JP5941845B2 - ポリビオチニル化化合物の調製方法 - Google Patents
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Description
−水溶性だが電気的に中性である。
−ビオチン官能基を含む官能基が分離し、正確に空間分布していることに起因して極性を有している。
−固相で合成可能である。
−X は、ビオチン又は
−AA は、BがNH2である場合には3官能分子誘導体であり、BがHである場合には2官能分子誘導体であり、
−AA1 〜 AA5は、それぞれ、3官能分子誘導体であり、
−G0 〜 G5は、それぞれ、少なくとも1つの(-CH2-CH2-O)ユニットを備えるアームであり、
−n0 〜 n5は、それぞれ、1〜8の整数であり、
−Tは、リガンドと反応することができる抗リガンド、又は抗リガンドに結合するための反応基であり、
前記方法は以下のステップ、すなわち、
(i)化学式W’’0-G0-OHで表されるn0個の化合物(但し、W’’0 はアミン保護基であり、n0及び G0 は、上述の定義に従うものである)を、化学式(II)で表される化合物に対してグラフト化して化学式(III)で表される化合物を得る、ステップと、
(ii)化学式(IV)で表される化合物を化学式(III)で表される化合物とカップリングして化学式(V)で表される化合物を得る、ステップと、
(iii)化学式W’’1-G1-OHで表される2n1個の化合物(但し、W’’1は、Wとは異なり、相互に同一のアミン保護基、又は相互に異なり前記方法に用いられる他の保護基とも異なるアミン保護基であり、G1及び n1は上述の定義に従う)を前記ステップ(ii)にて得られた化合物に対してグラフト化して、化学式(VI)で表される化合物を得る、ステップと、
−Yがビオチンの場合1回であり、この場合、pは2となる
−YがビオチンでなくZがビオチンである場合2回であり、この場合、pは2を経て、3となる
−Y及びZがビオチンではなくZがビオチンである場合3回であり、この場合、pは2, 3を経て、4となる
−Y, Z 及び Vがビオチンではない場合、pは2, 3, 4を経て、5となる
(v)上述のようにして得た化合物のW’’1 又は W’’p 基(pは2〜5)を脱保護して、ビオチンとカップリングするステップと、
(vi)上述のようにしてポリビオチニル化した化合物のW基を脱保護して、抗リガンド又は抗リガンド(T)に結合する反応基とカップリングするステップと、
(vii)前記樹脂(R)から得た化合物を切断して、化学式(I)で表される化合物を得るステップと、
を含むことを特徴とする、方法に関するものである。
−Xはビオチン又は
−AAは、BはNH2 である場合には3官能分子誘導体であり、BがHである場合に2官能分子誘導体であり、
−AA1 〜 AA4は、それぞれ、3官能分子誘導体であり、
−G0 〜 G5は、それぞれ、少なくとも1つの(-CH2-CH2-O-)ユニットを備えるアームであり、
−n0 〜 n5は、それぞれ、1〜8の整数であり、
−Tはマレイミド基、カルボン酸基、又は抗リガンドである、
ことを特徴とする、化合物に関するものである。
−置換基AA1 及び AA2、該当する場合、AA3, AA4 及び AA5は、同一であり、好ましくはリシン誘導体である。
−置換基AAはリシン誘導体であり、BはNH2である。
−置換基G0, G1、該当する場合、G2, G3, G4 及び G5 は同一であり、好ましくは化学式(-NH-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CO-)で表される
−整数n0, n1、該当する場合、n2, n3, n4 及び n5 は、同一であり、好ましくは2又は3である。
−以下の化学式で表されるUniversal NovaTag樹脂化合物(参照番号04-12-3910):
Rは
−W基はメトキシトリチルである。
−W1 基及び W’1基は、同一であり、適切な場合、W2 及び W’2は同一であり、W3 及び W’3 は同一であり、W4 及び W’4は同一であり、W5 及び W’5 は同一である。
−W1 基、W’1 基、及び、適切な場合、W2, W’2, W3, W’3, W4 、及び W’4 , W5 、及び W’5 は、フルオレニルトキシカルボニル基である。
−X はビオチン、又は
−AA は、BがNH2 である場合には3官能分子誘導体であり、BがHである場合に2官能分子誘導体であり、
−AA1 〜 AA4は、それぞれ、3官能分子誘導体であり、
−G0 〜 G5は、それぞれ、少なくとも1つの(-CH2-CH2-O-)ユニットを備えるアームであり、
−n0 〜 n5は、それぞれ、1〜8の整数であり、
−Tはマレイミド基、カルボン酸基、又は抗リガンドである。
−AA1 及び AA2、該当する場合、AA3, AA4 及び AA5 は同一であり、好ましくはリシン誘導体であり、
−置換基G0, G1、該当する場合、G2, G3, G4 及びG5 は同一であり、好ましくは化学式(-NH-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CO-),で表され、
−整数n0, n1、該当する場合、n2, n3, n4 及び n5 は、同一であり、好ましくは2又は3であり、
−X は
−AA はリシン誘導体であり、BはNH2 であり、
−抗リガンドはFab’ フラグメントであり、
−X は
・例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、グルコース−6−ホスフェートデヒドロジナーゼのような、比色定量、蛍光、発光によって検出することができる信号を生成する酵素
・蛍光化合物、発光化合物、染色化合物のようなクロモフォア
・32P, 35S 又は 125Iのような放射性分子
・Alexa又はフィコシアニンのような蛍光分子
これらのマーカーは、ストレプトアビジンのようなビオチンとの結合パートナーに結合するように改変する。このような改変は、当業者によく知られている。
(AA=AA1=AA2=リシン誘導体;
BはNH2;
G0=G1=G2= (-NH-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CO-) = Ado;
n0=n1=n2= 2
T= マレイミド
X=
−Fmoc-Lys(Mmt)-OH, 640.8 mg (Novabiochem社)
−Fmoc-Lys(Fmoc)-OH, 590.7 mg (Novabiochem社)
−Fmoc-Ado-OH, 385.4 mg (Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸、Polypeptide社)
−N-マレオイル-β-アラニン, 169.1 mg (FLUKA社)
−ビオチン, MW 244.3 (SIGMA社):予め、DMSO (ALDRICH社)に0.5Mで溶解した溶液(カートリッジあたりの溶液は2 ml)
下記の原料を使用した。
−N-メチル-ピロリドン(NMP)(Applied Biosystems社)
−ジクロロメタン(DCM)(Applied biosystems社)
−ピペリジン(ALDRICH社)
−無水酢酸(FLUKA社)
−メタノール(MERCK社)
−上記NMP中の2M ジ−イソプロピルエチルアミン、すなわちDIEA (ALDRICH社)溶液
−N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)(ALDRICH社)中で、全体で約0.45M N-ヒドロキシベンゾトリアゾール(SENN社)当量のベンゾトリアゾリルテトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート(HBTU)(Novabiochem社)溶液
−上記DCMと同一のDCM中で、1%トリフルオロ酢酸(TFA)(ACROS社)及び2.5%トリイソプロピルシラン(TIS)(FLUKA社)を含有する溶液
以下のモジュールを使用した。
−A:アミノ酸パウダーカートリッジを回収する
−B:ピペリジンによりFmoc N-末端基を脱保護する
−C:無水酢酸により未反応アミンをキャッピング(マスキング)する
−D:NMPにより樹脂をリンスする
−E:アミノ酸溶液を活性化して樹脂に移す
−F:攪拌してカップリングさせる
−G:第1リシンの側鎖のモノメトキシトリチルを脱保護する
−I:リアクタを断続的に30分間攪拌する
−a:カートリッジの回収、樹脂のリンス、及び活性化/リアクタへの移動のための条件モジュール
−b:ピペリジンによる追加の脱保護のための条件モジュール
−c:DCMにより樹脂をリンスする
−d:NMPにより樹脂をリンスする他のモジュール
−f:攪拌によってロングカップリングする条件モジュール
−i:未使用カートリッジを排出する条件モジュール
以下の表2に示すサイクルに従って、シンセサイザーをプログラムした。
樹脂を脱保護し、Fmoc-Lys(Mmt)-OH (II’)を以下のようにしてカップリングした(サイクル1:装置は、条件テストの結果に従って1つ又は2つのFmoc-Lys(Mmt)-OHアミノ酸カートリッジのみを使用した)。
以下の何れかによる:
a) 疎水性スペーサーアームAdo2のグラフト化
b) 分岐シントン=Fmoc-Lys(Fmoc)-OH のカップリング
i) 疎水性スペーサーアームAdo 2 のグラフト化(ステップa)
(サイクル2及び3:装置は、各サイクルで条件テストの結果に従って1つ又は2つのFmoc-Ado-OHアミノ酸カートリッジのみを使用した)
(サイクル4:装置は、条件テストの結果に従って1つ又は2つのFmoc-Lys(Fmoc)-OHアミノ酸カートリッジのみを使用した)
(3)に対して
−サイクル5及び6:装置は、条件テストの結果に従って、1つ又は2つのFmoc-Ado-OHアミノ酸カートリッジのみを使用した。
(サイクル10:装置は、条件テストの結果に従って、1つ又は2つのビオチンカートリッジのみを使用した。)
(サイクル11:この際、プログラムは条件テストによらず、2つのN-マレオイル-β-アラニンのカートリッジを使用する)
保護基Mmtは、1.5% TFA(トリフルオロ酢酸)及び1.5% TIS(トリイソプロピルシラン)を含むDCM(ジクロロメタン)溶液の反復的な作用により選択的に切断された。よって、ステップ1)で挿入されたリシン側鎖のアミンは自由になり、マレイミドの酸性型であるN-マレオイル-β-アラニンとカップリングされた。
合成後、樹脂を窒素ブランケットして乾燥させた。シンターを含む20 mlプラスチックシリンジに移して、室温で1時間30分にわたり攪拌し、10 mlのTFA/水(95/5)溶液と接触させた。そして、クリーベッジ溶液を収集して、(シリンジ中のシンターを介した)フィルタリングによりガラスフラスコに回収した。樹脂をTFA 5 mlでリンスし、さらに、約5 mlのDCMで3回リンスする。フラスコに樹脂をすべて加えた。未処理のクリーベッジ混合物を、バスを室温としたロータリーエバポレーターで、数十分間低圧で蒸発させた。最終的に、オイリーなオレンジ色の残留物が得られた。
[実施例2]
[4つのビオチンを有する化学式(I)の化合物の調製]
(AA=AA1=AA2=リシン誘導体;
BはNH2;
G0=G1=G2= (-NH-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CO-) = Ado;
n0=n1=n2= 3
T= マレイミド
X=
Y = ビオチン)
実施例1とは異なり、Fmoc-Lys(Mmt)-OHを手動でカップリングした。樹脂は既にアミン型であり、脱保護は不要である。Fmoc-Lys(Mmt)-OHの137個のミクロ粒子をNMP中の溶液に溶解し、HBTU/HOBtカップリング剤1当量と共にリアクタに手動で送った。試薬を最終的に体積が6 mlとする。そして、同様のDIEA 2M / NMP の溶液を0.5 mlリアクタに送り、カップリング反応を開始させた。樹脂は若干過剰であった。断続的にボルテックスしながら、実験室温で反応を2時間実施する。そして、以下の表3に示すプログラムに従う全自動モードで合成を再開した。
[2.2 骨格構築]
セクション1.2のステップi)に記載の手順を繰り返す。ただし、本例では、ステップi)を3回反復し、その結果3つのFmoc-Ado-OH(2つではない)を連続してカップリングして、以下の構造とする(ステップ2.2.i))。
(AA=AA1=AA2= AA3= リシン誘導体;
BはNH2;
G0=G1=G2= G3=(-NH-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CO-) = Ado;
n0=n1=n2=n 3 = 3
T= マレイミド
Y=
[4.1 内容]
従来、ビオチンのSHタンパク質(例えば、Fab’フラグメント、DTTで抑制した抗原、トラウト試薬によって改変したタンパク質)へのカップリングは、ビオチンBMCC(Pierce参照番号21900:1-ビオチンアミド-4{4'-(マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボキシアミド]ブテン)を、SHタンパク質の遊離スルフヒドリル官能基へ結合させることにより、実施されてきた。しかし、遊離スルフヒドリル官能基は少量では多数のビオチンを結合することができないので、ビオチン/SHタンパク質結合体を診断に使用する場合、検出信号は弱く、結合体1つ当たりビオチンが1つ存在することを表す。したがって、信号を強調することが重要である。
使用した市販の試薬を表5に挙げる。
− Fab’フラグメント:抗Listeria monocytogenes Fab’フラグメント、サルモネラ壁の抗抗原、HIVクローンA及びクローンBの抗p24、及び抗ヒトカリクレイン2
− HIVのgp160、HBVのHBs Ad、HBVのHBs Ay
− 抗体:サルモネラ壁抗抗原抗体
以下のようなカップリングにより結合体を得た。
− ペプシン処理によりFab’フラグメントを得て、2bMEで抑制し、Superdex 200 pg(prep grade)での精製後に、バッファー(PO450mM + NaCl 150 mM + EDTA(4Na) 5mM、pH=6.8)中で2 mg/mlに調節した
− DMSO中8.5 mM (4.54 g/l)でビオチンBMCC (533.69 g/モル)溶液を新たに調製した
− 脱イオン水2.5 mg/mlを含む実施例1の組成物の混合物を新たに調製した
− Fab'を1モル(46,000ダルトン)あたり、ビオチンBMCC又は実施例1の化合物を5モルの割合で、Fab'にカップリングした
− 実験室温で、褐色ガラスボトル中でロータリー攪拌しながら2時間培養した
− ビオチンBMCC又は実施例1の化合物に対してモル当量のヨードアセトアミドを添加してブロックした
− 新たに調製したPBSバッファー中10 mMヨードアセトアミド溶液を使用した
− 実験室温で、ロータリー攪拌しながら1時間培養した
− PBSバッファー+アジドに対して透析した
− 透析をやめ、280nm (e = 1.48)でODを測定して結合体の濃度を測定した
結合体は、以下のようなカップリングにより得た。
− 抗体1モルあたり20モルのトラウト試薬を添加して抗体を改変し、バッファー(PO4 50mM + NaCl 150 mM + EDTA(4Na) 5mM、pH=6.8)中で透析した
− 脱イオン水中、2.5 mg/mlで実施例1の化合物(3618.26 g/モル)の溶液を新たに調製した
− 抗体1モル(160,000ダルトン)あたり、実施例1の化合物を20モルの割合で改変抗体をカップリングした
−実験室温で、褐色ガラスボトル中でロータリー攪拌しながら2時間培養した
−実施例1の化合物に対してモル当量のヨードアセトアミドを添加してブロックした
− 新たに調製したPBSヨードアセトアミド溶液を使用した
− 実験室温で、ロータリー攪拌しながら1時間培養した
− PBSバッファー+アジドに対して透析した
− 透析をやめ、280nm (e = 1.4)でODを測定して結合体の濃度を測定した
以下のようにして結合体を得た。
− トラウト試薬4モルを抗原1モルに加えて抗原を改変し、バッファー(PO4 50mM + NaCl 150 mM + EDTA(4Na) 5mM、pH=6.8)中で透析した
− 脱イオン水中、1 mg/mlで実施例1の化合物(3618.26 g/モル)の溶液を新たに調製した
− 抗原1モル(MW = 25,000ダルトン)あたり、実施例1の化合物を1モルの割合で改変抗原に対してカップリングした
− 実験室温で、褐色ガラスボトル中でロータリー攪拌しながら2時間培養した
− 実施例1の化合物に対してモル当量のヨードアセトアミドを添加してブロックした
− 新たに調製したPBSヨードアセトアミド溶液を使用した
− 実験室温で、ロータリー攪拌しながら1時間培養した
− PBSバッファー+アジド+SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)に対して透析した
− 透析をやめ、280nmでODを測定して結合体の濃度を測定した
以下のようなカップリングにより結合体を得た。
− pH=8.3の0.1M NaHCO3 バッファー中で抗体又は抗原を透析した
− 抗体をカップリングするための、ビオチンNHs溶液(DMSO中11.36 g/l)、及び抗原をカップリングするためのビオチンNHs溶液(DMSO中2.0 g/l)を新たに調製した
− 抗体1モル(160,000ダルトン)あたり、ビオチンNHsを20モルの割合で抗原に対してカップリングし、抗原1モル(25,000ダルトン)あたり、ビオチンNHsを1モルの割合で抗原に対してカップリングした
− 実験室温で、褐色ガラスボトル中でロータリー攪拌しながら1時間培養した
− ビオチンNHsに対してモル当量の1Mリシンを添加してブロックした
− 実験室温で、ロータリー攪拌しながら1時間培養した
− 抗体は、PBSバッファー+アジドで透析し、抗原は、PBSバッファー+アジド+SDSで透析した
− 透析をやめ、280nmでODを測定して結合体の濃度を測定した
以下のようなカップリングにより結合体を得た。
− 抗原1モルあたり800モルのDTTで抗原を抑制し、実験室音で30分間攪拌した
− 抑制した抗原をPBS buffer + EDTA pH=7.5中で、Sephadex G25 ゲルにより脱塩した
− DMSO中4.35 mM(2.32 g/l)でビオチンBMCC(533.69 g/モル)溶液を新たに調製した
− 脱イオン水中、2.5 mg/mlで実施例1の化合物(3618.26 g/モル)の溶液を新たに調製した
− 抗原1モル(160,000ダルトン)あたり、ビオチンBMCC又は実施例1の化合物を20モルの割合で抑制抗原に対してカップリングした
− 実験室温で、褐色ガラスボトル中で攪拌又はボルテックスしながら2時間培養した
− 抗原1モルあたり20モルのNEMを添加してブロックした
− PBSバッファー中、10mM NEMの溶液を新たに調製して使用した
− 結合体をPBS+MIT中で透析した
− 透析を終了した
[5.1 直接ELISA試験]
本発明によるテトラビオチニル化化合物又は単一のビオチンを含む結合体の活性を、結合体をマイクロプレートに固定してペルオキシダーゼに結合したストレプトアビジンによって信号を生じさせて、ELISA試験で比較した。本発明の一実施形態では、ELISA試験によって、ポリビオチニル化化合物の「カップリングレベル」をモノビオチニル化化合物と比較した。
(抗体フラグメント及び全抗体を堆積させるための)Maxisorpウェルストリップ、又は(抗原を堆積させるための)Polysorpウェルストリップを使用した。
モノビオチニル化又はテトラビオチニル化結合体を、pH=9.6の50 mM CO3バッファーに0.05 μg/ml〜0.5 μg/mlの範囲で希釈して、倍数希釈した。
各希釈液を100 μl/ウェルで堆積した。
実験室温度で一晩培養した。
PBS tweenで3回洗浄した。
100 μl/ウェルのストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ堆積物を、PBSで1/6000°に希釈した。
オーブンで37 °Cで15分間培養した。
PBS tweenで3回洗浄した。
100 μl/ウェルのOPDを堆積した。
実験室温度で30分間暗黒で培養した。
100 μl/ウェルの1.8N H2SO4でブロックした。
492 nmでODを読み取った。
この目的のために、サルモネラの3つの株の培養物に由来する抗原をPolysorpマイクロプレートにまいた。そして、以下のステップを実施した。
− PBS中1 g/l BSAで、37 °Cのオーブンで1時間パッシベーションした
− PBS tweenで3回洗浄した
− PBSで2倍希釈した結合体を37 °Cで30分間培養し、PBS tweenで3回洗浄した
ストレプトアビジンを堆積させるステップから、直接ELISA試験と同様の手順に従った。
間接ELISA法により、結合体と、抗原又は抗体との間の「カップリングレベル」及び生物学的反応を試験した。
以下のように、結果を図2〜8に示す。
− 図2は、濃度に従ってマイクロプレートの底部に固定した、(ビオチンBMCCにより)モノビオチニル化した抗リステリアモノサイトゲネス(LMO)Fab’結合体、又は(本発明の実施形態に従う化合物により)テトラビオチニル化した抗LMOFab’結合体についての直接ELISA試験のOD測定結果を示すグラフである。
− 図3は、濃度に従ってマイクロプレートの底部に固定した、(ビオチンBMCCにより)モノビオチニル化した抗サルモネラFab’結合体、又は(本発明の実施形態に従う化合物により)テトラビオチニル化した抗サルモネラFab’結合体についての直接ELISA試験と、これらの結合体についての間接ELISA試験の(サルモネラ抗原による)OD測定結果を示すグラフである。
− 図4は、濃度に従ってマイクロプレートの底部に固定した、(ビオチンBMCCにより)モノビオチニル化した抗HIV Fab’結合体、又は(本発明の実施形態に従う化合物により)テトラビオチニル化した抗HIV Fab’結合体についての直接ELISA試験のOD測定結果を示すグラフである。
− 図5は、濃度に従ってマイクロプレートの底部に固定した、(ビオチンBMCCにより)モノビオチニル化した抗カリクレインFab’結合体、又は(本発明の実施形態に従う化合物により)テトラビオチニル化した抗カリクレインFab’結合体についての直接ELISA試験のOD測定結果を示すグラフである。
− 図6は、濃度に従ってマイクロプレートの底部に固定した、(ビオチンBMCCにより)モノビオチニル化した、DTTで抑制したgp160抗原結合体、又は(本発明の実施形態に従う化合物により)テトラビオチニル化した、DTTで抑制したgp160抗原結合体についての直接ELISA試験のOD測定結果を示すグラフである。
− 図7は、濃度に従ってマイクロプレートの底部に固定した、(ビオチンNHsにより)モノビオチニル化したB型肝炎表面抗原結合体、又は(本発明の実施形態に従う化合物により)テトラビオチニル化したB型肝炎表面抗原結合体についての直接ELISA試験のOD測定結果を示すグラフである。
− 図8は、濃度に従ってマイクロプレートの底部に固定した、(ビオチンNHsにより)モノビオチニル化した抗サルモネラ抗体結合体、又は(本発明の実施形態に従う化合物により)テトラビオチニル化した抗サルモネラ抗体結合体についての直接ELISA試験のOD測定結果を示すグラフである。
本試験の目的は、一実施形態によるテトラビオチニル化結合体とモノビオチニル化結合体のVidas信号を比較して、特異性を損なうことなく応答感受性を増強することである。
[使用した試薬]
リステリアモノサイトゲネス(bioMerieux社、フランス)のFab’抗体フラグメントを用いてテトラビオチニニル化結合体及びモノビオチニル化結合体を調製し、ビオチンBMCC及び実施例1と同様の化合物を調製し、上述のセクション4.3で記載した手順に従った。
他の試薬は以下の通りであった。
− LMO2コーン及びウェルストリップ(bioMerieux社、参照番号30 704)
− PALストレプトアビジン(BioSPA社、参照番号045 66074)
− モノビオチニル化ストック溶液:Fab’濃度0.32 mg/ml
− テトラビオチニル化ストック溶液:Fab’濃度0.26 mg/ml
− LMO2結合体希釈物(bioMerieux社、参照番号500 26004)
− PALストレプトアビジン希釈物(bioMerieux社、参照番号500 25992)
− Vidas装置(bioMerieux社)1台
− リステリアモノサイトゲネス4 b ATCC 19115
− リステリアモノサイトゲネス3a ATCC 51 782
− リステリアモノサイトゲネス1/2c 83 09 024
− リステリアモノサイトゲネス4c 83 09 031
− リステリアイノキュア6a 83 09 035
− リステリアイバノビ91 01 014
− リステリアウェルシメリ94 09 074
全株をブロス(LX Ref 42 120)中で、37 °C ± 1 °Cで24時間培養し、95-100 °Cで5分間加熱した。
純粋なリステリアイノキュア、リステリアイバノビ、及びリステリアウェルシメリ株を使用した。これらの株は、結合済みの抗体によって認識されないので、特異性を試験するために役立った。
リステリアモノサイトゲネスの4種の株を希釈物中で試験し、計数した。これらの株は被試験物の感受性を試験するために役立つ。
2種類の結合体を、Fab’濃度0.36 μg/mlに調節した。
LMO2ウェルストリップのキットを使用するために、開始結合体をウェルX5から回収した。そのウェルを、生理水600 μlでリンスした。そして、生理水を除去した後、試験対象のモノビオチニル化結合体又はテトラビオチニル化結合体を400 μl加えた。試料(株の希釈物)500 μlをウェルX0に堆積させて、LMO2 Vidas試験を開始した。この試験は約80分間にわたった。
結果を以下の表7に示す。
Claims (26)
- 化学式(I)で表される化合物を調製する方法であって、
但し、
−X は、ビオチン又は
−Y は、ビオチン又は
−Z は、ビオチン又は
−V は、ビオチン又は
−AA は、BがNH2である場合には3官能分子誘導体であり、ここで、該3官能分子は、リシン、ジアミノ酪酸、ジアミノプロパン酸、L-オルニチン、及びこれらの誘導体から選択され、BがHである場合には2官能分子誘導体であり、ここで、該2官能分子は、2官能ジアミンであり、
−AA1 〜 AA5は、それぞれ、3官能分子誘導体であり、ここで、該3官能分子は、リシン、ジアミノ酪酸、ジアミノプロパン酸、L-オルニチン、及びこれらの誘導体から選択され、
−G0 〜 G5は、それぞれ、少なくとも1つの(-CH2-CH2-O)ユニットを備えるアームであり、ここで、該アームは、ペンタオキサオクタデカノイル、テトラオキサペンタデカノイル、トリオキサドデカノイル、トリオキサトリデカノイル、ジオキサオクタノイル、オキサペントイル、及びヘキサオキサヘニコサノイル、及びこれらの誘導体から選択され、
−n0 〜 n5は、それぞれ、1〜8の整数であり、
−Tは、ハプテン、抗体、抗原、ペプチド、糖、レクチン、ポリヌクレオチド、及びポリヌクレオチド相補体から選択される、リガンドと反応することができる抗リガンド、又は、マレイミド基、カルボン酸基、チオール基、アミン基、アルコキシアミン基、ヒドラジン基、アジド基、アルキン基、及びアルデヒド基から選択される、抗リガンドに結合するための反応基であり、
前記方法は以下のステップ、すなわち、
(i)化学式W’’0-G0-OHで表されるn0個の化合物(但し、W’’0 はアミン保護基であり、n0及び G0 は、上述の定義に従うものである)を、化学式(II)で表される化合物に対してグラフト化して化学式(III)で表される化合物を得る、ステップと、
(但し、Rは予め官能化した樹脂であり、W 及び W0 は相互に異なるアミン保護基を表し、WはW’’0と異なり、AAは上述の定義に従う)
(ii)化学式(IV)で表される化合物を化学式(III)で表される化合物とカップリングして化学式(V)で表される化合物を得る、ステップと、
(但し、W1 及び W’1は、Wとは異なり、相互に同一のアミン保護基、又は相互に異なり、W0及び W’’0とも異なるアミン保護基であり、AA1 は上述の定義に従う)
(iii)化学式W’’1-G1-OHで表される2n1個の化合物(但し、W’’1は、Wとは異なり、相互に同一のアミン保護基、又は相互に異なり前記方法に用いられる他の保護基とも異なるアミン保護基であり、G1及び n1は上述の定義に従う)を前記ステップ(ii)にて得られた化合物に対してグラフト化して、化学式(VI)で表される化合物を得る、ステップと、
(iv)化学式(I)のXがビオチンの場合、ステップ(v)に直接進む、あるいは、化学式(I)のXがビオチンでない場合、化学式(VII)で表される2p-1個の化合物を用いてステップ(ii)及び(iii)を繰り返し、
化学式W’’p-Gp-OHで表される化合物(但し、pは2〜5の整数であり、Wp, W’p, W’’p は、Wとは異なり、相互に同一のアミン保護基、又は相互に異なり、前記方法に使用される他の保護基と異なるアミン保護基であり、AApはリシン、ジアミノ酪酸、ジアミノプロパン酸、L-オルニチン、及びこれらの誘導体から選択される3官能分子である)を、以下の順序で2pnp倍とする;
−Yがビオチンの場合1回であり、この場合、pは2となる
−YがビオチンでなくZがビオチンである場合2回であり、この場合、pは2を経て、3となる
−Y及びZがビオチンではなくVがビオチンである場合3回であり、この場合、pは2, 3を経て、4となる
−Y, Z 及び Vがビオチンではない場合、pは2, 3, 4を経て、5となる
(v)上述のようにして得た化合物のW’’1 又は W’’p 基(pは2〜5)を脱保護して、ビオチンとカップリングするステップと、
(vi)上述のようにしてポリビオチニル化した化合物のW基を脱保護して、ハプテン、抗体、抗原、ペプチド、糖、レクチン、ポリヌクレオチド、及びポリヌクレオチド相補体から選択される抗リガンド、又はマレイミド基、カルボン酸基、チオール基、アミン基、アルコキシアミン基、ヒドラジン基、アジド基、アルキン基、及びアルデヒド基から選択される、抗リガンド(T)に結合する反応基とカップリングするステップと、
(vii)前記樹脂(R)から得た化合物を切断して、化学式(I)で表される化合物を得るステップと、
を含むことを特徴とする、方法。 - 置換基AA1 及び AA2、該当する場合、AA3, AA4 及び AA5は、同一であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 置換基AA1 及び AA2、該当する場合、AA3, AA4 及び AA5は、リシン誘導体であり、該リシン誘導体は、-HN -(CH2)4-CH(NH-)-CO-である、請求項2に記載の方法。
- 置換基G0, G1、該当する場合、G2, G3, G4 及び G5 は、同一であることを特徴とする、請求項1〜3の何れか一項に記載の方法。
- 置換基G0, G1、該当する場合、G2, G3, G4 及び G5 は、式(-NH-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CO-)で表される、請求項4に記載の方法。
- 整数n0, n1、該当する場合、n2, n3, n4 及び n5 は、同一であることを特徴とする、請求項1〜5の何れか一項に記載の方法。
- 整数n0, n1、該当する場合、n2, n3, n4 及び n5 は、2又は3である、請求項6に記載の方法。
- W基はメトキシトリチルであることを特徴とする、請求項1〜7の何れか一項に記載の方法。
- W1 及び W’1 は同一であり、該当する場合、W2及び W’2 は同一であり、W3 及び W’3は同一であり、W4 及び W’4 は同一であり、並びに、W5及び W’5 は同一であることを特徴とする請求項1〜8の何れか一項に記載の方法。
- アミン保護基W1,W’1 及び、該当する場合、W2, W’2, W3, W’3, W4 及び W’4, W5 及び W’5は、フルオレニルメチルオキシカルボニル基であることを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 置換基AAは、リシン誘導体であり、該リシン誘導体は、-HN -(CH2)4-CH(NH-)-CO-であり、BはNH2であることを特徴とする、請求項1〜10の何れか一項に記載の方法。
- Xは
であり、Yはビオチンであることを特徴とする、請求項1〜11の何れか一項に記載の方法。 - 化学式(I)で表される化合物であって、
但し、
−Xはビオチン又は
−Yはビオチン又は
−Zはビオチン又は
−Vはビオチン又は
−AAは、BがNH2 である場合には3官能分子誘導体であり、ここで、該3官能分子は、リシン、ジアミノ酪酸、ジアミノプロパン酸、L-オルニチン、及びこれらの誘導体から選択され、BがHである場合には2官能分子誘導体であり、ここで、該2官能分子は、2官能ジアミンであり、
−AA1 〜 AA5は、それぞれ、3官能分子誘導体であり、ここで、該3官能分子は、リシン、ジアミノ酪酸、ジアミノプロパン酸、L-オルニチン、及びこれらの誘導体から選択され、
−G0 〜 G5は、それぞれ、少なくとも1つの(-CH2-CH2-O-)ユニットを備えるアームであり、ここで、該アームは、ペンタオキサオクタデカノイル、テトラオキサペンタデカノイル、トリオキサドデカノイル、トリオキサトリデカノイル、ジオキサオクタノイル、オキサペントイル、及びヘキサオキサヘニコサノイル、及びこれらの誘導体から選択され、
−n0 〜 n5は、それぞれ、1〜8の整数であり、
−Tはマレイミド基、カルボン酸基、又は、ハプテン、抗体、抗原、ペプチド、糖、レクチン、ポリヌクレオチド、及びポリヌクレオチド相補体から選択される抗リガンドである、
ことを特徴とする、化合物。 - 置換基AA1 及び AA2、該当する場合、AA3, AA4 及び AA5は、同一であることを特徴とする、請求項13に記載の、化学式(I)で表される化合物。
- 置換基AA1 及び AA2、該当する場合、AA3, AA4 及び AA5は、リシン誘導体であり、該リシン誘導体は、-HN -(CH2)4-CH(NH-)-CO-である、請求項14に記載の、化学式(I)で表される化合物。
- 置換基G0, G1、該当する場合、G2, G3, G4 及び G5 は同一であることを特徴とする、請求項13〜15の何れか一項に記載の、化学式(I)で表される化合物。
- 置換基G0, G1、該当する場合、G2, G3, G4 及び G5 は、式(-NH-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CO-)で表される、請求項16に記載の、化学式(I)で表される化合物。
- 整数n0, n1、該当する場合、n2, n3, n4 及び n5 は、同一であることを特徴とする、請求項13〜17の何れか一項に記載の、化学式(I)で表される化合物。
- 整数n0, n1、該当する場合、n2, n3, n4 及び n5 は、2又は3である、請求項18に記載の、化学式(I)で表される化合物。
- Xは
- AAはリシン誘導体であり、該リシン誘導体は、-HN -(CH2)4-CH(NH-)-CO-であり、BはNH2であることを特徴とする、請求項13〜20の何れか一項に記載の、化学式(I)で表される化合物。
- 前記抗リガンドは、Fab’フラグメントであることを特徴とする、請求項13〜21の何れか一項に記載の、化学式(I)で表される化合物。
- −Xは
−Yはビオチンであり、
−AA, AA1 及び AA2はリシン誘導体であり、該リシン誘導体は、-HN -(CH2)4-CH(NH-)-CO-であり、
−G0, G1 及び G2は、化学式−(NH-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CO)−を有し
−n0, n1 及び n2 は2であり、
−BはNH2 であり、
−Tはハプテン、抗体、抗原、ペプチド、糖、レクチン、ポリヌクレオチド、及びポリヌクレオチド相補体から選択される抗リガンドである
ことを特徴とする、請求項13に記載の、化学式(I)で表される化合物。 - Tは、Fab’フラグメントである、請求項23に記載の、化学式(I)で表される化合物。
- 請求項1〜12に記載された方法によって得られる化合物の、診断試験における信号増幅へのインビトロでの使用。
- 請求項13〜24に記載された化合物の、診断試験における信号増幅へのインビトロでの使用。
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