JP2023554517A - 試料中の目的の分析物を検出するための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、少なくとも１つの目的の分析物を判定するための方法に関する。本発明は、さらに、試料中の目的の分析物を検出するためのキット、複合体、複合体を合成する方法およびその使用に関する。

Description

発明の分野
本発明は、少なくとも１つの目的の分析物を判定するための方法に関する。本発明は、さらに、試料中の目的の分析物を検出するためのキット、複合体、複合体を合成する方法およびその使用に関する。

発明の背景
米国特許第９，５１１，１５０号明細書は、糖アルコールおよび架橋試薬、高分子、および治療用バイオコンジュゲートを報告している。米国特許出願公開第２０１６／０２５０８９６号明細書は、ホスホネートおよびスルホネートならびに親水性リンカー、ならびに細胞結合分子への薬物のコンジュゲーションのためのそのようなリンカーの使用を報告している。米国特許出願公開第２０１０／０００９９０２号明細書は、選択された分子量を有するＰＥＧ（ポリエチレングリコール）とのコンジュゲーションを報告している。Ｖｌａｈｏｖ Ｉ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．７５（２０１０）３６８５－３６９１は、葉酸－薬物コンジュゲートの毒性プロファイルを制御するための炭水化物ベースの合成アプローチを報告している。より詳細には、この文献は、１－アミノ－１－デオキシ－ｄ－グルシトール－γ－グルタメートサブユニットのペプチド骨格への組み込みを開示している。Ｆｍｏｃ戦略固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）に適したＦｍｏｃ－３，４；５，６－ジ－Ｏ－イソプロピリデン－１－アミノ－１－デオキシ－ｄ－グリシトール－γ－グルタメートの合成は、δ－グルコノラクトンからの４つのステップにおいて達成された。交互のグルタミン酸および３，４；５，６－ジ－Ｏ－イソプロピリデン－１－アミノ－１－デオキシ－ｄ－グリシトール－γ－グルタメート部分をシステイン担持樹脂上に添加し、続いて葉酸塩を添加し、脱保護し、開裂して、以下の新たな葉酸－スペーサーを単離した：Ｐｔｅ－γＧｌｕ－（Ｇｌｕ（１－アミノ－１－デオキシ－ｄ－グルシトール）－Ｇｌｕ）_２－Ｇｌｕ（１－アミノ－１－デオキシ－ｄ－グルシトール）－Ｃｙｓ－ＯＨ。

ポリマー化学の分野で知られている特定の技術的特徴は、組み込まれたモノマーの量および／またはポリマー鎖長の均一性の欠如を示す多分散性である。特定の技術的課題は、しばしば観察されるリンカーを含む化合物およびコンジュゲートの多分散性によってもたらされる。

具体的には、ＰＥＧ系リンカーは、このような欠点を有し得る。典型的に使用される重合化学の技術的特徴のために、得られる高分子量ＰＥＧ分子は、実質的な多分散性を特徴とする。すなわち、典型的な重合は、異なる分子量を有する分子の混合物を生じる。そのような混合分子量ＰＥＧ分子をリンカーとして使用することは、得られたコンジュゲート間の多分散性の伝播をもたらす。結果として、所望のコンジュゲートが均一な分子量と定義されるため、コンジュゲートのいかなる分析も複雑である。しかしながら、このような均一な分子量は達成されない。さらに、スペーサー中のＰＥＧ部分の親水性にもかかわらず、ＰＥＧとの特定のコンジュゲートは、依然として十分な溶解性を欠いている。

多糖類はまた、糖化学の複雑さおよび困難さのために、多分散性であり、構造が可変である傾向がある。より長くより複雑なアルコールの合成は、精巧で低収率の保護基操作を必要とする。

したがって、上記の課題を克服することが当該技術分野において緊急に必要とされている。

本発明のために、機能性分子を有利に架橋するために使用され得るポリオールを有する特定の実質的に単分散のリンカー分子が考案されている。本発明者らは、ポリオールを有する特定のリンカー分子が、ＰＥＧ含有誘導体よりも優れた親水性を提供するだけではないことを見出した。例示的な状況において、分析物特異的結合剤と標識化合物とを架橋するそのようなリンカーを含む複合体は、分析物検出アッセイにおいて改善された信号対雑音比をもたらす。さらに、リンカーおよび／または複合体は、単分散性を示し、これは好ましくはペプチド合成から生じ、ＨＰＬＣクロマトグラムによって示され得る。

本発明の目的は、試料中の目的の分析物を検出するための方法を提供することである。さらに、本発明は、試料中の目的の分析物を検出するためのキット、複合体、複合体を合成する方法およびその使用を提供することを目的とする。

この目的は、独立請求項の主題によって解決される。さらなる実施形態は、従属請求項にしたがう。

発明の概要
以下では、本発明は以下の態様に関する：

第１の態様では、本発明は、試料中の目的の分析物を検出するための方法であって、
ａ）目的の分析物を含む試料を提供するステップと、
ｂ）リンカーを含む複合体を提供するステップであって、リンカーが、標識化合物および分析物特異的結合剤に共有結合し、標識化合物が、検出可能な信号、好ましくは化学発光ベースの信号を生成することができる、複合体を提供するステップと、
ｃ）ステップａ）の試料をステップｂ）の複合体と結合させるステップと、
ｄ）標識化合物の検出可能な信号を使用することによって目的の分析物を検出するステップと、を含み、
複合体が式Ｉ：

の化合物であり、
式中、Ａは標識化合物を表し、Ｂは分析物特異的結合剤を表し、またはその逆であり、
Ｘは、ＯＨ、またはｔ≧１、好ましくはｔ＝１、３、５もしくは７の（ＣＨＯＨ）_ｔ－ＣＨ_２ＯＨであり、
ｍは、１から８、好ましくは≧２、特に２から８の整数であり、
ｎは、２から２０、好ましくは５から２０の整数であり、
ｒは、整数であり、≧０、好ましくは０であり、ここで、Ｘ＝ＯＨの場合、ｒ≧１であり、
ｓは、整数であり、≧０、好ましくは０であり、
ｚは、整数であり、≧１である、方法に関する。

第２の態様では、本発明は、試料中の目的の分析物を検出するための本発明の第１の態様にかかる方法の使用に関する。

第３の態様では、本発明は、試料中の目的の分析物の検出を実行するためのキットであって、別個の容器に、
ａ）分析物を固定可能な固相と、
ｂ）式Ｉ：

の化合物であって、
式中、Ａは標識化合物を表し、Ｂは分析物特異的結合剤を表し、またはその逆であり、
Ｘは、ＯＨ、またはｔ≧１、好ましくはｔ＝１、３、５もしくは７の（ＣＨＯＨ）_ｔ－ＣＨ_２ＯＨであり、
ｍは、１から８、好ましくは≧２、特に２から８の整数であり、
ｎは、２から２０、好ましくは５から２０の整数であり、
ｒは、整数であり、≧０、好ましくは０であり、ここで、Ｘ＝ＯＨの場合、ｒ≧１であり、
ｓは、整数であり、≧０、好ましくは０であり、
ｚは、整数であり、≧１である、
化合物と、を含む、キットに関する。

第４の態様では、本発明は、試料中の目的の分析物を検出するための本発明の第３の態様にかかるキットの使用に関する。

第５の態様では、本発明は、式Ｉ

の複合体であって、
式中、Ａは標識化合物を表し、Ｂは分析物特異的結合剤を表し、またはその逆であり、
Ｘは、ＯＨ、またはｔ≧１、好ましくはｔ＝１、３、５もしくは７の（ＣＨＯＨ）_ｔ－ＣＨ_２ＯＨであり、
ｍは、１から８、好ましくは≧２、特に２から８の整数であり、
ｎは、２から２０、好ましくは５から２０の整数であり、
ｒは、整数であり、≧０、好ましくは０であり、ここで、Ｘ＝ＯＨの場合、ｒ≧１であり、
ｓは、整数であり、≧０、好ましくは０であり、
ｚは、整数であり、≧１であり、
好ましくは、化合物が、試料中の目的の分析物を検出するのに適している、複合体に関する。

第６の態様では、本発明は、本発明の第５の態様の複合体を合成する方法であって、
ａ）モノマーまたはその誘導体を提供するステップであって、モノマーが、アミノ基、カルボキシ基および少なくとも１つのヒドロキシル基を含むアミノ酸であり、アミノ基またはカルボキシ基が第１の保護基によって保護されており、少なくとも１つのヒドロキシル基または各ヒドロキシル基が第２の保護基によって保護されている、モノマーまたはその誘導体を提供するステップと、
ｂ）固相ペプチド合成のプロセスにおいてモノマーを使用し、第１の保護基および第２の保護基を切断し、式ＩＩＩ

の複合体であって、
式中、Ａは標識化合物を表し、Ｒは第２のスペーサーを表し、またはその逆であり、Ｒは分析物特異的結合剤に共有結合することができるか、または分析物特異的結合剤に共有結合され、
Ｘは、ＯＨ、またはｔ≧１、好ましくはｔ＝１、３、５もしくは７の（ＣＨＯＨ）_ｔ－ＣＨ_２ＯＨであり、
ｍは、１から８、好ましくは≧２、特に２から８の整数であり、
ｎは、２から２０、好ましくは５から２０の整数であり、
ｒは、整数であり、≧０、好ましくは０であり、ここで、Ｘ＝ＯＨの場合、ｒ≧１であり、
ｓは、整数であり、≧０、好ましくは０であり、
ｚは、整数であり、≧１である、
複合体を形成するステップと、
を含む、方法に関する。

Ｅｌｅｃｓｙｓ ＥＣＬ技術を示している。 Ｅｌｅｃｓｙｓ Ｅ１７０の結果：本発明および比較例にかかるトロポニンＴ ｈｓアッセイの結果を示している。 Ｅｌｅｃｓｙｓ Ｅ１７０の結果：本発明および比較例にかかるトロポニンＴ ｈｓアッセイの結果を示している。 Ｅｌｅｃｓｙｓ Ｅ１７０の結果：本発明および比較例にかかるトロポニンＴ ｈｓアッセイの結果を示している。

発明の詳細な説明
本発明を以下に詳細に説明する前に、本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態および例に限定されず、これらは変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図しないことも理解されるべきである。別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当該技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。

いくつかの文献が本明細書中で引用されている。本明細書に引用されている各文献（全ての特許、特許出願、科学出版物、製造者の仕様書、説明書等を含む）は、上記であろうと以下であろうと、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。このように組み込まれた参照の定義または教示と、本明細書に引用された定義または教示との間に矛盾がある場合には、本明細書の本文が優先する。

以下、本発明の各要素について説明する。これらの要素は特定の実施形態とともに列挙されているが、これらは任意の方法および任意の数で組み合わせて追加の実施形態を作成し得ることを理解されたい。種々の説明された実施例および好ましい実施形態は、本発明を明示的に説明された実施形態のみに限定するように解釈されるべきではない。この記載は、明示的に記載された実施形態を任意の数の開示および／または好ましい要素と組み合わせる実施形態を支持し、且つ包含するものと理解されるべきである。さらにまた、本出願に記載されている全ての要素の任意の順列および組み合わせは、文脈が別段の意味を示さない限り、本出願の説明によって開示されていると考えるべきである。

定義
単語「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「備えること（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形は、記載された整数もしくはステップまたは整数もしくはステップのグループの包含を意味するが、いかなる他の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップのグループの除外を意味しないことが理解されよう。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、別途内容が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。

比率、濃度、量、および他の数値データは、「範囲」の形式で本明細書に表され得るかまたは提示され得る。このような範囲の形式は、便宜上および簡潔にするために単に使用されているに過ぎないことが理解され、したがって、その範囲の境界として明示的に列挙されている数値を含むだけではなく、各数値および部分範囲があたかも明示的に列挙されているかのごとく、その範囲内に包含される個々の数値または部分範囲の全てを含むことを柔軟に解釈するべきである。例示として、「４％～２０％」の数値範囲は、４％～２０％という明示的に列挙されている値を含むだけではなく、表示されている範囲内の個々の値および部分範囲を含むと解釈されるべきである。したがって、この数値範囲には、４、５、６、７、８、９、１０、．．．１８、１９、２０％などの個々の値と、４～１０％、５～１５％、１０～２０％などの部分範囲とが含まれる。この同じ原理は、最小値または最大値を列挙する範囲に適用される。さらに、このような解釈は、その範囲の幅または記載されている特性にかかわらず、適用すべきである。

「約」という用語は、数値に関連して使用される場合、示された数値よりも５％小さい下限値を有し、且つ示された数値よりも５％大きい上限値を有する範囲内の数値を包含することを意味する。

本明細書で使用される目的の分析物を「検出する」という用語は、本明細書の他の箇所に記載されている適切な検出方法を使用して、目的の分析物の定量または定性、例えば試料中の目的の分析物の存在または量を指す。

本開示の文脈において、「分析物」、「分析物分子」、または「目的の分析物」という用語は、検出可能な標識によって分析される化学種を互換的に指すために使用される。検出可能な標識、すなわち分析物によって分析されるのに適した化学種は、生体内に存在する任意の種類の分子とすることができ、これらに限定されないが、核酸（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡなど）、アミノ酸、ペプチド、タンパク質（例えば、細胞表面受容体、サイトゾルタンパク質など）、薬物分子、代謝産物またはホルモン（例えば、テストステロン、エストロゲン、エストラジオールなど）、脂肪酸、脂質、炭水化物、ステロイド、ケトステロイド、セコステロイド（例えば、ビタミンＤ）、別の分子の特定の修飾に特徴的な分子（例えば、タンパク質上の糖部分またはホスホリル残基、ゲノムＤＮＡ上のメチル残基）または生物によって内在化された物質（例えば、治療薬、乱用薬物、毒素など）またはそのような物質の代謝産物を含む。このような分析物は、バイオマーカーとして役立つことがある。本発明の文脈において、「バイオマーカー」という用語は、生物系の生物学的状態の指標として使用される当該系内の物質を指す。「分析物」は、分析物特異的受容体によって結合され得る任意の分子とすることができる。実施形態では、分析物は、感染因子の抗原である。感染因子の例は、ヒトに感染するウイルス、細菌および原虫病原体である。実施形態では、分析物は、ウイルス抗原、実施形態では肝炎ウイルス抗原またはヒトレトロウイルス抗原である。実施形態では、分析物は、Ｃ型肝炎ウイルスまたはＢ型肝炎ウイルスまたはＨＩＶ抗原である。

一般に、「受容体」という用語は、標的分子の特定の空間的および極性の構成、すなわち分析物のエピトープ部位を認識することができる任意の化合物または組成物を表す。したがって、本明細書で言及される「分析物特異的受容体」という用語は、分析物に結合または複合体化することができる分析物特異的反応物を含む。これは、これらに限定されないが、抗体、具体的にはモノクローナル抗体または抗体断片を含む。そのような受容体は、例えば分析物を固定化するために、分析物のキャッチャとして作用することができる。抗体によって認識されるエピトープが結合され、続いて分析物の別のエピトープに特異的な標識抗体が結合される。他の受容体は、当業者にとって公知である。受容体ベースの分析物アッセイにおける様々な受容体の特定の使用は、本開示を参照して当業者によって理解されるであろう。

目的の複数の分析物または分析物は、試料、例えば生物学的試料または臨床的試料中に存在し得る。「生物学的試料または臨床的試料」という用語は、本明細書において互換的に使用され、組織、器官もしくは個体の部分または片を指し、通常、組織、器官または個体の全体を表すことが意図されているこのような組織、器官または個体よりも小さい。分析に際して、生物学的試料または臨床的試料は、組織の状態、または器官もしくは個体の健康もしくは疾患状態に関する情報をもたらす。生物学的試料または臨床的試料の例は、これらに限定されないが、血液、血清、血漿、滑液、髄液、尿、唾液およびリンパ液などの液体試料、または乾燥血液スポットおよび組織抽出物などの固体の生物学的試料または臨床的試料を含む。生物学的試料または臨床的試料のさらなる例は、細胞培養物または組織培養物である。

本開示に関連して、「抗体」という用語は、完全な免疫グロブリン分子、具体的にはＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡまたはＩｇＧ、ならびにＦａｂフラグメントまたはＶ_Ｌ－、Ｖ_Ｈ－もしくはＣＤＲ領域などのそのような免疫グロブリン分子の一部に関する。さらにまた、この用語は、キメラ抗体およびヒト化抗体のような、修飾および／または改変された抗体に関する。この用語はまた、修飾または改変されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体、ならびに組換え的にまたは合成的に作製／合成された抗体に関する。この用語はまた、分離された軽鎖および重鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ／ｃ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２のような、損傷を受けていない抗体ならびにその抗体フラグメント／部分に関する。「抗体」という用語はまた、抗体誘導体、二機能性抗体および抗体構築物、例えば一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二重特異性ｓｃＦｖまたは抗体融合タンパク質を含む。

化学において、「固相合成」は、分子が固体支持体材料上に共有結合し、選択的保護基化学を利用して単一の反応容器内で段階的に合成される方法である。具体的な実施形態として、固相ペプチド合成は、ペプチドの合成のための個別のステップを含む一般的な技術である。このアプローチは、生成物を失うことなく未反応試薬を洗浄によって除去することを可能にする。通常、ペプチドは、アミノ酸鎖のカルボニル基側（Ｃ末端）からアミノ基側（Ｎ末端）に合成される。ペプチド合成では、アミノ保護アミノ酸がポリスチレンビーズなどであるがこれに限定されない固相材料に結合され、それによってカルボニル基と樹脂との間に共有結合、最も多くの場合アミド結合またはエステル結合を形成する。次いで、アミノ基が脱保護され、次のアミノ保護アミノ酸のカルボニル基と反応される。固相は、ここでジペプチドを担持する。このサイクルが繰り返されて、所望のペプチド鎖を形成する。全ての反応が完了した後、合成されたペプチドは、固相から切断される。

より具体的には、入ってくる各アミノ酸のカルボキシル部分は、いくつかの戦略のうちの１つによって活性化され、先行するアミノ酸のα－アミノ基と結合する。入ってくる残基のα－アミノ基は、この部位でのペプチド結合形成を妨げるために一時的にブロックされる。残基は、次の合成サイクルの開始時に脱ブロックされる。さらに、アミノ酸上の反応性側鎖が適切な保護基によって修飾される。ペプチド鎖は、合成サイクルの反復によって伸長される。過剰な試薬が使用されて、反応を可能な限り完了に近付ける。

α－アミノ基をブロックするために使用される「ブロック基」または「保護基」または「保護基」は、使用される合成化学および側鎖保護基の性質の双方を判定する。最も一般的に使用される２つのα－アミノ保護基は、Ｆｍｏｃ（９－フルオレニル－メトキシ－カルボニル）およびｔＢｏｃ（ｔｅｒｔ．－ブチルオキシカルボニル））である。Ｆｍｏｃ側鎖保護は、典型的には、ｔｅｒｔ．－ブタノールのエステル、エーテルおよびウレタンの誘導体によって提供され、典型的な対応するｔＢｏｃ保護基は、ベンジルアルコールのエステル、エーテルおよびウレタンの誘導体である。後者は、通常、より高い酸安定性のために電子求引性ハロゲンの導入によって修飾される。シクロペンチルまたはシクロヘキシルアルコールのエーテルおよびエステルの誘導体も使用される。

ペプチドを完全に組み立てた後、必要に応じて側鎖保護基が除去され、不安定な残基に最小限の損傷を与える条件を用いて、ペプチドが固体支持体から切断される。

その後、生成物が分析されて配列を検証することができる。合成ペプチドは、通常、ゲルクロマトグラフィまたはＨＰＬＣによって精製される。

標識および／または標的分子のペプチドへの結合は、異なる方法によって可能である。非限定的な例として、ＳＰＰＳに適した構成要素がペプチドに組み込まれてもよく、構成要素は、場合により保護され、ＳＰＰＳプロセス後に選択されるさらなる化合物との結合を形成するために使用され得る反応性基を含む。あるいは、選択された化合物は、ＳＰＰＳプロセスに入るときに構成要素に既に結合されてもよい。他の代替形態も可能である。

Ｆｍｏｃ保護基は、塩基に不安定である。Ｆｍｏｃ保護基は、通常、ピペリジンなどの希釈塩基によって除去される。側鎖保護基は、ペプチドを支持体に固定する結合も切断するトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）による処理によって除去される。ｔＢｏｃ保護基は、弱酸（通常、希釈ＴＦＡ）によって除去される。フッ化水素酸（ＨＦ）は、アミノ酸側鎖を脱保護するため、および樹脂支持体からペプチドを切断するための双方に使用され得る。Ｆｍｏｃは、ペプチド鎖が各サイクルで酸に供されず、市販の自動ペプチド合成において使用される主要な方法になっているため、ｔＢｏｃよりも穏やかな方法である。

ペプチド合成において主に使用されるアミノ基の保護基は、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）およびｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）である。いくつかのアミノ酸は、入ってくるＮ－保護アミノ酸との反応から特異的に保護されなければならない官能基を側鎖に担持する。Ｂｏｃ基およびＦｍｏｃ基とは対照的に、これらは、ペプチド合成の過程にわたって安定でなければならないが、ペプチドの最終脱保護中にも除去される。

「標識化合物」は、検出可能であるかまたは検出可能な状態にされ得る部分を含む。当業者は、特定の信号が減少または増加するように、物理的活性化（または励起）または化学試薬と併せて検出可能な信号を提供することができ、且つ修飾され得る化合物または組成物としての標識を知っている。

検出可能な信号を生成することができる標識化合物の特定の実施形態は、分析測定のために化学発光、好ましくは電気化学発光（ＥＣＬ）を利用するいくつかの市販の機器によって検出可能な標識を含む。ＥＣＬを放射するように誘導され得る種（ＥＣＬ活性種）がＥＣＬ標識として使用されている。ＥＣＬ標識の例は、ｉ）金属が、例えば、トリスビピリジル－ルテニウム（ＲｕＢｐｙ）部分などのＲｕ含有、Ｉｒ含有および／またはＯｓ含有有機金属化合物を含む第ＶＩＩＩ族の貴金属からの有機金属化合物、ならびにｉｉ）ルミノールおよび関連化合物を含む。ＥＣＬプロセスにおいてＥＣＬ標識に関与する種は、本明細書ではＥＣＬ共反応物と呼ばれる。一般的に使用される共反応物は、ＲｕＢｐｙからのＥＣＬについては第三級アミン（例えば、米国特許第５，８４６，４８５号明細書を参照）、シュウ酸塩および過硫酸塩、およびルミノールからのＥＣＬについては過酸化水素（例えば、米国特許第５，２４０，８６３号明細書を参照）を含む。ＥＣＬ標識によって生成された光は、診断手順におけるレポーター信号として使用され得る（Ｂａｒｄら、米国特許第５，２３８，８０８号明細書）。例えば、ＥＣＬ標識は、抗体、核酸プローブ、受容体またはリガンドなどの結合剤に共有結合され得る。結合相互作用における結合試薬の関与は、ＥＣＬ標識から放射されたＥＣＬを測定することによって監視され得る。あるいは、ＥＣＬ活性化合物からのＥＣＬ信号は、化学環境を示し得る（例えば、ＥＣＬ共反応物の形成または破壊を監視するＥＣＬアッセイを記載する米国特許第５，６４１，６２３号を参照）。ＥＣＬ、ＥＣＬ標識、ＥＣＬアッセイおよびＥＣＬアッセイを実施するための機器に関するさらなる背景については、米国特許第５，０９３，２６８号明細書；米国特許第５，１４７，８０６号明細書；米国特許第５，３２４，４５７号明細書；米国特許第５，５９１，５８１号明細書；米国特許第５，５９７，９１０号明細書；米国特許第５，６４１，６２３号明細書；米国特許第５，６４３，７１３号明細書；米国特許第５，６７９，５１９号明細書；米国特許第５，７０５，４０２号明細書；米国特許第５，８４６，４８５号明細書；米国特許第５，８６６，４３４号明細書；米国特許第５，７８６，１４１号明細書；米国特許第５，７３１，１４７号明細書；米国特許第６，０６６，４４８号明細書；米国特許第６，１３６，２６８号明細書；米国特許第５，７７６，６７２号明細書；米国特許第５，３０８，７５４号明細書；米国特許第５，２４０，８６３号明細書；米国特許第６，２０７，３６９号明細書および米国特許第５，５８９，１３６号明細書；国際公開第９９／６３３４７号パンフレット、国際公開第００／０３２３３号パンフレット、国際公開第９９／５８９６２号パンフレット、国際公開第９９／３２６６２号パンフレット、国際公開第９９／１４５９９号パンフレット、国際公開第９８／１２５３９号パンフレット、国際公開第９７／３６９３１号パンフレットおよび国際公開第９８／５７１５４号パンフレットを参照されたい。

「化学発光に基づく信号」という用語は、化学反応の結果として光の放射（発光）によって生成される信号を指す。この信号は、例えば、化学発光を利用するいくつかの市販の機器によって検出可能である。

本開示の文脈において、「複合体」という用語は、リンカー、標識化合物および分析物特異的結合剤の反応によって生成される生成物を指す。この反応は、一方では標識化合物とリンカーとの間、他方ではリンカーと分析物特異的結合剤との間に共有結合の形成をもたらす。

「リンカー」という用語は、標識化合物と分析物特異的結合剤との間のスペーサーとして機能し、および／または親水性および溶解性などの複合体の物理化学的特性に影響を及ぼす化合物を指すことができる。

「分析物特異的結合剤」という用語は、目的の分析物、例えばモノクローナル抗体に特異的に結合することができる（巨大）分子（タンパク質、ペプチド、核酸など）を指す。

「Ａは標識化合物を表し、Ｂは分析物特異的結合剤を表し、またはその逆である」という用語は、式ＩのＡが標識化合物を表し、式ＩのＢが分析物特異的結合剤を表すことを意味する。あるいは、式ＩのＢが標識化合物を表し、式ＩのＡが分析物特異的結合剤を表すことを意味する。

「ステップａ）の試料をステップｂ）の複合体と結合させる」という用語は、目的の分析物を含むかまたは含有する試料とステップｂ）の複合体との反応を指す。好ましくは、結合は、試料、好ましくは目的の分析物と複合体との間の共有結合を指す。

「ペプチド」という用語は、天然に存在するＬ－アミノ酸またはその類似体、例えばＤ－アミノ酸またはＮ－アルキル化アミノ酸などを使用して形成される分子を意味する。好ましいアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｌ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＶａｌからなる群から選択される。カルボン酸およびアミノ基を有する他の構成要素も可能である。さらに、蛍光色素またはビオチンのような修飾も可能である。

「固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）」は、十分に確立された方法である。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄらは、続いて不均一反応媒体として固相樹脂を使用してアミノ酸モノマーを結合することによってペプチドを構築するための便利な戦略を最初に開発した（Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５（１９６３）２１４９－２１５４）。

ペプチドの溶液中合成と比較して大きな利点として、ＳＰＰＳは容易に自動化され得、不純物または副生成物、試薬ならびに未反応の出発物質が、生成物または中間体が固相に係留されたままで洗い流され得る。

通常、上述したＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法は、架橋ポリスチレン樹脂のいわゆる「リンカー」への第１のＣ末端アミノ酸の結合から始まる。「リンカー」は、樹脂と合成されるペプチドのＣ末端アミノ酸との架橋要素として機能し、リンカーは、合成後のペプチドの脱離に使用される酸感受性結合を含む。

典型的なＳＰＰＳプロトコルの例として、Ｎ末端は、９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基によって保護され得、これは酸中で安定であるが、塩基によって除去可能である。ペプチド骨格に組み込まれたＮ末端アミノ基のみが、Ｆｍｏｃ基を除去した後、後続のアミノ酸のカルボン酸基と反応することができることを確実にするために、任意の側鎖官能基が塩基安定基によって保護される。既に述べたように、第１のアミノ酸の固定化後の第１のステップは、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％ピペリジンを用いたＦｍｏｃ基の除去によるアミノ官能の脱保護である。アミノ官能は、塩基の存在下で次のアミノ酸のＯ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）エステルを介して活性化カルボン酸と結合されて、新たなアミド結合を形成する。このプロセスは、所望のペプチドが樹脂に集合するまで繰り返される。最後のステップとして、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する溶液を使用して、完全なペプチドが樹脂から切断される。溶液中の放出されたペプチドが沈殿され、さらに精製する前に洗い流され得る。

ＳＰＰＳのこの「古典的な」方法は、修飾樹脂、リンカー、保護基、結合化学および開裂手順を使用して近年最適化されたが、原理は同じままである。

本明細書で使用される「固相」という用語は、分子を隔離するために当業者によって典型的に使用される固体、半固体、ゲル、フィルム、膜、メッシュ、フェルト、複合体、粒子、樹脂、紙などを含む多種多様な材料を指す。固相は、例えばクロマトグラフィカラム内の材料、または具体的な実施形態として、固相合成のためのデバイスのカラム内の官能化樹脂とすることができる。固相は、非多孔質または多孔質とすることができる。固相は、非磁性または磁性（反磁性、常磁性、および超常磁性の特徴を包含する）とすることができる。

上述したような固相の表面は、例えばブロモアセチル化、シリル化、硝酸を用いたアミノ基の付加、および中間タンパク質、デンドリマーおよび／またはスターポリマーの結合によって、連結部位を提供するように修飾され得る。このリストは限定することを意味するものではなく、当業者に公知の任意の方法が使用され得る。

用語「ポリオール単位」は、１つまたは複数のＯＨ基を含むモノマー（例えば、アミノ酸）を指す。そのようなモノマーは、互いに共有結合されてホモポリマーまたはヘテロポリマーを形成することができる。

「直鎖リンカー」という用語は、全てまたは少なくとも全てのＯＨ基がリンカー骨格／主鎖に直接結合しているポリオール単位によって形成されるリンカーを指す。

「分岐リンカー」という用語は、１つまたは複数のＯＨ基が側鎖に結合されているポリオール単位によって形成されるリンカーを指す。「整数」という用語は、正の整数を意味し、分数を意味しない。

「キット」は、少なくとも１つの試薬、例えば障害の処置のための薬品、または本発明のバイオマーカー遺伝子もしくはタンパク質を特異的に検出するためのプローブを含む、任意の製品（例えば、パッケージまたは容器）である。キットは、好ましくは、本発明の方法を実行するためのユニットとして、促進、流通、または販売される。典型的には、キットは、バイアル、チューブなどの１つまたは複数の容器手段を密接に閉じ込めて受け入れるように区画化された担体手段をさらに備え得る。特に、容器手段のそれぞれは、第１の態様の方法において使用される別個の要素のうちの１つを備える。キットは、反応触媒を含むがこれに限定されない１つまたは複数の他の試薬をさらに備えてもよい。キットは、緩衝液、希釈剤、フィルタ、ニードル、注射器、および使用説明を伴う添付文書を含むがこれらに限定されない、さらなる材料を含む１つまたは複数の他の容器をさらに備えてもよい。標識は、組成物が特定の用途に使用されることを示すために容器上に提示され得て、インビボ使用またはインビトロ使用のいずれかに関する指示も示し得る。コンピュータプログラムコードは、光記憶媒体（例えば、コンパクトディスク）などのデータ記憶媒体もしくは装置上に、またはコンピュータもしくはデータ処理装置に直接提供されてもよい。さらに、キットは、較正目的のために、本明細書の別の箇所に記載されるようなバイオマーカーの標準量を含み得る。

この詳細な説明において、「一実施形態」、「実施形態」、または「実施形態では」への言及は、言及されている特徴が、本開示にかかるその全ての態様に関して本技術の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。さらに、「一実施形態」、「実施形態」、または「複数の実施形態」への個々の言及は、必ずしも同じ実施形態を指すとは限らない。しかしながら、そのような実施形態は、特に明記しない限り、および当業者に容易に明らかになることを除いて、相互に排他的ではない。したがって、本開示にかかるその全ての態様における技術は、本明細書に記載の実施形態の任意の様々な組み合わせおよび／または統合を包含することができる。

実施形態
第１の態様では、本発明は、試料中の目的の分析物を検出するための方法であって、
ａ）目的の分析物を含む試料を提供するステップと、
ｂ）リンカーを含む複合体を提供するステップであって、リンカーが、標識化合物および分析物特異的結合剤に共有結合し、標識化合物が、検出可能な信号、好ましくは化学発光ベースの信号を生成することができる、複合体を提供するステップと、
ｃ）ステップａ）の試料をステップｂ）の複合体と結合させるステップと、
ｄ）標識化合物の検出可能な信号を使用することによって目的の分析物を検出するステップと、を含み、
複合体が式Ｉ：

の化合物であり、
式中、Ａは標識化合物を表し、Ｂは分析物特異的結合剤を表し、またはその逆であり、
Ｘは、ＯＨ、またはｔ≧１、好ましくはｔ＝１、３、５もしくは７の（ＣＨＯＨ）_ｔ－ＣＨ_２ＯＨであり、
ｍは、１から８、好ましくは≧２、特に２から８の整数であり、
ｎは、２から２０、好ましくは５から２０の整数であり、
ｒは、整数であり、≧０、好ましくは０であり、ここで、Ｘ＝ＯＨの場合、ｒ≧１であり、
ｓは、整数であり、≧０、好ましくは０であり、
ｚは、整数であり、≧１である、方法に関する。

本発明者らは、驚くべきことに、本発明の主題、特に本発明の第１の態様にかかる方法が、構造および多分散性に対する極めて良好な制御を有する、特にペプチドベースのポリオールリンカーを含む複合体を示すことを見出した。単一の分子量および純粋なリンカーを使用すると、生成物の精製、特性評価の複雑さを減少させ、製造の再現性を向上させる。特に、固相ペプチド化学が利用されて、本発明の複合体を得ることができる。

本発明にしたがって言及される方法は、上述したステップから本質的になる方法、またはさらなるステップを含む方法、を含む。さらに、本発明の方法は、好ましくは、エクスビボ、より好ましくはインビトロの方法である。さらに、本発明の方法は、上記で明示的に述べられたものに加えて、ステップを含んでもよい。例えば、さらなるステップは、目的のさらなる分析物の検出および／または本方法によって得られた結果の試料前処理、濃縮ステップまたは評価に関連し得る。本方法は、手動で実行されても、自動化によって支援されてもよい。好ましくは、ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および／または（ｄ）は、全体的にまたは部分的に、例えば適切なロボットおよび感覚機器による自動化によって支援されてもよい。

ステップｂ）によれば、複合体が提供される。複合体は、式Ｉの化合物である。複合体は、リンカーを含む。リンカーは、標識化合物と分析物特異的結合剤とを共有結合する。標識化合物は、検出可能な信号を生成することができる。好ましくは、検出可能な標識は、化学発光ベースの信号である。

ステップｃ）によれば、ステップａ）の試料がステップｂ）の複合体と結合される。

ステップｄ）によれば、標識化合物の検出可能な信号を使用することによって、目的の分析物が検出される。

本発明の第１の態様の実施形態では、ＸはＯＨである。この場合、ポリオール単位を有する直鎖リンカーを含む複合体が形成され得る。あるいは、Ｘは、ｔ≧１の（ＣＨＯＨ）ｔ－ＣＨ２ＯＨである。好ましくは、ｔ＝１、３、５または７、例えば３または５である。この場合、ポリオール単位を有する分岐リンカーを含む複合体が形成され得る。

本発明の第１の態様の実施形態では、ｍは整数である。ｍは、１から８の範囲から選択される。好ましくは、ｍは、２以上、例えば、２または３または４または５または６または７または８である。

本発明の第１の態様の実施形態では、ｎは整数である。ｎは、１から２０の範囲から選択される。好ましくは、ｍは、２以上、例えば、２または３または４または５または６または７または８または９または１０または１１または１２または１３または１４または１５または１６または１７または１８または１９または２０である。

本発明の第１の態様の実施形態では、ｒは整数である。ｒは、０以上である。好ましくは、例えば、Ｘ＝（ＣＨＯＨ）_ｔ－ＣＨ_２ＯＨでｔ≧１の場合、ｒは０である。Ｘ＝ＯＨの場合、ｒは１以上である。

本発明の第１の態様の実施形態では、ｓは整数である。ｓは、０以上である。好ましくは、ｓは０である。

本発明の第１の態様の実施形態では、ｚは整数である。ｚは、１以上である。好ましくは、ｚは、５から１０である。

本発明の第１の態様の実施形態では、複合体は、式ＩＩ：

の化合物であり、
式中、Ａ、Ｂ、ｍおよびｎのそれぞれは、式Ｉに関して上述したものと同じ意味を有し、
式中、Ｘは、ｔ≧１、好ましくはｔ＝１、３、５または７の（ＣＨＯＨ）_ｔ－ＣＨ_２ＯＨである。

本発明の第１の態様の実施形態では、複合体は、式ＩＩＩ：

の化合物であり、
式中、Ａ、Ｂ、ｍおよびｎのそれぞれは、式Ｉに関して上述したものと同じ意味を有し、
式中、ＸはＯＨであり、ｒ≧１であり、好ましくはｒ＝１である。

本発明の第１の態様の実施形態では、ステップｂ）は、ペプチドベースの合成、好ましくは固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を含む。

本発明の第１の態様の実施形態では、ＸはＯＨであり、および／またはｍは、２もしくは４もしくは６である。

本発明の第１の態様の実施形態では、Ｘは、ｔ＝１、３、５または７の（ＣＨＯＨ）_ｔ－ＣＨ_２ＯＨである。

本発明の第１の態様の実施形態では、標識化合物は、酵素、蛍光色素、発光色素、金属キレート複合体、および放射性同位体を含む部分からなる群から選択される。

本発明の第１の態様の実施形態では、標識化合物は、電気化学的に酸化または還元されたときに発光するように誘導され得る。

本発明の第１の態様の実施形態では、標識化合物は、Ｒｕ^２＋またはＩｒ^３＋である金属イオンを含む。

好ましくは、標識化合物は、以下の群から選択される：ＲｕまたはＩｒ。

本発明の第１の態様の実施形態では、標識化合物は、第１のコンジュゲーション法によってリンカーに共有結合され、第１のコンジュゲーション法は、以下の群から選択される：クリックケミストリー、アミド、エステル、イミド、炭酸塩、カルバミン酸塩、スクアレート、チアゾール、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキシム、ジヒドロピリダジン、チオール・マレイミド、付加環化、テトラジンライゲーション、フォトクリック、シュタウディンガーライゲーション、ディールス・アルダー、クロスカップリング、ピクト・スペングラー、クアドリシクラン。

本発明の第１の態様の実施形態では、分析物特異的結合剤は、抗体、抗体の分析物特異的フラグメントおよび／または誘導体、アプタマー、シュピーゲルマー、ダルピン、レクチン、アンキリンリピート含有タンパク質、およびＫｕｎｉｔｚ型ドメイン含有タンパク質からなる群から選択される。

本発明の第１の態様の実施形態では、分析物特異的結合剤は、第２のコンジュゲーション法によってリンカーに共有結合され、第２のコンジュゲーション法は、クリックケミストリー、アミド、エステル、イミド、炭酸塩、カルバミン酸塩、スクアレート、チアゾール、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキシム、ジヒドロピリダジン、チオール・マレイミド、付加環化、テトラジンライゲーション、フォトクリック、シュタウディンガーライゲーション、ディールス・アルダー、クロスカップリング、ピクテ・スペングラー、クアドリシクランから選択される。

好ましくは、分析物特異的結合剤は、以下の群から選択される：抗体、Ｆａｂ。

本発明の第１の態様の実施形態では、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩのＡは、標識化合物を表し、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩのＢは、分析物特異的結合剤を表す。

本発明の第１の態様の実施形態では、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩのＢは、標識化合物を表し、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩのＡは、分析物特異的結合剤を表す。

本発明の第１の態様の実施形態では、ステップ（ｃ）の前、最中または後に、分析物が固相に固定化される。

本発明の第１の態様の実施形態では、試料は、痰、唾液、液体、尿、全血、溶血全血、血清および血漿からなる群から選択される。

本発明の第１の態様の実施形態では、ステップ（ｂ）の複合体は、溶解形態で提供され、ステップ（ｃ）は、液体水性緩衝液中で行われる。

本発明の第１の態様の実施形態では、液体水性緩衝液は、リン酸塩、トリス緩衝液、クエン酸塩、カコジル酸塩、バルビタール、グリシン、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ビス－トリスメタン、ＡＤＡ、ビス－トリスプロパン、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＡＭＰＢ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢＳ、アセトアミドグリシン、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＡ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＳ、ＨＥＰＰＳ、トリシン、ジシンアミド、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、ＨＥＰＢＳ、ビシン、ＴＡＰＳおよびそれらの混合物から選択される。

本発明の第１の態様の実施形態では、液体水性緩衝液は、リン酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ、好ましくはｐＨ６．０～７．４）およびそれらの混合物から選択される。

本発明の第１の態様の実施形態では、複合体は、式ＩＶ－１またはＩＶ－２の化合物である：

式中、ｎは１よりも大きく、好ましくは１≦ｎ≦１５であり、例えば、ｎ＝１０である。好ましくは、複合体は、以下の式の化合物である：

この化合物は、ここではＢＰＲｕ－（ＭＦ７７）_１０Ｋ（ＭＨ）アミドと略される。

本発明の第１の態様の実施形態では、複合体は、式ＶまたはＶＩ：
の化合物であり、
式中、式ＶまたはＶＩのｎは、互いに独立して、１よりも大きく、好ましくは１≦ｎ≦１５であり、例えば、ｎ＝１０である。

好ましくは、複合体は、以下の式の化合物である：

この化合物は、ここではＢＰＲｕ－（ＭＦ７４）_５Ｋ（ＭＨ）アミドと略される。

好ましくは、複合体は、以下の式の化合物である：

好ましくは、複合体は、以下の式の化合物である：

実施形態では、標識化合物は、葉酸またはその誘導体を含有しないか、または含まない。

複数の実施形態では、標識化合物は、葉酸受容体結合リガンドを含有しないか、または含まない。

実施形態では、分析物特異的結合剤は、システインを含有しないか、または含まない。

いくつかの実施形態では、本方法は、薬物送達を含まない。

実施形態では、本方法は、診断方法、好ましくはインビトロ診断方法である。

実施形態では、ｎ＞２である。

実施形態では、ｎ＞４である。

複数の実施形態では、標識化合物は、薬物化合物、例えば、デスアセチルビンブラスチンヒドラジドまたはその誘導体を含まない。

実施形態では、Ｘ＝（ＣＨＯＨ）_ｔ－ＣＨ_２ＯＨであり、ｔ≧１、好ましくはｔ＝１、３、５または７である。

第２の態様では、本発明は、試料中の目的の分析物を検出するための本発明の第１の態様にかかる方法の使用に関する。

本発明の第１の態様について述べた全ての実施形態は、本発明の第２の態様に適用され、逆もまた同様である。

第３の態様では、本発明は、試料中の目的の分析物の検出を実行するためのキットであって、別個の容器に、
ａ）分析物を固定可能な固相と、
ｂ）式Ｉ：

の化合物であって、
式中、Ａは標識化合物を表し、Ｂは分析物特異的結合剤を表し、またはその逆であり、
Ｘは、ＯＨ、またはｔ≧１、好ましくはｔ＝１、３、５もしくは７の（ＣＨＯＨ）_ｔ－ＣＨ_２ＯＨであり、
ｍは、１から８、好ましくは≧２、特に２から８の整数であり、
ｎは、２から２０、好ましくは５から２０の整数であり、
ｒは、整数であり、≧０、好ましくは０であり、ここで、Ｘ＝ＯＨの場合、ｒ≧１であり、
ｓは、整数であり、≧０、好ましくは０であり、
ｚは、整数であり、≧１である、
化合物と、を含む、キットに関する。

本発明の第１の態様および／または本発明の第２の態様について述べた全ての実施形態は、本発明の第３の態様に適用され、その逆も同様である。

本発明の第３の態様の実施形態では、複合体は、式ＩＩ：

の化合物であり、
式中、Ａ、Ｂ、Ｘ、ｍおよびｎのそれぞれは、態様２１において言及されたものと同じ意味を有し、
式中、Ｘは、ｔ≧１、好ましくはｔ＝１、３、５または７の（ＣＨＯＨ）_ｔ－ＣＨ_２ＯＨである。

本発明の第３の態様の実施形態では、複合体は、式ＩＩＩ：

の化合物であり、
式中、Ａ、Ｂ、ｍおよびｎのそれぞれは、態様２１において述べたものと同じ意味を有し、
式中、ＸはＯＨであり、ｒ≧１であり、好ましくはｒ＝１である。

本発明の第３の態様の実施形態では、ＸはＯＨであり、ｍは、２または４または６である。

本発明の第３の態様の実施形態では、Ｘは、ｔ＝１、３、５または７の（ＣＨＯＨ）_ｔ－ＣＨ_２ＯＨである。

本発明の第３の態様の実施形態では、複合体は、溶解形態で具体化される。

本発明の第３の態様の実施形態では、少なくとも１つの容器または複数の容器は、ガラスまたはプラスチックから作られる。

第４の態様では、本発明は、試料中の目的の分析物を検出するための本発明の第３の態様にかかるキットの使用に関する。

本発明の第１の態様および／または本発明の第２の態様および／または本発明の第３の態様について述べた全ての実施形態は、本発明の第４の態様に適用され、逆もまた同様である。

第５の態様では、本発明は、式Ｉ

の複合体であって、
式中、Ａは標識化合物を表し、Ｂは分析物特異的結合剤を表し、またはその逆であり、
Ｘは、ＯＨ、またはｔ≧１、好ましくはｔ＝１、３、５もしくは７の（ＣＨＯＨ）_ｔ－ＣＨ_２ＯＨであり、
ｍは、１から８、好ましくは≧２、特に２から８の整数であり、
ｎは、２から２０、好ましくは５から２０の整数であり、
ｒは、整数であり、≧０、好ましくは０であり、ここで、Ｘ＝ＯＨの場合、ｒ≧１であり、
ｓは、整数であり、≧０、好ましくは０であり、
ｚは、整数であり、≧１であり、
好ましくは、化合物が、試料中の目的の分析物を検出するのに適している、複合体に関する。

本発明の第１の態様および／または本発明の第２の態様および／または本発明の第３の態様および／または本発明の第４の態様について述べた全ての実施形態は、本発明の第５の態様に適用され、逆もまた同様である。

本発明の第５の態様の実施形態では、複合体は、式ＩＩ：

の化合物であり、
式中、Ａ、Ｂ、Ｘ、ｍおよびｎのそれぞれは、態様２８において言及されたものと同じ意味を有し、
式中、Ｘは、ｔ≧１、好ましくはｔ＝１、３、５または７の（ＣＨＯＨ）_ｔ－ＣＨ_２ＯＨである。

本発明の第５の態様の実施形態では、複合体は、式ＩＩＩ：

の化合物であり、
式中、Ａ、Ｂ、ｍおよびｎのそれぞれは、態様２８において述べたものと同じ意味を有し、
式中、ＸはＯＨであり、ｒ≧１であり、好ましくはｒ＝１である。

本発明の第５の態様の実施形態では、ＸはＯＨであり、ｍは、２または４または６である。

本発明の第５の態様の実施形態では、Ｘは、ｔ＝１、３、５または７の（ＣＨＯＨ）_ｔ－ＣＨ_２ＯＨである。

本発明の第５の態様の実施形態では、ＡまたはＢは、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質からなる群から選択される。

本発明の第５の態様の実施形態では、Ａが分析物特異的結合剤を含み、Ｂが標識化合物を含むか、またはＢが分析物特異的結合剤を含み、Ａが標識化合物を含む。

本発明の第５の態様の実施形態では、分析物特異的結合剤は、抗体、抗体の分析物特異的フラグメントおよび／または誘導体、アプタマー、シュピーゲルマー、ダルピン、レクチン、アンキリンリピート含有タンパク質、およびＫｕｎｉｔｚ型ドメイン含有タンパク質からなる群から選択され、標識化合物は、酵素、蛍光色素、発光色素、金属キレート複合体、および放射性同位体を含有する部分からなる群から選択される。

第６の態様では、本発明は、本発明の第５の態様の複合体を合成する方法であって、
ａ）モノマーまたはその誘導体を提供するステップであって、モノマーが、アミノ基、カルボキシ基および少なくとも１つのヒドロキシル基を含むアミノ酸であり、アミノ基またはカルボキシ基が第１の保護基によって保護されており、少なくとも１つのヒドロキシル基または各ヒドロキシル基が第２の保護基によって保護されている、モノマーまたはその誘導体を提供するステップと、
ｂ）固相ペプチド合成のプロセスにおいてモノマーを使用し、第１の保護基および第２の保護基を切断し、式ＩＩＩ

の複合体であって、
式中、Ａは標識化合物を表し、Ｒは第２のスペーサーを表し、またはその逆であり、Ｒは分析物特異的結合剤に共有結合することができるか、または分析物特異的結合剤に共有結合され、
Ｘは、ＯＨ、またはｔ≧１、好ましくはｔ＝１、３、５もしくは７の（ＣＨＯＨ）_ｔ－ＣＨ_２ＯＨであり、
ｍは、１から８、好ましくは≧２、特に２から８の整数であり、
ｎは、２から２０、好ましくは５から２０の整数であり、
ｒは、整数であり、≧０、好ましくは０であり、ここで、Ｘ＝ＯＨの場合、ｒ≧１であり、
ｓは、整数であり、≧０、好ましくは０であり、
ｚは、整数であり、≧１である、
複合体を形成するステップと、
を含む、方法に関する。

本発明の第１の態様および／または本発明の第２の態様および／または本発明の第３の態様および／または本発明の第４の態様および／または本発明の第５の態様について述べた全ての実施形態は、本発明の第６の態様に適用され、逆もまた同様である。

本発明の第６の態様の実施形態では、第１および／または第２の保護基は、エステル、エーテル、シリルエーテル、アセタール、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、アミドおよびｔｅｒｔブチルエステルの群から選択される。

本発明の第６の態様の実施形態では、モノマーまたはその誘導体は、以下の式ｍ－１からｍ－４から選択される：

式中、ＦｍｏｃＨＮは、９－フルオレニルメトキシカルボニル保護基によって保護されたアミンを意味する。略語ｍ－１はまた、本明細書および本開示の内容において、ＭＦ７７と命名され得る。略語ｍ－２はまた、本明細書および本開示の内容において、（化合物）１８（例えば、スキーム４を参照）またはＦＡ３６と命名され得る。略語ｍ－３はまた、本明細書および本開示の内容において、Ｓ７７９と命名され得る。略語ｍ－４はまた、本明細書および本開示の内容において、ＭＦ７４と命名され得る。

本発明の第６の態様の実施形態では、固相合成の分野において公知の標準的な知識およびプロセス、方法および技術を使用することによって、上記提示された式ＩＩＩの複合体が、自動固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）装置において合成され、この装置を使用して提供され得る。

さらなる実施形態では、本発明は、以下の態様に関する：

１．試料中の目的の分析物を検出するための方法であって、
ａ）目的の分析物を含む試料を提供するステップと、
ｂ）リンカーを含む複合体を提供するステップであって、リンカーが、標識化合物および分析物特異的結合剤に共有結合し、標識化合物が、検出可能な信号、好ましくは化学発光ベースの信号を生成することができる、複合体を提供するステップと、
ｃ）ステップａ）の試料をステップｂ）の複合体と結合させるステップと、
ｄ）標識化合物の検出可能な信号を使用することによって目的の分析物を検出するステップと、を含み、
複合体が式Ｉ：

の化合物であり、
式中、Ａは標識化合物を表し、Ｂは分析物特異的結合剤を表し、またはその逆であり、
Ｘは、ＯＨ、またはｔ≧１、好ましくはｔ＝１、３、５もしくは７の（ＣＨＯＨ）_ｔ－ＣＨ_２ＯＨであり、
ｍは、１から８、好ましくは≧２、特に２から８の整数であり、
ｎは、２から２０、好ましくは５から２０の整数であり、
ｒは、整数であり、≧０、好ましくは０であり、ここで、Ｘ＝ＯＨの場合、ｒ≧１であり、
ｓは、整数であり、≧０、好ましくは０であり、
ｚは、整数であり、≧１である、方法。

２．複合体が式ＩＩ：

の化合物であり、
式中、Ａ、Ｂ、ｍおよびｎのそれぞれは、態様１において述べたものと同じ意味を有し、
式中、Ｘは、ｔ≧１、好ましくはｔ＝１、３、５または７の（ＣＨＯＨ）_ｔ－ＣＨ_２ＯＨである、態様１に記載の方法。

３．複合体が式ＩＩＩ：

の化合物であり、
式中、Ａ、Ｂ、ｍおよびｎのそれぞれは、態様１において述べたものと同じ意味を有し、
式中、ＸはＯＨであり、ｒ≧１であり、好ましくはｒ＝１である、態様１に記載の方法。

４．ＸがＯＨであり、および／またはｍが２もしくは４もしくは６である、態様１から３のいずれか一項に記載の方法。

５．Ｘがｔ＝１、３、５または７の（ＣＨＯＨ）_ｔ－ＣＨ_２ＯＨである、態様１から４のいずれか一項に記載の方法。

６．標識化合物が、酵素、蛍光色素、発光色素、金属キレート複合体、および放射性同位体を含有する部分からなる群から選択される、態様１から５のいずれか一項に記載の方法。

７．標識化合物が、電気化学的に酸化または還元されたときに発光するように誘導され得る、態様１から６のいずれか一項に記載の方法。

８．標識化合物が、Ｒｕ^２＋またはＩｒ^３＋である金属イオンを含む、態様１から７のいずれか一項に記載の方法。

９．標識化合物が、第１のコンジュゲーション法によってリンカーに共有結合され、第１のコンジュゲーション法が、クリックケミストリー、アミド、エステル、イミド、炭酸塩、カルバミン酸塩、スクアレート、チアゾール、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキシム、ジヒドロピリダジン、チオール・マレイミド、付加環化、フォトクリック、シュタウディンガーライゲーション、ディールス・アルダー、テトラジンライゲーション、クロスカップリング、ピクテ・スペングラー、クアドリシクランの群から選択される、態様１から８のいずれか一項に記載の方法。

１０．分析物特異的結合剤が、抗体、抗体の分析物特異的フラグメントおよび／または誘導体、アプタマー、シュピーゲルマー、ダルピン、レクチン、アンキリンリピート含有タンパク質、およびＫｕｎｉｔｚ型ドメイン含有タンパク質からなる群から選択される、態様１から９のいずれか一項に記載の方法。

１１．分析物特異的結合剤が、第２のコンジュゲーション法によってリンカーに共有結合され、第２のコンジュゲーション法が、クリックケミストリー、アミド、エステル、イミド、炭酸塩、カルバミン酸塩、スクアレート、チアゾール、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキシム、ジヒドロピリダジン、チオール・マレイミド、付加環化、テトラジンライゲーション、フォトクリック、シュタウディンガーライゲーション、ディールス・アルダー、クロスカップリング、ピクテ・スペングラー、クアドリシクランから選択される、態様１から１０のいずれか一項に記載の方法。

１２．式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩのＡが標識化合物を表し、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩのＢが分析物特異的結合剤を表す、態様１から１１のいずれか一項に記載の方法。

１３．式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩのＢが標識化合物を表し、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩのＡが分析物特異的結合剤を表す、態様１から１２のいずれか一項に記載の方法。

１４．ステップ（ｃ）の前、最中または後に、分析物が固相に固定化される、態様１から１３のいずれか一項に記載の方法。

１５．試料が、痰、唾液、液体、尿、全血、溶血全血、血清および血漿からなる群から選択される、態様１から１４のいずれか一項に記載の方法。

１６．ステップ（ｂ）の複合体が溶解形態で提供され、ステップ（ｃ）が液体水性緩衝液中で行われる、態様１から１５のいずれか一項に記載の方法。

１７．液体水性緩衝液が、リン酸塩、トリス緩衝液、クエン酸塩、カコジル酸塩、バルビタール、グリシン、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ビス－トリスメタン、ＡＤＡ、ビス－トリスプロパン、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＡＭＰＢ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢＳ、アセトアミドグリシン、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＡ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＳ、ＨＥＰＰＳ、トリシン、ジシンアミド、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、ＨＥＰＢＳ、ビシン、ＴＡＰＳおよびそれらの混合物から選択される、態様１から１６のいずれか一項に記載の方法。

１８．複合体が式ＩＶ－１：

の化合物であり、
式中、ｎは１よりも大きく、好ましくは１≦ｎ≦１５であり、例えば、ｎ＝１０である、態様１から１７のいずれか一項に記載の方法。

１９．複合体が式ＶまたはＶＩ：
の化合物であり、
式中、式ＶまたはＶＩのｎは、互いに独立して、１よりも大きく、好ましくは１≦ｎ≦１５であり、例えば、ｎ＝１０である、態様１から１８のいずれか一項に記載の方法。

２０．ステップｂ）がペプチドベースの合成、好ましくは固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を含む、態様１から１９のいずれか一項に記載の方法。

２１．試料中の目的の分析物を検出するための、態様１から２０のいずれか一項に記載の方法の使用。

２２．試料中の目的の分析物の検出を実行するためのキットであって、別個の容器に、
ａ）分析物を固定可能な固相と、
ｂ）式Ｉ：

の化合物であって、
式中、Ａは標識化合物を表し、Ｂは分析物特異的結合剤を表し、またはその逆であり、
Ｘは、ＯＨ、またはｔ≧１、好ましくはｔ＝１、３、５もしくは７の（ＣＨＯＨ）_ｔ－ＣＨ_２ＯＨであり、
ｍは、１から８、好ましくは≧２、特に２から８の整数であり、
ｎは、２から２０、好ましくは５から２０の整数であり、
ｒは、整数であり、≧０、好ましくは０であり、ここで、Ｘ＝ＯＨの場合、ｒ≧１であり、
ｓは、整数であり、≧０、好ましくは０であり、
ｚは、整数であり、≧１である、
化合物と、を含む、キット。

２３．複合体が式ＩＩ：

の化合物であり、
式中、Ａ、Ｂ、Ｘ、ｍおよびｎのそれぞれは、態様２２において言及されたものと同じ意味を有し、
式中、Ｘは、ｔ≧１、好ましくはｔ＝１、３、５または７の（ＣＨＯＨ）_ｔ－ＣＨ_２ＯＨである、態様２２に記載のキット。

２４．複合体が式ＩＩＩ：

の化合物であり、
式中、Ａ、Ｂ、ｍおよびｎのそれぞれは、態様２２において述べたものと同じ意味を有し、
式中、ＸはＯＨであり、ｒ≧１であり、好ましくはｒ＝１である、態様２２に記載のキット。

２５．ＸがＯＨであり、ｍが２または４または６である、態様２２から２４のいずれか一項に記載のキット。

２６．Ｘが、ｔ＝１、３、５または７の（ＣＨＯＨ）_ｔ－ＣＨ_２ＯＨである、態様２２から２５のいずれか一項記載のキット。

２７．複合体が溶解形態で具体化される、態様２２から２６のいずれか一項に記載のキット。

２８．試料中の目的の分析物を検出するための、請求項２２から２７のいずれか一項に記載のキットの使用。

２９．式Ｉ

の複合体であって、
式中、Ａは標識化合物を表し、Ｂは分析物特異的結合剤を表し、またはその逆であり、
Ｘは、ＯＨ、またはｔ≧１、好ましくはｔ＝１、３、５もしくは７の（ＣＨＯＨ）_ｔ－ＣＨ_２ＯＨであり、
ｍは、１から８、好ましくは≧２、特に２から８の整数であり、
ｎは、２から２０、好ましくは５から２０の整数であり、
ｒは、整数であり、≧０、好ましくは０であり、ここで、Ｘ＝ＯＨの場合、ｒ≧１であり、
ｓは、整数であり、≧０、好ましくは０であり、
ｚは、整数であり、≧１であり、
好ましくは、化合物が、試料中の目的の分析物を検出するのに適している、複合体。

３０．複合体が式ＩＩ：

の化合物であり、
式中、Ａ、Ｂ、Ｘ、ｍおよびｎのそれぞれは、態様２９において言及されたものと同じ意味を有し、
式中、Ｘは、ｔ≧１、好ましくはｔ＝１、３、５または７の（ＣＨＯＨ）_ｔ－ＣＨ_２ＯＨである、態様２９に記載の複合体。

３１．複合体が式ＩＩＩ：

の化合物であり、
式中、Ａ、Ｂ、ｍおよびｎのそれぞれは、態様２９において述べたものと同じ意味を有し、
式中、ＸはＯＨであり、ｒ≧１であり、好ましくはｒ＝１である、態様２９に記載の複合体。

３２．ＸがＯＨであり、ｍが２または４または６である、態様２９から３１のいずれか一項に記載の複合体。

３３．Ｘが、ｔ＝１、３、５または７の（ＣＨＯＨ）_ｔ－ＣＨ_２ＯＨである、態様２９から３２のいずれか一項記載の複合体。

３４．ＡまたはＢが、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質からなる群から選択される、態様２９から３３のいずれか一項に記載の複合体。

３５．Ａが分析物特異的結合剤を含み、Ｂが標識化合物を含むか、またはＢが分析物特異的結合剤を含み、Ａが標識化合物を含む、態様２９から３４のいずれか一項に記載の複合体。

３６．分析物特異的結合剤が、抗体、抗体の分析物特異的フラグメントおよび／または誘導体、アプタマー、シュピーゲルマー、ダルピン、レクチン、アンキリンリピート含有タンパク質、およびＫｕｎｉｔｚ型ドメイン含有タンパク質からなる群から選択され、標識化合物が、酵素、蛍光色素、発光色素、金属キレート複合体、および放射性同位体を含有する部分からなる群から選択される、態様２９から３５のいずれか一項に記載の複合体。

３７．態様２９から３６のいずれか一項に記載の複合体を合成する方法であって、
ａ）モノマーまたはその誘導体を提供するステップであって、モノマーが、アミノ基、カルボキシ基および少なくとも１つのヒドロキシル基を含むアミノ酸であり、アミノ基またはカルボキシ基が第１の保護基によって保護されており、少なくとも１つのヒドロキシル基または各ヒドロキシル基が第２の保護基によって保護されている、モノマーまたはその誘導体を提供するステップと、
ｂ）固相ペプチド合成のプロセスにおいてモノマーを使用し、第１の保護基および第２の保護基を切断し、式ＩＩＩ

の複合体であって、
式中、Ａは標識化合物を表し、Ｒは第２のスペーサーを表し、またはその逆であり、Ｒは分析物特異的結合剤に共有結合することができるか、または分析物特異的結合剤に共有結合され、
Ｘは、ＯＨ、またはｔ≧１、好ましくはｔ＝１、３、５もしくは７の（ＣＨＯＨ）_ｔ－ＣＨ_２ＯＨであり、
ｍは、１から８、好ましくは≧２、特に２から８の整数であり、
ｎは、２から２０、好ましくは５から２０の整数であり、
ｒは、整数であり、≧０、好ましくは０であり、ここで、Ｘ＝ＯＨの場合、ｒ≧１であり、
ｓは、整数であり、≧０、好ましくは０であり、
ｚは、整数であり、≧１である、
複合体を形成するステップと、
を含む、方法。

３８．第１および／または第２の保護基が、Ｆｍｏｃ、ｔＢｕ（ｔｅｒｔ－ブチル）ならびにエーテル、エステルおよび／またはアセタールの群から選択される、態様３７に記載の方法。

３９．モノマーまたはその誘導体が、以下の式ｍ－１からｍ－４から選択され、

式中、ＦｍｏｃＨＮは、９－フルオレニルメトキシカルボニル保護基によって保護されたアミンを意味する、態様３７またはから３８に記載の方法。

以下の実施例は、本明細書で特許請求される発明を例示するために提供されるのであって、限定するものではない。

実施例１
スキーム１．直鎖構成要素の合成。
アミノ酸（ＭＦ７６）は、市販の（－）－２，３－Ｏ－イソプロピリデン－Ｄ－エリスロノラクトン（ＭＦ７９）からＫａｍｉｙａら（Ｋａｍｉｙａ，Ｔ．；Ｓａｉｔｏ，Ｙ．；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｍ．；Ｓｅｋｉ，Ｈ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９７２，２８，８９９）の方法によって得られた。標準的なＭｅＣＮ－水性Ｎａ_２ＣＯ_３条件を用いたＦｍｏｃ－ＯＳｕによるその後のＦｍｏｃ保護は、構成要素ＭＦ７７を収率８１％で完成した。ＭＦ：Ｃ２２Ｈ２３ＮＯ６。ＭＷ：３９７．１５。物理的状態：白い固体。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、４００ＭＨｚ）：δ＝７．７７（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．６０（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．３７－７．４４（ｍ、２Ｈ）、７．３０－７．３６（ｍ、２Ｈ）、５．２２－５．３７（ｍ、１Ｈ）、４．６５（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．３６－４．５８（ｍ、３Ｈ）、４．１７－４．３１（ｍ、１Ｈ）、３．４５－３．５３（ｍ、２Ｈ）、１．６１（ｓ、３Ｈ）、１．４２（ｓ、３Ｈ）ｐｐｍ。ＨＰＬＣ－ＭＳ（ＴＥＡＡｃ（ｐＨ７．０）－ＭｅＣＮ、ＭｅＣＮの５％から１００％までの７分での勾配）ｍ／ｚ ３９６．２（［Ｍ－Ｈ］^－）；保持時間４．８分。

実施例２
スキーム２．分岐構成要素の合成。
Ｆｍｏｃ－Ｄ－グルコサミン酸（ＭＦ７３）。ＭｅＣＮ（５０ｍＬ）中のＦｍｏｃ－ＯＳｕ（３．２８ｇ、９．７４ｍｍｏｌ）を、Ｄ－グルコサミン酸（２．０ｇ、１０．２５ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（２．１７ｇ、２０．５０ｍｍｏｌ）の水（５０ｍＬ）中撹拌溶液に０℃で添加した。混合物は、白濁が形成される前に短時間透明になった。反応物を０℃で０．５時間、次いで、室温で１時間撹拌した。混合物をＨＣｌ（１．０Ｍ）の添加によってｐＨ８に調整し、次いで、真空中で濃縮した。残渣を水（－２００ｍＬ）に溶解し、ＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ）で抽出した。ＨＣｌ（１．０Ｍ）の添加によって水層をｐＨ２．０に調整し、ＥｔＯＡｃ（５×１５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濾過し、濃縮して、４．０ｇの所望の生成物を得た（収率９４％）。ＭＦ：Ｃ２１Ｈ２３ＮＯ８。ＭＷ：４１７．１４。物理的状態：白い固体。ＨＰＬＣ－ＭＳ（ＴＥＡＡｃ（ｐＨ７．０）－ＭｅＣＮ、ＭｅＣＮの５％から１００％までの７分での勾配）ｍ／ｚ ４１６．２（［Ｍ－Ｈ］－）；保持時間４．１分。

Ｆｍｏｃ－イソプロピリデン－Ｄ－グルコサミン酸（ＭＦ７４）。ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）中のＦｍｏｃ－Ｄ－グルコサミン酸ＭＦ７３（１．２２ｇ、２．９２ｍｍｏｌ）の撹拌懸濁液に、２，２－ジメトキシプロパン（２０ｍＬ）およびｐ－トルエンスルホン酸（０．１ｇ、０．５３ｍｍｏｌ）を添加した。１時間後、溶液をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で希釈し、ブライン（３×２５ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濃縮した。残渣をＮａ塩に変換し、これをフラッシュクロマトグラフィ（Ｃ－１８、Ｈ_２Ｏ－ＭｅＣＮ）によって精製すると、所望の生成物８４０ｍｇ（収率５８％）が得られた。ＭＦ：Ｃ２７Ｈ３１ＮＯ８。ＭＷ：４９７．２０。物理的状態：白い固体。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、４００ＭＨｚ）：δ＝７．７７（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．６２（ｄｄ，Ｊ＝８．２、８．０Ｈｚ、２Ｈ）、７．４１（ｄｄ，Ｊ＝７．５、７．４Ｈｚ、２Ｈ）、７．３２（ｄｄ，Ｊ＝７．４、７．３Ｈｚ、２Ｈ）、５．５９（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．７９（ｄ，Ｊ＝９．９Ｈｚ、１Ｈ）、４．４６－４．５５（ｍ、２Ｈ）、４．４１（ｄｄ，Ｊ＝１０．５、７．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．２６（ｄｄ，Ｊ＝７．０、６．９Ｈｚ、１Ｈ）、４．０９－４．２３（ｍ、２Ｈ）、４．０１（ｄｄ，Ｊ＝８．０、３．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．７２（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ、１Ｈ）、１．４４（ｓ、３Ｈ）、１．４３（ｓ、３Ｈ）、１．４０（ｓ、３Ｈ）、１．３６（ｓ、３Ｈ）ｐｐｍ。ＨＰＬＣ－ＭＳ（ＴＥＡＡｃ（ｐＨ７．０）－ＭｅＣＮ、ＭｅＣＮの５％から１００％までの７分での勾配）ｍ／ｚ ４９６．３（［Ｍ－Ｈ］－）；保持時間５．３分。

実施例３
実施例３は、拡張直鎖構成要素の合成を示す（スキーム３）。

スキーム３．拡張直鎖構成要素の合成。
化合物Ｓ７６３の合成
Ｄ－ガラクトノ－１，４－ラクトン（２．９４ｇ、１６．５ｍｍｏｌ）を２，２－ジメトキシプロパン（６０ｍＬ）およびアセトン（４．５ｍＬ）に懸濁し、その後、ｐ－トルエンスルホン酸一水和物（１．５９ｇ、８．３５ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を４０℃で７時間撹拌した。次いで、Ｎａ２ＣＯ３を添加することによって反応をクエンチし、懸濁液をセライトパッドで濾過し、溶媒を減圧下で除去した。次いで、残渣をジクロロメタンに溶解し、有機層を水で２回洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。最後に、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ＳｉＯ_２、ｎ－ヘキサン／ＥｔＯＡｃ １：１）によって精製すると、２．５９ｇの所望の生成物（５４％）^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、クロロホルム－ｄ）δｐｐｍ １．３６－１．４３（ｍ、９Ｈ）１．４６（ｓ、３Ｈ）３．６７－３．７５（ｍ、１Ｈ）３．７６－３．８０（ｍ、３Ｈ）３．８０－３．８７（ｍ、１Ｈ）３．９０－３．９６（ｍ、１Ｈ）４．０５－４．１２（ｍ、１Ｈ）４．３３－４．３９（ｍ、１Ｈ）４．５３－４．５７（ｍ、１Ｈ）７．２１－７．３７（ｍ、２Ｈ）が得られた。

化合物Ｓ７６９の合成
化合物Ｓ７６３（２．５９ｇ、８．９２ｍｍｏｌ）を３５ｍＬのドライピリジンに溶解し、氷浴で溶液を０℃に冷却した後、ＤＭＡＰ（１１５ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）を添加した。最後に、塩化メシル（８２８μＬ、１０．７１ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を０℃で１時間および室温でさらに時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をジクロロメタンに溶解した。次いで、有機相を水、ＮａＣｌ飽和溶液で洗浄し、次いで、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ＳｉＯ２、ｎ－ヘキサン：ＥｔＯＡｃ ７：３）によって精製して、２．９３ｇの所望の生成物（８９％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、クロロホルム－ｄ）δｐｐｍ １．４１－１．４８（ｍ、１２Ｈ）３．０９（ｓ、３Ｈ）３．８１（ｓ、３Ｈ）３．９４（ｔ，Ｊ＝７．５３Ｈｚ、１Ｈ）４．２４－４．３０（ｍ、２Ｈ）４．３０－４．４２（ｍ、２Ｈ）４．５０（ｄｄ，Ｊ＝１１．１０、２．７０Ｈｚ、１Ｈ）４．５６（ｄ，Ｊ＝５．４０Ｈｚ、１Ｈ）

化合物Ｓ７７１の合成
化合物Ｓ７６９（２．９３ｇ、７．９６１ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（２７ｍＬ）に溶解し、次いで、ＮａＮ_３（５６９ｍｇ、８．７５７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を８５℃で５時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をＨ_２ＯとＥｔＯＡｃの混合物に分配した。２相を分離した後、水層をＥｔＯＡｃで２回抽出し、合わせた有機層をＮａＣｌ飽和溶液で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して乾燥させた。最後に残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ＳｉＯ２、ｎ－ヘキサン：ＥｔＯａｃ ９：１）によって精製すると、生成物１．７４（６９％）が得られた。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、クロロホルム－ｄ）δｐｐｍ １．３５－１．５３（ｍ、１２Ｈ）３．３２（ｄｄ，Ｊ＝１３．１８、５．０２Ｈｚ、１Ｈ）３．６４（ｄｄ，Ｊ＝１３．１８、３．２６Ｈｚ、１Ｈ）３．７９－３．８０（ｍ、３Ｈ）３．９４（ｔ，Ｊ＝７．５０Ｈｚ、１Ｈ）４．１２－４．２０（ｍ、１Ｈ）４．３４（ｄｄ，Ｊ＝７．５３、５．２７Ｈｚ、１Ｈ）４．５５（ｄ，Ｊ＝５．２７Ｈｚ、１Ｈ）

化合物Ｓ７７５の合成
化合物Ｓ７７１（１．７４ｇ、５．５１８ｍｍｏｌ）を混合物１：２ ＴＨＦ／Ｈ_２Ｏ（１６０ｍＬ）に溶解し、その後、Ｂａ（ＯＨ）_２・８ Ｈ２Ｏ（２．８４ｇ、１６．５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１時間撹拌した。ＤＯＷＥＸ ５０ＷＸ２を添加し、その後、混合物を濾過した。最後に、濾液を真空中で乾燥させ、次のステップに直接使用した。

化合物Ｓ７７７の合成
化合物Ｓ７７５（１．３７ｇ、４．５４ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ ４：１混合物（２５ｍＬ）に溶解し、次いで、活性炭担持Ｐｄを添加した。次いで、フラスコを排気し、Ｈ_２雰囲気下にセットし、混合物をＨ_２を絶えず供給しながら室温で３時間激しく撹拌した。混合物をセライトパッドで濾過し、濾液を減圧下で濃縮し、真空中で乾燥させると、生成物１．２５ｍｇが得られ、これを以下のステップ（１００％）に直接使用した。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、メタノール－ｄ_４）δ ｐｐｍ １．４０－１．４６（ｍ、１２Ｈ）３．０６（ｄｄ，Ｊ＝１３．２０、８．８０Ｈｚ、１Ｈ）３．２４（ｄｄ，Ｊ＝１３．１０、２．９０Ｈｚ、１Ｈ）４．０１（ｄｄ，Ｊ＝７．９０、４．４０Ｈｚ、１Ｈ）４．２５（ｄ，Ｊ＝６．６０Ｈｚ、１Ｈ）４．２９－４．３８（ｍ、２Ｈ）

化合物Ｓ７７９の合成
化合物Ｓ７７７（１．１５ｇ、４．１７ｍｍｏｌ）をＨ_２Ｏ／アセトン１：１混合物（１００ｍＬ）に溶解し、その後、ＦｍｏｃＯＳｕ（２．２８ｇ、６．７５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。ＮａＨＣＯ_３（３５０ｍｇ、４．１８ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１時間撹拌した後、０．１Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨを約５単位に調整し、混合物をＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、減圧下で濃縮し、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ＳｉＯ_２、ｎ－ヘキサン：ＥｔＯＡｃ ２：３からＥｔＯＡｃ＋１％酢酸への勾配溶出）によって精製すると、所望の生成物１．５ｇ（７３％）が得られた。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、クロロホルム－ｄ）δｐｐｍ １．３４－１．５０（ｍ、１２Ｈ）３．４２－３．５６（ｍ、２Ｈ）３．７５－３．８４（ｍ、１Ｈ）４．０８－４．１６（ｍ、１Ｈ）４．１７－４．２４（ｍ、１Ｈ）４．２７－４．３５（ｍ、１Ｈ）４．３８－４．４８（ｍ、２Ｈ）４．５９（ｄ，Ｊ＝６．００Ｈｚ、１Ｈ）５．１５－５．２５（ｍ、１Ｈ）７．３０（ｔ，Ｊ＝７．５０Ｈｚ、２Ｈ）７．３９（ｔ，Ｊ＝７．４０Ｈｚ、２Ｈ）７．５８（ｄ，Ｊ＝７．４０Ｈｚ、２Ｈ）７．７５（ｄ，Ｊ＝７．６０Ｈｚ、２Ｈ）

実施例３ｂ
分枝ジオール誘導体の合成
スキーム４．誘導体１８の合成：ｉ）ＦｍｏｃＯＳｕ、Ｎａ_２ＣＯ３、Ｈ_２Ｏ／ＡＣＮ １：１、３時間；ｉｉ）ＡＤ－ミックスβ、Ｋ_２ＣＯ_３、Ｈ_２Ｏ／ｔｅｒｔ－ＢｕＯＨ １：１、７０時間；ｉｉｉ）２，２－ジメトキシプロパン、ｐ－ＴｓＯＨ、乾燥ＥｔＯＡｃ、４日。
化合物１６の合成
（Ｓ）－２－アミノブタ－３－エン酸塩酸塩（１５，７５０ｍｇ、５．４５ｍｍｏｌ）をＨ_２Ｏ／ＡＣＮ １：１混合物（５０ｍＬ）に溶解し、次いで、ＦｍｏｃＯＳｕ（１．８４ｇ、５．４５ｍｍｏｌ）およびＮａ_２ＣＯ_３（１．７３ｇ、１６．３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、有機溶媒を減圧下で蒸発させた後、水溶液を２Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨ≒１～２に酸性化した。次いで、得られた混合物をＥｔＯＡｃで５回抽出し、有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。生生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ＲＰ－Ｃ１８ＡＱ、２：３から３：２へのＨ_２Ｏ／ＡＣＮ勾配溶出）によって精製した。生成物を含有する画分をプールし、有機溶媒を減圧下で蒸発させた。形成された白色沈殿を濾別し、真空中で乾燥させると、Ｆｍｏｃ保護誘導体１６ １．５０ｇ（８５％）が得られた。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、クロロホルム－ｄ）δｐｐｍ ４．１８－４．５６（ｍ、３Ｈ）４．６０－５．５５（ｍ、４Ｈ）５．７６－６．０６（ｍ、１Ｈ）７．２８－７．３６（ｍ、２Ｈ）７．３７－７．４５（ｍ、２Ｈ）７．５１－７．６５（ｍ、２Ｈ）７．７２－７．８４（ｍ、２Ｈ）

化合物１７の合成
Ｆｍｏｃ－ビニルグリシン１６（１．４８ｇ、４．５９ｍｍｏｌ）をｔｅｒｔ－ＢｕＯＨ／Ｈ_２Ｏ １：１混合物（３０ｍＬ）に溶解し、その後、ＡＤ－ミックスβ（６．８８ｇ）およびＫ_２ＣＯ_３（６３４ｍｇ、４．５９ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で２４時間撹拌した。Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３（３ｇ）を添加し、室温で１５分間撹拌した後、６Ｎ ＨＣｌを用いて混合物をｐＨ１～２に酸性化し、次いで、ＥｔＯＡｃで５回抽出した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ＲＰ－Ｃ１８ＡＱ、Ｈ_２Ｏ／ＡＣＮ勾配溶出１：２から１：１）によって精製すると、ジオール誘導体１７（６３％）１．０３ｇが得られた。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、アセトン）δｐｐｍ ３．５２－３．６４（ｍ、２Ｈ）３．６７－３．８２（ｍ、１Ｈ）４．２０－４．５１（ｍ、５Ｈ）４．５２－４．６３（ｍ、１Ｈ）６．２３－６．４２（ｍ、１Ｈ）７．２９－７．３６（ｍ、２Ｈ）７．３７－７．４５（ｍ、２Ｈ）７．６９－７．７９（ｍ、２Ｈ）７．８２－７．８９（ｍ、２Ｈ）。

化合物１８の合成
化合物１４（１．０２ｇ、２．８５ｍｍｏｌ）を乾燥ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）および２，２－ジメトキシプロパン（３４ｍＬ、２７６．５ｍｍｏｌ）に溶解した。ｐ－トルエンスルホン酸（５４．２ｍｇ、０．２８５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で４日間撹拌した。２０ｍＬの５％ ＮａＨＣＯ_３溶液を添加することによって反応を停止させ、次いで、有機溶媒を減圧下で蒸発させた。クロマトグラフィ分離のために水相を直接注入した（ＲＰ－Ｃ１８ＡＱ、Ｈ_２Ｏ／ＡＣＮ勾配溶出９：１から７：３）。生成物を含有する画分をプールし、有機溶媒を減圧下で除去した。残りの水相を氷浴中で冷却した後、対応するカルボン酸を沈殿させながら２Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨを約１～２に調整した。得られた懸濁液をＥｔＯＡｃで２回抽出し、合わせた有機層をＮａＣｌ飽和溶液で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濃縮して乾燥させ、９００ｍｇの生成物（８０％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、クロロホルム－ｄ）δｐｐｍ １．２４－１．５４（ｍ、６Ｈ）３．６９－３．９２（ｍ、１Ｈ）４．０４－４．３１（ｍ、２Ｈ）４．３２－４．５４（ｍ、３Ｈ）４．５４－４．７１（ｍ、１Ｈ）５．３７－５．５３（ｍ、１Ｈ）７．２６－７．３４（ｍ、２Ｈ）７．３４－７．４５（ｍ、２Ｈ）７．４８－７．６４（ｍ、２Ｈ）７．７５（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）。

実施例４
ペプチド合成
ペプチドは、マルチペプチドシンセサイザー、例えばＭｕｌｔｉｓｙｎｔｅｃｈからのフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相ペプチド合成によって合成した。このために、４．０当量の各アミノ酸誘導体を使用した。アミノ酸誘導体を、１当量の１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾールを含むＮ－メチルピロリドンに溶解した。ペプチドをＴｅｎｔａｇｅｌ Ｒ樹脂上で合成した。結合反応は、反応媒体としてのジメチルホルムアミド中で、樹脂充填に対して４当量のＨＡＴＵおよび８当量のＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を用いて５分間行った。ジメチルホルムアミド中２５％ピペリジンを使用して、各合成ステップ後８分でＦｍｏｃ基を切断した。樹脂を２％ヒドラジンのＤＭＦ溶液で２×３０分間処理してｉｖＤｄｅ保護リジンを遊離させた。その後、６－マレイミドヘキサン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（１０当量）およびＤＩＰＥＡ（１０当量）を樹脂に添加し、１時間インキュベートした後、ＤＭＦで３回洗浄した。合成樹脂からのペプチドの放出および酸不安定性保護基の切断は、トリフルオロ酢酸、トリイソプロピルシランおよび水（３８：１：１）を含有するカクテルを用いて室温で３時間で達成された。その後、反応溶液を冷却したジイソプロピルエーテルと混合してペプチドを沈殿させた。沈殿物を濾過し、冷ジイソプロピルエーテルで再度洗い流し、少量の酢酸水溶液に溶解し、凍結乾燥した。得られた粗物質を、０．１％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル／水の勾配を用いた分取ＲＰ－ＨＰＬＣによって精製した。

精製された物質の同一性を、イオンスプレー質量分析法によって確認した。
ＢＰＲｕ－（ＭＦ７４）５－Ｋ（ＭＨ）アミド
配列：ＢＰＲｕ－ＭＦ７４－ＭＦ７４－ＭＦ７４－ＭＦ７４－ＭＦ７４－Ｌｙｓ（ＭＨ）－ＮＨ２
特殊アミノ酸誘導体：
ＢＰＲｕ：ルテニウム（ビピリジル）３カルボン酸
Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）
ＥＳＩ－ＭＳ_ｃａｌｃ：Ｍ^＋＝１８７６Ｄａ；ＥＳＩ－ＭＳ_ｅｘｐ：［Ｍ＋２Ｈ］^２＋＝９３７Ｄａ
ＢＰＲｕ－（ＭＦ７７）５－Ｋ（ＭＨ）アミド
配列：ＢＰＲｕ－ＭＦ７７－ＭＦ７７－ＭＦ７７－ＭＦ７７－ＭＦ７７－Ｌｙｓ（ＭＨ）－ＮＨ２
特殊アミノ酸誘導体：
ＢＰＲｕ：ルテニウム（ビピリジル）３カルボン酸
Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）
ＥＳＩ－ＭＳ_ｃａｌｃ：Ｍ＋＝１５７６Ｄａ；ＥＳＩ－ＭＳ_ｅｘｐ：［Ｍ＋２Ｈ］^２＋＝７８９Ｄａ
ＢＰＲｕ－（ＭＦ７７）１０－Ｋ（ＭＨ）アミド
配列：ＢＰＲｕ－ＭＦ７７－ＭＦ７７－ＭＦ７７－ＭＦ７７－ＭＦ７７－ＭＦ７７－ＭＦ７７－ＭＦ７７－ＭＦ７７－ＭＦ７７－Ｌｙｓ（ＭＨ）－ＮＨ２
特殊アミノ酸誘導体：
ＢＰＲｕ：ルテニウム（ビピリジル）３カルボン酸
Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）
ＥＳＩ－ＭＳ_ｃａｌｃ：Ｍ＋＝２１６１Ｄａ；ＥＳＩ－ＭＳ_ｅｘｐ：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋＝７２１Ｄａ
ＢＰＲｕ－（Ｓ７７９）５－Ｋ（ＭＨ）アミド
配列：ＢＰＲｕ－Ｓ７７９－Ｓ７７９－Ｓ７７９－Ｓ７７９－Ｓ７７９－Ｌｙｓ（ＭＨ）－ＮＨ２
特殊アミノ酸誘導体：
ＢＰＲｕ：ルテニウム（ビピリジル）３カルボン酸
Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）
ＥＳＩ－ＭＳ_ｃａｌｃ：Ｍ＋＝１８７６Ｄａ；ＥＳＩ－ＭＳ_ｅｘｐ：［Ｍ＋２Ｈ］^２＋＝９３９Ｄａ
ＢＰＲｕ－（ＦＡ３６）５－Ｋ（ＭＨ）アミド
配列：ＢＰＲｕ－ＦＡ３６－ＦＡ３６－ＦＡ３６－ＦＡ３６－ＦＡ３６－Ｌｙｓ（ＭＨ）－ＮＨ２
特殊アミノ酸誘導体：
ＢＰＲｕ：ルテニウム（ビピリジル）３カルボン酸
Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）
ＥＳＩ－ＭＳ_ｃａｌｃ：Ｍ＋＝１５７６Ｄａ；ＥＳＩ－ＭＳ_ｅｘｐ：［Ｍ＋２Ｈ］^２＋＝７８８Ｄａ
ＢＰＲｕ－（ＦＡ３６）５－Ｋ（ＭＨ）アミド
配列：ＢＰＲｕ－ＦＡ３６－ＦＡ３６－ＦＡ３６－ＦＡ３６－ＦＡ３６－ＦＡ３６－ＦＡ３６－ＦＡ３６－ＦＡ３６－ＦＡ３６－Ｌｙｓ（ＭＨ）－ＮＨ２
特殊アミノ酸誘導体：
ＢＰＲｕ：ルテニウム（ビピリジル）３カルボン酸
Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）
ＥＳＩ－ＭＳ_ｃａｌｃ：Ｍ＋＝１９３５Ｄａ；ＥＳＩ－ＭＳ_ｅｘｐ：［Ｍ＋２Ｈ］^２＋＝９６８Ｄａ
略語：
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＭＨ：マレイミドヘキサノイル

ＢＰＲｕ－（ＭＦ７４）５－Ｋ（ＭＨ）アミドおよびＢＰＲｕ－（ＭＦ７４）５－Ｋ（ＭＨ）－ＮＨ２は、本明細書および本開示の内容において交換可能に使用され得る。ＢＰＲｕ－（ＭＦ７７）５－Ｋ（ＭＨ）アミドおよびＢＰＲｕ－（ＭＦ７７）５－Ｋ（ＭＨ）－ＮＨ２は、本明細書および本開示の内容において交換可能に使用され得る。ＢＰＲｕ－（ＭＦ７７）１０－Ｋ（ＭＨ）アミドおよびＢＰＲｕ－（ＭＦ７７）１０－Ｋ（ＭＨ）－ＮＨ２は、本明細書および本開示の内容において交換可能に使用され得る。

Ｉｒリンカー－ＭＦ７７コンジュゲーションの一般プロトコル：
ステップ１、Ｉｒ結合：
１０ｍＬフラッシュにおいて、ポリオールリンカーＮ°（ｎ＝１０、６．６ｍｇ、４．３４μｍｏｌ）を１ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶解した。ＤＩＰＥＡ（２．８ｍｇ、２１．７μｍｏｌ）およびＩｒ３＋－ＮＨＳエステル（Ｃｓ＋塩、１０．５ｍｇ、５．２０μｍｏｌ、１ｍＬのＤＭＦに溶解）を添加した。反応物を室温で４時間反応させた。その後、溶媒を蒸発させ、赤色固体を２ｍＬのＨ_２Ｏに溶解し、生成物をＨＰＬＣ－分取Ｃ１８、１０ｍＬ／分、１回の注入によって精製した：
方法：
０分：９８％ Ｈ_２Ｏ、２％ ＣＨ_３ＣＮ；
０～１０分：９８％ Ｈ_２Ｏ、２％ ＣＨ_３ＣＮ；
１０～６０分：７０％ Ｈ_２Ｏ；３０％ ＣＨ_３ＣＮ；
６０～９０分：２０％ Ｈ_２Ｏ；８０％ ＣＨ_３ＣＮ；

ステップ２、脱保護：
合わせた分画８．８ｍｇをＤＭＦ中５％ヒドラジン溶液４ｍＬに溶解し、反応物を室温で２時間反応させた。その後、溶媒を蒸発させ、赤色固体を２ｍＬのＨ_２Ｏおよび１０当量に溶解し、Ｃｓ_２ＣＯ_３を添加した。生成物をＨＰＬＣ－分取Ｃ１８によって精製すると、生成物７．４ｍｇが得られた。

ステップ３、マレイミド結合：
１０ｍＬフラッシュ中で、ステップ２の生成物（７．４ｍｇ、２．８１μｍｏｌ）を２ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶解し、ＤＩＰＥＡ（１．８ｍｇ、１４．０４μｍｏｌ）およびマレイミド－ＮＨＳエステル（７．５ｍｇ、２８．０７μｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で４時間反応させた。その後、赤色溶液を乾燥させ、赤色固体をエッペンドルフに移した０．２ｍＬのＣＨＣｌ_３に溶解させ、０．８のＥｔ_２Ｏで沈殿させ、固体を遠心分離によって分離した。固体を同じ方法で４回洗浄することによって精製し、０．２ｍＬのＣＨＣｌ_３に溶解し、０．８のＥｔ_２Ｏで沈殿させた。その後、固体を真空乾燥して、４．９ｍｇの赤色固体生成物Ｎ°を得た。

Ｉｒ３＋－（ＭＦ７７）１０－Ｋ（マレイミド）アミド
配列：Ｉｒ３＋－ＭＦ７７－ＭＦ７７－ＭＦ７７－ＭＦ７７－ＭＦ７７－ＭＦ７７－ＭＦ７７－ＭＦ７７－ＭＦ７７－ＭＦ７７－Ｌｙｓ（マレイミド）－ＮＨ２
ＥＳＩ－ＭＳ_ｃａｌｃ：Ｍ＋＝２８４４Ｄａ；ＥＳＩ－ＭＳ_ｅｘｐ：［Ｍ＋２Ｈ］^２＋＝１４２３Ｄａ
ポリオール前駆体：（ＭＦ７７）１０－Ｋ（ｉｖＤｄｅ）アミド
配列：ＭＦ７７－ＭＦ７７－ＭＦ７７－ＭＦ７７－ＭＦ７７－Ｋ（ｉｖＤｄｅ）－ＮＨ２
ＥＳＩ－ＭＳ_ｃａｌｃ：Ｍ＋＝１５２２Ｄａ；ＥＳＩ－ＭＳ_ｅｘｐ：［Ｍ＋２Ｈ］^２＋＝７６２Ｄａ
Ｉｒ３＋－（ＭＦ７７）５－Ｋ（マレイミド）アミド
配列：Ｉｒ３＋－ＭＦ７７－ＭＦ７７－ＭＦ７７－ＭＦ７７－ＭＦ７７－Ｌｙｓ（マレイミド）－ＮＨ２
ＥＳＩ－ＭＳ_ｃａｌｃ：Ｍ＋＝２２５９Ｄａ；ＥＳＩ－ＭＳ_ｅｘｐ：［Ｍ＋２Ｈ］^２＋＝１１３０Ｄａ
ポリオール前駆体：（ＭＦ７７）５－Ｋ（ｉｖＤｄｅ）アミド
配列：ＭＦ７７－ＭＦ７７－ＭＦ７７－ＭＦ７７－ＭＦ７７－Ｋ（ｉｖＤｄｅ）－ＮＨ２
ＥＳＩ－ＭＳ_ｃａｌｃ：Ｍ＋＝９３７Ｄａ；ＥＳＩ－ＭＳ_ｅｘｐ：［Ｍ＋２Ｈ］^２＋＝４６９Ｄａ

実施例６
部位特異的抗体コンジュゲート
それぞれ、Ｂｈａｋｔａ Ｓ．ら、２０１３（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＴＨＩＯＭＡＢｓ ｆｏｒ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｉｏｌ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｌｉｎｋｅｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ）に記載されているプロトコルにしたがって、Ｅｌｅｃｓｙｓ抗トロポニンＴクローン５Ｄ８由来のＴｈｉｏＭａｂ変異体を、位置Ａ１１４Ｃおよび位置Ｓ３７４Ｃで異なるルテニウム標識（異なるリンカーを有する）とコンジュゲートした。次いで、これらのコンジュゲートを使用して、異なる濃度の元のＲ２試薬（検出試薬）を置き換えるＲｏｃｈｅ Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔ ｈｓ Ｅｌｅｃｓｙｓアッセイ（Ｉｄ．０５０９２７４４１９０、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）を行った。

標識の非部位特異的コンジュゲーション（ＳＡＴＰ－マレイミド）
Ｅｌｅｃｓｙｓ高感度トロポニン－Ｔ（ＨＳ Ｔｎ－Ｔ）クローン５Ｄ８を、多様なポリオールリンカーを含む新たに合成したマレイミド－Ｒｕ（ルテニウム）複合体のコンジュゲーションおよびＥＬＣ（電気化学発光）性能評価に使用した。官能化抗体を生成するために、Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオプロピオネート（ＳＡＴＰ）と１：５の化学量論（ＩｇＧ：ＳＡＴＰ）でコンジュゲートすることによってチオール官能性をＩｇＧに導入して、ＭＡＢ＜Ｔｎ－Ｔ＞ｃｈｉｍ－５Ｄ８－ＩｇＧ－ＳＡＴＰ（１：５）を生成した。ヒドロキシルアミン処理によって硫黄からのアセチル保護を除去して、最終スルフヒドリル含有抗体を得た。次いで、このＳＨ抗体を、５％ ＤＭＳＯを含む５０ｍＭ ＫＰＰ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４中のマレイモドポリオール－ルテニウム標識とコンジュゲートした。

実施例７
Ｅｌｅｃｓｙｓの性能
全てのアッセイ変異体は、トロポニンＴアッセイ仕様を使用して、ブランク対照とともにトロポニンＴ ｈｓアッセイプロトコルを使用してＣｏｂａｓ Ｅ１７０モジュールで実行された（希釈剤マルチアッセイ、Ｉｄ．１１７３２２７７１２２、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ、トロポニンＴ ｈｓ ＣａｌＳｅｔからのＣａｌ１およびＣａｌ２（Ｉｄ．０５０９２７５２１９０、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）。ＰＥＧおよびポリオール系リンカーの取り込み速度は同様である（取り込み速度を参照）。新たなポリオールリンカーＦＡ４１は、低（Ｃａｌ１／ＭＡ）および高範囲（Ｃａｌ２／ＭＡ）のＴｎＴ分析物において同等の信号対雑音比を示し、前世代のポリオール（ＭＦ７４）よりもリンカー安定性が著しく改善されている。ＭＡ：血清ブランク；Ｃａｌ１：１８ｎｇ／Ｌ；Ｃａｌ２：４２００ｎｇ／Ｌ。

次いで、これらのコンジュゲートを、２．５μｇ／ｍｌ濃度の元のＲ２試薬を置き換えるトロポニンＴ ｈｓ Ｅｌｅｃｓｙｓアッセイ変異体（Ｉｄ．０５０９２７４４１９０、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）で使用した。ＴｎＴ Ｒ２緩衝液中４℃でコンジュゲートを１週間インキュベートした後、最初のＥＣＬ測定を行った。

分岐ポリオールリンカー（ＭＦ７４基）は、ＰＥＧ２３およびリンカーなし（ＢＰＲｕ－ＭＥＡ）と比較して、雑音に対するより良好な信号を与える（Ｃａｌ１／ＭＡおよびＣａｌ２／ＭＡ）。

図１は、Ｅｌｅｃｓｙｓ ＥＣＬ技術の原理および可能なＥｌｅｃｓｙｓ抗体検査の機能を示している。ＥＣＬ（電気化学発光、結合抗原－抗体複合体を有する１つの磁化可能微粒子、２つの非結合コンジュゲート、３つの流路、４つの磁石、５つの例えばビオチン化抗体、６つの例えばストレプトアビジン被覆磁気ビーズ）は、イムノアッセイ検出のためのＲｏｃｈｅの技術である。この技術に基づいて、十分に設計された特異的且つ高感度のイムノアッセイと組み合わせて、Ｅｌｅｃｓｙｓは信頼できる結果をもたらす。ＥＣＬイムノアッセイの開発は、ルテニウム複合体およびトリプロピルアミン（ＴＰＡ）の使用に基づくことができる。反応複合体を検出するための化学発光反応は、試料溶液に電圧を印加することによって開始され、正確に制御された反応をもたらす。ＥＣＬ技術は、優れた性能を提供しながら、多くの免疫測定原理に適応することができる。

表２は、ＢＰＲｕ－（ＭＦ７７）_５Ｋ（ＭＨ）アミド、ＢＰＲｕ－（Ｓ７７９）_５－ＭＨおよびＢＰＲｕ－（ＭＦ７４）_５Ｋ（ＭＨ）アミドが、ＲＰ ＨＰＬＣ（水／アセトニトリル＋０．１％ ＴＦＡ）において６．８５分、６．７５分および６．７２分の同様の保持時間を有することを示す。対応するＰＥＧ結合化合物は、９．７３分の保持時間を有する。

図２は、本発明の方法を使用することによる、ならびにＰＥＧ－リンカーありおよびリンカーなしの比較方法を使用することによる、Ｅｌｅｃｓｙｓ Ｅ１７０：トロポニンＴ ｈｓアッセイ（ブランク値）の結果をそれぞれ示している。取り込み速度の関数としてのマルチアッセイ（ＭＡ）希釈剤カウントが示されている。取り込み速度は、ここでは抗体あたりのＥＣＬ標識の平均数を意味する。マルチアッセイ希釈剤は、ブランクおよび２．５μｇ／ｍＬコンジュゲートを含む。コンジュゲートおよび複合体という用語は、本開示全体において交換可能に使用され得る。コンジュゲーション手順は、例えば実施例６に記載されている。

図３および図４は、本発明の方法を使用することによる、ならびにＰＥＧ－リンカーありおよびリンカーなしの比較方法を使用することによる、Ｅｌｅｃｓｙｓ Ｅ１７０：トロポニンＴ ｈｓアッセイの結果をそれぞれ示している。標識取り込み速度の関数として、Ｃａｌ１カウント／マルチアッセイ（ＭＡ）希釈剤カウントおよびＣａｌ２カウント／マルチアッセイ（ＭＡ）希釈剤カウントが示されている。標識取り込み速度は、ここでは抗体あたりのＥＣＬ標識の平均数を意味する。Ｃａｌ１／マルチアッセイ希釈剤およびＣａｌ２／マルチアッセイ希釈剤は、前洗浄ステップを含まず、２．５μｇ／ｍＬのコンジュゲートを含む。

本特許出願は、欧州特許出願２０２１６２６７．３号の優先権を主張し、この欧州特許出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (15)

1. 試料中の目的の分析物を検出するための方法であって、
   ａ）前記目的の分析物を含む前記試料を提供するステップと、
   ｂ）リンカーを含む複合体を提供するステップであって、前記リンカーが、標識化合物および分析物特異的結合剤に共有結合し、前記標識化合物が、検出可能な信号、好ましくは化学発光ベースの信号を生成することができる、複合体を提供するステップと、
   ｃ）ステップａ）の前記試料をステップｂ）の前記複合体と結合させるステップと、
   ｄ）前記標識化合物の前記検出可能な信号を使用することによって前記目的の分析物を検出するステップと、を含み、
   前記複合体が式Ｉ：
   の化合物であり、
   式中、Ａは前記標識化合物を表し、Ｂは前記分析物特異的結合剤を表し、またはその逆であり、
   Ｘは、ＯＨ、またはｔ≧１、好ましくはｔ＝１、３、５もしくは７の（ＣＨＯＨ）_ｔ－ＣＨ_２ＯＨであり、
   ｍは、１から８、好ましくは≧２の整数であり、
   ｎは、２から２０、好ましくは５から２０の整数であり、
   ｒは、整数であり、≧０、好ましくは０であり、ここで、Ｘ＝ＯＨの場合、ｒ≧１であり、
   ｓは、整数であり、≧０、好ましくは０であり、
   ｚは、整数であり、≧１である、方法。
2. 前記複合体が式ＩＩ：
   

   

   の化合物であり、
   式中、Ａ、Ｂ、ｍおよびｎのそれぞれは、請求項１において述べたものと同じ意味を有し、
   式中、Ｘは、ｔ≧１、好ましくはｔ＝１、３、５または７の（ＣＨＯＨ）_ｔ－ＣＨ_２ＯＨである、請求項１に記載の方法。
3. 前記複合体が式ＩＩＩ：
   

   

   の化合物であり、
   式中、Ａ、Ｂ、ｍおよびｎのそれぞれは、請求項１において述べたものと同じ意味を有し、
   式中、ＸはＯＨであり、ｒ≧１であり、好ましくはｒ＝１である、請求項１に記載の方法。
4. ＸがＯＨであり、および／またはｍが２もしくは４もしくは６である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. Ｘがｔ＝１、３、５または７の（ＣＨＯＨ）_ｔ－ＣＨ_２ＯＨである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記標識化合物が、第１のコンジュゲーション法によって前記リンカーに共有結合され、前記第１のコンジュゲーション法が、クリックケミストリー、アミド、エステル、イミド、炭酸塩、カルバミン酸塩、スクアレート、チアゾール、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキシム、ジヒドロピリダジン、チオール・マレイミド、付加環化、フォトクリック、シュタウディンガーライゲーション、ディールス・アルダー、テトラジンライゲーション、クロスカップリング、ピクテ・スペングラー、クアドリシクランの群から選択され、
   および／または
   前記分析物特異的結合剤が、抗体、抗体の分析物特異的フラグメントおよび／または誘導体、アプタマー、シュピーゲルマー、ダルピン、レクチン、アンキリンリピート含有タンパク質、およびＫｕｎｉｔｚ型ドメイン含有タンパク質からなる群から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記複合体が式ＩＶ－１：
   

   

   の化合物であり、
   式中、ｎは１よりも大きく、好ましくは１≦ｎ≦１５であり、例えば、ｎ＝１０である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記複合体が式ＶまたはＶＩ：
   の化合物であり、
   式中、式ＶまたはＶＩのｎは、互いに独立して、１よりも大きく、好ましくは１≦ｎ≦１５であり、例えば、ｎ＝１０である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. ステップｂ）がペプチドベースの合成、好ましくは固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記試料中の前記目的の分析物を検出するための、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法の使用。
11. 試料中の目的の分析物の検出を実行するためのキットであって、別個の容器に、
    ａ）前記分析物を固定可能な固相と、
    ｂ）式Ｉ：
    

    

    の化合物であって、
    式中、Ａは標識化合物を表し、Ｂは分析物特異的結合剤を表し、またはその逆であり、
    Ｘは、ＯＨ、またはｔ≧１、好ましくはｔ＝１、３、５もしくは７の（ＣＨＯＨ）_ｔ－ＣＨ_２ＯＨであり、
    ｍは、１から８、好ましくは≧２の整数であり、
    ｎは、２から２０、好ましくは５から２０の整数であり、
    ｒは、整数であり、≧０、好ましくは０であり、ここで、Ｘ＝ＯＨの場合、ｒ≧１であり、
    ｓは、整数であり、≧０、好ましくは０であり、
    ｚは、整数であり、≧１である、
    化合物と、を含む、キット。
12. 前記試料中の前記目的の分析物を検出するための、請求項１１に記載のキットの使用。
13. 式Ｉ：
    

    

    の複合体であって、
    式中、Ａは標識化合物を表し、Ｂは分析物特異的結合剤を表し、またはその逆であり、
    Ｘは、ＯＨ、またはｔ≧１、好ましくはｔ＝１、３、５もしくは７の（ＣＨＯＨ）_ｔ－ＣＨ_２ＯＨであり、
    ｍは、１から８、好ましくは≧２の整数であり、
    ｎは、２から２０、好ましくは５から２０の整数であり、
    ｒは、整数であり、≧０、好ましくは０であり、ここで、Ｘ＝ＯＨの場合、ｒ≧１であり、
    ｓは、整数であり、≧０、好ましくは０であり、
    ｚは、整数であり、≧１であり、
    好ましくは、前記化合物が、試料中の目的の分析物を検出するのに適している、複合体。
14. 請求項１３に記載の複合体を合成する方法であって、
    ａ）モノマーまたはその誘導体を提供するステップであって、前記モノマーが、アミノ基、カルボキシ基および少なくとも１つのヒドロキシル基を含むアミノ酸であり、前記アミノ基または前記カルボキシ基が第１の保護基によって保護されており、前記少なくとも１つのヒドロキシル基または各ヒドロキシル基が第２の保護基によって保護されている、モノマーまたはその誘導体を提供するステップと、
    ｂ）固相ペプチド合成のプロセスにおいて前記モノマーを使用し、前記第１の保護基および第２の保護基を切断し、式ＩＩＩ：
    

    

    の複合体であって、
    式中、Ａは前記標識化合物を表し、Ｒは第２のスペーサーを表し、またはその逆であり、Ｒは分析物特異的結合剤に共有結合することができるか、または分析物特異的結合剤に共有結合され、
    Ｘは、ＯＨ、またはｔ≧１、好ましくはｔ＝１、３、５もしくは７の（ＣＨＯＨ）_ｔ－ＣＨ_２ＯＨであり、
    ｍは、１から８、好ましくは≧２の整数であり、
    ｎは、２から２０、好ましくは５から２０の整数であり、
    ｒは、整数であり、≧０、好ましくは０であり、ここで、Ｘ＝ＯＨの場合、ｒ≧１であり、
    ｓは、整数であり、≧０、好ましくは０であり、
    ｚは、整数であり、≧１である、
    複合体を形成するステップと、
    を含む、方法。
15. モノマーまたはその誘導体が、以下の式ｍ－１からｍ－４から選択され、
    

    

    式中、ＦｍｏｃＨＮは、９－フルオレニルメトキシカルボニル保護基によって保護されたアミンを意味する、請求項１４に記載の方法。