ES2248405T3 - Compuestos con un engarce ramificado. - Google Patents
Compuestos con un engarce ramificado.Info
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Abstract
Uso de un compuesto de la fórmula general (I): Zn - Y - Xm (I) en la que Z significa por lo menos un grupo funcional reactivo o un grupo de unión, X es un grupo funcional reactivo que está unido mediante enlace covalente a Z a través del engarce Y, dicho engarce (linker) es un engarce ramificado que tiene un peso molecular de > 1000 Da y contiene por lo menos un soporte de carga, n es un número entero de 1 a 10 y m es 1 ó 2, para la producción de conjugados.
Description
Compuestos con un engarce ramificado.
La presente invención se refiere a nuevos
engarces (linkers) y a su utilización para producir conjugados para
aplicaciones en métodos de diagnóstico y de terapia.
Los conjugados que contiene varios grupos de
enlace o/y grupos efectores, p.ej. grupos de marcado o de fijación
sobre fase sólida o toxinas, se utilizan a menudo en métodos de
diagnóstico y terapéuticos. Tales conjugados pueden prepararse por
unión directa o utilizando estructuras de engarce o conector
(linker), ya conocidas en la técnica anterior. La interferencia de
interacciones intramoleculares e intermoleculares entre los
reactivos conjugados u otros componentes a menudo resultan negativas
para la propiedades de tales conjugados.
En ensayos de diagnóstico, estas interacciones
intramoleculares e intermoleculares molestas suelen conducir a un
desequilibrio de los parámetros importantes del ensayo, por ejemplo
el intervalo dinámico de la señal, la relación
señal-ruido, la anchura del intervalo de medición,
el valor en blanco, el límite inferior de detección y, por lo tanto,
a un considerable trastorno experimental. A su vez, en los
procedimientos terapéuticos, las interacciones dan lugar a una
reducción de la eficacia o de la especificidad de diana.
El uso de engarces conocidos de la técnica
anterior para la conjugación de complejos metálicos luminiscentes
(EP-A-0 178 450,
EP-A-0 580 979, WO 87/06706) conduce
por ejemplo a un empeoramiento del intervalo dinámico de un ensayo.
Otros inconvenientes de tales conjugados son una elevada fijación
inespecífica a proteínas y valores elevados en blanco. Sin embargo,
también surgen problemas similares con otros grupos de marcado y de
fijación sobre fase sólida.
En los documentos WO 96/03409 y WO 96/03410 se
describe que la introducción de soportes de carga positiva o/y
negativa libre en los engarces, que generan la unión entre grupo
reactivo de unión del complejo metálico y uno de los ligandos o que
permiten la introducción de grupos hidrófilos en estos complejos
metálicos luminiscentes, reduce la adsorción inespecífica de los
conjugados de estos complejos y por ello mejora la sensibilidad del
ensayo así como la estabilidad y la recuperación de los conjugados
en los inmunoensayos. Además, en muchos casos es posible lograr un
aumento del rendimiento cuantitativo.
Bredehorst, R. y col., Anal. Biochem. 193,
272-9, 1991, describen un conjugado hapteno
fluoróforo trifuncional que contiene los 21 restos aminoácido de la
molécula de la cadena de insulina A como esqueleto. La cadena de la
insulina A que de este modo actúa como engarce entre los grupos
fluorescente y hapteno es un engarce lineal y no un engarce
ramificado.
En investigaciones recientes se ha encontrado que
el uso de engarces hidrófilos o cargados, según el documento WO
96/03409 o WO 96/03410, conlleva ventajas considerables en la
ejecución de los ensayos, pero, justamente cuando se utilizan estos
complejos, el valor en blanco es considerablemente más elevado que
el valor en blanco del sistema. Por ello sería de desear la
ulterior reducción del valor en blanco mediante la reducción de las
uniones inespecíficas. Deberían reducirse además las interacciones
inespecíficas, tanto intramoleculares como intermoleculares, entre
el grupo marcador y otros componentes del ensayo, sin afectar por
ello negativamente el rendimiento de señal ni la accesibilidad del
grupo marcador.
Ahora se ha encontrado de modo sorprendente que
dichos inconvenientes pueden eliminarse empleando engarces
ramificados con soportes cargados o/y grupos hidrófilos,
especialmente en las cadenas laterales. Estos engarces marcados
permiten además conseguir mejoras en otros tipos de conjugados que
se utilizan en métodos de diagnóstico y terapéuticos o con fines
explorativos.
Por consiguiente, un objeto de la presente
invención es el uso de un compuesto polifuncional de la fórmula
general (I):
(I)Z_{n} - Y -
X_{m}
en la que Z significa por lo menos
un grupo funcional reactivo o un grupo de unión, X es un grupo
funcional reactivo que está unido mediante enlace covalente a Z a
través del engarce Y, dicho engarce es un engarce ramificado que
tiene un peso molecular de \geq 1000 Da y contiene por lo menos
un soporte de carga o/y por lo menos un grupo hidrófilo, n es un
número entero de 1 a 10 y con preferencia de 1 a 4 y m es 1 ó 2 y
con preferencia 1, para la producción de
conjugados.
El grupo Z puede estar presente una o varias
veces y en cada caso con independencia de su aparición puede ser un
grupo funcional reactivo o un grupo de unión. Los ejemplos de
grupos de unión son los grupos marcadores o grupos efectores. Los
grupos efectores son por ejemplo los componentes de un par de unión
bioafín que pueden interaccionar específicamente con el otro
componente del par de unión bioafín.
Los grupos marcadores pueden elegirse entre
cualquier grupo detectable conocido, por ejemplo colorantes, grupos
marcadores luminiscentes, por ejemplo grupo quimioluminiscentes,
p.ej. ésteres de acridinio o dioxetanos o colorantes fluorescentes,
p.ej. la fluoresceína, la cumarina, la rodamina, la oxazina, la
resorrufina, la cianina y los derivados de los mismos. Otros
ejemplos de grupos marcadores son los complejos metálicos
luminiscentes, por ejemplo los complejos de rutenio o de europio,
las enzimas empleadas para el ensayo CEDIA (Cloned Enzyme Donor
Immunoassay, p.ej. según EP-0 061 888), las
micropartículas o nanopartículas, p.ej. las partículas de látex o
los soles de metales, y los radioisótopos.
En una forma preferida de ejecución, el grupo
marcador es un complejo metálico luminiscente y el compuesto tiene
una estructura de la fórmula general (II):
(II)[M(L_{1}L_{2}L_{3})]_{n}-
Y -
X_{m}A
en la que M es un catión metálico
divalente o trivalente, elegido entre los iones de tierras raras o
de metales de transición; L_{1}, L_{2} y L_{3} son iguales o
diferentes e indican ligandos provistos por lo menos de dos
heterociclos que contienen nitrógeno; L_{1}, L_{2} y L_{3}
están unidos al catión metálico mediante átomos de nitrógeno; X es
un grupo funcional reactivo que está unido mediante enlace covalente
por lo menos a uno de los ligandos L_{1}, L_{2} y L_{3} a
través del engarce Y; n es un número entero de 1 a 10, con
preferencia de 1 a 4; m es el número 1 ó 2 y con preferencia el 1 y
A significa el contraión que puede ser necesario para equilibrar la
carga.
El complejo metálico es con preferencia un
complejo metálico luminiscente, es decir, un complejo metálico que
sufre una reacción de luminiscencia detectable después de una
excitación apropiada. La reacción de luminiscencia puede detectarse
por ejemplo por medición de la fluorescencia o de la
electroquimioluminiscencia. El catión metálico de este complejo es
por ejemplo de un metal de transición o de un metal de las tierras
raras. El metal es con preferencia el rutenio, el osmio, el renio,
el iridio, el rodio, el platino, el indio, el paladio, el
molibdeno, el tecnecio, el cobre, el cromo o el tungsteno. Son
preferidos en especial el rutenio, el iridio, el renio, el cromo y
el osmio. El más preferido es el rutenio.
Los ligandos L_{1}, L_{2} y L_{3} son
ligandos provistos por lo menos de dos heterociclos que contienen
nitrógeno. Son preferidos los heterociclos aromáticos, tales como
el bipiridilo, el bipirazilo, el terpiridilo y el fenantrolilo. Los
ligandos L_{1}, L_{2} y L_{3} se eligen con preferencia
especial entre los sistemas cíclicos de la bipiridina y la
fenantrolina.
El complejo puede contener además uno o varios
contraiones A para equilibrar la carga. Los ejemplos de contraiones
dotados de la carga negativa conveniente son los halogenuros,
OH^{-}, carbonato, carboxilato de alquilo, p.ej. los grupos
trifluoracetato, sulfato, hexafluorfosfato y tetrafluorborato. Son
preferidos en especial los grupos hexafluorfosfato, trifluoracetato
y tetrafluorborato. Son ejemplos de contraiones con carga positiva
idónea los cationes monovalentes, por ejemplo los iones de metales
alcalinos y de amonio.
Por otro lado, el grupo Z puede ser un grupo
efector que interaccione específicamente y modo preferido sin enlace
covalente con un componente de unión. Son ejemplos de componentes
de unión idóneos los haptenos o antígeno/anticuerpo, biotina o
análogos de biotina, por ejemplo la aminobiotina, la iminobiotina o
la destiobiotina/avidina o estreptavidina, el azúcar/lectina, los
ácidos nucleicos o análogos de ácido nucleico/ácido nucleico
complementario, receptor/ligando, p.ej. receptor de hormona
esteroide/hormona esteroide, en los que uno de los componentes del
par de unión es el grupo efector y, por tanto, un componente del
compuesto (I).
En otra forma preferida de ejecución, Z puede ser
también una sustancia terapéuticamente activa, p.ej. una toxina o
una protoxina, p.ej. una sustancia antitumoral.
Los compuestos (I) se utilizan como moléculas
engarce para obtener conjugados. En este proceso, el componente de
unión y en particular un componente de unión definido antes se une
con enlace covalente por lo menos a un grupo funcional libre del
compuesto (I).
El producto resultante de la unión contiene por
lo menos dos grupos de unión, con preferencia diferentes, que están
unidos entre sí mediante el engarce ramificado Y.
El grupo funcional reactivo X o Z del compuesto
(I) o del complejo (II) es un grupo reactivo que puede unirse
mediante enlace covalente a una sustancia biológica. El grupo X es
con preferencia un grupo ácido carboxílico activado, por ejemplo un
halogenuro de ácido carboxílico, un anhídrido de ácido carboxílico,
una hidrazida de ácido carboxílico, una azida de ácido carboxílico
o un éster activo, p.ej. una
N-hidroxi-succinimida, un éster de
p-nitrofenilo, de pentafluorfenilo, de imidazolilo o
de N-hidroxibenzotriazolilo, una amina, una
maleimida, un tiol o un grupo fotoactivable, p.ej. una azida. El
compuesto puede contener uno o varios grupos funcionales X o Z, que
pueden ser el mismo o diferentes. X y Z son con preferencia
diferentes. Si Z es un grupo funcional, estará presente solamente
una vez. Si Z es un grupo de unión, puede estar presente varias
veces, por ejemplo hasta 10 veces. Los grupos funcionales o grupos
de unión Z pueden ser iguales o diferentes y pueden estar
opcionalmente bloqueados con grupos protectores. Sin embargo, el
número total de grupos X más Z es por lo menos de 2, es decir, el
compuesto es un compuesto por lo menos bifuncional, con preferencia
un compuesto por lo menos hetero-bifuncional. Los
grupos activos apropiados de los engarces
hetero-bifuncionales se describen en Aslam, M.,
Dent, A., Bioconjugation, pp. 216-363, Mcmillan
Reference Ltd., Londres 1998.
El peso molecular del engarce es por lo menos de
1000 Da, porque entonces las ventajas del engarce resultan
especialmente manifiestas. El peso molecular del engarce se sitúa
con preferencia dentro del intervalo entre 1000 y 50.000 Da, en
especial dentro del intervalo entre 1000 y 20.000 Da y con
preferencia especial dentro del intervalo entre 1000 y 10.000
Da.
El compuesto (I) y el complejo metálico (II)
difieren de la técnica anterior por el hecho de que el engarce Y
entre X y Z es un engarce ramificado que tiene por lo menos un
soporte de carga o/y por lo menos un grupo hidrófilo. En el sentido
de la presente invención, el término "soporte de carga" indica
un grupo que está presente principalmente en forma iónica en un
valor de pH comprendido entre 6 y 8. El engarce contiene con
preferencia hasta 70 soportes de carga de este tipo, con preferencia
especial de 1 a 40 y con preferencia muy particular de 2 a 20.
El engarce contiene con preferencia especial por
lo menos un soporte de carga negativa. Los ejemplos de soportes de
carga negativa idóneos son los grupos fosfato, fosfonato,
sulfinato, sulfonato, sulfato y carboxilato, siendo preferidos en
especial los grupos carboxilato y fosfato.
Los ejemplos de soportes de carga positiva son
los grupos amino y amino monosustituido o polisustituido, por
ejemplo los grupos mono-, di- o trialquil-amino, en
los que alquino indica un resto alquilo de cadena lineal o
ramificada de 1 a 6 átomos de C o un resto alquilo cíclico de 3 a 6
átomos de C. Los soportes de carga positiva se eligen con
preferencia especial entre los aminoácidos básicos, por ejemplo la
lisina, y los aminoácidos sustituidos, por ejemplo la
dietil-lisina o la dipropil-lisina.
Las aminas y las aminas sustituidas pueden utilizarse también como
dadores de electrones para la detección de complejos metálicos por
electroquimioluminiscencia.
Los engarces (linkers) pueden contener también
grupos hidrófilos no cargados como alternativa a o como complemento
de los soportes de carga. Los ejemplos preferidos de grupos
hidrófilos no cargados son los grupos óxido de etileno o poli(óxido
de etileno) que tengan con preferencia por lo menos tres unidades de
óxido de etileno, los grupos sulfóxido, sulfona, amida de ácido
carboxílico, éster de ácido carboxílico, amida de ácido fosfónico,
éster de ácido fosfónico, amida de ácido fosfórico, éster de ácido
fosfórico, amida de ácido sulfónico, éster de ácido sulfónico, amida
de ácido sulfúrico y éster de ácido sulfúrico. Los grupos amida son
con preferencia grupos amida primaria, con preferencia especial
restos amida de ácidos carboxílicos de grupos laterales de
aminoácidos, p.ej. los aminoácidos asparagina y glutamina. Los
ésteres se derivan con preferencia de alcoholes hidrófilos, en
particular de alcoholes C_{1}-C_{3} o de dioles
o de trioles.
En el sentido de la presente invención, el
término "ramificado" indica que el engarce contiene una cadena
principal entre los grupos Z y X y además una o varias cadenas
laterales que arrancan de la cadena principal. Los soportes de carga
y los grupos hidrófilos pueden estar ubicados en la cadena
principal o/y en una cadena lateral. Si el engarce de la invención
contiene diversos grupos Z y X, la cadena principal propiamente
dicha podrá estar ya ramificada. Sin embargo, el engarce en
cualquier caso contiene además una o varias cadenas laterales que
no contienen ninguno de los grupos Z y X. El número de cadenas
laterales se sitúa con preferencia entre 1 y 10, con preferencia
especial entre 2 y 6 y con preferencia muy especial entre 2 y
4.
En una forma preferida de ejecución de la
invención, el engarce contiene una cadena principal que contiene
uno o varios grupos hidrófilos no cargados, ya mencionados antes,
en particular grupos amida de ácido carboxílico o/y grupos
polietilenglicol, pero debe haber por lo menos un soporte de carga
en una o en varias de las cadenas laterales. En este caso de 1 a 10
soportes de carga y en particular de 1 a 5 soportes de carga pueden
estar presentes por ejemplo en cada cadena lateral. Como
alternativa, el engarce puede contener también soportes de carga en
la cadena principal y grupos hidrófilos no cargados en una o en
varias cadenas laterales. Además, pueden concebirse también formas
de ejecución en las que tanto la cadena principal como las cadenas
laterales contengan grupos hidrófilos no cargados y también
soportes de carga.
En el caso de que el engarce ramificado contenga
grupos diferentes de X y Z, que puedan interferir con la química de
unión buscada, p.ej. grupo del tipo -COO^{-} o -NH_{2},
durante la síntesis o/y unión podrán utilizarse grupos protectores
idóneos, que el experto en la materia ya conoce. Los grupos
-NH_{2} terminales de las cadenas peptídicas laterales están con
preferencia inactivados, p.ej. por acetilación o succinilación.
La longitud de la cadena principal del engarce
comprende con preferencia de 7 a 200 átomos, con preferencia de 7 a
100 átomos. La cadena principal es una cadena de alquileno
modificada con la incorporación de heteroátomos, p.ej. átomos de O
o grupos amida y contiene por lo menos un sitio de ramificación. Las
cadenas laterales que arrancan del punto de ramificación tienen con
preferencia una longitud de 4 a 100 átomos.
Los soportes de carga están situados con
preferencia en el engarce de tal manera que un átomo de H de la
unidad alquileno de la cadena principal o/y de una cadena lateral
se haya reemplazado con un grupo que contiene un soporte de carga,
p.ej. NH_{3}^{+} o CO_{2}^{-}.
El engarce ramificado que contiene los soportes
de carga libres o/y grupos hidrófilos está compuesto con
preferencia, por lo menos parcialmente, de unidades ácido
aminocarboxílico que están unidades entre sí mediante enlaces
peptídicos. En tal engarce, los puntos de ramificación pueden
derivarse de ácidos aminocarboxílicos polifuncionales, que
contengan por lo menos tres grupos funcionales, p.ej. grupos amino
o carboxilato, de tal manera que continúe habiendo un grupo
funcional después de la incorporación a la cadena principal que
pueda utilizarse como punto de partida para la síntesis de la
cadena lateral. Las ramas se generan con preferencia especial con
ácidos diaminocarboxílicos, tales como la lisina, la ornitina, la
hidroxilisina, etc.
Los soportes de carga del engarce ramificado
pueden derivarse con preferencia de grupos libres cargados con carga
positiva o/y negativa de ácidos amino-carboxílicos
polifuncionales, que contiene un total como mínimo de tres grupos
cargados, p.ej. grupos amino, carboxilato o fosfato, de modo que
después de la incorporación al engarce y la reacción concomitante
de dos de los grupos cargados continúe estando presente por lo
menos un soporte de carga libre. Por ejemplo, los soportes de carga
pueden derivarse de ácidos aminocarboxílicos trifuncionales que
contengan (a) un grupo amino y dos grupos carboxilato o (b) dos
grupos amino y un grupo carboxilato. Los ejemplos de ácidos
aminocarboxílicos trifuncionales son la lisina, la ornitina, la
hidroxilisina, el ácido aspártico y el ácido glutámico, los ácidos
carboxílicos trifuncionales simétricos similares a los descritos en
EP-0 618 192 o US-5 519 142. Como
alternativa, uno de los grupos carboxilato de los ácidos
aminocarboxílicos trifuncionales (a) puede reemplazarse por un
grupo fosfato, sulfonato o sulfato. Un ejemplo de un aminoácido
trifuncional de este tipo es la fosfoserina.
Como alternativa, el engarce ramificado puede
componerse también por lo menos parcialmente de unidades
azúcar-fosfato, p.ej. un esqueleto de DNA sin
nucleobases o compuesto de estructuras
glico-peptídicas. El engarce puede componerse
además, por lo menos parcialmente, de unidades sacárido. En
cualquier caso, la cadena lateral del engarce está situada con
preferencia en un sitio de ramificación de la cadena principal que
está formado por una unidad trifuncional y la longitud de la cadena
lateral es por lo menos dos bloques estructurales de la síntesis,
p.ej. aminoácidos naturales o sintéticos u otros componentes, por
ejemplo el etilenglicol.
El engarce hidrófilo ramificado se emplea con
preferencia en procedimientos inmunológicos para reducir los
problemas causados por uniones no específicas.
Se ha constatado que es ventajoso el uso de
aminoácidos de origen no natural y de motivos de secuencias de
origen no natural, p.ej. los dipéptidos UE o UQ para construir la
molécula del engarce según la presente invención. Se ha constatado
que es especialmente ventajoso en ensayos serológicos, es decir, en
ensayos proyectados para detectar anticuerpos en sueros de
pacientes. Se ha comprobado que los engarces provistos de
\beta-aminoácidos de origen no natural son
bastante estables a las proteasas, p.ej. frente a las proteasas del
suero o del plasma y por ello representan una forma de ejecución
preferida adicional de la presente invención.
En una forma de ejecución de la presente
invención, el engarce ramificado que contiene un complejo metálico
tiene la fórmula general (III):
en la que M, X, A, n y m tienen los
significados definidos anteriormente, R_{1}, R_{2}, R_{3},
R_{4}, R_{5} y R_{6} son iguales o diferentes y cada uno
significa uno o varios sustituyentes, con la condición de que X
esté unido a uno de los ligandos mediante uno de los sustituyentes
R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} o R_{6} y el engarce
Y.
Los ligandos del complejo son sistemas
fenantrolina o bipirideno opcionalmente sustituidos, dependiendo de
si están presentes o no los grupos marcados con línea de trazo
discontinuo.
Los sustituyentes R_{1}, R_{2}, R_{3},
R_{4}, R_{5} y R_{6} de los ligandos son con preferencia
hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, en particular
alquilo C_{1}-C_{3}, fenilo o un grupo
hidrófilo, ya definido antes, con la condición de que no contengan
el engarce Y.
\newpage
En una forma de ejecución particularmente
preferida, el engarce ramificado, que contiene un complejo metálico,
tiene la fórmula general (IIIa):
en la que M, X y A tienen los
significados definidos anteriormente, R_{1}, R_{2}, R_{3},
R_{4}, R_{5} tienen los significados definidos anteriormente, s
es un número entero de 0 a 6, con preferencia de 1 a 4, Y significa
un engarce ramificado con soportes de carga libres o/y grupos
hidrófilos.
En las figuras 1-7 se presentan
ejemplos de compuestos de la fórmula (I) con complejos metálicos
como grupos marcadores o biotina como grupo efector y el grupo
lateral amino de la lisina como grupo funcional reactivo. Los puntos
de ramificación del engarce están formados por el aminoácido
trifuncional lisina, que tiene dos grupos amino y un grupo
carboxilato. Un grupo amino y un grupo carboxilato se utilizan para
formar enlaces peptídicos en la cadena principal del engarce,
mientras que el segundo grupo amino se utiliza como punto de
partida para la síntesis de la cadena lateral. Los soportes de
carga libre se forman con cadenas laterales de ácido glutámico. En
la figura 8 se presenta un grupo amino de lisina bloqueado con
fenilacetilo (Phac). El bloqueo de uno o de varios grupos reactivos
del engarce con grupos protectores, p.ej. fenilacetilo o/y otros
grupos protectores compatibles con la estructural general, permite
introducir grupos de unión lábiles en el compuesto (I).
El grupo reactivo carboxilato puede convertirse
por ejemplo en un éster activo por reacción con
N-hidroxisuccinimida o suberato de disuccinimidilo
(DSS) (ver figura 12). Como alternativa, el grupo amino primario
puede convertirse también en un grupo maleimida por reacción con el
éster
maleimidohexanoil-N-hidroxisuccinimida
(MHS) (ver figuras 9-11).
La obtención de los compuestos según la presente
invención se describe con mayor detalle a continuación, empleando
complejos metálicos a título de ejemplo. De manera similar pueden
obtenerse compuestos adicionales que, como grupo efector, contengan
por ejemplo biotina o antígenos peptídicos.
La síntesis de un engarce cargado y ramificado
sobre un grupo marcador o un grupo de fijación sobre fase sólida,
por ejemplo un ligando N-heterocíclico de un
complejo metálico, puede llevarse a cabo por una reacción de unión
en solución, uniendo una ácido aminocarboxílico opcionalmente
parcialmente protegido con un grupo reactivo del ligando, p.ej. un
ácido carboxílico. Esta etapa de unión puede repetirse opcionalmente
hasta que se haya sintetizado el engarce ramificado de la longitud
deseada. En este proceso se introduce por lo menos un ácido
aminocarboxílico polifuncional que contiene uno o varios grupos
laterales cargados.
A continuación se introduce el grupo reactivo X y
se eliminan los grupos protectores que puedan estar presentes en los
grupos laterales de los ácidos aminocarboxílicos. Esta síntesis del
ligando por unión sucesiva de aminoácidos en solución puede tener
lugar como material de partida sobre un solo ligando o incluso
sobre un ligando que ya esté unido a un complejo metálico. Un
material de partida idóneo es por ejemplo un complejo metálico
luminiscente que contenga un grupo carboxilato libre. Tales
complejos son conocidos por los documentos mencionados antes y se
suministran en forma de productos comerciales por ejemplo de la
empresa Igen Inc. Company, Rockville, MD, EE.UU.
Por otro lado, el engarce ramificado puede
obtenerse también por síntesis peptídica en fase sólida. En una
primera forma de ejecución de la síntesis en fase sólida se une el
amino ácido a través de su grupo carboxilato con el soporte de la
fase sólida y después se sintetiza el engarce deseado por unión
sucesiva de más aminoácidos. En este proceso se utilizan para
obtener el engarce según la invención por lo menos un aminoácido
que contenga un grupo cargado como grupo lateral, p.ej. un grupo
amino o un grupo carboxilato y por lo menos un aminoácido sirve
como punto de ramificación y que está opcionalmente en forma
protegida. Una vez completada la secuencia deseada del engarce
puede unirse un complejo metálico activado, p.ej. un éster activo,
al grupo amino N-terminal libre del péptido que
está fijado sobre la fase sólida. Una vez separado de la fase
sólida, el grupo reactivo X puede unirse al extremo carboxi del
engarce peptídico y entonces se eliminan los grupos protectores que
puedan estar presentes.
En otro modo de síntesis en fase sólida se ancla
un conjugado de complejo aminoácido-metal, que
contenga un grupo amino protegido y un grupo carboxilato, p.ej. el
Fmoc-Lys-(-Ru(bipiridil)_{3}-OH),
sobre una fase sólida mediante el grupo carboxilato libre y el
engarce peptídico puede sintetizarse después de liberar el grupo
amino bloqueado. Una vez completada la secuencia del engarce deseado
se suelta el complejo de la fase sólida, obteniéndose un engarce
que contiene por lo menos el grupo ancla carboxilato original en
forma de soporte de carga libre. El grupo reactivo X puede unirse al
extremo amino del engarce peptídico resultante.
En otro procedimiento de síntesis en fase sólida,
la secuencia del engarce ramificado con soportes de carga puede
sintetizarse también directamente sobre un epítope peptídico
seleccionado.
Para obtener los compuestos según la presente
invención puede utilizarse también una combinación de las variantes
de síntesis recién mencionadas. En el documento DE 44 30 998.8 se
describen conjugados de complejo aminoácido-metal
que son idóneos para la síntesis en fase sólida de los complejos
según la invención con un engarce cargado. Se remite a este
documento como referencia.
Otro objeto de la presente invención es un
compuesto de la fórmula general (I) ya definido antes.
Otro objeto más de la presente invención es un
conjugado que contiene por lo menos una sustancia biológica, a la
que está unido por lo menos un compuesto (I) según la invención.
Son ejemplos de sustancias biológicas idóneas las células, los
virus, las partículas subcelulares, las proteínas, las
lipoproteínas, las glicoproteínas, los péptidos, los polipéptidos,
los ácidos nucleicos, los ácidos peptídico-nucleicos
(PNA), los oligosacáridos, los polisacáridos, los
lipopolisacáridos, los metabolitos celulares, los haptenos, las
hormonas, las sustancias farmacológicas, los alcaloides, los
esteroides, las vitaminas, los aminoácidos y los azúcares.
El compuesto se une a la sustancia biológica
mediante un grupo funcional reactivo de dicho compuesto que puede
unirse mediante enlace covalente con un grupo funcional de la
sustancia biológica. Si el grupo funcional es un éster activo,
entonces podrá unirse por ejemplo a grupos amino libres de la
sustancia biológica. Si el grupo funcional es un resto maleimida,
entonces podrá unirse por ejemplo a grupos SH libres de la sustancia
biológica.
En una forma especialmente preferida de ejecución
de la presente invención, los compuestos se unen a péptidos que
tienen con preferencia una longitud máxima de 50 aminoácidos y con
preferencia especial un máximo de 30 aminoácidos. Estos péptidos se
obtienen con preferencia por síntesis de un péptido de la secuencia
deseada de aminoácidos sobre una fase sólida durante la cual a) se
une un grupo de unión a la fase sólida o/y un grupo marcador, p.ej.
un complejo metálico activado, con preferencia un derivado éster
activo-complejo metálico, con el grupo amino
N-terminal del péptido o/y b) se introduce un
derivado aminoácido, que está unido al efector o/y al grupo
marcador, p.ej. un hapteno o un complejo metálico, por lo menos en
una posición del péptido durante la síntesis. Esta unión del grupo
efector o/y del grupo marcador, p.ej. el aminoácido
N-terminal del péptido, se lleva a cabo con
preferencia antes de soltar el péptido de la fase sólida y antes de
eliminar los grupos protectores de los grupos reactivos laterales de
los derivados aminoácido empleados para la síntesis del
péptido.
Los péptidos contienen con preferencia una o
varias regiones de epítope inmunológicamente reactivas. Estas
regiones de epítope se derivan con preferencia de organismos
patógenos, p.ej. bacterias, virus y protozoos o de antígenos
autoinmunes. La región de epítope se deriva con preferencia especial
de antígenos víricos y corresponde a las secuencias de aminoácido
del HIVI, HIVII, HIVO o del virus de la hepatitis C (HCV).
Otros ejemplos preferidos de sustancias
biológicas son la biotina, las toxinas, las protoxinas, los ácidos
nucleicos, los anticuerpos o los fragmentos de anticuerpo, los
antígenos polipéptidos, es decir, los polipéptidos o haptenos
inmunológicamente reactivos, es decir, moléculas orgánicas que
tienen un peso molecular de 150 a 2.000, en particular moléculas
que tienen una estructura de esteroide, por ejemplo las
cardenólidas, cardenólida-glucósidos (p.ej. la
digoxina, la digoxigenina), los alcaloides esteroides, las hormonas
sexuales (p.ej. la progesterona), los glucocorticoides, etc. Otros
ejemplos de haptenos son las prostaglandinas, las leucotreínas, las
leuco-endiinas, los tromboxanos, etc.
Otro objeto más de la presente invención es el
uso de los compuestos según la invención o los conjugados según la
invención en un método de detección, p.ej. en un método de deleción
inmunológica o en un método de hibridación de ácidos nucleicos, en
particular en un ensayo de luminiscencia.
Si se utiliza como grupo marcador un complejo
metálico, entonces se detectará con preferencia por
electroquimioluminiscencia en la que las especies luminiscentes se
generan electroquímicamente sobre la superficie de un electrodo. Los
ejemplos de realización de ensayos de luminiscencia con complejos
metálicos de la técnica anterior se podrán encontrar en los
documentos EP-0 580 979, WO 90/05301, WO 90/11511 y
WO 92/14138. Se remite como referencia los métodos y dispositivos
para los ensayos de luminiscencia que se describen en ellos. Los
ensayos de electroquimioluminiscencia se llevan a cabo en presencia
de una fase sólida, que se compone con preferencia de
micropartículas, en particular de micropartículas magnéticas que
están provistas de un recubrimiento reactivo, p.ej. un
recubrimiento de estreptavidina. De este modo es posible detectar
complejos inmunes o de hibridación que contengan un complejo
metálico como grupo marcador y que estén unidos a la fase
sólida.
La medición de la electroquimioluminiscencia se
realiza con preferencia en presencia de un agente reductor del
complejo metálico, p.ej. una amina. Son preferidas las aminas
alifáticas y en particular las alquilaminas primarias, secundarias y
terciarias, cuyos grupos alquilo tienen en cada caso de 1 a 3
átomos de carbono. Es preferida en especial la tripropilamina. Sin
embargo, la amina puede ser también una amina aromática o una amina
heterocíclica. El agente reductor puede estar ya integrado en la
esfera del ligando del complejo.
Como amplificador puede estar presente además un
agente tensioactivo, p.ej. un agente no iónico del tipo fenol
etoxilado. Tales sustancias son productos comerciales, por ejemplo
el Triton X100 o el Triton N401.
Por otro lado, el complejo metálico luminiscente
puede detectarse midiendo la fluorescencia o la fluorescencia
resuelta en el tiempo, en la que se excita el quelato metálico por
irradiación con luz de una longitud de onda idónea y se mide la
radiación fluorescente resultante. Los ejemplos de realización de
ensayos de fluorescencia se encontrarán en los documentos
EP-0 178 450 y EP-0 255 534. Se
remite a ellos como referencias.
El principio descrito antes con detalle de uso de
complejos metálicos con engarces ramificados y cargados o
hidrófilos puede aplicarse de forma similar a otros grupos
marcadores o/y grupos efectores. Otros formados preferidos de
ensayo, en los que pueden utilizarse los engarces ramificados, son
los ensayos homogéneos. Dichos ensayos se basan por ejemplo en los
procedimientos de medición ya conocidos como CEDIA o FRET
(fluorescence resonance energy transfer, véase p.ej. Pope, A. J. y
col., Drug Discov. Today 4, 350-362, 1999),
por ejemplo la FRET resuelta en el tiempo.
Pueden conseguirse ventajas considerables con
respecto a los formatos experimentales ya conocidos utilizando
engarces ramificados según la invención. Por ejemplo, se pueden
manipular mejor los complejos metálicos luminiscentes cargados
positivamente dentro de un conjugado que contenga un engarce
ramificado cargado negativamente. Se observa en general una mejor
solubilidad y, por tanto, una menor fijación inespecífica cuando se
emplean engarces ramificados en combinación con grupos marcadores
hidrófobos o/y sustancias biológicas. En muchos casos, esto puede
utilizarse para aumentar el número de grupos marcadores y por tanto
incrementar el rendimiento de señal. Además, los engarces
ramificados impedidos estéricamente impiden las interacciones entre
los grupos marcadores hidrófobos y las sustancias biológicas
hidrófobas, lo cual permite asegurar una mejor accesibilidad del
grupo marcador.
Los engarces ramificados según la invención
pueden ser muy ventajosos en métodos de diagnóstico reduciendo por
ejemplo el valor en blanco, mejorando el intervalo dinámico del
ensayo, disminuyendo el límite inferior de detección, ampliando el
margen del ensayo o/y mejorando la relación entre señal y ruido. En
las aplicaciones terapéuticas puede lograrse una reducción de la
dosis de la sustancia activa o/y una reducción de los efectos
secundarios.
Otro aspecto más de la presente invención es que
los engarces que llevan uno o varios soportes de carga o/y uno o
varios grupos hidrófilos, ya definidos antes, provocan un largo
desplazamiento del peso molecular aparente en los métodos
cromatográficos, por ejemplo la electroforesis a través de gel,
p.ej. la electroforesis a través de geles de agarosa, la
electroforesis a través de gel de SDS, la filtración a través de
gel, la cromatografía de interacción hidrófoba y la cromatografía
de intercambio iónico. Este efecto aparece con los engarces
ramificados, descritos en la presente solicitud, y también en los
engarces lineales descritos en el documento WO 96/03409. Como
resultado de este desplazamiento del peso molecular aparente, es
decir, los engarces parecen tener un peso molecular más alto del
que realmente tienen, pueden utilizarse para preparar conjugados que
tengan una estequiometría definida y una composición homogénea. Una
vez el engarce, que puede llevar por ejemplo un número definido de
grupos marcadores o grupos efectos, se ha unido a un grupo de
unión, p.ej. una biomolécula, los productos de reacción de la
preparación podrán obtenerse simplemente por métodos
cromatográficos con arreglo a su estequiometría (p.ej. una molécula
de engarce por cada grupo de unión, todos moléculas de engarce por
cada grupo de unión, tres moléculas de engarce por cada grupo de
unión, etc.) en forma de fracciones separadas.
El engarce empleado para obtener un conjugado
particular debería tener en este caso un peso molecular aparente con
preferencia \geq 20%, con preferencia especial \geq 30% y con
preferencia muy especial \geq 40% del peso molecular aparente del
grupo de unión en el mismo sistema de separación
cromatográfica.
Se proporcionan además kits de reactivos (engarce
más grupo(s) marcador(es) o grupo(s)
efector(es) más grupo de unión, p.ej. la biomolécula a
marcar), un sistema (que incluye un dispositivo de medida para
detectar el grupo marcador respectivo) y una composición que
contiene un reactivo de estequiometría y funcionalidad
definidas.
Un ejemplo preferido de tales conjugados con una
estequiometría definida son los conjugados de fragmentos de
anticuerpos Fab' mono-digoxigenilados.
La presente invención se ilustra también con los
ejemplos y figuras siguientes.
Los ejemplos, referencias, lista de secuencias y
figuras siguientes se proporcionan para facilitar la comprensión de
la presente invención, cuyo verdadero alcance se establece en las
reivindicaciones anexas. Se da por supuesto que se pueden introducir
modificaciones a los procedimientos sin apartarse del espíritu de
la invención.
Las figuras de 1 a 12 y de 16 a 20 así como de 23
a 25 presentan compuestos según la invención. Las figuras de 13 a
15 presentan secuencias de aminoácidos de los antígenos de
referencia y las figuras 21 y 22 presentan el engarce ramificado
fijado sobre una fase sólida (con o sin el grupo protector MTT y
con grupos protectores sobre las cadenas laterales de aminoácidos)
que se emplea para obtener los conjugados de las figuras 23 a
25.
Los engarces ramificados se sintetizan mediante
una síntesis de péptido en fase
sólida-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) en un
aparato de síntesis discontinua de péptidos (por partidas), p.ej.
el Applied Biosystems A433. En cada caso se emplean para ello 4,0
equivalentes del derivado aminoácido que se indica en la tabla
1.
| A | Fmoc-Ala-OH |
| C | Fmoc-Cys(Trt)-OH |
| D | Fmoc-Asp(OtBu)-OH |
| E | Fmoc-Glu(OtBu)-OH |
| gE | Fmoc-Glu-OtBu |
| F | Fmoc-Phe-OH |
| G | Fmoc-Gly-OH |
| H | Fmoc-His(Trt)-OH |
| I | Fmoc-Ile-OH |
| K1 | Fmoc-Lys(Boc)-OH |
| K2 | Fmoc-Lys(Fmoc)-OH |
| K3 | Fmoc-Lys(Dde)-OH |
| K4 | Fmoc-Lys(Alloc)-OH |
| K5 | Fmoc-Lys(PhAc)-OH |
| K6 | Fmoc-Lys-(marcador)-OH |
| K7 | Fmoc-Lys(Fmoc)-OH |
| L | Fmoc-Leu-OH |
| M | Fmoc-Met-OH |
| N | Fmoc-Asn(Trt)-OH |
| P | Fmoc-Pro-OH |
| Q | Fmoc-Gln(Trt)-OH |
| R | Fmoc-Arg(Pmc)-OH |
| S | Fmoc-Ser(tBu)-OH |
| T | Fmoc-Thr(tBu)-OH |
| U | Fmoc-\beta-alanina-OH |
| V | Fmoc-Val-OH |
| W | Fmoc-Trp-OH |
| Y | Fmoc-Tyr(tBu)-OH |
| Z | Fmoc-ácido \varepsilon-amino-caproico |
| Ps | Fmoc-Ser-(PO(OBzl)OH)-OH |
| Cs | Fmoc-Cys(SO_{3}H)-OH |
| M_{tt}-U | Mtt-\beta-alanina-OH |
Se disuelven los aminoácidos y los derivados de
aminoácidos en N-metil-pirrolidona.
Se sintetiza el péptido sobre una resina de Wang (Wang, S.S., J.
Am. Chem. Soc. 95, 1328-33, 1973). Se carga
la resina con 0,2-0,4 mmoles/g. Se llevan a cabo
las reacciones de unión durante 20 minutos empleando 4 equivalentes
de diciclohexilcarbodiimida y 4 equivalentes de
N-hidroxibenzotriazol en dimetilformamida,
referidos a los derivados de Fmoc-aminoácido en
dimetilformamida como medio de reacción. El grupo Fmoc se elimina
después de cada paso de síntesis con piperidina al 20% en
dimetilformamida durante 20 min. Se elige la cantidad de resina de
tal manera que después de la última ramificación se empleen 4
equivalentes de Fmoc-aminoácido con respecto a los
grupos amino. La
Fmoc-Lys(Fmoc)-OH se emplea
para ramificar y sinterizar posteriormente dos brazos idénticos.
Las ramas asimétricas se logran con derivados de aminoácido que
tengan grupos protectores ortogonales en la cadena lateral, por
ejemplo el Fmoc-Lys(Dde) o el
Fmoc-Lys(Alloc). Estos grupos protectores
ortogonales se eliminan de la resina por métodos ya conocidos de la
bibliografía técnica (Bycroft, B.W. y col., J. Chem. Soc., Chem.
Commun. 9, 778-9, 1993; Merzouk, A. y col.,
Tetrahedron Letters 33, 477-80, 1992). Los
grupos amino terminales de la base sólida se acetilan o se
succinilan opcionalmente con anhídrido acético o con anhídrido
succínico.
El hapteno, el marcador o el grupo funcional en
aquellos casos, en los que el correspondiente derivado de aminoácido
es estable durante la síntesis en fase sólida, ya está introducido
en la resina p.ej. sobre el aminoácido N-terminal
del péptido.
La introducción p.ej. de un marcador de tipo
quelato metálico se efectúa a través de derivados éster apropiados
en el grupo amino N-terminal libre del péptido
fijado sobre el soporte. Para ello se activan cuatro equivalentes de
complejo de rutenio(bipiridilo)_{3} (BPRu) por cada
grupo funcional amino primario libre con
N-hidroxibenzotriazol/diciclohexil-carbodiimida
y se disuelven en una pequeña cantidad de DMSO y esta se añade por
goteo y se agita durante 2 h a temperatura ambiente.
Un hapteno o un marcador puede introducirse
también en el extremo C durante la misma síntesis en fase sólida por
incorporación directa por ejemplo de un quelato metálico o de
derivados de aminoácido fijados sobre biotina (descritos en WO
96/03409).
Se suelta el péptido del soporte y se eliminan
los grupos protectores que son lábiles ante los ácidos añadiendo a
temperatura ambiente durante 40 min 20 ml de ácido trifluoracético,
0,5 ml de etanodiol, 1 ml de tioanisol, 1,5 g de fenol y 1 ml de
agua. Dependiendo de los derivados aminoácido que se utilicen, es
posible además emplear cócteles que contengan unas pocas trampas de
radicales. A continuación se añaden 300 ml de éter de diisopropilo
enfriado a la solución reaccionante y se mantiene a 0ºC durante 40
min con el fin de precipitar el péptido por completo. Se filtra el
precipitado, se lava con éter de diisopropilo y se disuelve en una
pequeña cantidad de ácido acético del 50% y se liofiliza. Se
purifica el material en bruto obtenido mediante cromatografía HPLC
preparativa en una columna Delta-PAK RP C18 (columna
de 50 x 300 mm, 100 \ring{A}, 15 \mum) con un gradiente
apropiado (eluyente A: agua, 0,1% de ácido trifluoracético;
eluyente B: acetonitrilo, un 0,1% de ácido trifluoracético) durante
120 min. Se identifica el material eluido por espectrometría de
masas.
En las figuras de 1 a 7 y 16 se presentan
ejemplos de tales compuestos, obtenidos por síntesis en fase
sólida.
Como alternativa, el grupo marcador (label), el
grupo efector (hapteno) o el grupo funcional pueden introducirse
también después de haberse soltado el compuesto de la resina. Para
ello es necesario bloquear los demás grupos (que no se quieran
derivatizar) con un grupo protector que sea estable durante la
síntesis de péptidos en fases sólida y también en el momento de
soltar o liberar el compuesto del soporte (p.ej. con el grupo
fenilacetilo (Phac)). El grupo protector puede eliminarse por
métodos enzimáticos, con la PenG-amidasa (descrita
en PCT/EP 95/02921).
En la figura 8 se presenta un ejemplo de un
compuesto protegido con el Phac.
Para introducir el grupo funcional maleimida se
disuelve un péptido del ejemplo 1 en una solución 0,1 M de fosfato
potásico, pH 7,0, se mezcla con un equivalente de éster de
N-hidroxisuccinimida del ácido maleinimidohexanoico
(MH = maleinimidohexanoílo) en DMSO y se agita a 25ºC durante 16 h.
Se purifica el material obtenido por HPLC preparativa (ver antes).
Se comprueba la identidad del material eluido mediante
espectrometría de masas.
Se obtienen los compuestos representados en las
figuras de 9 a 11 y 17.
Se realiza el experimento de modo similar al
descrito en el ejemplo 6 del documento WO 96/03409.
Se obtiene el compuesto que se representa en la
figura 12.
Se realiza un ensayo de puente de doble antígeno
para detectar los anticuerpos específicos del VIH. En este método se
incuba un líquido de muestra con un antígeno marcado con rutenio y
un antígeno biotinilado para el anticuerpo a determinar, en
presencia de una fase sólida recubierta con estreptavidina. La
presencia de anticuerpos anti-NH en el líquido de
muestra se determina midiendo el marcador en fase sólida mediante la
electroquimioluminiscencia, empleando un sistema Elecsys®. Se sabe
que una secuencia parcial (SEQ ID NO: 1) de la proteína gp36 del
HIV2 contiene epítopes antigénicos que son reconocidos por
anticuerpos importantes de los sueros de los pacientes.
Se obtiene un péptido que contiene la SEQ ID NO:
1 ampliado en el extremo N con un engarce funcional SH (SEQ ID NO: 2
y figura 3) del modo descrito en WO 96/03652. El trazo continuo
entre las dos cisteínas (C) de la figura 13 indica el puente
-SS-cistina.
Se conjuga a temperatura ambiente durante 2 h el
péptido de la SEQ ID NO: 2 (figura 13) con el engarce de rutenio
activado con maleimido en una solución de tampón fosfato potásico
0,1 moles/l, pH 7, con el fin de derivatizar el péptido del VIH con
complejos de rutenio activados con maleimido. Los componentes no
reaccionados se separan por medio de una cromatografía HPLC
preparativa o por medio de cromatografía a través de gel. Se
liofilizan los productos purificados.
compuesto A: engarce BPRu de la figura 9 con
antígeno gp36
compuesto B: engarce BPRu de la figura 10 con
antígeno gp36
compuesto C: engarce BPRu de la figura 11 con
antígeno gp36
compuesto D: engarce BPRu de la figura 17 con
antígeno gp36.
Los conjugados que contienen la SEQ ID NO: 2 y
una de las diversas variantes de engarce (compuestos
A-D) se evalúan con el formato de ensayo descrito
antes. Todas las evaluaciones se efectúan con el mismo péptido
biotinilado que contiene el epítope gp36 idéntico de la SEQ ID NO:
1 (figura 14) y en la misma concentración. Se emplean antígenos de
detección marcados en una concentración equimolar a la del antígeno
de captura biotinilado.
El conjugado representado en la figura 15 y
obtenido del modo descrito en PC/EP 95/02921 se utiliza en calidad
de antígeno de referencia marcado según la técnica anterior
(comparación en las tablas de 2 a 4).
Los antígenos según la invención se utilizan en
cantidades equimolares con respecto al antígeno de la técnica
anterior. La concentración es de 0,018 nmoles/l.
En las cuentas ECL de la tabla 2 se recogen los
resultados de los ensayos con los conjugados A y C, comparados con
el compuesto de la figura 15. Se observa que solamente se obtienen
valores en blanco considerablemente más bajos y señales positivas
constantes cuando se emplean engarces según la invención, que se
traducen por tanto en una mejor diferenciación entre las señales
positivas y las señales negativas. Estas relaciones mejoradas entre
señal y ruido conducen a una mejora del intervalo de medición.
| Ensayo | comparación | A | C |
| muestra negativa | 6014 | 2044 | 1975 |
| muestra positiva | 345247 | 484681 | 391007 |
| relación pos/neg | 57,5 | 237,1 | 198 |
En las cuentas ECL de la tabla 3 se recogen los
resultados del ensayo con el conjuntado B comparado con el compuesto
de la figura 15. Se observa que los efectos ventajosos del engarce
ramificado permiten además la introducción de diversos marcadores
sin aumento significativo del valor en blanco. Es sorprendente
también que las señales positivas no se extingan y se observa
incluso un aumento en las cuentas medidas.
| Ensayo | comparación | B |
| muestra negativa | 6096 | 2366 |
| muestra positiva | 393197 | 765298 |
| relación pos/neg | 64,5 | 323,5 |
En la tabla 4 se recogen los resultados del
ensayo con el conjugado D comparado con el compuesto de la figura
15, expresados en cuentas ECL. De modo sorprendente, los engarces
hidrófilos, ramificados, no cargados, tienen también un efecto
positivo en el valor en blanco. Se mejora la relación entre señal y
ruido.
| Ensayo | comparación | D |
| muestra negativa | 6718 | 2015 |
| muestra positiva | 553816 | 759947 |
| relación pos/neg | 82,4 | 377,1 |
Con la pepsina se separa un anticuerpo monoclonal
anti-Dig para obtener fragmentos
F(ab')_{2}. Después de la rotura cuantitativa se inactiva
la pepsina aumentando el pH y añadiendo la pepstatina. Se reduce el
F(ab')_{2} a Fab' por medio de la cisteamina sin
purificación previa. La cisteamina rompe (descompone) casi
selectivamente los enlaces disulfuro de la región bisagra. A
continuación se dializa. Esto elimina la mayor parte de productos
de rotura Fc generados con la pepsina, ya que son lo suficientemente
pequeños para pasar a través de los poros del tubo de diálisis
(>10.000 daltones).
La síntesis del conjugado se lleva a cabo por
reacción del Gab' con un exceso de
BPRu-engarce-MH. En este proceso se
convierte principalmente un grupo SH de la región bisagra. Se
forman pequeñas cantidades del Fab' polirrutenilado como reacción
secundaria, muy probablemente como resultado de los enlaces
disulfuro intramoleculares reducidos de la cadena ligera y de la
cadena Fd.
Se purifica el conjugado en bruto con un tamiz
molecular. En este proceso se separa el material monorrutenilado
del material polirrutenilado.
Se reconstituye el liofilizado del anticuerpo
monoclonal anti-DIG-M19.11 IgG con
H_{2}O para obtener una concentración de 20 mg/ml. Se añaden 20
\mul de una solución 1 M de citrato, pH 3,5, por cada ml de
solución (concentración final del citrato = 20 mM). Se ajusta el pH
con HCl a 3,60. Se filtra a través de un filtro de 0,45 \mum. Se
determina la concentración en una densidad óptica OD de 280 nm (1
OD_{280 nm} = 1,4 mg/ml). Se ajusta a 10 mg/ml con citrato 20 mM,
pH 3,60. Se calienta la solución en un baño de agua a 37ºC. Se
añaden 100 \mul de solución de pepsina (3 mg/ml) por cada ml de
solución de anticuerpo y se incuba a 37ºC en el baño de agua. Una
vez finalizada la rotura se interrumpe la reacción aumentando el
valor del pH y añadiendo pepstatina.
Se añaden 52,6 \mul de una solución 0,1 M de
ditiotreitol (DTT) por cada ml de mezcla de rotura y se incuba a
25ºC durante 30 min en un baño de agua. Se dializa el Fab' frente a
una solución 0,1 M de NaH_{2}PO_{4}/NaOH, pH 6,5, NaCl 30 mM,
EDTA 2 mM.
Se disuelve el
BPRu-engarce-MH en DMSO. La
estequiometría del
Fab':BPRu-engarce-MH es de 1:3
(molar). La concentración final del Fab' en la mezcla es de 3,9
mg/ml. La concentración máxima de DMSO en la mezcla es del 10%. El
tiempo de reacción a temperatura ambiente es de 1 h.
Se concentra el conjugado en bruto
2-3 veces empleando un AMICON PM 10 y se purifica
mediante Superdex 200 (tampón: MOPS/NaOH 25 mM, pH 6,5, NaCl 50 mM,
10% de DMSO; cantidad aplicada: máx. 1,5% del lecho de gel;
fracciones: 0,5% del lecho de gel). Se reúnen las fracciones que
contienen el conjugado del
Fab'-BPRu-engarce.
Se realiza un ensayo de puente de doble antígeno
para detectar los anticuerpos específicos del VIH. En este método se
incuba un líquido de muestra con un antígeno biotinilado y un
antígeno marcado con digoxigenina del anticuerpo a determinar, en
presencia de una fase sólida recubierta con estreptavidina y un
anticuerpo anti-Dig-BPRu. La
presencia de anticuerpos anti-NH en el líquido de
muestra se determina midiendo el marcador fijado mediante el puente
de doble antígeno sobre la fase sólida por
electroquimioluminiscencia, empleando un sistema Elecsys®.
Se utiliza como antígeno un péptido de VIH de la
región gp41 del HIV1 (SEQ ID NO: 3), marcado en el extremo N. La
obtención de los antígenos biotinilados y digoxigenilados se
describe en el documento PCT/EP 95/02921. Para la detección del
péptido gp41 rutenilado se emplean dos conjugados
anti-Dig-BPRu.
compuesto E:
anti-Dig-IgG-BPRu
sin engarce
compuesto F:
anti-Dig-Fab'-BPRu
con el engarce de la figura 9.
Los antígenos se emplean en cantidades
equimolares en una concentración de 20 ng/ml.
En la tabla 5 se recogen los resultados de los
ensayos con el compuesto E comparados con los del compuesto F. Se
preincuban el antígeno digoxigenilado y el conjugado del anticuerpo
(concentración: 180 ng/ml). Se puede ver que el uso del engarce
según la invención se traduce en valores en blanco considerablemente
más bajos, lo cual conlleva una mejor diferenciación entre señales
positivas y negativas. Esto se observa fácilmente a partir de los
valores normalizados (tabla 5/2).
| Ensayo (cuentas) | sin conjugado BPRu = | compuesto E | compuesto F |
| valor en blanco del sistema | |||
| muestra negativa | 441 | 2117 | 582 |
| muestra positiva 1 | 437 | 1215275 | 668410 |
| muestra positiva 2 | 453 | 49187 | 25819 |
| Ensayo (normalizado a | sin conjugado BPRu = | compuesto E | compuesto F |
| la muestra neg.) | valor en blanco del sistema | ||
| muestra negativa | 1,0 | 1,0 | 1,0 |
| muestra positiva 1 | 0,99 | 574,1 | 1148,5 |
| muestra positiva 2 | 1,03 | 23,1 | 44,4 |
En la tabla 6 se recogen los resultados del
procedimiento experimental en el que se ha cambiado que las
esferillas magnéticas con complejos inmunes fijados se lavan antes
de la adición del conjugado de anticuerpo (concentración 600 ng/ml).
También en este caso los valores en blanco son considerablemente
menores y esto conlleva una mejor diferenciación. Esta mejor
relación entre señal y ruido es evidente en especial en la tabla
6/2, en la que los valores se han normalizado con respecto al
blanco del sistema, medido en la muestra negativa.
| Ensayo (cuentas) | sin conjugado BPRu = | compuesto E | compuesto F |
| valor en blanco del sistema | |||
| muestra negativa | 464 | 2771 | 758 |
| muestra positiva 1 | 453 | 1503690 | 686607 |
| muestra positiva 2 | 480 | 47040 | 27133 |
| Ensayo sueros | sin conjugado BPRu = | compuesto E | compuesto F |
| pos/neg | valor en blanco del sistema | ||
| muestra negativa | 1,0 | 1,0 | 1,0 |
| muestra positiva 1 | 0,98 | 592,6 | 905,8 |
| muestra positiva 2 | 1,03 | 17,0 | 35,8 |
En la tabla 7 se recogen las uniones
inespecíficas del conjugado de anticuerpo sobre la fase sólida
recubierta con estreptavidina. En este procedimiento de ensayo se
utiliza únicamente el tampón y no se emplean antígenos biotinilados
ni digoxigenilados. La concentración del conjugado del anticuerpo
rutenilado es de 600 ng/ml. El engarce según la invención permite
obtener de nuevo mejores valores en blanco.
| Ensayo (cuentas) | sin conjugado BPRu = | compuesto E | compuesto F |
| valor en blanco del sistema | |||
| muestra negativa | 333 | 3188 | 566 |
| tampón | 329 | 983 | 436 |
Se disuelven 8,5 mg de
BPRu-engarce-NH (figura 1) en 2 ml
de tampón fosfato, pH 8,5, y se añaden por goteo 1,8 mg de derivado
de testosterona activada
(testosterona-3-dimetil-carboxioxima-NHS)
disueltos en 2 ml de dioxano. Se mantiene en agitación a
temperatura ambiente durante 6 h, con exclusión de la luz.
Se purifica el producto en bruto por
cromatografía HPLC preparativa. Se confirma por espectrometría de
masas (MALDI) que el peso molecular es de 3180.
Se lleva a cabo la síntesis de modo similar al
descrito en 7.1. La EM-MALDI confirma el peso
molecular esperado.
Partiendo de un derivado de lisina de un complejo
de rutenio se hace reaccionar el grupo
\alpha-amino libre de la lisina en un primer paso
por métodos convencionales con el éster (MP)-NHS
del ácido maleimido-propiónico. A continuación se
activa el ácido carboxílico por métodos estándar.
En el paso siguiente se hacen reaccionar a
temperatura ambiente 3,64 mg del éster activo con 25,5 mg del
polietilenglicol modificado con amino
H_{2}N-PEG-OCH_{3}-5000
(Shearwater) en 20 ml de acetonitrilo. Se concentra la mezcla del
producto en un evaporador rotatorio y se purifica por cromatografía
a través de gel (la EM-MALDI confirma el peso
molecular esperado).
La unión ulterior de la maleimida con el péptido
gp36 se realiza de modo similar al método recién descrito. El peso
molecular se determina por espectrometría de masas y corresponde al
peso molecular esperado de 6990.
Se sintetiza por procedimientos estándar el
engarce peptídico ramificado protegido con Mtt (figura 21).
Se elimina el grupo protector Mtt de modo
específico con arreglo al procedimiento descrito por Aletras, A. y
col., Int. J. Peptide Res. 45, 488, 1995, obteniéndose el
engarce fijado sobre fase sólida de la figura 22.
Se suspenden 50 mg de la molécula del engarce
ramificado fijado sobre fase sólida (figura 22) con un único grupo
amino N-terminal no protegido en 4 ml de DMF. A
continuación se añaden 10 \mul de trietilamina y el marcador
fluorescente activado (16 mg) y se conjuga con el engarce fijado
sobre la fase sólida (la síntesis del marcador activado, el éster
de la
rodamina-N-hidroxi-succinimida,
se describe en DE-4 137 934). Se agita la mezcla
reaccionante a temperatura ambiente durante 12 h.
Después de separarse de la fase sólida en
condiciones estándar (ácido trifluoracético al 95%) se realiza la
purificación por HPLC prep.
Por reacción de 16 mg del producto intermedio con
18,5 mg del suberato de disuccinimidilo (DSS) en 10 ml de DMF con 21
\mul de trietilamina durante 5 h y por purificación estándar se
obtienen 7 mg de producto (engarce ramificado marcado con rodamina
activada con NHS, tal como se muestra en la figura 23). Se analiza
por EM-MALDI-TOF y se encuentra un
peso molecular equivalente al valor teórico.
Se añaden 13 mg del derivado éster acridinio
(síntesis con arreglo a EP-82 636) a 50 mg de
engarce fijado sobre fase sólida (ver figura 22) disuelto en 4 ml de
DMF y se hacen reaccionar del modo descrito en el ejemplo 7.4.
Se purifica el engarce marcado con acridinio por
HPLC prep. y se liofiliza.
El rendimiento en producto es de 7 mg.
Se analiza el producto (ver figura 24) por
EM-MALDI-TOF y el peso molecular
hallado equivale al valor teórico.
Se sintetiza el compuesto fijado sobre fase
sólida, ramificado, marcado con acridinio, del modo descrito en el
ejemplo 7.4 (síntesis de la acridinio-sulfonamida,
véase US-5 543 524). Después de separarse de la fase
sólida y purificarse (ver antes) se hace reaccionar el grupo amino
C-terminal libre del engarce peptídico (4 mg de
engarce) con 0,7 mg de éster de
maleimidopropioniloxi-succinimida (MPS) en 1 ml de
DMF (temperatura ambiente, 150 h) y se purifica por HPLC prep.
El rendimiento de producto es de 2 mg.
Se analiza el producto (ver figura 25) por
EM-MALDI-TOF y el peso molecular
hallado equivale al valor teórico.
El engarce marcado con
sulfonamida-acridinio activado con MPS se conjuga
con grupos SH. En este ejemplo se emplea la TSH (hormona
estimuladora del tiroides) y la unión se realiza con arreglo a
método estándar (ver Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques,
Academic Press 1996, p. 456 y sig.).
En un estudio comparativo aplicando un
inmunoensayo de dos pasos (con paso de lavado después de la
incubación de la muestra con el primer anticuerpo) para la TSH, se
compara el conjugado con TSH de este ejemplo con el conjugado de TSH
sin engarce. Las concentraciones de TSH se indican en \muIU/ml en
la tabla 8. El Cal 1 y el Cal 2 son productos comerciales, Roche
Diagnostics, número de catálogo TSH Cal Set: Id. nº 1731483; las
muestras marcadas con Tris (Tris 100 mM, 1% de BSA, 0,1% de Thesit,
0,1% de Oxaban, pH 7,4) contienen 0 y 50 \muiU de TSH por ml,
respectivamente.
| TSH \muIU/ml | relación señal-ruido | relación señal-ruido | |
| (sin engarce) | (con engarce) | ||
| Cal 1 | 0 | ||
| Cal 2 | 1,43 | 2 | 7 |
| Tris 0 | 0 | ||
| Tris 50 | 50 | 17 | 127 |
Por la tabla 8 resulta obvio que el conjugado de
SH que contiene el engarce ramificado de la presente invención
presenta una mejora significativa en lo que respecta a la relación
señal-ruido si se compara con el conjugado sin
engarce.
Aletras, A. y col., Int. J. Peptide
Res. 45, 488, 1995
Aslam, M., Dent A., Bioconjugation,
Mcmillan Reference Ltd., Londres 1998, p. 95 y sig.
Bredehorst, R. y col., Anal.
Biochem. 193, 272-9, 1991
Bycroft, B.W. y col., J. Chem. Soc.,
Chem. Commun. 9, 778-9, 1993
Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques,
Academic Press 1996, p. 456 y sig.
Merzouk, A. y col., Tetrahedron
Letters 33, 477-80, 1992
Pope, A.J. y col., Drug Discov.
Today 4, 350-362, 1999
Wang, S.S., J. Am. Chem. Soc.
95, 1328-33, 1973
PCT/EP-95/02921
DE-4 137 934
DE-44 30 998.8
EP-0 061 888
EP-0 178 450
EP-0 255 534
EP-0 580 979
EP-0 618 192
US-5 519 142
WO 87/06706
WO 90/05301
WO 90/11511
WO 92/14138
WO 96/03409
WO 96/03410
WO 96/03652
<110> F. HOFFMANN-LA ROCHE
AG
\hskip1cmRoche Diagnostics GmbH
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Compuestos con un engarce
ramificado
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 19063WO
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> DE-10048417.1
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-09-29
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Ser Trp Gly Cys Ala Phe Arg Gln Val Cys
His Thr Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en posición 3 denota (Z) ácido
epsilon-amino-caproico y Xaa en las
posiciones 2 y 4 denota (U) beta-alanina
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Asn Ser Trp Gly Cys Ala Phe
Arg Gln Val}
\sac{Cys His Thr Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile
Cys Thr Thr}
\sac{Ala Val}
Claims (29)
1. Uso de un compuesto de la fórmula general
(I):
(I)Z_{n} - Y -
X_{m}
en la que Z significa por lo menos
un grupo funcional reactivo o un grupo de unión, X es un grupo
funcional reactivo que está unido mediante enlace covalente a Z a
través del engarce Y, dicho engarce (linker) es un engarce
ramificado que tiene un peso molecular de > 1000 Da y contiene
por lo menos un soporte de carga, n es un número entero de 1 a 10 y
m es 1 ó 2, para la producción de
conjugados.
2. Uso de un compuesto de la fórmula general
(I):
(I)Z_{n} - Y -
X_{m}
en la que Z significa por lo menos
un grupo funcional reactivo o un grupo de unión, X es un grupo
funcional reactivo que está unido mediante enlace covalente a Z a
través del engarce Y, dicho engarce es un engarce ramificado que
tiene un peso molecular de > 1000 Da y contiene por lo menos un
soporte de carga y por lo menos un grupo hidrófilo, n es un número
entero de 1 a 10 y m es 1 ó 2, para la producción de
conjugados.
3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que
el grupo de unión es un grupo marcador o un grupo efector.
4. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 3, en el que el grupo de unión es un grupo
marcador elegido entre grupos de detección luminiscentes y
fluorescentes, enzimas, micropartículas, nanopartículas y
radioisótopos.
5. Uso según la reivindicación 4, en el que el
grupo marcador es un complejo de quelato metálico y el compuesto es
de la fórmula general (II):
(II)[M(L_{1}L_{2}L_{3})]_{n}
- Y -
X_{m}A
en la
que
- M es un catión metálico divalente o trivalente,
elegido entre los iones de tierras raras o de metales de
transi-
ción;
ción;
- L_{1}, L_{2} y L_{3} son iguales o
diferentes e indican ligandos provistos por lo menos de dos
heterociclos que contienen nitrógeno; L_{1}, L_{2} y L_{3}
están unidos al catión metálico mediante átomos de nitrógeno;
- X es un grupo funcional reactivo que está unido
mediante enlace covalente por lo menos a uno de los ligandos
L_{1}, L_{2} y L_{3} a través del engarce Y;
- n es un número entero de 1 a 10;
- m es el número 1 ó 2 y
- A significa el contraión que puede ser
necesario para equilibrar la carga.
6. Uso según una de las reivindicaciones de 1 a
5, en el que el grupo de unión es un grupo efector elegido entre
componentes de pares de fijación bioafines específicos.
7. Uso según la reivindicación 6, en el que el
grupo efector se elige entre biotina y análogos de la misma,
estreptavidina, avidina, antígenos, haptenos, anticuerpos, ácidos
nucleicos, análogos de ácidos nucleicos, azúcares, lectinas,
receptores y ligandos receptores.
8. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 7, en el que el grupo funcional reactivo es
un ácido carboxílico, un halogenuro de ácido carboxílico, un
anhídrido de ácido carboxílico, una hidrazida de ácido carboxílico,
una azida de ácido carboxílico, una amina, un éster activo, una
maleimida, un tiol o un grupo fotoactivable.
9. Uso según una de las reivindicaciones de 1 a
8, en el que el engarce ramificado contiene por lo menos un soporte
de carga negativa elegido entre el conjunto formado por los grupos
fosfatos, fosfonatos, sulfinatos, sulfonatos, sulfatos y
carboxilatos.
\newpage
10. Uso según la reivindicación 9, en el que el
engarce ramificado contiene por lo menos un grupo carboxilato o/y
un grupo fosfato.
11. Uso según una de las reivindicaciones de 1 a
10, en el que el engarce ramificado contiene por lo menos un
soporte de carga positiva elegido entre los grupos amino y los
grupos amino sustituido.
12. Uso según una de las reivindicaciones de 1 a
11, en el que el engarce ramificado contiene hasta 70 soportes de
carga.
13. Uso según la reivindicación 12, en el que el
engarce ramificado contiene de 1 a 40 soportes de carga.
14. Uso según una de las reivindicaciones
previas, en el que el engarce ramificado contiene por lo menos un
grupo hidrófilo no cargado, elegido entre los grupos siguientes: el
óxido de etileno, el poli(óxido de etileno), el sulfóxido, la
sulfona, la amida de ácido carboxílico, el éster de ácido
carboxílico, la amida de ácido fosfónico, el éster de ácido
fosfónico, la amida de ácido fosfórico, el éster de ácido fosfórico,
la amida de ácido sulfónico, el éster de ácido sulfónico, la amida
de ácido sulfúrico y el éster de ácido sulfúrico.
15. Uso según la reivindicación 14, en el que por
lo menos un grupo hidrófilo no cargado es un grupo amida de ácido
carboxílico primario.
16. Uso según una de las reivindicaciones
previas, en el que el peso molecular del engarce se sitúa entre
1000 y 50.000 Da.
17. Uso según una de las reivindicaciones de 1 a
16, en el que el engarce ramificado está compuesto por lo menos
parcialmente por unidades ácido carboxílico, que están unidas entre
sí mediante enlaces peptídicos.
18. Uso según la reivindicación 17, en el que los
soportes de carga se derivan de ácidos aminocarboxílicos
polifuncionales que todavía contienen por lo menos un soporte de
carga libre después de su incorporación al engarce.
19. Uso según la reivindicación 17, en el que los
grupos hidrófilos se derivan de ácidos aminocarboxílicos
polifuncionales que todavía contienen por lo menos un grupo
hidrófilo después de su incorporación al engarce.
20. Uso según la reivindicación 17, en el que las
posiciones de ramificación se derivan de ácidos aminocarboxílicos
polifuncionales.
21. Uso según las reivindicaciones 18, 19 ó 20,
en el que los ácidos aminocarboxílicos polifuncionales se eligen
entre la lisina, la ornitina, la hidroxilisina, el ácido aspártico,
el ácido glutámico, la asparagina, la glutamina, la fosfoserina y
los ácidos aminocarboxílicos trifuncionales sintéticos.
22. Compuesto de la fórmula general (I)
(I)Z_{n} - Y -
X_{m}
en la que Z significa por lo menos
un grupo funcional reactivo o un grupo de unión, X es un grupo
funcional reactivo que está unido mediante enlace covalente a Z a
través del engarce Y, dicho engarce es un engarce ramificado que
tiene un peso molecular de > 1000 Da y contiene por lo menos un
soporte de carga, n es un número entero de 1 a 10 y m es 1 ó
2.
23. Compuesto de la fórmula general (I):
(I)Z_{n} - Y -
X_{m}
en la que Z significa por lo menos
un grupo funcional reactivo o un grupo de unión, X es un grupo
funcional reactivo que está unido mediante enlace covalente a Z a
través del engarce Y, dicho engarce es un engarce ramificado que
tiene un peso molecular de > 1000 Da y contiene por lo menos un
soporte de carga y por lo menos un grupo hidrófilo, n es un número
entero de 1 a 10 y m es 1 ó
2.
24. Conjugados que contienen por lo menos una
sustancia biológica y por lo menos un compuesto de la fórmula
general (I) tal como se reivindica en las reivindicaciones 22 y
23.
25. Conjugados según la reivindicación 24, en los
que la sustancia biológica es un anticuerpo o un fragmento de
anticuerpo, un ácido nucleico, un antígeno polipéptido, un péptido
inmunológicamente reactivo o un hapteno.
26. Uso de compuestos según las reivindicaciones
22 ó 23 o de conjugados según la reivindicación 24 ó 25, en un
método inmunológico de detección o en un método de hibridación de
ácidos nucleicos.
27. Uso según la reivindicación 26, en un método
de luminiscencia.
28. Uso según la reivindicación 26 ó 27 en un
método de electroquimioluminiscencia.
29. Uso según la reivindicación 28 para mejorar
la solubilidad de grupos marcadores o de grupos efectores o de sus
conjugados.
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