JP2024006375A - ビオチン標識剤、ビオチン標識されたタンパク質及びビオチン標識剤を含む免疫検査試薬 - Google Patents
ビオチン標識剤、ビオチン標識されたタンパク質及びビオチン標識剤を含む免疫検査試薬 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2024006375A JP2024006375A JP2022107195A JP2022107195A JP2024006375A JP 2024006375 A JP2024006375 A JP 2024006375A JP 2022107195 A JP2022107195 A JP 2022107195A JP 2022107195 A JP2022107195 A JP 2022107195A JP 2024006375 A JP2024006375 A JP 2024006375A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- biotin
- labeling agent
- labeled
- biotin labeling
- fab
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 title claims abstract description 321
- 239000011616 biotin Substances 0.000 title claims abstract description 171
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 title claims abstract description 171
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 title claims abstract description 162
- 238000002372 labelling Methods 0.000 title claims abstract description 121
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 title claims abstract description 93
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 56
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 56
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 19
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 title claims description 6
- MZJKOAWTWHFDFV-UHFFFAOYSA-N 5,6-dibromopyridazine-3,4-dione Chemical group BrC1=C(Br)C(=O)C(=O)N=N1 MZJKOAWTWHFDFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 125000001425 triazolyl group Chemical group 0.000 claims description 8
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 6
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 claims description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 6
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 4
- -1 polyethylene Polymers 0.000 claims description 4
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 2
- 125000000467 secondary amino group Chemical class [H]N([*:1])[*:2] 0.000 claims 4
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 claims 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 abstract description 4
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 51
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 50
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 47
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 40
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 31
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 28
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 28
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 28
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 16
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 15
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 14
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 108700021042 biotin binding protein Proteins 0.000 description 12
- 102000043871 biotin binding protein Human genes 0.000 description 12
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 10
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 10
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N Deuterated methanol Chemical compound [2H]OC([2H])([2H])[2H] OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 7
- PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 3-[bis(2-carboxyethyl)phosphanyl]propanoic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 6
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 5
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 5
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 5
- MYKHANQTTIRZJK-UHFFFAOYSA-N pyridazine-3,4-dione Chemical group O=C1C=CN=NC1=O MYKHANQTTIRZJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 125000002355 alkine group Chemical group 0.000 description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000001269 time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 125000006833 (C1-C5) alkylene group Chemical group 0.000 description 3
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000012482 interaction analysis Methods 0.000 description 3
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 238000006352 cycloaddition reaction Methods 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- NXJCBFBQEVOTOW-UHFFFAOYSA-L palladium(2+);dihydroxide Chemical compound O[Pd]O NXJCBFBQEVOTOW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- RNAMYOYQYRYFQY-UHFFFAOYSA-N 2-(4,4-difluoropiperidin-1-yl)-6-methoxy-n-(1-propan-2-ylpiperidin-4-yl)-7-(3-pyrrolidin-1-ylpropoxy)quinazolin-4-amine Chemical compound N1=C(N2CCC(F)(F)CC2)N=C2C=C(OCCCN3CCCC3)C(OC)=CC2=C1NC1CCN(C(C)C)CC1 RNAMYOYQYRYFQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- OHOQEZWSNFNUSY-UHFFFAOYSA-N Cy3-bifunctional dye zwitterion Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCN1C2=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C2C(C)(C)C1=CC=CC(C(C1=CC(=CC=C11)S([O-])(=O)=O)(C)C)=[N+]1CCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O OHOQEZWSNFNUSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 1
- 239000012359 Methanesulfonyl chloride Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- WUGQZFFCHPXWKQ-UHFFFAOYSA-N Propanolamine Chemical compound NCCCO WUGQZFFCHPXWKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 150000001345 alkine derivatives Chemical group 0.000 description 1
- 150000001356 alkyl thiols Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001615 biotins Chemical class 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 125000000950 dibromo group Chemical group Br* 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- UREBWPXBXRYXRJ-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate;methanol Chemical compound OC.CCOC(C)=O UREBWPXBXRYXRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000005389 magnetism Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- QARBMVPHQWIHKH-UHFFFAOYSA-N methanesulfonyl chloride Chemical compound CS(Cl)(=O)=O QARBMVPHQWIHKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 108010087904 neutravidin Proteins 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004686 pentahydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M sodium-L-ascorbate Chemical compound [Na+].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M 0.000 description 1
- 235000019187 sodium-L-ascorbate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011755 sodium-L-ascorbate Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Abstract
【課題】タンパク質への標識位置が明確で、失活を招くことのない標識剤を提供する。【解決手段】一端にビオチン構造（下記式（１））を有し、他端にジブロモ―ピリダジンジオン基（下記式（２））を有するビオチン標識剤。TIFF2024006375000020.tif40147TIFF2024006375000021.tif33147【選択図】なし
Description
本発明は、抗体などの種々のタンパク質を標識するためのビオチン標識剤に関し、特に、ジスルフィド結合を有するタンパク質に適したビオチン標識剤に関する。
ビオチンは、ストレプトアビジン等の特定のタンパク質と特異的に強く結合することが知られており、免疫染色やタンパク質の抽出精製などに利用されている。例えば、ビオチン標識した抗体に、色素や色素生成酵素を結合したストレプトアビジンを結合しておくことで、標的抗原分子を検出し、定量化することができる。またビオチン標識したタンパク質を、色素や色素生成酵素を結合したストレプトアビジンと反応させることで、ビオチンとストレプトアビジンとが結合し、標的であるタンパク質を可視的な方法で検出することを可能にする。また、ストレプトアビジンがもつ四つのビオチン結合ポケットを利用することで、図３に示すように、Au等の金属基板にビオチン化試薬を固定した状態で、ストレプトアビジンを結合することにより、ビオチンと結合していないストレプトアビジンの部分に、ビオチン標識抗体を結合させて固定化することも可能である。なおビオチンと特異的に結合するタンパク質としては、ストレプトアビジン以外にも種々のものが知られており、同様に利用されている。
従来、抗体などのタンパク質に対するビオチン標識試薬として、タンパク質やペプチドのリジン残基やシステイン残基を標的とした試薬などが知られている。リジン残基は、タンパク質表面に多く存在するため、リジン残基側鎖のアミノ基に対するビオチン標識はランダムとなり、定量的な把握が困難になる場合がある。一方、システイン残基は、存在比率が低いためにリジン残基よりも標識位置が限定されるが、ジスルフィド結合を切断して生じるスルフヒドリル基に対してビオチンが結合するので、標識後のタンパク構造が不安定化し、活性が低下したり、場合によっては失活したりするという課題がある。
なおビオチン標識ではなく、ジスルフィド結合に蛍光色素等の種々の化合物を標識する化合物が非特許文献１に提案されている。この化合物は、末端にアルキン基を持つ鎖状化合物の他端末にジブロモ―ピリダジンジオン基を結合した構造を有し、ジブロモ―ピリダジンジオン基が、タンパク質のジスルフィド結合を切断して生じるスルフヒドリル末端に結合することで、元のジスルフィド結合に由来する２つの硫黄原子がピリダジンジオン基を介して連結（再架橋）する。一方、反応性の高いアルキン基により種々の化合物を結合することが可能であり、これによってタンパク質に種類の異なる標識を行うことができる。
しかし、非特許文献１に開示された化合物は、製造の収率がよくない上に、そもそも、そのままビオチン標識に用いることはできない。即ち、ビオチン標識のためには、末端アルキンにビオチン構造を付加するための反応が必要となるが、非特許文献１には、それについての記載や示唆はない。
Nanoscale, 2020, 12, 11647-11658
本発明は、タンパク質への標識位置が明確であり、且つ、標識によってタンパク質本来の活性の低下や失活を招くことのないビオチン標識剤を提供することを課題とする。
上記課題を解決する本発明のビオチン標識剤は、一端にビオチン構造（式（１））を有し、他端にジブロモ―ピリダジンジオン基（式（２））を有するビオチン標識剤（以下、モノビオチン標識剤という）、または、３つの末端を有する分枝構造を持ち、３つの末端のうち、二端にそれぞれビオチン構造（式（１））を有し、他の一端にジブロモ―ピリダジンジオン基（式（２））を有するビオチン標識剤（以下、ダブルビオチン標識剤という）である。
式（１）
式（２）
本発明のモノビオチン標識剤は一端にジブロモ―ピリダジンジオン基を持ち、他端にビオチン構造を持つ直鎖状化合物であり、またダブルビオチン標識剤は、分岐状であって２つの端部にジブロモ―ピリダジンジオン基を持ち、他端にビオチン構造を持つ分岐状化合物で、いずれも新規な化合物である。両者は、ともにストレプトアビジン等のビオチン結合性タンパクに特異的な親和性を持つビオチン構造の利用を意図して、ビオチン標識剤として用いられる。なお以下の説明において、モノビオチン標識剤、ダブルビオチン標識剤を区別しないときは、単にビオチン標識剤という。
また本発明は上述したビオチン標識剤で標識されたタンパク質、及びビオチン標識剤を含む免疫検査試薬を提供するものである。
本発明によれば、タンパク質に含まれるジスルフィド基（S-S結合）に結合してタンパク質をビオチン標識する新規な化合物が提供される。この化合物は、上述したビオチン結合性タンパクに対し高い親和性を持ち、免疫染色、免疫検査試薬、タンパク質抽出・単離などに利用することができる。また本発明のビオチン標識剤はタンパク質のジスルフィド基に結合するので、標識部位が明確であり、例えば免疫検査試薬としたときの定量性が得られる。さらに本発明のビオチン標識剤は、切断したジスルフィド基の両端に結合するので、ジスルフィド基を再架橋し、標識対象であるタンパク質の構造の安定性を保つことができる。
さらに本発明のビオチン標識剤は、非特許文献１などに開示されたジスルフィド基に結合する化合物と比べ高い収率で安定的に得られ、且つ末端にビオチン構造を有しているので、ビオチン結合性タンパクに結合するための別な化合物との反応が不要で、そのままビオチン標識剤として用いることができる。
以下、本発明のビオチン標識剤及びそれにより標識されたタンパク質の実施形態を説明する。
本発明のビオチン標識剤は、上述したように、1個のビオチン構造（式（１））を持つモノビオチン化合物と、２個のビオチン構造を持つダブルビオチン化合物とを含むが、いずれも端部に式（２）で表されるジブロモ―ピリダジンジオン基を有している。このジブロモ―ピリダジンジオン基は、図１に示すように、２つのBrとジスルフィド基の切断後のスルフヒドリル末端との置換反応によって、標識対象であるタンパク質のS-S基を、ピリダジンジオン基を介して再結合する。これにより、S-S基を切断後にビオチン標識しても、タンパク質の構造を安定に保つことができる。
もう一方の端部のビオチン構造は、下式（３）で示すビオチンと同様に、ストレプトアビジン等のビオチン結合性タンパクと高い親和性を示し、ストレプトアビジン等のビオチン結合性タンパクと結合した状態で、種々の免疫反応や抗体、抗原の検出、分離等に利用することができる。
本発明のビオチン標識剤において、ビオチン構造（２個ある場合はそのうちの一つ）とジブロモ―ピリダジンジオン基とは、例えば、連結鎖Aで連結されている。ここで、連結鎖Aは、要素として、C１～５のアルキレン、繰り返し単位数が１～２０のポリエチレングリコール（(-CH2CH2O-)１～２０）、あるいは、その組み合わせを含み、要素の数が１～６のいずれかである。
ここで要素の数が２～６のとき、各要素は直接結合されていてもよいし、アミド結合、トリアゾール基、第２級アミンのいずれかを介して連結されていてもよい。また全ての要素間の結合は、同じ結合様式でもよいし、異なるものであってもよい。
またダブルビオチン標識剤は、連結鎖Aの要素と要素とを連結する連結部位のいずれかに第２級アミンを含み、当該第２級アミンに結合した水素原子が、連結鎖Bの一端と置換された構造を持ち、連結鎖Bの他端に、２つのビオチン構造の一方、即ち連結鎖Aとは連結されていない方のビオチン構造（式（２））が連結されている。連結鎖Bは、要素として、C１～５のアルキレン、繰り返し単位数が１～２０のポリエチレングリコール（(-CH2CH2O-)１～２０）、あるいは、その組み合わせを含み、要素の数は１～３のいずれかである。
また連結鎖Bについても、各要素は直接結合されていてもよいし、アミド結合、トリアゾール基、第２級アミンのいずれかを介して連結されていてもよい。また全ての要素間の結合は、同じ結合様式でもよいし、異なるものであってもよい。
連結鎖A及び連結鎖Bの要素数が最大の場合(Aの要素数＝６、Bの要素数＝３)を一般式で示すと、モノビオチン標識剤及びダブルビオチン標識剤は、次の式（I）、（II）で表される。
なお式（II）では、連結鎖Bが、連結鎖Aの中央の連結部位X3に連結鎖Bが連結した場合を示したが、連結Bは、連結部位が第２級アミンであれば、式中矢印で示すように、X１～X5のいずれに連結していてもよい。
本発明のモノビオチン標識剤及びダブルビオチン標識剤の代表的な例として、次の化学式（IA）及び（IIA）で表されるビオチン標識剤を例示する。
本発明のビオチン標識剤は、ジブロモ―ピリダジンジオン基が、標識対象であるタンパク質のジスルフィド基に結合することでタンパク質を標識するので、リジン残基に結合する従来の標識剤のように、タンパクのどの位置がビオチン標識されているか把握できないという問題がなく、ビオチンの結合数がより明確になるため、定量的な分析に役立つ。また切断したジスルフィド基にビオチンを結合する従来のビオチン標識手法では、タンパクの構造が不安定となり活性が低下し、失活するおそれもあるが、本発明のビオチン標識剤は、切断後のジスルフィド結合がピリダジンジオン基を介して再結合（バイパス）されるので、タンパク質の構造が安定し、活性の低下や失活を防止することができる。
＜ビオチン標識タンパク質及び試薬＞
本発明のビオチン標識タンパク質は、上述のモノビオチン標識剤或いはダブルビオチン標識剤で標識されたタンパク質、即ちタンパク質のS-S結合を再度連結するようにビオチン標識剤が結合したタンパク質である。図１に示したように、ビオチン標識剤のジブロモ―ピリダジンジオン基の２つのBrが、標識対象であるタンパク質のジスルフィド基を切断した後のスルフヒドリル末端との置換反応することで、タンパク質に結合し、そのS-S基を再結合する。これにより、安定した構造のビオチン標識タンパク質が得られる。
本発明のビオチン標識タンパク質は、上述のモノビオチン標識剤或いはダブルビオチン標識剤で標識されたタンパク質、即ちタンパク質のS-S結合を再度連結するようにビオチン標識剤が結合したタンパク質である。図１に示したように、ビオチン標識剤のジブロモ―ピリダジンジオン基の２つのBrが、標識対象であるタンパク質のジスルフィド基を切断した後のスルフヒドリル末端との置換反応することで、タンパク質に結合し、そのS-S基を再結合する。これにより、安定した構造のビオチン標識タンパク質が得られる。
標識の対象となるタンパク質としては、分子内にS-S結合を有するものであれば、特に限定されず、種々の抗体（或いは抗原）などであり、例えば、IgA、IgE、IgG、IgM、ScFv-Fc、(Fab’)2、Minibody、Fab、Diabody、scFv、VHHなどが挙げられる。
このような本発明のビオチン標識タンパク質は、ビオチン結合性タンパクを介して、蛍光色素、酵素或いはビーズを結合させることにより、免疫染色やタンパク質の抽出・精製等に適用することができる。
ここで、「ビオチン結合性タンパク質」とは、ビオチンと特異的に結合するタンパク質のことで、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、AVRタンパク質（Biochem.J.,2002,363, 609-617）、ブラダビジン（Bradavidin）（J.Biol.Chem.,2005,280, 13250-13255）、リザビジン（Rhizavidin）（Biochem.J., 2007,405, 397-405）、タマビジン（WO02/072817）およびこれらの変異体や修飾体、単量体や多量体（連結体）等を含む、ビオチンに高い親和性をもつタンパク質のことをいう。
本実施形態にかかるビオチン結合性タンパク質は、ビオチンとの特異的な結合能を有する限り、そのアミノ酸配列中に１または複数（例えば、１～１０、好ましくは、１～５、より好ましくは１～３）のアミノ酸の置換、挿入、欠失および／または付加を有していてもよく、いずれかのアミノ酸がグリコシル基などの糖鎖やその他の置換基で修飾されていてもよい。
ビオチン結合性タンパクがストレプトアビジンの場合を例にすると、例えば、図２に示すように、例えば抗体を本発明のビオチン標識剤でビオチン標識した後、蛍光色素を結合させたストレプトアビジンと反応させることにより、抗体を蛍光色素染色でき、免疫反応の可視化を図ることができる。逆に、ビオチン標識剤を、ストレプトアビジンを介して蛍光色素染色した後、抗体と反応させてもよい。酵素についても同様にしてストレプトアビジンを介して、ビオチン標識した抗体に結合することができ、免疫染色（色素増幅）やELISA、ウェスタンブロッディングに応用することができる。またビオチン標識したタンパクにビーズを結合させることで、ビーズの不溶性、あるいは磁性を付与している場合には磁性を利用して、所定のタンパク質を抽出し、精製することができる。
本発明の免疫検査試薬は、上述した免疫染色（色素増幅）やELISA、ウェスタンブロッディングを含む検査等に用いる試薬であり、本発明のビオチン標識剤、ビオチン標識タンパク質又はビオチン標識剤のビオチン構造にビオチン結合性タンパク質が結合しているものを含む。また図２では、ビオチン結合性タンパクがストレプトアビジンの場合を示しているが、前述したストレプトアビジン以外のビオチン結合性タンパクについても、同様の試薬とすることができ、そのような試薬も本願発明に包含される。
さらに本発明のビオチン標識タンパク質は、基板上に抗体固定化した試薬として利用することも可能である。抗体固定化した試薬の一例を図３に示す。この例では、Au基板を用意し、例えばチオール基とAuとの結合により、ビオチン標識アルキルチオールを基板に固定する。また自由端となっているビオチン標識剤のビオチン構造とストレプトアビジンとを結合し、ストレプトアビジンを固定化する。一方、本発明の標識剤でビオチン標識した抗体を用意し、これを四量体のストレプトアビジンのうちビオチン構造が結合していないストレプトアビジンに結合させる。これにより、抗体が基板に固定される。このような抗体固定化した基板は、免疫を利用した検査に用いられる。
この例でも、ストレプトアビジン以外のビオチン結合性タンパク質でも、それを基板に固定することにより、本発明の標識剤でビオチン標識した抗体を基板に固定することが可能である。
＜ビオチン標識剤の製造方法＞
以下、本発明のビオチン標識剤の製造方法の一例を説明する。
以下、本発明のビオチン標識剤の製造方法の一例を説明する。
本発明のビオチン標識剤は、ビオチンを出発原料とし、ビオチン標識剤の主構造となる化合物（IV）或いは化合物（V）を合成する。化合物（IV）（n=3のもの）はビオチンから９０％以上の収率で合成することができ（Tantama et al., J. Am. Chem. Soc., 2008, 130, 15733-15787、Zong et al., J. Am. Chem. Soc. 2019, 141, 8450-8461）、化合物（V）（n=3のもの）は上記化合物（IV）から９５％以上の収率で合成することができる（Wooyoung et al., Chem. & Biol., 2010, 17, 537-547、Peng-Yu et al., Chem. Asian. J., 2011, 6, 2762-2775）。
式（IV）、（V）において、Ｚは、要素として、-（CH2CH2O）1～20-、又は炭素数１～５のアルキレン基を含み、各要素間は、直接結合されているか、アミド結合、トリアゾール基、第２級アミンのいずれかで結合されている。すなわち、Zは要素の数ｎが６の場合、要素をZ1～Z6、結合部位をX1～X5で表すと、Z＝－Z１－X1－Z2－X2－Z3－X3－Z4－X4－Z5－X5－Z6－で表される。ｎは、モノビオチン標識剤製造の出発原料の場合、ｎ＝１～６のいずれかである。また、ダブルビオチン標識剤製造の場合は、出発原料としてｎ＝１～６の化合物と、ｎ＝１～３の化合物とを用意する。
モノビオチン標識剤（化合物（I））は、上記化合物（V）とジブロモ―ピリダジンジオン基を持つ活性化化合物（VI）との縮合反応により製造することができる。
ダブルビオチン標識剤（式（II））は、３－アミノ－１－プロパノールのアミノ基にアルキン基を導入した化合物(式（VII）)を用いて、ヒュスゲン環化付加反応により、アミンを中心として、ビオチン構造を含む出発化合物（式（IV））を直鎖状につなげた二量体を製造した後、中心のアミン窒素に連結した末端ヒドロキシ基をアミノ基に変換し、当該アミノ基にジブロモ―ピリダジンジオン基を含む化合物(式（VI）)を縮合反応により結合することにより製造することができる。
なお上記製造方法は、一例であり、例えば上記ではダブルビオチン標識剤として単一の出発化合物（IV）を用いてホモ二量体とした場合を説明したが、連結鎖（Z）nの構成が異なる2種類の出発化合物（IV）を用いてヘテロ二量体としてもよく、その場合にも同様の反応により両者を直鎖状につなげることが可能である。
また、モノビオチン製造後に、その連結鎖Ａに含まれる第２級アミンにアルキン基を導入し、ヒュスゲン環化付加反応によりビオチン構造を含む化合物（IV）を結合することも可能である。
また、モノビオチン製造後に、その連結鎖Ａに含まれる第２級アミンにアルキン基を導入し、ヒュスゲン環化付加反応によりビオチン構造を含む化合物（IV）を結合することも可能である。
以下、本発明のビオチン標識剤及びそれにより標識されたタンパク質の実施例を説明する。
＜実験例１＞Fabのダブルビオチン標識
１．ダブルビオチン標識剤の合成
以下の反応式により、ダブルビオチン標識剤（II）を合成した。
以下、合成手順を詳述する。
１．ダブルビオチン標識剤の合成
以下の反応式により、ダブルビオチン標識剤（II）を合成した。
＜化合物（ＶIII）の合成＞
文献記載の方法[Bioconjugate Chem. 2006, 17,52-57]に従って得られた化合物（IV）（24.4 g, 54.9 mmol）をDMF（220 mL）に溶解し、文献記載の方法[Angew. Chem. Int. Ed.2014,53, 5872 -5876.]に従って得られた化合物（VII）（4.15 g, 27.5 mmol）、L-アスコルビン酸ナトリウムの水溶液（5.99 g, 30.2 mmol, 20 mL）、硫酸銅（II）五水和物の水溶液（0.75 g, 3.02 mmol, 5 mL）を加えて、室温で42時間撹拌した。減圧下で溶媒を留去し、得られた残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル：メタノール＝1:0→1:2）で精製することにより、化合物（VIII）（16.5 g, 15.9 mmol）を収率58%で得た。Rf 0.30 [100%(v)メタノール]；1H NMR(400 MHz, メタノール-d4)δ値（ppm）：7.99 (s, 2H), 4.61-4.56（m, 4H）, 4.49 (ddd, J = 7.8, 5.0, 0.9 Hz, 2H), 4.30 (dd, J = 7.9, 4.5 Hz, 2H), 3.94-3.88 (m, 4H), 3.61 (q, J = 1.3 Hz, 9H), 3.58（d, J = 4.6 Hz, 10H）, 3.52 (t, J = 5.5 Hz, 4H), 3.34 (d, J = 1.7 Hz, 7H), 3.31 (s, 2H), 3.20 (ddd, J = 8.8, 5.8, 4.4 Hz, 2H), 2.92 (dd, J = 12.8, 5.0 Hz, 2H), 2.70 (d, J = 12.7 Hz, 2H), 2.57 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.20 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 1.82-1.53 (m, 11H), 1.43 (p, J = 7.4 Hz, 4H)；13C NMR（100 MHz, メタノール-d4）δ値（ppm）：176.1, 166.1, 145.2, 126.1, 71.6, 71.5, 71.5, 71.3, 70.6, 70.4, 63.4, 61.6, 61.6, 57.0, 51.4, 41.1, 40.3, 36.7, 30.8, 29.8, 29.5, 26.8；MALDI-TOFMS(m/z) [M+H]+計算値1040.54, 検出値1040.47、[M+Na]+計算値1062.52, 検出値1062.45。
文献記載の方法[Bioconjugate Chem. 2006, 17,52-57]に従って得られた化合物（IV）（24.4 g, 54.9 mmol）をDMF（220 mL）に溶解し、文献記載の方法[Angew. Chem. Int. Ed.2014,53, 5872 -5876.]に従って得られた化合物（VII）（4.15 g, 27.5 mmol）、L-アスコルビン酸ナトリウムの水溶液（5.99 g, 30.2 mmol, 20 mL）、硫酸銅（II）五水和物の水溶液（0.75 g, 3.02 mmol, 5 mL）を加えて、室温で42時間撹拌した。減圧下で溶媒を留去し、得られた残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル：メタノール＝1:0→1:2）で精製することにより、化合物（VIII）（16.5 g, 15.9 mmol）を収率58%で得た。Rf 0.30 [100%(v)メタノール]；1H NMR(400 MHz, メタノール-d4)δ値（ppm）：7.99 (s, 2H), 4.61-4.56（m, 4H）, 4.49 (ddd, J = 7.8, 5.0, 0.9 Hz, 2H), 4.30 (dd, J = 7.9, 4.5 Hz, 2H), 3.94-3.88 (m, 4H), 3.61 (q, J = 1.3 Hz, 9H), 3.58（d, J = 4.6 Hz, 10H）, 3.52 (t, J = 5.5 Hz, 4H), 3.34 (d, J = 1.7 Hz, 7H), 3.31 (s, 2H), 3.20 (ddd, J = 8.8, 5.8, 4.4 Hz, 2H), 2.92 (dd, J = 12.8, 5.0 Hz, 2H), 2.70 (d, J = 12.7 Hz, 2H), 2.57 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.20 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 1.82-1.53 (m, 11H), 1.43 (p, J = 7.4 Hz, 4H)；13C NMR（100 MHz, メタノール-d4）δ値（ppm）：176.1, 166.1, 145.2, 126.1, 71.6, 71.5, 71.5, 71.3, 70.6, 70.4, 63.4, 61.6, 61.6, 57.0, 51.4, 41.1, 40.3, 36.7, 30.8, 29.8, 29.5, 26.8；MALDI-TOFMS(m/z) [M+H]+計算値1040.54, 検出値1040.47、[M+Na]+計算値1062.52, 検出値1062.45。
＜化合物（IX）の合成＞
化合物（VIII）（16.2 g, 15.6 mmol）、トリエチルアミン（1.74 g, 17.2 mmol）、塩化メタンスルホニル（1.97 g, 17.2 mmol）をDMF（234 mL）に溶解し、遮光条件下、室温で15時間撹拌した。その後、アジ化ナトリウム（5.17 g, 79.5 mmol）を加えて、室温で24時間撹拌した。減圧下で溶媒を留去し、得られた残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル：メタノール＝1:2）で精製することにより、化合物（IX）（7.87 g, 7.39 mmol）を収率47%で得た。Rf 0.20 [1:2(v/v) 酢酸エチル－メタノール]；1H NMR(400 MHz, メタノール-d4)δ値（ppm）：8.00 (s, 2H), 4.59 (t, J = 5.1 Hz, 4H), 4.51-4.46 (m, 2H), 4.30 (dd, J = 7.9, 4.5 Hz, 2H), 3.91 (t, J = 5.1, 4H), 3.79 (s, 4H), 3.64-3.55 (m, 18H), 3.52 (t, J = 5.5 Hz, 4H), 3.34 (d, J = 1.7 Hz, 9H), 3.20 (ddd, J = 8.9, 5.9, 4.4 Hz, 2H), 2.92 (dd, J = 12.8, 5.0, 2H), 2.70 (d, J = 12.7 Hz, 2H), 2.59 (t, J = 7.1, 2H), 2.20 (t, J = 7.4, 4H), 1.84-1.52 (m, 10H), 1.43 (p, J = 7.2 Hz, 4H)；13C NMR（100 MHz, メタノール-d4）δ値（ppm）：176.1, 166.1, 144.9, 126.2, 71.5, 71.5, 71.5, 71.3, 70.6, 70.4, 63.4, 61.6, 61.6, 57.0, 51.4, 41.1, 40.3, 36.7, 30.7, 29.8, 29.5, 26.8；MALDI-TOFMS(m/z) [M+Na]+計算値1087.53, 検出値1087.41、[M-N2+Na]+計算値1059.52, 検出値1059.34。
化合物（VIII）（16.2 g, 15.6 mmol）、トリエチルアミン（1.74 g, 17.2 mmol）、塩化メタンスルホニル（1.97 g, 17.2 mmol）をDMF（234 mL）に溶解し、遮光条件下、室温で15時間撹拌した。その後、アジ化ナトリウム（5.17 g, 79.5 mmol）を加えて、室温で24時間撹拌した。減圧下で溶媒を留去し、得られた残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル：メタノール＝1:2）で精製することにより、化合物（IX）（7.87 g, 7.39 mmol）を収率47%で得た。Rf 0.20 [1:2(v/v) 酢酸エチル－メタノール]；1H NMR(400 MHz, メタノール-d4)δ値（ppm）：8.00 (s, 2H), 4.59 (t, J = 5.1 Hz, 4H), 4.51-4.46 (m, 2H), 4.30 (dd, J = 7.9, 4.5 Hz, 2H), 3.91 (t, J = 5.1, 4H), 3.79 (s, 4H), 3.64-3.55 (m, 18H), 3.52 (t, J = 5.5 Hz, 4H), 3.34 (d, J = 1.7 Hz, 9H), 3.20 (ddd, J = 8.9, 5.9, 4.4 Hz, 2H), 2.92 (dd, J = 12.8, 5.0, 2H), 2.70 (d, J = 12.7 Hz, 2H), 2.59 (t, J = 7.1, 2H), 2.20 (t, J = 7.4, 4H), 1.84-1.52 (m, 10H), 1.43 (p, J = 7.2 Hz, 4H)；13C NMR（100 MHz, メタノール-d4）δ値（ppm）：176.1, 166.1, 144.9, 126.2, 71.5, 71.5, 71.5, 71.3, 70.6, 70.4, 63.4, 61.6, 61.6, 57.0, 51.4, 41.1, 40.3, 36.7, 30.7, 29.8, 29.5, 26.8；MALDI-TOFMS(m/z) [M+Na]+計算値1087.53, 検出値1087.41、[M-N2+Na]+計算値1059.52, 検出値1059.34。
＜ダブルビオチン標識剤（II）の合成＞
化合物（IX）（400 mg, 0.375 mmol）をメタノール（4 mL）に溶解し、20%水酸化パラジウム-活性炭素（500 mg）を加えて、水素雰囲気下、室温で20時間撹拌した。セライトろ過後、ろ液を減圧下で濃縮し、残留物(X)（291 mg, Rf 0.10 [100％(v)メタノール]）を得た。文献記載の方法[Org.Biomol.Chem.2018,16,1359-1366.]に従って得られた化合物（VI）(127 mg, 0.28 mmol)と残留物(X)（291 mg, 0.28 mmol）をDMF（4 mL）に溶解し、室温で21時間撹拌した。減圧下で溶媒を留去し、得られた残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル：メタノール＝1:0→0:1）で精製することにより、ダブルビオチン標識剤（II）（134 mg, 0.097 mmol）を収率35%で得た。Rf 0.30 [100%(v) メタノール]；1H NMR(400 MHz, メタノール-d4)δ値（ppm）：7.98 (s, 2H), 4.59 (t, J = 5.1 Hz, 4H), 4.54-4.39 (m, 4H), 4.30 (dd, J = 7.9, 4.5 Hz, 2H) 3.91 (t, J = 5.4 Hz, 5H), 3.74 (s, 3H), 3.67 (s, 2H), 3.65-3.54 (m, 18H), 3.52 (t, J = 5.4 Hz, 5H), 3.31 (s, 1H)m 3.19 (ddt, J = 8.9, 6.7, 4.5 Hz, 2H), 2.92 (dd, J = 12.8, 5.0 Hz, 2H), 2.79 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 2.70 (d, J = 12.7 Hz, 2H), 2.66-2.58 (m, 2H), 2.52-2.48 (m, 2H), 2.21 (t, J = .4 Hz, 4H), 1.65 (dddt, J = 38.7, 24.3, 13.9, 6.8 Hz, 8H), 1.43 (p, J = 7.3 Hz, 4H)；13C NMR（100 MHz, メタノール-d4）δ値（ppm）：176.1, 172.1, 166.1, 154.8, 154.5, 145.3, 136.7, 136.5, 126.1, 71.6, 71.5, 71.5, 71.3, 70.6, 70.4, 63.4, 61.6, 57.0, 51.9, 51.4, 49.9, 45.5, 41.1, 40.4, 38.9, 36.8, 35.7, 35.0, 29.8, 29.5, 27.3, 26.9, 26.3；MALDI-TOFMS(m/z) [M+H]+計算値1377.43, 検出値1377.43、[M+Na]+計算値1399.41, 検出値1399.41、[M+K]+計算値1415.38, 検出値1415.39。
化合物（IX）（400 mg, 0.375 mmol）をメタノール（4 mL）に溶解し、20%水酸化パラジウム-活性炭素（500 mg）を加えて、水素雰囲気下、室温で20時間撹拌した。セライトろ過後、ろ液を減圧下で濃縮し、残留物(X)（291 mg, Rf 0.10 [100％(v)メタノール]）を得た。文献記載の方法[Org.Biomol.Chem.2018,16,1359-1366.]に従って得られた化合物（VI）(127 mg, 0.28 mmol)と残留物(X)（291 mg, 0.28 mmol）をDMF（4 mL）に溶解し、室温で21時間撹拌した。減圧下で溶媒を留去し、得られた残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル：メタノール＝1:0→0:1）で精製することにより、ダブルビオチン標識剤（II）（134 mg, 0.097 mmol）を収率35%で得た。Rf 0.30 [100%(v) メタノール]；1H NMR(400 MHz, メタノール-d4)δ値（ppm）：7.98 (s, 2H), 4.59 (t, J = 5.1 Hz, 4H), 4.54-4.39 (m, 4H), 4.30 (dd, J = 7.9, 4.5 Hz, 2H) 3.91 (t, J = 5.4 Hz, 5H), 3.74 (s, 3H), 3.67 (s, 2H), 3.65-3.54 (m, 18H), 3.52 (t, J = 5.4 Hz, 5H), 3.31 (s, 1H)m 3.19 (ddt, J = 8.9, 6.7, 4.5 Hz, 2H), 2.92 (dd, J = 12.8, 5.0 Hz, 2H), 2.79 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 2.70 (d, J = 12.7 Hz, 2H), 2.66-2.58 (m, 2H), 2.52-2.48 (m, 2H), 2.21 (t, J = .4 Hz, 4H), 1.65 (dddt, J = 38.7, 24.3, 13.9, 6.8 Hz, 8H), 1.43 (p, J = 7.3 Hz, 4H)；13C NMR（100 MHz, メタノール-d4）δ値（ppm）：176.1, 172.1, 166.1, 154.8, 154.5, 145.3, 136.7, 136.5, 126.1, 71.6, 71.5, 71.5, 71.3, 70.6, 70.4, 63.4, 61.6, 57.0, 51.9, 51.4, 49.9, 45.5, 41.1, 40.4, 38.9, 36.8, 35.7, 35.0, 29.8, 29.5, 27.3, 26.9, 26.3；MALDI-TOFMS(m/z) [M+H]+計算値1377.43, 検出値1377.43、[M+Na]+計算値1399.41, 検出値1399.41、[M+K]+計算値1415.38, 検出値1415.39。
２．ダブルビオチン標識Fabの調製
上記の合成により得られたダブルビオチン標識剤（II）を用いてFabのダブルビオチン標識を行った。Fabは、抗マウスポリクローナル IgG(H+L)、ヤギ、アフィニティー精製Fab断片（Jackson Immuno Research Laboratories, Inc.）を用いた。
上記の合成により得られたダブルビオチン標識剤（II）を用いてFabのダブルビオチン標識を行った。Fabは、抗マウスポリクローナル IgG(H+L)、ヤギ、アフィニティー精製Fab断片（Jackson Immuno Research Laboratories, Inc.）を用いた。
まず、Fab断片のＢＢＳ溶液（26.0 μＭ, 1.3 mg/mL, 28.3 μＬ）に、トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（TCEP）のＢＢＳ溶液（26.1 mM, 21.8 μL）を加えて、３７℃で１．５時間インキュベーションした。限外ろ過後、上記ダブルビオチン標識剤（IIA）のDMF溶液（6 mM, 4.90 μL）とＢＢＳ緩衝液（65.1 μL）を加え、２１℃で２１時間インキュベーションした。限外ろ過後、ダブルビオチン標識されたFabを得た。
なお緩衝液には、ＢＢＳ緩衝液（25 mMホウ酸、25 mM塩化ナトリウム、0.5 mＭエチレンジアミン四酢酸, pH8.0）、ＰＢＳ緩衝液（ＴａＫａＲａ社製「Phosphate Buffer Saline (PBS) Tablets, pH7.4」を1000 mLの超純水に溶解して使用）、或いは、ＴＢＳ－Ｔ緩衝液（TaKaRa社製「Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBS-T) Tablets, pH7.6」を500 mLの超純水に溶解して使用）を用いた。
また限外ろ過は、メルク製アミコンウルトラ―0.5 mL遠心式フィルター（３０００ＭＷＣＯ）を使用して、製品プロトコルに従って行った。
また限外ろ過は、メルク製アミコンウルトラ―0.5 mL遠心式フィルター（３０００ＭＷＣＯ）を使用して、製品プロトコルに従って行った。
ダブルビオチン標識Fabが生成したことを確認するために、ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）を行った。PAGEは１２％分離ゲル及び４％濃縮ゲルを用い、泳動後はバレットCBBステイン ワン（ナカライテスク）を用いてゲルを染色した。SDS-PAGEにおいて、分子量マーカーとしてプレシジョンPlusデュアルエクストラスタンダード（バイオ・ラッドラボラトリーズ）を使用した。ゲルイメージングには、Printgraph CMOS I（ATTO）を使用した。結果を図４に示す。
図４における各レーンは、左側から順に、分子量マーカー、原料Fab、TCEP反応（還元）後のFab、ダブルビオチン標識後のFabを示す。図示するように、原料Fab（約50kDa）に対し、還元反応後には分子量が半分（約25kDa）になっており、S-S結合が切断されて軽鎖と重鎖に分離したことがわかる。さらに、ダブルビオチン標識剤との反応後（最右レーン）では、多くが原料Fabと同じ分子量（約50kDa）にバンドが現れており、軽鎖と重鎖がダブルビオチン標識剤により再架橋されたことが確認できた。最右レーンで検出された二つのバンドの強度比（原料Fabと分子量が同程度のバンド/還元型Fabと分子量が同程度のバンド）から再架橋率を算出したところ、約79％の結果が得られた。すなわち上記反応により高い効率でダブルビオチン標識がなされていることを確認できた。
３．活性試験
ダブルビオチン標識Fabの活性を確認するために、ウェスタンブロッティングを行った。ウェスタンブロッティングにおけるゲルの転写には、トランスブロットTurbo転写パック 0.２ μm PVDFを使用し、トランスブロット Turbo システムにて転写した。転写後のPVDF膜は、バレットブロッキングワン(ウェスタンブロッティング用)（ナカライテスク）に浸し（50 mL/ゲル）、室温で30分間浸透してブロッキングした。ストレプトアビジン結合活性及び抗原結合活性を蛍光検出するため、ストレプトアビジンと抗原（マウスIgG抗体）が予めCy3色素で標識された試薬をそれぞれ用いた。
ダブルビオチン標識Fabの活性を確認するために、ウェスタンブロッティングを行った。ウェスタンブロッティングにおけるゲルの転写には、トランスブロットTurbo転写パック 0.２ μm PVDFを使用し、トランスブロット Turbo システムにて転写した。転写後のPVDF膜は、バレットブロッキングワン(ウェスタンブロッティング用)（ナカライテスク）に浸し（50 mL/ゲル）、室温で30分間浸透してブロッキングした。ストレプトアビジン結合活性及び抗原結合活性を蛍光検出するため、ストレプトアビジンと抗原（マウスIgG抗体）が予めCy3色素で標識された試薬をそれぞれ用いた。
抗原結合活性評価には、蛍光ラベル化抗原としてCyTM3-conjugeted ChromPure Mouse IgG, whole molecule（Jackson Immunoresearch Laboratories,Inc.）を、ストレプトアビジン結合活性評価には、CyTM3-conjugeted Streptavidin（Jackson Immunoresearch Laboratories,Inc.）を用い、これらをＴＢＳ－Ｔ緩衝液で希釈した (10 μL/gel)。この溶液にPVDF膜を浸し、室温で1時間振とうした。反応液を捨てて、ＴＢＳ－Ｔ緩衝液を50 mL加えて5分間振とうした。この洗浄操作を3回繰り返した。得られたゲルは、Typhoon 9400（アマシャム・バイオサイエンス）を用いて蛍光ゲルイメージング（励起波長532 nm、蛍光波長670 nm）を行った。ウェスタンブロッティングの結果を図５に示す。
図５左側の蛍光ゲルイメージは、ストレプトアビジン結合活性試験の結果を示している。最右レーンでのみ蛍光バンドが検出されたことから、ダブルビオチン標識剤が還元後のFabに結合したことで、意図するストレプトアビジン結合活性を発現したことが示された。検出された蛍光バンドのうち、上側のバンド（50kDa付近）は、ダブルビオチン標識Fabのストレプトアビジン結合活性を、下側のバンド（25kDa付近）は、ダブルビオチン標識Fab軽鎖、或いは、ダブルビオチン標識Fab重鎖のストレプトアビジン結合活性を示している。この結果から、本発明のダブルビオチン標識剤で標識されたFabは、ストレプトアビジンに対する結合活性を十分に有することが認められた。
図５右側の蛍光ゲルイメージは、抗原結合活性試験の結果を示している。蛍光バンドは50kDa付近に２つ検出されており、ひとつは原料Fabであり、もうひとつはダブルビオチン標識Fabであった。この結果から、ダブルビオチン標識によって、Fabの抗原結合性は損なわれることなく保たれていることが確認できた。
＜実験例２＞Fabのモノビオチン標識
１．モノビオチン標識剤の合成
１．モノビオチン標識剤の合成
以下の反応式により、モノビオチン標識剤（I）を合成した。
以下、合成手順の詳細を説明する。
文献記載の方法[Bioconjugate Chem. 2006, 17,52-57]に従って得られた化合物（IV）（1.02 g, 2.30 mmol）をメタノール（10 mL）に溶解し、20%水酸化パラジウム-活性炭素（1.25 g）を加えて、水素雰囲気下、室温で6時間撹拌した。セライトろ過後、ろ液を減圧下で濃縮し、残留物（V）（836 mg, Rf 0.10 [5:1(v/v)クロロホルム：メタノール]）を得た。残留物（V）（778 mg）と化合物（VI）（719 mg, 1.59 mmol）をDMF（10 mL）に溶解し、室温で14時間撹拌した。減圧下で溶媒を留去し、得られた残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム：メタノール＝6:1）で精製することにより、化合物（I）（292 mg, 0.39 mmol）を収率24%で得た。Rf 0.30 [4:1(v/v)クロロホルム－メタノール]；1H NMR(400 MHz, メタノール-d4)δ値（ppm）：4.57-4.41 (m, 3H), 4.31 (dd, J = 7.9, 4.4 Hz, 1H), 3.68 (s, 3H), 3.66-3.62 (m, 4H), 3.62-3.46 (m, 8H), 3.41-3.30 (m, 4H), 3.21 (ddd, J = 8.9, 5.9, 4.4 Hz, 1H), 2.93 (dd, J = 12.7, 5.0, 1H), 2.69 (dd, J = 12.7, 5.0 Hz, 1H), 2.60 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.22 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.81-1.53 (m, 4H), 1.51-1.38 (m, 2H)；13C NMR（100 MHz, メタノール-d4）δ値（ppm）：176.1, 166.1, 154.8, 154.5, 136.8, 136.5, 71.6, 71.2, 70.6, 70.4, 63.4, 61.6, 57.0, 45.5, 41.1, 40.5, 40.3, 36.8, 35.6, 34.7, 29.8, 29.5, 26.8, 26.3, 18.4；MALDI-TOFMS(m/z) [M+H]+計算値757.11, 検出値757.11、[M+Na]+計算値779.11, 検出値779.09、[M+K]+計算値795.06, 検出値765.09。
文献記載の方法[Bioconjugate Chem. 2006, 17,52-57]に従って得られた化合物（IV）（1.02 g, 2.30 mmol）をメタノール（10 mL）に溶解し、20%水酸化パラジウム-活性炭素（1.25 g）を加えて、水素雰囲気下、室温で6時間撹拌した。セライトろ過後、ろ液を減圧下で濃縮し、残留物（V）（836 mg, Rf 0.10 [5:1(v/v)クロロホルム：メタノール]）を得た。残留物（V）（778 mg）と化合物（VI）（719 mg, 1.59 mmol）をDMF（10 mL）に溶解し、室温で14時間撹拌した。減圧下で溶媒を留去し、得られた残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム：メタノール＝6:1）で精製することにより、化合物（I）（292 mg, 0.39 mmol）を収率24%で得た。Rf 0.30 [4:1(v/v)クロロホルム－メタノール]；1H NMR(400 MHz, メタノール-d4)δ値（ppm）：4.57-4.41 (m, 3H), 4.31 (dd, J = 7.9, 4.4 Hz, 1H), 3.68 (s, 3H), 3.66-3.62 (m, 4H), 3.62-3.46 (m, 8H), 3.41-3.30 (m, 4H), 3.21 (ddd, J = 8.9, 5.9, 4.4 Hz, 1H), 2.93 (dd, J = 12.7, 5.0, 1H), 2.69 (dd, J = 12.7, 5.0 Hz, 1H), 2.60 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.22 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.81-1.53 (m, 4H), 1.51-1.38 (m, 2H)；13C NMR（100 MHz, メタノール-d4）δ値（ppm）：176.1, 166.1, 154.8, 154.5, 136.8, 136.5, 71.6, 71.2, 70.6, 70.4, 63.4, 61.6, 57.0, 45.5, 41.1, 40.5, 40.3, 36.8, 35.6, 34.7, 29.8, 29.5, 26.8, 26.3, 18.4；MALDI-TOFMS(m/z) [M+H]+計算値757.11, 検出値757.11、[M+Na]+計算値779.11, 検出値779.09、[M+K]+計算値795.06, 検出値765.09。
２．モノビオチン標識Fabの調製
ダブルビオチン標識に用いたFabと同様のFab抗体を用い、実験例１と同様の手法でモノビオチン標識Fabを調製した。モノビオチン標識剤以外の試薬、溶媒、器具、機器類は、特に記載しない限り前述のダブルビオチン標識Fabと同じものを用いた。
ダブルビオチン標識に用いたFabと同様のFab抗体を用い、実験例１と同様の手法でモノビオチン標識Fabを調製した。モノビオチン標識剤以外の試薬、溶媒、器具、機器類は、特に記載しない限り前述のダブルビオチン標識Fabと同じものを用いた。
実験例１と同様に還元したFabのＢＢＳ溶液 （26.0 μＭ, 1.3 mg/mL, 28.3 μＬ）にTCEP（26.1 mM, 21.8 μL）を加えて、３７℃で１．５時間インキュベーションした。限外ろ過後、上記モノビオチン標識剤（I）のDMF溶液（15 mM, 3.43 μL）とＢＢＳ緩衝液（66.6 μL）を加え、２１℃で１８時間インキュベーションした。限外ろ過後、モノビオチン標識されたFabを得た。
モノビオチン標識Fabの生成と抗原結合活性を確認するために、ダブルビオチン標識Fabと同様の条件でSDS-PAGEを行った。結果を図６に示す。
図６における４つのレーンは、左側から順に、分子量マーカー、原料Fab、TCEP反応（還元）後のFab、モノビオチン標識後のFabを示す。最右レーンでは、原料Fab（約50kDa）と同じ位置にバンドが認められたことから、モノビオチン標識Fabが生成したことが示された。再架橋率は約78％と算出された。すなわち上記反応により、ダブルビオチン標識と同様に、高い効率でモノビオチン標識がなされていることを確認できた。
３．活性試験
モノビオチン標識Fabの活性を確認するために、ダブルビオチン標識Fabと同様の条件でウェスタンブロッティングを行った。結果を図７に示す。
モノビオチン標識Fabの活性を確認するために、ダブルビオチン標識Fabと同様の条件でウェスタンブロッティングを行った。結果を図７に示す。
図７左側の蛍光ゲルイメージは、ストレプトアビジン結合活性試験の結果を示している。最右レーンでのみ蛍光バンドが検出されたことから、モノビオチン標識剤が還元後のFabに結合したことで、意図するストレプトアビジン結合活性を発現したことが示された。ダブルビオチン標識した場合と同様に、検出された蛍光バンドのうち、上側のバンド（50kDa付近）は、モノビオチン標識Fabのストレプトアビジン結合活性を、下側のバンド（25kDa付近）は、モノビオチン標識Fab軽鎖、或いは、モノビオチン標識Fab重鎖のストレプトアビジン結合活性を示している。この結果から、本発明のモノビオチン標識剤で標識されたFabは、ストレプトアビジンに対する結合活性を十分に有することが認められた。
図７右側の蛍光ゲルイメージは、抗原結合活性試験の結果を示している。蛍光バンドは50kDa付近に２つ検出されており、ひとつは原料Fabであり、もうひとつはモノビオチン標識Fabであった。この結果から、ダブルビオチン標識と同様に、モノビオチン標識によっても、Fabの抗原結合性は損なわれることなく保たれていることが確認できた。
＜実験例３＞VHH抗体のモノビオチン標識
実験例２で合成したモノビオチン標識剤（I）を用いて、VHH抗体のモノビオチン標識を行い、結合活性の確認と評価を行った。
実験例２で合成したモノビオチン標識剤（I）を用いて、VHH抗体のモノビオチン標識を行い、結合活性の確認と評価を行った。
１．モノビオチン標識VHHの調製とストレプトアビジン結合活性の確認
VHH抗体は、ラクダ科動物由来の重鎖抗体における抗原結合ドメインを取り出したもので、分子量が小さい（15ｋDa）、熱に対する安定性が高い、大腸菌や酵母を利用した組み換え産生が可能である、タンパク質工学におけるハンドリング性がよい等の利点から、従来型の抗体の代替として期待される材料である。VHH抗体は、図８に示すように、分子内にジスルフィド結合を有し、本実験ではこのジスルフィド結合をターゲットとして、モノビオチン標識を行った。
VHH抗体は、ラクダ科動物由来の重鎖抗体における抗原結合ドメインを取り出したもので、分子量が小さい（15ｋDa）、熱に対する安定性が高い、大腸菌や酵母を利用した組み換え産生が可能である、タンパク質工学におけるハンドリング性がよい等の利点から、従来型の抗体の代替として期待される材料である。VHH抗体は、図８に示すように、分子内にジスルフィド結合を有し、本実験ではこのジスルフィド結合をターゲットとして、モノビオチン標識を行った。
VHH抗体は、文献記載の情報[Behar et al., Protein Eng. Des. Sel., 2008, 21, 1-10]に基づいてプロテイン・エクスプレスによって生産されたもの(anti-FcγRIII VHH抗体, C21)を使用した。VHH抗体以外の試薬、溶媒、器具、機器類は、特に記載しない限り前述のダブルビオチン標識Fabと同じものを用いた。
VHH 抗体のＰＢＳ溶液 (147 μM, 2.2 mg/mL, 8.4 μL)にTCEPのＢＢＳ溶液 (15.0 mM, 8.2 μL)とＢＢＳ緩衝液(33.5 μL)を加えて、３７℃で１．５時間インキュベーションした。限外ろ過後、モノビオチン標識剤（I）のDMF溶液（10 mM, 5.0 μL）とＢＢＳ緩衝液（65.0 μL）を加え、２１℃で２１時間インキュベーションした。限外ろ過後、モノビオチン標識されたVHH抗体を得た。
VHH抗体の還元反応とモノビオチン標識の各工程をSDS-PAGE（15％分離ゲル、４％濃縮ゲル）で分析した。また、ウェスタンブロッティングを行い、Cy3標識ストレプトアビジンを用いて、ビオチン構造が含まれるバンドを蛍光検出した。SDS-PAGEとウェスタンブロッティングの結果を図９に示す。
図９の左はSDS-PAGE、右はウェスタンブロッティングの結果である。両図とも、４つのレーンは、左から順に、分子量マーカー、原料VHH、還元型VHH、モノビオチン標識VHHを示す。SDS-PAGEの結果では、いずれのVHHも分子量差は小さく、バンドの位置に顕著な差はみられない。しかし、図９の右に示すウェスタンブロッティングの結果から、最右レーンに蛍光バンドが検出されており、ストレプトアビジンとの結合活性を示すことから、モノビオチン標識VHHの生成が認められた。
２．モノビオチン標識VHHの抗原結合活性評価
上記モノビオチン標識VHHの抗原結合活性を定量的に評価するために、SPR法による相互作用解析実験を行った。測定装置はBiacore X100（GEヘルスケアライフサイエンス）を使用した。まず、ストレプトアビジンが予め固定されたSensor Chip SA （Cytiva）に上記モノビオチン標識VHH溶液を流し、基板上にモノビオチン標識VHH抗体を固定化した。結果を図１０に示す。
上記モノビオチン標識VHHの抗原結合活性を定量的に評価するために、SPR法による相互作用解析実験を行った。測定装置はBiacore X100（GEヘルスケアライフサイエンス）を使用した。まず、ストレプトアビジンが予め固定されたSensor Chip SA （Cytiva）に上記モノビオチン標識VHH溶液を流し、基板上にモノビオチン標識VHH抗体を固定化した。結果を図１０に示す。
図１０に示すグラフおいて、縦軸はチップへの固定化量（RU）を示し、横軸は時間（流動実験開始からの経過時間）を示す。また黒丸は、濃度の異なるVHH混合体を投入した時点を示しており、時間間隔をおいて、9.2 ng/ml、92 ng/ml、0.92 μg/mlのVHH混合体を投入した。なおVHH混合体の濃度は、280 nmのUV吸光度から換算して求めた値である。0.92 μg/mlのVHH混合体を流した直後から固定化量が急峻に上昇（約700RU向上し）したことから、基板上のストレプトアビジンにモノビオチン標識VHHが固定化できたことが示された。
SAチップにモノビオチン標識VHHを結合した後、抗原（CD16）濃度を次第に高めながら流動し、表面プラズモン共鳴により抗原とVHHとの結合親和性を計測した。結果を図１１に示す。
図１１に示すセンサーグラムの縦軸はレスポンス（RU）、横軸は時間（s）である。センサーグラムから抗原の結合量は濃度依存的に増加することが確認された。またセンサーグラムから解離定数（KD値）を算出したところ、KD値は1.1×10-7 Mであった。このことからVHHのジスルフィド部位にビオチン標識しても抗原結合活性が維持されることが確認できた。
＜実験例４＞モノビオチン標識剤とダブルビオチン標識剤の結合活性比較
SPR法により、抗原との結合性及びストレプトアビジンとの結合性を評価した。
まずリガンドとしてFab抗体の抗原を固定しセンサーチップCM５（BiacoreTH）を用い、アナライトとして、原料Fab、モノビオチン標識Fab、及びダブルビオチン標識Fabをそれぞれ流し、表面プラズモンにより解離定数を測定した。その結果を図１２（原料Fab）、図１３（モノビオチン標識Fab）及び図１４（ダブルビオチン標識Fab）に示す。図１２～図１４において、Fab濃度依存的なセンサーグラムの変化が確認された。センサーグラムからKD値を算出したところ、原料FabのKD値は7.0×10-9 Mであるのに対し、モノビオチン標識FabのKD値は9.9×10-9 M、ダブルビオチン標識FabのKD値は1.1×10-8 Mで、活性はほぼ保たれていることが確認できた。
また、センサーチップ上の固定化抗原に結合したモノビオチン標識Fab、及び、ダブルビオチン標識Fabに対して、四量体ストレプトアビジンを流し、ストレプトアビジンとの結合活性を測定した。その結果を図１５（モノビオチン標識Fab）及び図１６（ダブルビオチン標識Fab）に示す。図１５及び図１６において、ストレプトアビジン濃度依存的なセンサーグラムの変化が確認された。センサーグラムからKD値を算出したところ、モノビオチン標識FabのKD値は4.4×10-13 M、ダブルビオチン標識FabのKD値は4.4×10-14 Mであった。即ち、ダブルビオチン標識Fabは、モノビオチン標識Fabよりも１０倍強くストレプトアビジンと結合することが確認された。
実験例１～４から、本発明のビオチン標識剤によりタンパクのジスルフィド部位にビオチン標識できること、チオールが再架橋されるのでタンパクの構造が安定し、活性が維持されること、また分子内にビオチン構造を２つ組み込むことにより、ストレプトアジピンに対する結合性が１０倍強くなることが確認された。
Claims (10)
- 一端にビオチン構造（式（１））を有し、他端にジブロモ―ピリダジンジオン基（式（２））を有するビオチン標識剤。
式（１）
- ３つの末端を有する分枝構造を持ち、３つの末端のうち、二端にビオチン構造（式（１））を有し、他の一端にジブロモ―ピリダジンジオン基（式（２））を有するビオチン標識剤。
式（１）
- 請求項１に記載のビオチン標識剤であって、
前記ビオチン構造と前記ジブロモ―ピリダジンジオン基とは、連結鎖Aで連結されており、連結鎖Aは、要素として、C１～５のアルキレン、繰り返し単位数が１～２０のポリエチレングリコール（(-CH2CH2O-)１～２０）、あるいは、その組み合わせを含み、要素の数が１～６のいずれかである、ことを特徴とするビオチン標識剤。 - 請求項２に記載のビオチン標識剤であって、
一端の前記ビオチン構造と一端の前記ジブロモ―ピリダジンジオン基とは、連結鎖Aで連結されており、連結鎖Aは、要素として、C１～５のアルキレン、繰り返し単位数が１～２０のポリエチレングリコール（(-CH2CH2O-)１～２０）、あるいは、その組み合わせを含み、要素の数が１～６のいずれかである、ことを特徴とするビオチン標識剤。 - 請求項３又は４に記載のビオチン標識剤であって、
前記連結鎖Aは、要素の数が２～６のとき、各要素は直接結合されているか、アミド結合、トリアゾール基、第２級アミンのいずれかを介して連結されていることを特徴とするビオチン標識剤。 - 請求項４に記載のビオチン標識剤であって、
前記連結鎖Aは第２級アミンを含み、当該第２級アミンに結合した水素原子が、連結鎖Bの一端と置換されており、該連結鎖Bの他端は、該連結鎖Aとは連結されていない一端のビオチン構造と連結されており、
連結鎖Bは、要素として、C１～５のアルキレン、繰り返し単位数が１～２０のポリエチレングリコール、あるいは、その組み合わせを含み、要素の数は１～３のいずれかであることを特徴とするビオチン標識剤。 - 請求項６に記載のビオチン標識剤であって、
前記連結鎖Bは、要素の数が２又は３のとき、各要素が直接結合されているか、アミド結合、トリアゾール基、第２級アミンのいずれかを介して連結されていることを特徴とするビオチン標識剤。 - 請求項１又は請求項２に記載のビオチン標識剤によりビオチン標識されたタンパク質。
- タンパク質が、IgA、IgE、IgG、IgM、ScFv-Fc、(Fab’)2、低分子抗体（Minibody）、Fab、二重特異性抗体（Diabody）、単鎖可変領域フラグメント（scFv）、及びVHHから選択される抗体または抗体フラグメントのいずれかであることを特徴とするビオチン標識されたタンパク質。
- 請求項１又は請求項２に記載のビオチン標識剤を含む免疫検査試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022107195A JP2024006375A (ja) | 2022-07-01 | 2022-07-01 | ビオチン標識剤、ビオチン標識されたタンパク質及びビオチン標識剤を含む免疫検査試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022107195A JP2024006375A (ja) | 2022-07-01 | 2022-07-01 | ビオチン標識剤、ビオチン標識されたタンパク質及びビオチン標識剤を含む免疫検査試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2024006375A true JP2024006375A (ja) | 2024-01-17 |
Family
ID=89540714
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022107195A Pending JP2024006375A (ja) | 2022-07-01 | 2022-07-01 | ビオチン標識剤、ビオチン標識されたタンパク質及びビオチン標識剤を含む免疫検査試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2024006375A (ja) |
-
2022
- 2022-07-01 JP JP2022107195A patent/JP2024006375A/ja active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6876002B2 (ja) | 機能的要素を共有結合により係留させるための細胞透過性、細胞適合性、かつ開裂可能であるリンカー | |
| EP1813948A1 (en) | Method of detecting target substances | |
| JP2011525187A (ja) | 多リガンド捕捉剤ならびに関連組成物、方法および系 | |
| US20100203653A1 (en) | Protein G-Oligonucleotide Conjugate | |
| US20110098197A1 (en) | Method for Specific Covalent Coupling of Antibody Using a Photoactivable Protein G Variant | |
| US20210178290A1 (en) | Systems and method for detection of analytes in high volumetric flow applications | |
| JPWO2002046395A1 (ja) | Ｃ末端修飾タンパク質およびその製造方法、ならびに、ｃ末端修飾タンパク質の製造に用いる修飾剤および翻訳テンプレート、ならびに、ｃ末端修飾タンパク質を用いたタンパク質相互作用の検出方法 | |
| US20100075314A1 (en) | Chemically-modified gold nanoparticles and methods for use in detecting target molecules | |
| Watanabe et al. | Conjugation of quantum dots and JT95 IgM monoclonal antibody for thyroid carcinoma without abolishing the specificity and activity of the antibody | |
| US11236386B2 (en) | Method for labeling of aldehyde containing target molecules | |
| JP2024006375A (ja) | ビオチン標識剤、ビオチン標識されたタンパク質及びビオチン標識剤を含む免疫検査試薬 | |
| Wang et al. | Resolving antibody–peptide complexes with different ligand stoichiometries reveals a marked affinity enhancement through multivalency | |
| JPH11503521A (ja) | 生物体液中のバンコマイシンの検出および定量化用試薬および方法 | |
| EP3981772A1 (en) | Tetra-functional chemical probe and method for identifying target membrane protein from living cell or living tissue by using said probe | |
| JP2007225586A (ja) | タンパク質の固定化方法 | |
| KR101317321B1 (ko) | 혈청 아밀로이드 ｐ 요소 단백질의 분자각인 칩 | |
| JPS63246382A (ja) | ビオチニル試薬及びそれを用いるビオチニル化法 | |
| JPH01501915A (ja) | 酵素制御放出系及び有機複合反応体 | |
| JPWO2007018315A1 (ja) | タンパク質と他の分子との相互作用を検出するためのタンパク質プローブ | |
| WO2024038918A1 (ja) | 一本鎖抗体結合アプタマー | |
| FI60216C (fi) | Biologiskt aktivt vid affinitetsreaktioner anvaendbart adsorptionsmedel | |
| JP2023554517A (ja) | 試料中の目的の分析物を検出するための方法 | |
| EP4296672A1 (en) | Labeled polypeptide, modified polypeptide, production method for these polypeptides, reagent containing these polypeptides, and measurement method for target substance | |
| WO2022224968A1 (ja) | ポリスルフィド標識用アルキル化剤及びそれを用いたポリスルフィドの標識方法 | |
| KR101946488B1 (ko) | 링커 화합물 및 이의 제조방법 |