ES2800164T3 - Medios y métodos para la funcionalización específica de sitio de polipéptidos - Google Patents

Abstract

Método para la producción de un polipéptido que comprende (a) introducir o añadir en el extremo C-terminal de un polipéptido una secuencia de reconocimiento para tubulina-tirosina ligasa; (b) poner en contacto el polipéptido obtenido en la etapa (a) en presencia de tubulina-tirosina ligasa y un derivado de tirosina en condiciones adecuadas para que la tubulina-tirosina ligasa someta a tirosinación dicho polipéptido con dicho derivado de tirosina.

Description

DESCRIPCIÓN

Medios y métodos para la funcionalización específica de sitio de polipéptidos

Antecedentes

La modificación por ingeniería genética de proteínas se ha convertido en una herramienta ampliamente usada en muchas áreas de la bioquímica de proteínas. Por ejemplo, las etiquetas de fusión de proteínas son herramientas indispensables usadas para mejorar los rendimientos de expresión de proteínas recombinantes, permitir la purificación de proteínas y acelerar la caracterización de la estructura y función de las proteínas. Las etiquetas que potencian la solubilidad, los epítopos modificados por ingeniería genética y las endoproteasas recombinantes han dado como resultado una variedad versátil de elementos combinatorios que facilitan la detección y purificación de proteínas. Sin embargo, las modificaciones de proteínas también son importantes para estudiar relaciones estructurales y funcionales.

En lugar del marcaje aleatorio de aminoácidos, tales como residuos de lisina, se han desarrollado métodos para proteínas de marcaje específicas (de secuencia). Junto a las modificaciones químicas, se han aplicado herramientas para integrar nuevos grupos químicos para reacciones/modificaciones bioortogonales o modificaciones quimioselectivas. Alternativamente, las proteínas también pueden modificarse selectivamente mediante enzimas. Al modificar los aminoácidos existentes o al introducir aminoácidos no naturales, las proteínas pueden manipularse a nivel de aminoácido individual. En la última década, se han notificado varios métodos que implican la modificación específica de sitio de proteínas. Esto permite el control espacial y temporal de las proteínas in vivo, así como el seguimiento de una molécula individual. Las modificaciones se introducen durante la traducción de proteínas, como modificación postraduccional, o químicamente, después del aislamiento de proteínas.

Después de la traducción, casi todas las proteínas requieren modificaciones postraduccionales (PTM) antes de madurar. La oxidación de cisteínas es una PTM común y es importante para el plegamiento y la estabilidad de las proteínas. Otras PTM aumentan la diversidad funcional de las proteínas mediante la modificación de aminoácidos, incluyendo fosforilación, glicosilación, ubiquitinación, nitrosilación, metilación, acetilación e isomerización cis-trans de prolina. Las PTM enzimáticas específicas de sitio son de particular interés ya que pueden usarse para manipular y/o estudiar proteínas.

Ejemplos de PTM son modificaciones asociadas a la membrana facilitadas por farnesil y N-miristoiltransferasas. En otro enfoque, se usa la enzima generadora de formilglicina (FGE) nativa para introducir formilglicina tanto en procariotas como en eucariotas. La proteína etiquetada con aldehído puede funcionalizarse fácilmente con biomoléculas funcionalizadas con aminooxilo o hidrazida. Además de la modificación de otras proteínas, pueden usarse algunas enzimas para la automodificación, tales como O6-alquilguanina-ADN-alquil-transferasa humana (hAGT), cutinasa y haloalcano-deshalogenasa.

Una clase sencilla de enzimas para modificar proteínas después de la traducción son las ligasas. Se demostró que la biotina ligasa (BirA) acepta también un isóstero de cetona de biotina como cofactor. Se demostró el ligamiento de este análogo de biotina a proteínas que portan el péptido aceptor de 15 aminoácidos (AP) in vitro e in vivo, seguido de la posterior conjugación cetona-hidrazina. En segundo lugar, se usó la ligasa de ácido lipoico (LplA) microbiana para unir específicamente una alquil azida en proteínas con un péptido aceptor de LplA (LAP) modificado por ingeniería genética. Otra ligasa es el sistema de ligamiento de proteínas basado en inteína. Un requisito previo para este método de ligamiento mediado por inteína es que la proteína diana se expresa como una fusión plegada correctamente con la inteína, lo que puede ser un desafío.

Otro conjunto de modificaciones postraduccionales se realiza mediante fosfopanteteinil transferasas (PPTasas). Las PPTasas transfieren un grupo fosfopanteteinilo (P-pant) a través de un enlace fosfodiéster a dominios de proteína transportadora de peptidilo/acilo (PCP/ACP). Estos dominios de normalmente 80-120 residuos de longitud están presentes en las sintetasas peptídicas no ribosómicas (NRPS), las policétido sintasas (PKS) y las sintasas de ácidos grasos (FAS). Curiosamente, se demostró el marcaje fluorescente ortogonal de los receptores de la superficie celular usando las etiquetas de péptidos selectivos Sfp y AcpS para PPTasas.

En lugar de explorar el espacio químico en el que las biomoléculas pueden modificarse mediante grupos funcionales y posteriormente incorporarse en proteínas de interés, algunas modificaciones enzimáticas generales aplicables preexisten en la naturaleza. La transpeptidación, por ejemplo, que se cataliza por sortasas, una transpeptidasa de Staphylococcus aureus, se ha convertido en un método general para derivatizar proteínas con diversos tipos de modificaciones. Para las modificaciones mediante sortasa convencionales, las proteínas diana se modifican por ingeniería genética para contener un motivo de reconocimiento de sortasa (LPXT) cercano a sus extremos C-terminales. Cuando se incuban con péptidos sintéticos que contienen uno o más residuos de glicina N-terminales y una sortasa recombinante, estos sustratos de sortasa artificiales experimentan una reacción de transacilación que da como resultado el intercambio de residuos C-terminales por el residuo de treonina con el péptido de oligoglicina sintético, dando como resultado que el extremo C-terminal de la proteína se ligue al extremo N-terminal del péptido sintético (documento WO 2013/003555).

Otras técnicas para la modificación por ingeniería genética de proteínas se basan en el ligamiento quimioselectivo y la incorporación de residuos de aminoácidos modificados que pueden servir como conexión conjunta para la adición de restos funcionales tales como fármacos, colorantes, etc. (Hackenberger y Schwarzer (2008), Angew. Chem Ed.

47, 10030-10074).

La modificación específica de sitio de proteínas se ha convertido en una herramienta poderosa para estudiar proteínas a nivel de aminoácido individual. Sin embargo, todavía es difícil modificar por ingeniería genética una proteína después de su traducción, es decir, realizar modificaciones postraduccionales, ya que las reacciones necesarias para funcionalizar una proteína traducida, por ejemplo, añadir un marcador a sólo un aminoácido específico, son a menudo difíciles, requieren mucho tiempo y material. Por tanto, todavía existe una demanda de modificación por ingeniería genética de una proteína para disponer fácilmente de una proteína con un adaptador que permita una funcionalización de dicho polipéptido.

La presente solicitud satisface esta demanda al proporcionar medios y métodos para equipar una proteína de interés con un aminoácido adaptador C-terminal que permite una funcionalización de dicha proteína tal como se describe a continuación en el presente documento, caracterizados en las reivindicaciones e ilustrados mediante los ejemplos y las figuras.

Los inventores han descubierto inesperadamente que, al contrario que el prejuicio generalizado en la técnica anterior, la tubulina-tirosina ligasa (TTL) puede someter a tirosinación polipéptidos modificados para comprender una secuencia de reconocimiento de TTL. En otras palabras, los presentes inventores transfirieron la acción de TTL fuera de su contexto, es decir, su acción sobre la tubulina, y demostraron que la TTL también es activa en sustratos heterólogos tales como péptidos o polipéptidos que simplemente contienen una secuencia de reconocimiento de TTL en su extremo C-terminal, pero por lo demás no están estructuralmente relacionados con una tubulina, es decir, péptidos o polipéptidos distintos de tubulina. Tal como se explica con más detalle a continuación, la opinión predominante en la técnica anterior era que la TTL simplemente actúa sobre los polipéptidos de tubulina, mientras que los presentes inventores demostraron para su sorpresa lo contrario (véanse los ejemplos 8 y 8.1). La TTL es activa en polipéptidos heterólogos y los equipa con una tirosina o un derivado de tirosina que actúa como un adaptador versátil para, por ejemplo, restos que funcionalizan un polipéptido.

También fue sorprendente para los presentes inventores observar que, dentro del “artificial”, (es decir, entorno no natural y polipéptidos distintos de tubulina como sustrato para TTL) en el que usaron TTL para someter a tirosinación polipéptidos, la TTL incluso introdujo un derivado de tirosina en el extremo C-terminal de un polipéptido de interés, que es diferente de tubulina. Por tanto, la TTL puede incorporar un derivado de tirosina en un polipéptido distinto de tubulina en un entorno no natural, mientras que en la técnica se enseñó que la TTL es estrictamente dependiente de la tubulina.

Por consiguiente, este hallazgo permite la unión de una tirosina o un derivado de tirosina a una gran cantidad de polipéptidos diferentes y, mediante la adición adicional de otros restos, abre nuevas perspectivas para investigación, diagnóstico y tratamiento. Por tanto, al hacer uso de la acción de TTL, es posible funcionalizar un polipéptido de interés (POI), ya que la tirosina o un derivado de tirosina añadido por la TTL al extremo C-terminal de una proteína que tiene una secuencia de reconocimiento de TTL permite el acoplamiento de restos a modo de un enlace no peptídico que sirve, por ejemplo, como marcadores, enzimas, fármacos, etc. Por tanto, habiendo reconocido y comprobado que la TTL es activa en sustratos heterólogos tales como péptidos o polipéptidos que simplemente contienen una secuencia de reconocimiento de TTL en su extremo C-terminal, pero que de otra manera no están estructuralmente relacionados con una tubulina, convierte a la TTL en una herramienta para equipar un POI con una tirosina o un derivado de tirosina que actúa como un adaptador versátil que está por sí solo conectado con restos que funcionalizan un POI para, por ejemplo, investigación, diagnóstico y tratamiento.

La tubulina-tirosina ligasa (TTL), que se aisló por primera vez de extractos cerebrales en 1977, cataliza la retirosinación postraduccional de la a-tubulina destirosinada. Tiene un marcado grado de conservación de secuencia desde equinodermos hasta seres humanos, y presenta > 96% de identidad entre ortólogos de mamíferos (Szyk, Deaconsecu y Piszczek). Notablemente, la enzima es indispensable para el desarrollo de células y organismos, y la supresión de TTL se ha relacionado con la transformación celular y se correlaciona con un mal pronóstico en pacientes que padecen diversas formas de cáncer (Prota, Magiera y Kujpers).

En la naturaleza, la TTL desempeña un papel importante en los ciclos recurrentes de destirosinación/tirosinación de a-tubulina. La alta especificidad de sustrato de TTL se ha reconocido pronto. Incluso antes de que se hubiera aislado la TTL, Arce, Hallak y Rodriguez notificaron en 1975 que, cuando los extractos cerebrales se incuban con tirosina radiactiva, el marcador sólo se incorpora a la a-tubulina. En 1994, Rüdiger et al. evaluaron los requisitos de sustrato de TTL mediante el uso de una variedad de péptidos sintéticos correspondientes a la secuencia C-terminal de atubulina.

Curiosamente, el prejuicio de que la ap-tubulina o fragmentos de la misma eran el único sustrato aceptado por la TTL para una tirosinación eficaz persistió en la técnica anterior. En consecuencia, la investigación sobre la actividad de la TTL se limitó, en los años siguientes, a evaluar si la TTL aceptaría derivados de tirosina y los uniría al heterodímero de ap-tubulina. Por ejemplo, Kalisz et al. (2000), Biochim Biophys Acta 1481: 131-138 fueron pioneros en generar TTL recombinante en E. coli. La TTL recombinante presentó propiedades catalíticas similares a las de la enzima derivada del tejido cerebral de mamíferos y pudo incorporar de manera covalente nitrotirosina en el extremo C-terminal de la a-tubulina in vitro, aunque con una afinidad 35 veces menor que para la tirosina. Recientemente, Banerjee et al. (2010), ACS chemical biology 5: 777-785 emplearon con éxito la TTL para conjugar un marcador fluorescente con ap-tubulina. Los autores desarrollaron un sistemas de marcaje de dos etapas en condiciones suaves y usaron 3-formiltirosina como sustrato de TTL y lo unieron al extremo C-terminal de la a-tubulina. Posteriormente, se añadió 7-hidrazino-4-metilcumarina mediante la formación de hidrazona a la tubulina modificada como un marcador fluorescente en condiciones suaves, permitiendo que la tubulina marcada con fluorescencia retuviera su capacidad de ensamblarse en microtúbulos. De nuevo, los autores enfatizan en este caso que el único sustrato de TTL es el extremo C-terminal de la a-tubulina con el requisito mínimo de EE como los últimos aminoácidos.

Sin embargo, la idea de usar TTL para unir una tirosina (o un derivado de la misma) a polipéptidos distintos de tubulina no evolucionó, presumiblemente porque los estudios anteriores suponían que se requería una interacción única entre TTL y ap-tubulina para permitir la tirosinación. Recientemente, el prejuicio ha sido confirmado por dos estudios realizados por(Szyk, Deaconsecu y Piszczek) y (Prota, Magiera y Kujpers).

Szyk et al. (2011), Nature Struc Mol Biol 18 (11): 1250-1259 determinaron la estructura cristalina de la TTL de rana. El estudio reveló que la TTL tiene una forma alargada y se compone de un dominio N-terminal, un dominio central y un dominio C-terminal, que juntos forman el sitio activo de la enzima. Los autores notificaron además que la TTL reconoce la tubulina por una estrategia bipartita. Engancha la cola de la tubulina a través de interacciones de baja afinidad y alta especificidad, y coopta lo que de otro modo sería una interfaz de homooligomerización para formar un complejo heterooligomérico fuerte con el cuerpo de la tubulina. Dicho de otra manera, Szyk et al. enseñan claramente que la TTL es altamente específica para la tubulina y para su acción requiere una fuerte interacción con la tubulina.

Prota et al. (2013), J Cell Biol 200 (3): 259-270 revelaron recientemente la base estructural de la interacción TTL-tubulina y la tirosinación de tubulina. Curiosamente, basándose en la información estructural obtenida durante el estudio, los autores concluyen que un modo de unión bipartito de ap-tubulina-TTL característico y un modo de unión de cola de a-tubulina-TTL explican la alta especificidad de TTL para a-tubulina. Los autores afirman que el modo complejo de interacción bipartita observado entre tubulina y TTL revela cómo la enzima ha evolucionado específicamente para reconocer y modificar la tubulina; prácticamente impiden que la enzima modifique sustratos adicionales.

En resumen, la técnica anterior implica que la única interacción entre la TTL y su sustrato ap-tubulina es un requisito previo indispensable para la tirosinación. Claramente, el hallazgo de la presente invención, que permite la tirosinación mediante TTL de prácticamente cualquier polipéptido que porte un motivo de reconocimiento de TTL, fue inesperado. El hecho de que la adición o introducción de una secuencia de reconocimiento de TTL en cualquier polipéptido funcional sería suficiente para convertirlo en un sustrato de TTL adecuado fue claramente y no pudo preverse. Más aún, además de tomar medidas sobre los polipéptidos heterólogos, el hecho de que la TTL usa en un contexto heterólogo incluso derivados de tirosina tal como muestran los presentes inventores (véanse los ejemplos 5 y 8.2) no podía esperarse en absoluto y destaca la no obviedad de la presente invención.

Sumario

La presente invención proporciona un método para la producción de un polipéptido que comprende

(a) introducir o añadir en el extremo C-terminal de un polipéptido una secuencia de reconocimiento para tubulinatirosina ligasa;

(b) poner en contacto el polipéptido obtenido en la etapa (a) en presencia de tubulina-tirosina ligasa y un derivado de tirosina en condiciones adecuadas para que la tubulina-tirosina ligasa someta a tirosinación dicho polipéptido con dicho derivado de tirosina; y

(c) opcionalmente conjugar un resto con dicho polipéptido sometido a tirosinación obtenido en la etapa (b).

La etapa (c) también se considera una etapa preferida del método anterior. Por tanto, en una realización preferida, dicho método anterior de la presente invención comprende además la etapa (c) de conjugar un resto con dicho polipéptido sometido a tirosinación obtenido en la etapa (b).

La presente invención también proporciona un polipéptido que puede obtenerse mediante los métodos, particularmente mediante dicho método anterior, de la presente invención. Tal polipéptido que puede obtenerse mediante los métodos de la presente invención y aplicarse en los mismos puede tener ventajosamente una longitud de más de 19 aminoácidos y/o puede ser un polipéptido distinto de tubulina.

La presente invención, como alternativa al método descrito anteriormente, proporciona un método para la producción de un polipéptido, que comprende

(a') introducir o añadir en el extremo C-terminal de un polipéptido una secuencia de reconocimiento para tubulinatirosina ligasa; y

(b') poner en contacto el polipéptido obtenido en la etapa (a') en presencia de tubulina-tirosina ligasa y un derivado de tirosina conjugado con un resto en condiciones adecuadas para que la tubulina-tirosina ligasa someta a tirosinación dicho polipéptido con dicho derivado de tirosina conjugado con dicho resto.

La presente invención también proporciona un polipéptido que puede obtenerse mediante dicho método alternativo de la presente invención. Tal polipéptido, por ejemplo, también puede ser tubulina, ya que la técnica anterior no proporcionaba tubulina que comprende un derivado de tirosina y un resto adicional, preferiblemente un resto tal como se describe en el presente documento.

La secuencia de reconocimiento para tubulina-tirosina ligasa de un polipéptido que se somete a un método de la presente invención y que también puede estar compuesta por un polipéptido de la presente invención puede tener preferiblemente al menos la secuencia de aminoácidos X1X2X3X4 (SEQ ID No: 11), en la que X1 y X2 es cualquier aminoácido, X3 es E, D o C y X4 es E. Ventajosamente, X2 puede ser G, S, A, V o F y/o X1 puede ser E, D, A, K o P. La secuencia de reconocimiento puede ser EGEE (SEQ ID No. 2), VDSVEGEGE^e E^g EE (SEQ ID No. 3), SVEGEGEEEGEE (SEQ ID No. 4), SADGEDEGEE (SEQ ID No. 5), SVEAEAEEGEE (SEQ ID No. 6), SYEDEDEGEE (SEQ ID No. 7) o SFEEENEGEE (SEQ ID No. 8).

El polipéptido que se produce y, por tanto, puede obtenerse mediante los métodos de la invención puede comprender una secuencia ligadora que precede a la secuencia de reconocimiento de tubulina-tirosina ligasa.

El resto que puede conjugarse con un polipéptido sometido a tirosinación mediante los métodos de la presente invención y que puede estar compuesto por un polipéptido de la presente invención puede ser un portador, un polipéptido, un marcador detectable, un compuesto químico, un ácido nucleico, un hidrato de carbono o un lípido. Tal polipéptido que se conjuga con un polipéptido sometido a tirosinación puede ser un anticuerpo o fragmento del mismo seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, anticuerpo humano, scFv, un DART, anticuerpo de dominio, nanocuerpo, una adnectina, un affibody, una anticalina, un DARPin o un aptómero. Tal marcador detectable puede comprender un fluoróforo, una enzima (peroxidasa, luciferasa), un radioisótopo, un trazador de PET, una proteína fluorescente o un colorante fluorescente. Tal compuesto químico puede ser una molécula pequeña, un polímero, tal como un polímero sintético (PEG) o un agente terapéutico. Tal ácido nucleico puede ser A^d N, ARN o un aptómero.

Las condiciones adecuadas aplicadas en los métodos para producir un polipéptido de la invención pueden comprender un tampón que contiene un nucleósido trifosfato, tal como ATP, cloruro de potasio, cloruro de magnesio, un agente reductor tal como DTT.

Un derivado de tirosina que se aplica en los métodos de la invención y que también está compuesto por un polipéptido de la invención puede contener un grupo funcional no natural (artificial) para una modificación quimioselectiva o bioortogonal, sin embargo, puede contener alternativamente un grupo funcional natural para una modificación quimioselectiva o bioortogonal. A veces, cuando se usa en el presente documento, un derivado de tirosina que contiene un grupo funcional no natural (artificial) para una modificación quimioselectiva o bioortogonal también se denomina “asidero de química click”. Este resto funcional no natural puede seleccionarse del grupo que consiste en alquino terminal, azida, alquino tensado, dieno, dienófilo, alcoxiamina, carbonilo, fosfina, fosfonito, fosfito, hidrazida, tiol, tetrazina, alqueno, ciclooctino, sustituyentes aceptores de electrones tales como halógenos, por ejemplo, F, Br, Cl, I, derivados de fenol (por ejemplo, OT, ON, OTf), nitrilos (CN), carbonilos (CO) o grupos nitro (NO2).

El derivado de tirosina aplicado en los métodos de la invención puede estar sustituido con los grupos funcionales mencionados anteriormente en las posiciones 2, 3 y 4, así como en la posición bencílica. Los grupos funcionales pueden estar conectados directamente en las posiciones mencionadas anteriormente o mediante un espaciador, tal como un espaciador de alquilo entre medias. A modo de ejemplo, el derivado de tirosina puede ser una tirosina sustituida en 3 o sustituida en 4, tal como el derivado de tirosina sustituido en 3 ó 4 es 3-nitrotirosina, 3-aminotirosina, 3-azidotirosina, 3-formiltirosina, 3-acetiltirosina o 4-aminofenilalanina.

En el presente documento, se proporciona un polipéptido que es un anticuerpo que, por ejemplo, puede obtenerse mediante la presente invención, tiene en su extremo C-terminal una secuencia de reconocimiento para tubulinatirosina ligasa (TTL) que tiene preferiblemente al menos la secuencia de aminoácidos X4X3X2X1, en la que X2 es E, D o C y X1 es E. Ventajosamente, tal polipéptido se modifica para introducir o añadir dicha secuencia de reconocimiento Dicho polipéptido tiene ventajosamente actividad biológica. X4 puede ser E, D, A, K o P. X3 puede ser G, S, A, V o F. X2 también puede ser G, S, A, V o F. X1 también puede ser E, D, A, K o P. Preferiblemente, la secuencia de reconocimiento puede ser EGEE (SEQ ID No. 2), VDSVEGEGEEEGEE (SEQ ID No. 3), SVEGEGEEEGEE (SEQ ID No. 4), SADGEDEGEE (SEQ ID No. 5), SVEAEAEEGEE (SEQ ID No. 6), SYEDEDEGEE (SEQ ID No. 7) o SFEEENEGEE (SEQ ID No. 8).

El polipéptido puede comprender una secuencia ligadora que precede a la secuencia de reconocimiento de tubulinatirosina ligasa.

En el polipéptido de la invención, un derivado de tirosina puede unirse de manera covalente a dicha secuencia de reconocimiento. Dicho derivado de tirosina puede contener un grupo funcional no natural (artificial) para una modificación quimioselectiva o bioortogonal, sin embargo, alternativamente puede contener un grupo funcional natural para una modificación quimioselectiva o bioortogonal. Este resto funcional no natural puede seleccionarse del grupo que consiste en alquino terminal, azida, alquino tensado, dieno, dienófilo, alcoxiamina, carbonilo, fosfina, fosfonito, fosfito, hidrazida, tiol, tetrazina, alqueno, ciclooctino, sustituyentes aceptores de electrones tales como halógenos, por ejemplo, F, Br, Cl, I, derivados de fenol (por ejemplo, OT, ON, OTf), nitrilos (CN), carbonilos (CO) o grupos nitro (NO2). El derivado de tirosina puede estar sustituido con los grupos funcionales mencionados anteriormente en las posiciones 2, 3 y 4, así como en la posición bencílica. Los grupos funcionales pueden estar conectados directamente en las posiciones mencionadas anteriormente o mediante un espaciador, tal como un espaciador de alquilo entre medias. A modo de ejemplo, el derivado de tirosina puede ser una tirosina sustituida en 3 o sustituida en 4, tal como el derivado de tirosina sustituido en 3 ó 4 es 3-nitrotirosina, 3-aminotirosina, 3-azidotirosina, 3-formiltirosina, 3-acetiltirosina o 4-aminofenilalanina.

Además, un resto puede conjugarse con dicho derivado de tirosina. Dicho resto puede ser un portador, un polipéptido, un marcador detectable, un compuesto químico, un ácido nucleico, un hidrato de carbono o un lípido. El polipéptido puede ser, en particular, un anticuerpo o fragmento del mismo seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, anticuerpo humano, scFv, un DART, anticuerpo de dominio, nanocuerpo, una adnectina, un affibody, una anticalina, un DARPin o un aptómero. El marcador detectable puede comprender un fluoróforo, una enzima (peroxidasa, luciferasa), un radioisótopo, una proteína fluorescente o un colorante fluorescente. El compuesto químico puede ser una molécula pequeña, un polímero, tal como un polímero sintético (PEG) o un agente terapéutico. El ácido nucleico puede ser ADN, ARN o un aptómero.

La presente invención también proporciona una composición de diagnóstico que comprende un polipéptido que, por ejemplo, puede obtenerse mediante los métodos de la presente invención.

Además, también se proporciona una composición farmacéutica un polipéptido que, por ejemplo, puede obtenerse mediante los métodos de la presente invención.

La presente invención proporciona además un kit que comprende medios para realizar el método de la presente invención. El kit puede comprender un vector de expresión que permite la expresión de una proteína de interés fusionada en su extremo C-terminal a una secuencia de reconocimiento para tubulina-tirosina ligasa, tubulinatirosina ligasa y un derivado de tirosina.

La presente invención también proporciona el uso de tubulina-tirosina ligasa para someter a tirosinación un polipéptido distinto de tubulina que tiene en su extremo C-terminal una secuencia de reconocimiento para tubulinatirosina ligasa.

En el presente documento, también se proporciona un método para instalar un asidero químico en el extremo C-terminal de un polipéptido distinto de tubulina, comprendiendo dicho método:

(a) proporcionar un polipéptido que tiene en su extremo C-terminal una secuencia de reconocimiento de tubulinatirosina ligasa; y

(b) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) en presencia de tubulina-tirosina ligasa y un derivado de tirosina que contiene un asidero químico en condiciones adecuadas para que la tubulina-tirosina ligasa someta a tirosinación dicho polipéptido con dicho derivado de tirosina.

Dicho método puede comprender opcionalmente además la etapa de conjugar un resto tal como se describe en el presente documento con dicho polipéptido sometido a tirosinación obtenido en la etapa (b).

La presente invención también proporciona el uso de tubulina-tirosina ligasa para instalar un asidero químico en el extremo C-terminal de un polipéptido distinto de tubulina, teniendo dicho polipéptido en su extremo C-terminal una secuencia de reconocimiento de tubulina-tirosina ligasa.

Debe señalarse que, tal como se usa en el presente documento, las formas singulares “un”, “una” y “el/la” incluyen las referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a “un reactivo” incluye uno o más de dichos reactivos diferentes y la referencia a “el método” incluye la referencia a etapas y métodos equivalentes conocidos por los expertos en la técnica que podrían modificarse o sustituirse por los métodos descritos en el presente documento.

A menos que se indique lo contrario, el término “al menos” delante de una serie de elementos debe entenderse que se refiere a cada elemento de la serie. Los expertos en la técnica reconocerán, o podrán determinar usando no más que la experimentación de rutina, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descritas en el presente documento. Tales equivalentes pretenden abarcarse por la presente invención.

El término “y/o” cuando se usa en el presente documento incluye el significado de “y”, “o” y “todos o cualquier otra combinación de los elementos conectados por dicho término”.

El término “alrededor de” o “aproximadamente”, tal como se usa en el presente documento, significa dentro del 20%, preferiblemente dentro del 10%, y más preferiblemente dentro del 5% de un valor o intervalo dado. Sin embargo, también incluye el número concreto, por ejemplo, aproximadamente 20 incluye 20.

El término “menos de” o “mayor que” incluye el número concreto. Por ejemplo, menos de 20 significa menos de o igual a. De manera similar, más de o mayor que significa más de o igual a, o mayor que o igual a, respectivamente. A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra “comprender”, y variaciones tales como “comprende” y “que comprende” implican la inclusión de una etapa o un número entero establecido o un grupo de etapas o números enteros, pero no la exclusión de cualquier otra etapa u otro número entero o grupo de etapas o números enteros. Cuando se usa en el presente documento, el término “que comprende” puede sustituirse por el término “que contiene” o “que incluye” o, a veces, cuando se usa en el presente documento, por el término “que tiene”.

Cuando se usa en el presente documento “que consiste en” excluye cualquier elemento, etapa o componente no especificado en el elemento de la reivindicación. Cuando se usa en el presente documento, “que consiste esencialmente en” no excluye materiales o etapas que no afectan materialmente a las características básicas y novedosas de la reivindicación.

En cada caso en el presente documento, cualquiera de los términos “que comprende”, “que consiste esencialmente en” y “que consiste en” puede reemplazarse por cualquiera de los otros dos términos.

Debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, los protocolos, el material, los reactivos y las sustancias, etc., particulares descritos en el presente documento y, como tal, pueden variar. La terminología usada en el presente documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares solamente, y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que se define únicamente por las reivindicaciones.

Todas las publicaciones y patentes citadas a lo largo del texto de esta memoria descriptiva (incluyendo todas las patentes, solicitudes de patentes, publicaciones científicas, especificaciones del fabricante, instrucciones, etc.), ya sean antes o a continuación, se incorporan en el presente documento mediante referencia en su totalidad. Nada en el presente documento debe interpretarse como una admisión de que la invención no tiene derecho a anteceder tal divulgación en virtud de la invención anterior. En la medida en que el material incorporado mediante referencia contradiga o sea incoherente con esta memoria descriptiva, la memoria descriptiva sustituirá a cualquier material de este tipo.

Figuras

Figura 1: ilustración esquemática de la presente invención. (A) Se muestra la reacción natural de la tirosinación de tubulina catalizada por TTL. La TTL interacciona con un motivo reactivo de TTL C-terminal (Tub-tag) y cataliza el ligamiento de una tirosina C-terminal. (B) Se muestra la reacción modificada por ingeniería genética. Se añade Tubtag de manera recombinante a cualquier proteína de interés (POI). La TTL cataliza el ligamiento C-terminal de tirosina y derivados de tirosina que pueden usarse para la química de conjugación específica de sitio de cualquier molécula reactiva.

Figura 2: ligamiento C-terminal de 3-nitro-tirosina (A, E), 3-azida-tirosina (B, F), 3-formil-tirosina (C, G) y 3-yodotirosina (D, H) con el péptido de 14 meros derivado de a-tubulina. (A, B, C, D) La línea roja representa el consumo de péptido, la línea azul la formación de péptido funcionalizado C-terminal, la línea negra la formación de producto secundario. Se muestra el valor medio de tres reacciones replicadas (DE). La cuantificación del sustrato y del producto se realizó mediante la integración del pico. (E, F, G, H) Se muestran trazas de fluorescencia mediante HPLC que se tomaron en diferentes momentos de la reacción de TTL con 3-nitro-tirosina (E), 3-azida-tirosina (F), 3-formil-tirosina (G) y 3-yodo-tirosina y péptido. El pico de fluorescencia correspondiente al péptido (izquierda) se reduce con el tiempo y aparece un nuevo pico, correspondiente al péptido modificado C-terminal.

Figura 3: validación por espectrometría de masas del ligamiento C-terminal de 3-formil-tirosina a nivel de proteína (nanocuerpo con péptido de 14 meros derivado de a-tubulina C-terminal). Un diagrama de ESI EM/EM del nanocuerpo después de digerir en gel usando tripsina. Se muestra el diagrama de EM/EM del péptido que porta el residuo 3-formil-tirosina terminal.

Figura 4: (A) unión C-terminal de un derivado de biotina a un nanocuerpo por reacción de formación de oxima. Se incorporó enzimáticamente 3-formil-L-tirosina al extremo C-terminal del nanocuerpo. Por tanto, el grupo aldehído incorporado específicamente en el sitio se usó para instalar biotina en una reacción de formación de oxima. El gel de SDS muestra el nanocuerpo no tratado en el carril 1, la reacción en la que se incubó el nanocuerpo con TTL y 3-formil-L-tirosina (carril 2) y la reacción en la que el nanocuerpo se incubó con TTL solo (carril 2). Tras la reacción enzimática, las muestras se incubaron con 20 eq. de la biotina. Se muestra el marcaje selectivo del nanocuerpo que contiene 3-formil-L-tirosina. (B) Unión C-terminal de Alexa594 a un nanocuerpo por reacción de formación de hidrazona. Se incorporó enzimáticamente 3-formil-L-tirosina al extremo C-terminal del nanocuerpo. Por tanto, el grupo aldehido incorporado específicamente en el sitio se usó para instalar un fluoróforo, concretamente Alexa594, en una reacción de formación de hidrazona. El gel de SDS muestra la reacción de nanocuerpo-Tub-tag con TTL y 3-formil-L-tirosina (carril 1), la reacción en la que se incubó el nanocuerpo-Tub-tag con TTL sola (carril 2) y la reacción en la que se usó un nanocuerpo sin el péptido Tub-tag (carril 3). Tras la reacción enzimática, las tres muestras se incubaron con 30 eq. de fluoróforo. Se muestra el marcaje selectivo del nanocuerpo que contiene 3-formil-L-tirosina. Figura 5: marcaje con Tub-tag de proteínas. (A) Marcaje quimioenzimático de proteínas mediante tubulina-tirosina ligasa (TTL). Los derivados de tirosina no naturales se ligan al extremo C-terminal de una etiqueta de reconocimiento corta (Tub-tag) para servir como asideros bioortogonales para una modificación química específica de sitio de una proteína de interés (POI). (B) Adición C-terminal de 3-N3-L-tirosina a péptido marcado con carboxifluoresceína (CF-Tub-tag). Se tomaron trazas de fluorescencia mediante HPLC en diferentes momentos de la reacción de TTL. (C) La línea roja representa el consumo de CF-Tub-tag, la línea azul la formación de CF-Tub-tag-YN3 funcionalizado de manera C-terminal. Se muestra el valor medio y la desviación estándar (DE) de tres reacciones replicadas. La cuantificación del sustrato y del producto se realizó mediante la integración del pico de b. (D) Adición C-terminal de 3-formil-L-tirosina a CF-Tub-tag. Se tomaron trazas de fluorescencia mediante HPLC en diferentes momentos de la reacción de TTL. (E) La línea roja representa el consumo de CF-Tub-tag, la línea verde la formación de CF-Tub-tag-YCHO funcionalizado de manera C-terminal. Se muestra el valor medio y la desviación estándar (DE) de tres reacciones replicadas. La cuantificación del sustrato y del producto se realizó a través de la integración del pico de d.

Figura 6: principio y eficiencia de la funcionalización mediada por TTL (A) Ilustración esquemática de la incorporación mediada por TTL de azida 3 seguido por la posterior cicloadición de azida-alquino promovida por tensión (SPAAC). (B) Incorporación de azida 3 al extremo C-terminal de GBP4 usando diferentes razones de GBP4/TTL y tiempos de reacción (una y tres horas) seguido por la SPAAC para un derivado de DBCO-biotina. SDS-PAGE e inmunotransferencia de tipo Western (Ac-HRP anti-Strep) muestran un marcaje por biotina eficaz de GBP4 en el plazo de una hora.

Figura 7: aplicación de nanocuerpos funcionalizados quimioenzimáticamente (A) Diagrama esquemático de la inmunoprecipitación de GFP con GBP1 biotinilado específicamente en el sitio. (B) Tinción de Coomassie y análisis de inmunotransferencia de tipo Western que muestran co-inmunoprecipitación de GFP eficaz y específica. (C) Diagrama esquemático de GBP1-Alexa594 marcado específicamente en el sitio. (D) Inmunofluorescencia con GBP1-Alexa594. Se muestra un núcleo de células HeLa con la lámina marcada conjuntamente con LaminB1-GFP y GBP1-Alexa594. La barra de escala es de 10 |im. (E) Región de ampliación de d. (F) Un perfil de intensidad de fluorescencia a lo largo de la línea punteada (que se muestra en e) demuestra una alta precisión de colocalización en la resolución de subdifracción.

Figura 8: se han añadido diferentes derivados de tirosina al extremo C-terminal del nanocuerpo GBP4 usando el marcaje con Tub-tag. La digestión tripsínica seguida por experimentos de HPLC-EM/EM reveló la incorporación exitosa de (A) L-tirosina (B) 3-N3-L-tirosina, (C) 3-formil-L-tirosina, (D) 3-NH2-L-tirosina y (E) 3-NO2-L-tirosina.

Figura 9: moléculas usadas para la adición bioortogonal a nanocuerpos modificados C-terminales.

Figura 10: se muestra el marcaje fluorescente de GBP4 con sulfo-Cy5-DBCO. Se incorporó enzimáticamente 3-N3-L-tirosina al extremo C-terminal de GBP4 usando TTL. Una incubación posterior con 30 eq. de sulfo-Cy5-DBCO muestra un marcaje selectivo de nanocuerpo que contiene 3-N3-L-tirosina por reacción de click de azida-alquino promovida por tensión (SPAAC).

Figura 11: se muestra el marcaje de GBP4 con biotina-fosfina usando ligamiento de Staudinger. Se incorporó enzimáticamente 3-N3-L-tirosina al extremo C-terminal de GBP4 usando TTL. Una incubación posterior con 40 eq. de biotina-fosfina muestra un marcaje selectivo de nanocuerpo que contiene 3-N3-L-tirosina por ligamiento de Staudinger.

Figura 12: se muestra la pegilación de GBP4 con tris(PEG750)fosfito (14) mediante la reacción de Staudinger con fosfito. Se incorporó enzimáticamente 3-N3-L-tirosina al extremo C-terminal de GBP4 usando TTL. Una incubación posterior con 40 eq. de fosfito muestra un marcaje selectivo de nanocuerpo que contiene 3-N3-L-tirosina por ligamiento de Staudinger.

Figura 13: se muestra el marcaje de GBP4 con Alexa594-hidrazida usando reacción de formación de hidrazona. Se incorporó enzimáticamente 3-formil-L-tirosina al extremo C-terminal de GBP4 usando TTL. Una incubación posterior con 30 eq. de Alexa594-hidrazida muestra un marcaje selectivo de nanocuerpo que contiene 3-formil-L-tirosina por condensación de aldehído.

Figura 14: se muestra el marcaje de GBP4 con biotina 15 usando reacción de formación de oxima. Se incorporó enzimáticamente 3-formil-L-tirosina al extremo C-terminal de GBP4 usando TTL. Una incubación posterior con 30 eq. de S2 muestra el marcaje selectivo de nanocuerpo que contiene 3-formil-L-tirosina por condensación de aldehído.

Figura 15: se muestra el marcaje específico de sitio del nanocuerpo específico de GFP GBP1 usando marcaje con Tub-tag. (A) Se incorporó enzimáticamente 3-N3-L-tirosina al extremo C-terminal de GBP1 usando TTL. Una incubación posterior con 30 eq. de sulfo-Cy5-DBCO o 30 eq. de biotina-DBCO muestra un marcaje selectivo de nanocuerpo que contiene 3-N3-L-tirosina por reacción de click de azida-alquino promovida por tensión (SPAAC). (B) Se incorporó enzimáticamente 3-formil-L-tirosina se incorporó enzimáticamente al extremo C-terminal de GBP4 usando TTL. Una incubación posterior con 30 eq. de Alexa594-hidrazida muestra un marcaje selectivo de nanocuerpo que contiene 3-formil-L-tirosina por condensación de aldehído.

Figura 16: micrografías confocales de células HeLa transfectadas con fusiones de GFP-PCNA. Las células se marcaron con anti-GFP (GBP1) conjugado con el colorante fluorescente Alexa594 a 1:25. Se muestran los canales de DAPI, GFP y Alexa594, así como la superposición. Barra de escala: 5 |im.

Figura 17: se muestra la incorporación de 3-N3-L-tirosina al extremo C-terminal de GBP4 en relación con el valor de pH. Las reacciones se realizaron usando una razón 10:1 de GBP4:TTL a diferentes valores de pH (5,0 - 9,0) durante 3 h. Las reacciones se enfriaron rápidamente hasta 4°C, se retiró el exceso de 3-N3-L-tirosina mediante diálisis (a 4°C) y se realizó la SPAAC para DBCO-biotina. Los rendimientos se estimaron usando el software Image Lab (Bio-Rad, EE.UU.).

Figura 18: se muestra la incorporación de 3-N3-L-tirosina al extremo C-terminal de GBP4 en relación con la concentración de 3-N3-L-tirosina. Las reacciones se realizaron usando una razón 10:1 de GBP4:TTL al usar diferentes concentraciones de derivados de tirosina (0,25 - 2 mM) durante 1 h. Las reacciones se enfriaron rápidamente hasta 4°C, se retiró el exceso de 3-N3-L-tirosina mediante diálisis (a 4°C) y se realizó la SPAAC para DBCO-biotina. Los rendimientos se estimaron usando el software Image Lab (Bio-Rad, EE.UU.).

Figura 19: se muestra la incorporación de 3-N3-L-tirosina al extremo C-terminal de GBP4 en relación con la temperatura de reacción. Las reacciones se realizaron usando una razón 10:1 de GBP4:TTL a diferentes temperaturas durante 1 h. Las reacciones se enfriaron rápidamente a 4°C, se retiró el exceso de 3-N3-L-tirosina mediante diálisis (a 4°C) y se realizó la SPAAC para DBCO-biotina. Los rendimientos se estimaron usando el software Image Lab (Bio-Rad, EE.UU.).

Figura 20: se muestra la correlación temporal de la incorporación de 3-N3-Mirosina al extremo C-terminal de GBP4. Las reacciones se realizaron usando una razón 5:1 de GBP4:TTL a 37°C. Las reacciones se enfriaron rápidamente hasta 4°C en momentos de tiempo específicos, se retiró el exceso de 3-N3-L-tirosina mediante diálisis (a 4°C) y se realizó la SPAAC para DBCO-biotina. Los rendimientos se estimaron usando el software Image Lab (Bio-Rad, EE.UU.).

Figura 21: reacciones de acoplamiento.

Figura 22: funcionalización en una etapa: la TTL puede añadir un derivado de tirosina, que ya está acoplado a un resto, a un polipéptido.

Figura 23. Marcaje de lisados y la aplicación de nanocuerpos funcionalizados quimioenzimáticamente al enriquecimiento de proteínas y a la microscopía de superresolución.

a) Diagrama esquemático del marcaje con Tub-tag de GFP en mezclas de proteínas complejas (lisado de E. coli). b) Tinción de Coomassie y análisis de inmunotransferencia de tipo Western que muestran la alta selectividad del ligamiento de tirosina y la posterior biotinilación. (+: lisado tratado con TTL, 3-N3-L-tirosina (1) y DBCO-biotina; C1: sin 3-N3-L-tirosina (1) añadida; C2: lisado tratado con DBCO-biotina; C3: lisado; C4: GFP purificada).

c) Diagrama de la biotinilación específica de sitio del nanocuerpo de unión a GFP GBP1 y posterior inmunoprecipitación de GFP.

d) Tinción de Coomassie y análisis de inmunotransferencia de tipo Western que muestran una coinmunoprecipitación eficaz y específica de GFP (GBP1-biotina simulado: lisado que carece de GFP sobreexpresada; GBP1-biotina con GFP: perlas cargadas con GBP1 y lisado que contiene GFP; perlas de control de GFP: perlas sin GBP1 inmovilizado, I: entrada para perlas de estreptavidina; FT: flujo continuo; B: perlas).

e) Diagrama del marcaje específico de sitio de GBP1 con Alexa594.

f) Inmunofluorescencia con GBP1-Alexa594. Se muestra un núcleo fijo de células HeLa con la lámina marcada conjuntamente con LaminB1-GFP y GBP1-Alexa594. Barra de escala: 10 mm.

g) Expansión de la región resaltada en (d).

h) El perfil de intensidad de fluorescencia a lo largo de la línea punteada que se muestra en (g) demuestra una alta precisión de colocalización a una resolución de subdifracción.

Descripción detallada

Los presentes inventores, por primera vez, han reconocido que la actividad de TTL no se limita a la tubulina, sino que la TTL puede someter a tirosinación prácticamente cualquier polipéptido que tenga un motivo de reconocimiento de TTL C-terminal en su secuencia de aminoácidos. Esta idea no era evidente por sí misma, en el pasado, varios estudios investigaron los principios de la interacción TTL-tubulina y llegaron a la conclusión de que la interacción única de TTL y su sustrato tubulina era esencial para una tirosinación eficaz. La idea de que la TTL podía someter a tirosinación cualquier polipéptido funcional que porte el motivo de reconocimiento específico, por tanto, fue una sorpresa. También fue una sorpresa que la TTL pueda incorporar derivados de tirosina en el extremo C-terminal de un polipéptido distinto de tubulina. Estos dos hallazgos sorprendentes abren nuevas vías para modificaciones postraduccionales de polipéptidos, ya que el derivado de tirosina puede comprender una entidad funcional que permite su conjugación con cualquier resto que pueda conferir funcionalidad a un polipéptido de interés que se someta a tirosinación. Por tanto, la presente invención proporciona polipéptidos novedosos que portan una secuencia de reconocimiento de TTL C-terminal; que pueden, entre otras cosas, actuar como sustratos de TTL para convertirse en sustratos sometidos a tirosinación y, de manera ventajosa, funcionalizarse aún más, ya que, tal como se explicó, la tirosina C-terminal puede usarse beneficiosamente como un “adaptador” para unir restos adicionales, por ejemplo, marcadores fluorescentes o agentes terapéuticos. Por tanto, la presente invención proporciona medios y métodos que tienen un potencial considerable para terapia, diagnóstico e investigación.

Por tanto, la presente invención proporciona un polipéptido preferiblemente recombinante o sintético que tiene en su extremo C-terminal una secuencia de reconocimiento para la tubulina-tirosina ligasa (TTL). Dicha secuencia de reconocimiento tiene preferiblemente al menos la secuencia de aminoácidos X4X3X2X1, en la que X2 es E, D o C y X1 es E. Dicho polipéptido se modifica, tal como se describe en el presente documento, para introducir o añadir dicha secuencia de reconocimiento. Dicho polipéptido tiene ventajosamente actividad biológica. Dicho polipéptido tiene preferiblemente una longitud de más de 19 aminoácidos, tal como 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más aminoácidos de longitud.

La presente invención también proporciona un método para la producción de un polipéptido que comprende (a) introducir o añadir en el extremo C-terminal de un polipéptido una secuencia de reconocimiento para tubulinatirosina ligasa;

(b) opcionalmente poner en contacto el polipéptido obtenido en la etapa (a) en presencia de tubulina-tirosina ligasa y un derivado de tirosina en condiciones adecuadas para que la tubulina-tirosina ligasa someta a tirosinación dicho polipéptido con dicho derivado de tirosina; y

(c) opcionalmente conjugar un resto con dicho polipéptido sometido a tirosinación obtenido en la etapa (b).

También se prevé que la etapa (c) sea una etapa preferida del método anterior. Por tanto, en una realización preferida, dicho método anterior de la presente invención comprende además la etapa (c) de conjugar un resto con dicho polipéptido sometido a tirosinación obtenido en la etapa (b).

Como alternativa, la presente invención también proporciona un método para la producción de un polipéptido que comprende

(a') introducir o añadir en el extremo C-terminal de un polipéptido una secuencia de reconocimiento para tubulinatirosina ligasa; y

(b') poner en contacto el polipéptido obtenido en la etapa (a') en presencia de tubulina-tirosina ligasa y un derivado de tirosina (ya) conjugado con un resto en condiciones adecuadas para que la tubulina-tirosina ligasa someta a tirosinación dicho polipéptido con dicho derivado de tirosina conjugado con dicho resto.

Dicho método alternativo permite, por así decirlo, una funcionalización en una etapa de un polipéptido en el que la tubulina-tirosina ligasa somete a tirosinación un polipéptido en el que se introduce o añade una secuencia de reconocimiento para tubulina-tirosina ligasa en su extremo C-terminal con un derivado de tirosina conjugado con un resto. Por tanto, dicho método, por así decirlo, simplifica la funcionalización ya que no se requiere una etapa de tirosinación adicional, en el que la tubulina-tirosina ligasa añade en primer lugar un derivado de tirosina al extremo C-terminal de un polipéptido en el que se introduce o añade una secuencia de reconocimiento para tubulina-tirosina ligasa para luego conjugar un resto con dicho polipéptido sometido a tirosinación. Por el contrario, los presentes inventores descubrieron que la tubulina-tirosina ligasa somete a tirosinación un polipéptido en el que se introduce o añade una secuencia de reconocimiento para tubulina-tirosina ligasa en su extremo C-terminal con un derivado de tirosina ya conjugado con un resto.

Los términos “proteína”, “péptido” y “polipéptido” se usan de manera intercambiable en el presente documento, y se refieren a un polímero de residuos de aminoácidos ligados entre sí mediante enlaces peptídicos (amida). Dicho término también abarca fragmentos de polipéptidos. Dichos fragmentos tienen preferiblemente actividad biológica. Dichos fragmentos pueden tener una longitud de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o más aminoácidos. Los términos se refieren a una proteína, un péptido o polipéptido de cualquier tamaño, estructura o función, con la excepción de tubulina. El término “tubulina”, tal como se usa en el presente documento, comprende cualquier isoforma (es decir, a-, p-, y-, 8-, e-, ^-tubulina), mutante, variante o derivado de tubulina. Tal como se explica en el presente documento, el hallazgo de la presente invención es, entre otros, que los polipéptidos distintos de tubulina, es decir, los polipéptidos que no son tubulina se someten a tirosinación por TTL, siempre que tengan una secuencia de reconocimiento de TTL. En otras palabras, los presentes inventores descubrieron que la TTL es activa en sustratos heterólogos, tales como péptidos o polipéptidos que simplemente contienen una secuencia de reconocimiento de TTL en su extremo C-terminal, pero que de otro modo no están estructuralmente relacionados con una tubulina. “Sustrato heterólogo” significa un péptido o polipéptido en el que la TTL se activa por medio de tirosinación, pero que no es una tubulina.

“Un polipéptido o péptido distinto de tubulina” o “un péptido o polipéptido que no es tubulina” abarca un polipéptido que no está estructuralmente relacionado con un polipéptido de tubulina. Tal polipéptido de tubulina tiene preferiblemente una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 60% o más, tal como el 70%, el 80%, el 90% o el 100%, con SEQ ID No. 1.

MRECISIHVGQAGVQIGNACWELYCLEHGI QPDGQMPSDKTIGGGDDSFN 50

TFFSETGAGKHVPRAVFVDL EPTVIDEVRTGTYRQLFHPEQLITGKEDAA 100

NNYARGHYTI GKEIIDLVLDRIRKLADQCT GLQGFLVFHS FGGGTGSGFT 150

SLLMERLSVD YGKKSKLEFS IYPAPQVSTAWEPYNSILT THTTLEHSDC 200

AFMVDNEAIYDICRRNLDIERPTYTNLNRL IGQIVSSITASLRFDGALNV 250

DLTEFQTNLV PYPRIHFPLATYAPVISAEKAYHEQLSVAE ITNACFEPAN 300

QMVKCDPRHG KYMACCLLYRGDWPKDVNAAIATIKTKRT IQFVDWCPTG 350

FKVGINYQPP TWPGGDLAKVQRAVCMLSN TTAIAEAWARLDHKFDLMYA 400

KRAFVHWYVGEGMEEGEFSEAREDMAALEKDYEEVGVDSVEGEGEEEGEE (SEQIDNO 1)

Por tanto, tales polipéptidos de tubulina se excluyen preferiblemente de un polipéptido de la presente invención que está sometido a tirosinación y modificado adicionalmente por conjugación de un resto a la tirosina del polipéptido sometido a tirosinación o que está sometido a tirosinación con un derivado de tirosina (ya) conjugado con un resto. Puede usarse una variedad de metodologías de alineación basadas en secuencias, que se conocen bien por los expertos en la técnica, para determinar la identidad entre secuencias. Estos incluyen, pero no se limitan a, el algoritmo local de identidad/homología de Smith, F. y Waterman, M. S. (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482-89, algoritmo de alineación de homología de Peason, W. R. y Lipman, D. J. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-48, herramienta de búsqueda de alineación local básica (BLAST, por sus siglas en inglés) descrita por Altschul, S. F. et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10, o el programa Best Fit descrito por Devereau, J. et al. (1984) Nucleic Acids. Res.

12: 387-95, y los programas de alineación FastA y TFASTA, preferiblemente usando la configuración predeterminada o mediante inspección. Alternativamente, una alineación puede hacerse de manera manual/visual de la siguiente manera: el porcentaje de identidad entre una secuencia de aminoácidos en cuestión y la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID No. 1 (secuencia de referencia) se determina mediante alineación por pares de tal manera que se obtiene la identidad máxima entre ambas secuencias de aminoácidos. Se cuentan los residuos de aminoácidos idénticos entre ambas secuencias de aminoácidos y se dividen entre el número total de residuos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No. 1 (incluyendo posiciones que no contienen residuos de aminoácidos, por ejemplo, uno o más espacios), dando lugar al porcentaje de identidad.

Una proteína, un péptido o polipéptido puede referirse a una proteína individual o una colección de proteínas. Pueden modificarse uno o más de los aminoácidos en el polipéptido, por ejemplo, mediante la adición de una entidad química tal como un grupo hidrato de carbono, un grupo hidroxilo, un grupo fosfato, un grupo farnesilo, un grupo isofarnesilo, un grupo ácido graso, un ligador para la conjugación, funcionalización, una pareja de fusión para la extensión de la semivida, etiquetas de afinidad, tales como una etiqueta de histidina, etiqueta Flag, etiqueta de estreptavidina, etiqueta Strep II, una inteína, una proteína de unión a maltosa, una porción Fc de IgA o IgG, proteína A o proteína G, y otras modificaciones. Otras posibles modificaciones químicas del polipéptido incluyen acilación o acetilación del extremo amino terminal o amidación o esterificación del extremo carboxilo terminal o, alternativamente, en ambos. Las modificaciones también pueden afectar al grupo amino en la cadena lateral de lisina o el grupo hidroxilo de treonina. Otras posibles modificaciones incluyen, por ejemplo, la extensión de un grupo amino con cadenas de polipéptidos de longitud variable (por ejemplo, tecnología XTEN o PASylation®), N-glicosilación, O-glicosilación y conjugación química de hidratos de carbono, tales como hidroxietil-almidón (por ejemplo, HESylation ®) o ácido polisiálico (por ejemplo, tecnología PolyXen®). También son posibles y se prevén modificaciones químicas tales como alquilación (por ejemplo, metilación, propilación, butilación), arilación y eterificación. Sin embargo, se prefiere que la modificación no elimine la capacidad de TTL de reconocer la secuencia de reconocimiento de TTL y/o de someter a tirosinación el polipéptido de la invención. Una proteína, un péptido o polipéptido también puede ser una molécula individual o puede ser un complejo multimolecular. Una proteína, un péptido o polipéptido puede ser sólo un fragmento de una proteína o un péptido que se produce de manera natural, siempre que presente actividad biológica tal como se define en el presente documento.

El término “tubulina-tirosina ligasa”, abreviado a veces en el presente documento como “TTL”, abarca polipéptidos que pueden someter a tirosinación polipéptidos, es decir, unir de manera covalente una tirosina o un derivado de tirosina a un polipéptido. Preferiblemente, una TTL puede someter a tirosinación un polipéptido en el extremo C-terminal de dicho polipéptido. Para esa acción, se prefiere que dicho polipéptido comprenda una secuencia de reconocimiento para ^tT^l . Dicho término abarca las TTL de eucariotas, preferiblemente mamíferos, más preferiblemente de seres humanos. Una TTL preferida se muestra en SEQ ID No: 12. Dicho término también abarca una TTL que tiene una identidad del 70%, el 80%, el 90% o el 95% o más con respecto a toda su secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de TTL mostrada en SEQ ID No: 12. Preferiblemente, tales polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que comparte una identidad, tal como se describió anteriormente, tienen actividad de TTL. La actividad de TTL puede someterse a prueba tal como se conoce en la técnica o se describe en el presente documento. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia puede determinarse en el presente documento tal como se describió anteriormente. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID No: 12 se usa como referencia en una comparación por pares. Se calcula como el porcentaje de números de “positivos” (aminoácidos homólogos) indicados como resultado en la salida del programa BLASTP dividido entre el número total de aminoácidos seleccionados por el programa para la alineación.

El término “someter a tirosinación” en todas sus formas gramaticales, tal como se usa en el presente documento, significa “unir de manera covalente una tirosina o un derivado de tirosina” a un polipéptido. Sin desear limitarse a una teoría específica, se prevé que la TTL añada una tirosina o un derivado de tirosina al último aminoácido C-terminal del motivo de reconocimiento de TTL. Dicha tirosina o dicho derivado de tirosina ya puede estar conjugado con un resto tal como se describe en el presente documento. La conjugación de un resto con una tirosina o un derivado de tirosina puede hacerse tal como se conoce en la técnica o preferiblemente puede hacerse tal como se describe en el presente documento. Por consiguiente, también se prevé que el término “someter a tirosinación” abarque que la tubulina-tirosina ligasa someta a tirosinación un polipéptido que tiene secuencias de reconocimiento para TTL tal como se describe en el presente documento con una tirosina o un derivado de tirosina que (ya) está conjugado con un resto tal como se describe en el presente documento. Este hallazgo de los presentes inventores fue nuevamente sorprendente ya que la TTL puede usar incluso derivados de tirosina conjugados con restos grandes o voluminosos (véase la figura 22).

La presente invención se refiere preferiblemente a un polipéptido “recombinante” o “sintético”. Un polipéptido “sintético” en el contexto de la presente invención se refiere a un polipéptido que se ha obtenido mediante métodos de biología de síntesis, incluyendo síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS), estrategia previa de captura de tiol, ligamiento químico nativo (NCL), ligamiento de proteína expresada (EPL) y el ligamiento de Staudinger, y el método de O-acil isopéptido. Tal polipéptido sintético contiene una secuencia de reconocimiento de TTL que se introduce o bien mediante adición o bien modificación de la secuencia de aminoácidos del polipéptido sintético. El término polipéptido “sintético” tal como se usa en el presente documento también incluye polipéptidos que se han tratado para alterar su secuencia de aminoácidos natural, por ejemplo, mediante desamidación. El término “recombinante” en el contexto de la presente invención se refiere a un polipéptido que está modificado por ingeniería genética, es decir, modificado para introducir o añadir una secuencia de reconocimiento para TTL en el extremo C-terminal de un polipéptido. Por tanto, excluye tales tubulinas que contienen de manera natural una secuencia de reconocimiento de TTL.

“Modificado para introducir una secuencia de reconocimiento” significa que la secuencia de aminoácidos de un polipéptido se modifica para introducir una secuencia de reconocimiento de TTL, tal como reemplazar o delecionar, pero no añadir o insertar, uno o más aminoácidos para construir una secuencia de reconocimiento de TTL en el extremo C-terminal de un polipéptido.

“Modificado para añadir una secuencia de reconocimiento” significa que la secuencia de aminoácidos de un polipéptido se modifica para añadir una secuencia de reconocimiento de TTL, es decir, añadir o insertar uno o más aminoácidos para equipar un polipéptido con una secuencia de reconocimiento de TTL en su extremo C-terminal.

Los ejemplos de polipéptidos o proteínas incluyen hormonas, citocinas y linfocinas recombinantes o sintéticas, anticuerpos, receptores, moléculas de adhesión y enzimas, así como fragmentos de los mismos. Una lista no exhaustiva de polipéptidos deseados incluye, por ejemplo, hormona de crecimiento humana, hormona de crecimiento bovina, hormona paratiroidea, hormona estimulante de tiroides, crecimiento de hormona estimulante de folículos, hormona luteinizante recombinantes o sintéticas; factor liberador de hormonas; lipoproteínas; alfa-1-antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; calcitonina; glucagón; moléculas tales como renina; factores de coagulación tales como factor VIIIC, factor IX, factor tisular y factor de von Willebrand; factores anticoagulantes tales como proteína C, factor natriurético auricular, tensioactivo pulmonar; un activador de plasminógeno, tal como urocinasa u orina humana o activador de plasminógeno de tipo tisular (t-PA); bombesina; trombina; factor de crecimiento hemopoyético; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa; RANTES (regulado en la activación normalmente de células T expresadas y secretadas); proteína inflamatoria de macrófagos humanos (MIP-1-alfa); una albúmina sérica tal como albúmina sérica humana; sustancia inhibidora de mulleriana; cadena A o B de relaxina; prorelaxina; péptido asociado a gonadotropina de ratón; ADNasa; inhibina; activina; receptores para hormonas o factores de crecimiento; integrina; proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurotrófico tal como factor neurotrófico derivado de hueso (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5 o -6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6), factores de crecimiento que incluyen factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento nervioso tal como NGF; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos tal como aFGF, bFGF, FGF-4, FGF-5, FGF-6; factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento transformante (TGF) tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF-pl, TGF-p2, TGF-p3, TGF-p4 o TGF-p5; factor de crecimiento similar a insulina I y II (IGF-I e IGF-11); des (1-3)-IGF-I (IGF-I cerebral), proteínas de unión al factor de crecimiento similar a la insulina; proteínas CD tales como CD-3, CD-4, CD-8 y CD-19; eritropoyetina; factores osteoinductores; inmunotoxinas; una proteína morfogenética ósea (BMP); un interferón tal como interferón alfa, beta y gamma; factores estimulantes de colonias (CSF), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (IL), por ejemplo, IL-1 a IL-10; superóxido dismutasa; eritropoyetina; receptores de células T; proteínas de membrana superficial, por ejemplo, HER2; factor de aceleración de señuelo; antígeno viral tal como, por ejemplo, una porción de la envoltura del SIDA; proteínas de transporte; receptores de asentamiento; adresinas; proteínas reguladoras; anticuerpos; proteínas quiméricas tales como inmunoadhesinas, y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos mencionados anteriormente.

El polipéptido de la invención se modifica para comprender una secuencia de reconocimiento para tubulina-tirosina ligasa (TTL) en su extremo C-terminal, que comprende al menos la secuencia de aminoácidos X4X3X2X1. El término “secuencia de reconocimiento” o “motivo de reconocimiento” se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a un tramo de aminoácidos que se reconoce por la TTL. Tales secuencias de reconocimiento se conocen en la técnica; véase, por ejemplo, Ruediger et al. (1994), Eur. J. Biochem. 220, 309-320 o Prota et al. (2013), J. Cell. Biol. 200, n.° 3, 259-270. Además, el experto puede someter a prueba fácilmente si una secuencia de aminoácidos de interés es una secuencia de reconocimiento de TTL aplicando, por ejemplo, el ensayo de “tirosinación de péptidos mediante TTL” descrito en Ruediger et al. “Reconocido” por la TTL incluye la unión de la TTL al motivo de reconocimiento. El motivo de reconocimiento comprende ventajosamente al menos 4 aminoácidos que se designan X4, X3, X2 y Xi en el presente documento. En general, “X” puede denotar cualquier aminoácido a menos que se indique lo contrario en el presente documento. Los aminoácidos incluyen, pero no se limitan a, los veinte aminoácidos “convencionales”: isoleucina (Ile, I), leucina (Leu, L), lisina (Lys, K), metionina (Met, M), fenilalanina (Phe, F), treonina (Thr, T), triptófano (Trp, W), valina (Val, V), alanina (Ala, A), asparagina (Asn, N), aspartato (Asp, D), cisteína (Cys, C), glutamato (Glu, E), glutamina (Gln, Q), glicina (Gly, G), prolina (Prol, P), serina (Ser, S), tirosina (Tyr, Y), arginina (Arg, R) e histidina (His, H). La presente invención también incluye, sin limitación, aminoácidos de configuración D, p-aminoácidos, aminoácidos que tienen cadenas laterales, así como todos los aminoácidos no naturales conocidos por un experto en la técnica.

Xi se refiere al último aminoácido C-terminal en el polipéptido, X2 al penúltimo, y así sucesivamente. Xi es E y X2 se selecciona de E, D o C. X3 es preferiblemente G, S, A, V o F, mientras que X4 se selecciona preferiblemente de E, D, A, K o P. En algunas realizaciones, X5 (es decir, el siguiente aminoácido hacia el extremo N-terminal de X4) se selecciona de E, A y V. En algunas realizaciones, X6 (es decir, el aminoácido que sigue a X5) puede seleccionarse de entre E, A, K y G. En general, cualquier combinación de Xi y X2 es concebible que no elimina la capacidad de la TTL para reconocer el motivo de reconocimiento respectivo. La secuencia de reconocimiento de TTL introducida en o añadida al polipéptido de la invención puede ser, por ejemplo, EGEE (SEQ ID No. 2). En una realización particular, la secuencia de reconocimiento de TTL es VDSVEGEGEEEGEE (SEQ ID No. 3, a veces también denominada en el presente documento motivo reactivo de TTL), SVEGEGEEEGEE (SEQ ID No. 4), SADGEDEGEE (SEQ ID No. 5), SVEAEAEEGEE (SEQ ID No. 6), SYEDEDEGEE (SEQ ID No. 7) o SFEEENEGEE (SEQ ID No. 8). En general, se prevé cualquier secuencia de reconocimiento en la que Xi es E y X2 es E, D o C, que se reconoce por la TTL.

El término “que tiene actividad biológica” tal como se usa en el presente documento significa que un polipéptido tiene una funcionalidad específica. Por ejemplo, si el polipéptido de la invención es un anticuerpo modificado, “que tiene actividad biológica” puede significar, por ejemplo, que tiene actividad de unión a antígeno. Si el polipéptido de la invención es una enzima modificada, “que tiene actividad biológica” puede significar, por ejemplo, que tiene actividad enzimática.

El polipéptido puede comprender una secuencia ligadora que precede a la secuencia de reconocimiento de la tubulina-tirosina ligasa. Una “secuencia ligadora” (también denominada “secuencia espadadora”) es una secuencia de aminoácidos que se introduce entre el polipéptido de la invención y la secuencia de reconocimiento de TTL, para conectar el polipéptido y la secuencia de reconocimiento de TTL. Por ejemplo, puede requerirse una secuencia ligadora para permitir el plegamiento preciso del polipéptido de la invención y/o para garantizar la flexibilidad y accesibilidad de la secuencia de reconocimiento de TTL. Existe una gran variedad de secuencias ligadoras posibles y está dentro del conocimiento del experto en la técnica elegir una secuencia ligadora adecuada basándose, por ejemplo, en el tamaño, la secuencia y las propiedades físicas (tal como hidrofobicidad) del polipéptido de la invención. Las secuencias ligadoras pueden componerse de residuos flexibles como glicina y serina. Puede preferirse que la secuencia ligadora no adopte una estructura secundaria (tal como una estructura de hélice a o una lámina p) para garantizar la máxima flexibilidad del motivo de reconocimiento de TTL unido.

En el polipéptido de la invención, un derivado de tirosina puede unirse de manera covalente a dicha secuencia de reconocimiento. El derivado de tirosina puede estar sustituido con los grupos funcionales mencionados anteriormente en las posiciones 2, 3 y 4, así como en la posición bencílica. Los grupos funcionales pueden conectarse directamente en las posiciones mencionadas anteriormente o mediante un espaciador, tal como un espaciador de alquilo entre medias. A modo de ejemplo, el derivado de tirosina puede ser una tirosina sustituida en 3 o sustituida en 4, tal como el derivado de tirosina sustituido en 3 ó 4 es 3-nitrotirosina, 3-aminotirosina, 3-azidotirosina, 3-formiltirosina, 3-acetiltirosina, 3-yodotirosina o 4-aminofenilalanina. El término “derivado de tirosina” también abarca fenilalanina o cualquier otro sustrato que esté unido por tubulina-tirosina ligasa al extremo C-terminal de un polipéptido que preferiblemente comprende una secuencia de reconocimiento para TTL. Ventajosamente, dicho otro sustrato se asemeja a tirosina o derivado de tirosina tal como se describe en el presente documento.

Preferiblemente, dicho otro sustrato contiene un grupo funcional no natural para modificaciones quimioselectivas o bioortogonales.

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El término “unido de manera covalente” se usa en el presente documento de manera intercambiable con los términos “enlazado de manera covalente a” y “adjunto de manera covalente” y se refiere a un tipo de enlace químico que implica la participación de dos pares de electrones entre átomos. Sin desear limitarse a una teoría específica, se prevé que el derivado de tirosina esté unido de manera covalente a la secuencia de reconocimiento de TTL por la acción de la TTL, de modo que el derivado de tirosina esté unido al último aminoácido C-terminal de la secuencia de reconocimiento, que se designa X1 en el presente documento. Lo mismo se aplica para la unión de tirosina, haciendo los cambios necesarios. La secuencia de aminoácidos C-terminal resultante será entonces X4X3X2X1X0, en la que X0 se refiere a una tirosina o un derivado de tirosina.

El derivado de tirosina puede contener además un grupo funcional no natural (artificial), que se usa preferiblemente para modificaciones quimioselectivas o bioortogonales. El término “química click” se refiere a una filosofía química introducida por Kolb, Finn y Sharpless en 2001 y abarca un grupo de potentes reacciones de ligación que pueden generar enlaces covalentes de manera rápida y fiable al unir pequeñas unidades que comprenden grupos reactivos. Las reacciones de química click son normalmente modulares, de amplio alcance, dan altos rendimientos químicos, generan subproductos inofensivos, son estereoespecíficas, presentan una gran fuerza motriz termodinámica > 84 kJ/mol para favorecer una reacción con un solo producto de reacción y/o pueden llevarse a cabo usando materiales de partida y reactivos fácilmente disponibles en condiciones de reacción fisiológicas simples. Además, las reacciones de química click preferiblemente no usan disolventes tóxicos, o usan un disolvente que sea benigno o que se elimine fácilmente (preferiblemente agua) y/o proporcione un aislamiento simple del producto mediante métodos no cromatográficos (cristalización o destilación). Una reacción exotérmica distinta hace que un reactivo esté “cargado por resorte”.

Las reacciones de química click comprenden, por ejemplo, reacciones de cicloadición, especialmente de la familia 1,3-dipolar, reacciones hetero-Diels-Alder; reacciones de apertura de anillo nucleófilas, por ejemplo, de electrófilos heterocíclicos tensados, tales como epóxidos, aziridinas, sulfatos cíclicos, sulfamidatos cíclicos, iones de aziridinio e iones de episulfonio; química de carbonilo de tipo no aldólico (por ejemplo, la formación de éteres de oxima, hidrazonas y heterociclos aromáticos); y adición a múltiples enlaces carbono-carbono; por ejemplo, reacciones de oxidación, tales como epoxidación, dihidroxilación, aziridinación y adiciones de haluros de nitrosilo y sulfenilo, pero también determinadas reacciones de adición de Michael. Kolb, Finn y Sharpless (2001) han descrito los principios generales de las reacciones de química click. Está dentro del conocimiento del experto en la técnica seleccionar una reacción de química click que sea adecuada para unir un resto deseado al derivado de tirosina unido de manera covalente al polipéptido de la invención.

El término “asidero de química click”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un reactante, o un grupo reactivo, que puede participar en una reacción de química click. Tal reactante o grupo reactivo es preferiblemente un grupo funcional no natural (artificial) para una modificación quimioselectiva o bioortogonal; sin embargo, alternativamente, puede ser un grupo funcional natural para una modificación quimioselectiva o bioortogonal. Por ejemplo, un alquino tensado, por ejemplo, un ciclooctino, es un asidero de química click, ya que puede participar en una cicloadición promovida por tensión, por ejemplo, cicloadición de azida-alquino promovida por tensión (SPAAC). En general, las reacciones de química click requieren al menos dos moléculas que comprendan asideros de química click que puedan reaccionar entre sí. Dichos pares de asideros de química click que son reactivos entre sí a veces se denominan en el presente documento “asideros de química click asociados”. Por ejemplo, una azida es un asidero de química click asociado para un ciclooctino o cualquier otro alquino. En el contexto de la presente invención, el asidero de química click puede seleccionarse preferiblemente del grupo que consiste en alquino terminal, azida, alquino tensado, dieno, dienófilo, alcoxiamina, carbonilo, fosfina, hidrazida, tiol, tetrazina, alqueno y ciclooctino. Otros asideros de química click adecuados son fácilmente accesibles para el experto en la técnica.

En el contexto de la conjugación a través de química click, la conjugación se realiza a través de un enlace covalente formado por la reacción de los asideros de química click. En determinadas realizaciones, la asociación es covalente, y se dice que las entidades están “conjugadas” entre sí. En algunas realizaciones, una proteína se conjuga de manera postraduccional con otra molécula, por ejemplo, una segunda proteína, formando un enlace covalente entre la proteína y la otra molécula después de que la proteína se haya traducido y, en algunas realizaciones, después de que la proteína se haya aislado En algunas realizaciones, la conjugación postraduccional de la proteína y la segunda molécula, por ejemplo, la segunda proteína, se efectúa mediante la instalación de un asidero de química click en la proteína y un segundo asidero de química click, que puede reaccionar con el primer asidero de química click, en la segunda molécula, y llevar a cabo una reacción de química click en la que los asideros de química click reaccionan y forman un enlace covalente entre la proteína y la segunda molécula, generando así una proteína quimérica. En algunas realizaciones, dos proteínas se conjugan en sus respectivos extremos C-terminales, generando una proteína quimérica conjugada C-C. En algunas realizaciones, dos proteínas se conjugan en sus respectivos extremos N-terminales, generando una proteína quimérica conjugada N-N.

El término “alqueno” se refiere a un hidrocarburo que tiene al menos un doble enlace carbono-carbono.

El término “alquino” se refiere a un hidrocarburo que tiene al menos un triple enlace carbono-carbono. Tal como se usa en el presente documento, el término “alquino terminal” se refiere a un alquino en el que al menos un átomo de hidrógeno está unido a un átomo de carbono de triple enlace. El término “alquino tensado” se refiere a, tal como se usa en el presente documento, el término “grupo alquino tensado” puede comprender el anillo que comprende un triple enlace carbono-carbono y también puede comprender grupos sustituyentes. El ciclooctino es un alquino tensado a modo de ejemplo que está previsto para su uso en la presente invención, por ejemplo, dibenzociclooctino (DBCO).

El término “azida” o “azido”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo de la fórmula (-N3). El término “dieno” se refiere a un hidrocarburo que contiene dos dobles enlaces de carbono.

El término “dienófilo” se refiere a un compuesto que reacciona con un dieno en una reacción de Diels-Alder para dar un producto de cicloadición.

El término “alcoxiamina” se refiere a cualquier derivado de alcoxilo de una amina.

El término “alcoxilo” se refiere a un grupo alquilo unido a través de un oxígeno (-O-).

El término “amina” se refiere a un derivado de amoniaco, en el que uno o más átomos de hidrógeno se han reemplazado por un sustituyente tal como un grupo alquilo o arilo.

Los términos “alquil” o “alquilo” se refieren a grupos hidrocarbonados de cadena lineal o ramificada que tienen de 1 a 12 átomos de carbono, preferiblemente de 1 a 8 átomos de carbono.

El término “carbonilo” se refiere a un grupo que comprende un átomo de carbono doblemente unido a un átomo de oxígeno. Los ejemplos incluyen cetonas, aldehídos o ácidos carboxílicos, o formas protegidas de los mismos.

El término “fosfina” se refiere al compuesto con la fórmula química PZ1Z2Z3, en la que cada uno de Z1, Z3 y Z2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo heterocíclico, arilo sustituido, heteroarilo, sililo, alcoxilo, ariloxilo, amino, y combinaciones de los mismos. El término “fosfonito” P(OZ1)(OZ2)Z3, en la que cada uno de Z1, Z3 y Z2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo heterocíclico, arilo sustituido, heteroarilo, sililo, alcoxilo, ariloxilo, amino, y combinaciones de los mismos. El término “fosfito” P(OZ1)(OZ2)(OZ3), en la que cada uno de Z1, Z3 y Z2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo heterocíclico, arilo sustituido, heteroarilo, sililo, alcoxilo, ariloxilo, amino, y combinaciones de los mismos.

El término “hidrazida” se refiere a un compuesto que tiene un enlace covalente nitrógeno-nitrógeno con cuatro sustituyentes, siendo al menos uno de ellos un grupo acilo.

El término “tio” o “tiol”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo de la fórmula (-SR), en la que R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, ariloxilo, sililo, y combinaciones de los mismos. Un “tiol sustituido” se refiere a un grupo de la fórmula (-SRr), en la que Rr puede ser cualquier sustituyente que dé como resultado la formación de un resto estable (por ejemplo, un grupo protector de tiol; alifático, alquilo, alquenilo, alquinilo, heteroalifático, heterocíclico, arilo, heteroarilo, acilo, sulfinilo, sulfonilo, ciano, nitro, alquilarilo, arilalquilo, y similares, cada uno de los cuales puede o no estar sustituido adicionalmente).

El término “alifático”, tal como se usa en el presente documento, incluye hidrocarburos tanto saturados como insaturados, no aromáticos, de cadena lineal (es decir, no ramificados), ramificados, acíclicos y cíclicos (es decir, carbocíclicos), que están opcionalmente sustituidos con uno o más grupos funcionales. Tal como apreciará un experto habitual en la técnica, se pretende que “alifático” en el presente documento incluya, pero no se limite a, restos alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo y cicloalquinilo. Por tanto, tal como se usa en el presente documento, el término “alquilo” incluye grupos alquilo lineales, ramificados y cíclicos. Una convención análoga se aplica a otros términos genéricos tales como “alquenilo”, “alquinilo”, y similares. Además, tal como se usa en el presente documento, los términos “alquilo”, “alquenilo”, “alquinilo”, y similares abarcan grupos tanto sustituidos como no sustituidos. En determinadas realizaciones, tal como se usa en el presente documento, “alifático” se usa para indicar aquellos grupos alifáticos (cíclicos, acíclicos, sustituidos, no sustituidos, ramificados o no ramificados) que tienen 1-20 átomos de carbono (alifático C1-20). En determinadas realizaciones, el grupo alifático tiene 1-10 átomos de carbono (alifático C1-10). En determinadas realizaciones, el grupo alifático tiene 1-6 átomos de carbono (alifático C1-6). En determinadas realizaciones, el grupo alifático tiene 1-5 átomos de carbono (alifático C1-5). En determinadas realizaciones, el grupo alifático tiene 1-4 átomos de carbono (alifático C1-4). En determinadas realizaciones, el grupo alifático tiene 1-3 átomos de carbono (alifático C1-3). En determinadas realizaciones, el grupo alifático tiene 1-2 átomos de carbono (alifático C1-2). Los sustituyentes del grupo alifático incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los sustituyentes descritos en el presente documento, que dan como resultado la formación de un resto estable.

El término “alquilo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a radicales hidrocarbonados saturados de cadena lineal o ramificada derivados de un resto hidrocarbonado que contiene entre uno y veinte átomos de carbono mediante la retirada de un solo átomo de hidrógeno. En algunas realizaciones, el grupo alquilo empleado en la invención contiene 1-20 átomos de carbono (alquilo C1-20). En otra realización, el grupo alquilo empleado contiene 1­ 15 átomos de carbono (alquilo C1-15). En otra realización, el grupo alquilo empleado contiene 1-10 átomos de carbono (alquilo C1-20). En otra realización, el grupo alquilo empleado contiene 1-8 átomos de carbono (alquilo C1-8). En otra realización, el grupo alquilo empleado contiene 1-6 átomos de carbono (alquilo C1-6). En otra realización, el grupo alquilo empleado contiene 1-5 átomos de carbono (alquilo C1-5). En otra realización, el grupo alquilo empleado contiene 1-4 átomos de carbono (alquilo C1-4). En otra realización, el grupo alquilo empleado contiene 1-3 átomos de carbono (alquilo C1-3). En otra realización, el grupo alquilo empleado contiene 1-2 átomos de carbono (alquilo C1-2). Los ejemplos de radicales alquilo incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, iso-butilo, sec-butilo, sec-pentilo, iso-pentilo, terc-butilo, n-pentilo, neopentilo, n-hexilo, sec-hexilo, n-heptilo, n-octilo, n-decilo, n-undecilo, dodecilo, y similares, que pueden albergar uno o más sustituyentes. Los sustituyentes del grupo alquilo incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los sustituyentes descritos en el presente documento, que dan como resultado la formación de un resto estable.

El término “alquileno”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un biradical derivado de un grupo alquilo, tal como se define en el presente documento, mediante la retirada de dos átomos de hidrógeno. Los grupos alquileno pueden ser cíclicos o acíclicos, ramificados o no ramificados, sustituidos o no sustituidos. Los sustituyentes del grupo alquileno incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los sustituyentes descritos en el presente documento, que dan como resultado la formación de un resto estable.

El término “alquenilo”, tal como se usa en el presente documento, denota un grupo monovalente derivado de un resto hidrocarbonado de cadena lineal o ramificada que tiene al menos un doble enlace carbono-carbono mediante la retirada de un solo átomo de hidrógeno. En determinadas realizaciones, el grupo alquenilo empleado en la invención contiene 2-20 átomos de carbono (alquenilo C2-20). En algunas realizaciones, el grupo alquenilo empleado en la invención contiene 2-15 átomos de carbono (alquenilo C2-15). En otra realización, el grupo alquenilo empleado contiene 2-10 átomos de carbono (alquenilo C2-10). En todavía otras realizaciones, el grupo alquenilo contiene 2-8 átomos de carbono (alquenilo C2-8). En aún otras realizaciones, el grupo alquenilo contiene 2-6 carbonos (alquenilo C2-6). En aún otras realizaciones, el grupo alquenilo contiene 2-5 carbonos (alquenilo C2-5). En aún otras realizaciones, el grupo alquenilo contiene 2-4 carbonos (alquenilo C2-4). En aún otras realizaciones, el grupo alquenilo contiene 2-3 carbonos (alquenilo C2-3). En aún otras realizaciones, el grupo alquenilo contiene 2 carbonos (alquenilo C2). Los grupos alquenilo incluyen, por ejemplo, etenilo, propenilo, butenilo, y similares, que pueden albergar uno o más sustituyentes. Los sustituyentes del grupo alquenilo incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los sustituyentes descritos en el presente documento, que dan como resultado la formación de un resto estable.

El término “alquenileno”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un biradical derivado de un grupo alquenilo, tal como se define en el presente documento, mediante la retirada de dos átomos de hidrógeno. Los grupos alquenileno pueden ser cíclicos o acíclicos, ramificados o no ramificados, sustituidos o no sustituidos. Los sustituyentes del grupo alquenileno incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los sustituyentes descritos en el presente documento, que dan como resultado la formación de un resto estable.

El término “alquinilo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo monovalente derivado de un hidrocarburo de cadena lineal o ramificada que tiene al menos un triple enlace carbono-carbono mediante la retirada de un solo átomo de hidrógeno. En determinadas realizaciones, el grupo alquinilo empleado en la invención contiene 2-20 átomos de carbono (alquinilo C2-20). En algunas realizaciones, el grupo alquinilo empleado en la invención contiene 2-15 átomos de carbono (alquinilo C2-15). En otra realización, el grupo alquinilo empleado contiene 2-10 átomos de carbono (alquinilo C2-10). En todavía otras realizaciones, el grupo alquinilo contiene 2-8 átomos de carbono (alquinilo C2-8). En todavía otras realizaciones, el grupo alquinilo contiene 2-6 átomos de carbono (alquinilo C2-6). En todavía otras realizaciones, el grupo alquinilo contiene 2-5 átomos de carbono (alquinilo C2-5). En todavía otras realizaciones, el grupo alquinilo contiene 2-4 átomos de carbono (alquinilo C2-4). En todavía otras realizaciones, el grupo alquinilo contiene 2-3 átomos de carbono (alquinilo C2-3). En todavía otras realizaciones, el grupo alquinilo contiene 2 átomos de carbono (alquinilo C2). Los grupos alquinilo representativos incluyen, pero no se limitan a, etinilo, 2-propinilo (propargilo), 1 -propinilo, y similares, que pueden albergar uno o más sustituyentes. Los sustituyentes del grupo alquinilo incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los sustituyentes descritos en el presente documento, que dan como resultado la formación de un resto estable.

El término “alquinileno”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un biradical derivado de un grupo alquinileno, tal como se define en el presente documento, mediante la retirada de dos átomos de hidrógeno. Los grupos alquinileno pueden ser cíclicos o acíclicos, ramificados o no ramificados, sustituidos o no sustituidos. Los sustituyentes del grupo alquinileno incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los sustituyentes descritos en el presente documento, que dan como resultado la formación de un resto estable.

El término “carbocíclico” o “carbociclilo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un tal como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alifático cíclico que contiene 3-10 átomos de anillo de carbono (carbocíclico C3-10). Los sustituyentes del grupo carbocíclico incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los sustituyentes descritos en el presente documento, que dan como resultado la formación de un resto estable.

El término “heteroalifático”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un resto alifático, tal como se define en el presente documento, que incluye hidrocarburos tanto saturados como insaturados, no aromáticos, de cadena lineal (es decir, no ramificados), ramificados, acíclicos, cíclicos (es decir, heterocíclicos) o policíclicos, que están opcionalmente sustituidos con uno o más grupos funcionales, y que contiene además uno o más heteroátomos (por ejemplo, átomos de oxígeno, azufre, nitrógeno, fósforo o silicio) entre átomos de carbono. En determinadas realizaciones, los restos heteroalifáticos se sustituyen mediante reemplazo independiente de uno o más de los átomos de hidrógeno en los mismos con uno o más sustituyentes. Tal como apreciará un experto habitual en la técnica, se pretende que “heteroalifático” en el presente documento incluya, pero no se limite a, restos heteroalquilo, heteroalquenilo, heteroalquinilo, heterocicloalquilo, heterocicloalquenilo y heterocicloalquinilo. Por tanto, el término “heteroalifático” incluye los términos “heteroalquilo”, “heteroalquenilo”, “heteroalquinilo”, y similares. Además, tal como se usa en el presente documento, los términos “heteroalquilo”, “heteroalquenilo”, “heteroalquinilo”, y similares abarcan grupos tanto sustituidos como no sustituidos. En determinadas realizaciones, tal como se usa en el presente documento, “heteroalifático” se usa para indicar aquellos grupos heteroalifáticos (cíclicos, acíclicos, sustituidos, no sustituidos, ramificados o no ramificados) que tienen 1-20 átomos de carbono y 1-6 heteroátomos (heteroalifático C1-20). En determinadas realizaciones, el grupo heteroalifático contiene 1-10 átomos de carbono y 1-4 heteroátomos (heteroalifático C1-10). En determinadas realizaciones, el grupo heteroalifático contiene 1-6 átomos de carbono y 1-3 heteroátomos (heteroalifático C1-6). En determinadas realizaciones, el grupo heteroalifático contiene 1­ 5 átomos de carbono y 1-3 heteroátomos (heteroalifático C1-5). En determinadas realizaciones, el grupo heteroalifático contiene 1-4 átomos de carbono y 1-2 heteroátomos (heteroalifático C1-4). En determinadas realizaciones, el grupo heteroalifático contiene 1-3 átomos de carbono y 1 heteroátomo (heteroalifático C1-3). En determinadas realizaciones, el grupo heteroalifático contiene 1-2 átomos de carbono y 1 heteroátomo (heteroalifático C1-2). Los sustituyentes del grupo heteroalifático incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los sustituyentes descritos en el presente documento, que dan como resultado la formación de un resto estable.

El término “heteroalquilo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un resto alquilo, tal como se define en el presente documento, que contiene uno o más heteroátomos (por ejemplo, átomos de oxígeno, azufre, nitrógeno, fósforo o silicio) entre átomos de carbono. En determinadas realizaciones, el grupo heteroalquilo contiene 1- 20 átomos de carbono y 1-6 heteroátomos (heteroalquilo C1-20). En determinadas realizaciones, el grupo heteroalquilo contiene 1-10 átomos de carbono y 1-4 heteroátomos (heteroalquilo C1-10). En determinadas realizaciones, el grupo heteroalquilo contiene 1-6 átomos de carbono y 1-3 heteroátomos (heteroalquilo C1-6). En determinadas realizaciones, el grupo heteroalquilo contiene 1-5 átomos de carbono y 1-3 heteroátomos (heteroalquilo C1-5). En determinadas realizaciones, el grupo heteroalquilo contiene 1-4 átomos de carbono y 1-2 heteroátomos (heteroalquilo C1-4). En determinadas realizaciones, el grupo heteroalquilo contiene 1-3 átomos de carbono y 1 heteroátomo (heteroalquilo C1-3). En determinadas realizaciones, el grupo heteroalquilo contiene 1-2 átomos de carbono y 1 heteroátomo (heteroalquilo C1-2). El término “heteroalquileno”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un biradical derivado de un grupo heteroalquilo, tal como se define en el presente documento, mediante la retirada de dos átomos de hidrógeno. Los grupos heteroalquileno pueden ser cíclicos o acíclicos, ramificados o no ramificados, sustituidos o no sustituidos.

Los sustituyentes del grupo heteroalquileno incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los sustituyentes descritos en el presente documento, que dan como resultado la formación de un resto estable.

El término “heteroalquenilo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un resto alquenilo, tal como se define en el presente documento, que contiene además uno o más heteroátomos (por ejemplo, átomos de oxígeno, azufre, nitrógeno, fósforo o silicio) entre átomos de carbono. En determinadas realizaciones, el grupo heteroalquenilo contiene 2-20 átomos de carbono y 1-6 heteroátomos (heteroalquenilo C2-20). En determinadas realizaciones, el grupo heteroalquenilo contiene 2-10 átomos de carbono y 1-4 heteroátomos (heteroalquenilo C2-10). En determinadas realizaciones, el grupo heteroalquenilo contiene 2-6 átomos de carbono y 1-3 heteroátomos (heteroalquenilo C2-6). En determinadas realizaciones, el grupo heteroalquenilo contiene 2-5 átomos de carbono y 1­ 3 heteroátomos (heteroalquenilo C2-5). En determinadas realizaciones, el grupo heteroalquenilo contiene 2-4 átomos de carbono y 1-2 heteroátomos (heteroalquenilo C2-4). En determinadas realizaciones, el grupo heteroalquenilo contiene 2-3 átomos de carbono y 1 heteroátomo (heteroalquenilo C2-3). El término “heteroalquenileno”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un biradical derivado de un grupo heteroalquenilo, tal como se define en el presente documento, mediante la retirada de dos átomos de hidrógeno. Los grupos heteroalquenileno pueden ser cíclicos o acíclicos, ramificados o no ramificados, sustituidos o no sustituidos.

El término “heteroalquinilo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un resto alquinilo, tal como se define en el presente documento, que contiene además uno o más heteroátomos (por ejemplo, átomos de oxígeno, azufre, nitrógeno, fósforo o silicio) entre átomos de carbono. En determinadas realizaciones, el grupo heteroalquinilo contiene 2-20 átomos de carbono y 1-6 heteroátomos (heteroalquinilo C2-20).

En determinadas realizaciones, el grupo heteroalquinilo contiene 2-10 átomos de carbono y 1-4 heteroátomos (heteroalquinilo C2-10). En determinadas realizaciones, el grupo heteroalquinilo contiene 2-6 átomos de carbono y 1-3 heteroátomos (heteroalquinilo C2-6). En determinadas realizaciones, el grupo heteroalquinilo contiene 2-5 átomos de carbono y 1-3 heteroátomos (C2-5 heteroalquinilo). En determinadas realizaciones, el grupo heteroalquinilo contiene 2- 4 átomos de carbono y 1-2 heteroátomos (heteroalquinilo C2-4). En determinadas realizaciones, el grupo heteroalquinilo contiene 2-3 átomos de carbono y 1 heteroátomo (heteroalquinilo C2-3). El término “heteroalquinileno”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un biradical derivado de un grupo heteroalquinilo, tal como se define en el presente documento, mediante la retirada de dos átomos de hidrógeno. Los grupos heteroalquinileno pueden ser cíclicos o acíclicos, ramificados o no ramificados, sustituidos o no sustituidos.

El término “heterocíclico”, “heterociclos” o “heterociclilo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo heteroalifático cíclico. Un grupo heterocíclico se refiere a un sistema de anillo no aromático, parcialmente insaturado o totalmente saturado, de 3 a 10 miembros, que incluye anillos individuales de 3 a 8 átomos de tamaño, y sistemas de anillo bicíclicos y tricíclicos que pueden incluir grupos arilo o heteroarilo aromáticos de cinco o seis miembros condensados con un anillo no aromático. Estos anillos heterocíclicos incluyen aquellos que tienen desde uno hasta tres heteroátomos independientemente seleccionados de oxígeno, azufre y nitrógeno, en los que los heteroátomos de nitrógeno y azufre pueden estar opcionalmente oxidado y el heteroátomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternizado. En determinadas realizaciones, el término heterocíclico se refiere a un anillo no aromático de 5, 6 ó 7 miembros o un grupo policíclico en el que al menos un átomo de anillo es un heteroátomo seleccionado de O, S, y N (en el que los heteroátomos nitrógeno y azufre puede estar opcionalmente oxidado), y los átomos de anillo restantes son carbono, uniéndose el radical con el resto de la molécula por medio de cualquiera de los átomos de anillo. Los grupos heterociclilo incluyen, pero no se limitan a, un grupo bi o tricíclico, que comprende anillos condensados de cinco, seis o siete miembros que tienen entre uno y tres heteroátomos independientemente seleccionados de oxígeno, azufre y nitrógeno, en los que (i) cada anillo de 5 miembros tiene de 0 a 2 dobles enlaces, cada anillo de 6 miembros tiene de 0 a 2 dobles enlaces y cada anillo de 7 miembros tiene de 0 a 3 dobles enlaces, (ii) los heteroátomos de nitrógeno y azufre pueden estar opcionalmente oxidados, (iii) el heteroátomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternizado y (iv) cualquiera de los anillos heterocíclicos anteriores puede condensarse con un anillo de arilo o heteroarilo.

Los heterociclos a modo de ejemplo incluyen azaciclopropanilo, azaciclobutanilo, 1,3-diazatidinilo, piperidinilo, piperazinilo, azocanilo, tiaranilo, tietanilo, tetrahidrotiofenilo, ditiolanilo, tiaciclohexanilo, oxiranilo, oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropuranilo, dioxanilo, oxatiolanilo, morfolinilo, tioxanilo, tetrahidronaftilo, y similares, que pueden albergar uno o más sustituyentes. Los sustituyentes incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los sustituyentes descritos en el presente documento, que dan como resultado la formación de un resto estable.

El término “arilo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un sistema de anillo aromático mono o policíclico que tiene 3-20 átomos de anillo, de los cuales todos los átomos de anillo son carbono, y que pueden estar sustituidos o no sustituidos. En determinadas realizaciones de la presente invención, “arilo” se refiere a un sistema de anillo aromático C4-C20 mono, bi o tricíclico que tiene uno, dos o tres anillos aromáticos que incluye, pero no se limita a, fenilo, bifenilo, naftilo, y similares, que pueden albergar uno o más sustituyentes. Los sustituyentes de arilo incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los sustituyentes descritos en el presente documento, que dan como resultado la formación de un resto estable. El término “arileno”, tal como se usa en el presente documento se refiere a un biradical de arilo derivado de un grupo arilo, tal como se define en el presente documento, mediante la retirada de dos átomos de hidrógeno. Los grupos arileno pueden estar sustituidos o no sustituidos. Los sustituyentes de grupo arileno incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los sustituyentes descritos en el presente documento, que dan como resultado la formación de un resto estable. Además, pueden incorporarse grupos arileno como un grupo ligador en un grupo alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, heteroalquenileno o heteroalquinileno, tal como se definen en el presente documento.

El término “heteroarilo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un sistema de anillo aromático mono o policíclico que tiene 3-20 átomos de anillo, de los cuales un átomo de anillo se selecciona de S, O y N; cero, uno o dos átomos de anillo son heteroátomos adicionales independientemente seleccionados de S, O y N; y los átomos de anillo restantes son carbono, uniéndose el radical con el resto de la molécula por medio de cualquiera de los átomos de anillo. Los heteroarilos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, piridinilo, pirimidinilo, pirazinilo, piridazinilo, triazinilo, tetrazinilo, piirolizinilo, indolilo, quinolinilo, isoquinolinilo, benzoimidazolilo, indazolilo, quinolinilo, isoquinolinilo, quinolizinilo, cinolinilo, quinazolinilo, ftalazinilo, naftridinilo, quinoxalinilo, tiofenilo, tianaftenilo, furanilo, benzofuranilo, benzotiazolilo, tiazolinilo, isotiazolilo, tiadiazolinilo, oxazolilo, isoxazolilo, oxadiaziolilo, oxadiaziolilo, y similares, que pueden albergar uno o más sustituyentes. Los sustituyentes del heteroarilo incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los sustituyentes descritos en el presente documento, que dan como resultado la formación de un resto estable.

El término “heteroarileno”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un biradical derivado de un grupo heteroarilo, tal como se define en el presente documento, mediante la retirada de dos átomos de hidrógeno. Los grupos heteroarileno pueden estar sustituidos o no sustituidos. Además, pueden incorporarse grupos heteroarileno como grupo ligador en un grupo alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, heteroalquenileno o heteroalquinileno, tal como se definen en el presente documento. Los sustituyentes del grupo heteroarileno incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los sustituyentes descritos en el presente documento, que dan como resultado la formación de un resto estable.

El término “acilo”, tal como se usa en el presente documento, es un subconjunto de un grupo alquilo sustituido, y se refiere a un grupo que tiene la fórmula general -C(=0)R^A , -C(=0)OR^A, -C(=0)-0-C(=0)R^A, -C(=0)SR^A, -C(=O)N(R^A)², -C(=S)R^A , -C(=S)N(R^a )², y -C(=S)S(R^A), -C(=NR^A)R^A , -C(=NR^A )OR^A , -C(=NR^A)SR^A y -C(=NR^A)N(R^A)², en las que R^A es hidrógeno; halógeno; hidroxilo sustituido o no sustituido; tiol sustituido o no sustituido; amino sustituido o no sustituido; acilo; alifático opcionalmente sustituido; heteroalifático opcionalmente sustituido; alquilo opcionalmente sustituido; alquenilo opcionalmente sustituido; alquinilo opcionalmente sustituido; arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, oxilo alifático, oxilo heteroalifático, alquiloxilo, heteroalquiloxilo, ariloxilo, heteroariloxilo, tioxilo alifático, tioxilo heteroalifático, alquiltioxilo, heteroalquiltioxilo, ariltioxilo, heteroariltioxilo, mono o diamino alifático, mono o diamino heteroalifático, mono o dialquilamino, mono o diheteroalquilamino, mono o diarilamino, o mono o diheteroarilamino; o dos grupos RA tomados juntos forman un anillo heterocíclico de 5 a 6 miembros. Los grupos acilo a modo de ejemplo incluyen aldehídos (-CHO), ácidos carboxílicos (-CO2H), cetonas, haluros de acilo, ésteres, amidas, iminas, carbonatos, carbamatos y ureas. Los sustituyentes del acilo incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los sustituyentes descritos en el presente documento, que dan como resultado la formación de un resto estable.

El término “acileno”, tal como se usa en el presente documento, es un subconjunto de un grupo alquileno sustituido, alquenileno sustituido, alquinileno sustituido, heteroalquileno sustituido, heteroalquenileno sustituido o heteroalquinileno sustituido, y se refiere a un grupo acilo que tiene las fórmulas generales: -R°-(C=X1)-R0-, -R°-X2(C=X1)-R0- o -R°-X2(C=X1)X3-R0-, en las que X1, X2, X3 es, independientemente, oxígeno, azufre o NRr, en la que Rr es hidrógeno o alifático opcionalmente sustituido, y R0 es un grupo alquileno, alquenileno, alquinileno, heteroalquileno, heteroalquenileno o heteroalquinileno opcionalmente sustituido, tal como se define en el presente documento. Los grupos acileno a modo de ejemplo en los que R° es alquileno incluyen -(CH²)^t -0(C=0)-(CH²)^t -; -(CH²)^t -NR^p(C=0)-(CH²)^t -; -(CH2)T-O(C=NRr)-(CH2)T-; -(CH²)^t -NR^p(C=NR^p)-(CH²)^t -; -(CH²)^t (C=0)-(CH²)a; _(CH2) ^a(C=NR^r )-(CH²)a; -(CH²)^t -S(C=S)-(CH²)^t ; -(CH²)^t NRr(C=S)-(CH2)T; -(CH2)T-S(C=NRr)-(CH2)T; -(CH2)T-O(C=S)-(CH²)^t ; -(CH²)^t -(C=S)-(CH²)^t -; o -(CH²)^t -S(C=0)-(CH²)^t , y similares, que pueden albergar uno o más sustituyentes; y en los que cada aparición de T es, independientemente, un número entero entre 0 y 20. Los sustituyentes del acileno incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los sustituyentes descritos en el presente documento, que dan como resultado la formación de un resto estable.

Cabe destacar que la invención no se limita a los asideros de química click a modo de ejemplo anteriores, y serán evidentes para los expertos en la técnica asideros de química click adicionales, pares de asideros de química click reactivos y condiciones de reacción para tales pares de asideros de química click.

Otros métodos adecuados para conjugar un resto con el derivado de tirosina del polipéptido de la invención comprenden reacciones de Staudinger (por ejemplo, ligamiento de Staudinger, reacción de Staudinger con fosfito), cicloadiciones promovidas por tensión, ligamientos de tetrazina, reacciones de Diels-Alder de demanda de electrones inversa, reacciones de formación de tiazolidina de aldehídos o cetonas con 1,2-aminotioles, reacciones de formación de oxazolidina de aldehídos o cetonas con 1,2-aminoalcoholes, reacciones de formación de acetal de aldehídos o cetonas con 1,2-dioles, catalizadas por metales, en particular acoplamientos cruzados catalizados por Pd, Cu, Ni y Fe con derivados de tirosina sustituidos con grupos aceptores de electrones.

Se prevé que un resto pueda unirse al derivado de tirosina unido de manera covalente al polipéptido de la invención, por ejemplo, mediante química de click o cualquier otro método adecuado tal como se describe en el presente documento. Por tanto, un resto puede conjugarse con el derivado de tirosina de un polipéptido sometido a tirosinación mediante un enlace no peptídico, sin embargo, en la alternativa, también puede conjugarse con el derivado de tirosina de un polipéptido sometido a tirosinación mediante un enlace peptídico. Dicho resto puede ser un portador, un polipéptido, un marcador detectable, un compuesto químico, un ácido nucleico, un hidrato de carbono o un lípido.

El término “portador” cuando se usa en el presente documento se refiere a un resto, tal como, por ejemplo, una molécula o un polímero, que actúa para mejorar la administración, eficacia y/o estabilidad del polipéptido de la invención. Por ejemplo, si el polipéptido de la invención se prevé para el tratamiento de un sujeto tal como se describe en el presente documento, el portador puede ser un portador farmacéuticamente aceptable que puede dirigir el polipéptido de la invención a una ubicación específica, facilitar su transporte, potenciar su estabilidad sérica, biodisponibilidad, y similares. En el presente documento se describen portadores farmacéuticamente aceptables. Sin embargo, un portador también puede ser una perla, tal como una perla magnética, o una superficie sólida. Una superficie sólida puede seleccionarse de poliestireno, polipropileno, poli(cloruro de vinilo), poliacrilamida, celulosas, dextranos, polímeros y copolímeros sintéticos, látex, sílice, agarosa, metal, vidrio o carbono.

Alternativamente, el resto que se conjuga con el derivado de tirosina unido al polipéptido de la invención es un polipéptido (denominado a continuación en el presente documento “resto polipeptídico”). Es concebible cualquier polipéptido que pueda unirse al derivado de tirosina unido de manera covalente al polipéptido de la invención. El resto polipeptídico puede requerir modificación para poder unirse.

En una realización particular, el resto polipeptídico es un anticuerpo o fragmento del mismo. Tal como se conoce bien en la técnica, un anticuerpo es una molécula de inmunoglobulina que puede unirse de manera específica a una diana, tal como un hidrato de carbono, polinucleótido, lípido, polipéptido, etc., a través de al menos un sitio de reconocimiento de epítopo, ubicado en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Tal como se usa en el presente documento, el término abarca anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, scFv, DART, anticuerpos de dominio, nanocuerpos, adnectina, affibodies, anticalinas, DARPin, aptómeros, o equivalentes funcionales de los mismos de una cualquiera de las especies de anticuerpo mencionadas anteriormente así como aglutinantes de afinidad.

Un “marcador detectable” es una molécula o un material que puede producir una señal detectable (tal como visual, electrónica u otra) que indica la presencia y/o concentración del marcador en una muestra. De ese modo, por ejemplo, puede detectarse la presencia, ubicación y/o concentración del polipéptido en una muestra detectando la señal producida por el marcador detectable. Un marcador detectable puede detectarse directa o indirectamente. Se apreciará que el marcador puede unirse a o incorporarse en una molécula, por ejemplo, una proteína, un polipéptido u otra entidad, en cualquier posición. Se apreciará que, en determinadas realizaciones, un marcador puede reaccionar con un sustrato adecuado (por ejemplo, una luciferina) para generar una señal detectable. En particular, el marcador detectable puede ser un fluoróforo, una enzima (peroxidasa, luciferasa), un radioisótopo, una proteína fluorescente o un colorante fluorescente. Otros marcadores detectables incluyen marcadores quimioluminiscentes, marcadores electroquimioluminiscentes, marcadores bioluminiscentes, polímeros, partículas poliméricas, partículas metálicas, haptenos y colorantes.

Un “fluoróforo” (o fluorocromo) es un compuesto químico fluorescente que puede reemitir luz tras la excitación con luz. Los ejemplos de fluoróforos incluyen 5-(y 6)-carboxifluoresceína, 5- o 6-carboxifluoresceína, ácido 6-(fluoresceína)-5-(y 6)-carboxamidohexanoico, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina y colorantes tales como Cy2, Cy3 y Cy5, cumarina opcionalmente sustituida incluyendo AMCA, PerCP, ficobiliproteínas incluyendo R-ficoeritrina (RPE) y aloficoeritrina (APC), rojo Texas, rojo Princeton, marcadores fluorescentes inorgánicos tales como partículas basadas en material semiconductor como nanocristalitos de CdSe recubiertos.

Los ejemplos de proteínas fluorescentes incluyen proteínas fluorescentes a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, Sirius, Azurite, EBFP, EBFP2, TagBFP, mTurquoise, ECFP, Cerulean, CyPet, TagCFP, mTFPI, mUkGI, mAGI, AcGFPI, TagGFP2, EGFP, GFP, mWasabi, EmGFP, YFP, TagYPF, Ypet, EYFP, Topaz, SYFP2, Venus, Citrine, mKO, mK02, mOrange, mOrange2, TagRFP, TagRFP-T, mStrawberry, mRuby, mCherry, mRaspberry, mKate2, mPlum, mNeptune, mKalama2, T-Sapphire, mAmetrine, mKeima, UnaG, dsRed, eqFP611, Dronpa, ^k F^p , EosFP, Dendra e IrisFP.

Los ejemplos de enzimas usadas como marcadores enzimáticos incluyen peroxidasa del rábano (HRP), fosfatasa alcalina (ALP o AP), p-galactosidasa (GAL), glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, p-N-acetilglucosamimidasa, pglucuronidasa, invertasa, xantina oxidasa, luciferasa de luciérnaga y glucosa oxidasa (GO).

Los ejemplos de marcadores radiactivos incluyen isótopos radiactivos de hidrógeno, yoduro, cobalto, selenio, tritio, carbono, azufre y fósforo. 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 18F, 31P, 32P, 35S, 67Ga, 76Br, 99mTc (Tc-99m), mIn, 169Yb y 186Re.

Un “compuesto químico” puede ser, en general, cualquier compuesto químico que puede estar ligado de manera covalente al derivado de tirosina unido al polipéptido de la invención. En particular, el compuesto químico puede ser una molécula pequeña, un polímero, tal como un polímero sintético (^p E^g ), o un agente terapéutico, tal como un agente citotóxico. Como tal, por ejemplo, un anticuerpo puede equiparse mediante los medios y métodos de la presente invención con un fármaco citotóxico para convertirse en un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC). Por supuesto, se prevé que un ligador esté conjugado con un derivado de tirosina y un fármaco citotóxico, si es necesario. Sin embargo, el fármaco citotóxico también puede conjugarse con el derivado de tirosina sin un ligador.

Los ejemplos de fármacos citotóxicos son doxorrubicina o derivados de la misma, maitanosinoides, por ejemplo,

DM1 o DM4, auristatinas, por ejemplo, auristatina E o auristatina F, caliqueamicinas, CC-1065, duocarmicinas, antraciclinas, pirrolobentodiazepinas, centanamicina, metabolito de iriontecán (SN38).

Las moléculas pequeñas a modo de ejemplo incluyen hormonas, nucleótidos, aminoácidos, azúcares, lípidos y compuestos orgánicos que tienen un peso molecular de menos de 100 kD. En algunas realizaciones, pueden preferirse moléculas pequeñas aprobadas por la FDA.

Los polímeros a modo de ejemplo incluyen péptidos, oligonucleótidos y compuestos orgánicos poliméricos. En particular, los polímeros adecuados incluyen, por ejemplo, polipéptidos de tipo elastina (ELP), cadenas de polipéptidos de longitud variable (por ejemplo, tecnología XTEN® o PASylation®) e hidratos de carbono, tales como hidroxietilalmidón (por ejemplo, HESylation®), ácido polisiálico (por ejemplo, tecnología PolyXen®) o polietilenglicol (PEGylation®).

El término “ácido nucleico” tal como se usa en el presente documento se refiere a un polímero de nucleótidos ligados entre sí mediante enlaces fosfodiéster. El término, en general, incluye cualquier polinucleótido en cualquier configuración posible, tal como monocatenario, bicatenario, lineal, circular, o una combinación de los mismos. Los ácidos nucleicos incluyen, por ejemplo, moléculas de ADN, moléculas de ARN, análogos del ADN o ARN generados usando análogos de nucleótidos, y aptómeros. Un aptómero es normalmente una molécula de ácido nucleico que puede unir moléculas tales como péptidos, proteínas y compuestos de bajo peso molecular.

La invención proporciona adicionalmente una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de la invención. Una composición farmacéutica según la presente invención puede comprender además uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. En una realización específica, el término “farmacéuticamente aceptable” significa aprobado por una agencia reguladora u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales, y más particularmente en seres humanos. Los portadores farmacéuticamente aceptables se conocen bien en la técnica e incluyen, por ejemplo, disoluciones acuosas tales como agua, dextrosa al 5% o solución salina tamponada fisiológicamente, u otros disolventes o vehículos tales como glicoles, glicerol, aceites tales como aceite de oliva o ésteres orgánicos inyectables que son adecuados para la administración a un sujeto humano o no humano. Los portadores farmacéuticamente aceptables a modo de ejemplo particulares incluyen liposomas (biodegradables); microesferas compuestas por el polímero biodegradable poli(D,L-ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), microesferas de albúmina; polímeros sintéticos (solubles); nanofibras, complejos de proteína-ADN; conjugados de proteínas; eritrocitos; o virosomas. Diversas formas de dosificación basadas en portadores comprenden nanopartículas lipídicas sólidas (SLN), nanopartículas poliméricas, nanopartículas cerámicas, nanopartículas de hidrogel, nanopartículas peptídicas copolimerizadas, nanocristales y nanosuspensiones, nanocristales, nanotubos y nanoagujas, nanoportadores funcionalizados, nanoesferas, nanocápsulas, liposomas, emulsiones lipídicas, microtúbulos/microcilindros lipídicos, microburbujas lipídicas, lipoesferas, lipopoliplexos, micelas lipídicas inversas, dendrímeros, etosomas, cápsulas ultrafinas multicompuestas, aquasomas, farmacosomas, coloidosomas, niosomas, discomas, proniosomas, microesferas, microemulsiones y micelas poliméricas. Otros portadores y excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados se describen, entre otros, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 15a ed., Mack Publishing Co., Nueva Jersey (1991) y Bauer et al., Pharmazeutische Technologie, 5a ed., Govi-Verlag Frankfurt (1997)). Véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición; Lippincott Williams & Wilkins, 2005.

En algunas realizaciones, un portador o una composición farmacéuticamente aceptable es estéril. Una composición farmacéutica puede comprender, además del principio activo, compuestos fisiológicamente aceptables que actúan, por ejemplo, como agentes de carga, cargas, solubilizantes, estabilizadores, agentes osmóticos, potenciadores de la absorción, etc. Los compuestos fisiológicamente aceptables incluyen, por ejemplo, hidratos de carbono, tales como glucosa, sacarosa, lactosa; dextranos; polioles tales como manitol; antioxidantes, tales como ácido ascórbico o glutatión; conservantes; agentes quelantes; tampones; u otros estabilizadores o excipientes.

La elección de uno(s) portador(es) farmacéuticamente aceptable(s) y/o compuesto(s) fisiológicamente aceptable(s) puede depender, por ejemplo, de la naturaleza del principio activo, por ejemplo, solubilidad, compatibilidad (lo que significa que las sustancias pueden estar presentes juntas en la composición sin interaccionar de una manera que reduciría sustancialmente la eficacia farmacéutica de la composición farmacéutica en situaciones de uso ordinario) y/o vía de administración de la composición.

Las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido de la invención y pueden formularse en diversas formas, por ejemplo, en forma sólida, líquida, gaseosa o liofilizada, y pueden estar, entre otros, en forma de una pomada, una crema, parches transdérmicos, un gel, polvo, un comprimido, disolución, un aerosol, gránulos, pastillas, suspensiones, emulsiones, cápsulas, jarabes, líquidos, elixires, extractos, tintura o extractos de fluidos, o en una forma particularmente adecuada para la administración tópica u oral. Una variedad de vías son aplicables para la administración del polipéptido de la invención, que incluyen, pero no se limitan a, por vía oral, tópica, transdérmica, subcutánea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular o intraocular. Sin embargo, cualquier otra vía puede elegirse fácilmente por la persona experta en la técnica si se desea.

Las composiciones farmacéuticas pueden usarse para el tratamiento de una amplia variedad de enfermedades y trastornos diferentes. Por tanto, la invención también prevé métodos de tratamiento que comprenden administrar un polipéptido de la invención a un sujeto que lo necesita. El sujeto es normalmente un mamífero, por ejemplo, un ser humano. En algunas realizaciones, el sujeto es un animal no humano que sirve como modelo para una enfermedad o un trastorno que afecta a los seres humanos. El modelo animal puede usarse, por ejemplo, en estudios preclínicos, por ejemplo, para evaluar la eficacia y/o determinar una dosis adecuada. En algunas realizaciones, una proteína de la invención se administra de manera profiláctica, por ejemplo, a un sujeto que no presenta signos o síntomas de la enfermedad o el trastorno (pero puede tener un riesgo aumentado de desarrollar el trastorno o se espera que desarrolle la enfermedad o el trastorno). En algunas realizaciones, se administra una proteína de la invención a un sujeto que ha desarrollado uno o más signos o síntomas de la enfermedad o el trastorno, por ejemplo, el sujeto ha sido diagnosticado con la enfermedad o el trastorno. Opcionalmente, el método comprende diagnosticar que el sujeto tiene una enfermedad o un trastorno para el cual la proteína es un tratamiento apropiado. Por “cantidad terapéuticamente eficaz” se entiende una cantidad del polipéptido de la invención que provoca un efecto terapéutico deseado. La dosis exacta dependerá del propósito del tratamiento, y podrá determinarse por un experto en la técnica usando técnicas conocidas. Tal como se conoce en la técnica y se describió anteriormente, pueden ser necesarios ajustes en función de la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la alimentación, la interacción farmacológica y la gravedad del estado, y podrán determinarse con experimentación de rutina por expertos en la técnica.

La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender además uno o más agentes terapéuticos adicionales. Preferiblemente, dichos agentes son terapéuticamente eficaces para el tratamiento de la enfermedad respectiva.

Además, la invención se refiere a una composición de diagnóstico que comprende el polipéptido de la invención. La composición de diagnóstico puede comprender medios para el diagnóstico, tales como agentes de detección.

Además, se proporciona un kit que comprende medios para realizar los métodos descritos en el presente documento. El kit puede comprender un vector de expresión que permite la expresión de una proteína de interés fusionada en su extremo C-terminal a una secuencia de reconocimiento para tubulina-tirosina ligasa que tiene una tubulina-tirosina ligasa y un derivado de tirosina y/o una disolución tampón tal como se describe en el presente documento que puede usarse para la tirosinación.

El término “vector de expresión” se refiere a una molécula de ácido nucleico portadora que tiene la capacidad de incorporar y transcribir secuencias de ácido nucleico heterólogo en un huésped, una célula huésped o in vitro La selección de vectores de expresión o transcripción apropiados está dentro del conocimiento de los expertos en la técnica. Muchos vectores de expresión procariotas y eucariotas están disponibles comercialmente. Los ejemplos de vectores usados en la presente invención incluyen plásmidos, virus, fagémidos, bacteriófagos, retrovirus, cósmidos o factores F. Pueden usarse vectores específicos para tipos de huéspedes o células huésped específicos. Se conocen numerosos ejemplos de vectores en la técnica y están disponibles comercialmente (Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edición (15 de enero de 2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN: 0879695765). Los ejemplos de vectores comúnmente usados con bacterias incluyen la serie pET (Novagen), la serie pGEX (Ge Healthcare), la serie pBAD (Invitrogen). Los ejemplos de vectores en levaduras son la serie pPic para Pichia (invitrogen), el sistema pKlac de Kluyveromyces lactis (New England biolabs), vectores de S. cereviseae (Patel et al. Biotechnol Lett. 200325 (4): 331-334) y el sistema pYes para S. cereviseae (Invitrogen). Los ejemplos de vectores para su uso en hongos son la serie pBAR (descrita en Pall et al.1993. Fungal Genetics Newsletter 40: 59-61). El sistema basado en plásmidos plEx (Merck) o el sistema basado en baculovirus (Merck) son dos ejemplos de sistemas útiles para células de insectos. Los ejemplos de vectores para su uso en células de insectos incluyen los sistemas regulados por tetraciclina pTet y pTre, el sistema basado en adenovirus Adeno-X, el sistema basado en retrovirus Retro-X (Clontech) y los vectores pcDNA (Invitrogen). El vector de expresión puede producirse de manera natural o puede ser artificial, lineal o circular. El vector también puede contener un intrón.

La presente invención también proporciona un método para la producción de un polipéptido que comprende (a) introducir o añadir en el extremo C-terminal de un polipéptido una secuencia de reconocimiento para tubulinatirosina ligasa;

(b) opcionalmente poner en contacto el polipéptido obtenido en la etapa (a) en presencia de tubulina-tirosina ligasa y un derivado de tirosina en condiciones adecuadas para que la tubulina-tirosina ligasa someta a tirosinación dicho polipéptido con dicho derivado de tirosina; y

(c) opcionalmente conjugar un resto con dicho polipéptido sometido a tirosinación obtenido en la etapa (b).

La etapa (c) de dicho método también puede verse como una etapa preferida del método. Por consiguiente, dicho método de la presente invención comprende además preferiblemente la etapa (c) de conjugar un resto con dicho polipéptido sometido a tirosinación obtenido en la etapa (b).

La presente invención, como alternativa al método descrito anteriormente, proporciona un método para la producción de un polipéptido, que comprende

(a') introducir o añadir en el extremo C-terminal de un polipéptido una secuencia de reconocimiento para tubulinatirosina ligasa; y

(b') poner en contacto el polipéptido obtenido en la etapa (a') en presencia de tubulina-tirosina ligasa y un derivado de tirosina conjugado con un resto en condiciones adecuadas para que la tubulina-tirosina ligasa someta a tirosinación dicho polipéptido con dicho derivado de tirosina conjugado con dicho resto.

La introducción o adición de una secuencia de reconocimiento para TTL en el extremo C-terminal de un polipéptido se realiza tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, tal secuencia de reconocimiento puede introducirse o añadirse mediante ingeniería genética o mediante síntesis, o bien síntesis química de proteínas o bien mediante biología de síntesis.

Varios factores pueden afectar a la velocidad a la que se producen las reacciones enzimáticas: temperatura, pH, concentración de enzimas, concentración de sustrato y la presencia de cualquier inhibidor o activador. En algunas realizaciones, se prevé que un tampón que contiene un nucleósido trifosfato, tal como ATP, cloruro de potasio, cloruro de magnesio y un agente reductor tal como DTT se emplee en el método de la invención para proporcionar condiciones adecuadas adecuadas para que la TTL someta a tirosinación el polipéptido de la invención. Otras condiciones a modo de ejemplo se describen en Ruediger et al. (1994), citado anteriormente.

Se prevé en el presente documento que el valor de pH en el método de la invención para proporcionar condiciones adecuadas para que la TTL someta a tirosinación el polipéptido de la invención esté en el intervalo de 5 a 9, preferiblemente de 5,5 a 8,5, incluso más preferiblemente de 6 a 8.

Además, se prevé en el presente documento que la concentración del derivado de tirosina en el método de la invención para proporcionar condiciones adecuadas para que la TTL someta a tirosinación el polipéptido de la invención pueda estar en el intervalo de 0,1 mM a 10 mM, preferiblemente de 0,25 mM a 5 mM, más preferiblemente de 0,5 mM a 3 mM, e incluso más preferiblemente de 1 mM a 2 mM.

También se prevé en el presente documento que la temperatura de reacción en el método de la invención para proporcionar condiciones adecuadas para que la TTL someta a tirosinación el polipéptido de la invención pueda estar en el intervalo de 1°C a 70°C, preferiblemente de 5°C a 65°C, más preferiblemente de 10°C a 60°C, incluso más preferiblemente de 15°C a 55°C, lo más preferiblemente de 19°C a 43°C, y por ejemplo de 19°C a 37°C.

Un tiempo de reacción adecuado para que la TTL someta a tirosinación el polipéptido de la invención puede estar en el intervalo de 5 minutos a 4 horas, preferiblemente de 10 minutos a 3 horas, más preferiblemente de 1 hora a 3 horas.

La conjugación de un resto con el derivado de tirosina de un polipéptido sometido a tirosinación se realiza tal como se describe en el presente documento.

La presente invención también proporciona el uso de tubulina-tirosina ligasa para someter a tirosinación un polipéptido distinto de tubulina que tiene en su extremo C-terminal una secuencia de reconocimiento para tubulinatirosina ligasa.

En el presente documento también se proporciona un método para instalar un asidero químico en el extremo C-terminal de un polipéptido distinto de tubulina, comprendiendo dicho método:

(a) proporcionar un polipéptido que tiene en su extremo C-terminal una secuencia de reconocimiento de tubulinatirosina ligasa; y

(b) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) en presencia de tubulina-tirosina ligasa y un derivado de tirosina que contiene un grupo funcional no natural para modificaciones quimioselectivas o bioortogonales en condiciones adecuadas para que la tubulina-tirosina ligasa someta a tirosinación dicho polipéptido con dicho derivado de tirosina. Dicho método puede comprender además opcionalmente la etapa de conjugar un resto tal como se describe en el presente documento con dicho polipéptido sometido a tirosinación obtenido en la etapa (b).

La presente invención también proporciona el uso de tubulina-tirosina ligasa para instalar un asidero químico en el extremo C-terminal de un polipéptido distinto de tubulina, teniendo dicho polipéptido en su extremo C-terminal una secuencia de reconocimiento de tubulina-tirosina ligasa.

Las realizaciones y definiciones de los términos descritos en el contexto de los medios tales como los polipéptidos de la invención son igualmente aplicables a los métodos y usos descritos anteriormente, haciendo los cambios necesarios.

Ejemplos

Ejemplo 1: información general

Se llevó a cabo HPLC analítica en un sistema de HPLC de SHIMADZU (Shimadzu Corp., Kioto, Japón) con un inyector automático SIL-20A, 2 bombas LC2 AAT, un detector de UV/Visible 2489, un horno de columna CTO-20A y un detector de fluorescencia RF-10 A X2, usando una columna de RP-HPLC Agilent Eclipse C18 5 |im, 250 x 4,6 mm con una velocidad de flujo de 0,5 ml/min. Se usó el siguiente gradiente: método A: (A = H2O TFA al 0,1%, B = MeCN TFA al 0,1%) el 35% de B 0-15 min, el 10-100% de B 15-17 min, el 100% de B 17-22 min, el 100-35% de B 22-25 min y el 35% de B 25-30 min. Se registraron cromatogramas de UV a 220 nm y se registraron espectros de fluorescencia con Ex/Em 495/517.

UPLC analítica: se obtuvieron trazas de UPLC-UV en un instrumento de clase H de Waters equipado con un gestor de disolvente cuaternario, un inyector automático de Waters y un detector TUV de Waters conectado a un detector de masas 3100 con una columna RP Acquity UPLC-BEH C18 1,7 |im, 2,1 x 50 mm con una velocidad de flujo de 0,6 ml/min. Se usó el siguiente gradiente: método B: (A = H2O TFA al 0,1%, B = MeCN TFA al 0,1%) el 5-95% de B 0-3 min, el 95% de B 3-5 min. Se registraron cromatogramas de UPLC- UV a 220 nm.

Se realizó HPLC preparativa en un sistema PLC 2020 de Gilson (Gilson Inc., WI, Middleton, EE.UU.) usando una columna Nucleodur C18 HTec Spum de Macherey-Nagel (Macherey-Nagel GmbH & Co. Kg, Düren, Alemania). Se usó el siguiente gradiente: método C: (A = H2O TFA al 0,1%, B = MeCN TFA al 0,1%) velocidad de flujo de 32 ml/min, el 10% de B 0-5 min, el 10-100% de B 5-35 min, el 100% de B 35-40 min. Método D: (A = H2O TFA al 0,1%, B = MeCN TFA al 0,1%) el 10% de B 0-5 min, el 10-100% de B 5-50 min, el 100% de B 50-55 min.

HPLC-EM/EM analítica: se analizaron péptidos mediante un sistema Ultimate 3000 nanoLC (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) conectado a un espectrómetro de masas LTQ Orbitrap XL (Thermo Scientific). Se realizaron separaciones mediante CL en una columna capilar (Acclaim PepMap100, C18, 3 |im, 100Á, 75 |im i.d. x 25 cm, Thermo Scientific) a una velocidad de flujo de eluyente de 300 nl/min. Se usó el siguiente gradiente: método E: (A = H2O ácido fórmico al 0,1%, B = MeCN ácido fórmico al 0,1%) el 3-50% de B 0-50 min Se adquirieron espectros de masas en un modo dependiente de los datos con un barrido de inspección mediante EM con una resolución de 30.000 (LTQ Orbitrap XL) o 60.000 (Orbitrap Elite) y barridos mediante Em /EM de los cinco o los 5 iones precursores más intensos en el cuadrupolo de trampa lineal, respectivamente.

Se realizó cromatografía en columna sobre gel de sílice (gel de sílice de Acros de 60 A, 0,035-0,070 mm).

Se midieron espectros de masas de alta resolución (EMAR) en un sistema Acquity UPLC y un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo LCT Premier™ (Waters Micromass, Milford, M^a , EE.UU.) con ionización por electropulverización usando agua y acetonitrilo (gradiente del 10-90%) con ácido fórmico al 0,1% como eluyente. Se registraron espectros de RMN con un espectrómetro Ultrashield 300 MHz de Bruker (Bruker Corp. Billerica, Mass., EE.UU.) a temperatura ambiental. Los desplazamientos químicos se notifican en ppm con respecto al pico de disolvente residual.

Los reactivos y disolventes estaban, a menos que se indique lo contrario, disponibles comercialmente como calidad para reactivo y no requirieron purificación adicional. Se adquirieron resinas y aminoácidos protegidos con Fmoc de IRIS BioTEch (Marktredwitz, Alemania) o Novabiochem (Darmstadt, Alemania).

Se llevó a cabo SPPS o bien de manera manual o bien con un sintetizador de péptidos automatizado Activo-P11 (Activotec, Cambridge, RU) por medio de condiciones basadas en Fmoc convencionales (protocolo Fast-moc con condiciones de HOBt/HBUT ).

Ejemplo 2: síntesis de derivados de tirosina 1, 2, 3, 4 y 5

2.1 Síntesis de 3-formil-L-tirosina (1)

Se realizó la síntesis de 1 según un procedimiento conocido en la bibliografía (Jung y Lavaroza (1997), J Org Chem, 62: 1553-1555; Banerjee et al. (2010), ACS chemical biology 5: 777-785).

W-[(1,1-dimetiletoxi)carbonil]-L-tirosina (7)

A una disolución de L-tirosina (6, 1 g, 5,5 mmol) en dioxano/agua 1/1 (50 ml), se le añadió lentamente trietilamina (1,16 ml, 8,28 mmol). Se enfrió la reacción hasta 0°C con un baño de hielo/agua y se añadió dicarbonato de di-terc-butilo (1,32 g, 6,07 mmol) en dos etapas. Después de 1 h a 0°C, se aumentó lentamente la temperatura hasta temperatura ambiental y se agitó la mezcla durante 24 h adicionales. Se eliminó el dioxano a presión reducida y se mezcló la disolución acuosa con 25 ml de NaHCO3 saturado, se lavó con etilo acetado, se acidificó hasta pH 1 con HCl 1 N, se extrajo con acetato de etilo y se lavaron los extractos orgánicos con salmuera, se secaron sobre MgSO4 y se evaporaron para dar N-Boc-L-tirosina (7) como una espuma blanca (1,471 g, 95%) que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. Los datos analíticos coincidieron con la bibliografía (Jung y Lavaroza (1997), J Org Chem, 62: 1553-1555).

N-[(1,1-dimetiletoxi)carbonil]-3-(3-formil-4-hidroxifenil)-L-alanina (8)

A una suspensión de 7 (2,00 g, 7,12 mmol) en cloroformo (30 ml) y agua (0,256 ml, 14,13 mmol) se le añadió hidróxido de sodio en polvo (1,71 g, 42,72 mmol) y se sometió la mezcla a reflujo durante 4 h. Se añadieron dos porciones adicionales de hidróxido de sodio en polvo (cada una de 0,42 g, 10,68 mmol) después de 1 y 2 h. Después de 8 h a reflujo, se enfrió la reacción hasta temperatura ambiental, se diluyó con agua y acetato de etilo (15 ml cada una), se descargó la fase orgánica, se acidificó la fase acuosa hasta pH 1 con HCl 1 N y se extrajo de nuevo con acetato de etilo. Se lavaron las fases orgánicas con salmuera, se secaron sobre MgSO4 y se concentraron. La cromatografía ultrarrápida en columna (gel de sílice, CHCl3/MeOH 12/1, ácido acético al 1%) dio el compuesto 8 (0,49 g, 23%). Los datos analíticos coincidieron con la bibliografía (Jung y Lavaroza (1997), J Org Chem, 62: 1553-1555).

3-formil-L-tirosina (1)

Se disolvió el compuesto 8 (0,49 g, 1,6 mmol) en 4 ml de CH2Cl2. Se añadió lentamente TFA (4 ml) a 0°C y se calentó la mezcla hasta temperatura ambiental en el plazo de 2 h. Se eliminó el disolvente a alto vacío. La HPLC preparativa (método C) dio el compuesto 1 como sal de TFA (0,29 g, 80%, el 18% de sal de TFA). Se determinó el contenido de sal de TFA mediante 19F-RMN y tetrafluoroetileno como patrón. 1H-RMN (300 MHz, D2O): 89,81 (s, 1H, CHO), 7,52 (d, J = 2,4 Hz, 1H, CHfenilo), 7,40 (dd, J = 8,6, 2,3 Hz, 1H, CHfenilo), 6,90 (d, J = 8,6 Hz, 1H, CHfenilo), 4,13 (t, J = 6,6 Hz, 1H, CH), 3,15 (m, 2H, CH2). 13C-RMN (75 MHz, D2O): 8197,18, 171,68, 159,21, 138,07, 134,02, 126,03, 120,97, 117,73, 54,18, 34,48.

2.2 Síntesis de 3-nitro-L-tirosina (2) y 3-azido-L-tirosina (3)

Se añadió L-tirosina (6, 2,00 g, 11 mmol) a 10 ml de HOAc, se enfrió la suspensión hasta 0°C y se añadió lentamente HNO3 (1,47 ml, 11 mmol, 7,5 N). En cuanto 6 se disolvió completamente (después de 4 h), se detuvo la reacción añadiendo 2,5 ml de H2O seguido por neutralización con disolución de NH3 al 25%. Se filtró la disolución resultante, se liofilizó el filtrado y se sometió a purificación mediante HPLC (método C) para dar el compuesto 2 como sal de TFA (1,38 g, 44%, el 51% de sal de TFA). Se determinó el contenido de sal de TFA mediante 19F-RMN y tetrafluoroetileno como patrón. 1H-RMN (300 MHz, D2O): 87,89 (d, J = 2,3 Hz, 1H, CHfenilo), 7,43 (dd, J = 8,7, 2,3 Hz, 1H, CHfenilo), 7,03 (d, J = 8,7 Hz, 1H, CHfenilo), 4,18 (t, J = 6,6 Hz, 1H, CH), 3,31 - 3,04 (m, 2H, CH2). 13C-RMN (75 MHz, D2O): 8171,11, 152,74, 138,21, 133,85, 126,40, 125,76, 120,19, 53,68, 34,23.

3-amino-L-tirosina (9)

Se disolvió el compuesto 2 (1,38 g, 4,86 mmol) en 100 ml de H2O y 500 |il de HCl conc. Se suplementó la disolución con Pd/BaSO4 (40 mg, el 5% de carga de catalizador) y se incubó la mezcla a temperatura ambiental durante 12 h bajo una atmósfera de H2. Después de la filtración del catalizador y la eliminación del disolvente a vacío, se obtuvo el producto 9 en rendimiento cuantitativo como sal de TFA (el 18% de contenido de sal de TFA). Se determinó el contenido de sal de TFA mediante 19F-RMN y tetrafluoroetileno como patrón. 1H-RMN (300 MHz, D2O): 87,42-7,15 (m, 2H, CHfenilo), 7,05 -6,89 (m, 1H, CHfenilo), 4,11 (t, J = 6,5 Hz, 1H, CH), 3,24-3,06 (m, 2H, CH2). 13C-RMN (75 MHz, D2O): 8171,91, 149,37, 131,23, 126,32, 124,68, 117,84, 116,79, 54,47, 34,61.

3-azido-L-tirosina (3)

Se disolvió 3-amino-L-tirosina (9, 0,696 g, 3,21 mmol) en 6 ml de HCl 0,5 M y se añadió lentamente una disolución de NaNO2 (0,221 g, 3,21 mmol) en 1 ml de H2O helada a 0°C. Después de 20 minutos, se añadieron 3 ml de una disolución de NaN3 (0,560 g, 8,62 mmol) en H2O en el plazo de 30 minutos y se agitó a 0°C durante otras 8 h. Se aisló y se purificó el precipitado gris mediante HPLC preparativa (método C) para dar el compuesto 3 puro (0,290 g, 41%). 1H-RMN (300 MHz, D2O): 86,95 (d, J = 2,0 Hz, 1H, CHfenilo), 6,89 - 6,79 (m, 2H, CHfenilo), 4,06 (t, J = 6,5 Hz, 1H, CH), 3,19 - 2,95 (m, 2H, CH2). 13C-RMN (75 MHz, D2O): 8172,04, 146,44, 127,24, 127,07, 126,58, 120,38, 116,86, 54,51, 34,83

2.3 Síntesis de 3-yodo-L-tirosina (4)

Se realizó la síntesis de 4 según un procedimiento conocido en la bibliografía (Cochrane et al. (2012), Org. Lett., 14: 2402-2405.

Se disolvió L-tirosina (6, 5,00 g, 27,5 mmol) en NH4OH conc. (500 ml) y se enfrió hasta 0°C. Se disolvió yodo (7,00 g, 27,5 mmol) en etanol (95%, 100 ml) y se añadió gota a gota en el plazo de 1 h a la disolución de tirosina y se agitó durante 2 horas adicionales. Se concentró la disolución hasta un volumen de aproximadamente 150 ml. Se acidificó hasta pH 4,5 y se enfrió hasta 0°C. Después de una hora a 0°C, se recogieron los cristales formados y se agitaron en acetona durante dos horas. Se recogió el producto para dar 4 como un sólido gris (5,40 g, 63%). 1H-RMN (300 MHz, D2O): 87,58 (d, J = 2,3 Hz, 1H, CHfenilo), 7,06 (dd, J = 8,4, 2,2 Hz, CHfenilo), 6,81 (d, J = 8,3 Hz, CHfenilo), 4,01 (t, J = 6,5 Hz, 1H, CH), 3,14 - 2,90 (m, 2H, CH2). 13C-RMN (75 MHz, D2O): 8172,26, 154,56, 139,81, 130,69, 115,29, 83,67, 75,88, 34,26.

2.4 Síntesis de O-propargil-L-tirosina (5)

Se realizó la síntesis de 5 según un procedimiento conocido en la bibliografía (Milles et al. (2012), JACS., 134: 5187­ 5195.

Producto intermedio 10

Se suspendieron 7 (5,02 g, 17,8 mmol) y K2CO3 (7,39 g, 53,5 mmol) en DMF seca (30 ml). Se añadió gota a gota bromuro de propargilo (80% en tolueno; 5,76 ml, 53,5 mmol) y se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 20 horas. Se añadieron H2O (100 ml) y Et2O (100 ml) y se separaron las dos fases. Se extrajo la fase acuosa con Et2O, se secaron las fases org. combinadas sobre MgSO4 y se evaporaron para dar 10 como un aceite amarillo que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional (6,02 g, 94%).

Producto intermedio 11

Se añadió lentamente cloruro de acetilo (7,27 g, 6,58 ml, 92,6 mmol) a metanol anhidro (55 ml) a 0°C. Se añadió entonces esta mezcla al compuesto 10 (6,02 g, 16,86 mmol), se dejó calentar hasta temp. ambiental y se agitó durante 16 horas adicionales. Se retiraron todos los componentes volátiles a vacío para dar sal de HCl de 11 como un sólido blanco que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional (4,01 g, 80%).

O-propargil-L-tirosina (5)

Se disolvió 11 (4,01 g, 13,63 mmol) en metanol (15 ml) y se añadió lentamente NaOH 2 N acuoso (20 ml). Se acidificó la mezcla cuidadosamente con HCl conc. hasta pH 3 y se mantuvo durante la noche a 4°C. Un precipitado blanco formado que se eliminó por filtración y se secó a vacío para dar la sal de HCl del compuesto 5 (3,05 g, 88%).

1H-RMN (300 MHz, DMSO-d6): 87,20 (d, J = 8,2 Hz, 2H, CHfenilo), 6,90 (d, J = 8,3 Hz, 2H, CHfenilo), 4,75 (d, J = 2,4 Hz, 2H, CH2), 3,56 (t, J = 2,4 Hz, 1H, CH), 3,45 (dd, J = 7,8, 4,6 Hz, 1H, CH), 3,08 (dd, J = 14,4m 4,6 Hz, 1H, CH), 2,85 (dd, J = 14,4, 7,9 Hz, 1H, CH).

2.5 Síntesis de 3-(W-¡m¡noacet¡l-W’-D-b¡ot¡n¡l-3,6-d¡oxaoctan,1,8-d¡am¡na)-t¡ros¡na (12)

Se d¡solv¡ó b¡ot¡na-h¡drox¡lam¡na (20 mg, 0,04 mmol) en 1 ml de NH4OAC pH 4,5, se añad¡ó 3-form¡l-L-t¡ros¡na 1 (9,34 mg 0,04 mmol) y se ¡ncubó la d¡soluc¡ón a 37°C, 200 rpm durante 4 h. Se pur¡f¡có la mezcla de reacc¡ón med¡ante HPLC preparat¡va (método D). Se obtuvo la ox¡ma 12 con un rend¡m¡ento del 71% (20 mg, 0,03 mmol). 1H-RMN (300 MHz, D2O): 88,38 (s, 1H, ONCH), 7,24 (d, J = 2,2 Hz, 1H, CHfemlo), 7,17 (dd, J = 8,5, 2,2 Hz, 1H, CHfemlo), 6,87 (d, J = 8,4 Hz, 1H, CHfemlo), 4,59 (s, 2H, COCH2O), 4,47-4,41 (m, 1H, CH), 4,27-4,21 (m, 1H,CH), 4,15 (t, J = 6,2 Hz, 1H, CH), 3,54-3,45 (m, 4H, OCH2CH2O), 3,41-3,32 (m, 6H, CH2O, CH2NH), 3,21-3,00 (m, 5H, CH2NHboc, CH, CH2), 2,83 (dd, Ji = 13, J² = 4,9, Hz 1H, CHHexoS), 2,63 (d, J = 13 Hz, 1H, CHHendoS), 2,10 (t, J = 7,2 Hz, 2H, CH2CO), 1,63-1,32 (m, 4H, CH2), 1,32-1,20 (m, 2H, CH2).

Ejemplo 3: síntes¡s de pépt¡do CF-Tub-tag (13)

Péptido 13 marcado con 5(6)-carboxifluoresceína (SEQ ID No. 3)

Se s¡ntet¡zó el pépt¡do 8 (SEQ ID No. 3) med¡ante quím¡ca basada en Fmoc convenc¡onal en una síntes¡s l¡neal en un s¡ntet¡zador de pépt¡dos Act¡votec segu¡do por acoplam¡ento manual de 5(6)-carbox¡fluoresceína. Se añad¡ó 0,1 mmol de Fmoc-E-Glu(tBu)-res¡na Wang (sust: 0,58 mmol/g) a un rec¡p¡ente de reacc¡ón y se real¡zó la síntes¡s con un exceso de am¡noác¡do de c¡nco veces. Se logró el acoplamiento med¡ante ad¡c¡ón de HOBt/HBTU/DIPEA. Después del acoplamiento del am¡noác¡do f¡nal, se acopló el fluoróforo en un proced¡m¡ento de acoplam¡ento doble con 5 eq de 5(6)-carbox¡fluoresceína, HOBt, HBTU y DIPEA en DMF durante 1 h. Se el¡m¡nó med¡ante esc¡s¡ón el pépt¡do de la res¡na med¡ante la ad¡c¡ón de TFA/DTT/T¡s/t¡oan¡sol (95/2/2/1) en 4 h. Poster¡ormente, se evaporó el cóctel de esc¡s¡ón med¡ante flujo de N2 y se prec¡p¡tó el pépt¡do med¡ante la ad¡c¡ón de d¡et¡l éter helado. Se centr¡fugó el prec¡p¡tado, se d¡solv¡ó en agua y aceton¡tr¡lo y se pur¡f¡có med¡ante HPLC preparativa (método D). Se obtuvo el pépt¡do con un rend¡m¡ento del 8% (16 mg, 8 pmol); pépt¡do en masa molar = 1850,6 Da; EMAR: m/z: 926,3065 [M+2H]2+ (m/z calc.: 926,3165).

Ejemplo 4: expres¡ón y pur¡f¡cac¡ón de TTL

Se expresó TTL (Canis lupus) que tenía el número de reg¡stro de NCBI XP_540180.2 en E. coli (BL21DE3) como proteína de fus¡ón Sumo-TTL con una et¡queta H¡s N-term¡nal. Se ¡ndujeron las células con IPTG 0,5 mM y se ¡ncubaron a 18°C durante 18 h. Se real¡zó la l¡s¡s en presenc¡a de l¡soz¡ma (100 pg/ml), ADNasa (25 pg/ml) y PMSF (2 mM) segu¡do por son¡cac¡ón (son¡f¡cador Branson®; 16 x 8 s, ampl¡tud del 20%) y centr¡fugac¡ón de res¡duos a 20.000 g durante 30 m¡n. Se pur¡f¡có H¡s-Sumo-TTL usando una H¡s-Trap de 5 ml. Para la ret¡rada de la et¡queta Sumo, se ¡ncubaron fracc¡ones máx¡mas con proteasa SenP2 a 4°C durante la noche. Un segundo desarrollo de H¡s-Trap ret¡ró entonces la fracc¡ón de Sumo. Se desaló entonces la proteína pur¡f¡cada en una columna PD10 (GE Healthcare); se ¡ntercamb¡ó el tampón con MES/K pH 6,8 (MES 20 mM, KCl 100 mM, MgCh 10 mM). Se congelaron por choque alícuotas de proteína y se almacenaron a -80°C a 0,8 g/l.

Ejemplo 5: determ¡nac¡ón de la act¡v¡dad de TTL usando carbox¡fluoresceína-pépt¡do 13

Se real¡zaron reacc¡ones de t¡ros¡nac¡ón en una d¡soluc¡ón de 250 pl que cons¡stía en MES/K 20 mM pH 7,0, KCl 100 mM, MgCl210 mM, ATP 2,5 mM, der¡vado de t¡ros¡na 1 mM, pépt¡do 0,2 mM, TTL 1 pM y DTT 5 mM en el caso del compuesto 1, 2, 4 y 5 o glutat¡ón reduc¡do 5 mM en el caso del compuesto 3, respectivamente. Se ¡ncubó la mezcla a 37°C y se tomaron varias alícuotas (25 |il) en el plazo de 24 h, se mezclaron con volúmenes iguales de H2O TFA al 0,1% y se sometieron o bien a HPLC analítica isocrática equipada con un detector de fluorescencia (método A) o bien a análisis mediante UPLC-EM analítica. Se estimaron las cantidades de sustrato y de péptidos de producto a partir del área máxima correspondiente en el espectro de fluorescencia o de detección de uV(Ex/Em: 495/517).

Ejemplo 6: clonación

Se equipó un nanocuerpo con una etiqueta derivada de TTL C-terminal (Tub-tag) y una etiqueta 6xHis N-terminal. Se añadió la secuencia codificante de ADN del péptido Tub-tag derivado de tubulina A1A VDSVEGEGEEEGEE (SEQ ID No: 3) a las secuencias de nanocuerpo por medio de PCR usando el cebador directo 5'-GGGGCCATGGCCCATCATCACCATCACCATGATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAG-3' (SEQ ID NO: 9) y el cebador inverso 5'-CCCCGAATTCTTATTCTTCGCCTTCTTCTTCGCCTTCGCCTTCCACGCTATCCACTGAGGAGACGGTGACC-3' (SEQ ID NO: 10), y se subclonó en el vector de expresión bacteriano pHen6 usando los sitios de restricción Ncol y EcoRI. Se verificaron los clones positivos mediante secuenciación de ADN.

Ejemplo 7: expresión y purificación de nanocuerpo-Tub-tag

Se expresaron proteínas de fusión nanocuerpo-Tub-tag en E. coli (JM109). Se indujeron las células con IPTG 0,5 mM y se incubaron a 18°C durante 18 h. Se realizó la lisis en presencia de lisozima (100 |ig/ml), ADNasa (25 |ig/ml) y PMSF (2 mM) seguido por sonicación (sonificador Branson®; 16 x 8 s, amplitud del 20%) y centrifugación de residuos a 20.000 g durante 30 min. Se purificó la proteína con un sistema Ákta FPLC usando una columna His-Trap de 5 ml (GE Healthcare), se concentraron fracciones máximas hasta 2 ml usando columnas de filtro Amicon (punto de corte de 3 kDa; (Millipore)) y se sometieron a cromatografía de exclusión molecular usando una columna Superdex 75 (GE Healthcare). Se agruparon las fracciones máximas y se congelaron por choque alícuotas de proteína y se almacenaron a -80°C a 0,5 g/l. Nota: se muestra Tub-tag en SEQ ID No. 3.

Ejemplo 8: ligamiento de derivados de tirosina a nanocuerpos modificados

Incorporación C-terminal de derivados de tirosina a nanocuerpos.

Se realizaron reacciones de tirosinación en una disolución de 50 |il que consistía en MES/K 20 mM pH 7,0, KCl 100 mM, MgCl210 mM, ATP 2,5 mM, derivado de tirosina 1 mM, TTL 1 |iM, nanocuerpo 5 |iM y glutatión reducido 5 mM en el caso de compuestos que contienen azida o DTT 5 mM en en el caso de otros derivados de tirosina, respectivamente. Se incubó la mezcla a 37°C durante 1-3 h.

8.1 Digestión tripsínica y análisis mediante EM/EM de nanocuerpos sometidos a tirosinación

Se sometieron a tirosinación nanocuerpos tal como se describió en el ejemplo 8. Se separaron las proteínas mediante SDS-PAGE. Se cortaron bandas de proteína de interés, se empaparon con 100 |il de (NH^COa 50 mM/ACN 1:1 y se incubaron a 30°C durante 10 min. Se retiró el sobrenadante y se incubaron los fragmentos de gel en (NH^COs 50 mM a 30°C durante 10 min adicionales. Se repitieron las dos etapas de incubación hasta que los fragmentos fueron incoloros. Más adelante, se deshidrataron los fragmentos de gel mediante la adición de 25 |il de ACN, se retiró el sobrenadante y se secaron los geles a presión reducida. Se realizó digestión en gel en un volumen total de 20 |il de (NH4)2CO350 mM a 37°C durante 12 h usando 0,05 |ig de tripsina. Se añadieron 20 |il de ACN TFA al 0,5%, se incubó la mezcla en un baño de ultrasonidos, se transfirió el sobrenadante a viales de vidrio de CL, se eliminó el disolvente a presión reducida y se resuspendieron los péptidos residuales en 6 |il de disolución del 95% de H2O TFA al 0,1%, el 5% de ACN TFA al 0,1%. Se separaron los péptidos mediante HPLC y se analizaron mediante experimentos de EM/EM.

8.2 Marcaje bioortogonal de nanocuerpos sometidos a tirosinación:

Marcaje de biotina

X = CHO, N3 Y = N 02H, dibencilciclooctino,

trifenilfosfinas sustituidas

Mareaje de nanocuerpos sometidos a tirosinación con biotina.

Se sometieron a tirosinación nanocuerpos tal como se describió en el ejemplo 8, anteriormente. Se volvieron a tamponar las mezclas de reacción con NH4OAc 100 mM, NaCl 100 mM pH 5,4 (en caso de reacción con biotinahidroxilamina) o PBS de Dulbecco pH 7,4 (en caso de biotina-fosfinas y biotina-dibencilciclooctinos) y se incubaron con 20-40 eq de derivado de biotina a 20°C - 37°C durante 4-12 h. Se separaron las proteínas mediante SDS-PAGE y se transfirieron en húmedo sobre una membrana de nitrocelulosa usando un sistema Mini-Protean Tetra de Bio-Rad (250 mA, 1 h). Se bloqueó la membrana con Roti-Block (Carl Roth, Karlsruhe, Alemania) durante 1 h a temperatura ambiental y se incubó durante 1 h con conjugado de estreptavidina y peroxidasa (Merck Millipore, Darmstadt, Alemania) (1:2000) a temperatura ambiental. Se realizó inmunodetección con disolución de quimioluminiscencia WesternBright (Western Bright ECL, Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Alemania) y un sistema de obtención de imágenes en gel ChemiDoc™ XRS+ (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.).

Marcaje con fluoróforos Alexa594®-hidrazida Cy5-dibencilciclooctino y Cy5-alquino

X = CHO, N3, I Y = NH-NH2, dibencilciclooctino,

alquino

Mareaje de nanocuerpo sometido a tirosinación con Alexa594®.

Se sometieron a tirosinación nanocuerpos tal como se describió en el ejemplo 8, anteriormente. Se volvieron a tamponar las mezclas de reacción con NH4OAc 100 mM, NaCl 100 mM pH 6,0 (en caso de reacción con Alexa594®-hidrazidas) o PBS de Dulbecco pH 7,4 (en caso de Cy5-dibencilciclooctinos) y se incubaron con 30 eq de fluoróforo a 20°C - 37°C durante 4 - 12h. En el caso de Cy5-alquino, se volvió a tamponar la mezcla de reacción 0,38 mmol de K2HPO4 a pH 7,0 y se añadieron 30 eq. de fluoróforo. Se incubó una disolución acuosa de 0,1 eq de Pd(OAc)2[DMADHP]2 y 0,2 eq de ascorbato de sodio a 37°C durante 10 minutos y se añadió a la mezcla de proteínas que se incubó adicionalmente a 37°C durante 4 h. Se separaron las proteínas mediante SDS-PAGE y se visualizaron mediante un sistema de obtención de imágenes en gel ChemiDoc™ MP (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) y un dispositivo de obtención de imágenes por láser FLA-5000 de Fuji (Alexa594®: excitación a 532 nm, Cy5: excitación a 634 nm, filtro de LPG) (Fujifilm, Tokio, Japón).

Pegilación mediante reacción de Staudinger con fosfito

Se sometieron a tirosinación nanocuerpos tal como se describió en el ejemplo 8, anteriormente. Se volvieron a tamponar las mezclas de reacción con Tris 50 mM, KCl 100 mM pH 8,5 y se incubaron con 40 eq. de tris(PEG750)fosfito a 37°C durante 24 h. Se separaron las proteínas mediante SDS-Page. Se transfirieron en húmedo los nanocuerpos pegilados sobre una membrana de nitrocelulosa usando un sistema Mini-Protean Tetra de Bio-Rad (250 mA, 1 h). Se usaron un anticuerpo anti-PEG-B-47 monoclonal (Ancam, RU) y un anticuerpo secundario de cabra anti-IgG H&L de conejo (HRP) (Abcam, RU) para la detección.

Ejemplo 9: marcaje en una etapa

0,2 eq de TTL H2N - C O O H HgN minimizadordeGFP

12

tampón MES/K, pH 7,0,

condiciones reductoras

Mareaje en una etapa de nanocuerpo con biotina 12.

Se realizaron reacciones de mareaje en una disolución de 150 |il que consistía en MES/K 20 mM pH 7,0, KCl 100 mM, MgCl210 mM, ATP 2,5 mM, tirosina-biotina 121 mM, TTL 1 |iM, nanocuerpo 5 |iM y DTT 5 mM. Se incubó la mezcla a 37°C durante 20 h. Se separaron las proteínas mediante SDS-PAGE y se transfirieron en húmedo sobre una membrana de nitrocelulosa usando un sistema Mini-Protean Tetra de Bio-Rad (250 mA, 1 h). Se bloqueó la membrana con Roti-Block (Carl Roth, Karlsruhe, Alemania) durante 1 h a temperatura ambiental y se incubó durante 1 h con conjugado de estreptavidina y peroxidasa (Merck Millipore, Darmstadt, Alemania) (1:2000) a temperatura ambiental. Se realizó inmunodetección con disolución de quimioluminiscencia WesternBright (Western Bright ECL, Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Alemania) y un sistema de obtención de imágenes en gel ChemiDoc™ XRS+ (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). Véase la figura 22.

Ejemplo 10: abreviaturas

Da Dalton

DIC diisopropilcarbodiimida

DIPEA diisopropiletilamina

DMADHP N,N-dimetil-2-amino-4,6-dihidropirimidina

DMF N,N-dimetilformamia

DTT ditiotreitol

eq equivalentes

Em longitud de onda de emisión en nanómetros

Ex longitud de onda de excitación en nanómetros

Fmoc fluorenilmetiloxicarbonilo

HBTU hexafluorofosfato de N,N,N',N-tetrametil-O-(1H-benzotriazol-1-il)uranio

HOAc ácido acético

HOBt hidroxibenzotriazol

HPLC cromatografía de líquidos de alta resolución

EMAR espectrometría de masas de alta resolución

CL cromatografía de líquidos

MeCN acetonitrilo

MHz megahercio

SDS-PAGE electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio

TFA ácido trifluoroacético

TIS triisopropilsilano

Tub-tag secuencia de reconocimiento de TTL derivada de tubulina

Marcaje con Tub-tag presente invención

UPLC cromatografía de líquidos de ultra alta resolución

UV ultravioleta

Ejemplo 11: funcionalización de proteínas específica de sitio versátil y eficaz mediante tubulina-tirosina ligasa En este documento se presenta un enfoque quimioenzimático novedoso para un marcaje de proteínas específico de sitio simple y rápido. Se reutilizó tubulina-tirosina ligasa (TTL) para unir diversos derivados de tirosina no naturales como pequeños asideros bioortogonales a proteínas recombinantes que contienen una secuencia de reconocimiento derivada de tubulina corta (Tub-tag). Esta estrategia novedosa permite una amplia variedad de modificaciones quimioselectivas de proteínas C-terminales para aplicaciones en bioquímica, biología celular y más, tal como se demuestra para el marcaje específico de sitio de nanocuerpos.

La funcionalización específica de sitio de proteínas es crucial para una gran cantidad de aplicaciones en las ciencias de la vida. Las proteínas fluorescentes y estrategias de automarcaje como el marcaje con SNAP-1 y HALO-2 se han convertido en herramientas indispensables para los biólogos celulares para analizar la actividad intracelular y ubicar proteínas de interés. La fusión genética de GFP o etiquetas de proteínas de automarcaje es sencilla, sin embargo, el tamaño y la naturaleza bioquímica de la unión pueden afectar a las propiedades y a la aplicación de la proteína quimérica3.

El corte y empalme trans de proteínas, el ligamiento de proteínas expresadas, así como la supresión de ámbar y la expresión auxotrófica en combinación con el marcaje bioortogonal4 son herramientas destacadas que permiten la colocación de pequeñas etiquetas y modificaciones para proteínas. Sin embargo, los bajos rendimientos de expresión, la necesidad de modificación por ingeniería genética de proteínas y el plegamiento de proteínas deteriorado son factores limitativos de estas técnicas. Además, los enfoques quimioenzimáticos encuentran una atención cada vez mayor para la direccionabilidad específica de sitio de las proteínas usando etiquetas de reconocimiento cortas y específicas junto con enzimas respectivas tales como tripsina5, sortasa A6, fosfopanteteiniltransferasa (PPTasa)7, biotina ligasa8, ácido lipoico ligasa9 y enzima generadora de formilglicina10

Juntos, estos sistemas quimioenzimáticos abren amplias posibilidades para el posterior marcaje quimioselectivo y específico de sitio, pero aún tienen limitaciones químicas. Estos desafíos incluyen sustratos grandes e hidrófobos para la reacción enzimática que puede afectar a la proteína de interés (PPTasa, ácido lipoico ligasa, biotina ligasa). Además, la reversibilidad de la reacción y la hidrólisis del producto requieren un alto exceso de catalizador y sustrato (marcaje con sortasa, enzima generadora de formilglicina, tripsina). En particular, la incorporación dirigida de grupos funcionales no naturales a menudo requiere una amplia modificación por ingeniería genética de enzimas para mejorar la eficiencia de reacción global.

En este documento se presenta un método novedoso y rápido para el marcaje específico de sitio de proteínas que combina el uso de pequeños aminoácidos no naturales como asideros bioortogonales y las ventajas técnicas del marcaje quimioenzimático. La técnica, denominada marcaje con Tub-tag, se basa en el ligamiento enzimático de pequeños derivados de tirosina fáciles de sintetizar al extremo C-terminal de una etiqueta de reconocimiento hidrófila de catorce aminoácidos (denominada Tub-tag) mediante tubulina-tirosina ligasa (TTL, figura 5a). En la naturaleza, la TTL cataliza la unión postraduccional de tirosina al extremo C-terminal de a-tubulina, que está implicada en la regulación de la homeostasis de microtúbulos1112. Curiosamente, la TTL también utiliza derivados de tirosina para la modificación de tubulina13. Para someter a prueba si la TTL puede conjugar derivados de tirosina no naturales con el péptido Tub-tag aislado, imitando el extremo C-terminal de tubulina, se realizó un experimento de ligamiento inicial con 3-N3-L-tirosina (3) y 3-formil-L-tirosina (1). Para este propósito, en primer lugar se sintetizó un péptido Tub-tag marcado con 5,6-carboxifluoresceína (CF-Tub-tag) mediante síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) convencional, se usó para el marcaje con Tub-tag con 1 y 3 (TTL:péptido 1:200) y se analizó el proceso de reacción mediante HPLC isocrática (figura 5b y c para 3, figura 5d y e para 1). Después de 120 minutos de incubación a 37°C, el rendimiento del conjugado con 1 y 3 fue del 63% y el 80%, respectivamente.

A continuación, se sometió a prueba si el marcaje con Tub-tag puede transferirse a proteínas de interés no relacionadas. Como prueba de principio, se usaron nanocuerpos de dominio único derivados de camello14 que se usan como herramientas analíticas en bioquímica, así como para el reconocimiento intracelular y la manipulación de antígenos en biología celular1516. Se fusionó la secuencia de Tub-tag con el extremo C-terminal de un nanocuerpo específico de GFP (GBP417) y se realizaron experimentos de marcaje mediados por TTL. La digestión tripsínica seguida por experimentos de HPLC-EM/EM mostró la adición exitosa C-terminal de tirosina (6), 3-N3-L-tirosina (3), 3-formil-L-tirosina (1), 3-NH2-L-tirosina (9) y 3-NO2-L-tirosina (2) (figura 8). A continuación, se combinó la incorporación de 3 con la posterior cicloadición de azida-alquino promovida por tensión (SPAAC)18 para la conjugación de un derivado de DBCO-biotina (figura 6). Usando una razón de TTL/GBP4 de 1:5 a 37°C, se encontró que el 82% de GBP4 se convirtió después de una hora, mientras que una razón de TTL/GBP4 de 1:10 proporcionó el 71% de GBP4 modificado en su extremo C-terminal. Ampliar el tiempo de ligamiento hasta tres horas dio como resultado conversiones del 99% y el 88% a razones de TTL/GBP4 de 1:5 y 1:10, respectivamente. La incorporación de 3-formil-L-tirosina (1) pudo lograrse con eficiencias similares. Para validar adicionalmente la modularidad del concepto de marcaje de Tub-tag, se realizó un marcaje fluorescente mediante SPAAC (figura 10) y se empleó una variedad de reacciones bioortogonales bien establecidas, incluyendo el ligamiento de Staudinger19 (figura 11) y la reacción de Staudinger con fosfito20 (figura 12) a 3-N3-L-tirosina (3). Además, se aplicaron reacciones formadoras de hidrazona (figura 13) y oxima21 (figura 14) en 3-formil-L-tirosina (1) incorporada específicamente en el sitio. Esto permitió incorporar diferentes derivados de biotina, fluoróforos e incluso permitió la pegilación ramificada de GBP4 (figura 12). Después de haber establecido esta modificación quimioenzimática, se usó este método para el marcaje fluorescente y con biotina de otro nanocuerpo específico de GFP (GBP117) (figura 15).

Para someter a prueba si la modificación mediada por TTL produce nanocuerpos funcionales, se usó GBP1 para aplicaciones bioquímicas y de biología celular. Tras la incorporación de 3-N3-L-tirosina (3) a través de TTL, se biotiniló GBP1 usando DBCO-biotina tal como se describió anteriormente y se inmovilizó en perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina (figura 7a). Estas perlas se usaron luego para la inmunoprecipitación de GFP a partir de lisados de células HEK. El posterior análisis por inmunotransferencia de tipo Western demostró una coinmunoprecipitación de GFP específica en comparación con los controles con lisado celular transfectado de forma simulada y perlas no funcionalizadas (figura 7b).

Posteriormente, se estudió si GBP1 marcado específicamente en el sitio puede usarse para teñir estructuras celulares en experimentos de inmunofluorescencia. Previamente se usó este nanocuerpo de unión a GFP como reactivo de tinción para técnicas de microscopía de superresolución22. La resolución más alta impone nuevos requisitos a los reactivos de detección y, por tanto, usar los reactivos de unión inmunofluorescentes más pequeños posibles es importante para liberar todo el potencial de la microscopía de súperresolución23 En este documento, tras la incorporación de 3-formil-L-tirosina (1) a través de TTL, se marcó GBP1 con el colorante Alexa594 usando reacción de formación de oxima (figura 7c). Las células HeLa que expresan GFP-LaminB1, que se ubica en el interior de la envoltura nuclear y forma la lámina nuclear, se tiñeron con GBP1-Alexa594. La microscopía de superresolución 3D-SIM reveló entonces la colocalización laminar del reactivo de tinción de GBP1 a alta resolución, lo que indica la unión funcional a GFP en este contexto celular (figura 7d, e y f). Se obtuvieron resultados similares con GFP-PCNA y la detección de sitios de replicación de ADN subnuclear (figura 16).

En resumen, se presenta el marcaje con Tub-tag para la modificación simple y específica de sitio de proteínas. Se muestra el ligamiento quimioenzimático mediado por TTL de derivados de tirosina no naturales como 3-N3-L-tirosina (3) y 3-formil-L-tirosina (1) con hasta un 99% de eficiencia usando concentraciones moderadas de enzimas y tiempos de reacción cortos. Estos residuos de tirosina modificados sirven entonces como asideros bioortogonales para una variedad de reacciones de marcaje quimioselectivo bien establecidas. La eficacia global de marcaje en condiciones de reacción suaves produce proteínas homogéneamente modificadas y funcionales, tal como se demuestra con nanocuerpos para inmunoprecipitación y microscopía de superresolución. Por tanto, el marcaje con Tub-tag dota a los anticuerpos recombinantes, y a las proteínas en general, con propiedades novedosas para explorar y manipular las funciones celulares con posibles aplicaciones en biotecnología, así como en diagnóstico y terapia.

Ejemplo 12: expresión y purificación de TTL

Se amplificó la secuencia codificante de TTL (Canis lupus) a partir de un vector de expresión de mamífero24, se clonó en un pET28-SUMO3 (EMBL-Heidelberg, planta de expresión de proteínas) y se expresó en E. coli BL21(DE3) como proteína de fusión Sumo-TTL con una etiqueta His N-terminal. Se indujeron las células con IPTG 0,5 mM y se incubaron a 18°C durante 18 h. Se realizó la lisis en presencia de lisozima (100 |ig/ml), ADNasa (25 |ig/ml) y PMSF (2 mM) seguido por sonicación (sonificador Branson®; 16 x 8 s, amplitud del 20%) y centrifugación de residuos a 20.000 g durante 30 min. Se purificó His-Sumo-TTL usando una His-Trap de 5 ml. Se desaló entonces la proteína purificada en una columna ^p D10 (GE Healthcare); se intercambió el tampón con MES/K pH 6,8 (MES 20 mM, KCl 100 mM, MgCl210 mM). Se congelaron por choque alícuotas de proteína y se almacenaron a -80°C a 2,7 g/l.

Ejemplo 13: determinación de la actividad de TTL usando el péptido CF-Tub-tag 13

Se realizaron reacciones de tirosinación en una disolución de 250 |il que consistía en MES/K 20 mM pH 7,0, KCl 100 mM, MgCl210 mM, ATP 2,5 mM, derivado de tirosina 1 mM, CF-Tub-tag 130,2 mM, TTL 1 |iM y DTT 5 mM en el caso del compuesto 2 o glutatión reducido 5 mM en el caso del compuesto 1, respectivamente. Se incubó la mezcla a 37°C y se tomaron varias alícuotas (25 |il), se mezcló con volúmenes iguales de H2O TFA al 0,1% y se sometieron a HPLC analítica isocrática equipada con un detector de fluorescencia (método: A = H2O TFA al 0,1%, B = MeCN TFA al 0,1%; el 35% de B 0-15 min, el 10-100% de B 15-17 min, el 100% de B 17-22 min, el 100-35% de B 22-25 min y el 35% de B 25-30 min). Se estimaron cantidades de sustrato y péptidos de producto a partir del área máxima correspondiente en el espectro de detección de fluorescencia (Ex/Em: 495/517).

Ejemplo 14: expresión y purificación de nanocuerpo-Tub-tag

Se expresaron proteínas de fusión de nanocuerpo-Tub-tag en E. coli (JM109). Se indujeron las células con IPTG 0,5 mM y se incubaron a 18°C durante 18 h. Se realizó la lisis en presencia de lisozima (100 |ig/ml), ADNasa (25 |ig/ml) y PMSF (2 mM) seguido por sonicación (sonificador Branson®; 16 x 8 s, amplitud del 20%) y centrifugación de residuos a 20.000 g durante 30 min. Se purificó la proteína con un sistema Akta FPLC usando una columna His-Trap de 5 ml (GE Healthcare, EE.UU.), se concentraron fracciones máximas hasta 2 ml usando columnas de filtro Amicon (punto de corte 3 kDa; (Merck Millipore, Alemania) y se sometieron a cromatografía de exclusión molecular usando una columna Superdex 75 (GE Healthcare, EE.UU.). Se agruparon fracciones máximas y se congelaron por choque alícuotas de proteína y se almacenaron a -80°C.

Ejemplo 15: reacción de TTL en GBP4 seguido por digestión tripsínica y análisis mediante EM/EM

Se realizaron reacciones de tirosinación en una disolución de 50 |il que consistía en MES/K 20 mM pH 7,0, KCl 100 mM, MgCl210 mM, ATP 2,5 mM, derivado de tirosina 1 mM, TTL 1 |iM, nanocuerpo 5 |iM y glutatión reducido 5 mM en el caso del compuesto 3 y DTT 5 mM en el caso del compuesto 1,2, 9 y tirosina (6), respectivamente. Se incubó la mezcla a 37°C durante 24 h. Se separaron las proteínas mediante s DS-PAGE. Se cortaron bandas de proteína de interés, se empaparon con 100 |il de (NH4)2CO350 mM/ACN 1:1 y se incubaron a 30°C durante 10 min. Se retiró el sobrenadante y se incubaron los fragmentos de gel en (NH4)2CO350 mM a 30°C durante 10 min adicionales. Se repitieron las dos etapas de incubación hasta que los fragmentos fueron incoloros. Más adelante, se deshidrataron los fragmentos de gel mediante la adición de 25 |il de ACN, se retiró el sobrenadante y se secaron los geles a presión reducida. Se realizó digestión en gel en un volumen total de 20 |il de (NH4)2CO350 mM a 37°C durante 12 h usando 0,05 |ig de tripsina (Thermo Fisher Scientific, EE.UU.). Se añadió 20 |il de ACN TFA al 0,5%, se incubó la mezcla en un baño de ultrasonidos, se transfirió el sobrenadante a viales de vidrio de CL, se eliminó el disolvente a presión reducida y se resuspendieron los péptidos residuales en 6 |il de disolución del 95% de H2O TFA al 0,1%, el 5% de ACN TFA al 0,1%. Se separaron los péptidos mediante HPLC y se analizaron mediante experimentos de EM/EM.

Ejemplo 16: adición quimioenzimática de derivados de tirosina a nanocuerpos

Se realizaron reacciones de tirosinación en una disolución de 150 |il que consistía en MES/K 20 mM pH 7,0, KCl 100 mM, MgCl210 mM, ATP 2,5 mM, derivado de tirosina 1 mM, TTL 0,1 - 1 |iM, nanocuerpo5 |iM y glutatión reducido 5 mM en el caso de compuestos que contienen azidas o DTT 5 mM para todos los otros derivados, respectivamente. Se incubó la mezcla a 37°C durante 1-3 h.

Ejemplo 17: SPAAC para sulfo-Cy5-DBCO o biotina-DBCO

Se realizaron reacciones de tirosinación tal como se describió en el ejemplo 16 usando el compuesto 3, glutatión reducido 5 mM y una razón de GBP4/TTL de 10:1 durante 3 h. Se volvieron a tamponar las mezclas de reacción con PBS de Dulbecco pH 7,4 y se incubaron con 30 eq. de Sulfo-Cy5-DBCO (Jena Bioscience GmbH, Alemania) o DBCO-PEG4-biotina (Jena Bioscience GmbH, Alemania) a 30°C durante 4 h. Se separaron las proteínas mediante SDS-PAGE. Se transfirieron en húmedo los nanocuerpos biotinilados sobre una membrana de nitrocelulosa usando un sistema Mini-Protean Tetra de Bio-Rad (250 mA, una hora). Se usó un conjugado de estreptavidina y peroxidasa (Merck Millipore, Alemania) para la detección. Se visualizaron los anticuerpos marcados de manera fluorescente mediante un dispositivo de obtención de imágenes por láser FLA-5000 de Fuji (excitación a 634 nm, filtro de LPG) (Fujifilm, Japón).

Ejemplo 18: ligamiento de Staudinger

Se realizaron reacciones de tirosinación tal como se describió en el ejemplo 16 usando el compuesto 3, glutatión reducido 5 mM y una razón de GBP4/TTL de 10:1 durante 3 h. Se volvieron a tamponar las mezclas de reacción con PBS de Dulbecco pH 7,4 y se incubaron con 40 eq. de biotina-fosfina (BIOMOL GmbH, Alemania) a 37°C durante 24 h. Se separaron las proteínas mediante SDS-PAGE. Se transfirieron en húmedo los nanocuerpos biotinilados sobre una membrana de nitrocelulosa usando un sistema Mini-Protean Tetra de Bio-Rad (250 mA, 1 h). Se usó un conjugado de estreptavidina y peroxidasa (Merck Millipore, Alemania) para la detección.

Ejemplo 19: reacción de Staudinger con fosfito

Se realizaron reacciones de tirosinación tal como se describió en el ejemplo 16 usando el compuesto 3, glutatión reducido 5 mM y una razón de GBP4/TTL de 10:1 durante 3 h. Se volvieron a tamponar las mezclas de reacción con Tris 50 mM pH 8,5, KCl 100 mM y se incubaron con 40 eq. de tris(PEG750)fosfito (14) a 37 C durante 24 h. Se separaron las proteínas mediante SDS-PAGE. Se transfirieron en húmedo los nanocuerpos pegilados sobre una membrana de nitrocelulosa usando un sistema Mini-Protean Tetra de Bio-Rad (250 mA, 1 h). Se usaron un anticuerpo anti-PEG-B-47 monoclonal (Abcam, UK) y un anticuerpo secundario de cabra anti-IgG H&L de conejo (HRP) (Abcam, UK) para la detección.

Ejemplo 20: reacciones de formación de hidrazona y oxima

Se realizaron reacciones de tirosinación tal como se describió en el ejemplo 16 con el compuesto 1, DTT 5 mM y una razón de GBP4/TTL de 10:1 durante 3 h. Se volvieron a tamponar las mezclas de reacción con MES/K 50 mM pH 6,0, KCl 100 mM y se incubaron con 30 eq de Alexa594-hidrazida (Thermo Fisher Scientific, EE.UU.) o hidroxilamina-biotina (15) a 37°C durante 4 h. Se separaron las proteínas mediante SDS-PAGE. Se transfirieron en húmedo los nanocuerpos biotinilados sobre una membrana de nitrocelulosa usando un sistema Mini-Protean Tetra de Bio-Rad (250 mA, 1 h). Se usó un conjugado de estreptavidina y peroxidasa (Merck Millipore, Alemania) para la detección. Se visualizaron los anticuerpos marcados de manera fluorescente mediante un dispositivo de obtención de imágenes por láser FLA-5000 de Fuji (excitación a 532 nm, filtro de LPG) (Fujifilm, Japón).

Ejemplo 21: inmunofluorescencia

Se mantuvieron células HeLa-Kyoto en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% y gentamicina a 50 |ig/ml (PAA, Alemania). Para experimentos de fluorescencia, se sembraron 106 células en cubreobjetos de 18*18 mm cuadriculados en una placa de 6 pocillos. Se realizó transfección con LaminB1-GFP que codifica para ADN plasmídico (donado amablemente por Jan Ellenberg) con Lipofectamine 3000 (Life Technologies, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. 18 h tras la transfección, se lavaron las células con PBST, se fijaron con formaldehído al 2%/PBS y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5%/PBS. A continuación, se bloquearon las células con BSA al 2%/PBST. Se incubaron entonces las células con GBP1 marcado con Atto594 Tub-tag durante 1 h, se lavaron con PBST, se tiñeron con DAPI (Life Technologies, EE.UU.) y se montaron en reactivo antidesvanecimiento Vectashield (Vector Laboratories, EE.UU.) sobre portaobjetos. Se realizó microscopía de alta resolución con un aparato DeltaVision OMX v3 (Applied Precision, Eslovaquia) equipado con diodos láser de 405, 488 y 593 nm, una lente de objetivo para aceite 100*/1,4 NA Plan-Apochromat (Olympus, Japón) y cámaras Cascade II:512 EM CCD (Photometrics, EE.UU.) tal como se describió previamente (Guizetti, J. et al. Cortical constriction during abscission implies helices of ESCRT-III-dependent filaments. Science 331, 1616-1620, doi:science.1201847 [pii] 10.1126/science.1201847 (2011)). Se realizó análisis de intensidad de fluorescencia de barrido lineal con ImageJ.

Ejemplo 22: ensayo de co-inmunoprecipitación con estreptavidina

Se mantuvieron células HEK 293T en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% y gentamicina a 50 |ig/ml (PAA, Alemania). Para experimentos de co-inmunoprecipitación, se sembraron 107 células en placas p100. Se realizó transfección con eGFP que codifica para ADN plasmídico peGFP-C1 (Life Technologies, Alemania) con polietilenimina (PEI, Sigma, EE.UU.) con 24 |ig de ADN por placa. Se preparó el reactivo de co-inmunoprecipitación usando GBP1 biotilinado (mediado por Tub-tag). Para este fin, se lavaron 200 |il de suspensión de perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina (Dynabeads MyOne Streptavidin T1) con PBS y luego se cargaron con 40 |ig de GBP1 biotilinado según las instrucciones del fabricante. Se equilibraron las perlas funcionalizadas con tampón IP (EDTA 0,5 mM, Tris/CI 50 mM pH 7,0, NaCl 150 mM). Se prepararon lisados celulares completos usando 200 |il de tampón de lisis (EDTA 0,5 mM, Tris/CI 50 mM pH 7,0, NaCl 150 mM, NP40 al 1%, PMSF 2 mM, 1x cóctel inhibidor de proteasa de mamífero. Se recogieron el 5% de sobrenadantes de lisado como muestras de entrada. Se diluyó la muestra restante hasta 1 ml usando tampón IP y se incubó con 50 |il de suspensión de perlas durante 4 h. Después de la co-inmunoprecipitación magnética, se recogieron el 5% del sobrenadante como muestras de flujo continuo. Para la tinción de Coomassie e inmunotransferencia de tipo Western, se hirvieron el 2% de fracciones de entrada, el 2% de fracciones de flujo continuo y el 20% de fracciones de perlas con tampón Laemmli a 95°C y se sometieron a SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad, EE.UU.). Se usó un anticuerpo anti-GFP monoclonal (Roche, Suiza) y anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch, EE.UU.) para la detección.

Ejemplo 23: microscopía confocal

Transfección. Se sembraron células HeLa a concentración subconfluente sobre un cubreobjetos de vidrio (Carl Roth, Alemania) el día antes de la transfección con PEI (Sigma-Aldrich, EE.UU.) con 2 |ig de pENeGFP-PCNA1. Después de la transfección, se incubaron las células durante 18-24 h a 37°C, el 5% de CO2.

Inmunofluorescencia. Se fijaron las células en formaldehído al 3,7% en PBS durante 10 min, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5% (neoLab Migge Laborbedarf-Vertriebs, Alemania) durante 10 min y se bloquearon en albúmina sérica bovina al 2% (Sigma-Aldrich, RU) durante 60 min. Para el marcaje con GFP, se incubaron las células durante 60 min con GBP1-Tub-tag-Alexa594 (1:25 ó 1:50) antes del lavado extensivo y la contratinción de ADN con DAPI 1 |ig/ml durante 10 min. Todas las etapas excepto la fijación se llevaron a cabo en PBS suplementado con Tween 20 al 0,02% (PBST, Carl Roth, 9127.1) a temperatura ambiente. Entonces se montaron los cubreobjetos de vidrio con el medio de montaje antidesvanecimiento Mowiol (Sigma-Aldrich, RU).

Microscopía confocal y análisis de imágenes. Se llevó a cabo la obtención de imágenes con un escáner de punto confocal SP5 II de Leica (Leica Microsystems, Alemania) equipado con dos detectores híbridos HyD. Se realizó la adquisición de imágenes con una lente de objetivo de inmersión en aceite *60/1,4-0,6 NA Planapochromat. Para visualizar DAPI, GFP y GBP1-Tub-tag-Alexa594, se usaron los láseres de excitación a 405, 488 y 561 nm, respectivamente. Se recogieron imágenes de 16 bits y se analizaron con Fiji2.

Ejemplo 24: síntesis química

Se llevó a cabo HPLC analítica en un sistema de HPLC de SHIMADZU (Shimadzu Corp., Japón) con un inyector automático SIL-20A, 2 bombas LC2 AAT, un detector de UV/Visible 2489, un horno de columna CTO-20A y un detector de fluorescencia RF-10 A X2, usando una columna de RP-HPLC Agilent Eclipse C185 |im, 250 x 4,6 mm con una velocidad de flujo de 0,5 ml/min. Se usó el siguiente gradiente: método A: (A = H2O TFA al 0,1%, B = MeCN TFA al 0,1%) el 35% de B 0-15 min, el 10-100% de B 15-17 min, el 100% de B 17-22 min, el 100-35% de B 22-25 min y el 35% de B 25-30 min. Se registraron cromatogramas de UV a 220 nm y se registraron espectros de fluorescencia con Ex/Em 495/517.

UPLC analítica: se obtuvieron trazas de UPLC-UV en un instrumento de clase H de Waters equipado con un gestor de disolvente cuaternario, un inyector automático de Waters y un detector TUV de Waters conectado a un detector de masas 3100 con una columna RP Acquity UPLC-BEH C18 1,7 |im, 2,1 x 50 mm con una velocidad de flujo de 0,6 ml/min (Water Corp., EE.UU.). Se usó el siguiente gradiente: método B: (A = H2O TFA al 0,1%, B = MeCN TFA al 0,1%) el 5-95% de B 0-3 min, el 95% de B 3-5 min. Se registraron cromatogramas de UPLC-UV a 220 nm. Se realizó HPLC preparativa en un sistema PLC 2020 de Gilson (Gilson Inc., WI, Middleton, EE.UU.) usando una columna Nucleodur C18 HTec Spum de Macherey-Nagel (Macherey-Nagel GmbH & Co. Kg, Alemania). Se usó el siguiente gradiente: método C: (A = H2O TFA al 0,1%, B = MeCN TFA al 0,1%) velocidad de flujo 32 ml/min, el 10% de B 0-5 min, el 10-100% de B 5-35 min, el 100% de B 35-40 min. Método D: (A = H2O TFA al 0,1%, B = MeCN TFA al 0,1%) el 10% de B 0-5 min, el 10-100% de B 5-50 min, el 100% de B 50-55 min.

HPLC-EM/EM analítica: se analizaron péptidos mediante un sistema Ultimate 3000 nanoLC (Thermo Scientific, EE.UU.) conectado a un espectrómetro de masas LTQ Orbitrap XL (Thermo Scientific, EE.UU.). Se realizaron separaciones mediante CL en una columna capilar (Acclaim PepMap100, C18, 3 |im, 100 A, 75 |im i.d. x 25 cm, Thermo Scientific, EE.UU.) a una velocidad de flujo de eluyente de 300 nl/min. Se usó el siguiente gradiente: método D: (A = H2O ácido fórmico al 0,1%, B = MeCN ácido fórmico al 0,1%) el 3-50% de B 0-50 min Se adquirieron espectros de masas en un modo dependiente de los datos con un barrido de inspección mediante EM con una resolución de 30.000 (LTQ Orbitrap X^l ) o 60.000 (Orbitrap Elite) y barridos mediante EM/EM de los cinco iones precursores más intensos en el cuadrupolo de trampa lineal, respectivamente.

Se realizó cromatografía en columna sobre gel de sílice (gel de sílice de Acros 60 A, 0,035-0,070 mm).

Se midieron espectros de masas de alta resolución (EMAR) en un sistema Acquity UPLC y un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo LCT Premier™ (Waters Corp., EE.UU.) con ionización por electropulverización usando agua y acetonitrilo (gradiente del 10-90%) con ácido fórmico al 0,1% como eluyente.

Se registraron espectros de RMN con un espectrómetro Ultrashield 300 MHz de Bruker (Bruker Corp., EE.UU.) a temperatura ambiental. Los desplazamientos químicos se notifican en ppm con respecto al pico de disolvente residual.

Se calcularon los rendimientos de producto basándose en los espectros de 1H-RMN. Se determinó el contenido de sal de TFA mediante 19F-RMN, tetrafluoroetileno como patrón y se consideró en el cálculo del rendimiento de producto. Los reactivos y disolventes estaban, a menos que se indique lo contrario, disponibles comercialmente como calidad para reactivo y no requirieron purificación adicional. Se adquirieron resinas y aminoácidos protegidos con Fmoc de IRIS BioTEch (Alemania) o Novabiochem (Alemania).

Se llevó a cabo SPPS o bien de manera manual o bien con un sintetizador de péptidos automatizado Activo-P11 (Activotec, RU) por medio de condiciones basadas en Fmoc (protocolo Fast-moc con condiciones de HOBt/HBUT ). Ejemplo 25: síntesis de 3-nitro-L-tirosina (2), 3-amino-L-tirosina (9) y 3-azido-L-tirosina (3)

Se añadió L-tirosina (6, 2,00 g, 11 mmol) a 10 ml de HOAc, se enfrió la suspensión hasta 0°C y se añadió lentamente HNO ³ (1,47 ml, 11 mmol, 7,5 N). Después de 4 h (cuando el material de partida se disolvió completamente) se diluyó la reacción con H ² O (2,5 ml) seguido por neutralización con disolución de NH ³ (25%). Se filtró la disolución resultante, se liofilizó el filtrado y se sometió a purificación mediante HPLC (método C) para dar el compuesto 2 como sal de TFA (1,38 g, 44%). Los datos analíticos coincidieron con la bibliografía (Seyedsayamdost, M. R., Argirevic, T., Minnihan, E. C., Stubbe, J. & Bennati, M. J. Am. Chem. Soc. 131, 15729-15738 (2009)).

1H-RMN (300 MHz, D2O): 87,89 (d, J = 2,3 Hz, 1H, CHfeniio), 7,43 (dd, J = 8,7, 2,3 Hz, 1H, CHfeniio), 7,03 (d, J = 8,7 Hz, 1H, CHfeniio), 4,18 (t, J = 6,6 Hz, 1H, CH), 3,31-3,04 (m, 2H, CH2); 13C-RMN (75 MHz, D2O): 8171,11, 152,74, 138,21, 133,85, 126,40, 125,76, 120,19, 53,68, 34,23; ESI-EMAR (m/z):[M]+ calculado para C9H12N2O5, 227,0660; encontrado 227,0674.

3-amino-L-tirosina (9)

Se disolvió el compuesto 2 (1,38 g, 4,86 mmol) en H2O (100 mi) y HCl conc. (500 |al). Se suplementó la disolución con Pd/BaSO4 (40 mg, el 5% de carga de catalizador) y se incubó la mezcla a temperatura ambiental durante 12 h bajo una atmósfera de H2. Después de la filtración del catalizador y la eliminación del disolvente a vacío, se obtuvo el producto 9 en rendimiento cuantitativo como sal de TFA. Los datos analíticos coincidieron con la bibliografía (Seyedsayamdost, M. R., Argirevic, T., Minnihan, E. C., Stubbe, J. & Bennati, M. J. Am. Chem. Soc. 131, 15729­ 15738 (2009)).

1H-RMN (300 MHz, D2O): 87,42-7,15 (m, 2H, CHfenilo), 7,05-6,89 (m, 1H, CHfenilo), 4,11 (t, J = 6,5 Hz, 1H, CH), 3,24­ 3,06 (m, 2H, CH2); 13C-RMN (75 MHz, D2O): 8 = 171,91, 149,37, 131,23, 126,32, 124,68, 117,84, 116,79, 54,47, 34,61; ESI-EMAR (m/z):[M]+ calculado para C9H13N2O3, 197,0918; encontrado 197,0910.

3-azido-L-tirosina (3)

Se disolvió 3-amino-L-tirosina (9, 0,696 g, 3,21 mmol) en HCI 0,5 M (6 ml) y se añadió lentamente una disolución de NaNO2 (0,221 g, 3,21 mmol) en H2O helada (1 ml) a 0°C. Después de 20 min, se añadió una disolución de NaN3 (0,560 g, 8,62 mmol) en H2O (3 ml) en el plazo de 30 min y se agitó a 0°C durante otras 8 h. Se aisló el precipitado gris y se purificó mediante H^p L^c preparativa (método C) para dar el compuesto 3 puro (0,290 g, 41%).1

1H-RMN (300 MHz, D2O): 86,95 (d, J = 2,0 Hz, 1H, CHfenilo), 6,89-6,79 (m, 2H, CHfenilo), 4,06 (t, J = 6,5 Hz, 1H, CH), 3,19-2,95 (m, 2H, CH2); 13C-RMN (75 MHz, D2O): 8172,04, 146,44, 127,24, 127,07, 126,58, 120,38, 116,86, 54,51, 34,83; ESI-EMAR (m/z):[M]+ calculado para C9H11N4O3, 223,0823; encontrado 223,0830.

Ejemplo 26: síntesis de 3-formil-L-tirosina (1)

Se realizó la síntesis de 1 según un procedimiento conocido en la bibliografía (Jung, M. E. & Lazarova, T. I. J. Org. Chem. 62, 1553-1555 (1997); Banerjee, A. et al. ACS Chem. Biol. 5, 777-785 (2010)).

A una disolución de L-tirosina ( ⁶ , 1 g, 5,5 mmol) en dioxano/agua 1/1 (50 ml), se le añadió lentamente trietilamina (1,16 ml, 8,28 mmol). Se enfrió la reacción hasta 0°C con un baño de hielo/agua y se añadió dicarbonato de di-tercbutilo (1,32 g, 6,07 mmol) en dos etapas. Después de 1 h a 0°C, se aumentó lentamente la temperatura hasta temperatura ambiental y se agitó la mezcla durante 24 h adicionales. Se eliminó el dioxano a presión reducida y se mezcló la disolución acuosa con NaHCO ³ saturado (25 ml), se lavó con acetato de etilo, se acidificó hasta pH 1 con HCI 1 N, se extrajo con acetato de etilo y se lavaron los extractos orgánicos con salmuera, se secaron sobre MgSO ⁴ y se evaporaron para dar tirosina protegida con Boc 7 como una espuma blanca (1,471 g, 95%) que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. Los datos analíticos coincidieron con la bibliografía (Jung, M. E. & Lazarova, T. I. J. Org. Chem. 62, 1553-1555 (1997)).

1H-RMN (300 MHz, CDCh): 87,50-7,22 (m, 2H, CHfenilo), 7,42 (dd, J = ⁸ , ⁶ , 2,3 Hz, 1H, CHfenilo), 6,92 (d, J = 8,4 Hz, 1H, CHfenilo), 5,11 (a, 1H, NH), 4,73-4,28 (m, 1H, CH), 3,32-2,90 (m, ² H,CH2), 1,42 (s, 9H, CH3).

N-[(1,1-dimetiletoxi)carbonil]-3-(3-formil-4-hidroxifenil)-L-alanina ( ⁸ )

A una suspensión de 7 (2,00 g, 7,12 mmol) en cloroformo (30 ml) y H2O (0,256 ml, 14,13 mmol) se le añadió hidróxido de sodio en polvo (1,71 g, 42,72 mmol) y se sometió la mezcla a reflujo durante 4 h. Se añadieron dos porciones adicionales de hidróxido de sodio en polvo (cada una de 0,42 g, 10,68 mmol) después de 1 y 2 h. Después de ⁸ h a reflujo, se enfrió la reacción hasta temperatura ambiental, se diluyó con agua y acetato de etilo (15 ml cada una), se descargó la fase orgánica, se acidificó la fase acuosa hasta pH 1 con HCl 1 N y se extrajo de nuevo con acetato de etilo. Se lavaron las fases orgánicas con salmuera, se secaron sobre MgSO4 y se concentraron. La cromatografía ultrarrápida en columna (gel de sílice, CHCh/MeOH 12/1, ácido acético al 1%) dio el compuesto ⁸ (0,49 g, 23%). Los datos analíticos coincidieron con la bibliografía (Jung, M. E. & Lazarova, T. I. J. Org. Chem. 62, 1553-1555 (1997)).

1H-RMN (300 MHz, CDCls): 89,85 (s, 1H, CHO), 7,49-7,21 (m, 2H, CHfenilo), 7,40 (dd, J = ⁸ , ⁶ , 2,3 Hz, 1H, CHfenilo), 6,94 (d, J = 8,4 Hz, 1H, CHfenilo), 5,10 (a, 1H, NH), 4,73-4,27 (m, 1H, CH), 3,30-2,89 (m, ² H,CH2), 1,40 (s, 9H, CH3).

3-formil-L-tirosina (1)

Se disolvió el compuesto 8 (0,49 g, 1,6 mmol) en CH2Cl2. Se añadió lentamente TFA (4 ml) a 0°C y se calentó la mezcla hasta temperatura ambiental en el plazo de 2 h. Se eliminó el disolvente a alto vacío. La HPLC preparativa (método C) dio el compuesto 1 como sal de TFA (0,29 g, 80%). Los datos analíticos coincidieron con la bibliografía (Jung, M. E. & Lazarova, T. I. J. Org. Chem. 62, 1553-1555 (1997)).

1H-RMN (300 MHz, D2O): 89,81 (s, 1H, CHO), 7,52 (d, J = 2,4 Hz, 1H, CHfenilo), 7,40 (dd, J = 8,6, 2,3 Hz, 1H, CHfenilo), 6,90 (d, J = 8,6 Hz, 1H, CHfenilo), 4,13 (t, J = 6,6 Hz, 1H, CH), 3,15 (m, 2H,CH2); 13C-RMN (75 MHz, D2O): 8 197,18, 171,68, 159,21, 138,07, 134,02, 126,03, 120,97, 117,73, 54,18, 34,48; ESI-EMAR (m/z):[M]+ calculado para Ci0Hi2No 4, 210,0758; encontrado 210,0760.

Ejemplo 27: síntesis de tris(PEG750)fosfito 14

Se sintetizó 14 basándose en un protocolo de Nischan et al (Angew. Chem. Int. Ed. 52, 11920-11924 (2013)). Se secó cuidadosamente polietilen glicometil éter a 70°C a alto vacío. Se añadió hexametilfosfortriamida (1 eq., 0,135 mmol, 24,5 |l) a polietilen glicometil éter seco (3 eq., 0,406 mmol, 0,314 g) a 110°C y se agitó bajo una corriente de N2 durante 72 h. Se recuperó el producto como un sólido parafínico blanco (0,133 mmol, 0,311 g). Con el fin de evitar la hidrólisis del producto, no se realizó purificación. Debido al carácter quimioselectivo de la reacción de Staudinger con fosfito, las impurezas no interfieren en la reacción y pueden retirarse fácilmente después de la reacción de Staudinger con fosfito.

1H-RMN (400 MHz, [D]-acetonitrilo): 83,58-3,57 (m, 198,9H, OCH2CH2O-), 3,32 (s, 9H, OCH3); 31P-RMN (400 MHz, [D]-acetonitrilo): 8140.

Ejemplo 28: síntesis de hidroxilamina-biotina S2

Éster de N-hidroxisuccinimida de D-biotina (16)

Se añadió 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimid (184 mg, 0,96 mmol) a una disolución de D-biotina (200 mg, 0,82 mmol) y N-hidroxisuccinimida (102 mg, 0,89 mmol) en DMF seca (10 ml). Se agitó la disolución durante 12 h a temperatura ambiental, se concentró y se cristalizó el producto a partir de 2-propanol para dar éster de succinimida 16 (261 mg, 80). Se usó el producto sin purificación adicional y los datos analíticos son según aquellos notificados en la bibliografía (Gerard, E., Meulle, A., Feron, O. & Marchand-Brynaert, J. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 586-590 (2012)).

1H-RMN (300 MHz, DMSO): 86,41 (s, 1H, NH), 6,36 (s, 1H, NH), 4,35-4,26 (m, 1H, CH), 4,18-4,11 (m, 1H, CH), 3,14-3,05 (m, 1H, CH), 2,89-2,75 (m, 5H, 2xCH2, CH), 2,64 (t J = 7,4 Hz, 2H, CH2), 2,60-2,55 (m, 1H, 3,32, CH), 1,72-1,32 (m, 6H, 3xCH2).

2-amino-3’[(terc-butoxicarbonil)amino]etilenglicol dietil éter (17)

A una disolución de 2,2’-(etilendioxi)-bis(etilamina) (4,07 g, 27,46 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (1,56 ml, 9,17 mmol) en CH2Cl2 seco (50 ml) a temperatura ambiental se le añadió gota a gota una disolución de dicarbonato de di-terc-butilo (2,0 g, 9,16 mmol) en C^h2CI2 seco (20 ml) en el plazo de 20 min. Después de una agitación adicional durante 1 h a temperatura ambiental, se concentró la mezcla, volvió a disolverse en 20 ml de agua y se extrajo cuatro veces con CH2Cl2 (10 ml). Se combinaron las fases orgánicas, se lavaron tres veces con salmuera, se secaron con MgSO4 y se concentraron para dar 2,02 g de un aceite incoloro de 17 en un rendimiento global del 88,8% que contenía algunas impurezas de especies doblemente protegidas (el 20% determinado a partir de 1H-RMN). Los datos analíticos son según aquellos notificados en la bibliografía (Ishida, M. et al. J. Am. Chem. Soc. 135, 12684-12689 (2013)).

1H-RMN (300 MHz, CDCls): 85,17 (a, 1H, NHBoc), 3,63 (s, 4H, OCH2CH2O), 3,56-3,47 (m, 4H, CH2O), 3,35-3,23 (m, 2H, CH2NHBoc), 2,86 (t, J = 5,2 Hz, 2H, CH2NH2), 1,51 (s, 2H, NH2), 1,42 (s, 9H, CH3); 13C-RMN (75 MHz, CDCls): 8 155,90, 79,03, 73,27, 70,08, 41,61,40,21,28,30.

N-Boc-N’-D-biotinil-3,6-dioxaoctan,1,8-diamina (18)

A una disolución de Boc-diamina 17 (109 mg, 0,44 mmol) y NEt3 (81 |l, 0,59 mmol) en DMF seca (5 ml), se le añadió éster de N-hidroxisuccinimida de D-biotina (16, 100 mg, 0,29 mmol) y se agitó durante 12 h. Se eliminó el disolvente, se resolvió el residuo en CH2Cl2 (40 ml), se lavó con 20 ml de salmuera, se secó sobre MgSO4 y se concentró. La cromatografía ultrarrápida en columna (gel de sílice, CH2Ch/MeOH: 99/1 ^ 93/7) dio el compuesto 18 (0,128 g, 93%). Los datos analíticos coincidieron con la bibliografía (Braun, M. et al. Eur. J. Org. Chem., 1173-1181 (2000)).

CCF (CH ² Cl ² :MeOH, 90:10 v/v): Rf = 0,37; ¹ H-RMN (300 MHz, CDCh): 87,35-7,23 (a, 1H. CONH), 6,77-6,19 (a, 2H, NH), 5,24-5,04 (a, 1H, CONH), 4,59-4,48 (m, 1H, CH), 4,40-4,28 (m, 1H,CH), 3,63 (s, 4H, OCH ² CH ² O), 3,58 (dt, J ¹ = J ² = 5,4 Hz, 4H, CH ² O), 3,46 (dt, J ¹ = J ² =4,9 Hz, 2H, CH ² NH), 3,32 (dt, J ¹ = J ² = 5,4 Hz, 2H, CH ² NHboc), 3,22-3,12 (m, 1H, CH), 2,98-2,89 (m, 1H, CHHexoS), 2,76 (d, J = 12,8 Hz, 1H, CHHendoS), 2,26 (t, J = 7,4 Hz, 2H, CH ² CO), 1,82­ 1,61 (m, 4H, CH ² ), 1,46 (s, 9H, CH ³ ), 1,26 (m, 2H, CH ² ); ¹³ C-RMN (75 MHz, CDCh): 8173,52, 165,20, 156,94, 79,10, 70,03 (4C), 61,78, 60,30, 55,30, 40,55, 40,31,39,13, 35,64, 29,61,28,35 (3C) 27,96, 25,46.

Éster de N’-Boc-aminooxiacetil-N-hidroxisuccinimida (19)

Se añadió 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimid (227 mg, 1,8 mmol) y N-hidroxisuccinimida (190 mg, 1,65 mmol) a una disolución de ácido N-Boc-aminooxiacético (287 mg, 1,5 mmol) en DMF seca (10 ml) y se agitó a temperatura ambiental durante 12 h. Se diluyó la mezcla mediante la adición de H2O (10 ml), se extrajo dos veces con EtOAc, se secó la fase orgánica sobre MgSO4 y se concentró a vacío. Se usó el líquido amarillento sin purificación adicional (352 mg, 81%). Los datos analíticos coincidieron con la bibliografía (Palaniappan, K. K. et al. Angew. Chem. Int. Ed.

52, 4849-4853 (2013)).

1H-RMN (300 MHz, CDCh): 87,84 (s, 1H, NH), 4,61 (s, 2H, CH2), 2,82 (s, 4H, 2x CH2), 1,31 (s, 9H, CH3); 13C-RMN (151 MHz, CDCI3) 8164,83, 162,92, 156,41,82,17, 70,48, 27,88, 25,39.

N-aminooxiacetil-N’-D-biotinil-3,6-dioxaoctan,1,8-diamina (15)

Se disolvió diamina 18 protegida con Boc (127 mg, 0,32 mmol) en CH2Cl2 (4 ml), se añadió TFA (1 ml) y se agitó la disolución a temperatura ambiental durante 2 h. Se eliminó el TFA y se secó el sólido restante usando alto vacío. Se disolvió la diamina desprotegida en una mezcla de DMF seca (3 ml) y NEt3 (89 |l, 0,64 mmol). Se disolvió éster de hidroxisuccinimida 19 (152 mg, 0,52 mmol) en DMF seca (0,5 ml), se añadió lentamente a la diamina y se agitó la mezcla resultante a temperatura ambiental durante 12 h. Se eliminó el disolvente y la cromatografía en columna ultrarrápida (gel de sílice, CH2Ch:MeOH, de 99:1 a 93:7) dio hidroxilamina ^s2 protegida con Boc (CCF = [CH2Cl2:MeOH, 90:10 v/v]: Rf = 0,3). Una desprotección final en disolución de TFA al 25% (CH2Ch) seguido por la eliminación del TFA dio hidroxilamina 15 desprotegida (102,2 mg, 71%).

¹ H-RMN (300 MHz, D ² O): 84,50 (s, 2H, COCH ² O), 4,49-4,43 (m, 1H, CH), 4,24-4,31 (m, 1H,CH), 3,54 (s, 4H, OCH ² CH ² O), 3,52-3,45 (m, 4H, CH ² O), 3,33 (dt, J ¹ = J ² = 5,3 Hz, 2H, CH ² NH), 3,24 (dt, J ¹ = J ² = 5,4 Hz, 2H, CH ² NHboc), 3,21-3,14 (m, 1H, CH), 2,85 (dd, J ¹ = 13, J ² = 4,9, Hz 1H, CHHexoS), 2,62 (d, J = 13 Hz, 1H, CHHendoS), 2,13 (t, J = 7,2 Hz, 2H, CH ² CO), 1,65-1,36 (m, 4H, CH ² ), 1,32-1,20 (m, 2H, CH ² ); ¹³ C-RMN (151 MHz, D ² O) 8176,79, 168,56, 165,14, 71,52, 69,26, 69,23, 68,70, 68,44, 61,93, 60,09, 55,20, 39,52, 38,67, 38,50, 35,26, 27,68, 27,52, 24,97; ESI-EM (m/z):[M]+ calculado para Ci8H34N5O6S, 448,22; encontrado 448,21.

Ejemplo 29: síntesis de péptido CF-Tub-tag 13

Péptido Tub-tag 14 marcado con 5(6)-carboxifluoresceína

Se sintetizó el péptido CF-Tub-tag mediante química basada en Fmoc convencional en una síntesis lineal en un sintetizador de péptidos Activotec seguido por acoplamiento manual de 5(6)-carboxifluoresceína. Se añadió 0,1 mmol de Fmoc-L-Glu(tBu)-resina Wang (sust: 0,58 mmol/g) a un recipiente de reacción y se realizó la síntesis con un exceso de aminoácido de cinco veces. Se logró el acoplamiento mediante adición de HOBt/HBTU/DIPEA. Después del acoplamiento del aminoácido final, se acopló el fluoróforo en un procedimiento de acoplamiento doble con 5 eq de 5(6)-carboxifluoresceína, HOBt, HBTU y DIPEA en DMF durante 1 h. Se eliminó mediante escisión el péptido de la resina mediante la adición de TFA/DTT/Tis/tioanisol (95/2/2/1) en el plazo de 4 h. Posteriormente, se evaporó el cóctel de escisión mediante flujo de N2 y se precipitó el péptido mediante la adición de dietil éter helado. Se centrifugó el precipitado, se disolvió en agua y se purificó mediante HPLC preparativa (método D). Se obtuvo el péptido con un rendimiento del 8% (16 mg, 8 pmol); péptido en masa molar = 1850,6 Da; ESI-EMAR (m/z): [M+2H]2+ calculado 926,3165; encontrado 926,3065.

Ejemplo 30: CL-UV a 220 nm, del 10 al 100% de acetonitrilo en agua que contiene TFA al 0,1% en una columna RP-C18

tiempo [min]

Bibliografía:

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2 Los, G. V. et al. HaloTag: a novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. Acs Chem Biol 3, 373-382, doi:10.1021/cb800025k (2008).

3 Schumacher, D. & Hackenberger, C. P. More than add-on: chemoselective reactions for the synthesis of functional peptides and proteins. Current opinion in chemical biology 22, 62-69, doi:10.1016/j.cbpa.2014.09.018 (2014).

4 Hackenberger, C. P. & Schwarzer, D. Chemoselective ligation and modification strategies for peptides and proteins. Angewandte Chemie International Edition 47, 10030-10074, doi:10.1002/anie.200801313 (2008).

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8 Chen, I., Howarth, M., Lin, W. & Ting, A. Y. Site-specific labeling of cell surface proteins with biophysical probes using biotin ligase. Nature methods 2, 99-104, doi:10.1038/nmeth735 (2005).

9 Fernandez-Suarez, M. et al. Redirecting lipoic acid ligase for cell surface protein labeling with small-molecule probes. Nature Biotechnology 25, 1483-1487, doi:10.1038/nbt1355 (2007).

10 Wu, P. et al. Site-specific chemical modification of recombinant proteins produced in mammalian cells by using the genetically encoded aldehyde tag. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 3000-3005, doi:10.1073/pnas.0807820106 (2009).

11 Rudiger, M., Wehland, J. & Weber, K. The carboxy-terminal peptide of detyrosinated alpha tubulin provides a minimal system to study the substrate specificity of tubulin-tyrosine ligase. European journal of biochemistry / FEBS 220, 309-320 (1994).

12 Szyk, A., Deaconescu, A. M., Piszczek, G. & Roll-Mecak, A. Tubulin tyrosine ligase structure reveals adaptation of an ancient fold to bind and modify tubulin. Nature structural & molecular biology 18, 1250-1258, doi:10.1038/nsmb.2148 (2011).

13 Banerjee, A. et al. Site-specific orthogonal labeling of the carboxy terminus of alpha-tubulin. ACS chemical biology 5, 777-785, doi:10.1021/cb100060v (2010).

14 Hamers-Casterman, C. et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature 363, 446-448, doi:10.1038/363446a0 (1993).

15 Trinkle-Mulcahy, L. et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   i. Método para la producción de un polipéptido que comprende

   (a) introducir o añadir en el extremo C-terminal de un polipéptido una secuencia de reconocimiento para tubulina-tirosina ligasa;

   (b) poner en contacto el polipéptido obtenido en la etapa (a) en presencia de tubulina-tirosina ligasa y un derivado de tirosina en condiciones adecuadas para que la tubulina-tirosina ligasa someta a tirosinación dicho polipéptido con dicho derivado de tirosina.
2. 2. Método según la reivindicación 1, que comprende además

   (c) conjugar un resto con dicho polipéptido sometido a tirosinación obtenido en la etapa (b).
3. 3. Método para la producción de un polipéptido que comprende

   (a') introducir o añadir en el extremo C-terminal de un polipéptido una secuencia de reconocimiento para tubulina-tirosina ligasa; y

   (b') poner en contacto el polipéptido obtenido en la etapa (a') en presencia de tubulina-tirosina ligasa y un derivado de tirosina conjugado con un resto en condiciones adecuadas para que la tubulina-tirosina ligasa someta a tirosinación dicho polipéptido con dicho derivado de tirosina conjugado con dicho resto.
4. 4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, en el que la secuencia de reconocimiento para la tubulina-tirosina ligasa tiene al menos la secuencia de aminoácidos X ¹ X ² X ³ X ⁴ (SEQ ID No: 11), en la que X ¹ y X ² es cualquier aminoácido, X ³ es E, D o C y X ⁴ es E.
5. 5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que X ² es G, S, A, V o F y/o en el que X ¹ es E, D, A, K o P.
6. 6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho polipéptido comprende una secuencia ligadora que precede a la secuencia de reconocimiento de tubulina-tirosina ligasa.
7. 7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho resto conjugado con un polipéptido sometido a tirosinación es un portador, un polipéptido, un marcador detectable, un compuesto químico, un ácido nucleico, un hidrato de carbono o un lípido.
8. 8. Método según la reivindicación 7, en el que el polipéptido es un anticuerpo o fragmento del mismo seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, anticuerpo humano, scFv, un DART, anticuerpo de dominio, nanocuerpo, una adnectina, un affibody, una anticalina, un DARPin o un aptómero.
9. 9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho derivado de tirosina contiene un grupo funcional no natural para modificaciones quimioselectivas o bioortogonales.
10. 10. Polipéptido que puede obtenerse mediante el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que es un anticuerpo y que comprende una secuencia de reconocimiento para la tubulina-tirosina ligasa que tiene al menos la secuencia de aminoácidos X ¹ X ² X ³ X ⁴ (SEQ ID No: 11), en la que X ¹ y X ² es cualquier aminoácido, X ³ es E, D o C y X ⁴ es E.
11. 11. Polipéptido según la reivindicación 10, que comprende además un derivado de tirosina unido de manera covalente a dicha secuencia de reconocimiento.
12. 12. Polipéptido según la reivindicación 11, en el que un resto se conjuga con dicho derivado de tirosina.
13. 13. Polipéptido según la reivindicación 12, en el que dicho resto es un compuesto químico.
14. 14. Composición de diagnóstico o farmacéutica que comprende el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13.
15. 15. Uso de tubulina-tirosina ligasa para someter a tirosinación un polipéptido distinto de tubulina que tiene en su extremo C-terminal una secuencia de reconocimiento para tubulina-tirosina ligasa.