KR20210126135A

KR20210126135A - 신규한 비오틴-특이적 단일클론 항체 및 그 용도

Info

Publication number: KR20210126135A
Application number: KR1020217031791A
Authority: KR
Inventors: 미하엘 게르크; 클라우스 히르첼; 카롤리네 도로테아 호이어; 에라스무스 후버; 한스-페터 요젤; 토마스 마이어; 미하엘 슈레믈; 프로프 레오폴트 폰
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2016-12-27
Filing date: 2017-12-19
Publication date: 2021-10-19
Also published as: KR102448441B1; KR20190092553A; JP6901562B2; EP3562841A1; JP2020503283A; CN110088130A; US20220107309A1; BR112019010915A2; WO2018122043A1; US20190324024A1

Abstract

본 발명은 비오틴에 결합할 수 있는 단일클론 항체에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 발명에 따른 단일클론 항체는 또한 비오틴 모이어티가 비오틴의 발레르산 모이어티의 카르복실 관능기의 탄소 원자를 통해 분자에 부착되어 있는 비오틴화 분자 상의 비오틴 모이어티에 결합하지 않는다. 또한, 본원에 개시되어 있는 바와 같은 항체의 생성 방법이 개시되어 있다. 본 발명에 따른 단일클론 항체는 (스트렙트)아비딘/비오틴 쌍을 사용하여 비오틴화 분석물 특이적 결합제를 (스트렙트)아비딘 코팅된 고체 상에 결합시키는 샘플 중 분석물 측정 방법에서 특정 용도를 갖는다.

Description

신규한 비오틴-특이적 단일클론 항체 및 그 용도{NOVEL BIOTIN-SPECIFIC MONOCLONAL ANTIBODY AND USE THEREOF}

살아있는 생물뿐만 아니라 인 비트로 생화학에서, 비오틴의 주요 기능은 카르복시트랜스페라아제 활성을 갖는 효소, 예를 들어 피루베이트 카르복실라제 및 아세틸-CoA-카르복실라제에 대한 보결분자단으로 필요한 보조-기질의 기능이다. 박테리아에서, 비오틴은 비오틴 단백질 리가아제에 의해 비오틴 카르복실 담체 단백질에 부착된다. 또한, 비오틴이 관심의 대상인 거의 모든 분자 상의 적합한 기에 공유 부착될 수 있는 다수의 화학적 방법이 공지되어 있다. 통상적인 특징으로서, 발레르산 측쇄의 카르복실 관능기의 탄소 원자는 커플링 반응에서 관심 분자 상의 적절한 (수용) 기 또는 링커의 반응기에 반응하며, 여기서 링커 그 자체는 관심 분자에 이미 연결되어 있거나, 링커는 비오틴이 링커에 부착되면 분자에 커플링된다. 일반적으로, 발레르산 측쇄의 카르복실 관능기의 탄소 원자를 통해 다양한 화학적 부위에 비오틴을 부착시키는 것을 비오틴화라고 지칭한다.

비오틴에 대한 아비딘 및/또는 스트렙타비딘 (=(스트렙트)아비딘) 각각의 특별한 친화도 (K_a = 10¹⁵ M^-1) 는 단백질과 리간드의 가장 강력한 공지된 비-공유 상호 작용 중 하나이다. 이는 복합 혼합물 중 비오틴화 분자가 (스트렙트)아비딘에 특이적으로 결합되게 한다. 이러한 이유로, 아비딘 및/또는 스트렙타비딘은 많은 면역 검출 어세이에서 사용된다.

(스트렙트)아비딘에 대한 강한 친화도 이외에, 두 가지 추가 특성이 단백질 및 기타 마크로분자 태깅에 비오틴을 특히 적합하게 한다. 첫째로, 비오틴 분자는 실질적으로 단백질보다 작다. 이의 분자 크기는 이러한 분자의 생물학적 기능의 손실을 최소화하면서 하나 이상의 비오틴 분자가 관심 분자에 컨쥬게이트되게 한다. 둘째로, 비오틴의 발레르산 측쇄의 말단 탄소 원자는 쉽게 유도체화될 수 있으므로, 관심 분자, 특히 단백질 상의 반응성 모이어티에의 컨쥬게이션을 용이하게 한다. 특히 비오틴화는 비오틴의 헤테로시클릭 모이어티의 구조를 바꾸지 않는다.

발레르산 측쇄의 말단 탄소 원자를 통한 비오틴화 후, 비오틴 모이어티는 (스트렙트)아비딘과 특이적으로 상호 작용하는 능력을 유지하는데, 테트라하이드로티오펜 고리와 융합된 우레이도 고리로 표시되는 헤테로시클릭 구조인 아비딘-유형 단백질의 결합 포켓과의 특이적 상호 작용에 책임이 있는 비오틴 분자의 모이어티가 영향을 받지 않기 때문이다.

비오틴의 헤테로시클릭 구조는 또한 비오틴에 대한 선행 기술의 단일클론 항체 (mAbs) 에 의해 표적화된다. Kohen F. 등 (Methods in Enzymology 279 (1997) 451-463) 은 면역원 비오틴화 소 혈청 알부민 (N-하이드록시석신이미도비오틴으로 컨쥬게이트된 BSA) 으로서 사용하는 단일클론 항체를 생성하였다. 이 문헌은 비오틴화 단백질의 비오틴 모이어티에 결합할 수 있는 항체의 항원 결합 영역의 아미노산 서열 분석을 보고한다. 서열 정렬은 비오틴의 바이시클릭 고리 시스템과 상호 작용하는 것으로 보고되었던 아비딘 및 스트렙타비딘의 폴리펩티드 서열의 상동성 스트레치로 수행되었다. 특히, 아비딘 및 스트렙타비딘의 폴리펩티드 서열과의 유사성이 비오틴-특이적 항체의 CDR2 및 CDR3 에서 식별되었다. 결과는 비오틴 결합 포켓의 아미노산 서열에서 공통 패턴이 비오틴 결합에 필요하다는 것으로 해석되었다.

Dakshinamurti, K 등 (Biochem. J. 237 (1986) 477-482) 은 활성화된 형태의 비오틴 (N-하이드록시석신이미도비오틴) 가 커플링되는 면역원 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 으로서 사용하는 쥐 mAbs 의 생성 및 특징 분석을 보고하였다. 여러 하이브리도마 클론을 수득하였고, 각각의 mAbs 는 유리 비오틴, 합텐-컨쥬게이트된 비오틴, 단백질-컨쥬게이트된 비오틴, 및 비오시틴 결합에 유효하였다. 특히, 비오시틴은 비오틴, 발레르산 카르복실 관능기로부터 형성된 아미드 및 아미노산 L-리신의 자연 발생 유도체이다. 이러한 유도체화 비오틴이 Dakshinamurti, K 등 (상기) 의 mAbs 에 의해 결합된다는 사실은 비오틴의 헤테로시클릭 구조, 즉 테트라하이드로티오펜 고리와 융합된 우레이도 고리를 표적으로 하는 결합 특이성을 나타낸다.

Dakshinamurti, K 등 (상기) 에 의해 보고된 mAbs 는 컨쥬게이트된 비오틴 및 또한 유리 비오틴에 결합하지만, JP 2008-094721 은 단백질-컨쥬게이트된 비오틴에 특이적으로 결합하나, 유리 비오틴에는 결합하지 않는 mAb 를 개시하고 있다. 표 1 은 선행 기술 항체의 논의된 특성을 요약한다.

Dakshinamurti, K 등 (상기) 의 보고와 유사하게, WO 00/50088 A2 는 치료적 개입에 유용한 항체를 다루고 있다; 구체적으로는, 여기에 유리 비오틴에 대한 각각의 친화도보다 1 내지 4 배 정도 높은 컨쥬게이트된 비오틴에 대한 친화도를 갖는 항체가 보고되었다. 문헌은 비오틴이 발레르산 모이어티의 카르복실 관능기의 탄소 원자를 통해 컨쥬게이트되는 항원에 의한 면역화를 개시하고 있다. 첫 번째 스크리닝 단계에서, 컨쥬게이트된 비오틴에 결합된 항체가 식별된다; 소정량의 유리 비오틴의 존재 하에서도 컨쥬게이트된 비오틴에 결합할 수 있는 단일클론 항체를 분비하는 클론을 식별하는 것을 목표로 하는 후속 두 번째 스크리닝 단계가 개시된다. 특히, 문헌은 한편으로는 유리 비오틴 (또 다른 분자에 공유 결합되지 않고 수용액에서 해리된 형태인 비오틴) 에 결합하지만 다른 한편으로는 비오틴화 분자 상의 비오틴 모이어티, 즉 또한 (스트렙트)아비딘에 의해 결합될 수 있는 비오틴 모이어티에 결합하지 않는 단일클론 항체에 관해서는 침묵하고 있다.

Indyk H.E. 등은 International Dairy Journal 35 (2014) 25-31 에서 우유에서 유리 비오틴을 검출하기 위한 광학 바이오센서 어세이를 보고한다. CM5 센서 칩을 갖는 Biacore Q 바이오센서를 사용하였다; 아민-개질된 센서 표면에 비오틴을 이의 NHS-활성화된 발레르산 말단 카르복실레이트 기의 공유 커플링에 의해 고정시켰다. 특히, 센서 칩에 커플링된 비오틴 분자의 배향은 비오틴화 분자 상의 비오틴과 동일하였으며, 즉 (스트렙트)아비딘에 의해 또한 결합될 수 있는 비오틴 모이어티에 상응한다. 따라서, 주로 비오틴의 헤테로시클릭 구조가 항체 결합에 노출되었다. 세 가지 상이한 비오틴-특이적 다클론 항체 및 두 가지 상이한 단일클론 항체의 결합 특성은 경쟁자로서 상이한 농도의 유리 비오틴의 존재 하에 비오틴 센서 칩을 사용하여 특징 분석되었다.

특히, 유리 비오틴에 특이적으로 결합하지만, 비오틴화 표적 분자 상에 컨쥬게이트된 비오틴에는 결합하지 않는 단일클론 항체를 기술하는 개시가 선행 기술에서 지금까지 발견되지 않았다. 이러한 항체는 주로 비오틴의 "꼬리" 로부터 결합할 것이며, 즉 비오틴의 발레르산 모이어티와 중요하게 상호 작용할 것이다. 특히, 한편으로는 유리 비오틴에 특이적으로 결합하지만, 다른 한편으로는 컨쥬게이트된 비오틴에는 결합하지 않으며, 컨쥬게이트된 비오틴은 발레르산 모이어티의 카르복실 관능기의 탄소 원자를 통해 표적 분자에 부착되어, 비오틴의 헤테로시클릭 "머리" 구조가 표적 분자로부터 말단에 위치하는 항체는 지금까지 기술되지 않았다. 또한, 수용액에서 단일클론 항체의 유리 비오틴에 대한 친화도 K_s[유리] 가 동일한 단일클론 항체의 컨쥬게이트된 비오틴에 대한 친화도 K_s[conj.] 보다 높고, 컨쥬게이트된 비오틴은 발레르산 모이어티의 카르복실 관능기의 탄소 원자를 를 통해 컨쥬게이트되고 (상기 참조), K_s[유리] 는 K_s[conj.] 와 적어도 50, 100, 500, 1,000, 5,000, 10,000, 50,000, 또는 적어도 100,000 배 상이한 것을 특징으로 하는 단일클론 항체는 지금까지 알려지지 않았다.

Johnson L.C. 는 ("The synthesis of new biotin derivatives and their bioactivity", Master of Science thesis dated December 2002, submitted to the Graduate Faculty of the Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College (US) retrieved from the internet on Feb. 16, 2017; URL:http://etd.lsu.edu/docs/available/etd-0927102-135929/unrestricted/Johnson_thesis.pdf) 에서 비오틴의 헤테로시클릭 "머리" 구조의 유도체화의 화학 반응을 기재하고 있다. 비오틴의 헤테로시클릭 구조에 포함된 1'-N 원자가 유도체화에 의해 표적화되는 구현예가 개시되어 있다.

Wu F.-B. 등은 Clinica Chimica Acta 308 (2001) 117-126 에서 경쟁적 면역 어세이에서 매트릭스 간섭에 대응하는 방법을 개시하고 있다. 표적 (혈청 티록신) 특이적 항체에 결합된 고정된 제 2 항체로 이루어진 초기 어세이 설정을 대체하였다. 대체는 먼저 비오틴화 소 혈청 알부민 (BSA) 을 고정시킨 후, 스트렙타비딘을 비오틴화 BSA 에 결합시킨 후, 사전에 비오틴화시킨 표적-특이적 항체를 스트렙타비딘에 결합시키는 것으로 제공되었다. 이러한 설정은 어세이의 표적 (혈청 티록신) 에 대한 증가된 결합 능력 및 그에 따라 증가된 매트릭스 내간섭성을 제공하는 것으로 밝혀졌다.

본 발명은 각 구조의 원위 (가장 말단) 부분으로서 유도체화된 비오틴의 발레르산 "꼬리" 모이어티를 특이적으로 나타내는 화학식 I 의 화학 구조 (하기 참조) 를 제공한다. 비오틴을 유도체화하고 그 "머리" 모이어티를 화학식 I 의 구조의 나머지에 부착시킴으로써, 발레르산 모이어티는 주로 면역 세포 수용체 및 항체와의 상호 작용을 포함하는 물리적 상호 작용에 노출되고 제시된다. 화학식 I 에 따른 유도체화된 비오틴과 상호 작용하는 항체가 발레르산 "꼬리" 모이어티를 표적화할 수 있는 결합 특성을 갖는다는 가설을 세웠다. 본 연구에서, 화학식 I 의 구조를 사용하여 도출될 수 있고, 이러한 구조와 반응할 수 있는 단일클론 항체가 본 발명에 따른 원하는 항체의 특성을 갖는지 여부를 추가로 시험하였다.

따라서, 본 발명의 원하는 항체는 또 다른 분자에 공유 결합되어 있지 않은 비오틴에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체이다. 또한, 상기 추론에 따라, 본 발명의 원하는 항체는 수용액에서 해리된 형태인 비오틴에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체이다. 이때, 본 발명의 원하는 항체는 비오틴화 표적 분자 상에 컨쥬게이트된 비오틴에 결합하지 않으며, 비오틴은 발레르산 모이어티의 카르복시 기를 통해 표적 분자에 부착된다. 이러한 비오틴화 표적 분자에서, 비오틴의 "머리" 구조의 컨쥬게이트된 형태가 존재하며, 예를 들어 (스트렙트)아비딘에 의해 결합될 수 있다.

따라서, 본 발명자들은 유리 비오틴에 특이적으로 결합하기 위한 항체가 생산되고 단리될 수 있는지 여부를 밝혀냈다. 이러한 비오틴에 대한 결합은 비오틴의 "머리" 부분에 결합하는 이미 이전에 보고된 항체와 비교하여 완전히 상이한 구조적 기반을 가질 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은 하기 화학식 I 의 화합물에 특이적으로 결합하고, 또한 비오틴에 결합하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체를 제공하는 것이었다:

식 중, Y 는 CH₂ 또는 C=O 이고, X 는 O 또는 (CH₂)_n 이고, n 은 1 내지 20 의 정수이고, R 은 H, 또는 Z-L 이며, 이때 L 은 링커이고, Z 는 비오틴 모이어티를 함유하지 않는 합텐 및 폴리펩티드로부터 선택된다.

다른 목적은 화학식 I 의 분자 및 비오틴에 결합하지만, 발레르산 모이어티의 카르복실 관능기의 탄소 원자를 통해 마크로분자에 부착되어 있는 컨쥬게이트된 비오틴에는 결합하지 않는 단일클론 항체를 제공하는 것이었다. 또 다른 목적으로서, 본 발명의 항체는 화학적으로 개질되지 않은 발레르산 모이어티을 포함하는 비오틴에 결합한다. 따라서, 비오틴화 표적 분자 상에 컨쥬게이트된 비오틴에 대한 친화도가 유리 비오틴에 대한 친화도보다 적어도 50, 100, 500, 1,000, 5,000, 10,000, 이상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 배수로 낮은 단일클론 항체를 단리하는 것이 목적이다. 즉, 유리 비오틴에 대한 친화도가 비오틴화 표적 분자 상에 컨쥬게이트된 비오틴에 대한 친화도보다 적어도 50, 100, 500, 1,000, 5,000, 및 적어도 10,000 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 배수로 높은 단일클론 항체를 단리하는 것이었다.

놀랍게도 이러한 단일클론 항체가 생성되고 단리될 수 있다는 것이 밝혀졌다.

최근, 고용량 비오틴 보충제가 "유행" 이되었다. 비오틴은 각질의 주요 원인으로 여겨지며, 고용량 비오틴은 모발, 손톱 및 피부의 품질과 양을 개선할 수 있다. 비오틴은 수용성이며 빠르게 배설된다. 그러나, 고용량 비오틴 보충제를 섭취하면, 순환계에 다소 높은 수준의 비오틴이 존재할 수 있으며, 순환계 내 비오틴은 분석물의 측정을 위해 인 비트로 분석에 사용되는 샘플, 즉 혈청 또는 혈장과 같은 샘플에 존재할 것이다. 샘플에 포함된 비오틴은 높은 수준으로 존재할 경우, (스트렙트)아비딘 코팅된 고체 상 및 비오틴화 특이적 결합제를 사용하는 분석물의 측정을 위한 어세이에서 간섭을 일으킬 수 있다.

따라서, 고용량 비오틴 보충제의 사용이 증가함에 따라, (스트렙트)아비딘-비오틴 결합 쌍을 기반으로 하는 어세이에서 동일한 샘플로부터의 분석물의 측정으로 샘플 중 비정상적으로 높은 수준의 비오틴에 의한 잠재적인 간섭을 감소시킬 필요가 증가하고 있다.

본원에 개시된 바와 같은 항체가 비오틴의 잠재적인 간섭을 감소시키는데 사용될 수 있는지 여부를 조사하는 것이 추가 과제였다. 놀랍게도, 비오틴에 결합할 수 있지만 비오틴화 표적 분자 상의 비오틴 모이어티에는 결합하지 않는 단일클론 항체가 샘플 중 비정상적으로 높은 수준의 비오틴에 의해 야기되는, 잠재적인 간섭을 이러한 샘플 중 분석물 측정 방법에서 (스트렙트)아비딘/비오틴 쌍을 사용하여 비오틴화 분석물 특이적 결합제를 (스트렙트)아비딘 코팅된 고체 상에 결합시키는 어세이에서, 대응하는데 특히 유용한 것으로 밝혀졌다.

발명의 개요

하기 화학식 I 의 화합물에 특이적으로 결합하고, 또한 비오틴에 결합하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체가 본원에 보고된다:

또한, (스트렙트)아비딘/비오틴 결합 쌍을 사용하여 비오틴화 분석물 특이적 결합제를 (스트렙트)아비딘 코팅된 고체 상에 결합시키는 샘플 중 분석물 측정 방법으로서, 샘플에 (a) 본원에 보고된 바와 같은 항체, (b) 비오틴화 분석물 특이적 결합제, (c) 스트렙타비딘 코팅된 고체 상을 첨가한 다음, (스트렙트)아비딘 및 비오틴화 분석물 특이적 결합제를 통해 고체 상에 결합된 분석물을 측정하는 것을 포함하는 방법이 보고된다.

또한, (스트렙트)아비딘/비오틴 결합 쌍을 사용하여 비오틴화 분석물 특이적 결합제를 표지에 결합시키는 샘플 중 분석물 측정 방법으로서, 샘플에 (a) 본원에 보고된 바와 같은 항체, (b) 비오틴화 분석물 특이적 결합제, (c) 표지에 결합된 (스트렙트)아비딘을 첨가한 다음, 분석물, 비오틴화 분석물 특이적 결합제 및 표지된 스트렙타비딘를 포함하는 복합체를 분리하고, 분석물에 결합된 표지의 양을 결정하는 것을 포함하는 방법이 보고된다.

또한, (스트렙트)아비딘/비오틴 쌍을 사용하여 비오틴화 분석물 특이적 결합제를 (스트렙트)아비딘 코팅된 고체 상 또는 표지된 (스트렙트)아비딘에 결합시키는 샘플 중 분석물 측정 방법에서의, 본원에 보고된 바와 같은 항체의 용도가 보고된다.

또한, 적어도 (a) 본원에 개시된 바와 같은 항체, (b) 비오틴화 분석물 특이적 결합제, 및 (c) (스트렙트)아비딘 코팅된 고체 상을 포함하는 면역 어세이 시험 키트가 보고된다.

또한, 하기 화학식 I 에 따른 면역원이 보고된다:

식 중, Y 는 CH₂ 또는 C=O 이고, X 는 O 또는 (CH₂)_n 이고, n 은 1 내지 20 의 정수이고, R 은 Z-L 이며, 이때 L 은 링커이고, Z 는 적어도 30 개의 아미노산의 폴리펩티드, 바람직하게는 키홀 림펫 헤모시아닌이다.

또한, (a) 실험 동물을 본원에 개시된 바와 같은 면역원으로 면역시켜, B-세포를 유도하여 면역원에 결합하는 항체를 생산하는 단계, (b) 하이브리도마 기술 또는 B-세포 PCR 기술을 통해, 단계 (a) 의 B-세포에 의해 생산된 면역원에 결합하는 단일클론 항체를 수득하는 단계, (c) 비오틴에 대한 결합에 대하여 단계 (b) 의 항체를 추가로 선택하여, 본원에 개시된 바와 같은 항체를 수득하는 단계를 포함하는, 본원에 개시된 바와 같은 항체의 생산 방법이 보고된다.

a) 실험 동물을 본원에 개시된 바와 같은 면역원으로 면역시켜, B-세포를 유도하여 면역원에 결합하는 항체를 생산하는 단계, b) 하이브리도마 기술 또는 B-세포 PCR 기술을 통해, 단계 (a) 의 B-세포에 의해 생산된 면역원에 결합하는 단일클론 항체를 수득하는 단계, c) 비오틴에 대한 결합에 대하여 단계 (b) 의 항체를 선택하는 단계, 및 d) 하기 화학식 II 의 화합물에 결합하지 않는 항체를 선택하여, 본원에 개시된 바와 같은 항체를 수득하는 단계를 포함하는, 본원에 개시된 바와 같은 항체의 생산 방법이 보고된다:

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본 발명의 상세한 설명

한 구현예에서, 본 발명은 하기 화학식 I 의 화합물에 특이적으로 결합하고, 또한 비오틴에 결합하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체에 관한 것이다:

식 중,

Y 는 CH₂ 또는 C=O 이고,

X 는 O 또는 (CH₂)_n 이고, n 은 1 내지 20 의 정수이고,

R 은 H, 또는 Z-L 이며,

이때,

L 은 링커이고,

Z 는 비오틴 모이어티를 함유하지 않는 합텐 및 폴리펩티드로부터 선택된다.

놀랍게도, (하기에 더 상세히 기재되는) 화학식 I 의 구조 및 비오틴 둘 모두에 결합하는 단일클론 항체는 본원에 개시되고 하기에 더욱 상세히 예시되는 방법을 기반으로 신뢰할 수 있게 생성될 수 있는 것으로 밝혀졌다.

본 개시의 목적을 위해, 본원에 언급된 모든 양태 및 구현예에서, 용어 "(스트렙트)아비딘" 및 아비딘-유형 단백질은 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 아비딘-유형 단백질은 테트라하이드로티오펜 고리와 융합된 우레이도 고리로 표시되는 비오틴의 헤테로시클릭 구조에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 결합 포켓을 갖는 단백질로 이해된다. 이러한 특성으로 인해, 아비딘-유형 단백질이 비오틴화 표적 분자에 결합할 수 있으며, 이때 비오틴은 비오틴의 발레르산 측쇄의 카르복실 관능기의 탄소 원자를 통해 분자에 공유 결합된다. 아비딘-유형 단백질의 여러 구현예가 당업계에 공지되어 있다. 보다 구체적으로, 아비딘-유형 단백질은 아비딘, 뉴트라비딘, 스트렙타비딘, 브라다비딘, 트랩타비딘, 이들의 비오틴-결합 변이체, 이들의 혼합물, 이들의 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체 또는 다량체, 이들의 컨쥬게이트된 형태 및 관심의 대상인 종래의 비오틴화 분자에 결합하는 항체를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 이들의 자연 발생 형태에서 많은 아비딘-유형 단백질 (특히 항체가 아닌 것들), 구체적으로는 아비딘 및 스트렙타비딘이 단독사량체인 것이 공지되어 있으며; 즉 이들은 4 개의 동일한 하위단위로 이루어진다. 단량체성 아비딘-유형 단백질의 변이체의 구현예에서, 자연 발생 형태는 각각의 단량체가 비오틴 결합 포켓을 갖는 디-, 트리-, 또는 테트라-올리고머일 수 있다. 한 구현예에서, 아비딘-유형 단백질은 단량체, 단독이량체, 단독삼량체, 및 단독사량체로부터 선택된다.

또한 보다 구체적으로는, 아비딘-유형 단백질은 테트라하이드로티오펜 고리와 융합된 우레이도 고리로 표시되는 비오틴의 헤테로시클릭 구조에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 포켓을 갖는 항체일 수 있다. 이러한 특성을 갖는 항체의 예는 선행 기술에 공지되어 있으며 상기에 언급되어 있다. 보다 더 구체적인 구현예에서, 아비딘-유형 단백질은 도 3 A 의 구조의 비오틴 모이어티에 특이적으로 결합하는 경우 식별될 수 있다. 보다 더 구체적인 구현예에서, 아비딘-유형 단백질은 도 3 B 의 구조에 특이적으로 결합하지 않는다.

한 구현예에서, 본 개시에 따른 (스트렙트)아비딘은 아비딘, 뉴트라비딘, 스트렙타비딘, 브라다비딘, 트랩타비딘, 이들의 비오틴-결합 변이체, 및 이들의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택된다.

본 개시에서 "(스트렙트)아비딘" 또는 아비딘-유형 단백질을 언급할 때, 이들 용어는 이들의 임의의 변이체를 동등하게 포함하는 것으로 이해되며, 단, 변이체는 비오틴을 테트라하이드로티오펜 고리와 융합된 우레이도 고리로 표시되는 비오틴의 헤테로시클릭 구조에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 결합 포켓과 비-공유적으로 결합할 수 있다. 이와 관련하여, 변이체가 하나 이상의 보존적 아미노산 치환, 아날로그 아미노산 치환 및/또는 결합 포켓의 아미노산의 기능에 상당한 영향을 미치지 않거나 변경시키지 않는 아미노산의 결실 및/또는 첨가를 포함한다는 고려 하에, 적어도 하나의 결합 포켓을 형성하는 아미노산이 원래의 아비딘-유형 단백질의 아미노산 서열의 유사한 정전기적 및 입체화학적 특성을 갖는다는 점에서 변이체는 "기능적으로 동등한 폴리펩티드" 이다. "기능적으로 동등한" 은 또한 각각의 언급된 아미노산 서열과 관련하여 상동 아미노산 서열을 포함한다.

"보존적 치환" 은 아미노산 및 핵산 서열 모두에 적용된다. 특정 핵산 서열과 관련하여, "보존적으로 치환된" 은 동일한 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않을 때에는 본질적으로 동일한 서열을 지칭한다. 유전자 코드의 축퇴성으로 인해, 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 주어진 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU 는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 코돈에 의해 알라닌이 특정되는 모든 위치에서, 코돈은 코딩되는 폴리펩티드를 변경하지 않으면서 상응하는 코돈 중의 어느 것으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 "침묵 변이" 로서, 이는 보존적으로 변형된 변이의 한 종류이다. 본원에서 폴리펩티드를 코딩하는 모든 핵산 서열은 또한 모든 가능한 핵산의 침묵 변이를 기술한다. 당업자는 핵산 중의 각 코돈 (일반적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 트립토판에 대해 유일한 코돈인 TGG 는 제외) 이 기능적으로 동일한 분자를 생성하도록 변형될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 각각의 핵산의 침묵 변이는 각 기재된 서열에 내포되어 있다.

아미노산 서열과 관련하여, 아미노산 서열 중 단일 아미노산 또는 작은 퍼센트의 아미노산을 변경하는, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 개개의 치환은, 그러한 변경이 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시키는 경우에, "보존적 치환" 이라는 것을 당업자는 인지할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환에 관한 표는 당업계의 통상의 전문가에게 공지되어 있다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환에 관한 표는 당업계의 통상의 전문가에게 공지되어 있다. 하기 8개의 군은 각각 서로에 대해 보존적인 치환인 아미노산을 함유한다:

용어 "보존적 아미노산 치환" 은 치환된 아미노산이 화학적 기준 서열에서 상응하는 아미노산과 유사한 구조적 또는 화학적 특성을 갖는 모든 치환을 의미한다. 예를 들어, 보존적 아미노산 치환은 하나의 지방족 또는 소수성 아미노산, 예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 또는 트립토판의 다른 것으로의 치환; 하나의 하이드록실-함유 아미노산, 예를 들어, 세린 및 트레오닌의 다른 것으로의 치환; 하나의 산성 잔기, 예를 들어, 글루탐산 또는 아스파르트산의 다른 것으로의 치환; 하나의 아미드-함유 잔기, 예를 들어, 아스파라긴 및 글루타민의 다른 것으로의 치환; 하나의 방향족 잔기, 예를 들어, 페닐알라닌 및 티로신의 다른 것으로의 치환; 하나의 염기성 잔기, 예를 들어, 리신, 아르기닌 및 히스티딘의 다른 것으로의 치환; 및 하나의 작은 아미노산, 예를 들어, 알라닌, 세린, 트레오닌, 및 글리신의 다른 것으로의 치환을 포함한다.

본원에서 아미노산 서열과 관련하여 사용되는 "결실" 및 "첨가" 는 아미노 말단, 카르복시-말단, 아미노산 서열의 내부 또는 이들의 조합에 대한 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 첨가를 의미하며, 예를 들어, 첨가는 본 출원의 항체 대상 중 하나에 대한 것일 수 있다.

본원에서 사용된 "상동 서열" 은 상응하는 기준 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 상동인 아미노산 서열을 갖는다. 적어도 90% 동일한 서열은 기준 서열의 10 개의 아미노산 당 1 개 이하의 변경, 즉, 결실, 첨가 또는 치환의 임의 조합을 갖는다. 퍼센트 상동성은 예를 들어, DNA STAR™ 프로그램의 MEGALIGN™ 프로젝트를 사용하여 변이체의 아미노산 서열을 기준 서열과 비교함으로써 결정된다.

2 개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 용어 "동일" 또는 퍼센트 "동일성" 은 2 개 이상의 동일한 서열 또는 하위 서열을 의미한다. 비교 윈도우, 또는 지정 영역에 걸쳐 하기 서열 비교 알고리즘 (또는 당업자가 이용 가능한 다른 알고리즘) 중 하나를 사용하여 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 측정되는 바와 같은 최대 상응성에 대하여 비교 및 정렬되었을 때, 서열은 동일한 (즉, 특정 영역에 걸쳐 약 60% 동일성, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95% 동일성) 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 백분율을 갖는 경우 "실질적으로 동일하다". 이러한 정의는 또한 시험 서열의 보완을 의미한다. 동일성은 적어도 약 50 개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이의 영역에 걸쳐, 또는 75-100 개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이의 영역에 걸쳐, 또는 특정되지 않은 경우 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전체 서열에 걸쳐 존재할 수 있다. 인간 이외의 종으로부터의 동족체를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 엄격한 혼성화 조건 하에 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편을 갖는 표지된 프로브로 라이브러리를 스크리닝하는 단계, 및 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 전장 cDNA 및 게놈 클론을 단리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있다. 이러한 혼성화 기법은 당업자에게 잘 알려져 있다.

서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열은 시험 서열이 비교되는 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 및 기준 서열은 컴퓨터에 입력되고, 필요한 경우 하위 서열 좌표가 지정되며, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 기본 프로그램 파라미터가 사용될 수 있거나, 대안적인 파라미터가 지정될 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터를 기반으로 기준 서열에 대하여 시험 서열의 퍼센트 서열 동일성을 계산한다.

본 개시의 목적을 위해, 용어 "비오틴" 또는 "유리 비오틴" 은 상호 교환적으로 사용되며, 자연 발생 화합물, 즉 D(+)-비오틴을 나타내는 것으로 이해된다.

비오틴 (D(+)-비오틴; C₁₀H₁₆N₂O₃S; MW = 244.31 g/mol; IUPAC 명칭: 5-[(3aS,4S,6aR)-2-옥소-1,3,3a,4,6,6a-헥사하이드로티에노[3,4-d]이미다졸-4-일]펜탄산), CAS 등록 번호 58-85-5 는 테트라하이드로티오펜 고리와 융합된 우레이도 고리, 및 테트라하이드로티오펜 고리의 탄소 원자 중 하나에 부착된 발레르산 치환기를 포함한다. 비오틴의 기본 구조는 오래전부터 알려져 있으며 예를 들어 Melville D.B. 등에 의해 보고되었다 (J. Biol. Chem. 146 (1942) 487-492). 비오틴은 3 개의 인접한 키랄 탄소 원자를 가지며, 따라서 4 개의 부분입체 이성질체 라세미 형태가 가능하다. 부분입체 이성질체 라세미 형태 중에서, 오직 D(+)-비오틴만 자연에서 발생하는 반면 다른 이성질체들은 합성 기원이다. 생물학적으로 활성인 형태는 도 1A 및 도 1B 에 도시된 (3aS,4S,6aR) 배열이다.

Marquet A. (Pure & Appl. Chem. 49 (1977) 183-196) 에 따르면, D(+)-비오틴의 결정 구조에서, 도 1B 에 도시된 바와 같이 우레이도 고리는 평면이고, 티오판 고리는 엔벨로프 형태를 갖는다. 발레르산 측쇄는 완전히 펼쳐지지 않지만 비틀리고, 측쇄의 C₆ 원자와 우레이도 고리의 N'₃ 원자 사이에 상호 작용이 있다; 알려진 바에 따르면, 이러한 상호 작용은 비오틴의 반응성에 영향을 미친다. Glasel J.A. (Biochemistry 5 (1966) 1851-1855) 및 Lett R. & Marquet A. (Tetrahedron 30 (1974) 3365-3377) 에서 보고되는 NMR 연구에서 보여지는 바와 같이 티오판 고리의 엔벨로프 형태는 또한 용액 중에서 보고되었다.

용어 "비오틴 모이어티" 는 예를 들어 임의 종류의 비오틴화 또는 화학적 커플링에 의해 수득된 바와 같은 분자의 비오틴-관련 부분 또는 비오틴-유래 부분을 지칭하는데 사용된다.

발레르산 측쇄의 카르복실 관능기의 탄소 원자를 통해 관심 분자 상의 적절한 화학 기에 비오틴을 부착하는 것은 "비오틴화" 또는 "통상적인 비오틴화" 로 지칭된다. 따라서, 관심의 대상인 "비오틴화" 분자의 비오틴 잔기는 바깥쪽을 향하는 고리 구조 (즉, 테트라하이드로티오펜 고리와 융합된 우레이도 고리) 를 갖고, 비오틴 잔기의 선형 부분은 비오틴화 분자의 표면 쪽으로 안쪽을 향한다. 바깥쪽을 향하는 고리 구조는 아비딘-유형 단백질에 의해 결합될 수 있다. 따라서, 중요하게는, 비오틴의 헤테로시클릭 "머리" 구조는 아비딘-유형 단백질에 의한 특이적 결합을 위해 노출되어야 한다.

용어 "(스트렙트)아비딘/비오틴 결합 쌍" 은 당업자에게 완전하게 공지되어 있다. 이는 한편으로는 비오틴 (비오틴화 분자의 비오틴 모이어티 포함) 및 다른 한편으로는 (스트렙트)아비딘이 이 결합 쌍의 두 구성원을 대표한다는 사실을 지적한다. 상기 기재한 바와 같이, 이 결합 쌍은 비-공유 상호 작용에 대해 공지된 가장 높은 결합 친화도 중 하나를 갖는다는 것에서 두드러진다.

단수형 표현은 관사의 하나 또는 하나 초과 (즉, 하나 이상) 의 문법적 대상을 지칭하는 것으로 본원에서 사용된다. 예를 들어, "항체" 는 하나의 항체 또는 하나 초과의 항체를 의미한다.

용어 "항체" 는 전체 항체 및 항체 단편을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 항체 구조를 포함한다. 본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 염소, 양, 마우스, 토끼, 또는 래트 항체, 키메라 항체, 또는 본 발명에 따른 특징적인 특성이 보유되는 한 추가로 유전적으로 조작된 항체이다.

"항체 단편" 은 전장 항체, 바람직하게는 이들의 가변 도메인, 또는 적어도 이들의 항원 결합 부위를 포함한다. 항체 단편의 예는 디아바디(diabody), 단쇄 항체 분자, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. scFv 항체는, 예를 들어, Huston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88 에 기재되어 있다. 또한, 항체 단편은 V_H 도메인 (즉, V_L 도메인과 함께 조립될 수 있음), 또는 IGF-1 에 결합하는 V_L 도메인 (즉, V_H 도메인과 함께 기능성 항원 결합 부위에서 조립되어 본 발명에 따른 항체의 특성을 제공할 수 있음) 의 특성을 갖는 단쇄 폴리펩티드를 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "단일클론 항체" 또는 "단일클론 항체 조성물" 은 단일 아미노산 조성물의 항체 분자의 제조를 지칭한다.

용어 "특이적 결합제" 는 관심의 대상인 분석물에 특이적으로 결합하거나 특이적으로 결합될 수 있는 작용제를 나타내는데 사용된다. 면역 어세이에 대하여 많은 상이한 어세이 설정이 당업계에 공지되어 있다. 특정 어세이 설정에 따라, 각종 비오틴화 특이적 결합제가 사용될 수 있다. 한 구현예에서, 비오틴화 특이적 결합제는 비오틴화 분석물-특이적 결합제, 고체 상에 결합된 비오틴화 분석물, 및 고체 상에 결합된 비오틴화 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

용어 "분석물-특이적 결합제" 는 관심의 분석물에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 본 개시내용의 견지에서 분석물-특이적 결합제는 전형적으로 분석물 (다른 용어 관심의 분석물; 표적 분자) 에 결합할 수 있는 결합 또는 포획 분자를 포함한다. 하나의 구현예에서 분석물-특이적 결합제는 적어도, 그것의 대응하는 표적 분자, 즉 분석물에 대해 10⁷ ℓ/mol 의 친화성을 갖는다. 분석물-특이적 결합제는 다른 구현예에서 그것의 표적 분자에 대해 10⁸ ℓ/mol 또는 심지어 10⁹ ℓ/mol 의 친화성을 갖는다. 숙련가는 특이적이라는 용어가 샘플에 존재하는 다른 생체분자가 분석물에 특이적인 결합제와 상당히 결합하지 않는 것을 나타내는데 사용되는 것을 알 것이다. 일부 구현예에서, 표적 분자 이외의 생체분자에 대한 결합 수준은 표적 분자의 친화성의 오로지 10%, 더 바람직하게는 오로지 5% 또는 그 미만인 결합 친화성을 야기한다. 하나의 구현예에서 분석물에 대한 것외에 다른 분자에 대한 결합 친화성은 측정가능하지 않다. 하나의 구현예에서 분석물-특이적 결합제는 친화성 뿐만 아니라 특이성에 대한 상기 최소 기준 둘 다를 충족시킬 것이다.

항체와 관련하여 사용되는 용어 "분석물-특이적 결합" 은 항체와 분석물 상의 표적 에피토프의 면역 특이적 상호 작용, 분석물 상의 에피토프에 대한 항체의 결합을 지칭한다. 분석물 상의 에피토프를 통한 항체의 분석물-특이적 결합의 개념은 당업자에게 매우 명백하다.

용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질" 은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 용어는 자연 발생 아미노산 중합체뿐만 아니라 하나 이상의 아미노산 잔기가 비-자연적으로 코딩된 아미노산인 아미노산 중합체에 적용된다. 본원에서 사용되는 용어는 아미노산 잔기가 공유 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 사슬을 포함한다. 폴리펩티드, 펩티드 및 단백질은 표준 서열 표기법을 사용하여 좌측에 질소 말단 및 우측에 카르복시 말단으로 표기된다. 표준 단일 문자 표기법은 다음과 같이 사용되었다: A―알라닌, C―시스테인, D―아스파르트산, E―글루탐산, F―페닐알라닌, G―글리신, H―히스티딘, S―이소류신, K―리신, L―류신, M―메티오닌, N―아스파라긴, P―프롤린, Q―글루타민, R―아르기닌, S―세린, T―트레오닌, V―발린, W―트립토판, Y―티로신. 본원에 사용되는 용어 "펩티드" 는 5 개 이하의 아미노산의 길이를 갖는 아미노산의 중합체를 지칭한다. 본원에 사용되는 용어 "폴리펩티드" 는 6 개 이상의 아미노산의 길이를 갖는 아미노산의 중합체를 지칭한다. 용어 "단백질" 은 글리코실화, 포스포릴화, 아세틸화 또는 다른 번역 후 변형과 같은 추가 변형을 갖는 폴리펩티드 사슬 또는 폴리펩티드 사슬을 의미한다.

"합텐" 은 항체의 형성과 같은 면역 반응을 직접 유도하지 않는 작은 분자 (예를 들어, 살충제, 살균제, 약물, 호르몬, 독소, 합성 펩티드, 등) 이다. 항원성 마크로분자와 같은 면역원성 담체와 컨쥬게이트시켜 합텐에 대한 항체를 생산하기 위한 기술이 확립되어 있다. 본 개시의 목적을 위해, 합텐은 저 분자량 분자, 구체적으로는 10,000 Da 이하의 분자량을 갖는 것으로 이해되며, 이는 단백질과 같은 면역원성 담체와 컨쥬게이트되지 않는 한 그리고 컨쥬게이트될 때까지 면역 반응을 일으키지 않는다. 항체가 형성되면, 이는 합텐에 결합할 수 있다. 이렇게 생성된 항체는 많은 분야, 구체적으로는 면역 진단 키트 또는 바이오센서의 개발에 유용하다. 따라서, 용어 "합텐" 은 적어도 30 개의 아미노산의 폴리펩티드와 같은 면역원성 담체에 부착되는 경우에만 면역 반응을 일으킬 수 있는 10,000 Da 이하의 작은 분자를 의미한다. 이러한 의미에서 및 한 구현예에서, 합텐은 그 자체로는 항체 형성을 촉진할 수 없지만, 적어도 30 개의 아미노산의 단백질에 컨쥬게이트될 때 항체 형성을 촉진할 수 있는 불완전한 항원이다. 예시적인 합텐은 아닐린, o-, m-, 및 p-아미노벤조산, 퀴논, 히스타민-석시닐-글리신 (HSG), 하이드랄라진, 할로탄, 인듐-DTPA, 플루오레세인, 디곡시게닌, 테오필린, 브로모데옥시우리딘, 스테로이드 화합물 및 디니트로페놀이다. 특정 구현예에서, 합텐은 비오틴이 아니며, 비오틴 모이어티를 함유하지 않는다. 한 특정 구현예에서, 합텐은 디곡시게닌 또는 테오필린 또는 플루오레세인 또는 브로모데옥시우리딘이다. 화학식 I 에 따른 화합물의 개시의 맥락에서의 합텐, 화합물의 모이어티로서의 합텐은 화합물의 나머지 부분에 공유 결합되는 것으로 이해되며, 이때 합텐 모이어티 (즉, 10,000 Da 이하의 화학 구조) 는 적어도 30 개의 아미노산의 폴리펩티드와 같은 면역원성 담체에 부착되는 경우에만 면역 반응을 유도할 수 있다.

"단리된" 항체는 그것의 자연적인 환경의 성분으로부터 식별된 및 분리된 및/또는 회수된 것이다. 그것의 자연적인 환경의 오염 성분은 항체에 대한 연구, 진단 또는 치료 용도에 간섭할 물질이고, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 예를 들면, 쿠마씨 블루 또는 은 염색을 사용하는 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE 에 의해 결정된 바와 같이, 항체 95 중량% 초과, 및 일부 구현예에서, 99 중량% 초과로 정제된다.

면역글로불린 G 부류의 항체는 일반적으로 2 개의 동일한 경쇄 (L) 및 2 개의 동일한 중쇄 (H) 로 구성된, 약 150,000 달톤의 헤테로사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 1 개의 공유 디설파이드 결합에 의해 중쇄에 연결되는 반면, 디설파이드 연결의 수는 상이한 면역글로불린 아이소타입의 중쇄 사이에서 상이하다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 간격을 둔 사슬내 디설파이드 브릿지를 갖는다. 각각의 중쇄는 1 개의 말단에, 가변 도메인 (V_H) 에 이은 다수의 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 1 개의 말단에 가변 도메인 (V_L) 및 그것의 다른 말단에 불변 도메인을 갖고; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제 1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정한 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이에 계면을 형성하는 것으로 여겨진다.

항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인" 은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 말한다. 중쇄의 가변 도메인은 "VH" 로서 불릴 수 있다. 경쇄의 가변 도메인은 "VL" 로서 불릴 수 있다. 이들 도메인은 일반적으로 항체의 최대 가변 부분이고, 항원-결합 부위를 함유한다.

용어 "가변성" 은 가변 도메인의 특정 부분이 항체 중에서 서열이 광범위하게 상이하고, 그것의 특정한 항원에 대한 각각의 특정한 항체의 결합 및 특이성에서 사용되는 것을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전반에 고르게 분포되지 않는다. 이것은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에 과가변 영역 (HVR) 으로 불리는 3 개의 분절에서 집중된다. 가변 도메인의 좀더 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR) 으로 불린다. 고유의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 각각은 베타-시트 구조를 연결하는, 그리고 일부 경우에서 이의 일부를 형성하는 루프를 형성하는, 3 개의 HVR 에 의해 연결된 대부분 베타-시트 배치구성을 채용하는 4 개의 FR 영역을 포함한다. 각각의 사슬 중의 HVR 은 FR 영역에 아주 근접하여 함께 유지되고, 다른 사슬로부터의 HVR 과 함께, 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991) 참조). 불변 도메인은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관여되지 않으나, 다양한 효과기 기능, 예컨대 항체-의존적 세포 독성에서 항체의 참여를 나타낸다.

임의의 척추동물 종으로부터의 항체 (면역글로불린) 의 "경쇄" 는 그것의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반한, 카파 (κ) 및 람다 (λ) 로 불리는 2 개의 명확히 구별되는 유형 중 하나에 배정될 수 있다.

본 발명에 따른 방법에서 사용된 항체는 임의의 동물 기원으로부터일 수 있다. 하나의 구현예에서 항체는 인간, 쥣과 (예를 들면, 마우스 및 래트), 당나귀, 원숭이, 토끼, 염소, 기니아 피그, 낙타, 말, 또는 닭 항체이다.

그들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체 (면역글로불린) 는 상이한 부류로 배정될 수 있다. 인간 면역글로불린에 5 개의 주요 부류가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 그리고, 이들 중 몇 개는 하위 부류 (아이소타입), 예를 들면, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁, 및 IgA₂ 로 추가로 나눠질 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ 로 불린다. 상이한 부류의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 배치구성은 잘 알려지고, 예를 들면, Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W. B. Saunders, Co., 2000) 에 일반적으로 기재된다. 항체는 항체와 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드와의 공유 또는 비-공유 회합에 의해 형성된, 더 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.

용어 "전장 항체" "온전한 항체" 및 "전체 항체" 는 본원에서 아래에 정의된 바와 같은 항체 단편이 아닌, 그것의 실질적으로 온전한 형태로의 항체를 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용된다. 용어는 특히 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 가진 항체를 지칭한다.

"항체 단편" 은 바람직하게는 그의 항원-결합 영역을 포함하는, 온전한 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')₂, 및 Fv 단편; 단일-사슬 항체 분자; scFv, sc(Fv)₂; 디아바디; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.

항체의 파파인 소화는 각각 단일 항원-결합 부위, 및 그 명칭이 쉽게 결정화하는 그것의 능력을 반영하는 잔류 "Fc" 단편을 갖는, "Fab" 단편이라고 불리는 2 개의 동일한 항원-결합 단편을 생성한다. 펩신 처리는 2 개의 항원-결합 부위를 갖고 여전히 항원에 가교결합할 수 있는 F(ab')₂ 단편을 산출한다.

Fab 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 함유하고 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제 1 불변 도메인 (CH1) 을 함유한다. Fab' 단편은 항체-힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 몇 개의 잔기의 첨가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH 는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들) 이 유리 티올기를 가지고 있다는 Fab' 에 대한 명칭이다. F(ab')₂ 항체 단편은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지된다.

"Fv" 는 완전한 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 하나의 구현예에서, 2-사슬 Fv 종은 단단한, 비-공유 회합으로 1 개의 중쇄 및 1 개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 단일-사슬 Fv (scFv) 종에서, 1 개의 중쇄 및 1 개의 경쇄 가변 도메인은 경쇄 및 중쇄가 2-사슬 Fv 종 (sc(Fv)₂) 에 있는 것과 유사한 "이량체성" 구조로 회합할 수 있는 가요성 펩티드 링커에 의해 공유 결합될 수 있다. 상기 배치구성에서 각각의 가변 도메인의 3 개의 HVR 이 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상에 항원-결합 부위를 규정한다. 집합적으로, 6 개의 HVR 은 항체에 대한 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 오직 3 개의 HVR 을 포함하는 Fv 의 절반) 은, 심지어 전체 결합 부위보다 낮은 친화성이긴 하지만, 항원을 인지하고 결합하는 능력을 갖는다.

본 개시는 본원에 개시된 바와 같이 유리 비오틴에 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론 항체로부터 유도된 1가 Fab 단편 및 단쇄 Fv 를 포함한다. 자연 발생 항체 형태와 비교하여, 1가 종은 보다 작은 분자량으로 인해 수용액에서 더 빠르게 확산될 수 있다. 또 다른 양태는 적합한 조건 하에서 특히 scFv 항체가 원핵 생물 발현 시스템에서 재조합으로 생산될 수 있다는 것이다.

용어 "디아바디" 는 2 개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편을 지칭하는데, 이 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH-VL) 내의 경쇄 가변 도메인 (VL) 에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH) 을 포함한다. 동일한 사슬 상의 2 개의 도메인 사이의 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 이루고 2 개의 항원-결합 부위를 창출하도록 강요된다. 디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있다. 디아바디는, 예를 들어, EP 404097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Holliger et al., PNAS USA 90: 6444-6448 (1993) 에 좀더 자세히 설명된다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003) 에 기재된다.

본원에서 사용된 용어 "단일클론 항체" 는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체, 즉, 집단을 포함하는 개별 항체가 소량으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이, 예를 들면, 자연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 지칭한다. 따라서, 수식어 "단일클론" 은 항체의 특징을 별개의 항체의 혼합물이 아닌 것으로서 나타낸다. 특정 구현예에서, 이러한 단일클론 항체는 전형적으로 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하고, 여기서 상기 표적-결합 폴리펩티드 서열은 복수의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적-결합 폴리펩티드 서열의 선택을 포함하는 방법에 의해 수득되었다. 예를 들면, 선택 방법은 복수의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파아지 클론, 또는 재조합 DNA 클론의 집단으로부터의 독특한 클론의 선택일 수 있다. 선택된 표적 결합 서열은 예를 들면, 표적에 대한 친화성을 개선하기 위해, 표적 결합 서열을 인간화하기 위해, 세포 배양 중 그것의 생산을 개선하기 위해, 그것의 면역원성을 생체내에서 감소시키기 위해, 다중특이적 항체를 생성하는 등을 위해 추가로 변경될 수 있고, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체가 또한 본 발명의 단일클론 항체라는 것으로 이해되어야 할 것이다. 전형적으로 상이한 결정인자 (에피토프) 에 대항하여 지향된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 대조적으로, 단일클론-항체 제제의 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지향된다. 그들의 특이성에 더해, 단일클론-항체 제제는 이들이 다른 면역글로불린에 의해 전형적으로 비오염되는 것이 유리하다.

수식어 "단일클론" 은 항체의 특징이 실질적으로 균질한 집단의 항체로부터 수득되는 것으로 나타내며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단일클론 항체는 예를 들어, 하이브리도마 방법 (예를 들어, Kohler and Milstein., Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2^nd ed. 1988); Haemmerling et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참고), 파지-디스플레이 기술 (예를 들어, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, PNAS USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004) 참고), 및 인간 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 유전자좌 또는 유전자의 일부 또는 전부를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체의 생산을 위한 기술 (예를 들어, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., PNAS USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); 및 Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995) 을 포함하는 다양한 기술에 의해 생산될 수 있다.

본원에서 단일클론 항체는 구체적으로 중쇄 및/또는 경쇄의 부분이 특정한 종으로부터 유래되는 항체 중의 또는 특정한 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 항체 중의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라성" 항체를 포함하는 한편, 사슬(들) 의 나머지는 이들이 요망된 생물학적 활성을 나타내는 한, 또 다른 항체 부류 또는 하위 부류, 뿐만 아니라 이러한 항체의 단편에 속하는 또는 또 다른 종으로부터 유래되는 항체 중의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이다 (예를 들면, 미국 특허 번호 4,816,567 및 Morrison et al., PNAS USA 81:6851-6855 (1984)). 키메라성 항체는 항체의 상기 항원-결합 영역이 예를 들면, 마카크 원숭이를 관심의 항원으로 면역화시킴으로써 생산된 항체로부터 유래되는 PRIMATIZED® 항체를 포함한다.

용어 "과가변 영역" "HVR" 또는 "HV" 는 본원에서 사용되는 경우 루프를 구조적으로 정의하는 서열 및/또는 형태에서 과가변적인 항체-가변 도메인의 영역을 말한다. 일반적으로, 항체는 6 개의 HVR 을; 3 개는 VH 에 (H1, H2, H3), 3 개는 VL 에 (L1, L2, L3) 포함한다. 고유의 항체에서, H3 및 L3 은 6 개의 HVR 의 최대 다양성을 나타내고, H3 은 특히 항체에 대한 미세한 특이성을 부여하는데 독특한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 예를 들면, Xu et al. Immunity 13:37-45 (2000); Johnson and Wu in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003) 을 참고한다. 사실상, 오직 중쇄로만 이루어진 자연 발생적 낙타과 항체는 경쇄의 부재 시 기능하고 안정적이다. 예를 들어, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993) 및 Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996) 을 참고한다.

다수의 HVR 묘사가 본원에 사용되고 포함된다. Kabat 상보성-결정 영역 (CDR) 인 HVR 은 서열 가변성을 기반으로 하고 가장 통상적으로 사용된다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Chothia 는 구조적 루프의 위치 대신에 언급된다 (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). AbM HVR 은 Kabat CDR 과 Chothia 구조 루프 사이의 절충을 나타내고, Oxford Molecular's AbM 항체-모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. "접촉" HVR 은 이용가능한 복합 결정 구조의 분석에 기반한다. 이들 HVR 각각으로부터의 잔기를 하기에 명시한다.

HVR 은 하기와 같은 "연장된 HVR" 을 포함할 수 있다: VL 중 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2), 및 89-97 또는 89-96 (L3), 및 VH 중 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2), 및 93-102, 94-102, 또는 95-102 (H3). 가변성-도메인 잔기는 각각의 이들 연장된-HVR 정의에 대해, Kabat et al. (상기 참조) 에 따라 넘버링된다.

표현 "Kabat 으로의 가변성-도메인 잔기-넘버링" 또는 "Kabat 으로의 아미노-산-위치 넘버링" 및 이의 변이는, Kabat et al. (상기 참조) 에서의 항체 편집의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인을 위해 사용되는 넘버링 시스템을 말한다. 본 넘버링 시스템을 사용하면, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR 의 단축, 또는 그 내로의 삽입에 상응하는 몇 개의 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들면, 중쇄 가변 도메인은 H2 의 잔기 52 후에 단일 아미노산 삽입체 (Kabat 에 따른 잔기 52a) 및 중쇄 FR 잔기 82 후에 삽입된 잔기 (예를 들면 Kabat 에 따른 잔기 82a, 82b, 및 82c, 등) 를 포함할 수 있다. 잔기의 Kabat 넘버링은 "표준" Kabat 넘버링된 서열과 항체의 서열의 상동성의 영역에서 정렬에 의해 제시된 항체에 대해 결정될 수 있다.

용어 "실험 동물" 은 비-인간 동물을 의미한다. 한 구현예에서, 실험 동물은 래트, 마우스, 햄스터, 토끼, 낙타, 라마, 비-인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 상어 및 파충류로부터 선택된다. 한 구현예에서, 실험 동물은 토끼이다.

N'1 원자의 치환기로 인해, 화학식 I 에 따른 분자는 (스트렙트)아비딘의 결합 포켓과 양립할 수 없는데, 비오틴과 헤테로시클릭 구조와의 본질적인 밀접한 상호 작용이 입체적으로 방해되기 때문이다. 화학식 I 에 따른 화합물이 면역원으로서 사용되면, 이러한 구조가 또한 관심의 대상인 종래의 비오틴화 분자에 대한 항체의 결합 형성을 방지한다는 가설을 세웠다. 본원에 개시된 유도체화된 비오틴의 구조는 여전히 비오틴 의 "꼬리" 양상을 보존하기 때문에, 면역원에 포함된 유도체화된 디아미노비오틴이 비오틴에 대하여 원하는 단일클론 항체를 생성하는데 적합할 수 있다는 가설을 세웠다.

실제로, 한 구현예에서, 본 발명에 따른 단일클론 항체는 종래의 비오틴화 분자, 즉 비오틴과 컨쥬게이트된 분자에 결합하지 않으며, 이때 비오틴 모이어티의 발레르산 측쇄의 카르복실 관능기의 탄소 원자는 분자에 공유 결합된다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 항체는 화학식 II (도 3A 에 또한 도시되어 있음) 의 화합물에 결합하지 않는다.

오히려, 본 발명에 따른 단일클론 항체는 화학식 I 의 화합물 (식 중, Y 는 CH₂ 또는 C=O 이고, X 는 O 또는 (CH₂)_n 이고, n 은 1 내지 20 의 정수이고, R 은 H, 또는 Z-L 이며, 이때 L 은 링커이고, Z 는 합텐임) 에 결합한다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 단일클론 항체는 도 3 B 에 도시된 화학식 III 의 화합물에 결합한다.

보다 구체적인 구현예에서, 화학식 III 의 화합물에 대한 단일클론 항체의 결합 친화도는 화학식 II 의 화합물에 대한 결합 친화도보다 적어도 50 배 높다. 또 다른 보다 구체적인 구현예에서, 화학식 III 의 화합물에 대한 단일클론 항체의 결합 친화도는 화학식 II 의 화합물에 대한 결합 친화도보다 적어도 500 배, 적어도 1,000 배, 적어도 5,000, 적어도 10,000 배, 적어도 50,000 배, 및 적어도 100,000 배 높다.

따라서, 본원에 개시된 바와 같은 모든 양태의 또 다른 특정 구현예에서, 예시적인 화학식 II (도 3 A 참조) 의 화합물을 포함하나 이에 한정되지 않는 비오틴화 표적 분자 상에 컨쥬게이트된 비오틴에 대한 단일클론 항체의 친화도는 유리 비오틴에 대한 친화도보다 적어도 50, 100, 500, 1,000, 5,000, 및 적어도 10,000 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 배수로 낮다. 즉, 본 발명에 따른 단일클론 항체는 비오틴화 표적 분자 상에 컨쥬게이트된 비오틴에 대한 친화도보다 적어도 50, 100, 500, 1,000, 5,000, 및 적어도 10,000 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 배수로 높은 컨쥬게이트되지 않은 (유리) 비오틴에 대한 친화도를 갖는다.

생화학적 및 생물학적 샘플에서 관심 분석물의 검출 및 정량화를 위한 수많은 방법 및 시스템이 개발되었다. 미량의 미생물, 의약품, 호르몬, 바이러스, 항체, 핵산 및 기타 단백질을 측정할 수 있는 방법 및 시스템은 연구자 및 임상의에게 매우 중요하다.

많은 어세이 방법은 샘플에서 관심의 대상인 특정 표적 분자를 포획하고 표적 분자를 결정할 수 있는 분석물-특이적 결합제를 사용한다. 다른 어세이에서, 관심 분석물은 고체 상 결합된 분석물과 검출 가능하게 표지된 분석물-특이적 결합제를 갖는 샘플 내의 분석물의 경쟁적 결합에 의해 검출될 수 있다. 혈청 어세이에서, 항원에 대한 항체, 예를 들어 감염원은 바로 또는 소위 더블 항원 샌드위치 어세이에서 검출된다.

전형적으로, 관심 분석물의 존재는 하나 이상의 분석물-특이적 결합제에 부착된 관찰 가능한 "표지" 의 존재 또는 부재에 의해 표시된다.

오늘날 대부분의 면역 어세이는 어떻게 해서든지 고체 상을 사용한다. 일반적으로 어세이에 사용된 특이적 결합제 중 적어도 하나는 직접 또는 간접적으로 고체 상에 결합된다. (스트렙트)아비딘-비오틴 결합 쌍은 매우 높은 결합 친화도를 특징으로 한다. 이러한 이유로, (스트렙트)아비딘-비오틴 결합 쌍은 (스트렙트)아비딘으로 코팅된 고체 상에 대한 임의의 적절한 비오틴화 특이적 결합제의 간접적인 결합에 광범위하게 사용된다.

"샌드위치 어세이" 는 가장 유용하고 일반적으로 사용되는 어세이 중 하나인 어세이 유형이다. 샌드위치 어세이 기법의 다수의 변형이 존재하며, 모두 본 발명에 포함되도록 의도된다. 간단히 말해서, 전형적인 순방향 어세이에서, 표지되지 않은 항체는 "고체 상" 상에 고정되고, 시험될 샘플은 결합된 분자와 접촉하게 된다. 이 포획 항체의 고정은 고체 상에 직접, 또는 예를 들어 특이적 결합 쌍을 통해, 예를 들어 스트렙타비딘-비오틴 결합 쌍을 통해 간접적으로 흡착될 수 있다. 적합한 기간, 항체-항원 복합체의 형성을 허용하기에 충분한 기간 동안의 배양 후, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 리포터 분자로 표지된 항원에 결합하는 제 2 항체를 첨가하고, 항체-항원-표지된 항체의 샌드위치-복합체 의 형성을 허용하기에 충분한 시간 동안 배양한다. 임의의 미반응 물질을 세척하고, 분석물의 존재를 리포터 분자에 의해 생성된 신호를 검출하여 결정한다. 결과는 가시적인 신호의 단순한 관찰에 의해 정성적일 수도 있거나, 또는 공지된 양의 분석물을 함유하는 대조군 샘플과 비교함으로써 정량화될 수 있다.

본 발명의 목적을 위해, 전형적인 샌드위치 어세이에서, 제 1 비오틴화 분석물 특이적 결합제, 예를 들어 비오틴화 항체는 (스트렙트)아비딘으로 코팅된 고체 상에 비-공유적으로 결합된다. 고체 상은 전형적으로 유리 또는 중합체이며, 가장 일반적으로 사용되는 중합체는 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌이다. 고체 상은 튜브, 비드, 마이크로 플레이트의 디스크, 또는 면역 어세이를 수행하기에 적합한 임의의 다른 표면의 형태일 수 있다. 코팅 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 일반적으로 가교-결합, 공유 결합 또는 물리적 흡착으로 이루어진다. (스트렙트)아비딘-코팅된 고체 상은 일반적으로 비-특이적 결합을 차단하기 위해 처리되며, 시험 절차를 위한 제조에서 세척된다. 시험할 샘플의 분액을 제 1 또는 포획 항체 및 표지된 제 2 항체와 접촉시키고, 적합한 조건 (예를 들어, 실온 내지 40 ℃, 예컨대 25 ℃ 에서 32 ℃ 까지) 하에 충분한 기간 (예를 들어, 2-40 분 또는 보다 편리한 경우에는 하룻밤 동안) 동안 배양하여, 제 1 또는 포획 항체와 상응하는 항원 및 항원 상의 또 다른 에피토프에 결합하는 제 2 항체와 항원을 결합시켜 샌드위치 복합체를 형성한다. 그 후, (스트렙트)아비딘-코팅된 고체 상을 첨가하고, 적합한 조건 (예를 들어, 실온 내지 40 ℃, 예컨대 25 ℃ 에서 32 ℃ 까지) 하에 충분한 기간 (예를 들어 2-40 분 또는 보다 편리한 경우에는 하룻밤 동안) 동안 배양하여, 제 1 또는 포획 항체와 고체 상을 결합시킨다. 제 2 항체는 관심 항원 및 제 1 항체의 복합체에 대한 제 2 항체의 결합을 나타내는데 사용되는 리포터 분자에 연결된다.

어세이에 대한 변형은 샘플 및 표지된 항체 둘 모두가 (스트렙트)아비딘/비오틴 결합 쌍에 의해 고체 상에 결합될 수 있는 항체 또는 결합된 항체에 동시에 첨가되는 동시 어세이를 포함한다. 이러한 기법은 쉽게 알 수 있는 임의의 부차적인 변형을 포함하여 당업자에게 잘 알려져 있다.

또 다른 대안적인 설정에서, 제 1 비오틴화 항체가 제공되고, 합텐으로 표지된 제 2 항체가 제공되고, 두 항체는 상응하는 항원을 함유하는 샘플과 접촉되는 샌드위치 복합체가 형성된다. 제 1 및 제 2 항체 및 항원을 포함하는 샌드위치의 형성을 허용하는 조건 하에서 배양 시, 표지를 갖는 (스트렙트)아비딘이 첨가되고, 복합체는 제 2 항체에 부착된 합텐을 특이적으로 결합시킬 수 있는 고체 상에 의해 포획된다. 세척 단계 후, 고체 상에 의해 결합된 표지의 양은 관심 항원의 존재 및 양을 나타낸다.

일반적으로, 본원의 모든 양태 및 구현예와 관련하여, 본 개시는 하기 화학식 I 의 화합물을 제공한다:

식 중, Y 는 CH₂ 또는 C=O 이고, X 는 산소 원자 또는 (CH₂)_n 이고, n 은 1 내지 20 의 정수이고, R 은 H, 또는 Z-L 이며, 이때 L 은 링커이고, Z 는 비오틴 모이어티를 함유하지 않는 합텐 및 폴리펩티드로부터 선택된다.

화학식 I 의 구조의 첫 번째 주요 특징은 개질되지 않은, 컨쥬게이트되지 않은 발레르산 측쇄를 갖는 비오틴 모이어티이다. 비오틴 모이어티의 헤테로시클릭 구조에 대한 측쇄의 형태는 완전히 랜덤하지 않은 것으로 추측되었다. 이러한 견해는 NMR 데이터 및 한편으로는 발레르산 측쇄의 탄소 원자와 다른 한편으로는 N'3 원자 사이의 상호 작용에 대한 이전의 발견에 의해 확증되었다. 따라서, 지금까지 대답하지 않은 질문은 (스트렙트)아비딘에 의해 결합될 수 있는 헤테로시클릭 "머리" 부분의 (원위로부터) 반대편에 있는 비오틴 분자의 "꼬리" 부분이 실제로 단일클론 항체에 의한 인식에 적합한지의 여부였다.

화학식 I 에서의 비오틴의 헤테로시클릭 모이어티의 N'3 원자는 직접 개질이 없기 때문에 또 다른 중요한 특징이다. 다시 말해서, 이 원자가 발레르산 측쇄의 일부인 탄소 원자와의 상호 작용에 관여하는 경우, 측쇄의 형태에 대한 이러한 상호 작용은 마찬가지로 유지된다.

본 발명의 기저를 이루는 또 다른 중요한 특징은 치환기 R-X-Y (여기서, Y 는 CH₂ 또는 C=O 이고, X 는 산소 원자 또는 (CH₂)_n 이고, n 은 1 내지 20 의 정수임) 을 갖는 비오틴의 헤테로시클릭 모이어티의 N'1 원자이다. 따라서, 치환된 비오틴은 특히 원하는 항체의 검출 및 스크리닝에 유용한 면역원 및 분자의 형성을 가능하게 하는 빌딩 블록으로서 제조된다. 구체적으로는 이러한 목적을 위해, 말단기 R 은 Z-L 로 선택될 수 있으며, 이때 L 은 링커이고, Z 는 비오틴 모이어티를 함유하지 않는 합텐으로부터 선택된다.

용어 "링커" 는 제 1 모이어티를 제 2 모이어티 또는 더 많은 모이어티와 컨쥬게이션 (연결) 시키는데 사용될 수 있는 이관능성 또는 다관능성 모이어티를 나타낸다. 서로에 대해 결합된 제 1 및 제 2 모이어티를 포함하는 컨쥬게이트는 2 개의 반응성 관능기를 갖는 링커를 사용하여 편리하게 제조될 수 있다. 이러한 컨쥬게이트에서, 2 개의 모이어티는 상기 링커를 "통해" 결합된다. 당업자에게는 명백한 바와 같이, 이러한 컨쥬게이트에서 링커의 관능성 모이어티는 미반응된 관능성 모이어티로서가 아닌 결합의 일부로서 존재한다.

본원에서 정의하는 바와 같은, 용어 "반응성 기" 또는 "반응성 관능기" 는, 링커를 아미노기에 결합시키기 위해서 아민기, 바람직하게는 N-하이드록시석신이미드기 또는 말레이미드기와 반응하는데 적합한 임의의 기; 또는 링커를 SH-기에 결합시키기 위해서 제 2 관능기 결합에 적합한, 예를 들어 SH-기, 바람직하게는 말레이미드기와 반응하는데 적합한 기를 의미한다.

특정 구현예에서, 헤테로이관능성 링커는 N-하이드록시석신이미드 및 말레이미드 반응성 기를 기반으로 하는 NHS-말레이미드 링커; 석신이미딜-(PEG)n NHS-PEG-말레이미드 링커, NHS-할로아세틸 링커; 및 NHS-피리딜디티올 링커로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특히 바람직한 구현예에 있어서, 헤테로이관능성 링커는 석신이미딜-(PEG)n NHS-PEG-말레이미드 링커이다.

특정 구현예에서, L 은 1 내지 200 개의 원자의 주쇄 길이를 갖는다. 즉, 주쇄 길이가 1 내지 200 개의 원자이면, Z 와 R 사이의 가장 짧은 연결은 1 내지 200 개의 원자로 이루어진다.

고리 시스템이 존재하는 경우, 링커 길이를 평가할 때 고리 시스템에서 가장 짧은 수의 원자가 취해진다. 예를 들어, 페닐렌 고리는 링커에서 4 개의 원자의 길이를 차지한다.

화학식 I 의 한 구현예에서, L 은 주쇄로서 직선형 또는 분지형 포화, 불포화, 미치환 또는 치환 C1-C20 알킬 사슬, 또는 탄소 원자, 치환된 탄소 원자 및/또는 O, N, P 및 S 로부터 선택된 하나 이상의 원자, 또는 치환된 N, P, S 원자로 이루어진 1 내지 200 개의 원자 사슬, 또는 하나 이상의 시클릭 또는 헤테로시클릭 방향족 또는 비-방향족 고리 시스템을 함유하는 주쇄와 관련하여 전술한 바와 같은 사슬을 갖는 링커이다.

화학식 I 의 한 구현예에서, 링커 L 은 주쇄로서 직선형 또는 분지형 포화, 불포화, 미치환 또는 치환 C1-C100 알킬 사슬, 또는 탄소 원자, 치환된 탄소 원자 및/또는 O, N, P 및 S 로부터 선택된 하나 이상의 원자, 또는 치환된 N, P, 또는 S 원자로 이루어진 1 내지 100 개의 원자 사슬, 또는 하나 이상의 시클릭 또는 헤테로시클릭 방향족 또는 비-방향족 고리 시스템을 함유하는 주쇄와 관련하여 전술한 바와 같은 사슬을 갖는다.

화학식 I 의 한 구현예에서, 링커 L 은 주쇄로서 직선형 또는 분지형 포화, 불포화, 미치환 또는 치환 C1-C50 알킬 사슬, 또는 탄소 원자, 치환 탄소 원자 및/또는 O, N, P 및 S 로부터 선택된 하나 이상의 원자, 또는 치환된 N, P, 또는 S 원자로 이루어진 1 내지 50 개의 원자 사슬, 또는 하나 이상의 시클릭 또는 헤테로시클릭 방향족 또는 비-방향족 고리 시스템을 함유하는 주쇄와 관련하여 전술한 바와 같은 사슬을 갖는다.

화학식 I 의 하나의 다른 구현예에서, 링커 L 은 주쇄로서 직선형 또는 분지형 포화, 불포화, 미치환 또는 치환 C1-C20 알킬 사슬, 또는 탄소 원자, 치환 탄소 원자 및/또는 O, N, P 및 S 로부터 선택된 하나 이상의 원자, 또는 치환된 N, P, 또는 S 원자로 이루어진 1 내지 20 개의 원자 사슬, 또는 하나 이상의 시클릭 또는 헤테로시클릭 방향족 또는 비-방향족 고리 시스템을 함유하는 주쇄와 관련하여 전술한 바와 같은 사슬을 갖는다.

화학식 I 의 또 다른 특정 구현예에서, L 은 (단독-)2관능성 가교제와 링커에 의해 연결된 2 개의 모이어티의 각각의 적절한 화학 기의 반응시 수득되는 링커이며, (단독-)2관능성 가교제는 예를 들어 하기이다:

화학식 I 의 또 다른 특정 구현예에서, L 은 (헤테로-)2관능성 가교제와 링커에 의해 연결된 2 개의 모이어티의 각각의 적절한 화학 기의 반응시 수득되는 링커이며, (헤테로-)2관능성 가교제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:

NHS-말레이미드 가교제, 예를 들어

화학식 I 의 한 구현예에서, R 은 Z-L 이고, Z 는 폴리펩티드이다. 따라서, 본원에 개시된 바와 같은 모든 다른 양태 및 구현예와도 관련된 본 개시 및 본 발명의 또 다른 일반적인 양태는, 하기 화학식 I (식 중, Y 는 CH₂ 또는 C=O 이고, X 는 O 또는 (CH₂)_n 이고, n 은 1 내지 20 의 정수이고, R 은 Z-L 이며, 이때 L 은 링커이고, Z 는 적어도 30 개의 아미노산의 폴리펩티드임) 에 따른 면역원이다.

중요하게는, 단독 비오틴 모이어티의 면역원성은 낮지만, 폴리펩티드는 비오틴 모이어티에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 한 구현예에서, 폴리펩티드는 래트, 토끼, 마우스, 돼지 또는 소 혈청 알부민, 소 또는 돼지 티로글로불린, 오발부민, 파상풍 톡소이드, 젤라틴, 대두 트립신 억제제, 키홀 림펫 헤모시아닌 및 유사한 물질로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드는 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 이다.

한 구현예에서, 모든 다른 양태 및 구현예와 관련된 본 개시는 또한 본 개시에 다른 면역원에 특이적으로 결합하는 다클론 항체 (항체, 그 항체 단편, 및 그 항원 결합 단편 포함) 의 생산 방법을 제공한다. 방법은 하기를 포함한다: (a) 본 발명에 따른 면역원을 제공하는 것; (b) 실험 동물을 동물의 면역 시스템이 항체를 만드는 조건 하에 면역원으로 면역화하는 것; 및 (c) 동물로부터 비오틴에 특이적으로 결합하는 항체를 제거하는 것. 동물은 양, 염소, 토끼, 래트, 마우스 등일 수 있다.

본원에 개시된 바와 같은 모든 다른 양태 및 구현예와도 관련된 본 개시 및 본 발명의 또 다른 일반적인 양태는, 본 발명에 따른 항체의 생산 방법으로서, 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 실험 동물을 본 발명에 따른 면역원으로 면역시켜, B-세포를 유도하여 면역원에 결합하는 항체를 생산하는 단계, (b) 하이브리도마 기술 또는 B-세포 PCR 기술을 통해, 단계 (a) 의 B-세포에 의해 생산된 면역원에 결합하는 단일클론 항체를 수득하는 단계, (c) 비오틴에 대한 결합에 대하여 단계 (b) 의 항체를 추가로 선택하여, 본 발명에 따른 항체를 수득하는 단계.

한 구현예에서, 화학식 I 에서, R 은 Z-L 이고, Z 는 합텐이며, 이때 합텐은 비오틴 모이어티를 함유하지 않는다. 따라서, 본원에 개시된 바와 같은 모든 다른 양태 및 구현예와도 관련된 본 개시 및 본 발명의 또 다른 일반적인 양태는 하기 화학식 I 에 따른 화합물이다:

식 중, Y 는 CH₂ 또는 C=O 이고, X 는 O 또는 (CH₂)_n 이고, n 은 1 내지 20 의 정수이고, R 은 Z-L 이며, 이때 L 은 링커이고, Z 는 합텐이며, 이때 합텐은 비오틴 모이어티를 함유하지 않는다.

본 양태에 따른 화합물은 예를 들어 본 발명에 따른 면역원을 사용하여 생성된 클론 또는 단일클론 항체의 식별 방법에서 원하는 항체를 포획하는데 특히 유용하다. 이러한 항체는 화합물의 비오틴 모이어티에 특이적으로 결합할 것이며, 즉 화합물은 본 발명에 따른 원하는 항체를 포획할 수 있다. 이와 관련하여, 화합물의 포획 특이성을 유지하기 위해 합텐은 추가의 비오틴 모이어티가 아니어야 하고/하거나 추가의 비오틴 모이어티를 함유해서는 안 된다. 따라서, 비오틴이 아니고/아니거나 비오틴을 함유하지 않는 적합한 합텐은 디니트로페놀, 아닐린, 아미노벤조산, 하이드랄라진, 플루오레세인, 및 디곡시게닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, Z 는 디곡시게닌이다.

화학식 I (식 중, Y 는 CH₂ 또는 C=O 이고, X 는 O 또는 (CH₂)_n 이고, n 은 1 내지 20 의 정수이고, R 은 Z-L 이며, 이때 L 은 링커이고, Z 는 합텐이며, 이때 합텐은 비오틴 모이어티를 함유하지 않음) 에 따른 화합물의 특정 구현예는 하기 화학식 III 의 화합물이다:

.

본원에 개시된 바와 같은 모든 다른 양태 및 구현예와도 관련된 본 개시 및 본 발명의 또 다른 일반적인 양태는 본 발명에 따른 항체의 생산 방법으로서, (a) 실험 동물을 본 발명에 따른 면역원으로 면역시켜, B-세포를 유도하여 면역원에 결합하는 항체를 생산하는 단계, (b) 하이브리도마 기술 또는 B-세포 PCR 기술을 통해, 단계 (a) 의 B-세포에 의해 생산된 면역원에 결합하는 단일클론 항체를 수득하는 단계, (c) 비오틴에 대한 결합에 대하여 단계 (b) 의 항체를 추가로 선택하여, 본 발명에 따른 항체를 수득하는 단계를 포함하는 방법이다.

하이브리도마 기술에 의해 단일클론 항체를 생산하는 세포주의 생성은 당업자에게 잘 알려져 있다.

당업자에게 공지된 B-세포 PCR 기술은 B-세포로부터 총 mRNA 를 단리하고 cDNA 로 전사할 수 있다는 사실로부터 이점을 취한다. 특정 프라이머로 동족 VH- 및 VL- 영역 코딩 핵산이 증폭될 수 있다. 동일한 서열이 거의 수득되지 않는다. 방법은 동일한 항원에 결합하는 매우 다양한 항체를 제공한다.

VH-코딩 핵산의 증폭에 사용되는 프라이머는 NMRI-마우스, 아르메니아 햄스터, Balb/c-마우스 및 시리아 햄스터 및 토끼로부터 수득한 cDNA 에 사용할 수 있다.

본원에 보고된 바와 같은 모든 방법의 한 구현예에서, 아미노산 서열은 증폭된 VH-코딩 핵산으로부터 유도되며, 정확한 개시 및 종결점은 EVQL/QVQL 내지 VSS (VH-영역) 및 DIVM/DIQM 내지 KLEIK (VL-영역) 의 아미노산 서열을 위치시킴으로써 식별된다.

또한 본원에 보고된 것은 하기 단계를 포함하는 B-세포 PCR 을 사용하여 항체를 생산하는 방법이다: (a) (성숙한) B-세포 집단 (실험 비-인간 동물의 혈액으로부터 수득됨) 을 제공하는 단계, (b) B-세포 집단의 세포를 적어도 하나의 형광 염료 (한 구현예에서 1 내지 3, 또는 2 내지 3 의 형광 염료) 로 염색하는 단계, (c) 염색한 B-세포 집단의 단일 세포를 개별 용기에 침착시키는 단계 (한 구현예에서 용기는 다중 웰 플레이트의 웰이다), (d) 침착된 개별 B-세포를 피더 세포의 존재 하에 배양하는 단계, (e) 개별 B-세포의 배양 시 분비된 항체의 결합 특이성을 결정하는 단계, (f) 역전사 효소 PCR 및 뉴클레오티드 시퀀싱에 의해 특이적으로 결합하는 항체의 가변 경쇄 및 중쇄 도메인의 아미노산 서열을 결정하여, 핵산을 코딩하는 단일클론 항체 가변 경쇄 및 중쇄 사슬 도메인을 수득하는 단계, (g) 핵산을 코딩하는 단일클론 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 항체의 발현을 위한 발현 카세트에 도입하는 단계, (h) 세포에 핵산을 도입하는 단계, (i) 세포를 배양하고, 세포 또는 세포 배양 상등액으로부터 항체를 회수하여 항체를 생산하는 단계.

한 구현예에서, 비-인간 동물은 래트, 마우스, 햄스터, 토끼, 비-인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 및 파충류로부터 선택된다.

본원에 개시된 단일클론 항체의 생산 방법의 특정 구현예에서 단계 (c) 에서 선택은 화학식 I (식 중, Y 는 CH₂ 또는 C=O 이고, X 는 O 또는 (CH₂)_n 이고, n 은 1 내지 20 의 정수이고, R 은 H, 또는 Z-L 이며, 이때 L 은 링커이고, Z 는 비오틴 모이어티를 함유하지 않는 합텐 및 폴리펩티드로부터 선택됨) 에 따른 화합물에 대한 항체의 결합에 대한 경쟁자로서 비오틴을 사용하는 경쟁적 어세이에서 수행된다. 이 화합물은 이미 논의되었다. 화합물은 원하는 항체를 포획하는데 특히 유용하다. 이러한 항체는 화합물의 비오틴 모이어티에 특이적으로 결합할 것이며, 즉 화합물은 본 발명에 따른 원하는 항체를 포획할 수 있다. 이와 관련하여, 화합물의 포획 특이성을 유지하기 위해 합텐은 추가의 비오틴 모이어티가 아니어야 하고/하거나 추가의 비오틴 모이어티를 함유해서는 안 된다. 따라서, 합텐은 고체 상에 포획 시약을 고정시키는데 사용되며, 예를 들어 실시예 5 의 합텐으로서 디곡시게닌이 예시된다.

또 다른 중요한 단계는 본원에 개시된 바와 같은 면역원을 사용하여 생성되고, 본원에 개시된 바와 같은 방법에 의해 실제로 비오틴을 결합시킬 수 있는 항체, 구체적으로는 단일클론 항체의 선택 및/또는 확인이다. 이에 의해 경쟁적 결합 어세이는 수용액 중 유리 비오틴과 접촉되었을 때 항체가 비오틴을 결합시킬 수 있음을 보장한다. 따라서, 본원에 개시된 단일클론 항체의 생산 방법의 구현예에서 단계 (c) 에서 선택은 본원에 개시된 바와 같은 면역원에 대한 항체의 결합에 대한 경쟁자로서 비오틴을 사용하는 경쟁적 어세이에서 수행된다.

본원에 개시된 단일클론 항체의 생산 방법의 또 다른 구현예에서 단계 (c) 에서 선택은 화학식 III (또한 도 3 B 에 도시됨) 의 화합물에 대한 항체의 결합에 대한 경쟁자로서 비오틴을 사용하는 경쟁적 어세이에서 수행된다.

보다 일반적으로, 본원에 개시된 단일클론 항체의 생산 방법의 또 다른 구현예에서 단계 (c) 에서 선택은 화학식 I (식 중, Y 는 CH₂ 또는 C=O 이고, X 는 O 또는 (CH₂)_n 이고, n 은 1 내지 20 의 정수이고, R 은 Z-L 이며, 이때 L 은 링커이고, Z 는 합텐이며, 이때 합텐은 비오틴 모이어티를 함유하지 않음) 에 따른 화합물에 대한 항체의 결합에 대한 경쟁자로서 비오틴을 사용하는 경쟁적 어세이에서 수행된다.

본 개시의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명은 이제 양태 및 구현예에서 하기 화학식 I 의 화합물을 특이적으로 결합시키고 또한 비오틴에 결합하는 것을 특징으로 하는 신규한 단일클론 항체를 제공한다:

본 발명의 단일클론 항체는 본 발명에 따르고 본원에 개시된 바와 같은 방법에 의해 수득될 수 있다.

상기 기재한 바와 같이, 본 발명에 따른 단일클론 항체는 화학식 II 의 화합물을 결합시키지 않는 것을 특징으로 한다. 화학식 II 에서, 비오틴 모이어티는 발레르산 측쇄의 카르복실 관능기의 탄소 원자를 통해 합텐에 링커를 통해 커플링된다. 따라서, 분자는 본 발명에 따른 원하는 항체가 결합하지 않는 종래의 비오틴화 분자를 예시한다.

따라서, 본원에 개시된 바와 같은 모든 다른 양태 및 구현예와도 관련된 본 개시 및 본 발명의 또 다른 일반적인 양태는 비오틴화 분자에 결합하지 않는 항체의 생산 방법으로서, 여기서 비오틴 모이어티는 발레르산 측쇄의 카르복실 관능기의 탄소 원자를 통해 합텐에 링커를 통해 커플링되고, 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 실험 동물을 본 발명에 따른 면역원으로 면역시켜, B-세포를 유도하여 면역원에 결합하는 항체를 생산하는 단계, (b) 하이브리도마 기술 또는 B-세포 PCR 기술을 통해, 단계 (a) 의 B-세포에 의해 생산된 면역원에 결합하는 단일클론 항체를 수득하는 단계, (c) 비오틴에 대한 결합에 대하여 단계 (b) 의 항체를 선택하는 단계, 및 (d) 비오틴화 분자에 결합하지 않는 항체를 선택하여, 비오틴화 분자에 결합하지 않는 본 발명에 따른 항체를 수득하는 단계. 특정 구현예에서, 단계 (d) 는 화학식 II 의 화합물과 함께 수행된다.

따라서, 보다 구체적으로는, 화학식 II 의 화합물에 결합하지 않는 항체의 생산 방법이 개시되며, 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 실험 동물을 본 발명에 따른 면역원으로 면역시켜, B-세포를 유도하여 면역원에 결합하는 항체를 생산하는 단계, (b) 하이브리도마 기술 또는 B-세포 PCR 기술을 통해, 단계 (a) 의 B-세포에 의해 생산된 면역원에 결합하는 단일클론 항체를 수득하는 단계, (c) 비오틴에 대한 결합에 대하여 단계 (b) 의 항체를 선택하는 단계, 및 (d) 화학식 II 의 화합물에 결합하지 않는 항체를 선택하여, 화학식 II 의 화합물에 결합하지 않는 본 발명에 따른 항체를 수득하는 단계.

특히 (스트렙트)아비딘/비오틴 결합 쌍을 사용하여 비오틴화 분석물 특이적 결합제를 (스트렙트)아비딘 코팅된 고체 상에 결합시키는 샘플 중 분석물 측정 방법에서, 샘플이 매우 많은 양의 비오틴을 함유하는 경우 분석물의 측정은 부정확해질 수 있다. 이러한 이유로, 비오틴을 제거하는 것이 매우 바람직하다. 이러한 기술적 문제는 샘플 전처리, 즉 샘플이 분석물 측정 방법에 적용되기 전에 유리 비오틴을 제거하는 과정으로 해결될 수 있다. 그러나, 이는 예를 들어, 샘플을 (스트렙트)아비딘으로 코팅된 자성 입자와 혼합하고, 혼합물을 배양함으로써 비오틴을 입자에 결합시킨 다음, 입자를 자기적으로 제거하는 것과 같은, 원하지 않는 많은 수의 별개의 작업 단계를 포함할 것이다. 이러한 샘플 전처리의 접근법은 원료 및 시간과 같은 자원이 소모될 뿐만 아니라, 또한 이러한 접근법은 샘플 (예를 들어, 이의 부피 및 조성물) 이 변화하여 분석물 검출 및 측정에서 원하지 않는 효과를 야기할 수 있는 위험이 있다.

놀랍게도, 비오틴을 결합시킬 수 있고 종래의 관심 비오틴화 분자에 결합하지 않는 본 발명에 따른 단일클론 항체가 비오틴 간섭을 감소시키는 명쾌한 해결책을 제공한다는 것이 밝혀졌다. 비오틴 제거제로서 작용하는 동안, 항체의 비오틴 결합 특성은 예를 들어 (스트렙트)아비딘에 대한 비오틴화 분석물 특이적 결합제의 결합을 간섭하지 않는 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 단일클론 항체는 샘플에 존재할 수 있는 높은 수준의 비오틴에 의해 야기되는 간섭을 대응하는 것에서 강력한 수단인 것으로 밝혀졌다.

본원에 개시된 바와 같은 모든 다른 양태 및 구현예와도 관련된 본 개시 및 본 발명의 또 다른 일반적인 양태는 (스트렙트)아비딘/비오틴 쌍을 사용하여 비오틴화 분석물 특이적 결합제를 (스트렙트)아비딘 코팅된 고체 상에 결합시키는 샘플 중 분석물 측정 방법에서의 본 발명에 따른 항체의 용도이다.

본원에 개시된 바와 같은 모든 다른 양태 및 구현예와도 관련된 본 개시 및 본 발명의 또 다른 일반적인 양태는 (스트렙트)아비딘/비오틴 결합 쌍을 사용하여 비오틴화 분석물 특이적 결합제를 (스트렙트)아비딘 코팅된 고체 상에 결합시키는 샘플 중 분석물 측정 방법으로서, 샘플에 a) 본 발명에 따른 항체, b) 비오틴화 분석물 특이적 결합제, c) 스트렙타비딘 코팅된 고체 상을 첨가한 다음, (스트렙트)아비딘 및 비오틴화 분석물 특이적 결합제를 통해 고체 상에 결합된 분석물을 측정하는 것을 포함하는 방법이다.

본 개시는 분석물이 측정되어야 하고 그 측정 방법이 (스트렙트)아비딘/비오틴 결합 쌍을 사용하는 샘플에 포함된 잠재적으로 간섭하는 유리 비오틴을 제거하는 수단을 제공한다. 바람직한 제거 단계는 (스트렙트)아비딘/비오틴 쌍의 형성 전에 수행된다. 따라서, 한 구현예에서, (스트렙트)아비딘/비오틴 결합 쌍을 사용하여 비오틴화 분석물 특이적 결합제를 (스트렙트)아비딘 코팅된 고체 상에 결합시키는 샘플 중 분석물 측정 방법으로서, 샘플에 a) 본 발명에 따른 항체, b) 비오틴화 분석물 특이적 결합제, c) (스트렙트)아비딘 코팅된 고체 상을 첨가한 다음, (스트렙트)아비딘 및 비오틴화 분석물 특이적 결합제를 통해 고체 상에 결합된 분석물을 측정하는 것을 포함하고, 단계 (a) 및 임의로 또한 단계 (b) 는 단계 (c) 전에 수행되는 방법이 제공된다. 또 다른 구현예에서, 단계 (a) 및 단계 (b) 는 단계 (c) 가 수행되기 전에 동시에 수행된다. 또 다른 구현예에서, 단계 (b) 및 단계 (c) 는 단계 (a) 가 수행된 후에 동시에 수행된다. 또 다른 구현예에서, 모든 세 단계 (a), (b) 및 (c) 는 동시에 수행된다. 놀랍게도, 본 발명의 단일클론 항체는 샘플 중 분석물 측정 방법으로서, 샘플은 유리 비오틴을 함유하고, (스트렙트)아비딘/비오틴 쌍을 사용하여 비오틴화 분석물 특이적 결합제를 (스트렙트)아비딘 코팅된 고체 상 또는 표지된 (스트렙트)아비딘에 결합시키고, 샘플, 본 발명의 단일클론 항체, 비오틴화 결합제 및 (스트렙트)아비딘 코팅된 고체 상 또는 표지된 스트렙타비딘은 동시에 서로 접촉되는 방법에서 사용하기 위한 유리 비오틴의 효과적인 제거제로서 기술적으로도 적합하다.

본원에 개시된 바와 같은 분석물 검출 및/또는 측정의 모든 양태 및 구현예와 관련하여, 수성 액체 샘플은 본 개시에 따른 방법에서 분석물의 특이적인 인 비트로-검출에 사용될 수 있다. 샘플은 분석물을 포함하는 것으로 공지될 수 있거나 또는 이것은 분석물을 포함하는 것으로 의심될 수 있다. 하나의 구현예에서 본 개시내용에 따른 방법에서 사용되는 인 비트로 진단을 위한 샘플은 전혈, 혈청, 혈장, 리쿼(liquor), 소변 또는 타액으로부터 선택된 체액이다. 하나의 구현예에서 분석물을 포함하는 또는 포함하는 것으로 의심되는 샘플은 혈청, 혈장 또는 리쿼이다. 하나의 구현예에서 분석물을 포함하는 또는 포함하는 것으로 의심되는 샘플은 혈청 또는 혈장이다.

본원에 개시된 바와 같은 모든 다른 양태 및 구현예와도 관련된 본 개시 및 본 발명의 또 다른 일반적인 양태는 적어도 (a) 본 발명에 따른 청구항 중 어느 하나에 따른 항체, (b) 비오틴화 분석물 특이적 결합제, 및 (c) (스트렙트)아비딘 코팅된 고체 상을 별도의 용기에 포함하는 면역 어세이 시험 키트이다.

용어 단일 용기 유닛은 많은 자동 분석기, 예컨대 Elecsys® 분석기 시리즈 (Roche diagnostics) 에 대해, 특정 분석물을 측정하는데 필요한 시약은 "시약 팩" 의 형태로, 즉, 분석기 상에 피팅되고 상이한 구획 내에 관심의 분석물의 측정에 필요한 핵심 시약 모두를 함유하는 하나의 용기 유닛으로서 제공된다는 사실에 관한 것이다.

하나의 구현예에서 본 발명은 상기 결합 쌍의 제 1 파트너가 아비딘 또는 스트렙타비딘이고, 상기 결합 쌍의 상기 제 2 파트너가 비오틴 또는 비오틴 유사체, 예컨대 아미노비오틴, 이미노비오틴 또는 데스티오비오틴으로부터 선택되는 키트에 관한 것이다.

하기의 실시예 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 이의 진정한 범주는 첨부된 청구항에 기재된다. 본 발명의 취지를 벗어나지 않고 기재된 절차에 변형이 가해질 수 있다는 것을 이해한다.

도 1 A: D(+)-비오틴; B: D(+)-비오틴
도 2 a 및 b: 실시예 1 및 2 의 합성 반응식
도 3 A: 화학식 II 의 화합물; B: 화학식 III 의 화합물
도 4 항체 동역학적 스크리닝 어세이로부터의 예시적인 동역학적 특징. 점선: Dig-비오틴-컨쥬게이트-M-19.11-Fab' 복합체 주입의 SPR 결합 신호. 실선: 300 nM d-비오틴을 보충한 Dig-비오틴-컨쥬게이트-M-19.11-Fab' 복합체의 SPR 결합 신호. 전형적으로, 세 가지 부류의 유리 d-비오틴 블로킹 동역학이 관찰되었다. A: 완벽한 d-비오틴 경쟁. B: 중간 정도의 d-비오틴 블로킹. C: d-비오틴에 의한 신호 간섭 없음. 이후의 상세한 조사를 위해 적합한 항체 후보를 부류 A 및 B 로부터 선택하였다.
도 5 선두 항체 후보 클론 G SPR IC50 측정의 예시적인 SPR 센서그램 오버레이 플롯. 270 nM Dig-비오틴-컨쥬게이트를 270 nM (도시되지 않음), 90 nM, 30 nM (2 회), 10 nM, 3.3 nM 및 1 nM 의 유리 d-비오틴 농축물과 혼합하였다. 90 nM 유리 d-비오틴 농축물을 함유하는 혼합물이 가장 낮은 응답 신호를 생성하였고, 1 nM 유리 d-비오틴이 가장 높은 신호를 생성하였다 (표시됨). X 는 IC50 계산에 사용된 리포트 포인트의 위치를 나타낸다.
도 6A 동역학적 스크리닝 어세이 실험 SPR 설정. 먼저, 예비 형성된 Dig-비오틴-컨쥬게이트-M-19.11-Fab' 를 분자량이 증가된, 컨쥬게이트된 d-비오틴에 대한 결합을 모니터링하기 위해 용액 중 분석물로서 사용하였다. 둘째로, d-비오틴을 분석물 혼합물에 첨가하여 컨쥬게이트 결합과 경쟁하게 하였다.
도 6B SPR 어세이 실험 설정. Dig-비오틴-컨쥬게이트 상호 작용을 d-비오틴 농도 시리즈의 존재 및 부재 하에 측정하였다. d-비오틴의 부재 하에, 농도 의존적 시리즈의 Dig-비오틴-컨쥬게이트를 사용하여 토끼 항체 동역학 대 Dig-비오틴-컨쥬게이트를 결정하였다. IC50 측정은 분석물 샘플 혼합물 중 일정한 농도의 Dig-비오틴-컨쥬게이트 및 증가하는 농도의 유리 d-비오틴으로 수행되었다.
도 6C 대안적인 SPR 어세이 실험 설정. Dig-비오틴-컨쥬게이트 상호 작용을 d-비오틴 농도 시리즈의 존재 및 부재 하에 측정하였다. d-비오틴의 부재 하에, 농도 의존적 시리즈의 Dig-비오틴-컨쥬게이트를 사용하여 토끼 항체 동역학 대 Dig-비오틴-컨쥬게이트를 결정하였다. 이 경우, Dig-비오틴-컨쥬게이트는 표면 표시된 M-19.11 항체에 의해 포획되는 반면, 토끼 항체 또는 이의 단편은 용액 중 농도 의존적 분석물로서 사용되었다. IC50 측정은 분석물 샘플 혼합물 중 일정한 농도의 토끼 항체 및 증가하는 농도의 유리 d-비오틴으로 수행되었다.

실시예 1

N'1 원자에서의 비오틴의 유도체화

(1) FMOC-베타-알라닌-산 클로라이드

건조 조건 하의 플라스크 내의 4.7 g FMOC-베타-알라닌 (IRIS, FAA1300) 에 약 20 ㎖ 티오닐 클로라이드를 천천히 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 50 min 동안 교반한 후, 10 min 분 동안 환류하에 가열하였다. 냉각 후, 혼합물을 증발시키고, 잔류물을 무수 톨루엔에 3 회 용해키시고, 매회 증발시켰다.

수득량은 5.1 g 이었다.

(2) FMOC-베타-알라닐-비오틴

[Fang and Bergstrom in Nucleic Acids Research, 2003, Vol. 31, No. 2, 708] 에 기재되어 있는 바와 같이 아르곤의 불활성 분위기에서 실온에서 DMAP (0.63 g) 의 존재하에 밤새 15 ㎖ 건조 피리딘 중 t-부틸클로로디페닐실란 (6.5 ㎖) 과 비오틴 (2.48 g) 을 반응시켜 비오틴의 카르복실산을 보호하였다.

10 ㎖ 디클로로메탄에 용해시킨 4.9 g FMOC-베타-알라닌-산 클로라이드를 첨가하고, 실온에서 3.5 h 동안 교반하였다. 혼합물을 증발시키고, DMF 를 첨가하고, 다시 증발시켰다. 잔류물을 DMF-H₂O (3:1) 에 용해시키고, 50 mmol 포타슘 카르보네이트를 첨가하고, 혼합물을 30 min 동안 교반하였다. 시트르산으로 pH 4 로 산성화시킨 후, 생성물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 칼럼 크로마토그래피 (실리카, 용리액 에틸 아세테이트/메탄올) 로 정제하였다.

HPLC-ESI-MS: M⁺ = 538.3 Da. 수득량은 1.5 g 이었다.

(3) 베타-알라닐-비오틴 = 5-[3-(3-아미노-프로피오닐)-2-옥소-헥사하이드로-티에노[3,4-d]이미다졸-6-일]-펜탄산

FMOC 보호기는 1.67 g FMOC-베타-알라닐-비오틴을 DMF (60 ㎖) 중 20% 피페리딘의 혼합물에 용해시켜 절단되었다. 혼합물을 증발시키고, 진공 하에 건조하였다. 그 후, 생성물을 역상 실리카 및 H₂O-아세토니트릴 구배를 사용하여 분취 HPLC 로 단리하였다.

HPLC-ESI-MS: M⁺ = 316.3 Da. 수득량은 0.55 g 이었다.

실시예 2

면역원의 합성

(4) 석신이미딜-수베릴-베타-알라닐-비오틴 = 7-{3-[6-(4-카복시-부틸)-2-옥소-헥사하이드로-티에노[3,4-d]이미다졸-3-일]-3-옥소-프로필카바모일}-헵탄산 2,5-디옥소-피롤리딘-1-일 에스테르

24 mg 디석신이미딜 수베르에이트 10 ㎕ 트리메틸아민을 10 ㎖ 플라스크에 첨가한 후, 1 ㎖ DMF 에 용해된 10 mg 베타-알라닐-비오틴을 첨가하였다. 30 min 동안 교반한 후, 용매를 진공 하에 제거하였다. 잔류물을 분취 HPLC 로 정제하였다.

HPLC-ESI-MS: M⁺ = 569.3 Da. 수득량은 12 mg 이었다.

(5) 항원 컨쥬게이트 = KLH-SUB-베타-ala-비오틴

상기 실시예 1 에서 기재한 바와 같이 합성된 10 mg 의 NHS 에스테르를 1000 ㎕ DMSO 에 용해시키고 100 mg KLH (키홀 림펫 헤모시아닌, Sigma H 8283) 의 용액에 첨가하였다. pH 를 pH = 8.3 으로 조정하고 용액을 밤새 교반하였다. 혼합물을 Amicon 교반 셀에서 정제하였다.

아미노 기 분석: 항원-KLH 비 - 약 500:1

실시예 3

단일클론 항체 스크리닝 시약의 합성

(1) Dig-3-CME-AMCAP-DADOO-비오틴

디곡시게닌-3-CME-AMCAP-NHS 에스테르 (다른 명칭: 디곡시게닌 NHS-에스테르, 카드-20(22)-에놀리드, 3-[2-[[6-[(2,5-디옥소-1-피롤리디닐)옥시]-6-옥소헥실]아미노]-2-옥소에톡시]-12,14-디하이드록시-, (3β,5β,12β)-) = CAS 번호 129273-26-3 은 DE3836656A1 에 기재된 바와 같이 합성되거나, 시판 제품 (Merck-Sigma) 으로 수득되었다.

21 mg 디곡시게닌-3-CME-AMCAP-NHS 에스테르를 3 ㎖ DMF 에 용해시키고, 6 ㎕ 트리메틸아민을 첨가하였다. 그 후, 14 mg 비오틴-DADOO 을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2 h 동안 교반하였다. 용매를 증발에 의해 제거하고, 생성물을 분취 HPLC 크로마토그래피로 단리하였다.

HPLC-ESI-MS: M⁺ = 918.7 Da. 수득량: 23 mg.

(2) Dig-3-CME-AMCAP-베타-ala-비오틴

베타-알라닐-비오틴 = 베타-ala-비오틴 = 5-[3-(3-아미노-프로피오닐)-2-옥소-헥사하이드로-티에노[3,4-d]이미다졸-6-일]-펜탄산을 상기 기재한 바와 같이 합성하였다 (실시예 1).

20 mg 디곡시게닌-3-CME-AMCAP-NHS 에스테르를 3 ㎖ DMF 에 용해시키고, 6 ㎕ 트리메틸아민을 첨가하였다. 그 후, 10.5 mg 베타-ala-비오틴을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 3.5 h 동안 교반하였다. 용매를 증발에 의해 제거하고, 생성물을 분취 HPLC 크로마토그래피로 단리하였다.

HPLC-ESI-MS: M⁺ = 859.6 Da. 수득량: 16 mg.

실시예 4

유리-비오틴 결합 항체의 생산을 위한 토끼의 면역화

본 개시에서 유리 비오틴을 제거하는 능력을 갖는 항체의 개발이 보고되었다. 이를 위해 본 발명자들은 비오틴의 발레르산 모이어티의 COOH-기가 접근 가능하고 컨쥬게이션에 사용되지 않은 경우에만 비오틴에 결합하는 항체를 생산하였다. 본 발명에 따른 항체는 비오틴화 분자, 즉 비오틴이 카르복실 기의 탄소 원자를 통해 공유 결합된 통상적인 비오틴-컨쥬게이트에 결합하지 않는다.

이러한 항체를 생성하기 위해, 12-16-주령 NZW 토끼를 KLH-SUB-베타-ala-비오틴으로 면역화하였다 (상기 실시예 2 참조). 모든 토끼를 반복하여 면역화하였다. 첫 달에는 동물을 매주 면역화하였다. 두 번째 달 이후에는 동물을 한 달에 한 번 면역화하였다. 첫 번째 면역화를 위해, 500 ㎍ KLH-SUB-베타-ala-비오틴을 1 ㎖ 140 mM NaCl 에 용해시키고, 1 ㎖ CFA (프로인드 완전 아쥬반트: complete Freund's adjuvans) 에 에멸젼화시켰다. 이후의 모든 면역화에 대해서는, CFA 를 IFA (프로인드 불완전 아쥬반트: incomplete Freund's adjuvans) 로 대체하였다. 면역화 시작 후 45 일째에 동물들의 역가를 평가하였다.

실시예 5

면역화된 동물의 항체 역가 분석

혈청 적정의 실험 설정은 (i) 통상적인 유형의 컨쥬게이트된 비오틴, 즉 발레르산 모이어티의 카르복실 관능기의 탄소 원자를 통해 담체에 컨쥬게이트된 비오틴과, (ii) 우레이도 고리의 N'₁ 원자가 담체에 공유 부착된 컨쥬게이트된 비오틴을 구별할 수 있는 다클론 항체의 양을 결정하도록 고안되었다. 실시예 3 및 도 3 A 및 B 는 (i) 에 대하여 예시적인 화합물 (1) Dig-3-CME-AMCAP-DADOO-비오틴 (화학식 II 의 화합물), 및 (ii) 에 대하여 예시적인 화합물 (2) Dig-3-CME-AMCAP-베타-ala-비오틴 (화학식 III 의 화합물) 을 제공한다.

따라서, 96 웰 플레이트를 먼저 5 ㎍/㎖ 의 다클론 양 항-Dig 항체 (Sigma) 로 코팅한다. 세척 단계 후, 플레이트를 5% BSA (Roche) 로 블로킹하여 백그라운드 신호를 감소시켰다. 상이한 비오틴-Dig 컨쥬게이트 (CME-AMCAP-베타-ala-비오틴 및 Dig-3-CME-AMCAP-DADOO-비오틴) 를 포획하기 위해, 항-Dig 코팅된 플레이트를 250 ng/㎖ 의 컨쥬게이트와 별도의 웰에서 배양하였다. 추가적인 세척 단계 후, 토끼 혈청을 1% BSA 를 함유하는 PBS 에 희석하고, 희석액을 플레이트에 첨가하였다. 혈청을 1:300, 1:900, 1:2,700, 1:8,100, 1:24,300, 1:72,900, 1:218,700 및 1:656,100 희석에서 시험하였다. 결합된 항체는 기질로서 HRP-표지된 F(ab')₂ 염소 항-토끼 Fcγ (Dianova) 및 ABTS (Roche) 에 의해 검출되었다. 분석된 동물의 역가는 희석 곡선의 50% 신호 감소로 설정되었다.

추가의 음성 대조군으로서, 플레이트를 또한 상이한 종래의 비오틴화 분자, 펩티드-비오틴 컨쥬게이트 (CD68-bi), 재조합 단백질-비오틴 컨쥬게이트 (CD4-bi) 및 재조합 F(ab')₂-비오틴 컨쥬게이트 rK-F(ab')₂ 로 코팅하였다. 3 개의 음성 대조군 모두에서, 비오틴은 발레르산 모이어티의 카르복실 관능기의 탄소 원자를 통해 링커에 커플링되었으며, 따라서 다클론 혈청에 의해 검출되어서는 안 된다. 표 2 는 그 결과를 보여준다.

3 마리의 면역화된 동물로부터의 다클론 혈청만 면역원과 유사하고 발레르산 측쇄의 COOH-기가 접근 가능한 Dig-3-CME-AMCAP-베타-ala-비오틴에 결합한다는 것이 밝혀졌다. 비오틴이 발레르산 모이어티의 카르복실 관능기의 탄소 원자를 통해 각각의 담체에 커플링된 모든 스크리닝 시약, rK-F(ab')₂, CD68-bi, CD4-bi 및 Dig-3-CME-AMCAP-DADOO-비오틴은 약하게 검출되거나 전혀 검출되지 않았다.

실시예 6

유리-비오틴에 결합하는 단일클론 항체의 개발

용액 중 비오틴 (즉, 유리 비오틴) 에 결합할 수 있고 종래의 비오틴화 표적과 교차 반응성이 없는 항체의 개발을 위해, Seeber et al. (2014), PLoS One. 2014 Feb 4;9(2) 에 기재되어 있는 바와 같은 B-세포 클로닝을 사용하였다. 항원 반응성 B-세포의 풍부화를 위해, 비오틴화 마우스 항-Dig 항체 (Roche) 를 스트렙타비딘 코팅된 마그네틱 비드 (Miltenyi) 에 결합시켰다. 그 후, 면역화된 동물의 PBMC 풀을 제조하고, 250 ng/㎖ Dig-3-CME-AMCAP-베타-ala-비오틴과 배양하였다. 1 h 의 배양 후, 세포를 PBS 로 세척하고, 사전-코팅된 항-Dig 마그네틱 비드와 배양하였다. 항원-반응성 B-세포의 풍부화를 위해, MACS 칼럼 (Miltenyi) 을 사용하였다. B-세포 저장 및 배양을 Seeber et al. (2014), PLoS One. 2014 Feb 4;9(2) 에 기재되어 있는 바와 같이 수행하였다. ELISA 를 수행하기 24 h 전에, 항원-반응성 클론을 식별하기 위해, 2 ㎍/㎖ 스트렙타비딘을 세포 배양 상등액에 첨가하여 유리 비오틴을 중화시켰다. 이는 세포 기원의 배양 배지 중 유리 비오틴이 상등액 중 항체와 스크리닝 시약 Dig-3-CME-AMCAP-베타-ala-비오틴 (화학식 III) 의 상호 작용을 차단할 수 있기 때문에 예방 조치로 수행되었다. ELISA 를 위해, 96 웰 플레이트를 5 ㎍/㎖ 다클론 염소 항-토끼-IgG 항체로 코팅하였다. 세척 단계 후, 플레이트를 5% BSA 로 블로킹하여 백그라운드 신호를 감소시켰다. 플레이트를 다시 세척하고, 30 ㎕ 의 토끼 B-세포 배양물을 96 웰 플레이트로 옮기고, 실온에서 1 h 동안 배양하였다. 또 다른 세척 단계 후, 50 ng/㎖ 의 양성 스크리닝 시약, Dig-3-CME-AMCAP-베타-ala-비오틴, 또는 음성 스크리닝 시약, Dig-3-CME-AMCAP-DADOO-비오틴 (화학식 II) 을 웰에 첨가하고, 실온에서 1 h 동안 배양하였다. 스크리닝 시약에 결합된 항체의 검출을 위해, 3 ㎍/㎖ 의 POD 표지된 다클론 양 항-Dig-항체를 플레이트에 첨가하였다. 최종 세척 단계 후, ABTS (Roche) 를 POD 기질에 첨가하고, 405 nm 에서 OD 를 측정하여 양성 클론을 식별하였다. 결과를 표 3 에 나타냈다.

실시예 7

단일클론 항체에 의한 비오틴의 결합

새롭게 생성된 원하는 항체 (표 3 에 나타낸 클론으로 표시되는 것들 포함) 가 유리 비오틴에 추가적으로 결합한다는 것을 입증하기 위해, 경쟁 ELISA 어세이를 고안하고 수행하였다.

이러한 목적을 위해, 항체는 우선 Seeber et al. (2014), PLoS One. 2014 Feb 4;9(2) 에 기재되어 있는 바와 같이 클로닝되었다. 항체 함유 상등액을 생성하기 위해, HEK 세포를 항-비오틴 항체의 관련 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 플라스미드로 일시적으로 형질 감염시켰다. 1 주의 배양 시간 후, 일시적 형질 감염에서의 항-비오틴 항체의 농도를 측정하고, 선택된 클론의 각 농도를 5 ㎍/㎖ 로 조정하였다.

ELISA 를 위해, 96 웰 플레이트를 5 ㎍/㎖ 다클론 염소 항-토끼-IgG 항체로 코팅하였다. 세척 후, 플레이트를 5% BSA 로 블로킹하여 백그라운드 신호를 감소시켰다. 플레이트를 다시 세척하고, 일시적 형질 감염 (5 ㎍/㎖) 으로부터의 항체 상등액 30 ㎕ 를 96 웰 플레이트의 각 웰로 옮기고, 실온에서 1 h 동안 배양하였다.

각각의 선택된 클론을 8 개의 상이한 웰에 연속적으로 첨가하여 비오틴 적정을 수행하였다.

배양 후, 플레이트를 다시 3 회 세척하여 클론 상등액에 존재하는 스트렙타비딘/비오틴 복합체를 제거하였다. 양성 대조군의 경우, 50 ng/㎖ 의 양성 스크리닝 시약, Dig-3-CME-AMCAP-베타-ala-비오틴 (화학식 III) 을 각 항체의 웰 중 하나에 첨가하고, 실온에서 1 h 동안 배양하였다.

유리 비오틴의 결합을 시험하기 위해 적정을 수행하였다. 이러한 목적을 위해, 유리 비오틴을 농도를 증가시키면서 Dig-3-CME-AMCAP-베타-ala-비오틴에 첨가하였다. 비오틴을 10 ng/㎖, 20 ng/㎖, 40 ng/㎖, 80 ng/㎖, 160 ng/㎖, 320 ng/㎖ 및 640 ng/㎖ 의 농도로 소정량의 50 ng/㎖ Dig-3-CME-AMCAP-베타-ala-비오틴에 첨가하였다. 그 후, 플레이트를 다시 세척하고, Dig-3-CME-AMCAP-베타-ala-비오틴에 결합된 항체를 검출하기 위해, 3 ㎍/㎖ 의 POD 표지된 다클론 양 항-Dig-항체를 플레이트에 첨가하였다. 최종 세척 단계 후, ABTS (Roche) 를 POD 기질로서 첨가하고, 405 nm 에서 OD (광학 밀도) 를 측정하여 신호를 검출하였다. 특히, 신호 감소는 스크리닝 시약의 존재 하에 증가하는 비오틴 농도의 결과로서 감소된 것으로 관찰되었다. 이는 유리-비오틴 용액과 Dig-3-CME-AMCAP-베타-ala-비오틴이 선택된 항체에 대한 결합에 경쟁하고 있음을 나타낸다.

실시예 8

면역 어세이에서 비오틴 간섭에 대한 대응

Elecsys TSH 어세이를 위한 대조군 샘플, PreciControl Universal 2 에 증가하는 농도의 비오틴 (예를 들어, 0, 100 및 200 ng/㎖ 최종 농도의 비오틴) 을 첨가하였다.

항 TSH 검출- 항체를 함유하는 Elecsys TSH 판매 키트의 시약 2 이 변형되지 않은 버전 (대조군), 및 300 ㎍/㎖ 의 본 발명에 따른 단일클론 항 비오틴 항체를 추가로 함유하는 변형된 버전으로 사용된다.

샌드위치 어세이는 Elecsys TSH 어세이에 대한 통상의 어세이 프로토콜에 따라 수행하였다: 요약하자면, 50 ㎕ 의 샘플 (비오틴을 함유하거나 함유하지 않는PreciControl Universal 2) 을 60 ㎕ 의 비오틴화 항-TSH 항체를 함유하는 Elecsys TSH 키트의 시약 1 및 50 ㎕ 의 300 ㎍/㎖ 의 단일클론 항 비오틴 항체를 추가로 첨가하거나 첨가하지 않은 루테닐화 항-TSH 항체를 함유하는 시약 2 와 배양하였다. 37 ℃ 에서 9 min 동안 배양 후, Elecsys TSH 키트의 스트렙타비딘 코팅된 마그네틱 비드의 현탁액 40 ㎕ 를 첨가하고, 반응물을 추가의 9 min 동안 배양하고, 마지막으로 반응 혼합물을 전극 표면에 마이크로입자가 자기적으로 포획되는 측정 셀로 흡인한다. 그 후, 결합되지 않은 물질을 ProCell 로 제거하였다. 전극에 전압을 가한 후 광전자 증배관으로 측정되는 전기 화학 발광-기반 발광을 유도한다.

표 4 는 상이한 항-비오틴 제거제 항체 클론을 함유하거나 함유하지 않는 TSH-시약 변형에 대하여 수득된 신호를 나타낸다.

대조군 시약을 사용하면, 샘플 중 100 또는 200 ng/㎖ 비오틴의 존재는 기준 신호 (비오틴을 함유하지 않는 샘플) 의 53% 또는 16% 로의 현저한 신호 저하를 발생시킨다.

이와는 대조적으로, 시약 R2 에서 비오틴 결합 항체를 함유하는 키트의 변형된 버전에서, 비오틴의 간섭 효과는 현저하게 감소된다.

실시예 9

동역학적 항체 스크리닝

동역학적 스크리닝은 37 ℃ 에서 GE Healthcare Biacore 4000 기기에서 수행되었다. Biacore CM5 시리즈 S 센서를 기기에 장착하고, 유체 역학으로 다루고, 제조사의 지침에 따라 사전 컨디셔닝하였다. 시스템 완충액은 HBS-EP (10 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.05 % (w/v) P20) 였다. 샘플 완충액은 1 mg/㎖ CMD (카르복시메틸덱스트란, Fluka) 가 보충된 시스템 완충액이었다.

토끼 항체 포획 시스템은 바이오센서에서 확립되었다. 다클론 염소 항-토끼 IgG Fc 포획 항체 GARbFcγ (코드 번호: 111-005-046, lot# 105332, Jackson Immuno Research) 를 NHS/EDC 화학을 사용하여 제조사의 지침에 따라 고정시켰다. 10 mM 소듐 아세테이트 완충액 (pH 4.5) 중 30 ㎍/㎖ GARbFcγ 를 플로우 셀 1, 2, 3 및 4 의 스팟 1, 2, 4 및 5 에서 예비 농축하고, 10.000 RU GARbFcγ 로 고정시켰다. 그 후, 센서를 1 M 에탄올아민을 사용하여 pH 8.5 로 포화시켰다. 스팟 1 및 5 는 상호 작용 측정에 사용하고 스팟 2 및 4 는 기준으로 사용하였다. 각각의 토끼 항체 클론 현탁액을 샘플 완충액에 1:2 로 희석하고 1 min 동안 30 ㎕/min 의 유량으로 주입하였다. 토끼 항체 포획 수준 (CL) 을 반응 단위 (RU) 로 모니터링하였다.

Dig-비오틴-컨쥬게이트의 분자량 0.9 kDa 이 SPR 스크리닝 기기의 감도 범위에 대하여 너무 작기 때문에, 300 nM Dig-비오틴-컨쥬게이트 (Dig-3-cme-Amcap-β-Ala-비오틴 (BMO No. 15420318)) 를 실온에서 2 시간 동안 900 nM <Dig>M-D.G-Fab' 와 사전 배양하였다. mAb<Dig>M-D.G-Fab 는 KD 5 pM 친화도를 갖는 디곡시게닌에 결합한다. M-D.G-Fab' 는 또한 Dig-비오틴-컨쥬게이트의 디곡시게닌 모이어티에 피코몰의 친화도도 결합하고, GARbFcγ 포획 시스템과 간섭하지 않는다. M-D.G-Fab' 는 항-비오틴 토끼 클론 및 유리 d-비오틴과 간섭하지 않는다. 50 kDa M-D.G-Fab' 를 사용하여, 0.9 kDa Dig-비오틴-컨쥬게이트에 추가적인 질량을 로딩하였다. 이는 50.9 kDa 분자량을 갖는 매우 안정한 면역 복합체를 생성하는데, 이는 SPR 스크리닝 기기의 감도 범위에 최적이다. M-D.G-Fab' 는 단량체성이고, 분석물 결합활성(avidity) 효과는 생성되지 않았고 검출되지 않았다. 예비 형성된 Dig-비오틴-컨쥬게이트-M-D.G-Fab' 복합체를 5 min 동안 30 ㎕/min 로 단독 주입하여 각각의 표면 표시된 항-비오틴 토끼 mAb 에 대한 회합 단계를 모니터링하였다. 토끼 클론으로부터의 컨쥬게이트의 해리를 5 min 동안 모니터링하였다. 동역학 속도 결정의 각 사이클 후, 20 ㎕/min 에서 10 mM 글리신 pH 2.0 의 1 min 주입, 이어서 10 mM 글리신 pH 2.25 의 2 min 주입으로 토끼 클론을 바이오센서 포획 시스템으로부터 완전히 세척하였다.

두 번째 스크리닝 설정에서, d-비오틴 결합 간섭에 민감한 토끼 항-비오틴 항체가 식별되었다. 300 nM Dig-비오틴-컨쥬게이트, 900 nM <Dig>M-D.G-Fab' 및 300 nM 유리 d-비오틴 (d-비오틴, CAS 번호: 58-85-5, 카탈로그 번호: 47868, Supelco) 으로 이루어진 분석물 혼합물을 실온에서 밤새 배양하여 제조하였다. 상기 기재한 바와 같이 그러나 이 용액 중 분석물 혼합물을 사용하여 동역학적 스크리닝을 수행하였다. 또 다른 구현예에서, 상이한 Dig-비오틴-컨쥬게이트 및 <Dig>M-D.G-Fab' 농도가 사용되었다.

도 6 은 스크리닝에 대한 실험 설정을 설명한다. 이 방법으로 수천 개의 토끼 항체를 시험하였다.

Biacore 4000 Evaluation 소프트웨어를 사용하여 분석물 단일 농도 동역학의 동역학 흔적을 모니터링하였다. 또한, 동역학 데이터는 리포트 포인트 특징 분석 및 동역학 결정에 의해 해석되었다. 2 개의 리포트 포인트, 분석물 주입 종료 바로 직전에 기록된 신호, 말기 결합 (Binding Late: BL) 및 해리 시간 종료 직전의 신호, 말기 안정성 (Stability Late: SL) 를 사용하여 분석물/항원 결합 안정성을 특징 분석하였다. 또한, 해리 속도 상수 k _d (1/s) 를 Langmuir 모델에 따라 계산하고 식 ln(2)/(60*kd) 에 따라 항체/항원 복합체 반감기를 분 단위로 계산하였다. 식: MW (항체) / MW(항원) * BL (항원) / CL (항체) 을 사용하여, 몰비, 결합 화학량을 계산하였다.

마지막으로, 각각의 항-비오틴 토끼 mAb 동역학 흔적을 하나의 분석 플롯으로 오버레이하였다. 주로 이들 오버레이 플롯을 육안으로 검사하여, 300 nM 유리 d-비오틴의 존재 하에 유효한 Dig-비오틴-컨쥬게이트 결합 신호 감소를 나타내는 항체를 선택하였다. 유효한이란, 90% 초과의 Dig-비오틴-컨쥬게이트 결합 신호 감소를 의미한다. 또 다른 구현예에서, 80%, 70%, 60%, 및 50% 신호 감소를 나타내는 항체를 선택하였다. 선택된 항체를 상세한 IC50 분석으로 옮겼다.

도 4 는 SPR 기반 동역학적 스크리닝으로 측정한 3 가지 항체 블로킹 특징을 예시적으로 도시한다. 부류 A 는 Dig-비오틴-컨쥬게이트 결합의 완전한 d-비오틴 블로킹을 도시한다. 부류 B 는 d-비오틴 신호 간섭에 대한 중간 정도의 감도를 갖는 항체를 특징으로 하고, 부류 C 는 d-비오틴에 민감하지 않다.

상세한 SPR 기반 기능 분석

상세한 동역학 연구를 37 ℃ 에서 GE Healthcare T200 기기 에서 수행하였다. Biacore CM5 시리즈 S 센서를 기기에 장착하고, 유체 역학으로 다루고, 제조사의 지침에 따라 사전 컨디셔닝하였다. 시스템 완충액은 HBS-EP (10 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.05 % (w/v) P20) 였다. 샘플 완충액은 1 mg/㎖ CMD (카르복시메틸덱스트란, Fluka) 가 보충된 시스템 완충액이었다.

한 구현예에서, 토끼 항체 포획 시스템이 CM5 바이오센서에서 확립되었다. 다클론 염소 항-토끼 IgG Fc 포획 항체 GARbFcγ (코드 번호: 111-005-046, lot# 105332, Jackson Immuno Research) 를 NHS/EDC 화학을 사용하여 제조사의 지침에 따라 고정시켰다. 10 mM 소듐 아세테이트 완충액 (pH 4.5) 중 30 ㎍/㎖ GARbFcγ 를 플로우 셀 1, 2, 3 및 4 에서 예비 농축하고, 10.000 RU GARbFcγ 로 고정시켰다. 그 후, 센서를 1 M 에탄올아민을 사용하여 pH 8.5 로 포화시켰다.

초기 동역학적 스크리닝 단계로부터 선택된 토끼 항체 클론을 각각 샘플 완충액에 500 nM 로 희석하고, 5 ㎕/min 의 유량에서 2 min 동안 바이오센서로 포획한 후, 60 ㎕/min 로 10-배 농축된 HBS-EP 시스템 완충액으로 2 min 세척 단계를 수행하였다. 토끼 항체 포획 수준 (CL) 을 반응 단위 (RU) 로 모니터링하였다. T200 기기의 보다 높은 감도는 <Dig>M-D.G-Fab' 에 의한 추가적인 분자량 로드를 회피하였다. 일련의 분석물을 60 ㎕/min 로 5 min 동안 주입하고 회합 단계 및 해리 단계를 5 min 동안 모니터링하였다. 먼저, Dig-비오틴-컨쥬게이트 분석물을 용액 중 d-비오틴을 생략하고 300 nM 로 주입하였다. 그 다음, d-비오틴 농도를 4 nM, 8 nM, 15nM, 30 nM, 90 nM 및 270 nM 로 증가시켜 Dig-비오틴-컨쥬게이트 혼합물에 첨가하였다. 센서그램 오버레이 플롯을 만들어 증가하는 d-비오틴 농도 하의 Dig-비오틴-컨쥬게이트 결합 신호 억제를 분석하였다. 분석물 회합 단계의 신호 고원(plateau)으로부터의 말기 결합 리포트 포인트를 증가하는 d-비오틴 농도에 대하여 플롯하고, d-비오틴 IC50 값을 Biaevaluation 소프트웨어의 포인트-투-포인트 모드를 사용하여 결정하였다. 또한, 센서그램 오버레이 플롯을 d-비오틴의 경쟁 성능에 대하여 시각적으로 연구하고, % 신호 억제를 추정하였다. 또 다른 구현예에서, % 신호 블로킹을 0 nM d-비오틴 및 270 nM d-비오틴 샘플 주입의 비교에 의해 계산하였다.

도 6 은 IC50 측정의 SPR 실험 설정을 도시한다. 도 6B 는 바람직한 구현예를 도시한다.

도 5 은 이 경쟁 어세이의 결과를 예시적으로 도시한다. 나타낸 것은 항체 선두 후보 G 이다. 샘플 중 유리 d-비오틴 농도가 높을수록, Dig-비오틴-컨쥬게이트 결합 신호가 낮으며, 따라서 d-비오틴 결합에 대한 항체의 민감성이 추정된다. 클론 G 의 IC50 결정은 IC50 = 30 nM d-비오틴이었다.

또 다른 구현예에서, Dig-비오틴-컨쥬게이트 결합 항체의 동역학 파라미터 ka [1/Ms], kd [1/s], t1/2 diss [min], KD [M] 및 결합 화학량 (몰비) 을 결정하였다.

클론 G 의 37 ℃ 동역학을 ka = 5.8*10E5 1/Ms, kd = 2.1*10E-2 (1/s), t1/2 diss = 1 min, MR = 1.2 로 결정하였다. Dig-비오틴-컨쥬게이트에 대한 친화도는 KD = 36 nM 이었다.

클론 A 의 37 ℃ 동역학을 ka = 1.0*10E6 1/Ms, kd = 3.0*10E-4 (1/s), t1/2 diss = 39 min, MR = 1.5 로 결정하였다. Dig-비오틴-컨쥬게이트에 대한 친화도는 KD = 0.3 nM 이었다.

한 구현예에서, T200 기기 어세이 설정은 상기 기재한 바와 같았다. Dig-비오틴-컨쥬게이트는 0 nM, 4 nM, 8 nM, 15nM, 30 nM, 90 nM 및 270 nM 의 농도 시리즈로 주입하였다. 동역학 파라미터는 Biacore 평가 소프트웨어를 사용하여 결정하였다.

또 다른 구현예에서, Dig-비오틴-컨쥬게이트 항체 결합의 동역학 파라미터 ka [1/Ms], kd [1/s], t1/2 diss [min], KD [M] 및 결합 화학량 (몰비) 을 대안적인 센서 표면 설정에 의해 결정하였다. 한 구현예에서, 쥐 항체 포획 시스템이 CM5 바이오센서에서 확립되었다. 다클론 토끼 항-마우스 IgG 포획 항체 (RbAMIgG (토끼 항 마우스 IgG), pAb<M-IgG>Rb-IgG(IS), BR-1008-38, 2017-08, GE Healthcare) 를 NHS/EDC 화학을 사용하여 제조사의 지침에 따라 고정시켰다. 10 mM 소듐 아세테이트 완충액 (pH 5.0) 중 30 ㎍/㎖ GARbFcγ 를 플로우 셀 1, 2, 3 및 4 에서 예비 농축하고 10.000 RU 로 고정시켰다. 그 후, 센서를 1 M 에탄올아민을 사용하여 pH 8.5 로 포화시켰다.

약 300 RU 의 30 nM mAb<Dig>M-19/11-IgG(Q) (Roche, 28.1.1999, entrance 19.5.2017, Id. 2157861) 를 1 min 동안 10 ㎕/min 으로 포획하였다. Dig-비오틴-컨쥬게이트는 150 nM 로 2 min 동안 주입되어 M-19/11-IgG 에 의해 30 ㎕/min 으로 안정하게 포획되었다.

도 6 은 어세이 설정을 설명하고 있다. 이 어세이는 바람직하게는 재조합으로 발현된 토끼 항-비오틴 Fab' 단편의 동역학 결정에 사용되었다.

항-비오틴 토끼 항체 또는 이의 단편은 결합 동역학을 결정하기 위해 상기 기재한 바와 같이 농도 의존적인 시리즈로 주입되었다.

실시예 10

ITC 실험

ITC 실험의 목적은 용액 중 유리 비오틴에 대한 선택된 항체의 친화도 및 결합 반응의 열역학적 파라미터와 화학량을 바로 결정하는 것이었다.

모든 ITC 실험은 VP-ITC 마이크로열량계 (Malvern Instruments) 에서 수행하였다. 실험은 25 ℃ 에서 포스페이트 완충액 (25 mM 포타슘 포스페이트 pH 7.4, 150 mM 포타슘 클로라이드) 에서 수행하였다. 단백질 농도는 단일클론 항체에 대하여 750 ㎍/㎖ 였고 파라토프에 대한 몰 농도는 10 μM 이었다. 비오틴 농도는 100 μM 였다. 적정은 310 rpm 의 교반 속도 및 10 ㎕ 주입 사이 200 s 의 시간 간격으로 수행하였다. 각 샘플에 대한 첫 번째 주입은 데이터 피팅에서 제외하였다. NanoAnalyze Data Analysis 소프트웨어 패키지 (버전 3.6.0) 를 사용하여 실험 데이터를 이론 커브에 피팅하여 K_d (M 단위의 해리 상수), n (결합의 화학량) 및 ΔH (kcal/mol 단위의 엔탈피 변화) 에 대한 값을 제공하였다. 열역학적 파라미터 (ΔG 및 ΔS) 를 하기 식을 사용하여 K_d 및 ΔH 로부터 계산하였다:

ΔG = RTln(K_d) = ΔH - TΔS

식 중, R 은 일반적인 기체 상수이고, T 는 온도이고, ΔG, ΔH 및 ΔS 는 깁스 자유 에너지, 엔탈피 및 엔트로피의 변화이다.

실시예 11

원핵 세포 발효로부터의 Fab 단편의 정제

본 발명의 발현된 폴리펩티드는 숙주 세포의 주변 세포질로 분비되고 회수된다. 세포는 원심 분리 또는 여과에 의해 수확될 수 있다. 바이오매스를 2.0 내지 8.0 의 pH 를 갖는 적절한 완충액에 재현탁하거나 완전한 발효 브로스를 사용하여 물리적, 화학적 또는 효소적 방법으로 세포를 파괴시킨다. 세포가 파괴되면, 세포 잔해 또는 전체 세포를 원심 분리 또는 여과로 제거할 수 있다. 폴리펩티드의 정제는 여러 침전 단계 및 양이온, 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용, 혼합 모드, 친화성 또는 겔 여과 크로마토그래피에서의 분별을 포함할 수 있다. 미량의 결합된 비오틴을 제거하기 위해, 결합제, 예를 들어 스트렙타비딘으로의 폴리펩티드 용액의 처리가 필요할 수 있다. 폴리펩티드 투석의 최종 제형의 경우, 한외 여과 또는 초음파 투석 단계가 수행될 수 있다. 폴리펩티드는 액체, 동결 액체 또는 분무 건조 또는 동결 건조 고체로 저장될 수 있다.

Claims

하기 화학식 I 의 화합물에 특이적으로 결합하고, 또한 비오틴에 결합하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체:

[식 중,
Y 는 CH₂ 또는 C=O 이고,
X 는 O 또는 (CH₂)_n 이고, n 은 1 내지 20 의 정수이고,
R 은 H, 또는 Z-L 이며,
이때,
L 은 링커이고,
Z 는 비오틴 모이어티를 함유하지 않는 합텐 및 폴리펩티드로부터 선택됨].
제 1 항에 있어서, 하기 화학식 II (도 3A 에 또한 도시되어 있음) 의 화합물에 결합하지 않는 것을 추가의 특징으로 하는 단일클론 항체:

.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 화학식 III (도 3 B 에 또한 도시되어 있음) 의 화합물에 대한 단일클론 항체의 결합 친화도가 하기 화학식 II 의 화합물에 대한 결합 친화도보다 적어도 50 배 높은 단일클론 항체:

.
제 3 항에 있어서, 화학식 III 의 화합물에 대한 단일클론 항체의 결합 친화도가 화학식 II 의 화합물에 대한 결합 친화도보다 적어도 500 배, 적어도 1,000 배, 적어도 5,000 배, 적어도 10,000 배, 적어도 50,000 배, 및 적어도 100,000 배 높은 단일클론 항체.
(스트렙트)아비딘/비오틴 결합 쌍을 사용하여 비오틴화 분석물 특이적 결합제를 (스트렙트)아비딘 코팅된 고체 상에 결합시키는, 샘플 중 분석물 측정 방법으로서,
샘플에
a) 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 항체,
b) 비오틴화 분석물 특이적 결합제,
c) 스트렙타비딘 코팅된 고체 상
을 첨가하는 단계,
그 다음,
(스트렙트)아비딘 및 비오틴화 분석물 특이적 결합제를 통해 고체 상에 결합된 분석물을 측정하는 단계를 포함하는, 샘플 중 분석물 측정 방법.
제 5 항에 있어서, 단계 5 (a) 및 임의로 또한 단계 5 (b) 가 단계 5 (c) 전에 수행되는 샘플 중 분석물 측정 방법.
(스트렙트)아비딘/비오틴 쌍을 사용하여 비오틴화 분석물 특이적 결합제를 (스트렙트)아비딘 코팅된 고체 상에 결합시키는 샘플 중 분석물 측정 방법에서의, 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
적어도 하기를 포함하는 면역 어세이 시험 키트:
a) 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 항체,
b) 비오틴화 분석물 특이적 결합제, 및
c) (스트렙트)아비딘 코팅된 고체 상.
하기 화학식 I 에 따른 면역원:

[식 중,
Y 는 CH₂ 또는 C=O 이고,
X 는 O 또는 (CH₂)_n 이고, n 은 1 내지 20 의 정수이고,
R 은 Z-L 이며,
이때,
L 은 링커이고,
Z 는 적어도 30 개의 아미노산의 폴리펩티드, 바람직하게는 키홀 림펫 헤모시아닌임].
하기 단계를 포함하는, 제 1 항에 따른 항체의 생산 방법:
a) 실험 동물을 제 9 항에 따른 면역원으로 면역시켜, B-세포를 유도하여 면역원에 결합하는 항체를 생산하는 단계,
b) 하이브리도마 기술 또는 B-세포 PCR 기술을 통해, 단계 (a) 의 B-세포에 의해 생산된 면역원에 결합하는 단일클론 항체를 수득하는 단계,
c) 비오틴에 대한 결합에 대하여 단계 (b) 의 항체를 추가로 선택하여, 제 1 항에 따른 항체를 수득하는 단계.
제 10 항에 있어서, 단계 (c) 에서, 선택이 하기 화학식 I 에 따른 화합물에 대한 항체의 결합에 대한 경쟁자로서 비오틴을 사용하는 경쟁적 어세이에서 수행되는 항체의 생산 방법:

[식 중,
Y 는 CH₂ 또는 C=O 이고,
X 는 O 또는 (CH₂)_n 이고, n 은 1 내지 20 의 정수이고,
R 은 H, 또는 Z-L 이며,
이때,
L 은 링커이고,
Z 는 비오틴 모이어티를 함유하지 않는 합텐 및 폴리펩티드로부터 선택됨].
제 10 항에 있어서, 단계 (c) 에서, 선택이 제 9 항에 따른 면역원에 대한 항체의 결합에 대한 경쟁자로서 비오틴을 사용하는 경쟁적 어세이에서 수행되는 항체의 생산 방법.
제 10 항에 있어서, 단계 (c) 에서, 선택이 하기 화학식 III (또한 도 3 B 에 도시되어 있음) 의 화합물에 대한 항체의 결합에 대한 경쟁자로서 비오틴을 사용하는 경쟁적 어세이에서 수행되는 항체의 생산 방법:

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하기 단계를 포함하는, 제 2 항에 따른 항체의 생산 방법:
a) 실험 동물을 제 9 항에 따른 면역원으로 면역시켜, B-세포를 유도하여 면역원에 결합하는 항체를 생산하는 단계,
b) 하이브리도마 기술 또는 B-세포 PCR 기술을 통해, 단계 (a) 의 B-세포에 의해 생산된 면역원에 결합하는 단일클론 항체를 수득하는 단계,
c) 비오틴에 대한 결합에 대하여 단계 (b) 의 항체를 선택하는 단계, 및
d) 하기 화학식 II 의 화합물에 결합하지 않는 항체를 선택하여, 제 2 항에 따른 항체를 수득하는 단계:

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