JP3647845B2 - 分枝リンカーを有する化合物 - Google Patents

Description

【０００１】
本発明は、診断法または治療法における適用のための複合体を作製するための新しいリンカーおよびその使用に関する。
【０００２】
数個の結合性基または／およびエフェクター基、例えば、標識基または固相結合性基または毒素を含有してなる複合体は、しばしば診断法または治療法において使用される。かかる複合体は、直接結合させることにより、または先行技術で公知のブリッジ構造もしくはリンカー構造を用いることにより調製されうる。複合体パートナー間または他の成分間の分子内および分子間相互作用を妨害することは、しばしば、かかる複合体の性質にとって不利である。
【０００３】
診断試験において、これらの望ましくない分子内および分子間相互作用は、しばしば、シグナル、信号対雑音比、測定範囲の幅、ブランク値、検出下限の力学的範囲などの重要なアッセイパラメータの欠陥をもたらし、したがって、アッセイの相当な欠陥をもたらす。治療手順において、該相互作用がさらに、有効性または標的特異性の減少をもたらす。
【０００４】
発光金属複合体の複合体のための先行技術で公知のリンカーの使用（欧州特許公開公報第０１７８４５０Ａ号、欧州特許公開公報第０５８０９７９Ａ号、国際公開第８７／０６７０６号パンフレット）は、例えば、アッセイの力学的範囲の低下をもたらす。かかる複合体の他の欠点は、タンパク質に対する非常に高い非特異的結合性および非常に高いブランク値である。しかしながら、類似の問題は、他の標識基および固相結合性基でも生じる。
【０００５】
国際公開第９６／０３４０９号パンフレットおよび国際公開第９６／０３４１０号パンフレットには、金属錯体の反応性結合性基を配位子の１つに連結するリンカー内への遊離の正または／および負の電荷担体の導入、またはこれらの発光金属錯体内への親水性基の導入が、これらの錯体の複合体の非特異的吸収を低減し、したがって、イムノアッセイにおいて試験感度ならびに該複合体の安定性および回収率が向上することが開示されている。さらに、ある場合においては、総収量（ｑｕａｎｔｕｍ ｙｉｅｌｄ）の増加を達成することが可能である。
【０００６】
Ｂｒｅｄｅｈｏｒｓｔ，Ｒ．らのＡｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９３（１９９１）２７２−９には、主鎖としてインスリンＡ鎖分子の２１個のアミノ酸残基を含有する三官能性ハプテン−発蛍光団複合体が記載されている。このように発光基とハプテン間のリンカーの働きをするインスリンＡ鎖は、直鎖リンカーであり、分枝リンカーではない。
【０００７】
最近の研究において、国際公開第９６／０３４０９号パンフレットまたは国際公開第９６／０３４１０号パンフレットによる親水性または帯電リンカーの使用は、試験成績において相当な利益をもたらすことがわかったが、かかる複合体を用いた場合でも、ブランク値は該系ブランク値よりも相当高い。したがって、非特異的結合の低減により、ブランク値をさらに低下させることが望ましいと思われる。また、標識基と他の試験化合物間の非特異的な分子内および分子間相互作用は、シグナル生成量（ｓｉｇｎａｌ ｙｉｅｌｄ）および該標識基の接近性（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）に悪影響を及ぼすことなく低減されるべきである。
【０００８】
驚くべきことに、前記の欠点は、帯電担体または／および親水性基を特に側鎖に有する分枝リンカーを使用することにより排除されうることがわかった。また、これらの分枝リンカーは、診断もしくは治療法において、またはスクリーニング目的のために使用される他の種類の複合体における改善をもたらす。
【０００９】
したがって、本発明の主題は、複合体作製のための、一般式（Ｉ）：
Ｚｎ−Ｙ−Ｘｍ （Ｉ）
式中、Ｚは少なくとも１つの反応性官能基または結合性基であり、Ｘは、リンカーＹを介してＺに共有結合している反応性官能基であり（ここで、該リンカーは、１０００Ｄａ以上の分子量を有し、かつ少なくとも１つの電荷担体または／および少なくとも１つの親水性基を含有する分枝リンカーである）、ｎは１〜１０の整数、好ましくは１〜４の整数であり、ｍは１または２、好ましくは１である、
の多官能性化合物の使用である。
【００１０】
Ｚ基は、１回または数回生じ得、各場合において、独立して反応性官能基または結合性基でありうる。該結合性基の例は、標識基またはエフェクター基である。エフェクター基は、例えばバイオアフィン（ｂｉｏａｆｆｉｎｅ）結合対の他方のパートナーと特異的に相互作用しうるバイオアフィン結合対のパートナーである。
【００１１】
標識基は、染料などの任意の検出可能な公知の基、化学発光基などの発光標識基、例えばアクリジニウムエステルもしくはジオキセタン、または蛍光染料、例えばフルオレセイン、クマリン、ローダミン、オキサジン、レソルフィン（ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ）、シアニンおよびその誘導体から選択されうる。標識基の他の例は、ルテニウム錯体もしくはユーロピウム錯体などの発光金属錯体またはＣＥＤＩＡ（クローン化酵素ドナーイムノアッセイ（Ｃｌｏｎｅｄ Ｅｎｚｙｍｅ Ｄｏｎｏｒ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、例えば欧州特許第００６１８８８号）に使用されるような酵素、ミクロ粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）またはナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、例えばラテックス粒子もしくは金属ゾルならびに放射性同位体である。
【００１２】
好ましい態様において、標識基は発光金属錯体であり、該化合物は一般式（ＩＩ）：
［Ｍ（Ｌ₁ Ｌ₂ Ｌ₃ ）］ｎ−Ｙ−ＸｍＡ （ＩＩ）
式中、
Ｍは、希土類金属イオンまたは遷移金属イオンから選ばれる二価または三価の金属カチオンであり、Ｌ₁ 、Ｌ₂ およびＬ₃ は、同じかまたは異なっており、窒素含有複素環を少なくとも２つ含有する配位子を表し、かつ窒素原子を介して金属カチオンに結合しており、Ｘは、リンカーＹを介して配位子Ｌ₁ 、Ｌ₂ およびＬ₃ の少なくとも１つに共有結合している反応性官能基であり、ｎは１〜１０の整数、好ましくは１〜４の整数であり、ｍは１または２、好ましくは１であり、Ａは電荷を一様にするために必要でありうる対イオンを表す、
の構造を有する。
【００１３】
金属錯体は、好ましくは発光金属錯体、すなわち、適切な励起後に検出可能な発行反応を行なう金属錯体である。発光反応は、例えば、蛍光測定により、もしくは電気化学発光（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）測定により検出され得る。この錯体における金属カチオンは、例えば、遷移金属または希土類金属である。該金属は、好ましくは、ルテニウム、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、白金、インジウム、パラジウム、モリブデン、テクネチウム、銅、クロムまたはタングステンである。ルテニウム、イリジウム、レニウム、クロムおよびオスミウムが特に好ましい。ルテニウムが最も好ましい。
【００１４】
配位子Ｌ₁ 、Ｌ₂ およびＬ₃ は、窒素含有複素環を少なくとも２つ含有する配位子である。ビピリジル、ビピラジル、テルピリジル（ｔｅｒｐｙｒｉｄｙｌ）およびフェナントロリル（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｙｌ）などの芳香族複素環が好ましい。配位子Ｌ₁ 、Ｌ₂ およびＬ₃ は、特に好ましくは、ビピリジン環系およびフェナントロリン環系から選ばれる。
【００１５】
該錯体は、電荷を一様にするための１つ、または数個の対イオンＡをさらに含みうる。好適な負の帯電対イオンの例は、ハロゲン化物、ＯＨ^- 基、カーボネート基、アルキルカルボキシレート基、例えばトリフルオロアセテート基、スルフェート基、ヘキサフルオロホスフェート基およびテトラフルオロボレート基である。ヘキサフルオロホスフェート基、トリフルオロアセテート基およびテトラフルオロボレート基が特に好ましい。好適な正の帯電対イオンの例は、アルカリ金属イオンおよびアンモニウムイオンなどの一価カチオンである。
【００１６】
他方において、Ｚ基は、結合パートナーと特異的に、好ましくは非共有結合的に相互作用するエフェクター基でありうる。好適な結合パートナーの例は、ハプテンまたは抗原／抗体、アミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチンなどのビオチンまたはビオチンアナログ／アビジンまたはストレプトアビジン、糖／レクチン、核酸または核酸アナログ／相補核酸、レセプター／配位子、例えばステロイドホルモンレセプター／ステロイドホルモンであり、この場合、結合対の一方のパートナーはエフェクター基であり、したがって化合物（Ｉ）の成分である。
【００１７】
さらに好ましい態様では、Ｚは治療上活性な物質、例えば毒素、またはプロ毒素、例えば抗腫瘍物質でもあり得る。
【００１８】
複合体を調製するために、化合物（Ｉ）がリンカー分子として使用される。このプロセスにおいて、結合パートナー、特に上述のような結合パートナーを化合物（Ｉ）の少なくとも１つの遊離官能基に共有結合させる。
【００１９】
得られる結合生成物は、分枝リンカーＹを介して互いに連結された少なくとも２つの、好ましくは異なる結合性基を含有する。
【００２０】
化合物（Ｉ）または錯体（ＩＩ）の反応性官能基ＸまたはＺは、生物学的物質に共有結合されうる反応性基である。Ｘ基は、好ましくは、カルボン酸ハロゲン化物、カルボン酸無水物、カルボン酸ヒドラジド、カルボン酸アジドなどの活性化カルボン酸基、または活性エステル、例えばＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、イミダゾリルエステルもしくはＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、アミン、マレイミド、チオールまたは光活性化性基、例えばアジドである。該化合物は、同じか異なりうる１つまたは数個の官能基ＸまたはＺを含有しうる。ＸおよびＺは、好ましくは異なっている。Ｚが官能基である場合、これは好ましくは１つだけで存在する。Ｚが結合性基である場合、それは、数個、例えば１０個まで存在しうる。官能基または結合性基Ｚは、それぞれ同じか異なり得、任意に保護基によりブロックされている。しかしながら、Ｘ基とＺ基を足した総数は、少なくとも２である、すなわち該化合物は、少なくとも二官能性化合物、好ましくは少なくともヘテロ二官能性化合物である。ヘテロ二官能性リンカーのための適切な活性基は、Ａｓｌａｍ Ｍ．，Ｄｅｎｔ Ａ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ（１９９８）Ｍｃｍｉｌｌａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐ２１６−３６３に記載されている。
【００２１】
リンカーの分子量は、少なくとも１０００Ｄａである。これは、リンカーの利点が特に明白になるからである。リンカーの分子量は、好ましくは１０００〜５０，０００Ｄａの範囲であり、特に１０００〜２０，０００Ｄａの範囲であり、最も好ましくは１０００〜１０，０００Ｄａの範囲である。
【００２２】
化合物（Ｉ）および金属錯体（ＩＩ）は、ＸとＺ間のリンカーＹが、少なくとも１つの電荷担体または／および少なくとも１つの親水性基を含有する分枝リンカーであるという点で先行技術と異なる。本発明の文脈において、「電荷担体」という用語は、ｐＨ値が６〜８の範囲で、主にイオン形態で存在する基を意味する。リンカーは、好ましくは７０個まで、特に好ましくは１〜４０個、最も好ましくは２〜２０個の、かかる電荷単体を含有する。
【００２３】
リンカーは、特に好ましくは少なくとも１つの負の電荷担体を含有する。好適な負の電荷担体の例は、ホスフェート基、ホスホネート基、スルフィネート基、スルホネート基、スルフェート基およびカルボキシレート基であり、カルボキシレート基およびホスフェート基が最も好ましい。
【００２４】
正の電荷担体の例は、アミノ基および一アルキルアミノ基、二アルキルアミノ基もしくは三アルキルアミノ基（ここで、アルキル基は、炭素数が１〜６である直鎖もしくは分枝アルキル残基、または炭素数が３〜６である環状アルキル残基を表す）などの一置換アミノ基または多置換アミノ基である。正の電荷担体は特に好ましくは、リシンなどの塩基性アミノ酸、またはジエチルリシンもしくはジプロピルリシンなどの置換アミノ酸から選ばれる。アミンおよび置換アミンもまた、電気化学発光による金属錯体検出のための電子供与体として使用しうる。
【００２５】
リンカーはまた、電荷担体の代替物として、または電荷担体に加えて非帯電親水性基を含みうる。非帯電親水性基の好ましい例は、エチレンオキシド基もしくは、好ましくは少なくとも３つのエチレンオキシド単位を有するポリエチレンオキシド基、スルホキシド基、スルホン基、カルボン酸アミド基、カルボン酸エステル基、ホスホン酸アミド基、ホスホン酸エステル基、リン酸アミド基、リン酸エステル基、スルホン酸アミド基、スルホン酸エステル基、硫酸アミド基および硫酸エステル基である。アミド基は好ましくは第一級アミド基であり、特に好ましくは、例えばアミノ酸アスパラギンおよびグルタミンの、アミノ酸側鎖基のカルボン酸アミド残基である。エステルは、好ましくは、親水性アルコール、特にＣ₁ 〜Ｃ₃ アルコールまたはジオールまたはトリオールに由来するものである。
【００２６】
本発明の文脈において、「分枝」という用語は、リンカーがＺ基とＸ基との間に主鎖と、さらにこの主鎖を起点とする１つまたは数個の側鎖とを含有することを意味する。電荷担体および親水性基は、主鎖または／および側鎖に位置しうる。本発明のリンカーが数個のＺ基およびＸ基を含有する場合、主鎖それ自体がすでに分枝でありうる。しかしながら、いずれの場合でもリンカーは、Ｚ基およびＸ基を全く含有しない１つまたは数個の側鎖をさらに含有する。側鎖の数は、好ましくは１〜１０であり、特に好ましくは２〜６であり、最も好ましくは２〜４個である。
【００２７】
本発明の好ましい態様では、リンカーは、上述のような非帯電親水性基、特にカルボン酸アミド基または／およびポリエチレングリコール基を１つまたは数個含有する主鎖を含有するとともに、１つまたは数個の側鎖に電荷担体が少なくとも１つ存在する。この場合、例えば、１つの側鎖あたり１〜１０個の電荷担体、特に１〜５個の電荷担体が存在しうる。あるいはまた、リンカーは、主鎖に電荷担体を、１つまたは数個の側鎖に非帯電親水性基を含有しうる。また、さらなる態様では、主鎖および側鎖が、電荷担体とともに非帯電親水性基を含有することが想定されうる。
【００２８】
分枝リンカーが、意図する結合化学的特性を妨害しうるＸおよびＺ以外の基、例えば、−ＣＯＯ^- 基または−ＮＨ₂ 基などを含有する場合、合成および／または結合の際に当業者に公知の適切な保護基を使用する。ペプチド側鎖内の末端−ＮＨ₂ 基は、好ましくは、例えば、アセチル化またはスクシニル化により不活性化する。
【００２９】
リンカーの主鎖の長さは、好ましくは７〜２００原子であり、特に好ましくは７〜１００原子である。主鎖は、ヘテロ原子、例えばＯ原子、またはアミド基を含有させることにより修飾されたアルキレン鎖であり、少なくとも１つの分枝部を含有する。分枝部に形成される側鎖は、好ましくは４〜１００原子の長さを有する。
【００３０】
電荷担体は、好ましくは、主鎖のアルキレン単位のＨ原子または／および側鎖内のＨ原子が電荷担体を含有する基、例えばＮＨ₃ ⁺ またはＣＯ₂ ^- で置換されるようにリンカー内に位置する。
【００３１】
遊離の電荷担体または／および親水性基を含有する分枝リンカーは、好ましくは、少なくとも部分的に、ペプチド結合により互いに連結されたアミノカルボン酸単位から構成される。かかるリンカーにおいて、分枝点は多官能性アミノカルボン酸に由来し得、該多官能性アミノカルボン酸は、主鎖への導入後もなお１つの官能基が存在するような、少なくとも３つの官能基、例えばアミノ基もしくはカルボン酸基を含有し、かつ側鎖の合成の開始点として使用しうる。分枝は、特に好ましくは、リシン、オルニチン、ヒドロキシリシンなどのジアミノカルボン酸を用いて作製する。
【００３２】
分枝リンカーの電荷担体は、好ましくは、多官能性アミノカルボン酸の遊離の正または／および負の帯電基に由来し得、該多官能性アミノカルボン酸は、リンカーへの導入および２つの帯電基の同時反応後もなお少なくとも１つの遊離の電荷担体が存在するような、総数が少なくとも３つの帯電基、例えば、アミノ基、カルボキシレート基もしくはホスフェート基を含有する。例えば、電荷担体は、（ａ）１つのアミノ基および２つのカルボキシレート基、または（ｂ）２つのアミノ基および１つのカルボキシレート基を含有する三官能性アミノカルボン酸に由来しうる。かかる三官能性アミノカルボン酸の例は、リシン、オルニチン、ヒドロキシリシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸、欧州特許公開公報第０６１８１９２号または米国特許第５，５１９，１４２号明細書に記載のような対称三官能性カルボン酸である。あるいはまた、三官能性アミノカルボン酸（ａ）内のカルボキシレート基の１つは、ホスフェート、スルホネートまたはスルフェート基で置換されうる。かかる三官能性アミノ酸の例は、ホスホセリンである。
【００３３】
あるいはまた、分枝リンカーは、ホスフェート−糖単位、例えば、核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）を有しないＤＮＡ主鎖から少なくとも部分的に構成され得るか、またはグリコペプチド構造から構成されうる。さらにまた、リンカーは、少なくとも部分的にサッカリド単位から構成されうる。いずれの場合においても、リンカーの側鎖は、好ましくは三官能性単位により構成される主鎖の分枝部に位置しており、側鎖の長さは、合成に使用される少なくとも２つの構成（ｂｕｉｌｄｉｎｇ）ブロック、例えば、天然もしくは合成のアミノ酸、またはエチレングリコールなどの他の成分である。
【００３４】
好ましくは、分枝親水性リンカーは、非特異的結合により引き起こされる問題を低減するために、免疫学的手順において使用される。
【００３５】
本発明のリンカー分子を構築するために、非天然のアミノ酸、および例えばジペプチドＵＥまたはＵＱのような非天然の配列モチーフを使用するのが有利であることがわかっている。これは、血清学的アッセイ、すなわち患者の血清中の抗体を検出するために設定されたアッセイにおいて特に有利であることが証明されている。非天然のβアミノ酸を有するリンカーは、プロテアーゼに対して、例えば血清または血漿中のプロテアーゼに対してむしろ安定であることが証明されており、したがって、本発明のさらに好ましい態様を示す。
【００３６】
本発明の一態様において、金属錯体を含有する分枝リンカーは、一般式（ＩＩＩ）：
【００３７】
【化１】

【００３８】
式中、Ｍ、Ｘ、Ａ、ｎおよびｍは先に定義した通りであり、Ｒ₁ 、Ｒ₂ 、Ｒ₃ 、Ｒ₄ 、Ｒ₅ およびＲ₆ は、同じかまたは異なっており、それぞれ、１つまたは数個の置換基を表すが、Ｘは、置換基Ｒ₁ 、Ｒ₂ 、Ｒ₃ 、Ｒ₄ 、Ｒ₅ またはＲ₆ の１つおよびリンカーＹを介して配位子の１つに結合している、
を有する。
【００３９】
錯体の配位子は、点線で示された基が存在するかしないかに応じて、任意に置換されたフェナントロリン系またはビピリジン系である。
【００４０】
配位子上の置換基Ｒ₁ 、Ｒ₂ 、Ｒ₃ 、Ｒ₄ 、Ｒ₅ およびＲ₆ は、好ましくは水素、Ｃ₁ 〜Ｃ₅ アルキル、特にＣ₁ 〜Ｃ₃ アルキル、フェニル、または上述のような親水性基であるが、これらは、リンカーＹを含有しないものとする。
【００４１】
特に好ましい態様では、金属錯体を含有する分枝リンカーは、一般式（ＩＩＩａ）：
【００４２】
【化２】

【００４３】
式中、Ｍ、ＸおよびＡは先に定義した通りであり、Ｒ₁ 、Ｒ₂ 、Ｒ₃ 、Ｒ₄ 、Ｒ₅ は先に定義した通りであり、ｓは、０〜６の整数、好ましくは１〜４の整数であり、Ｙは遊離の電荷担体または／および親水性基を有する分枝リンカーを表す、
を有する。
【００４４】
標識基として金属錯体を有するか、またはエフェクター基としてビオチンを有し、反応性官能基としてリシンのアミノ側鎖基を有する、式（Ｉ）の化合物の例を図１〜７に示す。リンカーの分枝点は、２つのアミノ基および１つのカルボキシレート基を有する三官能性アミノ酸であるリシンにより形成される。リンカーの主鎖内ペプチド結合を形成するために１つのアミノ基および１つのカルボキシレート基が使用されるが、側鎖の合成のための開始点としては第２のアミノ基が使用される。遊離の電荷担体は、グルタミン酸側鎖から形成される。図８において、リシンアミノ基は、フェニルアセチル（Ｐｈａｃ）によりブロックされる。リンカー内の１つまたは数個の反応性基の保護基、例えばフェニルアセチルまたは／および全体の構造と適合性である他の保護基によるブロッキングはまた、不安定な結合基が化合物（Ｉ）内に導入されやすくする。
【００４５】
反応性カルボキシレート基を、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはジスクシンイミジルスベレート（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｓｕｂｅｒａｔｅ）（ＤＳＳ）との反応により活性エステルに変換しうる（図１２参照のこと）。あるいはまた、第一級アミノ基を、マレイミドヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＨＳ）との反応によりマレイミド基に変換しうる（図９〜１１参照のこと）。
【００４６】
一例として金属錯体を用いた本発明の化合物の調製を以下に詳細に記載する。例えば、ビオチンまたはペプチド抗原をエフェクター基として含有する他の化合物は、同様にして調製しうる。
【００４７】
金属錯体のＮ−複素環配位子などの標識基上または固相結合性基上の帯電した分枝リンカーの合成は、任意に部分的に保護されたアミノカルボン酸を、配位子の反応性基、例えばカルボン酸にカップリングさせることにより、溶液中でのカップリング反応として行なうことができる。この結合段階は、所望の長さの分枝リンカーが合成されるまで任意に繰り返し得る。このプロセスにおいて、１つまたは数個の帯電側鎖基を含有する少なくとも１つの多官能性アミノカルボン酸が導入される。
【００４８】
続いて、反応性基Ｘが導入され、該アミノカルボン酸の側鎖基上に存在しうる保護基を除去する。溶液中で連続的にアミノ酸を結合することによる配位子の合成は、単一の配位子において起こり得るし、出発物質としての金属錯体にすでに結合している配位子でも起こり得る。好適な出発物質は、例えば、遊離のカルボキシレート基を含有する発光性金属錯体である。かかる金属錯体は、上述の文献から公知であり、また、例えばＩｇｅｎ Ｉｎｃ．Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡにより商品としても提供される。
【００４９】
他方において、分枝リンカーは、固相ペプチド合成によっても調製しうる。固相合成の第１の態様では、アミノ酸を、そのカルボキシレート基により固相支持体に結合させ、次いで、さらにアミノ酸を連続的にカップリングさせることにより所望のリンカーを合成する。このプロセスでは、側鎖基として帯電基、例えばアミノ基またはカルボキシレート基を含有する少なくとも１つのアミノ酸、および分枝部となり、かつ任意に保護された形態である少なくとも１つのアミノ酸を用いて本発明のリンカーを調製する。所望のリンカー配列が完成した後、活性化された金属錯体、例えば活性エステルを、固相に結合したペプチドの遊離Ｎ−末端アミノ基に結合させうる。固相から切り離した後、反応性基Ｘをペプチドリンカーのカルボキシ末端に結合させることができ、存在しうる保護基を除去する。
【００５０】
固相合成の別の様式においては、保護されたアミノ基およびカルボキシレート基を含有するアミノ酸−金属錯体複合体、例えばＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（−Ｒｕ（ピリジル）₃ −ＯＨ）を、遊離カルボキシレート基により固相に固定させ得、ブロックされたアミノ基を切り離した後、ペプチドリンカーが合成されうる。所望のリンカー配列が完成した後、錯体を固相から切り離し、少なくとも元のカルボキシレートアンカー基を遊離の電荷担体として含有するリンカーを得る。得られたペプチドリンカーのアミノ末端に反応性基Ｘをカップリングさせうる。
【００５１】
固相合成のさらなる手順において、電荷担体を有する分枝リンカー配列を、選択したペプチドエピトープ上で直接合成することもできる。
【００５２】
また、上述の合成変形型の組み合わせを用いて本発明の化合物を調製することができる。帯電リンカーを有する本発明の錯体の固相合成に好適なアミノ酸−金属錯体複合体は、独国特許４４ ３０ ９９８．８号に記載されている。これによりこの開示に対して言及がなされる。
【００５３】
本発明のさらなる主題は、上述のような一般式（Ｉ）の化合物である。
【００５４】
本発明のさらなる主題は、少なくとも１つの本発明の化合物（Ｉ）がカップリングした少なくとも１つの生物学的物質を含有してなる複合体である。生物学的物質の例は、細胞、ウイルス、亜細胞粒子、タンパク質、リポ蛋白、糖蛋白、ペプチド、ポリペプチド、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、オリゴ糖、多糖類、リポ多糖類、細胞代謝物、ハプテン、ホルモン、薬理学的物質、アルカロイド類、ステロイド類、ビタミン類、アミノ酸および糖類である。
【００５５】
生物学的物質の官能基に共有結合しうる化合物の反応性官能基により、化合物を生物学的物質にカップリングさせる。官能基が活性エステルである場合、それは、例えば、生物学的物質の遊離アミノ基に結合しうる。官能基がマレイミド残基である場合、それは、例えば、生物学的物質の遊離ＳＨ基に結合しうる。
【００５６】
本発明の特に好ましい態様では、化合物は、好ましくは最大５０個のアミノ酸長、特に好ましくは最大３０個のアミノ酸を有するペプチドに結合する。これらのペプチドは、好ましくは、所望のアミノ酸配列のペプチドを固相上で合成することにより調製され、この間に、ａ）固相結合性基または／および標識基、例えば活性化された金属錯体、好ましくは金属錯体−活性エステル誘導体がペプチドのＮ−末端アミノ基にカップリングする、または／およびｂ）エフェクター基または／および標識基、例えばハプテンまたは金属錯体に共有結合したアミノ酸誘導体が、合成中にペプチドの少なくとも１つの位置に導入される。例えばペプチドのＮ−末端アミノ酸へのエフェクター基または／および標識基のカップリングは、好ましくは、固相からペプチドを切り離す前、およびペプチド合成に使用されるアミノ酸誘導体の反応性側鎖基上の保護基を除去する前に行なわれる。
【００５７】
ペプチドは、好ましくは、１つまたは数個の免疫学的に反応性のエピトープ領域を含有する。これらのエピトープ領域は、好ましくは、病原性微生物、例えば細菌、ウイルスおよび原生動物、または自己免疫抗原に由来する。該エピトープ領域は、特に好ましくは、ウイルス抗原に由来し、ＨＩＶＩ、ＨＩＶＩＩ、ＨＩＶＯまたはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のアミノ酸配列に相当する。
【００５８】
生物学的物質のさらに好ましい例は、ビオチン、毒素、プロ毒素（ｐｒｏｔｏｘｉｎ）、核酸、抗体もしくは抗体断片、ポリペプチド抗原、すなわち免疫学的に反応性のポリペプチドまたはハプテンすなわち１５０〜２０００の分子量を有する有機分子、特に、カルデノライド、カルデノライドグリコシド（例えば、ジゴキシン、ジゴキシゲニン）、ステロイドアルカロイド、性ホルモン（例えば、プロゲステロン）、グルココルチコイドなどのステロイド骨格を有する分子である。ハプテンの他の例は、プロスタグランジン、ロイコトレイン（ｌｅｕｃｏｔｒｅｉｎｅ）、ロイコ−エン−ジイン（ｌｅｕｃｏ−ｅｎ−ｄｉｉｎｅ）、トロンボキサンなどである。
【００５９】
本発明のまたさらなる主題は、検出方法、例えば免疫学的検出方法または核酸ハイブリダイゼーション法、特に発光アッセイにおける、本発明の化合物または本発明の複合体の使用である。
【００６０】
金属錯体を標識基として使用する場合、それは、好ましくは、発光種が電極の表面上に電気化学的に発生する電気化学的発光により検出される。先行技術の金属錯体を用いる発光アッセイを行なうための例は、欧州特許公開公報第０５８０９７９号、国際公開公報第９０／０５３０１号パンフレット、国際公開公報第９０／１１５１１号パンフレットおよび国際公開公報第９２／１４１３８１号パンフレットにみられうる。これにより、これらに開示された方法および発光アッセイのための装置に対して言及がなされる。電気化学的発光アッセイは、好ましくはミクロ粒子、特に、反応性コート、例えばストレプトアビジンが設けられた磁気ミクロ粒子からなる固相の存在下で行なわれる。このようにして、固相に結合した標識基として金属錯体を含有する、免疫複合体またはハイブリダイゼーション複合体を検出することが可能である。
【００６１】
電気化学的発光の測定は、好ましくは、金属錯体の還元剤、例えばアミンの存在下で行われる。脂肪族アミンが好ましく、特に、アルキル基の炭素数がそれぞれ１〜３である第一級、第二級および第三級アルキルアミンが好ましい。トリプロピルアミンが特に好ましい。しかしながら、アミンはまた、アニリンなどの芳香族アミンまたは複素環アミンでありうる。還元剤はすでに錯体の配位子球体内に一体化されうる。
【００６２】
また、表面活性剤、例えば、エトキシル化フェノールなどの非イオン性剤が増幅剤として存在し得る。かかる物質は、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００またはＴｒｉｔｏｎ Ｎ４０１の名称で商品として入手しうる。
【００６３】
他方において、発光金属錯体はまた、蛍光または経時的（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ）蛍光を測定することにより検出され得、ここでは、適切な波長の光を照射することにより金属キレートが励起され、生じた蛍光発散を測定する。蛍光アッセイを行なうための例は、欧州特許公開公報第０１７８４５０号および欧州特許公開公報第０２５５５３４号にみられる。これにより、この開示に対する言及がなされる。
【００６４】
上記の詳細に記載した、分枝した帯電または親水性リンカーを有する金属錯体を用いることの原理は、他の標識基または／およびエフェクター基に同様に適用されうる。分枝リンカーが使用されうる他の好ましい試験形式は、均一系（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）アッセイである。かかるアッセイは、例えば、ＣＥＤＩＡまたは経時的ＦＲＥＴなどのＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動、例えば、Ｐｏｐｅ，Ａ．Ｊ．ら、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ｓＴｏｄａｙ ４（１９９９）３５０−３６２参照のこと）として知られる測定手順に基づくものである。
【００６５】
本発明の分枝リンカーを用いることにより、公知の試験形式と比べてかなりの利点が達成されうる。したがって、例えば、正に帯電した発光金属錯体は、負に帯電した分枝リンカーを含有してなる複合体内で、より良好に取り扱われうる。改良された溶解性、したがって低下した非特異的結合特性は、一般に、分枝リンカーが疎水性の標識基または／および生物学的物質と組み合わせて用いられる場合に見られる。多くの場合において、これは、標識基の数を増加するため、したがって、シグナル生成量を増加させるために使用されうる。さらにまた、立体的に制約される（ｄｅｍａｎｄｉｎｇ）分枝リンカーは、疎水性標識基と疎水性生物学的物質との間の相互作用を妨げ、これにより、標識基の接近性の改良が確実になる。
【００６６】
本発明の分枝リンカーは、例えば、ブランク値を低下させること、試験の力学的範囲を改良すること、検出限界を低下させること、試験範囲を広げること、または／および信号対雑音比を改良することにより、診断方法において非常に有利でありうる。活性物質の用量の低減、または／および副作用の低下が治療適用において達成されうる。
【００６７】
本発明のまたさらなる局面は、１つまたは数個の電荷担体または／および１つまたは数個の上述したような親水性基を保有するリンカーが、ゲル電気泳動、例えば、アガロースゲル電気泳動、ＳＤＳゲル電気泳動、ゲル濾過、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法において見掛け分子量の大きなシフトを引き起こすことである。この効果は、本明細書に記載された分枝リンカーを用いて、および国際公開第９６／０３４０９号パンフレットに記載された線状リンカーを用いると生じる。見掛け分子量におけるこのシフトの結果、すなわち、リンカーが実際の場合よりも大きな分子量を有するように見える結果、それらを用いて、規定の化学量論および均一な組成を有する複合体を調製することができる。例えば、規定の数の標識基またはエフェクター基を保有するリンカーが結合性基、例えば、生体分子にカップリングされた後、調製の反応生成物は、別個の画分として、その化学量論にしたがって（例えば、１つの結合性基あたり１分子のリンカー、１つの結合性基あたり２分子のリンカー、１つの結合性基あたり３分子のリンカーなど）、クロマトグラフィー法により簡単に得られうる。
【００６８】
特定の複合体を調製するために使用されるリンカーは、この場合、同じクロマトグラフィー分離系における結合性基の見掛け分子量の好ましくは２０％以上、特に好ましくは３０％以上、最も好ましくは４０％以上の見掛け分子量を有するはずである。
【００６９】
さらにまた、試薬キット（リンカー＋（１つまたは複数の）標識基または（１つまたは複数の）エフェクター基＋結合性基、例えば、標識対象の生体分子）、システム（それぞれの標識基を検出するための測定装置を含む）および規定の化学量論および官能性の試薬を含有する組成物が提供される。
【００７０】
規定の化学量論を有するかかる複合体の好ましい例は、モノジゴキシゲニル化Ｆａｂ’抗体断片複合体である。
【００７１】
以下の実施例および図面により本発明をさらに明らかにする。
【００７２】
以下の実施例、参考文献、配列表および図面は、本発明の理解を補助するために提供され、その真の範囲は特許請求の範囲に記載される。本発明の精神から逸脱することなく、記載された手順において変形がなされうることが理解される。
【００７３】
実施例１：固相ペプチド合成による分枝リンカーの調製
例えばApplied Biosystems A433 のバッチペプチド合成機でのフルオレニルメチルオキシカルボニル-(Fmoc)-固相ペプチド合成により、分枝リンカーを合成した。各場合において、表１に示される4.0 当量のアミノ酸誘導体をこのために使用した。
【００７４】
【表１】

【００７５】
アミノ酸およびアミノ酸誘導体を、N-メチル -ピロリドンに溶解した。ペプチドをWang樹脂上で合成する(Wang, S.S. 、J Am Chem Soc 95 (1973) 1328-33)。樹脂を0.2 〜0.4mMol/g で充填する。反応媒体としてのジメチルホルムアミド中のF-moc-アミノ酸誘導体に対して、ジメチルホルムアミド中4 当量のジシクロヘキシルカルボジイミドおよび4 当量のN-ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いてカップリング反応を20分間行なった。合成の各工程の後、ジメチルホルムアミド中20％ピペリジンを用いて20分間F-moc 基を切断した。最後の分枝後、アミノ基に対して4 当量のFmoc- アミノ酸が用いられるように、樹脂の量を選択した。分枝および続く２つの同一のアームの合成のためにFmoc-Lys(Fmoc)-OH を使用する。非対称な分枝を、Fmoc-Lys(Dde) またはFmoc-Lys(Alloc) などの直交する側鎖保護基を有するアミノ酸誘導体により得る。文献中の公知の方法により(Bycroft, B. W. ら、J. Chem. Soc., Chem. Commun. 9 (1993) 778-9;Merzouk, A. ら、Tetrahedron Letters 33(1992)477-80) 、樹脂上でこれらの直交する保護基を切断する。固相上の末端アミノ基を、任意に無水酢酸または無水コハク酸を用いてアセチル化またはスクシニル化する。
【００７６】
ハプテン、標識または官能基を、対応するアミノ酸誘導体が固相合成の間に安定である場合、樹脂上、例えばペプチドのN-末端アミノ酸上にすでに導入しておいた。
【００７７】
担体結合ペプチドの遊離のN-末端アミノ基に、適切な活性エステル誘導体を介して、例えば金属キレート標識の導入を行なった。このために、遊離の第１級アミノ官能基当たり4 当量のルテニウム（ビピリジル）₃ 錯体（BPRu）をN-ヒドロキシベンゾトリアゾール／ジシクロヘキシルカルボジイミドを用いて活性化して少量のDMSOに溶解し、これを滴下して室温で２時間攪拌した。
【００７８】
例えば、金属キレートまたはビオチン結合アミノ酸誘導体の直接取込みにより、ハプテンまたは標識を、固相合成の間にすでにC-末端に導入しうる(WO96/03409 に記載されている) 。
【００７９】
ペプチドを支持体から放出させ、トリフルオロ酢酸20ml、エタンジオール0.5ml 、チオアニソール1ml 、フェノール1.5gおよび水1ml を用いて、酸不安定性保護基を40分間室温で切断する。使用されるアミノ酸誘導体に依存して、少しのラジカルトラップを含むカクテルを使用することも可能である。次に、冷ジイソプロピルエーテル300ml を反応溶液に添加して、ペプチドを完全に沈澱させるために 0℃で40分間保った。沈殿物を濾過し、ジイソプロピルエーテルを用いて洗浄し、少量の50％酢酸に溶解させ、凍結乾燥させた。適切なグラジエント（溶離剤Ａ：水、 0.1％トリフルオロ酢酸、溶離剤Ｂ：アセトニトリル、0.1 ％トリフルオロ酢酸）をかけるデルタ-PAK RP C18 （カラム50×300mm; 100Å; 15μ）上の調製用HPLCによって、得られた粗物質を約120 分で精製した。質量分析によって、溶出した物質を同定した。
【００８０】
固相合成により調製されたかかる化合物の例を、図１〜７および図１６に示す。
【００８１】
代替的には、標識基（標識）、エフェクター基（ハプテン）または官能基はまた、樹脂からの切断後に導入されうる。このために、固相ペプチド合成の間ならびに切断の間に安定である保護基（例えば、フェニルアセチル(Phac)）を用いて、誘導体化されない他の基をブロックする必要がありうる。保護基は、PenGアミダーゼを用いて酵素的に除去されうる（PCT/EP95/02921に記載されている）。
【００８２】
Phacを用いて保護された化合物の例を、図８に示す。
【００８３】
実施例２：分枝ペプチドリンカーへのマレインイミド官能基の導入
マレインイミド官能基を導入するために、実施例１のペプチドを、0.1Mリン酸カリウム緩衝液pH7.0 に溶解し、DMSO中１当量のマレインイミドヘキサン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MH＝マレインイミドヘキサノイル）と混合して、25℃で16時間攪拌した。調製物を調製用HPLC（上記を参照のこと）により精製した。溶出した物質の同一性を、質量分析によって確認した。
【００８４】
図９〜１１および図１７に示される化合物を調製した。
【００８５】
実施例３：分枝ペプチドリンカーへのN-ヒドロキシスクシンイミドエステル基の導入
実験を、WO96/03409の実施例６と類似のように行なった。
【００８６】
図１２に示す化合物を調製した。
【００８７】
実施例４：免疫学試験における分枝および帯電リンカーを有する金属錯体−抗原複合体の使用
HIV に対する特異的抗体を検出するために、二抗原架橋試験(double antigen bridge test)を行なった。この方法において、測定対象の抗体に対するルテニウム標識抗原およびビオチン標識抗原と共に試料液体を、ストレプトアビジン被覆固相の存在下でインキュベートした。Elecsys （登録商標）システムを用いる電気化学発光によって固相上の標識を測定することにより、試料液体中の抗HIV 抗体の存在を決定する。HIV2のgp36タンパク質の一部の配列（配列番号：１）が、患者血清中の重要な抗体により認識される抗原性エピトープを含有することが公知である。
【００８８】
SH官能基リンカーを有し、Ｎ末端で伸長した配列番号：１を含有するペプチド（配列番号：２および図13）を、WO96/03652に記載されているように調製した。図13の２つのシステイン(C) の間の実線は、-SS-シスチン架橋を示す。
【００８９】
マレインイミド−活性化ルテニウム錯体を有するHIV ペプチドを誘導するために、0.1mol/lリン酸カリウム緩衝液pH7.0 中で2 時間室温にて、配列番号：２のペプチド (図13) を、それぞれマレインイミド活性化ルテニウムリンカーと複合体化した。調製用HPLCまたはゲルクロマトグラフィーのいずれかにより、非反応成分を分離した。精製産物を凍結乾燥した。
【００９０】
化合物Ａ：gp36抗原を有する図９由来のBPRuリンカー
【００９１】
化合物Ｂ：gp36抗原を有する図10由来のBPRuリンカー
【００９２】
化合物Ｃ：gp36抗原を有する図11由来のBPRuリンカー
【００９３】
化合物Ｄ：gp36抗原を有する図17由来のBPRuリンカー
【００９４】
配列番号：２および種々のリンカーバリアント（化合物Ａ〜Ｄ）の１つを含有する複合体を、上記試験フォーマットを用いて評価した。同一の配列番号：１のgp36エピトープを含有する同じビオチン標識ペプチド（図14）を用いて、同じ濃度で、全評価を行なった。ビオチン標識捕捉抗原に対して等モルの濃度で標識検出抗原を使用した。
【００９５】
図15に示される複合体を、PCT/EP95/02921に記載のようにして調製し、先行技術の標識参照抗原として使用した（表２〜４における比較）。本発明の抗原を先行技術の抗原に対して等モル量で使用した。濃度は、0.018nmol/l であった。
【００９６】
図15の化合物と比較した複合体ＡおよびＣを用いた実験の結果を、表２にECL カウントで示す。一定の陽性シグナルを有するかなり低いブランク値が、本発明のリンカーを使用することによってのみ得られ、それは、したがって、陽性シグナルと陰性シグナルの間の良好な区別を生じることが、見出されうる。これらの改善された信号対雑音比は、測定範囲の改善をもたらす。
【００９７】
【表２】

【００９８】
図15の化合物と比較した複合体Ｂを用いた実験の結果を、表３にECL カウントで示す。分枝リンカーの有利な効果がまた、ブランク値の有意な増加なしに数個の標識の導入を可能にすることが見出されうる。陽性シグナルは消えず、測定カウントにおける増加さえ観察されることもまた、驚くべきことである。
【００９９】
【表３】

【０１００】
表４は、図15の化合物と比較した複合体Ｄを用いた実験からの結果をECL カウントで示す。驚くべきことに、非帯電分枝親水性リンカーもまた、ブランク値に対して正の効果を有する。信号対雑音比が改善される。
【０１０１】
【表４】

【０１０２】
実施例５：抗体断片複合体の調製
１．手順の説明
IgG 由来のFab'の調製
モノクローナル抗Dig 抗体をペプシンにより切断し、F(ab')₂-断片を形成した。定量的な切断後、pHを上げてペプスタチンを添加することによりペプシンを不活性化した。予め精製することなく、システアミンによりF(ab')₂ をFab'に分解した(reduced) 。システアミンは、ほとんど選択的にヒンジ領域のジスルフィド架橋を切断する。次に、それを透析した。これにより、ペプシンにより生じたFc切断産物のほとんどは、それらが透析チューブの孔を通過するのに十分小さいので（>10,000 ダルトン）、除去される。
【０１０３】
Fab'-BPRU リンカー複合体
過剰のBPRu- リンカー-MH とFab'を反応させることにより、複合体合成を行なった。このプロセスにおいて、ヒンジ領域のSH基が主に変換した。軽鎖およびFd鎖の分解した分子内ジスルフィド架橋の結果最も起こりやすい副反応として、少量の多ルテニウム標識(polyruthenylated) Fab' を形成した。
【０１０４】
粗複合体の精製
粗複合体を分子ふるいによって精製した。このプロセスにおいて、一ルテニウム標識物質を多ルテニウム標識物質から分離した。
【０１０５】
２．手順
F(ab')₂ を形成するための抗体の切断
モノクローナル抗体抗-DIG-M19.11 IgG の凍結乾燥物(lyophilisate)を、20mg/ml の濃度を得るために、H₂O を用いて再構築した。溶液1ml 当たり20μl の1Mクエン酸塩pH3.5 を添加した（クエン酸塩の最終濃度＝20mM）。pHをHCl を用いて3.60に調整した。それを0.45μm フィルターを通して濾過した。濃度をOD 280nmで決定した（１OD_280nm ＝1.4mg/ml) 。それを、20mMクエン酸塩pH3.60を用いて10mg/ml に調整した。溶液を水浴中で37℃に加熱した。抗体溶液1ml 当たり100 μl ペプシン溶液(3mg/ml)を添加し、水浴中で37℃にてインキュベートした。完全な切断後、pH値を上げ、ペプスタチンを添加することにより、反応を停止した。
【０１０６】
Fab'への分解
切断混合物1ml 当たり52.6μl の0.1Mジチオトレイトール(DTT) を添加し、水浴中で25℃にて30分間インキュベートした。0.1M NaH₂PO₄/NaOH pH6.5 、30mM NaCl 、2mM EDTAに対して、Fab'を透析した。
【０１０７】
Fab'-BPRu-リンカー複合体の合成
BPRu- リンカー-MH をDMSO中に溶解した。化学量論的Fab'：BPRu- リンカー-MH は、1:3 （モル／モル) であった。混合物におけるFab'の最終濃度は、3.9mg/mlであった。混合物におけるDMSOの最大濃度は、10％であった。反応時間は、室温にて１時間であった。
【０１０８】
精製
粗複合体を、AMICON PM 10を使用して2 〜3 倍濃縮し、Superdex 200によって精製した（緩衝液:25mM MOPS/NaOH pH6.5,50mM NaCl,10％ DMSO 、適用量：ゲル床の最大1.5 ％、画分：ゲル床の0.5 ％) 。Fab'-BPRu-リンカー複合体を含む画分をプールした。
【０１０９】
実施例６：免疫学試験における分枝および帯電リンカーを有する金属錯体−抗体断片複合体の使用
HIV に対する特異的抗体を検出するために、二抗原ブリッジ試験を行なった。この方法において、測定対象の抗体に対するビオチン標識抗原およびジゴキシゲニン標識抗原と共に試料液体を、ストレプトアビジン被覆固相および抗-Dig-BPRu 抗体の存在下でインキュベートした。Elecsys （登録商標）システムを用いる電気化学発光によって固相への二抗原ブリッジを介して結合した標識を測定することにより、試料液体中の抗HIV 抗体の存在を決定した。
【０１１０】
HIV1のgp41領域由来のHIV ペプチド（配列番号：３）をN 末端で標識し、抗原として用いた。ビオチン標識抗原およびジゴキシゲニン標識抗原の調製は、PCT/EP95/02921に記載されている。２つの抗-Dig-BPRu 複合体を、ルテニウム標識gp41ペプチドの検出に使用した。
【０１１１】
化合物Ｅ：リンカー無しの抗-Dig-IgG-BPRu
【０１１２】
化合物Ｆ：図9 のリンカーを有する抗-Dig-Fab'-BPRu
【０１１３】
抗原を20ng/ml の濃度の等モル量で使用した。
【０１１４】
化合物Ｆと比較した化合物Ｅを用いた実験の結果を、表５に示す。ジゴキシゲニン標識抗原および抗体複合体（濃度180ng/ml）をプレインキュベートした。本発明のリンカーの使用により、陽性シグナルと陰性シグナルの間の良好な区別に関連するかなり低いブランク値を生じることが見出されうる。これは、正規化された値から容易に見出される（表5/2 ）。
【０１１５】
【表５】

【０１１６】
表６では、抗体複合体（濃度600ng/ml）を添加する前に、結合した免疫錯体を有する磁気ビーズを洗浄するように試験手順を変更した。この場合もまた、ブランク値はかなり低く、このことは、改善された区別に関連した。改善された信号対雑音比は、特に表6/2 から明らかであり、この値は、陰性試料を用いて測定したシステムブランクに対して正規化されている。
【０１１７】
【表６】

【０１１８】
表７は、ストレプトアビジン固相への抗体複合体の非特異的結合を示す。この「試験手順」において、緩衝液のみを使用し、ビオチン標識抗原もジゴキシゲニン標識抗原も使用しなかった。ルテニウム標識抗体複合体の濃度は、600ng/mlであった。本発明のリンカーはまた、改善されたブランク値を示す。
【０１１９】
【表７】

【０１２０】
実施例７：さらなる複合体の調製
１．テストステロン誘導体（図18）の合成
約2ml のリン酸緩衝液pH8.5 に、8.5mg の BPRu-リンカー-NH₂（図１）を溶解し、ジオキサン2ml に溶解した1.8mg の活性化テストステロン誘導体（テストステロン-3- ジメチル- カルボキシオキシム-NHS）を滴下した。それを光を遮断して６時間室温で攪拌した。
【０１２１】
調製用HPLCにより、粗生成物を精製する。分子量を、質量分析(MALDI) により3180と確認した。
【０１２２】
２．T3誘導体（図19）の合成
7.1.と同様に合成を行なった。MS-MALDIは、予期される分子量に対応した。
【０１２３】
３．PEG-Lys-MP-gp36 誘導体（図20）の合成
ルテニウム錯体のリジン誘導体で開始し、マレインイミド- プロピオン酸-(MP)-NHS エステルを用いる従来法により、第一段階でリジンの遊離のα- アミノ基を反応させた。次に、カルボン酸を、標準法により活性化させた。
【０１２４】
次の工程では、3.64mgの活性エステルを25.5mgのアミノ修飾ポリエチレングリコールH₂N-PEG-OCH₃-5000(Shearwater) と20mlアセトニトリル中室温で反応させた。生成物の混合物を、ロータリーエバポレートし、ゲルクロマトグラフィーにより精製した（MALDI は、予期した分子量に対応した）。
【０１２５】
すでに記載した方法と同様にして、 gp36-ペプチドへのマレインイミドのさらなる結合を行なった。質量分析を用いて決定した分子量は、予期した分子量6990に対応した。
【０１２６】
４．蛍光染料標識分枝リンカー（図23）の合成
Mtt-保護分枝ペプチドリンカー（図21）を、標準手順により合成する。
【０１２７】
具体的にはAletras A.ら、Int. J. Peptide Res.(1995)45, 488 に記載の方法により、Mtt 保護基を切断し、固相に結合した図22のリンカーを得た。
【０１２８】
単一の非保護 N末端アミノ基を有する分枝リンカー分子（図22）を結合した固相50mgを4ml のDMF に懸濁させた。その後、10μl のトリエチルアミンおよび活性化蛍光標識(16mg)を添加し、固相結合リンカーに複合体化させた（活性化標識であるローダミン-N- ヒドロキシスクシンイミドエステルの合成は、DE4137934 に記載されている）。反応混合物を12時間室温で攪拌した。
【０１２９】
標準条件下での固相からの切断後（トリフルオロ酢酸95％）、調製用HPLCを用いて精製を行なった。
【０１３０】
21μl のトリエチルアミンを含む10mlのDMF 中での16mgの中間体と18.5mgのジスクシンイミジルスベレート(DSS) との５時間の反応および標準的な精製は、7mg の生成物（図23に示されるNHS-活性化ローダミン標識分枝リンカー）をもたらした。これをMALDI-TOF により解析し、分子量が理論値に対応することを見出した。
【０１３１】
実施例８：アクリジニウム標識分枝リンカー構造
１．アクリジニウムエステル標識分枝リンカー
4ml のDMF に溶解した50mgの固相結合リンカー（図22を参照）に、13mgのアクリジニウムエステル誘導体（EP 82636に従って合成）を添加し、実施例7.4 に記載のように反応させた。
【０１３２】
アクリジニウム標識リンカーを調製用HPLCにより精製し、凍結乾燥させた。
【０１３３】
生成物の収量が7mg であることを見出した。
【０１３４】
生成物（図24を参照）をMALDI-TOF により解析し、分子量が理論値に対応することを見出した。
【０１３５】
２．アクリジニウムスルホニル標識分枝リンカーの合成
アクリジニウム標識分枝固相結合化合物を、実施例7.4 に記載のように合成する（アクリジニウムスルホンアミドの合成は、US 5,543,524を参照）。固相からの切断および精製の後（上記参照）、1ml のDMF 中でペプチドリンカー(4mgのリンカー) の遊離のC 末端アミノ基を、0.7mg のマレイミドプロピオニル−オキシスクシンイミドエステル(MPS) と反応させ（室温、150 時間）、調製用HPLCにより精製する。
【０１３６】
生成物の収量が2mg であることを見出した。
【０１３７】
生成物（図25を参照）をMALDI-TOF により解析し、分子量が理論値に対応することを見出した。
【０１３８】
MPS-活性化アクリジニウムスルホンアミド標識リンカーをSH基に複合体化する。この実施例において、 TSH（甲状腺刺激ホルモン）を使用し、標準プロトコルに従ってカップリングを行なった(Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996, p.456 ff を参照) 。
【０１３９】
TSHに対する二段免疫アッセイ(two step immunoassay)を用いる比較研究において（第１抗体と試料のインキュベーション後に洗浄工程を有する）、本実施例のTSH-複合体をリンカー無しのTSH-複合体と比較した。表８においてTSH 濃度をμIU/ml として示す。Cal 1 およびCal 2 は市販品のRoche Diagnostics 発注番号TSH Cal Set: Id. Nr: 1731483であり、Tris（100mM Tris、 1％BSA 、 0.1％Thesit、 0.1％Oxaban、pH7.4 ）で示される試料は、1ml 当たりそれぞれ 0および50μIU TSHを含有する。
【０１４０】
【表８】

【０１４１】
表８から、本発明の分枝リンカーを含有するTSH-複合体は、かかるリンカー無しの複合体と比較して信号対雑音比に関して有意な改善を示す。
【０１４２】
参考文献の表

【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明の化合物を示す。
【図２】 図２は、本発明の化合物を示す。
【図３】 図３は、本発明の化合物を示す。
【図４】 図４は、本発明の化合物を示す。
【図５】 図５は、本発明の化合物を示す。
【図６】 図６は、本発明の化合物を示す。
【図７】 図７は、本発明の化合物を示す。
【図８】 図８は、本発明の化合物を示す。
【図９】 図９は、本発明の化合物を示す。
【図１０】 図１０は、本発明の化合物を示す。
【図１１】 図１１は、本発明の化合物を示す。
【図１２】 図１２は、本発明の化合物を示す。
【図１３】 図１３は、参照抗原のアミノ酸配列を示す。
【図１４】 図１４は、参照抗原のアミノ酸配列を示す。
【図１５】 図１５は、参照抗原のアミノ酸配列を示す。
【図１６】 図１６は、本発明の化合物を示す。
【図１７】 図１７は、本発明の化合物を示す。
【図１８】 図１８は、本発明の化合物を示す。
【図１９】 図１９は、本発明の化合物を示す。
【図２０】 図２０は、本発明の化合物を示す。
【図２１】 図２１は、図２３〜２５の複合体を作製するのに使用した固相結合分枝リンカー（Mtt-保護基有りおよびアミノ酸側鎖上に保護基有り）を示す。
【図２２】 図２２は、図２３〜２５の複合体を作製するのに使用した固相結合分枝リンカー（Mtt-保護基無しおよびアミノ酸側鎖上に保護基有り）を示す。
【図２３】 図２３は、本発明の化合物を示す。
【図２４】 図２４は、本発明の化合物を示す。
【図２５】 図２５は、本発明の化合物を示す。

Claims (7)

1. 複合体の作製のための、一般式（Ｉ）：
   Ｚｎ−Ｙ−Ｘｍ （Ｉ）
   〔式中、Ｚは少なくとも１つの反応性官能基または結合性基であり、Ｘは、リンカーＹを介してＺに共有結合している反応性官能基であり（ここで、該リンカーは、１０００Ｄａより大きな分子量を有し、かつ少なくとも１つの電荷担体を含有する分枝リンカーである）、ｎは１〜１０の整数であり、ｍは１または２である〕
   で表わされる化合物の使用。
2. 複合体の作製のための、一般式（Ｉ）：
   Ｚｎ−Ｙ−Ｘｍ （Ｉ）
   〔式中、Ｚは少なくとも１つの反応性官能基または結合性基であり、Ｘは、リンカーＹを介してＺに共有結合している反応性官能基であり（ここで、該リンカーは、１０００Ｄａより大きな分子量を有し、かつ少なくとも１つの電荷担体および少なくとも１つの親水性基を含有する分枝リンカーである）、ｎは１〜１０の整数であり、ｍは１または２である〕
   で表わされる化合物の使用。
3. 一般式（Ｉ）
   Ｚｎ−Ｙ−Ｘｍ
   〔式中、Ｚは少なくとも１つの反応性官能基または結合性基であり、Ｘは、リンカーＹを介してＺに共有結合している少なくとも１つの反応性官能基であり（ここで、該リンカーは、１０００Ｄａより大きな分子量を有し、かつ少なくとも１つの電荷担体を含有する分枝リンカーである）、ｎは１〜１０の整数であり、ｍは１または２である〕
   で表わされる化合物。
4. 一般式（Ｉ）
   Ｚｎ−Ｙ−Ｘｍ
   〔式中、Ｚは少なくとも１つの反応性官能基または結合性基であり、Ｘは、リンカーＹを介してＺに共有結合している少なくとも１つの反応性官能基であり（ここで、該リンカーは、１０００Ｄａより大きな分子量を有し、かつ少なくとも１つの電荷担体および少なくとも１つの親水性基を含有する分枝リンカーである）、ｎは１〜１０の整数であり、ｍは１または２である〕
   で表わされる化合物。
5. 少なくとも１つの生物学的物質と、請求項３または４記載の一般式（Ｉ）の化合物の少なくとも１つとを含有してなる複合体。
6. 該生物学的物質が抗体もしくは抗体断片、核酸、ポリペプチド抗原、免疫学的に反応性のペプチドまたはハプテンである請求項５記載の複合体。
7. 免疫学的検出法または核酸ハイブリダイゼーション法における請求項３または４記載の化合物または請求項５または６記載の複合体の使用。

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