カレ類似体の相対ＥＣＬ容量どの比率が０．１０以上であるものである。この比 率は少なくとも０，２５であるのか望ましく、好ましくは１．０以上である。

本発明を更によく理解するために、多数の例を示すが、これらの実施例は発明の 範囲を制限することを意図するものではない。これらの例は、単に当業者に発明 を例示する目的で提供されるものである。

この合成上程は、下記の工程図１ａ）を参照することによって更によく理解する ことができる。

下記の処理手続は、４−炭素スペーサ−アームを有するビビリ９ンリガンドの合 成についてのものである。しかしながら、同じ合成手続を、ブロモヘキサノール のＴＨＰ−誘導体を用いて７−炭素ビピリジンリガンドの合成について全く変更 なしに用いられている。

３−ブロモ−１−プロパツール１２．５ｇ（約９０ミリモル）を、２５０ｍ１の 丸底フラスコにいれた。ジクロロメタン５０．０ｍｌおよびｐ−１−ルエンスル ホ：ノ酸１００ｍｇをフラスコに加えた。溶液を磁気撹拌プレート上で撹拌した 。

３．４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン９．２ｇ（約１１０ミリモル）をジクロロメタ ン８０ｍ１に溶解し、生成する溶液を圧を均等にした添加漏斗に入れた。添加漏 斗中の３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン溶液を、フラスコ中の溶液に１時間かけ て加えた。フラスコ中の溶液の色が、明または暗緑色に変化した。反応の進行を 、５０％へキサン　５０％酢酸エチル中のシリカゲルブｌノート上でＴＬＣによ ってチェックした。ＴＬＣプレートを、リンモリブデン酸の溶液にプレートを浸 漬することによって展開し、これをホットプレート上で加温した。生成物である ３−ブロモ−１−プロパツールのＴＨＰ−誘導体のＲ１は約１．０であり、未反 応の３．４−ジヒドロ−２Ｈ−ピランのＲ，は約０゜５（筋を示す）であった。

ＴＬＣは、反応が３．４−ジヒドロ−２Ｈ−ピランの添加後約１時間で完結した ことを示し、Ｒ１が約１．０の主要な単一スポットによって示された。次に、２ ０％重炭酸ナトリウム溶液１００ｍ１を加えて反応を停止させた後、水性層をジ クロロメタン１００ｍ１で２回抽出した。−緒に合わせたジクロロメタン層を５ ０ｇ無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、ロータリーエバポレーターで蒸発させて、 油状生成物を得た。

最終（油状）生成物を、移動相として５％酢酸エチルニ９５％ヘキサンを用いて シリカゲルカラムクロマトグラフィによって精製した。クロマトグラフィは、前 記の溶媒条件を用いてＴＬＣによって監視した。純粋な生成物を含む画分を合わ せ、溶媒をロータリーエバポレ−ターで蒸発させて除去したところ、純粋で透明 な油状生成物１６．０ｇを得た。、二の反応段階の収率は約７５±５％であった 。

’Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、（反応工程図■で示されるように”）ＴＨＰ−基の Ｈ５プロトンに特徴的な４．５５ｐｐｍに多重線を示す。

３−ブロモプロパツールのＴＨＰ−誘導体の’Ｈ−ＮＭＲスペクトルデータ：　 ’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩｓ　）　、６１．　３０〜１．　８０　（ｍ、６）　；２ ．　０６（ｑｎ、２）；３．４０〜３．　５０　（ｍ、４）　；３．　７４〜３ ．　８３　（ｍ、２）；および４．５０〜４．５７　（ｍ、ｌ）。

！　（ｂ）　アルキル化反応 この合成工程は、下記の工程図１ｂ）を参照することによって更によく理解する ことができる。

この処理手続は、リチウムジイソプロピルアミド（ＬＤＡ）の現場での生成を用 いた。５００ｍ１の丸底フラスコをオーブンで乾燥し、デシケータ−中で冷却し て使用訂に水分を除去した。ジイソプロピルアミン３．　１ｍｌ　（約２２ミリ モル）を、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１５．Ｏｍｌと共に５００ｍ１丸底フ ラスコに入れた。フラスコの口には、三方コックが取り付けてあった。このコッ クの出口の一つはアルゴンを満たしたゴム風船に連結されており、他の出口はゴ ム隔膜で封印して、シリンジを用いて試薬を容易に導入できるようにした。フラ スコを、絶えず撹拌を続けたドライアイス−イソプロピルアルコール冷却槽中で 一７８℃に冷却し、この槽にはドライアイスとイソプロピルアルコールを必要に 応じて追加して検温を保持した。３０分後に、ブチルリチウム１４．Ｏｍｌ　（ 約２２ミリモル）を、ゆっくりとジイソプロピルアミン溶液に添加した。添加の 後に、反応フラスコを注意しながら冷却槽から１０分間上げ、その後冷却槽に再 度浸漬した。

４．４′−ジメチル−２，２′−ビピリジン３．６８ｇ（約２０．θミリモル） を乳棒と乳鉢で摩砕して微粉末とした。これを、２５０ｍ１丸底フラスコ中で乾 燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）８０．Ｏｍｌに溶解した。反応フラスコを冷却 槽の界面上まで引上げ、ビピリジン溶液を徐々に加えた。ビピリジン溶液を添加 したところ、反応混合物の色は暗紫色に変化した。ビピリジン溶液を添加し終わ った後、フラスコを冷却槽に再度浸漬し、反応混合物を冷却槽中で２時間撹拌し た。３−ブロモ−１−プロパ／−／１，１７）ＴＨＰ−誘導体６．０ｇ（約２６ ．０ミリモル）を１００ｍ１丸底フラスコに入れた後、乾燥ＴＨＦ約ｌＯ〜１５ ｍ１を加え、溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発させた。乾燥ＴＨＦの添加 および蒸発の工程を更に２回繰り返し、それぞれの操作時に真空にアルゴンを流 入させた。最後に、残渣を乾燥ＴＨＦ５．Ｏｍｌに溶解し、生成する溶液を反応 混合物に加え、更に１時間撹拌した。反応はシリカゲルプレート上で１０％メタ ノール：９０％クロロホルムを移動相として用いてＴＬＣによってチェックした 。ＴＬＣでは２個のスポットが観察された。移動率の小さな（未反応の）４．４ ’−ジメチル−２，２′−ビピリジンのＲ１は約０．３５であり、移動率の大き なアルキル化生成物のＲ，は約０．４２である。所望な生成物に対応するＴＬＣ スポットが未処理の出発物質に対して６０質量％を上回るとき、反応は良好であ った。

反応混合物を、次に一晩撹拌した。ドライアイスまたはイソプロピルアルコール を冷却槽に更に添加する必要はなかった。

反応のＴＬＣを翌日再度チェックした。次に、飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液１００ｍ１を 加えて反応を停止し、反応停止した混合物を分岐漏斗に移した。振盪を行い、混 合物を沈澱させた後、溶液を底部の水層と上部のＴＨＦ層とに分離した。次いで 、ＴＨＦ層を分離して、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。水層をジクロロメタ ン１５０ｍ１で２回抽出した。−緒に合わせた有機層を無水硫酸ナトリウム上で 乾燥し、ロータリーエバポレーターで蒸発させ、油状残渣を得た。反応混合物を 生成する前に、下記のＩ　（ｃ）に記載の方法でＴＨＦ基の脱保護を行った。

＋　（ｃ）　ＴＨＦ基の脱保護およびカラムクロマトグラフィによる精製この合 成工程は、下記の工程図１ｃ）を参照することによって更によく理解することが できる。

未反応の４，４′−ジメチル−２，２′−ビピリジンとアルキル化生成物との間 のＲ，の差は極めて小さい。したがって、ＴＨＰ−基の脱保護を行い、所望な生 成物と不純物との間のＲ，の差をかなり大きくしてからビピリジンリガンドの精 製を行うのが好ましい。

化合物　Ｒ。

４−炭素ビピリジンリガントのＴＨＰ−誘導体　０，４２４．４′−ジメチル− ２，２′−ビピリジン（未反応）　０．３５４−炭素ビピリジンリガンド（アル コールリガンド）　０．１５メタノール４０ｍ１をアルキル化反応（＋　（ｂ） 節）からの油状残渣に加え、２５０ｍ１丸底フラスコに入れた。油状残渣は、未 反応の４，４′−ジメチル−２，２′−ビピリジン、ビピリジンリガンドのＴＨ Ｐ−誘導体（所望な生成物）および未反応の３−ブロモ−１−プロパツールのＴ ＨＰ−誘導体を含んでいる。

ｐ−トルエンスルホン酸５．０ｇ（約２５ミリモル）を反応混合物に加えた後、 室温で１時間撹拌した。反応は、シリカゲルプレート上で１０％メタノール；ク ロロホルムを移動相とするＴＬＣによって監視した。各種の成分に対するＲ１値 は、未反応の４，４−ジメチル−２，２′−ビピリジンのＲｒは約０．３５、ス ペーサーアームを有するビピリジンリガンドのＴＨＰ−誘導体のＲ９は約０．　 ４２、およびスペーサーアームを有するビピリジンアルコールリガンドのＲ９は 約０．１５であった。反応の完結は、ＴＬＣ上でのビピリジンリガンドのＴＨＰ −誘導体に対応するスポット（Ｒｔ約０．４２）の消失によって示された。次に 。

溶媒（メタノール）をロータリーエバポレーターで蒸発させ、残渣をジクロロメ タンｌ０ｍ１に再懸濁し、これに重炭酸ナトリウムの飽和溶液４０．Ｏｍｌを加 えた。次に、水層をジクロロメタン１００ｍ１で２回抽出した。−緒に合わせた 有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶媒をロータリーエバポレーター上で 留去したところ、生成物として油状残渣を得た。

油状生成物を２％メタノール、９８％クロロホルムを移動相として用いてシリカ ゲルカラムクロマトグラフィによって精製した。カラムはｌＯ％メタノール＝９ ０％クロロホルムでシリカゲル上でＴＬＣによって監視した。純粋な画分（ＴＬ Ｃによって判定）を合わせて、溶媒をロータリーエバポレーターで留去した。

アルギル化反応の収率は、反応中の乾燥条件の保持並びにブチルリチウムのよう な試薬の新鮮さによって極めて大きく変化した。このアルキル化反応の収率は、 約６０±１０％であった。化合物は、資料の’Ｈ−ＮＭＲスペクトルを記録する ことによって特徴決定した。

ビピリジンアルコールリガンドの’Ｈ−ＮＭＲスペクトルデーター：　’Ｈ−Ｎ ＭＲ（ＣＤＣ１，）、δ１．　５４〜１．　６４　（ｍ、２）　；　１．　６８ 〜１．　８０（ｍ、２）　；２．　４５　（ｓ、　ＡＲＣＨＩ　）　；２．　６ ６〜２．　７５　（ｔ、２）　；３、　５９〜３．　６８　（ｔ、２）　；７． 　０９〜７．　２０　（ｍ、２．　Ａｒ−Ｈ）　；８゜２０　（ｓ、２．　Ａｒ 　−Ｈ）　；　８．　５０〜８．　６０　（ｍ、２．　Ａｒ−Ｈ）。

２、トリス−ビピリジンルテニウム（１１）錯体タグ−アルコールの製造この合 成工程は、下記の反応工程図２）を参照することによって一層よ（理解すること ができる。

ノスージクロロービス（ビピリジン）ルテニウム（Ｉ　Ｉ）二水和物１．０４０ ｇ（２，０ミリモル）および（ｌｃ節からの）４−炭素ビピリジンリガンド５３ ０．０ｍｇ（約２．２ミリモル）を２５０ｍ１丸底フラスコに入れ、ｌＯ％エタ ノール／水５０．Ｏｍｌを加え、溶液にアルゴンガスを１０〜１５分間流した。

フラスコに水冷式冷却器を取り付け、混合物を６時間還流し、トリス−ビピリジ ンルテニウム（Ｉ　Ｉ）錯体を形成させた。還流中は、フラスコをアルミニウム 箔て覆った。溶媒をロータリーエバポレーターで留去した後、錯体をできるだけ 少量の脱イオン水に溶解させ、イオン交換カラムに載せた。

通常の精製手続ではイオン交換樹脂７．０ｇを用いて、錯体１．３ｇ（約２゜０ ミリモノりをカラムクロマトグラフィによって精製した。樹脂を、脱イオン水３ ００ｍ１で２〜３時間膨潤させた後、膨潤した樹脂を長さか３０ｃｍで内径が２ ．５ｃｍのカラムに１５ｃｍの高さまで充填した。次いで、樹脂に洗浄して乾燥 した砂を０．５ｃｍの高さまで積層し、カラムを脱イオン水２５０ｍ１で洗浄し た。第２節からの錯体形成反応から得たタグ−アルコールをできるだけ少量の脱 イオン水に溶解させ、樹脂の細上部に注意しながら積層した。クロマトグラムを 、脱イオン水２５０ｍ１でカラムを洗浄することによって展開した。この洗浄段 階中に明黄色の不純物は（深紅色の）主バンドから分離し始めた。この不純物を 、ｌｏｒｎＭ　ＮａＣｌ溶液約３５０ｍ１でカラムを洗浄することによって、カ ラムから溶出した。溶離液を、後で１００ｍＭ　ＮａＣ１溶液に切り替えた。そ の後、主要な深紅色バンドが溶出し始め、所望な生成物のほとんどは５００〜６ ００ｍ１の容積で溶出した。暗褐色の物質は永久にカラム上に吸着して、イオン 強度の極めて大きい緩衝液（２〜３Ｍ　Ｈ（ｌおよびＮａＣＩ）でもカラムから 溶出しなかった。

溶出したタグ−アルコールを、次の手続にしたがってヘキサフルオロリン酸アン モニウムを用いて沈澱させた。溶出物を絶えず撹拌しながら加熱して沸騰させた 後、７５〜８０°Ｃまで冷却し、次いで安定な沈澱が生じる（沈澱が生じ、再度 溶解しなくなる）までスパーチルを用いて少量のへキサフルオロリン酸アンモニ ウムを加えた。溶液を最初に室温（２０〜２５℃）にした後、４℃まで一晩冷却 した。生成する沈澱を溶融ディスク（１０〜１５μｍ）を備えたグツフナ−漏斗 上に集めた後、真空で乾燥した。カラム精製の後のこの錯体形成反応の平均収率 は〉８０％であった。この段階での錯体の分子量は約９４５．４５（水和の水を 除く）である。

前記の手続によって調製して精製したタグ−アルコールを、次にＨＰＬＣおよび ’Ｈ−ＮＭＲスペクトル分析法によって分析した。ＨＰＬＣによる特性決定は、 ベックマン（Ｂｅｃ）ｃｍａｎ）　Ｃ＋　ｓ−逆相カラムを備えたパーキン−エ ルマー（Ｐｅｒｋｉｎ・Ｅｌ［１ｌｅｒ）製ＨＰＬＣ装置で行った。移動相は、 Ａ）５０％Ｏ，ｌＯＭ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ７，２５：５０％アセ トニトリル、およびＢ）９０％アセトニトリル：１０％０．１０Ｍ酢酸トリエチ ルアンモニウム、ｐＨ７，２５の緩衝液から成っていた。クロマトグラフィは、 ８０％緩衝液Ｂの等質（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）条件下で行った。流速はＩ、Ｏｍ ｌ／分に保持し、溶出は２８０ｎｍにおける吸収によって監視した。

タグ−アルコール２．０ｍｇを緩衝液Ｂ１００μｌに溶解した。次いで、この保 存溶液１．　０μｌを緩衝液Ｂで４００μｌに希釈した。この希釈溶液５０μｍ をＨＰ　Ｌ　Ｃ装置に注入した。タグ−アルコールは、２２〜２３分の間に単一 の主ピークとして溶出した。溶出ピークの積分によって測定したタグ−アルコー ルの純度は、９５±３％であった。

’Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、ＧＥ製の３００ＭＨｚ　ＦＴ−ＮＭＲ装置で記録し た。典型的な分析では、タグ−アルコール３０ｍｇをＣＤＩ　ＣＮ５ｏｏμｍに 溶解した。　’Ｈ−ＮＭＲでも、この物質の純度は満足なものであった。

タグ−フル：＋　−ル（Ｄ　’Ｈ−ＮＭＲデー９−：　’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ、Ｃ Ｎ）６１゜５２〜１．　６５（ｍ、２）　；１．　７２〜１．　８５（ｍ、２） 　：２．　２０（ｓ、３゜この合成工程は、下記の反応工程図３）を参照するこ とによって一層よく理解することができる。

タグ−アルコール９４．５ｍｇ　（約１ミリモル）およびＩＨ−テトラゾール３ ５゜Ｏｍｇ　（約０．５ミリモル）を５０ｍ１丸底フラスコに入れた。新たに蒸 留した乾燥アセトニトリル（ＣａＨｔ上で蒸留）ｌＯｍｌを加え、ロータリーエ バポレーターで留去した。乾燥アセトニトリルの添加および蒸発を３回行い、こ の物質を乾燥するようにした。最後に、タグ−アルコールおよびテトラゾールの 混合物を、再度乾燥アセトニトリル３．０ｍｌに溶解した。全操作工程中におい て、反応フラスコはアルゴン雰囲気下に保持した。２−シアノエチル−Ｎ、　Ｎ 、　Ｎ’　。

Ｎ′−テトライソプロピルホスホルアミダイト（ホスフィチル化剤）５００μｌ （約１．６Ｅリモル）を、反応混合物に撹拌を続けながら加えた。反応を、アル ミニウム箔で被覆して１時間行った。飽和塩化ナトリウム溶液１０．０ｍｌを加 えて反応を停止し、水相をジクロロメタン２５ｍ１で３回抽出した。合わせた有 機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶媒をロータリーエバポレーター上で留 去した。発泡性残渣を真空下にて十分に乾燥した。この物質を乾燥ジクロロメタ ン１５〜２０ｍ１に溶解し、この溶液を乾燥ペンタンの拡販溶液に徐々に加えた 。

この沈澱段階はグローブボックス中でアルゴン雰囲気下にて行うのが好ましい。

タグーホスホルアミダイト溶液約１０ｍ１を添加した後、沈澱を沈降させた。ペ ンタン（上清）を注意深く傾瀉によって除去し、再度新たなペンタンを加えた後 、残りのタグ−ホスホルアミダイト溶液を加えた。タグ−ホスホルアミダイト溶 液を添加し終った後、沈澱をペンタン溶液中で更に３０分間撹拌した。上清を注 意深く傾瀉して、痕跡量の溶媒を真空下にて除去した。最終生成物は非晶質粉末 であり、これを真空下にて十分に乾燥した。生成物を”Ｐ−ＮＭＲスペクトル分 析法によって特性決定した。沈澱段階の後のホスフィチル化反応の収率は、−貫 して〉７５％であった。

タグ−ホスホルアミダイトを、”Ｐ−ＮＭＲスペクトル分析法によって特性決定 した。試料は、タグ−ホスホルアミダイト４５．０ｍｇをＣＤｓ　ＣＮ　５００ μｍに溶解して調製した。スペクトルは、夕■部標準として８５％リン酸を存す るＪＥＯＬ製２７０ＭＨｚＦＴ−ＮＭＲ装置で記録した。

タグ−ホスホルアミダイトの’Ｈ−ＮＭＲスペクトルデーター：　’Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤ、ＣＮ）δ１．　Ｉ（１−１，２１（ｍ、１２）　；　１．　６１−１． 　７２　（ｍ。

２）　；１．　７６〜！、８５　（ｍ、２）　；２．　Ｉ　（ｓ、３．　Ａｒ− Ｃ旦Ｓ）：Ｚ。

６２〜２．　６８　（ｔ、２）　；２．　８２〜２．　８８　（ｔ、２）　：３ ．　５２〜３．８３　（ｍ、６）　；　２．　２５〜７．　３０　（ｍ、２．　 ５’−Ａｒ一旦）、７．３９〜７゜８、５１〜８．５６　（ｄ、　４．６−Ａｒ 一旦）。

オリゴヌクレオチドは、β−シアノエチルホスホルアミダイト化学（１）を用い て、アプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ） 　（サンジョゼ・カリフォルニア）製自動オリゴヌクレオチドシンセサイザーで 作成した。５′末端に対するオリゴヌクレオチドアミノの修飾は最後のカップリ ング段階で起こり、３′末端では修飾した固相（制御された細孔ガラス）を用い ることによって起きた。

アミノモディファイア−は、クロンチク（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ）　（サンディエゴ 、カリフォルニア）から入手した。生成する５′が修飾されたオリゴヌクレオチ ドは総て（Ｃ６、ＮＨｚ　）と表わされるアミン基に対する６個の炭素から成る スペーサーアームを含んでいる。３′の修飾されたオリゴヌクレオチドは総て、 アミノ基に対する３個の炭素から成るスペーサーアームを含んでいる。これらの 配列の幾つかは、合成中にタグ−ホスホルアミダイトを用いて直接標識した。５ ′末端に対するオリゴヌクレオチドＲｕ　（Ｔ　Ｉ）修飾は、アプライドバイオ システムス製の自動オリゴヌクレオチドシンセタイザー上でタグ−ホスホルアミ ダイトｃｏ、４Ｍ）を用いて最後のカップリング段階で起き、下記のオリゴヌク レオチドではＲｕ（１１）と表わした。構築したオリゴヌクレオチド、その修飾 物および有用性を、下記に説明する。

Ｂ、　Ｅ６領域に対するヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）のすリゴヌクレオナ ＰＶＩ６（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４）、ａＰＶｔ６ｐ（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：２ ＰＶＩ６　５’　（Ｃ６，ＮＨ，）　ＣＡＧＴＴＡＡＴＡＣＡＣＣＴＡＡＴＴＡ ＡＣＡＡＡＴＣＡＣＡＣ；３　Ｐ　Ｖ　１６　５　’　（Ｃ６，Ｎ　Ｈ２）　Ａ ＣＡＡＣＡＴＴＡＧＡＡＣＡＧＣＡＡＴＡＣＭＣＡＡＡＣＣＧおよび３　ＰＶ　 ｌ　６　ｐ　５　’　Ｒｕ　（Ｉ　Ｉ　）　：　ＡＣＡＡＣＡＴＴＡＧＡＡＣＡ ＧＣＡＡＴＡＣＡＡＣＡＡＡＣＣＧ。

Ｉ　ＨＰｖ１８について： ２ＰＶＪ　８　５’　（Ｃ６，ＮＨｚ　）　ＣＡＣＣＧＣＡＧＧＣＡＣＣＴＴＡ ＴＴＡＡＴＡＡＡＴｒＧＴＡＴ；３ＰＶ１８　５’　（Ｃ６，ＮＨｔ）　ＧＡＣ ＡＣＡＴＴＧＧＡＡＡＡＡＣＴＡＡＣＴＭＣＡＣＴＧＧＧ。

これらのオリゴヌクレオチドは、ビオチン化した２ＰＶ１６または２ＰＶＩ８を 用いて、それぞれＨＰＶＩ６および１８ＤＮＡについてはフラグメント３ＰＶ１ ６または３ＰＶ１８を増幅して、それぞれの増幅した生成物を補足することがラ ムダｌ　：　５　’　Ｒｕ　（Ｉ　Ｉ　）　：　ＧＡＡＡＡＴＧＴＧＣＴＧＡＣ ＣＧＧＡＣＡＴＧＡＡＡＡＴＧＡＧラムダ　５　’　ＧＡＡＡＡＴＧＴＧＣＴＧ ＡＣＣＧＧＡＣＡＴＧＭＡＡＴＧＡＧラムダＣ５’ＣＴＣＡＴＴｒＴＣＡＴＧＴ ＣＣＧＧＴＣＡＧＣＡＣＡＴＩＴＴＣうＬダＩ　Ｃ５’　（Ｃ６，ＮＨ２）　Ｃ ＴＣＡＴＴＴｒＣＡＴＧＴＣＣＧＧＴＣＡＧＣＡＣＡＴＴＩＴＣｏＤ、非特異的 才’Ｊ　コヌ’）　レオチＦ配列、２ＰＶ６（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９）２ＰＶ ６　（Ｃ６，ＮＨ２）　ｍＧＴＧＡＣＡＣＡＧＧＴＡＧＣＡＣＣＧＡＡＴＴＡＧ ＣＡＣｏＳ　Ｋ　３８　５　’　ＡＴＭＴＣＣＡＣＣＴＡＴＣＣＣＡＧＴＧＧＡ ＧＭＡＴＳＫ３９　５’　（Ｃ６，ＮＨ，）　ｍＧＧＴＣＣＴｒＧＴＣＴｒＡＴ ＧＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣＳ　Ｋ　１９　５　’　Ｒｕ　（Ｉ　Ｉ　）　：　ＡＴ ＣＣＴＧＧＧＡＴＴＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＧＴＡＡＧＡＡＴＧＴＡＴＡＧＣＣＣ ＴＡb。

総ての合成オリゴヌクレオチドを調製して、バイオゲル（Ｂ［０ＧＥＬ）”　（ バイオ−ラド・ラプス（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｓ）、ミッチモンド、カリフォ ルニア）カラム上でゲル濾過によってあらゆる混入しているアミノ基を除去した 。ビオチンを、ＮＨ３−ビオチン（クロンチク、サンディエゴ、カリフォルニア ）を用いてオリゴヌクレオチドの５′−アミノ基を介して導入した。タグーＮＨ Ｓエステル標識（Ｒｕトリスビピリジル！ＩのＮＨＳエステル）を、下記のよう にして修飾したオリゴヌクレオチドのアミノ基を介して導入した。オリゴヌクレ オチド０．　１マイクロモルをＰＢＳ１００μｍ　（ｐＨ７，４）に溶解したも のをタグーＮＨＳエステル標識０．５マイクロモルをＤＭＳＯに溶解したものと 、室温で暗所にて一晩反応させた。オリゴヌクレオチドは、エタノール沈澱によ ってこれらの標識反応から回ホスホルアミダイトを標識したオリゴヌクレオチド を、高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によって特性決定した。クロマトグ ラフィに用いた緩衝液系は、下記の溶液から成っていた二人）　１００ｍＭ酢酸 トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）緩衝液、ｐＨ７，２５〜７．　５０、およ びＢ）　環部の１００ｍＭＴＥＡＡ、ｐＨ７，２５〜７．５０およびＨＰＬＣ級 のアセトニトリル。

分析は、ＬＫＢ２１４０迅速スペクトル検出器、ＬＫＢ２１５ＯＮ（ＰＩ、Ｃポ ンプ、ＬＫＢ２１５２ＬＣコントローラーおよびＬＫＢ２２１１スーパーラソク フラクションコＬ／クター、ギルソ：／モデル（Ｇｉｌｓｏｎ　Ｍｏｄｅｌ）　 ２３１　（ギルシン・メディカル−エレク、インコーボレーテド（Ｇｉｌｓｏｎ 　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｅｌｅｃ、、　Ｉｎｃ、）、ミドルトン、ライスコンシン） 、試料注入装置を備えたＬＫＢ　ＨＰＬＣ装置ｔ（ファルマンア・エルケービ・ バイオテクノロジー・インコーボレーテド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢＢｉｏ ｔｅｃｂｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ、）　、ビス力タウェイ、ニューシャーシー）に よって行い、４０１ギルソン希釈装置はへツクマンＣＩ８逆相カラムど共に用い た。下記のグラディエンドプログラムを、分析の際に用いた。

、グラディエンドプログラム： 時間　流速　％Ｂ 時１分 ０：００　ｏ、ｓｏ　１０：００ ０、３０　０．５０　４０：００ ０、３５　０．５０　１０＋００ ０：４０　０．５０　１０：００゜ ｌｉＩ記のクロマトグラフィ条件下では、未標識オリゴヌクレオチドは１６〜２ ０分の間に溶出し、標識したオリゴヌクレオチドは２９〜３３分の間に溶出した 。ピークを積分したところ、標識したオリゴヌクレオチドの比率は、未標識オリ ゴヌクレオチドに対する溶出ピークの２６０ｎｍにおける吸収に対して８０％を 上回ホスホルアミダイトを標識したオリゴヌクレオチドの試料は、試料（２〜３ μｍ）を脱イオン化ホルムアミド（３〜５μｍ）と混合した後、ゲル上に置いて 調製した。オリゴヌクレオチド４μｇを、試料毎にオリゴヌクレオチド】容に対 してホルムアミドを少なくとも１．５容用いて、実験に供した。これらのオリゴ ヌク［７オチドの試料を、標準的方法（マニアチス（！１ｌａｎｉａｔｉｓ）ら 、分子クローニング、実験室便覧（ＭＯＬＥＣｔＪＬＡＲＧＬＯＮＩＮＧ、　Ａ 　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮｔＪＡＬ）　、コールド・スプリング・ハーバ −・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ）、１９８２年、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク）によっ て調製した尿素を用いて１２％ポリアクリルアミドゲル上で分析した。ブロモフ ェノールブルーのマーカー染料がゲル底部に移動するまで、ゲルを運転した。オ リゴヌクレオチドを、ゲルを（電気泳動が完了した後に）螢光薄層クロマトグラ フィシート（コダック（Ｋｏｄａｋ）　、カタログ番号＋３１８１）（これは螢 光指示薬または同等のものを有するシリカゲルである、コダック、ロチニスター 、ニューヨーク）の最上部に置いて分析した。次に、螢光薄層クロマトグラフィ シート上のゲルに紫外線（ＵＶ、約３００　ｎｍ）を照射した。オリゴヌクし・ オチドの存在は、ＵＶ光線の吸収が螢光薄層クロマトグラフィシートからの螢光 を弱めることによって見える暗いバンドによって同定した。自動ＤＮＡ合成の際 に生成した分子種は、生成するバンドの−および強度を記録した写真を分析する ことによって決定した。ゲルは、ＵＶ透視装置（フォトダイン（Ｆｏｔｏｄｙｎ ｅ）、二ニーベルリン、ライスコンシン、モデル番号３−３０００）上で照射を 行い、Ｒｕ　（１１）錯体を標識したバンドを同定することによっても分析を行 った。Ｒｕ　（Ｉ　Ｉ）錯体を標識したオリゴヌクレオチドは、写真に写りやす い特徴的な橙色の螢光を発する。Ｒｕ　（Ｉ　Ｉ）を標識したバンドの分離およ び分析は、未標識オリゴヌクレオチドの移動度と比較してＲｕ（ＴＩ）錯体を標 識したオリゴヌクレオチドの移動度が小さいことを利用した。Ｒｕ　（Ｉ　Ｉ） を標識したオリゴヌクレオチドの移動度が小さいのは、未標識オリゴヌクレオチ ドと比較して分子量が増加しており、（を荷が＋２であることを特徴とする）　 Ｒｕ　（Ｉ　Ｉ）残基が存在するため電荷対質量比が変化したことによるもので ある。

実施例ｖＩ 標識オリゴヌクレオチドの特性決定 標識したオリゴヌクレオチドをゲル電気泳動によって分析を行ったところ（実施 例Ｖ）、生成した２個のホスホルアミダイト（それぞｔＮＳ７個の炭素および４ 個の炭素スペーサーを有する）（実施例Ｉ）は、自動ＤＮＡ合成の際に効率的に カップリングできることが明らかになった。これは、これらのゲル上で検出され る少量の未標識物質（５％未満）により証明された。この化学を用いて標識した オリゴヌクレオチドの電気化学的活性を、両方のホスホルアミダイト（実施例Ｉ ）で標識したオリゴヌクレオチドについて検討した。この検討の結果、４個の炭 素を存するスペーサーホスホルアミダイトからのシグナルは１５％だけ良好であ り、２個の標識の間には有意差はほとんどなかった。

実施例Ｉの４炭素スペ一サーホスホルアミダイト誘導体（４Ｃホスホルアミダイ ト）を選択して、合成の相対的な容易さによって更に特性決定した。実施例■の ４Ｃボスホルアミダイトは４日間は自動シンセタイザー上で活性で機能を育した ままであり、カップリング効率はほとんど失われなかった。この４Ｃホスホルア ミダイトは、乾燥形怒で９力月間以上も安定なままであり、良好な保存寿命も存 していた。複数のバッチの４Ｃホスホルアミダイトを標識したオリゴヌクレオチ ド（実施例Ｉ）を分析したところ、標識は同様に標識した配列を一貫して生成で きることも判った。電気化学的ルミネッセンス（ＥＣＬ）特性を分析したところ 、標識したオリゴヌクレオチドの５バツチについてのシグナルの変動係数は、３ ．５％に過ぎなかった。

長期保存下での標識したヌクレオチドの安定性を更に検討した。４バツチのオリ ゴヌクレオチドの電気化学的ルミネッセンスを比較した。合成後２週間経った２ バツチを、６ケ月経ったバッチおよび５ケ月経ったバッチと比較した。この比較 では、ＣＶは５．１１％に過ぎず、電気化学的ルミネッセンスの喪失はなかった 。

Ｂ５Ａｌ　５ｍｇ　（ＰＢＳ２〜３ｍＩ中）に、ビオチン−ｘ−ＮＨ３（クロン チク（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ）、サンディエゴ、カリフォルニア）５０ｍｇ／ｍｌを 含むジメチルスルホキシド１０５μｌを加えた後、室温で３０分間混合して、イ ンキュベーションした。ＩＭグリシン３０μｌを加えて反応を停止させ、室温で １０分間インキュベーションした。反応混合物をゲル濾過クロマトグラフィ（パ イオーゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ）　Ｐ　６、パイオーラド・ラプス（Ｂｉｏ−ｒａ ｄ　Ｌａｂｓ）、リッチセント、カリフォルニア）によって精製した。このビオ チン−ＢＳＡを０．２μｍフィルターおよびシリンジを用いて濾過した。ビオチ ン−ＢＳＡ５ｍｇを０．２Ｍ炭炭酸ナトリウム型炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９ ，６、ｌｏｍｌに溶解したものをダイナビーズ（ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ）”　（ダ イナル（ＤＹＮＡＬ）　＃Ｉ４００２）　（ダイナビーズはダイナル、グレート ネック、ニューヨークの商標である）（このビーズは（ＤダイナルＭ−４５０ダ イナビーズ、４．５μｍの直径の超常磁性粒子、３０ｍｇ／ｍｌ、ダイナル、４ ５ノースステーシヨンプラザ、グレートネック、ニューヨーク１１０２１より入 手、または（ｊｉ）ダイナルＭ−２８０ダイナビーズ、２．８μｍの直径の超常 磁性粒子、１０ｍｇ／ｍｌ、ダイナル、４５ノースステーシヨンプラザ、グレー トネック、ニューヨーク１１０２１より入手 から成っている）であって、炭酸塩／重炭酸塩で洗浄したもの、３００ｍｇに加 えた。この混合物を混合し、室温で混合しながら一晩インキユベーションした。

ビーズを磁性により分離した後、ＥＣＬ希釈剤（３７，５ｍＭ　ＫＨｚ　ＰＯ４ ，１０９，２ｍＭ　ＫＨＩ　ＰＯ４’　３Ｈ＊　０１１５１．７ｍＭ　ＮａＣ１ ，０，６５ｍＭ　ＮａＮ５０．４３ｍＭウシ血清アルブミンをＨｔＯに溶解した もの）ｌＯｍｌ、およびｔＲＮＡ　（１０ｍｇ／ｍ１）１００μｌおよびｔＲＮ Ａ（１０ｍｇ／ｍ１）１００μｌを加えた。この混合物を室温で混合しながら３ 〜４時間インキュベーションした。ビーズをＥＣＬ希釈剤１０ｍ１で１回洗浄し 、この混合物を２〜６℃で一晩混合してインキュベーションし、ビーズ上のタン パク質を安定化した。ビーズを磁気的に分離し、ストレプトアビジン（スクリッ プスラボラトリーズＣ３ｃｒｒｐｐｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、サンディ エゴ、カリ７ｔルニア、カタログ番号Ｓ１２１４）１５ｍｇを含むリン酸緩衝剤 塩（ＰＢＳ）ｌＯｍｌに懸濁下の血、１時間混合した。ビーズをＥＣＬ希釈剤１ ０ｍ１でそれぞれの洗浄のために５分間混合して、４回洗浄した。ビーズを最終 的にＥＣＬ希釈剤２９．７ｍｌおよびｔＲＮＡ３００ｕ１　（１０ｍｇ／ｍｌ） に再懸濁し、最終濃度を粒子１０ｍｇ／ｍｌ＋ｔＲＮＡ１００μｇ／ｍｌとした 。

増幅反応は、下記のように行った。ｄＡＴＰ２００ｔｔＭ、ｄＣＴＰ２００ｕＭ 、ｄＧＴＰ２００　μＭ、ｄＴＴＰ２００ｕＭ、ＭｇＣ１ｔ　２ｍＭ、トリス− ＨＣｌｌｏｍＭ、ｐＨ８，３，５０ｍＭ　ＫＣＩ、ブライ７−０．　５μＭ、ア ンブリタク（ＡｍｐｌｉＴａｇ）”　（パーキンエルマー−セトウス、ノルウオ ーク、コネチカット）４０単位／ｍｌおよび試料ＤＮＡ１μｇを含む反応混合物 を調製した。用いたプライマーはタグーＮＨＳエステルで標識したＩＮＦＯ３プ ライマー（実施例ＩＩＡ）であった。ＤＮＡ試料はヒト胎盤ＤＮＡ　（シグマ（ Ｓｉｇｍａ）　、セントルイス、ミズーリー）、およびコントロールとしてのサ ケ精子（ＳＳ）ＤＮＡ　（シグマ）であった。この反応混合物を、パーキンエル す−−モトウスＤＮＡ熱サイクラ−中で９７°Ｃで１０秒問および５０°Ｃで１ 秒間の８０サイクルを施した。試料を、ビオチンで標識したＩＮＦＧ２　（ＳＥ Ｑ　ＩＤ　Ｎｏ：　ｌ）２ｎｇで、試料９０μＩに５５℃で３０分間ハイブリダ イゼーションすることによって増幅のために分析した。これらのハイブリダイゼ ーションした試料を、次にストレプトアビジンビーズ２０μｇと、室温で３０分 間振盪しながらインキュベーションして、ビオチン化プローブを補足した。次に 、これらのビーズをＥＣＬ分析緩衝液（１１２ｍＭ　ＫＨ，ＰＯ４，８８ｍＭ　 Ｋｚ　ＨＰＯ４”　３Ｈｔ　０１５０μＭＮａＣＩ、６．５ｍＭ　ＮａＮ５．０ ．８μＭ　トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００，０，４ｍＭ　ツウィーン（ Ｔｗｅｅｎ）　２０．１００ｍＭ＋−リスプロピルアミン）で３回洗浄し、ビー ズの試料をＥＣＬ分析緩衝液に再懸濁し、ＥＣＬ分析装置上で読取り、ＥＣＬカ ウントの数として表わされる電気化学的ルミネッセンス（ＥＣＬ）の水準を測定 した。結果は次の通りてあった：サケ精子ＤＮＡついては６２カウント、ヒト胎 盤ＤＮＡについては２２９６１カウント。この結果は、目的とするインターフェ ロン遺伝子セグメントが特異的に増幅されたことを示していた。

Ｂ、　サザンブロツトによる増幅の評価この増幅の性質を評価するため、増幅し た生成物についてサザンプロット分析を行った。ＩＮＦＯ３（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：２）で増幅したヒトＤＮＡ試料１Ｏｕｌ（出発ＤＮＡ］００ｎｇと同等）、 ＩＮＦＯ３（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：２）で増幅したサケ精子ＤＮＡ１０μｍ、ヒ ト胎盤ＤＮＡ１μｇおよびＤＮＡサイズマーカーをゲル電気泳動に付した後、ニ トロセルロース膜に移した（４）。

次に、このプロットしたＤＮＡをＩＮＦＯ２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｉ）でビオ チン化したプローブでハイブリダイゼーションした後、推賞される手続にしたが ってストレプトアビジンアルカリ性ホスファターゼキットを用いて検出した（ラ イフテクノロジー（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）　、ガイセルスバー グ、メリーランド）。

この試験の結果は、増幅した試料中に２個の強（ハイブリダイゼーションした種 を示していた。これらの種をＤＮＡサイズマーカーに基づいて算出したところ、 ６２０および５９０塩基対となった。予想されたように、増幅されなかったヒト ＤＮＡは全くシグナルを示さず、サケ精子の増幅したコントロールも示さなかっ た。サザンプロット分析からのこのデーターは、単一のプライマー増幅が認めら れるというＥＣＬ分析からの結果を支持している。

増幅反応を下記のようにして設定した。ｄＡＴＰ２００μＭ、ｄｃＴＰ２００ｕ Ｍ、ｄＧＴＰ２００μＭ、ｄＴＴＰ２００μＭ、ＭｇＣ１ｔ　２ｍＭ、ｌ・リス −ＨＣｌ　１０ｍＭ、ｐｉ−ｔｓ、３．５０ｍＭ　ＫＣＩ、ブライ７−０．　５ μＭ、アンブリタク（ＡｍｐｌｉＴａｇ）”　（バーキンエルマー−セトウス） ４０単位／ｍｌおよび試料ＤＮＡ１μｇを含む反応混合物を調製した。用いたプ ライマーはタグーＮＨＳエステルで標識した３ＰＶ１６　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ ：４）プライマーであった。

ＤＮＡ試料はＨＰＶＩ　６ＤＮＡ　（５）およびコントロールとしてのサケ精子 （ＳＳ）ＤＮＡ　（シグマ）であった。この反応混合物を、バーキンエルす−− モトウスＤＮＡ熱サイクラ−中で９７°Ｃで１０秒問および５０°Ｃで１秒間の ８０サイクルを施した。

試料を、ビオチンで標識した２ＰＶＩ６　２ｎｇで、試料９０μｌに５５°Ｃで ３０分間ハイブリダイゼーションすることによって増幅のために分析した。これ らのハイブリダイゼーションした試料を、次にストレプトアビジンビーズ２０μ ｇと、室温で３０分間振盪しながらインキュベーションして、ビオチン化プロー ブを補足した。次に、これらのビーズをＥＣＬ分析緩衝液で３回洗浄し、ビーズ の試料をＥＣＬ分析緩衝液に再懸濁し、ＥＣＬ分析装置上で読取り、ＥＣＬの水 準を測定した。ＥＣＬカウント数で表わした結果は次の通りであった：サケ精子 ＤＮＡついては６７カウント、ＨＰＶ１６ＤＮＡについては３２４４４カウント 。この結果は、目的とするＨＰＶ１６ＤＮＡが特異的に増幅されたことを示しこ の増幅の性質を評価するため、増幅した生成物についてサザンプロット分析ヲ行 ツタ。３ＰＶ１６Ｔ増幅したＨＰＶＩ６ＤＮＡ試料１０μｌ　（出発ＤＤＮＡ１ ００ｎと同等）、３ＰＶ１６で増幅したサケ精子ＤＮＡ１０μｍ、ＨＰＶ１６Ｄ ＮＡ１μｇおよびＤＮＡサイズマーカーをゲル電気泳動に付した後、ニトロセル ロース膜に移した（５）。次に、このプロットしたＤＮＡを２ＰＶ１６でビオチ ン化したプローブでハイブリダイゼーションした後、推奨される手続にしたがっ てストレプトアビジンアルカリ性ホスファターゼキットを用いて検出した（ライ フテクノロジー化ｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）　、ガイセルスバーグ、 メリーランド）。

この試験の結果は、増幅したＰＶ１６ＤＮＡ試料中に強くハイブリダイゼーショ ンした種を示していた。この種をＤＮＡサイズマーカーに基づいて算出したとこ ろ、８７０塩基対となった。増幅されなかったＨＰＶ１６ＤＮＡは全くシグナル を示さず、サケ精子の増幅したコントロールも示さなかった。サザンプロット分 析からのこのデーターは、単一のプライマー増幅が認められるというＥＣＬ分析 からの結果を支持している。

ヒト胎盤ＨＰＶＩ　６　（ＣａＳｋｉ）およびＨＰＶ１８　（ＨｅＬａ）ＤＮＡ を、試料を２０．３０．４０．５０，６０および８０のサイクル数の時点で取り 出したことを除き、それぞれＩＮＦＧ３　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋２）、３ＰＶ １６ｐ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４）（タグ−ホスホルアミダイトを用いて標識し たＥＣＬ）および３１）ＶＩ８（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６）を用いて前記のよう にして増幅を行った。次に、これらの試料を分析して、ＥＣＬカウント数によっ て表わされる増幅生成物の水準を測定した。

表１ ３ＰＶ１６ｐＡ（ＰＶ１６　７２　２６２　５２３４　１０８７９　７７０８　 ６６６２ＳＳ”　−−−−−８４ ３ＰＶｌＢ／ＨＰＶ１８　３７０　５８３　１７５６　６８５７　６７９４　６ ０７３ＳＳ　−−−−−１４８ １ＮＦＧ３／ヒト　８５　５３　１９９　２７８５　３５３３　５４９１これら の結果は、生成したシグナルの水準がサイクル３０の後に急速な増幅を示し、指 数増幅を示しているので予想されない方法によって増幅が起きていることを示し ていた。３ＰＶ１６ｐ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４）を用いるこの増幅は、ホスホ ルアミダイトで標識したオリゴヌクレオチドを単一のプライマー増幅でタグーＮ ＨＳエステルで標識したオリゴヌクレオチドに代えることができることを増幅に ついての様々な温度サイクルの効果を検討するため、様々な温度サイクルを評価 した。２段階サイクルの低温を変化させた。サイクル温度は９７”Ｃから３０℃ 、９７℃から４０℃、９７℃から５０℃、９７℃から６０℃および９７℃から７ ０°Ｃであった。これらのサイクルを、明快にするために低温と呼ぶ。また、エ リコンブ（Ｅｒｉｃｏｍｐ）　（ツインブロック（Ｔｗｉｎ　ＢＬｏｃｋ）、エ リコンブインコーボレーテド（Ｅｒｊｃｏｍｐ　Ｉｎｃ、）、サンディエゴ、カ リフォルニア）サーモサイクラ−を用いた。増幅のための池の条件は、ヒトイン ターフェロンおよびヒトパピローマウィルスＤＮＡについての前記の時間経路に 就いて記載したものと同じであった。

Ａ、　パーキンエルマーＤＮＡサーマルサイクラ−を用いた場合の結果３ＰＶ１ ６ｐ　ＨＰＶ１６　１０１０３　１６７９１　１０５７９　１２２６６　６１Ｓ Ｓ　８９　１１３　１３０　９２　６５３ＰＶ１８　）ＩＰＶ１８　５０　１１ ３　５５９５　９６　６２ＳＳ　７３　８６　１３４　１２５　６６［ＮＦＧ３ 　ヒト　１０１　＋３４８　７１１９　６３９０　５２ＳＳ　６３　８１　２２ ０　９１７　４１３ＰＶＩ６ｐ　ＨＰＶ１６　１６３０７　１０４９１　９０９ ３　１６３４６　７１ＳＳ　６６　１０６　９４　１０３　６６３ＰＶＩ８　Ｈ ＰＶｌＢ　２０４　６９９　８３８８　４７３１　７６ＳＳ　５０　５１　８６ 　７０　７３ １ＮＦＧ３　ヒト　１９０　３４３６　６３５０　６６１７　４６ＳＳ　７０　 ７２　１２６５　９９３　５にれらの結果は、この増幅反応の性質が温度によっ て変化し、それぞれの特定の鋳Ｖ−プライマーの組み合わせは異なる最適温度を 有するので、所定の鋳型での増幅を行うには温度を最適にする必要があることを 示している。当業者であれば、増幅手続の展開には最適温度が必要なことが多い ことを理解されるであろう。

この単一のプライマー増幅温度の検討により、ホスホルアミダイトで標識したオ リゴヌクレオチドがこの単一プライマー増幅での高温および長時間のインキュベ ーションに耐えることかできることが明らかになった。

実施例ＸＴＩ 異なる起源からのＤＮＡポリメラーゼを試験して、単一のプライマー増幅は酵素 特異的ではないことを確かめた。

下記の組成から成る反応混合物を調製した。

レブリナーゼ（ＲＥＰＬ［ＮＡＳＥ）ＴＭ（デュポン（ＤｕＰｏｎｔ）、ボスト ン、マサチューセ・ソツ）：５０ｍＭ）リス−ＨＣｌ、ｐＨ９，０，２０ｍＭ硫 酸アンモニウム、１゜５　ｍＭ　Ｍｇ　ＣＩ　ｚ、ｄＡＴＰ２００ｔｔＭ、ｄＣ ＴＰ２００ｕＭ、ｄＧＴＰ２００μＭ、ｄＴＴＰ２００μＭ、プライマー０．５ μＭ、試料ＤＮＡ１０μｇ／ｍｌ、レブリナーゼ？＆Ｉ４ｏ単位／ｍｌ。

ＨＯＴ　ＴＵＢ”ポリメラーゼ（アメルシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、アーリン トンハイツ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ）　、イリノイ）：２５ｍＭ １−リス−ＨＣＬ　ｐＨ９，５（２５℃）、５０ｍＭ　ＫＣＩ、１０ｍＭ　Ｍｇ ＣＬ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１ｍｇ／ｍｌ、ｄＡＴＰ２００μＭ、ｄｃ ＴＰ２００μＭ、ｄＧＴＰ２００μＭ、ｄＴＴＰ２００μＭ１プライマー０．　 ５μＭ、試料ＤＮＡｌ０μｇ／ｍｌ、ＨＯＴ　ＴＵＢ”ＤＮＡポリメラーゼ４０ 単４Ｌ’ｍ　Ｉ　；ピロスターゼ（ＰＹＲＯ３ＴＡＳＥ）”　（モレキュラージ エネテイックリソーシス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｒｅ５ｏｕｒ ｃｅｓ）　、タンパ、フロリダ）：ｄＡＴＰ２００．ｃｚＭ。

ｄｃＴＰ２００μＭ、　ｄＧＴＰ２００μＭ１ｄＴ’Ｉ７．Ｐ２Ｏ０μＭ、　５ ０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ９，０（２５℃）、１．５ｍＭ　ＭｇＣＬ、２０ ｍＭ硫酸アンモニウム、０，０１％ゼラチン、プライマー０．５μＭ１試料ＤＮ Ａ１０μｇ／ｍｌ　ピロスターゼＴＭ、ベント（ＶＥＮＴ）　”　Ｄ　Ｎ　Ａポ リメラーゼにューイングランドバイオラブス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏ ｌａｂｓ）　、ビバーリー、マサチューセッツ）：ｄＡＴＰ２００μＭ、ｄｃＴ Ｐ２００μＭ、ｄＧＴＰ２００μＭ、　ｄＴＴＰ２００μＭ、５０ｍＭトリス− ＨＣｌ、ｐＨ８，８，２ｍＭ　Ｍｇ５Ｏａ　。

１０ｍＭ硫酸アンモニウム、１０ｍＭ　ＫＣＩ、０．　１％トライトンＸ−１０ ０、ＢＳＡＯ，１ｍｇ／ｍｌブライｖ−０，５μＭ、試料ＤＮＡ１Ｏμｇ／ｍｌ 、ベントＴＭＤＮＡポリメラーゼ、アンプリターフ（ＡＭＰＬＩＴＡＱ）’　（ パーキンエルマー−セトゥス）、前記の条件下。

これらのポリメラーゼを用いて、プライマー３ＰＶ１６（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ： ４）を用い６８ＰＶ１６　（ＣａＳｋｉ）およびブライＴ−４ＮＦＧ３　（ＳＥ Ｑ　ＩＤ　ＮＯ：２）を用いるヒト胎盤ＤＮＡの試料を増幅した。１００μｌの 試料を、！サイクルが９７℃で１０秒問および５０”Ｃで１秒間で８０サイクル を用いてパーキンエルマーーセトウスサーマルサイクラーで反復した。ＨＰＶお よびヒトインターフェロンガンマ−増幅生成物は、前記と同様にして分析した。

ＥＣＬカウント数として表わした増幅生成物のＥＣＬ分析は、次の通りである。

３ＰＶＩ６ｐ／ＨＰＶＩ６　７４４９　９２２６　２０９　７９７６　６９３５ １ＮＦＧ３／ｌニド　５３０４　５５７０　２６２　５５９９　５５８１これら の結果は、はとんどのＤＮＡポリメラーゼがこの増幅系で働き、Ｍｇ”または温 度条件はほとんど最適にならないことを示している。ベントＤＮＡポリメラーゼ の活性が乏しいのは、Ｍｇ”条件が最適でないことによるものとも考えられる。

ホスホルアミダイトで標識したオリゴヌクレオチドが広範囲のＤＮＡポリメラー ゼでの単一プライマー増幅を指示することができるというこの例証は、これがこ れらの反応を抑制しないことを示している。

ＤＮＡの試料を希釈して、Ｔａｑポリメラーゼを用いて上記と同様にして単一増 幅を行った。試料を、前記と同様にビオチン化プライマーｒＮＦＧ２　（ＳＥＱ ＩＤＮＯ：Ｉ）、２ＰＶＩ８（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５）および２ＰＶＩ６（Ｓ ＥＱ　ＸＤ　ＮＯ：３）を用いて分析した。結果は、ＥＣＬカウント数で表わす 。

表５ ＮＡ ＤＮＡ（７）量　ＩＮＦＧ３　３ＰＶ１８　３ＰＶ１６ｐｎｇ　ヒトＳＳ　ＨＰ ＶｌＢ　ＳＳ　ＨＰＶ１６　５Ｓ＋　２０３７　−　５８０　−　１２０３８　 −これらの結果は、この方法の感受性を表わしている。ヒトインターフェロン遺 伝子は、試料ＤＮＡｌｎｇのみで検出された。これらの結果は、ＨＰＶ　ＤＮＡ 試ｆ４（実施例ＸのＨｅＬａおよびＣａ５ｋｉ）についてのデーターと一致する 。

サケ精子ＤＮＡ１μｇのコントロール試料から得られた結果は、この分析系の特 異性を表わしている。このことは、この方法の診断での育用性および少量の試料 から特異的な遺伝子の検出を表わしている。ホスホルアミダイトで標識したプラ イマーが単一プライマー増幅を行うことができることにより、ＤＮＡｌｎｇでの ＨＰＶ１６を効率的に検出することができる。

前例で最良の結果が得られたポリメラーゼＨＯＴ　ＴＵＢ”″、ビロスターゼ１ およびレブリナーゼ”　（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｆｌａｖｉｓから単離）を用いて予 備検討を行い、最適プライマー濃度を決定した。１００μｌの反応当たり２００ ｎｇ　（０，２μの以下の濃度は無効であった。最適濃度は、１００μｍ反応当 たり約５００ｎｇ（０，５μＭ）であった。０．５μＭを上回ると、改良は余り 見られなかった。

特に、ピロスターゼアＭおよびレブリナーゼ７′は、最初のプライマー検討の際 に試験した池のポリメラーゼと比較して、良好な反応を示したので、更に特性決 定を行った。タグ−ホスホルアミダイト標識ＩＮＦＯ３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ： ２）プライマー及びＩＮＦＧ２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌ）ビオチン化プローブ を用いるこれらの検討からの結果を、下記の表６に示す。結果はＥＣＬカウント 数で表わしている。

表６ ポリメラーゼ、　ピロスターゼＴＭ　レブリナーゼ７ＭＤＮＡ試料　ヒト　ＳＳ 　ヒト　８８ 反応当たりのプライマーの量 ２μｇ　＋０５２２　６５８　６５９７　１８１５００　ｎｇ　４４９０　１３ ２　４５０９　２２５２００ｎｇ　２２７　６６　１７２　６５これらの結果は 、プライマーに対する最適濃度範囲が広いことを示している。

１００μｍ当たり５００ｎＨの低濃度が、バックグラウンド水準は更に低（なり 易く、オリゴヌクレオチドの使用が一層経済的であるのでオリゲン（ＯＲＩＧＥ Ｎ）”分析系に最適であると思われる。他の分析系及びクローニング法は異なる 最適濃度を存するものと考えられるが、通常は前記の値に従うものと思われる。

この例の分析結果は、ビロスターゼＴＩ″はプライマー濃度が低くてもまたは高 くても同様に良好に作用することができるので、最良の結果が得られることを示 していた。

オリゴヌクレオチド３ＰＶ１８（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６）を用いて、Ｔａｑお よびエリコンブサーモサイクラ−での９７°Ｃから６０℃までの循環を行う前記 のプロトコールを用いて、ＨＰＶｌＢを含むＤＮＡ　（ＨｅＬａ）およびサケ精 子ＤＮＡを含むコントロールｌμｇを増幅した。これらの増幅した試料（１０μ ｌ、５　すなわち増幅した試料の１０％）を、増幅していない物質ｌμｇおよび 分子量マーカーと共に１％アガロースゲル上で流した。次に、この物質を既知の 方法を用いてサザンプロットし、２ＳＳを標識した２ＰＶ１８プローブとハイブ リダイゼーションした。このプローブ（実施例１１Ｂに記載のもの）はアミノ基 を存し、アメルシャム（Ａｍｅｒｓｈａａ）製「３５Ｓ標識剤」　（アメルシャ ム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、アーリントンハイツ、イリノイ）を用いて標識した。

簡単に説明すれば、オリゴヌクレオチＦ２．　５μｇ’Ｅ：採取し、！ｓＳ標識 剤５０μｃｉを８０％ＤＭｓ０１０μｌｉ：溶解したものと一晩反応させた。こ の標識したプローブを７０％エタノールで沈澱させ、洗浄した。プローブをハイ ブリダイゼーション緩衝液５００μｌに再懸濁し、ハイブリダイゼーション溶液 ５ｍｌ当たり２．５Ｘ１０’カウントの濃度で用いた。フィルターを、６ＸＳＳ Ｃ，０，５％ＳＤＳ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ”中で５５°Ｃでハイブリダイゼーシ ョンした後、６０°Ｃで０．１６ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中で洗浄し、乾燥し た。次に、フィルターにエンハンス（ＥＮＨＡＮＣＥ）”　（エヌイーエヌ（Ｎ ＥＮ）　、ボストン、マサチューセッツ）を噴霧し、フィルムの下に置いた。こ のハイブリダイゼーション実験の結果、ＨＰＶｌＢを含むＤＮＡの単一プライマ ー増幅からの特異的生成物が検出された。主生成物の計算上の大きさは用いた分 子量基準を考慮して約２０００塩基と決定した。他の試料では、未増幅物質の１ ０倍以上の物質用いても、ハイブリダイゼーションは全く見られなかった。

これは、単一のプライマー増幅が可能であり、単一の主を増幅することができる ことを表わしている。

対になったプライマーポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、本質的に記載されて いる方法で行った（６．　７）。反応は、特に断らないかぎり、典型的には１０ ０μｍであった。ＰＣＲｌ、ｔＳＫ３８　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋１０）オリゴ ヌクレオチｌ’　５ピコモルおよび５Ｋ３９（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１）（ビ オチン化した）オリゴヌクレオチド５０ピコモルを用いる非対称様式で、または ５Ｋ３８（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ＩＯ）および５Ｋ３９（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ： １１）をそれぞれ５０ピコモルを用いる標準様式で行った。

サーモサイクラ−条件は下記の通りであった＝９５°Ｃで１分間に続き、６０℃ で１分間。これらのＰ、ＣＲのサイクル数は、分離分析については３０および非 分離分析またはＨＩＶの１０未満の複製の検出については４０であった。

２６０ｎｍでの淡色遷移を用いる融解の検討を、日立ＵＯＯ（ヒタチ・インスッ ルメンツ・インコーボレーテド（Ｈｉｔａｃｈｉ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　 Ｉｎｃ、）　、ダンバリー、コネチカソト）二重波長分光光度計およびその温度 制御したセル上で行った。ラムダＣ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８）にハイブリダイ ゼーションしたラムダ（１゜６４ｍＭ）、およびラムダＣ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ ＋８）にハイブリダイゼーションしたラムダ１　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア）（ 標識したＴａｇ）１．０５ｍＭを５００ｍＭ　ＮａＣ１、］ＯｍＭ）リス−ＨＣ Ｌ　ｐＨ７，４に溶解した試料を、ブランクおよび毎分１”Ｃで加熱し、コント ロール試料として５００ｍＭＮａＣｌ、ｌ０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，４を 有する調和したキュベツトに導入した。この分析を３回繰り返し、データーを平 均し、規格化し、２個の試料の間のＴａｇ探識吸収について補正した。

ビーズについての融解検討は、ラムダｕｐまたはラムダ１　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏニア）（Ｔａｇ標識）およびラムダＩＣ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８）（ビオチ ン化）の予備形成したハイブリッドで行った。ハイブリッドは、ラムダ■Ｐまた はラムダ１　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア）（Ｔａｇ標識’）１１４ビ一１モルを ラムダＩＣ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８）（ビオチン化）６０ピコモルと５０″Ｃ で２０分間ハイブリダイゼーションすることによって形成した。これらの錯体を ストレプトアビジンビーズ（実施例Ｖｌｌ）１．５ｍｇ上で補足した。結合した ハイブリットを存するビーズを分析毎に５０μｇ（５００μｌ）ずつに別けて、 振盪しながら５分間各種の温度でインキュベーションした後、磁性ラック上で分 離し、新たなＥＣＬ分析緩衝液で洗浄した。ビーズに結合したシグナルを、ベッ クマンＬＳ−１００ｃ（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）　、アーバイン、カリフ ォルニア９２６６４）液体シンチレーションカウンターまたはＥＣＬ装置で分析 することによってそれぞれの試料について（３回）測定した。結果を３１ｐがら のシグナルに対して規格化し、データーを比較した。３時間の時点でのデーター を、規格化の参照点として用いた。

ハイブリダイゼーションの速度論の検討は、ビーズ上で予め補足されたラムダＩ Ｃ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８）（ビオチン化）を用いて行った（分析毎にビーズ ８０μｇ」二（二〇、１ピコモル）。ラムダ１　（Ｔａｇｌ識）またはラムダＣ ２Ｐ標識したもの）を、ＥＣＬ分析緩衝液５００μｍに加えた（分析当たり０． 　３ピコモル）。試料を様々な時間インキュベーションし、３時間の時点での試 料を１００％ハイブリダイゼーションした試料として用いて、試料シグナルの規 格化を行った。ハイブリダイゼーションの後、ハイブリッドを磁性ラックを用い てハイブリッドしていないプローブから分離し、上溝を除去した。これらの試料 を、ＥＣＬ分析緩衝液６００μｍに再懸濁し、試料によってＥＣＬ装置上でまた はベックマンＬＳ−１００（：液体シンチレーションカウンターで分析した。試 料は３回測定し、バックグラウンドデーターを差し引き、３時間ハイブリッドし たラムダ（”Ｐａｌ識した）試料からのシグナルに対して規格化した。

Ｔａｇ標識および！！Ｐ標識したプローブの比較のための試験分析形式は、ビオ チン化した２ＰＶ６　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９）およびビオチン化したラムダ 】Ｃ混合物の濃度比の範囲を表わす標準曲線からなり、分析当たりオリゴヌクレ オチド６ピコモルの一定濃度を生じた。この標準曲線は、０．０．１．２５．１ ゜５および３ピコモル／試料の範囲のラムダＩＣ（漂的）を有する分析媒質を調 製することによって構築した。この標準曲線は、ＰＣＲ反応からの生成物の濃度 を模するように設計され、異なる水準のビオチン化したＰＣＲ生成物をビオチン 化したプライマーの一定のバックグラウンドに対して測定しなければならない。

この標準曲線に加えて、ビオチン化したオリゴヌクレオチドを６ピコモル／試料 の一定量と共にビオチン化したラムダＩＣ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８）ｏ、０． ０．３３３．０．１６７．０．　６００．　１．　６７．０，８６６．３．　０ ０．２゜１７．１．３３．３，５０ピコモルを含む一組のコントロール試料を同 様にして調製した。次に、これらの標準およびコントロールを、ＥＣＬ分析緩衝 液中のストレプトアビジンビーズ５００μｇ（５０μｍ）を用いて分析し、室温 で１５分間振盪しながらインキュベーションすることによって補足した。固相を 磁性ラックを用いて分離した後、補足したオリゴヌクレオチドをＰＣＲ試料に用 いた洗浄液を模して０．０５Ｍ　ＮａＯＨて洗浄した。次に、ビーズをＥＣＬ分 析緩衝液で洗浄した後、ラムダ１（Ｔａｇ標識を含む）ラムダｌまたはラムダ３ ２ｐ標識（０，２μＣｉ）ブロープロピコモル（６μｍ）を加えた。これらを５ ０゛Ｃで１５分間ハイブリッドした後、Ｔａｇ標識分析についてはＥＣＬ分析緩 衝液（５００μｌ）で２回洗浄し、３２　Ｐ　ｆｉ識分析については４回洗浄し た。これらの試料を、ＥＣＬ装置上で分析しまたはベックマンＬＳ−１００ｃ液 体シンチレーションカウンターでカウントした。これらの分析実験は、それぞれ の標識に対して３回行い、それぞれの試料または標準は、１回の実験で３回測定 した。

ＨＩＶＩ　ｇａｇ遺伝子の対になったプライマーのＰＣＲ増幅は、オリゴヌクレ オチド５Ｋ３８（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋ｌＯ）および５Ｋ３９（ＳＥＱ　ＩＤＮ ０：ｌＩ）を用いて行った。未標識５Ｋ３８と共にビオチン化５Ｋ３９を用いて 、生成するＰＣＲ生成物を、前記の容にＴａｑ標識プローブ５Ｋ１９にハイブリ ッドした。

非分離分析のために、非対称ＰＣＲ反応を過剰量のビオチン化したプライマーを 用いて行った。このＰＣＲ反応では、Ｔａｇ標識したプローブに四つ手直接ハイ ブリダイゼーションに利用可能な過剰量のビオチン化した一本鎖ＤＮＡを生じた 。ハイブリダイゼーションのために、増幅されるＨＩＶＩ　ｇａｇ遺伝子に特異 的なＴａｇ−オリゴヌクレオチド５Ｋ１９　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２）（５ ０μｍ）１ピコモルを増幅後にＰＣＲＩ　５μｍに加えた後、６ｏ″Ｃで１５分 間インキュベーションした。このハイブリダイゼーション混合物に、ストレプト アビジンをカップリングしたビーズ６００μｇを含むＥＣＬ分析緩衝液６０μｌ を加えた後、混合物を室温で１５分間振盪しながらインキュベーションした。試 料の容積をＥＣＬ分析緩衝液を加えて６００μｍまで増加させた後、ＥＣＬ装置 で電気化学的ルミネッセンスの検出を行った。

定量分析のプロトコールは、次のようにして行った：　ＰＣＲ当たりＨＩＶＩ（ バーキンエルマー−セトゥス、ノルウオーク、コネチヵット）の０．５０，１０ ０．４００．２０００個の複製の基準を３回測定した。ＰＣＲから、反応混合物 １５μｍずっ３回ストレプトアビジンをカップリングしたビーズ６００μｇに加 えた後、室温で１５分間インキュベーションした。これらの試料中の固相を磁性 ラックを用いて分離し、５０ｍＭ　ＮａＯＨで洗浄し、ＥＣＬ分析緩衝液で洗浄 し、ｍｓしタオリゴヌクレオチド５Ｋ１９　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１２）１ ０ピコモルを含むＥＣＬ分析緩衝液１００μｌに再懸濁した。これらの試料を６ ０°Ｃで１５分間ハイブリダイゼーションした。固相を、磁性ラックを用いて分 離し、ＥＣＬ分析緩衝液で３回洗浄し、６００μｌのＥＣＬ分析緩衝液に再懸濁 し、電気化学的ルミネッセンスをＥＣＬ装置によって検出した。それぞれの試料 および標準は３回測定した。

タグ−ホスホルアミダイト標識 の有効性を、試験配列ラムダ１（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８）の合成によって試験 した。この標識した配列を、標識および未標識ＤＮＡのゲル電気泳動およびＨＰ ＬＣによって分析した。この分析では、９０％を上回るカップリング効率がこの ホスホルアミダイトを用いて得ることができることを示していた。標識したラム ダｌ配列の５バツチを比較することにより、オリゴヌクレオチド１モル当たりの 回収されたＥＣＬのカウント数にはほとんど変動はないことが示された。これら の標識がハイブリダイゼーション速度および融解曲線について有する効果を測定 するため、下記の検討を行った。

Ａ、　温度によるＤＮＡ錯体の変性 温度によるＤＮＡ錯体の変性を、変性に伴って見られる淡色遷移によって監視し た（１）。変性温度曲線に対するこのデーターを確かめるため、ＥＣＬ分析ビー ズの表面からの予め形成しておいたハイブリッドの変性を３！Ｐ分析に比較して 分析した。これらのデーターは、これらの配列についての変性温度曲線は実質的 には同じであることを表わしていた。

ダグーホスホルアミダイトＥＣＬｆｉ識の存在下でのハイブリダイゼーションの 速度論についての検討は、最初は利用した分析形式でのハイブリダイゼーション の速度が大ぎい（１分未満）であることによって阻害された。

プローブの濃度を希釈によって低下させ、ビーズに結合した標的へのハイブリダ イゼーシヨンの速度を遅くし、生成する測定の制度を増加させた。

ｃ、ｓｕｐ分析に対するＥＣＬタグ−ホスホルアミダイト分析の比較ハイブリダ イゼーションの速度論を検討したところ、タグ−ホスホルアミダイト標識を加え てもブローブハイプリダイゼーシ３ンの速度論にはほとんど影響せず、Ｒｕ　（ Ｉ　Ｉ）を標識したプローブ（タグ−ホスホルアミダイト）および２″Ｐプロー ブの速度は同じであった。変性と組み合わせたこの情報は、はとんどの場合に、 これらの合成的に標識したオリゴヌク１７オチドの速度論的特性は元の配列の特 性と同じになることを示している。

ある分析環境でのタグ−ホスホルアミダイトを標識したオリゴヌクレオチド（ブ ロー・ブとしての）挙動を、３２ｐを標識したオリゴヌクレオチドを含む参照分 析の挙動と比較した。−組の標準と、タグ−ホスホルアミダイトで標識したオリ ゴヌクレオチドプローブに相補的な合成的にビオチン化した３０塩基のオリゴヌ クレオチドの希釈物からの一組の試料を比較した。ＹはＥＣＩ、分析によって決 定した値であり、ＸはＳ″Ｐ分析によって測定した値である。これらのデーター から、下記の方程式が得られた。￥＝−３．６ｘｌＯ−ｆｉ＋０，８４Ｘ、Ｒ” 　＝０．９９６゜既知の値に対する個々の試料の結果の分析を行ったところ、Ｅ ＣＬ　（０，５９）および”Ｐ　（３，５４）に対する計算値の標準誤差をこれ らの２つの方法の相対誤差を比較することができた。

ダクーホスホルアミダイトで標識したオリゴヌクレオチドと２ｔＰを標識したプ ローブ（モデル分析）とを比較した結果、これらの方法は良好な相関を有し、相 関係数（Ｒ１）は０．９９６であった。ＥＣＬ　（０，５９）および”Ｐ　（３ ，５４）の試料についての計算値の標準誤差を分析することにより、これらの２ つの方法の相対誤差を比較することができた。この分析を行ったところ、これら のホスホルアミダイトで標識したオリゴヌクレオチドを用いるＥＣＬ法の精度は この分析に置ける３！Ｐて標識したプローブより大きかった。これらの差は、０ ｐ測定は、ビーズに結合したおよびあらゆる残りの遊離標識を両方とも測定する ことになるので、ビーズに結合したＲｕ（ＴＩ）標識（タグ−ホスホルアミダイ ト）のＥＣＬ測定法の特異性が大きくなることによるものと思われる。測定法に 対するこの効果および放射性同位体を取り扱う困酸さから、タグ−ホスホルアミ ダイト標識オリゴヌクレオチドのＥＣＬ分析と比較して３ｔＰ分析法は余り行わ れていない。

Ｄ、　Ｒｕ（ＩＩ）ｆｆ識の安定性 Ｒｕ（ＩＩ）（タグ−ホスポルアミダイト）標識の安定性は、ホスホルアミダイ ト化学を用いるオリゴヌクレオチドの直接的標識によって示された。この標識を 、■、によって酸化し、ＮＨ□で５５°Ｃにて一晩加水分解した後、未反応で活 性を有する標識したオリゴヌクレオチドを回収した。この方法で標識したオリゴ ヌクレオチドをＨＰＬＣ、ゲル電気泳動およびＥＣＬ活性によって分析し、純粋 であり且つＥ　ＣＬ、分析に対して活性であると判定した。これらの条件下での オリゴヌクレオチドのこの安定性は、本発明によって標識したオリゴヌクレオチ ドを含む成分から調製した分析キットの試薬は安定でありしかも再現性の高い分 析結果が得られることを示している。

Ｅ、　ＤＮＡ−Ｒｕ　（Ｔ　Ｉ）（タグ−ホスホルアミダイト）相互作用Ｒｕ　 （Ｉ　Ｉ）錯体とＤＮＡとの相互作用は報告されている（８．　９）。これらの 相互作用は、標的ＤＮＡに対する標識したプローブの結合親和性に影響すること が知られている。酵素およびビオチン標識も、プローブの結合性を干渉すること が知られている（ＰＣＴ　Ｕ３８７１００９８７号明細書、ＷＯ８７１０６７０ ６号明細書、１０）。これらの効果は、ハイブリダイゼーション温度および他の 条件を低下させることによって抑制されている。対照的に、タグ−ホスホルアミ ダイト標識は、ＤＮＡに対する標識したプローブの結合親和性にほとんど影響し ないことが判っている。これは、前記のハイブリダイゼーション検討によって明 らかにされており、タグ−ホスホルアミダイ１−で標識したプローブは有用性を 有しており、分析パラメーターを調整する必要がないことが明らかである。

Ｆ、タグ−ホスホルアミダイ１−とタグ−ＮＨＳとの比較ダクーＮＨＳエステル を用いて、実施例ＶＩ　Ｉｆ　ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、Ｘｌｌ。

ＸＩＩＬＸＩＶおよびＸｖのオリゴヌクレオチドを標識し、タグ−ホスホルアミ ダイト標識したオリゴヌクレオチＦ’と比較した。２種類の標識試薬の差は、タ グ−ホスホルアミダイトを本質的には自動核酸合成および標識法に用いることが できることによることが判った。

用いてきた用語および表現は説明のために用いられているのであり、制限のため てはなく、これらの用語および表現を用いることが前記の特徴と同等のものを全 く除外することを意図するものではなく、本発明の範囲内で様々な変更を行うこ とができるものと認められる。

文献 １、Ｂｅａｕｃａｇｅ、Ｓ、Ｌ、およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｍ、Ｈ，、ｒデ オキシヌクレオシドホスホルアミダイト、デオキシヌクレオチド合成のための新 規なりラスのキー中間体」、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、、　２２．１ ８５９−６２　（１９８２）。

２、Ｇｒａｙ、Ｐ、Ｗ、およびＧｏｅｄｄｅｌ、　Ｄ、Ｖ、、　ｒヒト免疫イン ターフェロン遺伝子の構造Ｊ　、Ｎａｔｕｒｅ、　２９８．８５９−８６３　（ ＋９８２）。

３、　５ｈｉｂａｔａ、　Ｄ、に、　Ａｒｎｈｅｉｍ、　Ｎ、Ｂ、および−ｒｔ ｉｎ、　Ｊ、Ｗ、、ｒポリメラーゼ連鎖反応を用いるパラフィンに埋設した組織 でのヒトパピローマウィルスの検出」、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１６７、 ２２５−３０　（１９８８）。

４、Ｙｅｅ、Ｃ，、Ｋｒｓｈｎａｎ−Ｈｅｗｌｅｔｔ、［、、Ｂａｋｅｒ、　Ｃ ，Ｃ，、Ｓｃｈｌｅｇｅｌ、　Ｒ，およｎｏｗｌｅｙ。

Ｐ、Ｍ、、ｒヒト子宮癌細胞系でのヒトパピローマ配列の存在および発現Ｊ　、 Ａａ　Ｊ。

Ｐａｔｈｏｌ、、　１１９．３６１−６　（１９８５）。

５、Ｚｏｓｋｉ、Ｇ、およｒＪ′Ｗｏｏｄｗａｒｄ、　Ｓ、、ｒ電気化学ルミネ ッセンス減少の測定を行うだめの装置」、１９９１年８月２１田こ公表番号０４ ４１８８０号で公表された係属ＥＰＯ出願８９９１２９１３．４号に対応するＰ ＣＴ　Ｕ３８９１０４８５４号明細書。

６、Ｍｕｆｔｉｓ、に、Ｂ、およ１ＪＦａｌｏｏｎａ、　Ｆ、Ａ、、　ｒポリメ ラーゼによって触媒される連鎖反応によるイン・ビトロでのＤＮＡの特異的合成 Ｊ　、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　１．５５゜３３５−５０　（１９ ８７）。

７、　８ａｒｏｎｅ、　Ａ、Ｄ、、　Ｔａｎｇ、　Ｊ−ＹおよびＣａｒｕｔｈｅ ｒｓ、　Ｍ、Ｈ，、ｒビス−ジアルキルアミノホスフィンのイン・シテユての活 性化−ポリマー支持体上でのデオキシオリゴヌクレオチドの新規な合成法Ｊ　、 Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１２，４０５１−６１　（１９８４ ）。

８、Ｕｐｄｙｋｅ、Ｔ、Ｖ、およびＮ１ｃｏｌｓｏｎ、　Ｇ、Ｌ、、ｒビオチン 化モノクローナル抗体およびストレプトアビジン−アガロースを存する膜抗原の 免疫親和性単離」、！Ｊｅｔｈｏｄｓ　εｎｘｙｍｏ１．．　１２１．　７１７ −２５　（１９８６）。

９、Ｃａｒｄｕｌｌｏ、　Ｒ，Ａ、、　Ａｇｒａｗａｉ、　Ｓ、、　Ｆｌｏｒｅ ｓ、　Ｃ，、Ｚａｍｅｃｎｉｋ、　Ｄ、Ｃ，、およ１ｏ１ｆB Ｄ、Ｅ、、ｒ核酸の検出および非放射性経口反応エネルギー移動による／％イブ リダイゼーションＪ　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　 ８５．８７９０−４　（１９８８）。

］　０．　Ｏｕ、　Ｃ−Ｙ、　Ｋｗｏｋ、　Ｓ、、　Ｍｉｔｃｂｅｌｌ、　Ｓ、 Ｗ、、　Ｍａｃｋ、　Ｄ、Ｈ，、５ｎｉｎｓｋｙ、　Ｊ、ＪA。

Ｋｒｅｂｓ、　Ｊ、Ｗ、、　Ｆｅｏｒｉｎｏ、　Ｐ、、　Ｗａｒｆｉｅｌｄ、　 Ｄ、およびＳｃｈｏｅｈｅｔｍａｎ、　Ｇ、、　ｒ末梢血のP 核細胞のＤＮＡに置けるＨＩＶ−１の直接検出のためのＤＮＡ増輻増幅、　５ｃ ｉｅｎｃｅ。

２３９、２９５−９７　（１９８８）。

フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ０９Ｋ　１１１０７　 ９１５９−４ＨＣ１２Ｑ　１／６８　ＺＮＡ　Ａ　９４５３−４８ＧＯＩＮ　２ １／７７　Ｚ　９４０８−２ＪＩ

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＭはＲｕ、ＯｓおよびＲｅから成る群から選択され、ｕ・ｔ＝ｖであり 、ｕは１または２であり、ｔはＩまたは２であり、Ｌｌ、Ｌ２およびＬ３は同一 でもまたは異なっていてもよく、それぞれ▲数式、化学式、表等があります▼， ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学式、表等があります▼ であり、但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は同一でもまたは異な っていてもよく、それぞれＨ、１〜５個の炭素原子を有するアルキル基、▲数式 、化学式、表等があります▼または▲数式、化学式、表等があります▼；であり 、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６、の少なくとま一つは▲数式、化学 式、表等があります▼または▲数式、化学式、表等があります▼； であり、ｎは１〜２０の範囲の整数であり、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ２、ＣＯＯおよび ＣＯＮＨから成る群から選択され、ａおよびｂは−Ｎ（ＣＨ−（ＣＨ２）２）２ 、−ＮＨ−ＣＨ−（ＣＨ３）２、Ｏ−（ＣＨ２）２−ＣＮ、Ｏ−ＣＨ３またはモ ルホリノであり、但しａおよびｂは同一ではなく、ＺはＭと会合する対イオンで あり、リガンドＬ１、Ｌ２およびＬ３は化合物が電気化学ルミネッセンスが可能 であるように選択される）を有する化合物。
2. ２．Ｌ１、Ｌ２およびＬ３が総て置換されたまたは未置換のビピリジルであり、 ｎは４〜７である、請求項１に記載の化合物。
3. ３．式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ＭはＲｕ、ＯｓおよびＲｅから成る群から選択され、Ｌ１、Ｌ２および Ｌ３は同一でもまたは異なっていてもよく、それぞれ▲数式、化学式、表等があ ります▼，▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学式、表等があ ります▼であり、但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は同一でもま たは異なっていてもよく、それぞれＨ、１〜５個の炭素原子を有するアルキル基 であり、但し、Ｒ１〜Ｒ６の一つは、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ のリンカーであり、ｎは１〜２０の範囲の整数であり、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ２、Ｃ ＯＯおよびＣＯＮＨから成る群から選択され、ｙは１〜２０の整数であり、ｚは ０または１であり、Ｂは成体分子またはその合成類似体であり、ホスホジエステ ル基は前記の生体分子に結合している）を有し、電気化学ルミネッセンスを生じ ることができる化合物。
4. ４．式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｍはルテニウム、オスミウムまたはレニウムであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３ 、Ｒ４およびＲ５は同一でもまたは異なっていてもよく、それぞれＨ、１〜４個 の炭素原子を有するアルキル基であり、ｎは１〜２０の整数であり、ＸはＯ、Ｓ 、ＳＯ２、ＣＯＯおよびＣＯＮＨから成る群から選択され、ｙは１〜２０の整数 であり、ｚは０または１であり、ｍは１〜１０００の整数であり、ＮＡＢは修飾 されていてもまたは修飾されていなくともよい核酸塩基である）を有し、電気化 学的ルミネッセンスが可能な錯体。
5. ５．前記の核酸がポリメラーゼ増幅反応のプライマーである、請求項４に記載の 錯体。
6. ６．前記の核酸がハイブリダイゼーションプローブである、請求項４に記載の錯 体。
7. ７．試料中に存在する目的とする核酸の分析物質を検出する方法であって、前記 の試料を式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｍはルテニウム、オスミウムまたはレニウムであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３ 、Ｒ４およびＲ５は同一でもまたは異なっていてもよく、それぞれＨ、１〜４個 の炭素原子を有するアルキル基であり、ｎは１〜２０の整数であり、ＸはＯ、Ｓ 、ＳＯ２、ＣＯＯおよびＣＯＮＨから成る群から選択され、ｙは１〜２０の整数 であり、ｚは０または１であり、ｍは１〜１０００の整数であり、ＮＡＢは修飾 されていてもまたは修飾されていなくともよい核酸塩基である）を有するプロー ブと、このプローブが目的とする前記の分析物質に選択的に結合して、目的とす る分析物質−プローブ錯体を形成するような条件下で接触させ、この錯体の電気 化学的ルミネッセンスを測定する段階を含んでなる方法。
8. ８．前記の目的とする分析物質が核酸配列であり、前記のプローブがこの目的と する分析物質に相補的な核酸プローブである、請求項７に記載の方法。
9. ９．ポリメラーゼ連鎖反応または他のプライマーに対する反応の増幅生成物にお いて目的とする核酸を検出するように上記反応を行う方法であって、（ａ）前記 のポリメラーゼ連鎖反応または他のプライマーに対する反応において、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｍはルテニウム、オスミウムまたはレニウムであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３ 、Ｒ４およびＲ５は同一でもまたは異なっていてもよく、それぞれＨ、１〜４個 の炭素原子を有するアルキル基であり、ｎは１〜２０の整数であり、ＸはＯ、Ｓ 、ＳＯ２、ＣＯＯおよびＣＯＮＨから成る群から選択され、ｙは１〜２０の整数 であり、ｚは０または１であり、ｍは１〜１０００の整数であり、ＮＡＢは修飾 されていてもまたは修飾されていなくともよい核酸塩基である）を有するプライ マーを取り込み、 （ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応または他のプライマーに対する反応を行い、（ｃ） 目的とする増幅した核酸の電気化学的ルミネッセンスを測定することから成る、 方法。
10. １０．ポリメラーゼ連鎖反応または他のプライマーに対する反応の生成物中に目 的とする核酸を検出する方法であって、（ａ）前記の反応中の少なくとも１個の 核酸を、式式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｍはルテニウム、オスミウムまたはレニウムであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３ 、Ｒ４およびＲ５は同一でもまたは異なっていてもよく、それぞれＨ、１〜４個 の炭素原子を有するアルキル基であり、ｎは１〜２０の整数であり、ＸはＯ、Ｓ 、ＳＯ２、ＣＯＯおよびＣＯＮＨから成る群から選択され、ｙは１〜２０の整数 であり、ｚは０または１であり、ｍは１〜１０００の整数であり、ＮＡＢは修飾 されていてもまたは修飾されていなくともよい核酸塩基である）を有する化合物 で標識し、 （ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応または他のプライマーに対する反応を行い、前記の 核酸を増幅生成物中に取り込み、 （ｃ）目的とする前記の核酸の電気化学的ルミネッセンスを測定する段階から成 る方法。
11. １１．化合物の相対的ＥＣＬ容量の、そのビピリジル類似体の相対的ＥＣＬ容量 に対する比が０．１０以上である、請求項１に記載の化合物。
12. １２．化合物の相対的ＥＣＬ容量の、そのビピリジル類似体の相対的ＥＣＬ容量 に対する比が０．１０以上である、請求項３に記載の化合物。
13. １３．目的とする分析物質−プローブ錯体の相対的ＥＣＬ容量の、そのビピリジ ル類似体に対する相対的ＥＣＬ容量の比が０．１０以上である、請求項７に記載 の方法。
14. １４．錯体の相対的ＥＣＬ容量の、そのビピリジル類似体の相対的ＥＣＬ容量に 対する比が０．２５以上である、請求項４に記載の錯体。