KR0169755B1 - Dna 프로브 검정을 위한 개선된 전기화학발광 라벨 - Google Patents

Dna 프로브 검정을 위한 개선된 전기화학발광 라벨 Download PDF

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Abstract

본 발명은 프로포라미디티 화학약품을 사용하는 신규한 올리고튜클레오티드용 전기화학 발광 (ECL)라벨에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]
DNA프로브 검정을 위한 개선된 전기화학발광 라벨
[발명의 분야]
본 발명은 포스포라미디트 화학약품을 사용하는 올리고뉴클레오티드에 대한 신규의 전기화학발광(ECL) 라벨에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 자동화된 DNA합성 중에 라벨의 직접 혼입을 가능케 하는 트리스(2,2-비피리딘) 루테늄(Ⅱ) 착물 비스(2,2-비피리딘) [4-{4-(2-시아노에톡시-N,N-디이소프로필아미노)-포스핀옥시부틸}4'-메틸] 2,2-비피리딘 루테늄(Ⅱ) 이헥사플루오로포스페이트에 관한 것이다.
본 출원에서 괄호 안의 아라비아 숫자로 표시된 몇몇 문헌을 참고한다. 이 참고 문헌에 대한 자세한 언급은 청구범위 바로 전에 명세서의 말미에 기술된다. 이들 참고 문헌은 이 발명에 속하는 기술분야에 대하여 서술한다.
[발명의 배경]
생화학적인 및 생물학적인 물질내에 관심있는 분석물에 대한 검출 및 정량분석을 위한 무수한 시스템 및 방법이 개발되었다. 미량의 미생물, 제약물, 호르몬, 바이러스, 항체 핵산, 및 기타 단백질을 측정할 수 있는 방법 및 시스템이 연구자 및 임상의에게 매우 가치 있다.
기술의 실질적인 주요 부분은 널리 공지한 결합 반응, 예컨대, 항원-항체 반응, 핵산 혼성체와 반응, 및 단백질-리간드 시스템에 근거하여 발전되어 왔다. 연구 및 진단학에서 가치있는 많은 검정 방법 및 시스템은 많은 생화학적 및 생물학적 결합 시스템에서의 고도의 특이성이 기인한다. 전형정으로, 관심있는 분석물의 존재는 하나 이상의 결합 물질에 부착된 관찰가능한 라벨의 존재 또는 부재에 의해 나타난다. 광화학적, 화학적 및 전기화학적 수단을 통해 발광 할 수 있는 라벨이 특히 관심있다.
광발광은 물질이 전자기 방사선을 흡수할 때 발광을 유발하는 방법이다. 형광 및 인광이 광발광의 유형들이다. 화학발광체 방법은 에니지의 화학적 전이에 의해 형광 종의 생성을 수반한다. 전기화학발광은 전기화학적으로 발광 종의 생성을 수반한다.
관심있는 분석물을 함유하는 샘플이 화학발광 라벨로 라벨링된 반응물과 혼합되는, 많은 화학발광 검정 기술이 개발되었다. 반응성 혼합물을 인큐베이션하고 라벨링된 반응물의 소분량을 분석물에 결합시킨다. 인큐베이션후에, 혼합물의 결합 및 비결합 분획을 분리시키고, 분획 중 하나 또는 둘다에서의 라벨의 농도를 화학발광 기술에 의해 측정할 수 있다. 하나 또는 둘다의 분획에서 측정된 화학발광의 수준은 생물학적 샘플내 관심있는 분석물의 양을 나타낸다.
전기화학발광(ECL) 검정 기술은 다른 검정 기술을 능가하는 개선법이다. 이는 관심있는 분성물의 존재 및 농도에 대한 민감하고 정확한 측정을 제공한다. 이 기술에서는, 발광을 개시하기 위하여 인큐베이션된 샘플을 전해 전량계 활동 전극에 노출 시킨다. 적절한 화학적 환경하에서 특정시간에서 및 특정 방식으로 사용 전극 상에 부과된 전압에 의해 상기 전기화학발광이 개시된다. 라벨에 의해 생성된 광을 측정하는데, 이는 분석물의 존재 또는 양을 가리킨다. 상기 ECL 기술에 대해 보다 상세히 설명하기 위하여, PCT 공개 출원 번호 US85/01253(W086/02734), PCT 공개 출원 번호 US87 /00987(W087/06706) 및 PCT 공개 출원 번호 US88/03947(W089/04302)를 참고한다. 상기 출원서의 공개물의 내용을 인용한다.
또한, 미합중국 특허 일련번호 267,509 및 미합중국 특허 출원 번호266,914는 바람직한 검정 조성물에 관한 것이고; 미합중국 특허 번호 5,601,445 및 미합중국 특허 출원 일련 번호 744,890은 바람직한 ECL-기재 검정 수행방법을 지도하고; 미합중국 특허 일련 번호 652,427은 ECL-기재 검정을 수행하기 위한 바람직한 방법 및 장치를 서술한다. 이들 특허 및 출원서의 공개물의 내용도 참고 인용한다.
PCT 공개 출원 번호 US89/04919(W0/90/50301)에서 교시된 방법은 연구 및 임상 세팅에서 수행된 다양한 검정에서 극히 소량의 분석물의 검출 및 정량분석을 허용한다. 그러나, 연구자 및 임상의들은 이들 방법에 의해 수행된 검정의 검출 한계를 낮추고, 검정의 민감도를 증가시키고 속도를 증가시키기 위해 노력할 것을 계속하여 요구하고 있다.
특히, DNA 프로브 검정 개선에 대한 요구가 존재한다. 이점에서, 출원인은 관심있는 분석물을 특이적 라벨링된 화합물을 사용하여 검출할 수 있음을 발견했다. 이들 라벨링된 화합물 중 일부는 예컨대, AU 33343/89로 부터 및 밴워스 일동(Bannwarth et al.)으로부터, 비방사성활성 라벨 문자로서 바토페난트롤린, RuⅡ착물에 의한 올리고뉴클레오티드에 대한 간단한 특이적 라벨링, Tetrahedron Letters, Vol, 30, No, 12, pp, 1513-1516, 1989에 공지되어 있고 나머지는 신규이다.
[발명의 목적]
따라서, 본 발명이 일차 목적은 특이적 라벨링된 화합물을 사용하여 샘플내 존재하는 관심있는 핵산 분석물을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은, 중합효소 연쇄반응 및 기타 프라이머 의존성 반응에서 특이적 라벨링된 화합물을 반응에 혼입시켜 반응의 증폭 생성물내 관심있는 핵산을 검출하명서 상기 응을 수행하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 중합효소 연쇄반응 및 기타 프라이머 의존성 반응에서 적어도 하나의 핵산서열에서 특이라벨링된 화합물을 라벨링 함으로써 상기 반응내 생성물내 관심있는 핵산 분석물을 검출하는 것이다.
본 발명의 상기 및 기타 목적은 하기 서술 및 청구범위를 통해 자명해질 것이다
[발명의 요약]
한 측면에서, 본 발명의 목적은 하기식의 화합물을 사용하여 달성된다.
이때 M은 Ru,Os 및 Re로 구성된 군으로부터 선택되고: u·t=v,u는 1 또는 2 이고 t는 1 또는 2 이고; L1,L2및 L3는 동일하거나 상이하고 각각은
이때 R1, R2, R3, R4, R5및 R6는 동일하거나 상이하고 각각은 H, 1-5개의 탄소 원자의 알킬기,
R1, R2, R3, R4, R5, 및 R6중 적어도 하나는
n은 1-20 범위의 정수이고; X는 O, S, SO2, COO, 및 CONH로 구성된 군으로 부터 선택되고; a 및 b는 -N(CH-CH3)2)2, -NH-CH-(CH3)2, O-(CH2)2-CH, O-CH3또는 모르폴리노이며, 단 a 및 b는 동일하지 않고; Z는 M과 관련된 반대 이온이며; 단, 부가적으로, 리간드 L1, L2및 L3는 상기 화합물이 전기화학발광을 할 수 있도록 선택된다.
두 번째 측면에서, 본 발명의 목적은 하기식의 화합물을 사용하여 달성된다.
이때 M, L1, L2및 L3는 상기 정의된 바와 같으나, 단 L1, L2및 L3의 정의에 포함된 R1-R6기중 하나는 하기식의 링커이고
이때 n 및 X는 상기 정의된 바와 같고, y는 1-20의 정수이고; z는 0 또는 1이고; B는 생체분자 또는 이의 합성 동족체이고, 포스포디에스테르기는 상기 생체분자에 결합되며; 상기 화합물은 전기화학발광할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 목적은 하기식의 측정 화합물을 사용하여 달성된다:
이때 M,R1,R2,R3,R4,R5,n,X,y 및 z는 상기 정의된 바와 같고; m은 1-1000의 정수이고; NAB는 변형되거나 변형되지않은 핵산 염기이며, 상기 화합물은 전기화학발광할 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명의 목적은 프로브가 관심있는 분석물에 선택적으로 결합하여 관심있는 분석물-프로브 복합체를 형성하는 조건하에서 관심있는 핵산 분석물을 함유한 상기 샘플을 상기 식 Ⅲ의 프로브와 접촉시켜 상기 복합체의 전기화학발광을 측정함으로써, 상기 샘플내에 존재하는 관심있는 핵산 분석물을 검출하는 방법으로 달성된다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 목적은 중합효소 연쇄 반응 또는 기타 프라이머-의존성 반응의 증폭 생성물내의 관심있는 핵산을 검출하기 위해 하기 (a)-(c)에 의해 중합효소 연쇄 반응 또는 기타 프라이머-의존성 반응을 수행하는 방법으로 달성된다;
(a) 상기 중합효소 연쇄 반응 또는 다른 프라이머-의존성 반응에 상기식Ⅲ의 프라이머를 혼입시키고;
(b) 중합효소 연쇄 반응 또는 기타 프라이머-의존성 반응을 수행하고;
(c) 관심있는 증폭된 핵산의 전기화학발광을 측정한다.
부가적인 측면으로, 본 발명의 목적은 하기 (a)-(c)에 의해 중합효소 연쇄 반응 또는 기타 프라이머-의존성 반응의 생성물내의 관심있는 핵산 검출방법으로 성취된다.
(a) 상기 반응에서의 적어도 하나의 핵산을 상기 일반식Ⅲ의 화합물로써 라벨링하고;
(b) 상기 핵산을 증폭 생성물내로 혼입시키는 중합효소 연쇄 반응 또는 기타 프라이머-의존성 반응을 수행하고;
(c) 관심있는 상기 핵산의 전기화학발광을 측정한다.
[특정 바람직한 실시양태의 서술]
[정의]
본 발명을 보다 명백하게 이해하기 위해, 특정 용어를 하기와 같이 정의한다.
뉴클레오티드는 아덴닌, 시토닌, 구아닌, 및 티민(DNA) 또는 우라실(RNA)의 네 염기중 하나, 더하기 당(DNA에 대해 데옥시리보스, RNA에 대해 리보스)을 더하고 인산염을 더한 것이다. DNA 중합 반응을 위한 단량체를 제공하기 위해, 전형적으로 모두 네 개의 데옥시뉴클레오티드가 필요하다. 본원에서 정의되는 뉴클레오티드는 또한 주형상에서 중합효소의 작용을 증진시키기 위해 사용되는 5-메틸-dGTP 및 7-데아자-dGTP와 같은 변형된 염기도 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 뉴클레오티드란 용어는 비오틴 및 디곡시게닌(Boehringer Mannheim,Indianapoils, Iudiana로부터 디속시게닌-11-UTP)에 연결되는 염기, 및 증폭중에 프라이머 또는 프라이머 연장 생성물 내로 직접 혼입될 수 있는 비오틴-21-UTP 및 아미노-7-dUTP(Clontech, PaloAlto, California)를 포함하는데, 증폭된 서열의 선택적 결합을 제공한다.
올리고뉴클레오티드는 적어도 두 개의 뉴클레오티드로 형성된 서열이다.
폴리뉴클레오티드는 긴 올리고뉴클레오티드이며,RNA 또는 DNA 일 수 있다.
용어 올리고뉴클레오티드는 당업계에서 일반적으로 보다 작은 핵산 사슬로 표시하는데 사용되고, 폴리뉴클레오티드는 당업계에서 일반적으로 DNA 또는 RNA 염색체 또는 그의 단편을 포함하는 보다 큰 핵산 사슬을 표시하는데 사용되는 한편, 여기서 전자 또는 후자의 용어의 사용은 특별히 명시하지 않는한 크기를 제한하지 않는다.
용어 핵산은 상기 서술된 바와 같이 변형된 염기를 가지거나 가지지 않은 DNA 또는 RNA 염색체 또는 그의 단편을 포함하는 임의 길이의 폴리뉴클레오티드를 언급하는 것으로 당업계에 널리 공지되어 있다.
서열(에컨대, 서열, 유전자 서열, 폴리뉴클레오티드 서열, 핵산 서열)은 5'로부터 3' 방향으로 판독하는 폴리뉴클레오티드 가닥에 존재하는 실제 열거된 염기(리보스 또는 데옥시리보스)를 언급한다.
특정 또는 선택된 뉴클레오티드 서열은 다른 상이한 서열로부터 구별가능한(즉, 혼성체화 분석에 의해) 특정 서열을 언급한다(예컨대, 특정 뉴클레오티드 서열 5'-ATGCCC-3'은 5'-AAGCCC-3'과 같은 서열이 아님).
프로브는 관심있는 표적 핵산 서열에 상보적인 서열을 가지며 프로브- 표적 듀플렉스의 검출을 가능케 하는 몇몇 부가적 특성을 가지는 단일 또는 이중 가닥 핵산이다. 당업자는 프로브 및/또는 표적이 이중가닥이라면, 이중 가닥 핵산이 가닥 분리되어야만이 혼성체화가 일어날 수 있는 것으로 이해할 것이다.
프로브는 부착된 태그(tag)또는 마커(marker)에 의해 검출가능하게 된다. 프로브에 연결된 태그 또는 마커는 형광 또는 태그, 동위원소(예컨대, 방사성동위체 또는 자기공명) 라벨, 염색 마커, 효소 마커, 항체에 의해 검출가능한 항원성 결정인자. 또는 스트렙타비딘 피복된 비드(bead) 같은 또 다른 지시자 부분이 특이적으로 프로브에 부착될 수 있게끔하는 비오틴 같은 결합 부분(binding moiety)을 포함할 수 있다. 라벨링되거나 태그를 붙인 프로브-표적 듀플렉스가 형성될 때, 듀플렉스는 태그 또는 라벨의 특징적 특성에 의해 검출될 수 있다. 대안적으로, 하기 실시예에서 ECL 검정을 위해 서술된 바와 같이, 결합 부분을 가진 프로브는 혼성체화 및 듀플렉스 형성을 통해 라벨링된 표적의 포획을 가능케하여 라벨 또는 다른 기술 수단에 의한 검출을 가능케한다.
핵산에 적용될 때 용어 라벨 또는 라벨링된은, 문제의 핵산이 발광, 전기화학발광, 확인된 화학물질의 촉매현상, 방사능, 또는 특이한 결합 특성을 포함할 수 있는 특성에 의해 검출가능한 부분에 연걸된다는 것을 의미한다. 이리하여, 용어 라벨은 달리 특별히 서술되지 않으면 리간드 부분을 포함한다.
프라이머는 관심있는 서열(관심있는 서열은 보다 큰 핵산 서열내의 하부단편일 수 있다.)의 부분에 상보적인 올리고뉴클레오티드의 비교적 짧은 분절이다. 프라이머는 결과 생성되는 연장 생성물의 5' 말단을 나타낸다. 주형 가닥 상의 관심있는 서열에 대해 3' 말단에 상보적인 프라이머는 주형에로의 혼성체화시 중합효소가 이 3' 말단에 작용할 수 있게끔 한다. 3' 말단에 대한 변형이 프라이머로서 기능하는 올리고뉴클레오티드의 능력에 영향을 미칠 것이라는 것이 널리 공지되어 있다. 한 예는 DNA 서열화에서 디데옥시뉴클레오티드를 혼입시켜DNA중합효소의 작용을 막는 것이다. 프라이머의 길이는 특정 온도에 의존할 것이나, 20∼30 염기쌍이 일반적 크기인 것으로 널리 공지되어 있다. 널리 공지된 바와 같이, 프라이머는 성공적인 혼성체화가 일어나기 위해 완전한 상보물일 필요는 없다. 프라이머가 불완전한 상보물이라면, 프라이머 서열을 혼입한 연장 생성물이 초래될 것이고, 이후의 주기 동안중에, 이 프라이머 서열에 대한 상보물이 주형 서열 내로 혼입될 것이다.따라서 주형의 상보물의 서열로부터 변경된 서열을 가진 적당히 전택된 프라이머가 시험관내 돌연변이 생성을 제공하는데 사용될 수 있는 것으로 널리 알려져있다. 프라이머는 상기 정의된 바와 같이 임의의 공지된 변형되거나 라벨링된 염기를 포함하여, 임의의 공지된 핵산 염기를 혼입할 수 있는데, 그럼으로써,프라이머 연장 생성물은 프라이머 연장 생성물의 분리 및 검출을 허용하는 이들 특징물을 혼입하게 될 것이다. 프라이머에 유리하게 연결된 태그 또는 마커는 형광 또는 발광 태그, ECL 라벨, 동위원소(예컨대, 방사성동위원소 또는 자기공명) 라벨, 염색 마커, 효소 마커, 항체에 의해 검출가능한 항원 결정인자, 또는 스트렙타비딘 피복된 비드같은 또 다른 지시자가 프라이머 또는 상기 프라이머를 혼입하는 임의 핵산 서열에 특이적으로 부착하게끔 하는 비오틴 같은 결합 부분을 포함할 수 있다. 라벨링되거나 태그를 붙인 증폭 생성물이 생성될 때, 증폭 생성물은 태그 또는 라벨의 특징적 특성에 의해 검출될 수 있다.
특정 또는 선택된 프라이머는 상보적인(프라이머에 상보적) 어댑터 말단 서열이 부착되어 있는 임의 DNA 서열에 무차별하게 어닐링하는 유니버셜 프라이머와 구별된다. 존재하는 모든 핵산 서열에 어댑터를 무작위로 부착시키는 것을 피하기 위해, 관심있는 핵산을 단리하도록, 또는 달리 말하면 관심있는 원하는 DNA 서열에만 결찰 절차가 진행되도록 유니버셜 프라이머를 가지고 주의가 기울어져야 한다.
용어 단일 프라이머는 관심있는 목표 핵산 서열과 선택적으로 혼성체화하도록 고안된 단일의 짝안지은(unpaired) 특정 또는 선택된 프라이머를 의미한다.
단일 프라이머 증폭은 관심있는 서열 부분에 상보적인 단일의 짝안지은 프라이머를 이용하여 핵산을 증폭시키는 방법이다.
혼성체화는 상보적인 단일 가닥 핵산으로부터의 이중 가닥 또는 듀플렉스 핵산의 형성을 서술한다. 혼성체화는 충분히 상보적인 단일 가닥 DNA 및/또는RNA 사이에 일어나서 DNA-DNA, DNA-RNA, 또는 RNA-RNA을 형성할 수 있다.
어닐링은 단일 사슬 핵산으로 구성되는 용액의 온도가 멜팅(melting) 또는 변성 온도 이하로 낮춰질 때 상보적인 단일 사슬 핵산 사이의 혼성체화를 언급한다.
DNA의 시험관내 증폭은 DNA중합효소에 의해 촉매화된다. 많은 유형의 DNA 중합효소가 당업계에 공지되어 있다. 그들은 일반적으로 프라이머가 어닐링되는 단일 가닥 주형을 이용하여 이중 가닥 DNA 서열의 합성을 촉매작용하는 일반적 특성을 공유한다. 대부분의 유기체로부터 추출된 DNA 중한요소는 핵산의 열 변성을 위해 요구된 온도에서 불활성된다. 이리하여, 상기 열 민감성 효소가 이용된다면 각 열 주기의 출발에서 효소의 대체, 또는 열 불활성화를 막기 위한 어떤 인자의 첨가가 요구된다. 시험관내 PCR에 바람직한 DNA 중합효소는, 고온에서 자라서 내열성(듀플렉스 DNA를 변성시키는 온도에서 촉매 활성을 잃지 않는다)인 유기체로부터 유도된다.
DNA 중합효소에 의해 촉매작용된 반응은 당업계에 공지되어 있고, 본원에서는 DNA중합효소 반응으로 언급된다. 본원에서 변형된 반응은 당업계에 공지된 완충액, DNA 주형(관심있는 DNA 서열)의 공급물, (주형 서열 조성에 의존하여) 몇몇 또는 모든 4개의 데옥시리보뉴클레오티드 삼인산염(상기 서술된 바와 같이 변형된 염기를 포함할 수 있는), 바람직하게 관심있는 핵산에 대하여 1000:1의 몰 과량에서 사용되는 주형의 3' 말단에 또는 부근에로 혼성체화되도록 고안된 특정 프라이머, 및 환형 가닥 분리를 위한 수단을 요구한다. 가닥 분리는 바람직하게 어닐링 및 변성 온도사이의 열 주기에 의해 성취된다. 역전사효소는 DNA-DNA 복제 뿐만 아니라 RNA-RNA 복제 모두를 매개하는 것으로 공지된다. 따라서, 이제 공지된 임의 수의 효소는 연쇄 반응을 촉매할 것이다.
전기화확발광(ECL) 라벨은 전기화학적으로 작용할 때 발광종이 되는 것들이다. 그들이 관심있는 분석물의 존재 및 농도의 민감하고 정확한 측정을 제공한다. 상기 기술에서, 발광을 유발하기 위해 샘플을 전압전류 사용 전극에 노출시킨다. 라벨에 의해 생성된 광을 측정하는데, 이는 분석물의 존재 또는 양을 나타낸다. 상기 ECL 기술은 Bard 일행 (PCT US85/-2153, WO86/02734) 및 Massey 일행 (PCT US87/00 987, WO 87/06706)에 의한 PCT 공개된 출원에서 서술된다.
ECL 검정 완충액은 ECL 분석기 내 적극상에서 전기화학적 반응을 위해 필요한 트리프로필아민을 함유하는 일반적 희석제이다.
ECL 희석제는 저장 목적을 위해 불안정한 생체분자를 함유하는 용액을 희석하는데 사용되는 희석액이다.
용어 검출 및 정량분석은 측정으로서 언급되고, 이때 정량 분석은 검정 조성물 및 보정물의 제조를 요구할 수 있는 것으로 이해된다.
ECL 장치 는 전기화학발광 기재 검정을 수행하기 위한 임의 장치이다.
태그 NHS(N-히드록시-숙신이미드) 및 태그 포스포라미디트는 ECL 태그의 예이다. 태그-NHS 에스테르는 NHS (에스테르와 반응하여 아미드 결합을 형성할 수 있는 자유 아미노기를 함유하는 물질을 라벨링하는데 유용하다(예컨데 WO86/02734 참조). 태그 포스포라미디트는 포스포-결합, 특별히 포스포디에스테르는 포스포-결합, 특별히 포스포디에스테르 결합을 형성하는 자유 아미노, 설피드릴, 또는 히드록실 기를 함유하는 물질을 라벨링하는데 유용하다.
[발명의 상세한 설명]
개선된 DNA 프로브 검정법이 있어야 한다는 요구가 계속되고 있다. 특정 라벨링된 화합물을 사용하여 고도로 민감한 핵산 프로브 검정을 수행할수 있음이 밝혀졌다.
특히, 매우 민감한 핵산 프로브 검정은 하기식의 프로브 검정은 하기식의 화합물을 사용하여 수행할 수 있다;
이때 M은 Ru, Os 및 Re로 구성된 군으로쿠터 선택되고; u·t=v, u는 1 또는 2 이고 t는 1 또는 2이고; L1, L2및 L3는 동일하거나 상이하고 각각은
이때 R1, R2, R3, R4, R5및 R6는 동일하거나 상이하고 각각은 H, 1-5개의 탄소 원자의 알킬기,
R1, R2, R3, R4, R5및 R6중 적어도 하나는
n은 1-20 범위의 정수이고; X는 O,S,SO2,COO, 및 CONH로 구성된 군으로부터 선택되고; a 및 b는 -N(CH-(CH3)2)2, -NH-CH(CH3)2, O-(CH2)2-CN, O-CH3또는 모르폴리노이고, 단 a 및 b는 동일하지 않고 Z는 M과 관련된 반대이온이며; 부가적으로, 리간드 L1, L2및 L3는 상기화합물이 전기화학발광을 할 수 있도록 선택된다.
한 실시양태는 매우 민감한 핵산 프로브 검정시에 L1, L2및 L3가 모두 치환된 비피리딜이고, n은 4내지 7인 상기 서술된 식 Ⅰ의 화합물을 사용한다.
특히 바람직한 실시양태는 자동 DNA 합성 중에 라벨을 직접 혼입할 수 있는 트리스(2,2-비피리딘) 루테늄(Ⅱ) 착물 비스(2,20비피리딘)[4-{4-(2-시아노에톡시-N,N-디이소프로필아미노)포스핀옥시부틸}4'-메틸]2,2-비피리딘 루테늄(Ⅱ) 디헥사플루오로포스페이트를 사용한다. 오스뮴 및 레늄 착물로도 유사한 결과가 얻어진다.
물론, 본 발면의 검정은 대략 임의 생체분자 또는 이의 합성 동족체를 검출하기 위해 유사하게 사용할 수 있다. 그러나, 본 검정법은 관심있는 핵산 분석물, 특히 샘플내에 존재하는 핵산 서열을 검출하는데 특히 유용하다. 관심있는 분석물은 중합효소 연쇄 반응 또는 기타 프라이머-의존성 반응의 생성물이거나 프로브에 선택적으로 결합할 수 있다.
예컨대, AU 33343/89는 유사한 화합물을 지도한다. 그러나, 이화합물은 DNA와 같은 핵산과 원치않는, 비-특이적 상호작용을 갖는다. 게다가, 참고 문헌에서 바람직한 화합물은 바토페나트롤린·RuⅡ및 벤즈바토페난트롤린·RuⅡ착물이다. 이들 화합물의 단점은 이의 크기 및 수용해서 결여를 포함한다. 따라서, 착물상의 아릴 치환체는 크기의 문제점을 심화시키고 이는 ECL 분석 중에 전극을 장애할 수 있다. 이 참고 문헌은 단지 형광에 관련된 것인 듯 하다. 형광성이란 그것이 방사선을 흡수한 후에 분자로부터 광의 즉각 방출(대략 10-6초)이다. 시간 분석 형광은 상이한 형광단이 형광을 방출하는데 소요된 시간에 근거한다. 따라서 긴 수명 시간(0.1 내지 10×10-6초)을 갖는 형광단은 짧은 수명 시간(10내지 1×10-9초)을 갖는 보통인 것들(샘플 및 용기내의 오염물 같은)로 부터 용이하게 분리된다.
방사 에너지의 흡수에 의해 발광이 생성되는 형광에 반해, ECL에 의해 발생된 발광은 전극의 결계면에서의 전기화학에 의해 생성된다. 예컨대, 본 발명의 화합물에 있어, Ru2+는 Ru3+로 산화되고 그다음 트리프로필 아민의 전기화학적 산하 생성물과 반응하여 광으로서 에니지를 방출하는 여기(exciation) 상태의 Ru2+를 발생한다. 이 유형의 여기 산화-환원 메카니즘은 형광의 경우에 발생하는 여기와 현저하게 다르다. 이차이는 예컨대 AU33343/89에 교시된 화합물 및 본 발명의 화합물의 형광 및 ECL 용량을 비교하는 하기 도표에 제시된다. 특히, 이도표는 비피리딜 및 바토페나트롤린 Ru 착물 사이의 형광 및 ECL 용량을 비교한다.
1 - 450 nm에서 여기
2 - 완충액 방출에 대해 보정됨
3 - 완충액 ECL에 대해 보정됨
화합물들의 상대적 ECL 용량은 생체분자 또는 이의 동족체에 결합될 때 화합물에 의해 실질적으로 나타난다.
본 발명에서 특히 관심있는 화합물은 화합물의 상대 ECL 용량 대 비피리딜 동족체의 상대 ECL 용량의 비율이 0.10보다 크거나 같은 것들이다. 바람직하게, 비율은 적어도 0.25이고 1.0 또는 그 이상이 바람직하다.
본 발명은 보다 잘 이해하기 위해, 많은 실시예가 이어지며 이는 어느방식으로든 본 발명의 범위를 제한하지 않는다 이들은 단지 당업자에게 본 발명을 예시하기 위해 제공된다.
[실시예 1]
라벨합성(테그-포스포미미디트)
Ⅰ(a), 브로모알칸올의 THP-유도체 합성
본 합성의 계획은 하기 도해 1a를 참고하여 보다 잘 이해될 수 있다.
하기 절차는 4-탄소 스페이서 아암을 갖는 피피리딘 리간드의 합성을 위한 것 이다. 그러나, 동일한 합성 절차가 브로모헥산올의 THP-유도체를 사용하여 7-탄소 비피리딘 리간드를 합성하기 위해 임이의 변형없이 사용되었다.
3-브로모-1-프로판올, 12.5g(∼90 밀리몰)을 250 ㎖ 둥근 바닥 플라스크에 넣었다. 디클로로메탄, 50 ㎖, 및 p-톨루엔설폰산 100㎎을 상기 플라스크에 가했다. 용액을 마그네틱 교반 플레이트 상에서 교반시켰다. 3,4-디히드로-2H-피란, 9,2 g(110 밀리몰)을 디클로로메탄 80 ㎖에 용해시키고, 결과 얻어진 용액을 균압 첨가 깔때기에 넣었다. 첨가 깔때기내 3,4-디히드로-2H-피란 용액을 상기 플라스크내 용액에 1 시간의 기간에 걸쳐 첨가했다. 플라스크내 용액의 색은 밝거나 또는 어두운 녹색으로 변했다. 반응의 진행을 50% 헥산: 50% 에틸아세테이트내 실리키겔 플레으트 상 TLC에 의해 체크했다. TLC 플레이트를 포스포몰리부덴 상에 침지시키고 상기를 고온 플레이트 상에서 가온하여 전개시켰다. 생성뭉 3-브로모-1-프로판올의 THP-유도체는 Rf∼1.0을 가지고 반응하지 않은 3,4-디히드로 -2H-피란은 Rf∼0.5(줄무늬가 나타남)를 가졌다. TLC는 Rf∼1.0을 갖는 주요한 단일 얼룩 반점에 의해 나타난 바와 같이 3,4-디히드로-2H-피란의 첨가후 약 1 시간 후에 반응이 완결되었음을 보였다. 그리고나서 20% 중탄산나트륨 용액 100㎖을 첨가하여 반응을 퀀칭시킨 후 디클로로메탄 100㎖로 2회 수성층을 추출했다. 합한 디클로로메탄층을 무수 황산나트륨 50g 상에서 건조시키고 회전 증발시켜 오일성 생성물을 얻었다.
최종(오일성) 생성물을 이동상으로서 5% 에틸아세테이트: 95% 헥산을 사용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제했다. 크로마토그래피를 상기 서술된 용매 조건을 사용하여 TCL에 의해 관찰하였다. 순수한 생성물을 함유한 분획을 모으고 회전 증발에 의해 용매를 제거하여 순수하고 맑은 오일성 생성물 16.0g을 얻었다. 상기 반응 단계의 수율은 약 75±5%였다.
nmr1H-nmr 스펙트럼은 4.55ppm에서 다중선을 보이는데, 이는 THP-기의 Ha양성자(반응 도해Ⅰ에 제시된 바와 같음)의 특성이다.
3-브로모 프로판올의 THP-유도체1H-nmr 스펙트럼 데이타:1H-nmr(CDC13),11.30-1.80(m,6); 2.06(qn,2); 3.40-3.50(m,4); 3.74-3.83(m,2) 및 4.50-4.57(m,1)
1(b).알킬화 반응
본 합성 계획은 하기 도해 1b)를 참고하여 보다 잘 이해될 수 있다.
상기 절차는 리튬 디이소프로필아미드(LDA)의 현장(in situ)발생을 사용했다. 500㎖ 둥근 바닥 플라스크를, 사용에 앞서 수분을 제거하기 위해 오븐에서 건조시키고 건조시 안에서 식혔다. 디이소프로필아민, 3.1㎖(∼22밀리몰),을 건조테트라히드로 푸란(THF)15.0㎖와 함께 500㎖ 둥근 바닥 플라스크에 넣었다. 플라스크의 출구에 삼방(三方) 스톱콕크를 장치했다. 스톱코크의 한 출구를 아르곤-충전된 풍선에 연결하고 다른 출구는 주사기를 이용한 반응 시약의 도입을 용이하게 하기 위해 고무 격막으로 봉했다. 일정하게 교반시킨 드라이아이스-이소프로필 알콜 냉각 배쓰내 플라스크를 -78℃로 냉각시키고 배쓰의 온도를 유지하기 위해 드라이아이스와 이소프로필 알콜 모두를 필요한 만큼 첨가했다. 30분 후 부틸리튬 14.0㎖(∼밀리몰)을 디이소프로필아민에 서서히 첨가했다. 첨가후, 반응 플라스크를 10분 동안 냉각 배쓰로부터 주의하여 들어올린 다음 냉각 배쓰내로 재-침수시켰다.
4,4'-디메틸-2,2'-비피리딘, 3.68g(∼20.0밀리몰)을 막자와 막자사발 내에서 고온 분말로 연마했다. 이를 250㎖ 둥근바닥 플라스크내 건조 테트라히드로푸란(THF) 80.0㎖에 용해시켰다. 반응 파스크를 냉각 배쓰표면 바로 위로 들어올리고, 비피리딘 용액을 서서히 첨가했다. 비피리딘 용액을 첨가하자 반응 혼합물의 색이 짙은 보라색으로 변했다. 비피리딘 용액의 첨가를 완결한 후, 플라스크를 냉각 배쓰에 재-침수시키고 반응 혼합물을 냉각 배쓰내에서 2 시간 동안 교반시켰다. 3-브로모-1-프로판올의 THP-유도체,6.0g(∼26.0 미리몰)을 100㎖ 둥근 바닥 플라스크에 넣은 다음 약 10-15㎖의 건조 THP를 첨가하고 용매를 회전 증발기상에서 증발시켰다. 건조THF의 첨가 및 증발 과정을 2회 더 반복하고 매회 진공에 아르곤을 방충시켰다. 최종적으로, 잔류물을 건조 THF 5.0㎖에 용해시키고 결과 얻어진 용액을 반응 혼합물에 첨가하고 부가의 1시간 동안 교반했다. 반응을 이동상으로서 10% 메탄올: 90% 클로로포름과 함께 실리카겔 플레이트 상 TLC에 의해 체크했다. TLC는 두 개의 반점을 나타냈다. 보다 서서히 이동한(미반응) 4.4'-디메틸-2,2'-비피리딘은 Rf∼0.35를 가지고 빠르게 이동한 알킬화 생성물은 Rf∼0.42를 가진다. 원하는 생성물에 대응하는 TCL 반점이 반응하지 않은 출발 물질에 대해 60 질량% 이상을 보이면 성공적인 반응임을 의미한다. 그리고나서 반응 혼합물을 밤새 교반시켰다. 냉각 배쓰에 부가의 드라이아이스나 이소프로필알콜 첨가가 더 이상 필요치 않았다.
반응의 TCL를 다음날 다시 체크했다. 그리고나서 NH4CL 포화용액 100㎖를 첨가하여 반응을 퀀칭시키고 퀀칭시킨 혼합물을 분별 깔때기에 옮겼다. 진탕시킨 후, 혼합물을 침전시키고 나서, 용액을 하부 수성층 및 상부 THF층으로 분리시켰다. 그리고나서 THF 층을 분리해 내고 무수 황산 나트륨 상에서 건조시켰다. 수성층을 디클로로메탄 150㎖로 2회 추출했다. 합한 유기층을 무수 황산 나트륨상에서 건조시키고 회전 증발시켜 오일성 잔류물을 얻었다. 반응 혼합물을 하기 1(c)에서 서술한 바와 같이, THP기의 탈보호 후에 정제했다.
1(c), THP-기의 탈보호 및 칼럼 크로마토그래피에 의한 정제
본 합성 계획은 하기 도해 1c)를 참고하여 보다 잘 이해될 수 있다.
반응하지 않은 4,4'-디메틸-2,2'- 비피리딘과 알킬화 생성물 간의 Rf 차이는 매우 작다. 따라서, 비피리딘 리간드의 정제는 원하는 생성물과 물순물간의 Rf차이가 커지게되는 THP-기의 탈보호 후에 수행하는 것이 바람직하다.
화합물 Rf
4-탄소 비피리딘 리간드의 THP-유도체 0.42
4,4'-디메틸-2,2'-비피리딘 (미반응) 0.35
4-탄소 비피리딘 리간드 (알콜 리간드) 0.15
메탄올 40㎖를 알킬화 반응(1(b)절)으로부터 얻은 오일성 잔류물에 첨가하고 250㎖둥근 바닥 플라스크에 넣었다. 오일성 잔류물은 반응하지 않은 4,4'-디메틸-2,2'-비피리딘 리간드의 THP-유도체(원하는 생성물), 및 반응하지 않은 3-브로모-1-프로판올의 THP-유도체 혼합물을 함유한다. p-톨루엔 설폰산, 5.0g(∼25 밀리몰)을 반응 혼합물에 첨가한 후 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응을 이동상으로서 10%메탄올:클로로포름과 함께 실리카 겔 플레이트 상에서 TCL에 의해 관찰했다. 다양한 성분에 대한 Rf 값은 반응하지 않은 4,4'-디메틸 -2.2'-비피리딘 Rf∼0.35, 스페이서 아암을 갖는 비피리딘 리간드의 THP-유도체 Rf∼0.42, 및 스페이서 아암을 갖는 비피리딘 알콜 리간드 Rf∼0.15였다. 반응의 완결은 TLC 상 비피리딘 리간드의 THP-유도체에 해당하는 반점(Rf∼0.42)의 소멸로 나타났다. 그리고나서, 용매(메탄올)를 회전 증발기 상에서 증발시키고, 잔류물을 디클로로메탄 10㎖에 재현탁시켰으며, 상기에 중탄산 나트륨 포화 용액 40㎖를 첨가했다. 그리고나서 수성층을 디클로로메탄 100㎖로 2회 추출했다. 합한 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 용매는 회전 증발기 상에서 스트립핑시켜 생성물로서 오일성 잔류물을 얻었다.
오일성 생성물을 이동상으로서2% 메탄올: 98% 클로로포름을 사용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래픽에 의해 정제했다. 칼럼을 10% 메탄올:90% 클로로포름과 함께 실리카겔 상 TCL 에 의해 관찰했다. 순수한 분획(TCL에 의해 판명됨)을 모으고 용매를 회전 증발에 의해 제거했다. 알킬화 반응의 수율은 부틸리튬과 같은 반응시약의 신선함 뿐만 아니라 반응중의 건조한 조건을 유지시키는 것에도 매우 많이 좌우된다. 본 알킬화 반응 단계의 수율은 약 60±10%였다. 샘플의1H-NMR 스펙트럼을 기록하여 화합물의 특성을 나타냈다.
비피리딘 알콜 리간드의1H-NMR 스펙트럼 데이터:1H-NMR (CDC13), 1,54-1.64(m,2); 1.68-1.80(m,2); 2.45(s, AR-CH3); 2.66-2.75(t, 2);3.59-3.98(t, 2); 7.09-7.20(m, 2 Ar-H); 8.20(S, 2 Ar-H) 8.50-8.60(m, 2 Ar-H).
2. 트리스-비피리딘 루테늄(Ⅱ) 착물 태그-알콜의 제조
본 합성 계획은 하기 도해 2)를 참고하여 보다 잘 이해할 수 있다.
시스-디클로로-비스(비피리딘) 루테늄(Ⅱ) 이수화물, 1.040g(2.0밀리몰), 및 4-탄소 비피리딘 리간드(1C 절로부터 얻음) 530.0㎎(∼2.2밀리목)을 250㎖ 둥근 바닥 프라스크에 넣고, 롤내 10% 에탄올 50.0㎖를 첨가하고, 용액을 10-15분 동안 아르곤 기체로 퍼어징 시켰다. 플라스크에 수냉식 농축기를 장치하고, 혼합물을 6 시간 동안 환류시켜 트리스-비피리딘 루테늄(Ⅱ) 착물을 형성했다. 플라스크를 환류하는 동안 알루미늄 호일로 봉했다. 용매를 회전증발에 의해 제거한 다음, 착물을 초소량의 탈이온수에 용해시키고 이온-교환 칼럼상에 적재시켰다.
통상의 정제 방법은 이온-교환 수지 7.9g을 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의해 착물 1.3g(∼2.0밀리몰)을 정제했다. 수지를 2-3 시간 동안 탈이온수 300㎖ 내에서 팽윤시킨 다음 팽윤된 수지를 길이 30㎝ 및 내부직경 2.5㎝의 칼럼에 15㎝ 높이까지 채웠다. 그리고나서 수지에 세척하고 건조시킨 모래를 0.5㎝ 높이로 층을 깔고 칼럼을 탈이온수 250㎖로 세척했다. 2절에 의해 착물 형성 반응으로부터 얻은 태그-알콜을 최소량의 탈이온수에 용해시키고 수지의 상부에 조심스럽게 층을 이루게 했다. 크로마토그램을 탈이온수 250㎖로 세턱하여 전개시켰다. 상기 세척 단계 동안, 밝은 노란색의 불순물이 주밴드(암-적색)부터 분리되기 시작했다. 상기 불순물을 10mMNaCl 용액 ∼350㎖로 칼럼을 세척하여 컬럼을 빠져나오게 했다. 후에 용출액을 100mM NaCL 용액으로 대체했다. 이후, 암적색의 주요 밴드가 용출하기 시작했고, 원하는 생성물의 대부분이 500-600㎖의 부피로 용출되었다. 암적색 물질은 영구히 칼럼상에 흡수되어서 매우 높은 이온력의 완충액(2-3M HCl 및 NaCl) 하에서도 칼럼으로부터 용출되지 않았다.
그리고나서 용출된 태그-알콜으 하기 방법에 의해 암모늄 핵사플루오로-포스페이트를 사용하여 침전시켰다. 용출액을 일정하게 교반시키며 끊을 깨까지 가열한 다음 75-80℃로 식힌 후 스파튤라를 사용하여 소량의 암모늄헥사-플루오로포스트페이트를 안정한 침전물이 보일 때까지 첨가했다.(침전물이 나타나고 다시 용액에 용해되지 않았다). 먼저 용액을 실온(20-25℃)으로 만든 다음 밥새 4℃로 냉각시켰다. 결과 얻어진 침전물을 유리원료 디스크(10-15μ)가 장치된 바흐너 깔때기 상에서 수집한 다음 진공하에 건조시켰다. 칼럼 정제 후 상기 착물화 반응의 수율은 80%로 관찰되었다. 상기 단계에서 착물의 분자량은 ∼945.45이다(수하된 물은 배제).
그리고나서 상기 방법에 의해 제조되고 정제된 태그-알콜을 HPLC 및1H-nmr 스펙트로스코피에 의해 분석했다. HPLC 특성 규명은 베크만 C18-역상 칼럼과 함께 퍼어킨-엘머 HPLC 인스트루먼트상에서 실행되었다. 이동상은 하기 완충액으로 구성되었다. A) 50% 0.10M 트리에틸암모늄 아세테이트, pH 7.25 : 50% 아세토니트릴, 및 B) 90%아세토니트릴 : 10% 0.10M 트리에틸암모늄 아세테이트, pH 7.25. 크로마토그래피를 80% 완충액 B와 함께 평균 조건하에 수행했다. 유속은 1.0 ㎖/분에 유지시켰고, 용출액은 280nm에서 흡광에 의해 관찰했다.
태그-알콜, 2.0㎎을 완충액 B 100㎕에 용해시켰다. 그리고나서, 상기 원료 용액 1.0㎕를 완충액 B와 함께 400㎕로 희석했다. 상기 희석 용액 50㎕를 HPLC 장치에 주입했다. 태그-알콜이 22-23분간에 단일 주요 피크로 용출되었다. 태크-알콜의 순도는 용출액 피크를 적분하여 결정된 95±3%였다.
1H-NMR 스펙트럼을 GE-300 MHz FT-nmr 장치상에서 기록했다. 일반적으로 분석에서, 태그-알콜 30㎎을 CD3CN 500㎕에 용해시켰다.1H-NMR 또한 물질의 순도가 만족스러운 것으로 나타났다.
태그-알콜의1H-NMR 스펙트럼 데이타:(CD3CN) δ1,52-1.65(m, 2); 1.72-1.85(m, 2); 2.20(s, 3 Ar-CH3); 2,82-2.90(m, 2); 3.50-3.60(m, 2); 7,23-7,32(m, 2, 5' Ar-H); 7.38-7.48(m, 4, 4 Ar-H); 7.42-7.52(M, 2 3' Ar-H); 7,52-760(m, 4 , 3 Ar-H); 8.02-8.14(m, 4, 5 Ar-H); 8.38-8.44(d, 2, 6' Ar-H) 및 8.50-8.56(d, 4, 6 Ar-H)).
3. 아인산염화 반응
본 계획은 하기 도해 3)을 참고하여 보다 잘 이해할 수 있다.
테그-알콜 945 mg(∼1밀리몰) 및 1H-테느라졸 35.0㎎(∼0.5 밀리몰)을 50㎖ 둥근 바닥 플라스크에 넣었다. 최근에 증류시킨 건조한 아세토니트릴(CaH2) 상에서 증류함) 10㎖를 첨가하고 회전 증발시켰다. 건조함 아세토니트릴의 첨가 및 증류를 3회 수행하여 물질의 수분 제거를 확실히했다. 최종적으로, 태크-알콜 및 테트라졸 혼합물을 건조한 아세토니트릴 3.0 ㎖에 재용해 시켰다. 모든 일련의 조작 과정 중에 반응 플라스크를 아르곤 대기하에 방치했다. 2-시아노에틸-N,N,N',N'- 테트라 이소프로필포스포로디아미디트(아인산염화제) 500㎕(∼1.6밀리몰)을 교반중인 반응 혼합물에 첨가했다. 반응을 1 시간 동안 진행시켰고, 알루미늄 호일로 봉했다. 염화나트륨 포화수용액 10.0㎖를 첨가하여 반응을 정지시키고 수성층을 디클로로메탄 25㎖로 2회 추출했다. 합한 유기층을 무수 황산 나트륨 상에서 건조시키고 용매를 회전 증발에 의해 제거했다. 거품 잔류물을 진공하에 세심하게 건조시켰다. 물질을 건조한 디클로로메탄 15-20㎖ 에 용해시키고 용액을 교반중인 건조한 펜탄용액에 서서히 첨가했다. 상기 침전 단계를 아르곤 대기하 글로브 상자내에서 수행하는 것이 바람직하다. 태그-포스포라미디트 용액 약 10㎖의 첨가후에, 침전물을 가라앉혔다. 펜탄(상등액)을 주의하여 가만히 따라내고 신선한 펜탄으로 보충하고 나서 잔류 태그-포스포라미디트 용액을 첨가했다. 태그-포스포라이디트 용액의 첨가를 완결한 후, 침전물을 30분 이상 동안 펜탄 용액내에서 교반시켰다. 상등액을 주의하여 가만히 따라 내고, 미량의 용매는 진공하에 제거했다. 최종 생성물은 비결정 분말이었고, 이를 진공하에 세심하게 건조시켰다. 생서물은31P-nmr 분광학에 의해 특성이 규명되었다. 침전 단계 후 아인산 염화 반응의 수율은 75%으로 밝혀졌다.
태그-포스포라미디트를31p-nmr에 의해 규명하였다. 샘플은 CD3CN 500㎕ 내 태그-포스포라미디트 45.0㎎을 용해시켜 제조 되었다. 스펙트럼을 외부 기준으로서 85% 인산과 함께 JEOL 270 MHz Ft-nmr 장치상에서 기록했다.
태그-포스포라미디트의 1H-NMR 스펙트럼 테이타:1H-NMR (CD3CN),δ 1.10-1.12(m, 12); 1,61-1.72(m, 2); 1,76-1,85(m, 2): 2.1(s, 3 Ar-CH3); 2.62-2.68(t, 2); 2.82-2.88(t, 2); E,52-3.83(m, 6); 7.25-7.30(m, 2, 5' Ar-H); 7,39-7.46(m, 4, 4 Ar-H),7,55-7.61(m, 2, 3' Ar-H); 7,75-7.80(m, 4, 3 Ar-H); 8.03-8.12(m, 4, 5 Ar-H); 8.39-8.45(d, 2, 6' Ar-H) 및 8.51-8.56(d, 4, 6 Ar-H).
[실시예 2]
올리고뉴클레오티드 합성
올리고뉴클레오티드를 응용 바이오시스템(캘리포니아주 산호세) 자동화 올리고뉴클레오티드 합성기 상에서 β-시아노에틸 포스포라미디트 화학약품(1)을 사용하여 만들었다. 5'말단에 대한 올리고뉴클레오티드 아미노 변형은 최종 커플링 단계에서 일어났다. 클론테크(Clonech)(캘리포니아주, 샌디에고)가 아미노 변형제를 공급했다. 결과 얻어진 5'변형 올리고뉴클레오티드 모두는 6개 탄소 스페이서 아암을 아미노기에 대해 함유하고(C6,NH2)로 명시되었다. 몇몇 서열은 합성중에 태그-포스포라미디트를 사용하여 직접 라벨링시켰다. 5'-말단에 대한 올리고뉴클레오티드 Ru(Ⅱ)변형은 응용 바이오시스템 자동화 올리고뉴클레오티드 합성기 상에 태그-포스포라미디트를 사용하여 최종단계에서 일어나고 하기 올리고뉴클레오티드에서Ru(Ⅱ)로 명시하였다. 제조된 올리고뉴클레오티드 그들의 변형 및 사용이 하기에 서술된다.
A. 인간 인터페론 감마 유전자의 증폭을 취한 올리고뉴클레오티드
INFG2 (SEQ ID NO:1) 및 INFG 3(SEQ ID NO:2) (2)
INFG2 (C6, NH2) CTCCACACTCTTTTGGATGCTCTGGTCATC;
INFG3 (C6, NH2) CACATCATCCTCTGTTTGTGCTCTTTCCT.
B. E6 구역에 대한 인간 파필로마 바이러스(HPV)를 위한 올리고뉴클레오티드, 올리고튜클레오티드 서열 2PV16(SEQ ID NO:3),3PV16(SEQ ID NO:4), 3PV16(SEQ ID NO:4), 2PV18(SEQ ID NO:5), 3PV18(SEQ ID NO:6) (3)
HPV16의 경우 :
2PV16 5' (C6,NH2) CAGTTAATACACCTAATTAACAAATCACAC;
3PV16 5' (C6,NH2) ACAACATTAGAACAGCAATACAACAAACCG; 및
3PV16p 5' RU(Ⅱ): ACAACATTAGAACAGCAATACAACAAACCG.
HPV18의 경우 :
2PV18 5' (C6, NH2) CACCGCAGGCACCTTATTAATAAATTGTAT;
3P V18 5' (C6, NH2) GACACATTGGAAAAACTAACTAACACTGGG.
상기 올리고뉴클레오티드는 각각 증폭된 생성물의 포획을 위해 비오틴화된 2PV16 또는 2PV18과 함께 HPV16 및 18 DNA 각각에 대해 단편 3PV16 또는 3PV18 C의 증폭을 가능하게 한다.
C. 람다 서열에 대한 올리고뉴클레오티드, 람다 1(SEQ ID NO:7), 람다(SEQ ID NO:7), 람다 C(SEQ ID NO:8), 람다 IC(SEQ ID NO. 8)
람다 1 5' Ru(Ⅱ):GAAAATGTGCTGACCGGACATGAAAATGAG
람다 5' GAAAATGTGCTGACCGGACATGAAAATGAG
람다 C 5' CTCATTTTCATGTCCGGTCAGCACATTTTC
람다 1C 5' (C6,NH2)CTCATTTTCATGTCCGGTCAGCACATTTTC
D. 비특이적 올리고뉴클레오티드 서열, 2PV6(SEQ ID NO:9) 2PV6 (C6, NH2) TTTGTGACACAGGTAGCACCGAATTAGCAC
E. HIV 서열에 대한 올리고뉴클레오티드 SK38(SEQ ID NO:10), SK39(SEQ IO NO:11), 및 SK19(SEQ ID NO:12)
HIVI의 경우:
SK38 5' ATAATCCACCTATCCCAGTGGAGAAAT
SK39 5' (C6,NH2) TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC
SK19 5'
Ru(Ⅱ): ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTAC
[실시예 3]
라벨링 올리고 뉴클레오티드
모든 합성 올리고뉴클레오티드를 정제하여 BIOGELTMP6(바이오-라드랩, 켈리포니아주 리치몬드시) 칼럼 상의 겔 여과에 의해 임의의 오염된 아미노기를 제거했다. NHS-비오틴(클로테크, 캘리포니아주 센디에고시)를 사용하여 올리고뉴클레오티드의 5'-아미노기에 의해 비오틴을 도입한다. 태그-NHS 에스테르 라벨(Ru 트리스 비피리딜 착물의 NHS 에스테르)을 하기와 같이 변형 올리고뉴클레오티드의 아미노기에 의해 도입시켰다. PVS(pH 7.4) 100㎕내 올리고뉴클레오티드(0.1μmole)을 어두운 곳에서 실온으로 밤새도록 DMSO에 용해된 태그-NHS 에스테르 라벨 0.5 μmole과 반응시켰다. 에탄올 침전에 의해 이들 라벨링 반응으로부터 올리고뉴크레오티드를 회수했다.
[실시예 4]
태그-포스포라미디트 라벨링된 올리고뉴클레오티드의 규명
포스포라미디트 라벨링된 올리고뉴클레오티드를 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 특성화했다. 크로마토그래피에 사용된 완충 시스템은 하기 용액:A) 100 mM 트리에틸암모늄 아세테이트(TEAA) 완충액,pH 7.25-7.50, 및 B) 동일 부의 100 mM TEAA, pH 7,25-7.50 및 HPLC 구배 아세토니트릴로 구성된다.
LKB 2140 고속 분광 감지기, LKB 2150 HPLC 펌프, LKB 2152 LC 제어기, 및 LKB 2211 수퍼라크 분획 제어기가 장치된 LKB HPLC 시스템(파마시아 LKB 바이오테므놀로지사, 뉴저지주 피츠케터웨이시)에 의해 분석을 수행했고 길슨 모델 231(길슨 메디칼 일렉트사, 위스콘신주 미들톤시) 샘플 주입기, 및 401 길슨 희석기를 베크맨 C18 역상 칼럼과 함께 사용했다. 분석중에 하기 구배 프로그램을 사용했다:
상기 서술된 크로마토그래피 조건하에서, 라벨링안된 올리고뉴클레오티드는 16-20 분간 용출시키고 라벨링된 올리고뉴클레오티드는 29-33분간 용출시킨다. 피크들의 적분(integration) 은 라벨링된 올리고뉴클레오티드 %가 라벨링안된 올리고뉴클레오티드에 비해 용출된 피이크의 260nm 흡광도에 근거하여 80% 이상 큼을 보여준다.
[실시예 5]
올리고뉴클레오티드의 겔 전기 영동
포스포라미디트 라벨링된 올리고뉴클레오티드의 샘플을 겔상에 적재하기 전에 탈이온화 포름아미드(3-5 ㎕)와 샘플(2-3 ㎕)을 혼합함으로써 제조했다. 올리고뉴클레오티드 4㎕을 올리고뉴클레오티드 부피당 포름아미드 적어도 1 1/2 부피를 사용하여 샘플마다 실행시킨다. 올리고뉴클레오티드의 이들 샘플은 표준 방법에 의해 제조된 우레아와 함께 12% 폴리아크릴 아미드 겔상에서 분석했다(만니아티스 일동, 분자 클로닝, 실험실 매뉴얼 콜드 스프링 하버 레버레이토리, 1982, 뉴욕주 콜드스프링 하버시), 겔의 바닥에까지 브러모페놀 블루 마커 염료가 진행할 때까지 겔을 주행시킨다. 형광 얇은-막 크로마토그래피 시트(Kodak, Cat,번호, 13181번)의 상부 상에 겔을 놓음으로써(전기영동이 완료된 후에)올리고뉴클레오티드를 분석했다.(이는 형광표시물 또는 동등물을 갖는 실리카 겔이다. 코다, 뉴욕주 로체스터시). 그다음 형광 얇은-막 크로마토그래피 시이트 상의 겔을 자외선(UV) (대략 300 nm)으로 비추었다. 올리고뉴클레오티드의 존재를 형광 얇은-막 크로마토그래피 시이트로부터의 형광을 감소시키는 UV 광의 흡수로 인해 나타나는 검은 뿐로 확인했다. 자동 DNA 합성중에 생산된 분자종은 결과 생성된 결합의 위치 및 밀도를 기록한 사진을 분석함으로써 측정된다. 또한 겔을 Ru(Ⅱ) 착물 라벨링된 띠를 확인하기 위한 UV 트랜스 일룸;네이트(포토다인, 위스콘신주 뉴 베를린시, 모델 번호 3-3000) 상의 조명에 의해 분석했다. Ru(Ⅱ) 착물 형광으로 라벨링된 올리고뉴클레오티드는 사진찍기 편한 특징적 오렌지 색으로 형광을 발한다. Ru(Ⅱ) 라벨링된 띠의 분리 및 분석은 라벨링 안된 올리고뉴클레오티드의 것과 비교되는, Ru(Ⅱ) 착물 라벨링된 올리고뉴클레오티드의 더느린 이동성을 이용했다. Ru(Ⅱ) 착물 라벨링된 올리고뉴클레오티드의 더느린 이동성은 라벨링안된 올리고뉴클레오티드에 비하여(2+전하를 특징으로하는) Ru(Ⅱ) 부분의 존재로 인한 분자량 증가 및 질량비에 대한 전하 변화의 조합으로부터 야기된다.
[실시예 6]
라벨링된 올리고뉴클레오티드의 규명
겔 전기영동(실시예 5)에 의한 라벨링된 올리고뉴클레오티드의 분석은 (각각 7 탄소 및 4 탄소 스페이서를 갖는) 발생된 두 개의 포스포라미디트(실시예 1)가 자동 DNA 합성 중에 효율적으로 결합할 수 있음을 입증했다. 이는 이들 겔상에 감지할 수 있는 라벨링안된 물질이 소량(5% 미만)이므로 입증되었다. 이 화학약품을 사용하여 라벨링된 올리고뉴클레오티드의 전기화학적 활성을 두 개의 포스포라미디트(실시예 1)로 라벨링된 올리고뉴클레오티드에 대해 연구했다. 이 연구의 결과는 4 탄소 스페이스 포스포라미디트(실시예 1)으로부터 15% 더 우수한 신호가 있음을 나타내는데, 이는 두 라벨사이에 유의한 차이가 거의 없음을 나타낸다.
실시예 1의 4탄소 스페이서 포스포라미디트 유도체를 합성의 상대적 용이함에 근거하여 부가적 특성화를 위해 선택했다. 실시예 1의 4C 포스포라미디트는 4일 동안 자동 합성기 상에서 활성이고 기능성인 채로 남았으며 커플링 효율을 거의 손실하지 않았다. 또한 이들 4-C 포스포라미디트는 건조 형태로 9개월에 걸쳐 안정한 채로 있으므로 우수한 저장 수명을 입증했다. 또한, 4C 포스포라미디트 라벨링된 올리고뉴클레오티드(실시예 1)의 다수 배치 분석은 동일하게 라벨링된 서열을 일정하게 생산하는 라벨능력을 입증했다. 전기화학발광(ECL) 성질의 분석은 라벨링된 올리고뉴클레오티드의 5개 뱃치에 대해 신호 변화가 단지 3.5% 계수임을 나타냈다.
장기간 저장 하에 라벨링된 뉴클에오티드의 안정성에 대한 부가적인 연구를 수행했다. 올리고뉴클레오티드의 네 개 뱃치에 대해 전기화학발광을 비교했다. 1주 지난 두 개의 뱃치를 두 개의 뱃치, 즉 합성 후 6개월 지난 것 하나, 및 5개월 지난 것 하나와 비교했다. 비교는 단지 5.11% CVA 를 나타냈으며, 전기화학발광의 감소를 나타내지 않는다.
[실시예 7]
스트렙타비딘 자석 비드의 제조
BSA(PBS 2-3 ㎖ SO) 15 ㎎에, 비오틴-x-NHS(캘리포니아주 산디아고시 클론테크) 50 ㎎/㎖를 함유한 디메틸설폭시드 105 ㎕를 첨가하고 나서 혼합하였고 실온에서 30분 동안 인큐베이션 하였다. 1M 글리산 30 ㎕를 첨가하여 반응을 중지시킨 뒤, 실온에서 10분 동안 인큐베이션 하였다 반응 믹스를 겔 여과 크로마토그래피(캘리포니아주 리치몬드시 바이오-라드 랩스(Bio-rad Labs), Bio-Gel P6)에 의해 정제하였다. 0.2 ㎛ 필터 주사기를 사용하여 상기 비오틴-BAS를 여과하였다. 0.2M 탄산나트륨/중탄산나트륨 완충액 pH 9.6 10 ㎖내 비오틴-BSA 5 ㎎을 탄산염/중탄산염으로 세척된 DYNABEADSTM(DYNAL # 14002) (DYNABEADS는 뉴욕주 그레이트 낵크시 DYNAL의 상표명임) 300㎎에 첨가하였다.
(비드는: (i)뉴욕주 11021 그레이트 넥크시 노오스 스테이션 플라자 45, Dynal M-450 Dynal로 부터 얻어진, Dynal M-450 Dynabeads,4.5 ㎛ 직경 초상자성입자, 30 ㎎/㎖; 또는
(Ⅱ) 뉴욕주 11021 그레이트 넥크시 노오스 스테이션 플라자 45, Dynal로부터 얻어진, Dynal M-280 Dynabeads, 2.8㎛ 직경 초상 자성 입자, 10㎖/㎖로 구성된다.)
상기 혼합물을 와동시키고, 실온에서 밤새 혼합하면서 인큐베이션 하였다. 비드를 자기적으로 분리시키고 나서 ECL 희석액 (H2O 내 37.5 mM KH2PO4,109.2mM K2HPO43H2O, 151.7Mm NaC1, 0.65 mM NaN3, 0.43mM 소 혈청알부민) 10㎖ 및 tRNA(10㎎/㎖) 100㎕를 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 3-4시간 동안 혼합하면서 인큐베이션 하였다. 비드를 ECL희석액 10㎖로 1회 세척하고 ECL희석액 10㎖ 및 tRNA(10㎎/㎖)10㎕내에 재현탁시켰다. 상기 혼합물을 혼합하고 2-6℃에서 밤새 인큐베이션하여 단백질을 비드 위에 안정화시켰다. 비드를 자기적으로 분리시키고 스트렙타비딘(캘리포니아주 산디에고시Scripps Laboratories, 카탈로그 번호 S1214) 15㎎를 함유한 인산염 완충 염수(PBS)10㎖ 내에 현탁시키고나서 1 시간 동안 혼합하였다. 비드를 ECL희석액 10㎖내에 4회 세척하면서, 각 세척동안 5분 혼합하였다. 비드를 ECL 희석액 29.7㎖ 및 tRNA(10㎎/㎖) 300㎕ 내에 최종적으로 재현탁시켜 입자 10㎎/㎖ +tRNA 100㎕/㎖의 최종 농도가 되게 하였다.
[실시예 8]
사람 인터페론 감마 유전자의 증폭
A. 증폭 절차
증폭 반응을 하기와 같이 일으키게 하였다. dATP 200 ㎛, dCTP 200 ㎛, dGTP 200 ㎛, dTTP 200 ㎛, MgCl2wmM, Tris-HCL 10mM, pH 8.3, 50mM KCl, 프라이며(Primer) 0.5㎛, AmpliTaq(코네티커트주 노르워크시, PerkinElmer-Cetus) 40 Units/㎖ 및 샘플 DNA 1 ㎍ 을 함유하는 반응 혼합물을 제조하였다. 사용된 프라이머는 태그-NHS 에스테르로 라벨링된 INFG3 프라이머(Ex. ⅡA)였다. DNA 샘플은 사람의 태반 DNA(미주리주 세인트 루이스시, Sigma) 및 대조군으로서 연어정자(SS) DNA(Sigma)였다. 상기 반응 믹스를 Perkin Elmer-Cetus DNA 열 사이클러내 1-초동안 97℃ 및 1초 동안 50℃의 80 주기에 적용시켰다. 55℃에서 30분 동안 샘플 90 ㎕에 비오틴으로 라벨링된 INFG2(SEQ ID NO:1)2ng과의 혼성체화에 의한 증폭에 관해 샘플을 분석하였다. 그다음 상기 혼성체화된 샘플을 실온에서 30분 동안 진탕하면서 스트렙타비딘 비드 20 ㎍과 함께 인큐베이션하여 비오틴화된 프로브를 포획하였다. 그다음 상기 비드를 ECL 검정 완충액(112mM KH2PO4, 88 mM K2HPO4· 3H2O, 50㎛ NaCL. 6.5 Mm NaN3, 0.8 ㎛ Triton X-100, 0.4mM Tween 20, 10 MM 트리프로필아민)으로 3회 세척하였고 비드 샘플을 ECL 검정 완충액내에 재현탁 시키고 ECL 분석기 상에서 읽어 ECL 카운트의 수로서 표현된 전기화학발광(ECL)의 수준을 측정하였다. 결과는 하기와 같았다: 연어정자 DNA의 경우, 62 카운트; 및 사람 태반 DNA의 경우, 22961 카운트, 이 결과는 관심있는 인터페론 유전자 분절이 특이적으로 증폭했음을 나타낸다.
B. 서던 블롯에 의한 증폭 평가
상기 증폭의 특성을 평가하기 위해, 증폭 생성물에 대한 서어던 블롯 분석을 실행하였다. INFG3 증폭 사람 DNA 샘플 10 ㎕ (출발 DNA의 100ng에 해당함), INFG3 증폭 연어 정자 DNA 10㎕, 사람 태반 DNA 1㎍ 및 DNA 사이즈 마커를 겔 전기영동에 적용시키고 나서, 니트로셀로셀룰로스 막(22)으로 이동시켰다. 그 다음 상기 블롯팅된 DNA를 TNFG2 (SEQ ID NO:1) 비오틴화된 프로브와의 혼성체와에 적용시키고 나서 추천된 절차를 따르는 스트렙타비딘 알칼리서 포스파타아제(메릴랜드주 게이더어스버그시, Life Technologies)를 사용하여 검출하였다. 상기 테스트의 결과는 증폭된 샘플내 2가지 강하게 혼성체화하는 종의 증명이었다. 상기 종은 DNA 사이즈마커를 가준으로 620 및 590 염기 쌍인 것으로 추정되었다. 에상된 바와 같이 증폭되지 않은 사람의 DNA는 어떠한 신호도 보이지 않았으며 연어 정자 증폭 대조군도 마찬가지였다. 서어던 블롯으로부터의 상기 데이터는 단일 프라이머증폭이 관찰되었다는 ECL 검정으로 부터의 결론을 지지한다.
[실시예 9]
사람 파필로마 바이러스 16 (HPV 16) DNA의 증폭
A. 증폭 절차
증폭반응을 하기와같이 일으키게 하였다. dATP 200 μM, dCTP 200 μM, dGTP 200 μM, dTTP 200 μM, MgCl22EmM, Tris-HCL 10mM, pH 8.3, 50mM KCl, 프라이머 0.5 μM, AmpliTaq(Perkin Elmer-Cetus) 40 Units/ml 및 샘플 DNA 1㎍을 함유하는 반응 혼합물을 제조하였다. 사용된 프라이머는 태그-NHS 에스테르로 라벨링된 3PV16 (SEQ ID NO:4)프라이머였다. 상기 반응 혼합물을 Perkin Elmer-Cetus DNA 열 사이클러내 10 초 동안97℃ 및 1초 동안 50℃의 80 주기에 적용시켰다.
55℃에서 30분 동안 샘플 90㎕에 비오틴으로 라벨링된 2PV16 2ng 과의 혼성체화에 의한 증폭에 관해 샘플을 분석하였다. 그다음 상기 혼성체화 된 샘플을 실온에서 30분 동안 진탕하면서 스트렙타비딘 비드 20㎍과 함께 인큐베이션하여 비오틸화된 프로브를 포획하였다. 그다음 상기 비드를 ECL 검정 완충액으로 3회 세척하였고 비드 샘플을 ECL 검정 완충액내에 현탁시키고 ECL 분석기 상에서 읽어 ECL의 수준을 결정하였다. 결과는 ECL 카운트 를 단위로 하는 하기와 같았다. 연어 정자 DNA의 경우,67 카운트, 및 HPV16 DNA의 경우, 32444 카운트, 상기 결과는 관심있는 HPV16DNA의 특이적 증폭을 증명하였다.
B. 서어던 블롯에 의한 증폭의 평가
상기 증폭의 특성을 평가하기 위해, 서어던 블롯 분석을 실행하였다. 3PV16 증폭 HPV16 DNA 샘플 10㎕ (출발 DNA의 100ng에 해당함), 3PV16 증폭-연어 정자 DNA 10㎕, HPV16 DNA 1㎕ 및 DNA 사이즈 머커를 겔 전기영동에 적용시키고 나서 니트로셀룰로스 막(24)으로 이동시켰다. 그다음 상기 블롯팅된 DNA를 2PV16 비오틴화된 프로브와의 혼성체화에 적용시키고 나서 추천된 절차를 따르는 스트랩타비딘 알칼리성 포르파타아제 (메틸랜드주 베이더버그시, Life Technologies)를 사용하여 검출하였다. 상기 테스트의 결과는 증폭 HPV16 DNA 샘플내 강하게 혼성체화하는 종의 증명이였다. 상기 종은 DNA 사이즈 마커를 기준으로, 870 염기 쌍이라고 추정되엇다. 증폭되지않은 HPV16 DNA는 어떠한 신호도 보이지 않았으며 연어 정자 증폭 대조군도 마찬가지 였다. 서어던 블롯으로부터의 상기 데이타는 단일 프라이머 증폭이 성취되었다는, ECL 검증증거를 근거로한 결론을 지지한다.
[실시예 10]
증폭의 시간 경과
사람 태반 HPV16 (CaSki) 및 HPV18 (HeLa) DNA의 샘플을 각각,INFG3 (SEQ ID NO:2), 3PV16p (SEQ ID NO:4)(태그-포스포아미디트를 사용하여 라벨링된 ECL) 및 3PV18 (SEQ ID NO:6)을 사용하여 상기 서술된 바와 같이 증폭에 적용시켰지만, 샘플을 주기수 20, 30, 40, 50, 60 및 80에서 꺼내었다. 그다음 상기 샘플을 ECL 카운트에 의해 지시되는 바와 같이 증폭 생성물의 수준을 측정하기 위해 분석하였다.
상기 결과들은, 생성된 신호의 수준이 지수적 증폭을 증명하는, 주기 30후 급속한 증폭을 보임에 따라 예상치 않은 방법에 의해 증폭이 일어났다는 것을 증명하였다. 3PV16p (SEQ ID NO:4)를 사용한 상기 증폭은 단일 프라이머 증폭시에 태그-NHS 에스테르 라벨링된 올리고뉴클레오티드의 능력을 입증했다.
[실시예 11]
증폭을 위한 최적 온도
상이한 온도 주기가 증폭에 미치는 영향을 연구하기 위해, 상이한 온도주기를 평가하였다. 2단계 주기의 보다 낮은 온도를 변화시켰다. 주기 온도는 97℃ 대 30℃, 97℃ 대 60℃, 및 97℃ 대 30℃, 97℃ 대 40℃, 97℃ 대 50℃, 97℃ 대 60℃, 및 97℃ 대 70℃였다. 이러한 주기들은 명확성을 위해 보다 저온으로 언급한다. 또한 Ericomp(캘리포니아주 산디에고시 Ericomp Inc, Twin Block)서어모사이클러를 사용하였다. 증폭을 위한 그밖의 조건은 사람 인터페론 및 사람 파필로마 바이러스 DNA의 경우 상기에 시간 경과에 대해 서술된 바와 같았다.
A. Perkin Elmer DNA 열 사이클러를 사용한 결과들
B. Ericomp 열 사이클러에 의한 결과
상기 결과들은 상기 증폭 반응의 온도 의존 특성을 증명하고, 각 특성주형-프라이머 조합이 상이한 온도 최적을 가짐에 따라 임의 주형과의 증폭을 허용하는 온도의 최적화에 대한 필요를 지적한다. 당업자는 온도 최적화가 증폭 절차 개발에 종종 필요하다는 것을 이해할 것이다. 상기 단일 프라이머 증폭 온도 연구는 이 단일 프라이머 증폭시에 고온 및 긴 인큐베이션을 견디는 포스포라미디트 라벨링된 올리고뉴클레오티드의 능력을 입증한다.
[실시예 12]
다른 DNA 중합효소를 사용하는 증폭
단일 프라이머 증폭이 효소 특이성이 아니라는 것을 확증하기 위해 다른 원으로부터의 DNA 중합효소를 테스트했다.
하기 조성물을 구성되는 반응 혼합물을 제조했다.
상기 서술한 조건하에 REPLINASE (DuPont, Boston MA) ; 50mM Tris-HCL, pH 9.0, 20mM 황산암모늄, 1,5mM MgCl, dATP 200μM, dCTP 200 μM, dGTP 200 μM, dTTP 200 μM, 프라이머 0.5μM, 10 ㎍/㎖ 샘플 DNA. 40Units/㎖ REPLINASE
HOT TUB DAN 중합효소 (Amersham, Arlington Heights, Illinois); 25mM Tris-HCl, pH 9.5(25℃), 50mM KCl, 10mM MgCl, 1㎎/ml 소의 혈청 알부민(BSA), dATP 20μM, dCTP 200μM, dFTP 200μM, dTTP 200μM, 0.5μM 프라이머, 10μg/ml 샘플 DNA, 40Units/ml HOT TUBTMDNA 중합효소:PYROSTASE (Molecular Genetic Resources, Tampa, Florida); dATP 200μM, dCTP 200μM, dGTP 200μM, dTTP 200μM, 50mM Tris-HCl, pH 9.0(25℃), 1.5mM MgCl, 20mM 황산암모늄, 0.01% 젤라틴, 프라이머 0.5μM, 10μg/ml 샘플 DNA, 40Units/ml PYROSTASE :VENT DNA 중합효소(New England Biolabs, Beverly, Massachusetts); dATP 200μM, dCTP 200μM, dGTP 200μM, dTTP 200μM, 20mM Tris-HCl, pH 8.8, 2mM MgSO, 10mM 황산 암모늄, 10mM KCl, 0.1% Triton X-100 0.1㎎/mL BSA, 0.5μM 프라이머, 10μg/ml 샘플 DNA, 40Units/ml VENT DNA 중합효소:AMPLITAQ (Perkin Elmer-Cetus).
이들 중합효소를 프라이머 3PV16(SEQ ID NO:4)을 사용한 HPV16(CaSki) DNA 및 프라이머 INFG3(SEQ ID NO:2)를 사용한 인간 태반의 DNA의 샘플을 증폭시키는데 사용했다. 100μℓ의 샘플을 80주기에 대해 97℃ 10초 및 50℃ 1초의 주기를 사용하여 Perkin Elmer-Cetus Thermal 사이클러에서 사이클링시켰다. HPV 및 인간 인터페론 감마 증폭된 생성물을 상기와 같이 분석했다.
증폭 생성물의 ECL 검정을 ECL 카운트로서 표현했다.
이들 결과로 대부분의 DNA 중합효소가 Mg++ 또는 온도 조건이 그다지 최적화되지 않은 이 증폭 시스템으로 작업할 것이라는 것을 증명한다.
Vent DNA 중합효소로부터의 불량한 활성은 비-광학적 Mg++ 조건에 기인할 수 있다. 포스포라미디트 라벨링된 올리고뉴클레오티드가 넓은 범위의 DNA 중합효소에 의한 단일 프라이머 증폭을 지시할 수 있다는 상기 증명은 그것이 상기 반응을 억제하지 않음을 의미한다.
[실시예 13]
증폭의 민감성
DNA의 샘플을 희석하고, Taq 중합효소를 사용하여 상기 서술한 바와 같이 단일 증폭시켰다. 샘플을 비오틴화된 프라이머 INFG2( SEQ ID NO:1), 2PV18(SEQ ID NO:5) 및 2PV16(SEQ ID NO:3)를 사용하여 상기 서술한 바와 같이 분석했다. 결과를 ECL 카운트로써 표현했다.
이들 결과로 이 방법의 민감성을 증명한다. 인간 인터페론 유전자를 단지 1ng의 DNA 샘플에서도 검출했다. 이들 결과는 HPV DNA 샘플(실시예 13의 Hela 및 CaSki)에 대한 자료와 일치한다. 연어 정자 DNA lμg 대조 샘플로부터의 결과로, 이 검정 시스템의 특이성을 증명한다. 이는, 작은 샘플 크기로부터 특이 유전자의 진단 및 검출 방법의 유용성을 증명한다. 단일 프라이머 증폭을 효과적으로 진행시키기 위한 포스포라미디트 라벨링된 프라이머의 능력을 DNA 1ng 내에서 HPV16의 검출을 가능하게 한다.
[실시예 14]
최적 프라이머 농도
최적 프라이머 농도를 결정하기 위해, 앞서 실시예의 가장 우수한 결과를 제공한 HOT TUB , PYROSTASE 및 REPLINASE (Thermus flavis로부터 단리된)를 이용하여 예비 연구를 수행했다. 100μℓ 반응 당 200ng 농도(0.2μM) 또는 그 이하는 비효과적이다. 최적 농도는 100μℓ 반응당 약 500ng(0.5μM)이었다. 0.5μM 이상에서는 개선이 거의 없음이 명백하다. 특히, PYROSTASE 및 REPLINASE 은 초기 프라이머 연구 중에 테스트한 다른 중합효소와 비교하여 보다 우수하게 반응을 나타내었으므로 한층 더 특징화되었다. 태그-라벨링된 INFG3(SEQ ID NO:2) 프라이머 미 INFG2(SEQ ID NO:1) 비오틴화된 프로브로의 이들 연구로부터 결과를 하기 표 6에서 설명했다. 결과를 ECL 카운트로써 표현했다.
이들 결과는 프라이머에 대한 넓은 최적 농도 범위를 나타낸다. 500ng/100μℓ의 보다 낮은 농도는 배경 수준이 보다 낮으려는 경향이 있을 때 ORIGEN 검정 시스템에 가장 잘 적합한 것으로 보이며, 이러한 올리고뉴클레오티드의 사용은 보다 경제적이다. 다른 검정 시스템 및 클로닝 방법은 다른 최적 농도를 가지는 것으로 예상되나, 일반적으로 여기서 지시되 이들 값에 따를 것으로 예상된다. 이 실시예 검정의 결과는 PYROSTASE 가 낮은 및 높은 프라이머 농도에서도 잘 기능하는 그의 능력 때문에 가장 우수한 결과를 제공하였음을 가리킨다.
[실시예 15]
인간 파필로마 바이러스(HPV18) DNA의 증폭
올리고뉴클레이티드 3PV18(SEQ ID NO:6)을 사용하여, Taq로 앞서 서술한 프로토콜을 사용하고 Ericomp 열사이클러에서 97℃로부터 60℃까지 사이클링하면서 1μg의 HPV18-함유 DNA(Hela) 및 연어 정자 DNA를 함유하는 대조군을 증폭시켰다. 이들 증폭된 샘플(10μℓ, 즉 10%의 증폭된 샘플)을 1μg의 증폭되지 않은 물질 및 분자량 마커와 함께 1% 아가로스 겔 상에서 실행시켰다. 그리고 나서, 이 물질의 공지된 방법을 사용하여 서어던 블롯팅시키고, S 라벨링된 2PV18 프로브와 혼성체화했다. 이 프로브(실시예 ILB에서 서술한 바와 같다)는 아미노기를 가지고, Amersham의 S 라벨링 약제(Amersham, Arlington Heigwts, Illinois)를 사용하여 라벨링시켰다. 간단하게, 2.5μg의 올리고뉴클레오티드를 취하고, 밤새 10μℓ의 80% DMSO 내에서 S 라벨링 약제의 50μCi와 반응시켰다. 이 라벨링된 프로브를 70% 에탄올로부터 침전시키고 세척했다. 프로브를 혼성체화 완충액 500μℓ 내에서 재현탁시키고, 혼성체화 용액 5ml당 2.5×10 카운트의 농도에서 사용했다. 여과기를 6XSSC, 0.5% SDS 내에서 55℃에서 혼성시키고나서, 10mM EDTA 를 0.16XSSC, 0.1% SDS에서 세척하고 건조시켰다. 다음에 여과기를 ENHANCE (NEN, Boston, Massachuse tts)로 분무시키고, 필름하에 놓았다. 이 혼성체화 실험의 결과는 HPV18 함유 DNA의 단일 프라이머 증폭으로부터의 특정 생성물의 검출이었다. 주요 생성물의 추정된 크기는 사용된 분자량 표준로 약 2000 염기인 것으로 결정되었다. 다른 샘플은 10배 이상의 물질이 증폭되지 않은 물질에 로딩되더라도, 임의 혼성체화를 나타내지 않았다. 이는 단일 종을 증폭시키기 위한 단일 프라이머의 증폭의 능력을 나타내었다.
[실시예 16]
짝진 프라이머 중합효소 연쇄 반응
짝진 프라이머 연쇄 반응(PCR)을 근본적으로 (6.7)에서 서술된 바대로 수행했다. 달리 언급되지 않은 한 반응물은 전형적으로 100μℓ이다. SK38(SEQ ID NO:10) 올리고뉴클레오티드 5 pmole 및 SK39(SEQ ID NO:11)(비오틴화됨) 올리고뉴클레오티드 50 pmole을 사용하여 비대칭 방식으로 또는 SK38(SEQ ID NO:10) 및 (SEQ ID NO:11) 둘다 50 pmole을 사용하여 표준 방식으로 PCR을 수행했다.
써모사이클러 조건은 다음과 같았다: 95℃ 1분동안 이어서 60℃ 1분 동안 상기 PCR 실행에 대한 주기는 분리 검정의 경우 30번 및 비-분리 검정의 경우 또는 10개 미만의 HIV 복사본 감지의 경우에 40번이었다.
[실시예 17]
혼성체화 연구
260nm에서 차아크롬산 이동을 사용하여 멜팅 연구를 히타찌 US200(히타찌 인스트류먼트사, 코네티캇트주 댄버리시)이중 과정 분광사진계 및 그의 온도 조절된 셀을 사용하여 수행했다. 람다 C(SEQ ID NO:8)(1.64mM)에 혼성체화된 람다의 샘플 및 500mM NaCl, 10mM Tris-HCl pH 7.4 내 람다 C(SEQ ID NO:8)(1.05mM)에 혼성체화된 람다 1(SEQ ID NO:7)(태그라벨링됨)을 매치된 쿠베트 내로 도입시켜서 대조표준 샘플로서 500mM NaCl, 10mM Tris-HCl pH 7.4와 함께 분당 1℃ 가열하였다. 이 검정을 세 번 반복하여 자료를 평균하고, 정규화하고 두 샘플 사이의 태그 라벨 흡광도를 보정하였다.
비이드에 대한 멜팅 연구를 람다 32P 또는 람다 1(SEQ ID NO:7)(태그라벨) 및 람다 1C(SEQ ID NO:8)(비오틴화됨)의 예비형성된 혼성체에 대해 수행했다. 혼성체는 50℃에서 20분간 동안 람다 1C(SEQ ID NO:8) 60pmol과 람다 32P 또는 람다 1C(SEQ ID NO:7) 114pmol의 혼성체화에 의해 수행했다. 이 복합체를 스트렙타비딘 비이드 1.5㎎상에 포획했다(실시예 7). 결합된 혼성체를 가는 비이들 검정마다 50μg(500μℓ)로 분취하고 진탕하면서 5분동안 변하는 온도에서 인큐베이션하고 이어서 자기 선반 상에서 분리시키고 새 ECL 검정 완추액내로 세척했다. 베크만 LS-100C(베크만, 캘리포니아주 92664 일빈) 액체 신틸레이션 계수기 또는 ECL 장치에서의 분석에 의해 각각의 샘플(세개)에 대해 비이드 결합 신호를 측정했다. 결과를 P 결과로부터의 신호에 의해 정규화하여 자료를 비교한다. 정규화를 위한 기준점으로 3시간 전에 대한 자료를 사용했다.
혼성체화의 동력화 연구를 비이드사의 예비-포획된 람다 1C, (SEQ ID NO:8)(비오티화됨)을 사용하여 수행했다(매검정마다 비이드 80μg 상에 0.1pmole). 람다 1(태그 라벨) 또는 람다(32p 라벨링됨)를 ECL 검정 완충액 500μℓ에 첨가했다(매 검정마다 0.3pmole). 샘플을 다양한 시간동안 인큐베이션하고 샘플 신호의 정규화를 위해 100% 혼성체화된 샘플로서 시간 지점을 사용했다. 혼성체화 후에, 자기 선반을 사용하여 혼성체는 혼성체화 안된 프로브와 분리하고 상등액을 제거했다. 이들 샘플을 ECL 검정 완충액 600μℓ에 재현탁시키고 샘플에 따라 ECL 장치 또는 베그맨 LS-100C 액체 신틸레이션 계수기에서 분석했다. 샘플을 3번 실행하고 자료 근거를 요약하고 3시간 동안 혼성체화된 람다( P 라벨링된) 샘플로부터의 신호에 대해 정규화했다.
태그 라벨 및 P 라벨링된 프로브의 비교를 위한 시험 검정 포맷은 비오틴화된 2PV6, (SEQ ID NO:9) 및 비오틴화된 람다 1C 혼합물의 농도비의 범위를 나타내는 기준 곡선으로 이루어지며, 이는 매검정마다 6pmole의 일정한 올리고뉴클레오디트 농도를 산출했다. 기준 곡선은 0.0, 1.25, 1.5 및 3pmole/샘플의 범위인 람다 1C(표적)을 갖는 검정 배지를 제조함으로써 제작했다. 이 기준 곡서은 PCR 반응으로부터의 생성물 농도를 모방하도록 설계했으며, 비오틴화된 PCR 생성물의 함량 차이는 비오틴화된 프라이머의 일정한 배경에 대해 측정해야 한다. 상기 기준 곡선에 대해, 한 세트의 대조 표준 샘플을 6pmole/샘플의 일정양의 비오틴화된 올리고뉴클레오티드와 함께 비오티화된 람다 1C(SEQ ID NO:8) 0.0, 0.333, 0.167, 0.600, 1.67, 0.866, 3.00, 2.17, 1.33 3.50pmole을 함유하도록 동일방식으로 제조했다. 그다음 이들 기준과 대조표준을, 실온에서 15분동안 진탕하면서 인큐베이션에 의해 포획하기 위해 ECL 검정 완충액 내 스트렙타비딘비이드 500μg(50μℓ)를 사용하여 분석했다. 고체 상을 자기 래크를 사용하여 분리한 다음 포획된 올리고뉴크레이도티드를 0.05M NaOH로 세척하여 PCR 샘플에 사용된 세척을 모방한다. 그 다음 비이드를 ECL 검정 완충액으로 세척한 다음 6pmole의 람다 1(태그라벨 함유) 또는 람다 32p 라벨링된(0.2 μCi) 프로브를 첨가했다. 이들을 50℃에서 15분동안 혼성체와 한 후에, 태그 라벨 검정의 경우에 ECL 검정 완충액(500μℓ)에서 두 번 또는 32P 라벨 검정의 경우 4번 세척했다. 이들 샘플을 ECL 장치에서 분석하거나 베크맨 LS-100C 액체 신틸레이션 계수기에서 계수했다. 이들 검정을 실행 각 라벨에 대해 3번 수행했으며, 각 샘플 또는 기준을 3번 실행했다.
[실시예 18]
짝진 프라이머 PCR HIV DNA 검정
HIVI gag 유전자의 짝진 프라이머 PCR 증폭은 올리고뉴클레오티드 SK38 (SEQ ID NO:10) 및 SK39(SEQ ID NO:11)을 사용하여 수행했다.
라벨링 안된 SK38과 함께 비오틴화된 SK39를 사용하여, 결과의 PCR 생성물을 상기 서술된 태그 프로브 SK19에서 혼성체화했다.
비-분리 검정에 있어, 비대칭 PCR 반응을 과량의 비오틴화된 프라이머와 수행했다. 상기 PCR 반응은 태그 라벨링된 프로브에 의한 직접 혼성체화에 유요한 과량의 비오틴화된 단일-가닥 DNA를 생성했다. 혼성체화에 있어서, 증폭될 HIVI gag 유전자에 대해 특이적인 태그-올리고뉴클레오티드 SK19(SEQ ID NO:12)(50μℓ) 1pm ole 증폭후에 상기 PCR 15μℓ에 첨가하고 이어서 60℃에서 15분간 인큐베이션했다. 상기 혼성체화 혼합물에 스트렙타비딘 결합된 비이드 600μg을 함유하는 ECL 검정 완충액 60μℓ를 첨가한 다음 혼합물을 실온에서 15분 동안 진탕하면서 인큐베이션시켰다. ECL 검정 완충액을 첨가하여 샘플 부피를 600μℓ로 증가시킨 후 ECL 장치로 전기화학발광을 감지했다.
하기와 같이 정량 분석 프로토콜을 수해했다: PCR 당 HIVI 0, 50, 100, 400, 2000 복사본의 가닥을(퍼킨 엘머 세튜스, 코네티캇트주 노루웨크시) 세 번 실행했다. PCR로부터, 세 개의 반응 혼합물 15μℓ 분취량을 스트렙티비딘 결합된 비이드 600μg에 첨가한 후 실온에서 15분 동안 인큐베이션했다. 이 샘플내의 고체상을 자석층을 사용하여 분리하고, 50mM NaCH로 세척하고 ECL 검정 완충액으로 세척하고 라벨링된 올리고뉴클로에오티드 SK19(SEQ ID NO:12)의 10pmole을 함유하는 ECL 검정 완충액 100μℓ에 재현탁했다. 이들 샘플을 60℃에서 15분 hd안 혼성체화했다. 자석층을 사용하여 고체상을 분리하고, ECL 검정 완충액으로 세 번 세척하고 600μℓ ECL 검정 완충액에 재현탁하고 ECL 장치로 전기화학발광을 검출했다. 각각의 샘플 및 기준을 3번 실행했다.
[실시예 19]
Ru(Ⅱ)-포스포라미디트 라벨의 장점
태그-포스포라미디트 라벨;
의 효능을 시험 서열 람다 1(SEQ ID NO:8)의 합성의 의해 시험했다. 상기 라벨링된 서열을 겔 전기영동에 의해 그리고 라벨링된 및 라벨링안된 DNA HPLC에 의해 분석했다. 이 분석은 90% 이상의 결합 효율을 상기 포스포라미디트로써 얻어질 수 있음을 입증했다. 라벨링된 라마 1 서열의 5개의 뱃치의 비교는 올리고뉴클레오티드의 몰당 회수된 ECL 계수치에 거의 변화가 없음을 입증했다.
이들 라벨이 혼성체화동력학과 멜팅 곡선에 대해 갖는 효과를 측정하기 위해 하기의 연구를 수행했다:
A. 온도에 의한 DNA 복합체의 변성
온도에 의한 DNA 복합체의 변성을 보이는 차아크롬산 이동에 의해 감시했다(1), 변성 온도 분포에 대한 상기 자료를 확증하기 위해32P 검정에 비교하여 ECL 검정 비이드의 표면으로부터 예비형성된 혼성체의 변성을 분석했다. 데이터는 상기 서열에 대한 변성 온도 분포가 실질적으로 동일함을 입증했다.
B. 혼성체화 동력학에 대한 태그-포스포라미디트 ECL 라벨의 영향
태그-포스포라미디트 ECL 라벨의 존재하에 혼성체화 동력학에 대한 연구는 사용된 검정 포맷과 혼성체화의 신속한 속도(1분 미만)로 초기에 곤란을 겪었다.
측정치의 정확도를 증가시키기 위하여 희석으로 프로브 농도를 감소시켜 결과, 비이드 결합된 표적에로의 저속 혼성체화를 제공하였다.
C. ECL 태그-포스포라미디트 검정과32P 검정의 비교
또한 혼성체화 동력학 연구는 태그-포스라미디트 라벨의 첨가가 프로브 혼성체화 동력학에 거의 영향이 없으며, Ru(Ⅱ) 라벨링된 프로브(태그-포스포라미디트) 및32P 프로브 모두에 대한 속도가 동일함을 입증했다. 변성 결과와 조합하여 상기 정보는 대부분의 경우에 상기 합성 라벨링된 올리고뉴클레오티드의 동력한 성질이 천연 서열의 것과 동일한 것을 의미한다.
검정 환경에서 태그-포스포라미디트 라벨링된 올리고뉴클레오티드(프로브로서)의 행동을32P 라벨링된 올리고튜클레오티드를 구성하는 참고 검정과 비교했다. 태그-포스포라미디트 라벨링된 올리고뉴클레오티드 프로브에 대해 상보적인 합성 비오틴화된 30개 염기 올리고뉴클레오티드의 희석물로부터 한 세트의 샘플 및 한 세트의 가닥을 비교했다. Y=ECL 검정에 의해 측정된 값 및 X=32P 검정에 의해 측정된 값, 자료는 하기 등식 =-3.6×10-2+0.84X, R2=0.996을 산출했다. 공지값에 대한 개별 샘플 결과의 분석은 상기 두 방법의 상대적 오차를 비교하는 ECL(0.59)와32P(3.54) 모두에 대한 평가의 기준으로 오차를 야기했다.
태그-포스포라미디트 라벨링된 올리고뉴클레오티드 및32P 라벨링된 프로브(모델 검정) 사이의 비교 결과는 두 방법들 사이의 우수한 상관관계를 입증했으며 상관계수 (R2)는 0.996이었다. ECL(0.59) 및32P (3.54) 샘프레 대한 평가의 기준 오차 분석으로 이들 두 방법의 상대오차를 비교했다. 이 분석은 상기 검정에서32P 라벨링된 프로브를 능가하는 상기 포스포라미디트 라벨링된 올리고뉴클레오티드를 사용하는 ECL 방법이 더 큰 정확도를 입증했다. 아마도 이런 차이는32P 측정이 결합된 비이드 및 임의 잔여 자유 레벨을 측정할 것이므로 비이드 결합 Ru(Ⅱ) 라벨(태그-포스포라미디트)의 ECL 측정의 더 큰 특이성에 기인한다. 상기 측정 노력 및 방사성 동위원소 취급이 어려움이 태그-포스포라미디트 라벨링된 올리고뉴클레어티드의 ECL 검정에 비해32P 검정의 불량한 성능의 원인이다.
D. Ru(Ⅱ)라벨의 안전성
Ru(Ⅱ) (태그-포스포라미디트) 라벨의 안정성은 포스포라미디트 화학 약품을 사용한 올리고뉴클레오티드의 직접라벨링에 의해 입증했다. 라벨을 I2로 산화시키고 55℃에서 밤새도록 NH3으로 가수분해한 후, 원래의 및 활성 라벨링된 올리고뉴클레오티드를 회수했다. 상기 방식으로 라벨링된 올리고뉴클레오티드를 HPLC, 겔 전기영동 및 ECL 활성에 의해 분석하고 ECL 검정으로 순수 및 활성을 판단했다. 이들 조건하에 올리고뉴클레오티드의 상기 안정성은 본 발명에 따라 라벨링된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 성분으로부터 제조된 검정 키트의 시약이 안정할 것이고 매우 재현가능한 검정을 제공함을 의미한다.
E. DNA-Ru(Ⅱ)(태그-포스포라미디트) 상호반응
Ru(Ⅱ) 착물과 DNA의 상호작용이 서술되어 있다(8, 9). 이들 상호작용은 표적 DNA에 대해 라벨링된 프로브가 결합친화도에 대한 영향을 갖는다고 공지되어 있다. 또한 효소 및 비오틴 라벨은 프로브 결합을 방해한다(PCT US87/00987, WO87/06706, 10). 이들 효과는 혼성체화 온도 및 기타 상기 기동을 낮춤으로써 제어했다. 반면에, 태그-포스포라미디트 라벨은, DNA에 대한 라벨링된 프로브의 결합 친화도에 대한 영향이 있더라도 거의 없음을 입증한다. 이는 검정 파라메타에 대한 조정이 필요없이 태그-포스포라미디트 라벨링된 프로브가 유용성을 가짐을 명확히 입증하는 상기 논의된 혼성체화 연구로써 입증된다.
F. 태그-포스포라미디트 및 태그-NHS의 비교
태그-포스포라미디트 라벨링된 올리고뉴클레오티드와의 비교를 위해 실시예 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 15에서 태그-NHS 에스테를 사용하여 올리고뉴클레오티드를 라벨링했다. 두 개의 라벨링 시약들 사이의 차이는 근본적으로 자동 핵산 합성을 사용되는 태그-포스포라미디트의 능력과 라벨링 절차에 있음을 발견했다.
사용된 용어와 표현은 설명 용어로서 사용된 것으로서 제한이 아니며, 상기 용어 또는 표현의 사용이 서술된 특징을 갖는 임의 등가물을 배제하고자 함이 아니고, 다양한 변형이 본 발명의 영역내에서 가능한 것으로 이해되어야 할 것이다.
[참고문헌]

Claims (14)

  1. 하기식의 전기화학발광가능한 화합물:
    이때 M은 Ru, Os 및 Re로 구성된 군으로부터 선택되고; u·t=v, u는 1 또는 2이고 t는 1 또는 2이고; L1, L2및 L3는 동일하거나 상이하고 각각은
    이때, R1, R2, R3, R4, R5및 R6는 동일하거나 상이하고 각각은 H, 1-5개의 탄소원자의 알킬기,
    R1, R2, R3, R4, R5및 R6중 적어도 하나는
    n은 1-20 범위의 정수이고; X는 O, S, SO2, COO 및 CONH로 구성된 군으로부터 선택되고; a 및 b는 -N(CH-(CH3)2)2, -NH-CH-(CH3)2, O-(CH2)2-CN, O-CH3또는 모르폴리노이고, 단 a 및 b는 동일하지 않고; Z는 M과 관련된 반대이온이다.
  2. 제1항에 있어서, L1, L2및 L3가 모두 치환되거나 비치환된 비피리딜이고 n이 4 내지 7인 화합물.
  3. 하기식의 전기화학발광가능한 화합물:
    이때 M은 Ru, Os al Re로 구성된 군으로부터 선택되고; L1, L2및 L3는 동일하거나 상이하고 각각은
    이때 R1, R2, R3, R4, R5, R6는 동일하거나 상이하고 각각은 H 또는 1-5개의 탄소원자의 알킬기이나, 단 R1-R6중 하나는 하기식의 링커이고;
    이때 n은 1-20 범위의 정수이고 X는 O, S, SO2, COO 및 CONH로 구성된 군으로부터 선택되고; y는 1-20의 정수이고; Z는 0 또는 1이고; B는 생체분자 또는 이의 합성 동족체이고, 포디에스테르기는 상기 생체분자에 결합된다.
  4. 하기식의 전기화학발광가능한 착물.
    이때 M은 루테늄, 오스뮴 또는 레늄이고; R1, R2, R3, R4, 및 R5는 동일하거나 상이하고 각각은 H 또는 1-4 탄소원자의 알킬이고; n은 1 내지 20의 정수이고; X는 O, S, SO2, COO 및 CONH로 구성된 군으로부터 선택되고; y는 1-20의 정수이고, Z는 0 또는 1이고 m은 1-1000의 정수이고; NAB는 변형되거나 변형되지 않은 핵산 염기이다.
  5. 제4항에 있어서, 상기 핵산이 중합효소 증폭반응을 위한 프라이머인 착물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 핵산이 혼성체화 프로브인 착물.
  7. 프로브가 관심있는 핵산 분석물에 선택적으로 결합하여 관심있는 분석물-프로브 복합체를 형성하는 조건하에서, 샘플을 하기식의 프로브와 접촉시키고;
    (이때 M은 루테늄, 오스뮴 또는 레늄이고, R1, R2, R3, R4및 R5는 동일하거나 상이하고 각각은 H 또는 1-4개의 탄소원자의 알키이고; n은 1 내지 20은 정수이고, X는 O, S, SO2, COO 및 CONH로 구성되고 군으로부터 선택되고; y는 1-20의 정수이고, Z는 0 또는 1이고 m은 1-1000의 정수이고; NAB는 변형되거나 변형되지 않은 핵산 염기임); 상기 복합체의 전기화학발광을 측정하는 단계들로 구성되는, 샘플내에 존재하는 관심있는 핵산 분석물을 검출하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 관심있는 분석물이 핵산 서열이고 상기 프로브가 상기 관심있는 분석물에 상보적인 핵산 프로브인 방법.
  9. 하기 (a)-(c)로 구성되는 중합효소 연쇄 반응 또는 기타 프라이머-의존성 반응의 증폭 생성물 내의 관심있는 핵산이 검출되도록 중합효소 연쇄 반응 또는 기타 프라뇨머-의존성 반응을 수행하는 방법. (a) 상기 중합효소 연쇄반응 또는 다른 프라이머-의존성 반응에 하기식의 프라이머를 혼입시키고;
    (이때 M은 루테늄, 오스뮴 또는 레늄이고; R1, R2, R3, R4, 및 R5는 동일하거나 상이하고 각각은 H 또는 1-4 탄소원자의 알킬이고; n은 1 내지 20의 정수이고; X는 O, S, SO2, COO 및 CONH로 구성되고 군으로부터 선택되고; y는 1-20의 정수이고, Z는 0 또는 1이고 m은 1-1000의 정수이고; NAB는 변형되거나 변형되지 않은 핵산 염기임); (b) 중합효소 연쇄 반응 또는 기타 프라이머-의존성 반응을 수행하고; (c) 관심있는 증폭된 핵산의 전기화학발광을 측정한다.
  10. 하기 단계들(a)-(c)로 구성되는, 중합효소 연쇄반응 기타 프라이머-의존성 반응의 생성물 내 관심있는 핵산 검출 방법: (a) 상기 반응에서 적어도 하나의 핵산을 하기식의 화합물로 라벨링하고;
    (이때 M은 루테늄, 오스뮴 또는 레늄이고; R1, R2, R3, R4, 및 R5는 동일하거나 상이하고 각각은 H 또는 1-4 탄소원자의 알킬이고; n은 1 내지 20의 정수이고; X는 O, S, SO2, COO 및 CONH로 구성되고 군으로부터 선택되고; y는 1-20의 정수이고, Z는 0 또는 1이고 m은 1-1000의 정수이고; NAB는 변형되거나 변형되지 않은 핵산 염기임); (b) 상기 핵산을 증폭 생성물내로 혼힙시키는 중합효소 연쇄 반응 또는 기타 프라이머-의존성 반응을 수행하고; (c) 관심있는 상기 핵산의 전기화학발광을 측정한다.
  11. 제1항에 있어서, 화합물의 상대 ECL 용량 대 이의 비피리딜 동족체의 상대 ECL 용량의 비율이 0.10 이상인 화합물.
  12. 제3항에 있어서, 화합물의 상대 ECL 용량 대 이의 비피리딜 동족체의 상대 ECL 용량의 비율이 0.10 이상인 화합물.
  13. 제7항에 있어서, 관심있는 분석물-프로브 착물의 상대 ECL 용량 대 이의 비피리딜 동족체의 상대 ECL 용량의 비율이 0.10 이상인 방법.
  14. 제4항에 있어서, 착물의 상대 ECL 용량 대 이의 비피리딜 동족체의 상대 ECL 용량의 비율이 0.25 이상인 착물.
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