JP2921989B2 - ハプテンで標識されたペプチド - Google Patents

ハプテンで標識されたペプチド

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明はハプテンで標識されたペプチドの製造方法、
該方法により取得可能なハプテンで標識されたペプチ
ド、及び免疫学的測定方法におけるこれらのペプチドの
使用に関する。
体液中、特にヒト血清中の免疫グロブリンの検出は、
微生物、特にHIV、肝炎ウイルス等のウィルスによる感
染を診断するために用いられる。披験試料中の特異的免
疫グロブリンの存在は通常、該特異的免疫グロブリンと
反応する１種以上の抗原との反応により検出される。試
料液体中の特異的免疫グロブリンの検定方法は、高感度
で信頼性が高く、簡単且つ迅速でなければならない。
近年、放射性同位体を含まないマーカー基を利用した
検出系がさかんに開発されており、このような系では光
学（例えば発光又は蛍光）検出系、NMR活性検出系又は
金属沈殿検出系によって披験試料中の分析対象物、例え
ば特異抗体の存在を測定することができる。
EP−Ａ−0307149は、２種の組換えポリペプチドを抗
原として使用する抗体の免疫学的試験を開示しており、
この試験では一方の組換え抗原を固相に固定し、他方に
マーカー基を担持させ、両者を異なる生物で発現させて
試験の特異性を高めている。
EP−Ａ−0366673は、精製標識抗原との反応および固
相に結合された同一精製抗原との反応によって抗体を検
出する試料中の抗体の検出方法を開示している。
EP−Ａ−0386713は、２種の固体支持体を用いるHIV抗
体の検出方法を記載しており、この方法は種々のHIV抗
体を２種の固体担体に固定し、各担体を試料のアリコー
トと標識HIV抗原とに接触させ、少なくとも１階の試験
で陽性反応が生じるか否かにより抗体の存在を検出す
る。HIV抗原としては、組換えにより製造されたポリペ
プチドが開示されている。
EP−Ａ−0507586は、特異的免疫グロブリンの免疫学
的試験の実施方法を記載している。該方法は免疫グロブ
リンと結合することが可能な２種の抗原と試料とを接触
させる方法であり、第１の抗原は固体担体と結合するの
に適した基を有し、第２の抗原はマーカー基を有してい
る。マーカー基は酵素、色原体、金属粒子などの直接マ
ーカー基でもよいし、間接マーカー基であってもよい。
すなわち、抗原に結合されたこのマーカー基はさらにシ
グナル生成基を有するマーカー基のレセプターと反応す
ることができる。このような間接マーカー基の１例とし
てフルオレセイン誘導体が挙げられており、そのレセプ
ターである抗体は酵素に結合されている。抗原としては
Ｂ型肝炎表面抗原などのポリペプチドが開示されてい
る。この抗原に誘導体化によってSH基が導入され、フル
オレセインと結合するために用いられる。
EP−Ａ−0507587は、IgM抗体の特異的検出方法を開示
している。この方法は、被験抗体に対する標識抗体及び
固相に結合することが可能な被験抗体に対する第２の抗
体と共に試料をインキュベートするものである。
従来技術から公知の免疫抗体検出方法は、通常、組換
えDNA法により普通に製造したポリペプチド抗体を使用
している。しかし、このようなポリペプチド抗原を用い
ると問題が生じる恐れがある。即ち、組換えポリペプチ
ドはしばしば融合ポリペプチドの形態のみで製造され、
その場合、融合部分は試験で偽陽性の結果を生じる恐れ
がある。また、組換えの発現により製造されるポリペプ
チドは、試料溶液中での非常に安定性が低いことが多
く、凝集する傾向がある。このようなポリペプチドに
は、マーカー基を選択的且つ再現可能に導入できないこ
とが多いという欠点もある。
更に、組換えポリペプチド抗原 の製造はコストが高く、組換えポリペプチド抗原のロッ
トにより免疫学的反応性に大きなばらつきが生じる恐れ
がある。
従って、本発明の目的は、簡単且つ効率的に免疫学的
試験用抗原を製造することができ、従来技術から公知で
ある抗原の欠点を少なくとも部分的に解消する方法を提
供することである。また、このような方法ではマーカー
基を抗原に選択的に且つ再現可能に導入できるはずであ
る。
この目的は、（ａ）所望により選択的に切り離せるよ
うに選択した側鎖の第１級アミノ酸上の保護基により反
応性側基を保護したアミノ酸誘導体から所望のアミノ酸
配列をもつペプチドを固相上で合成し、（ｂ）保護基を
切り離して少なくとも１個の遊離の第１級アミノ基を形
成し、（ｃ）ペプチドの少なくとも１個の遊離の第１級
アミノ基にハプテン活性エステル誘導体を結合し、
（ｄ）所望により残存している保護基を切り話すことを
特徴とするハプテンで標識されたペプチドの製造方法に
より達せられる。ハプテンは、ステロール、胆汁酸、性
ホルモン、コルチコイド、カルデノリド、カルデノリド
配糖体、ブファジエノリド（bufadienolides）、ステロ
イド−サポゲニン及びステロイドアルカロイドからなる
群から選択される。
本発明の方法により製造されるペプチドは、最長50ア
ミノ酸、特に好ましくは30アミノ酸を有し、免疫学的検
出法、特に特異的免疫グロブリンの定量に非常に好適で
ある。驚くべきことに、本発明の方法により製造される
ペプチドは、嵩高いハプテンマーカー基の存在にも拘わ
らず、測定しようとする免疫グロブリンに対して高い親
和性と特異性とをもつことが判明した。
本発明の方法は、ハプテンマーカー基をその位置と個
数に関して選択的に導入することを可能にする。即ち、
本発明によるペプチド合成では、使用するアミノ酸誘導
体の第１級アミノ基上で特定の保護基を用いることによ
り、い保護基を選択的切り離した後にハプテンとの反応
に使用できるペプチド上のこれらの位置を個々に選択す
ることが可能である。こうして試験の再現性と感度を改
善することができる。
本発明の方法の別の利点は、ペプチド抗体を使用する
のでIgG、IgM、IgE及びIgAなどのあらゆる抗体のクラス
を確認できることにある。また、凝集しにくい小型で安
定な定義された抗原を使用するので、試験は干渉の影響
を受けにくい。
本発明の方法によりペプチドに結合するハプテンは、
ステロール、胆汁酸、性ホルモン、コルチコイド、カル
デノリド、カルデノリド配糖体、ブファジエノリド、ス
テロイド−サポゲニン及びステロイドアルカロイドを含
む群から選択されるステロイド骨格をもつ分子である。
これらのハプテンは特異的レセプター、例えばハプテン
に対する抗体又は抗体のフラグメントと結合することが
できる。ハプテンは、特に好ましくは、カルデノリド及
びカルデノリド配糖体からなる群から選択される。これ
らの物質クラスの代表的な例はジゴキシゲニン、ジギト
キシゲニン、ギトキシゲニン、ストロファンチジン、ジ
ゴキシン、ジギトキシン、ジトキシン及びストロファン
チンであり、ジゴキシゲニン及びジゴキシンが特に好適
である。
本発明の方法では、ハプテン活性エステル誘導体をペ
プチドのアミノ末端又は／及び遊離第１級アミノ側基と
結合する。本発明では「活性エステル」の用語は、ペプ
チドの他の反応基と干渉性の副反応が生じないような条
件の下で、ペプチドの遊離アミノ基と反応し得る活性化
エステル基を包含することを意味する。Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステルが活性エステル誘導体として好
適に用いられる。適切なハプテン活性エステル誘導体の
例は、ジゴキシン−4"'−ヘミグルタレート−Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミドエステル、ジゴキシゲニン−３−
カルボキシメチルエーテル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステル、ジゴキシゲニン−３−Ｏ−メチルカルボ
ニル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステル、ジゴキシゲニン−３−ヘミスクシネー
ト−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ジギトキ
シン−4"'−ヘミグルタレート−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル及びジギトキシゲニン−３−ヘミスク
シネート−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであ
る。これらのハプテン誘導体はBo ehringer Mannheim C
ompany GmbH（ドイツ国、マンハイム）から市販されて
いる。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル類に加
え、ｐ−ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル、イ
ミダゾール又はＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールエス
テル類などの類似体も使用することができる。
本発明の方法では、所望のアミノ酸配列をもつペプチ
ドを、好ましくは市販のペプチド合成機（例えば、Appl
ied Biosystems製のA431又はA433型装置）を用いて固相
上で合成する。合成は、アミノ酸誘導体を用いてペプチ
ドのカルボキシル末端から開始する公知の方法により行
うことが好ましい。好ましくはアミノ酸誘導体を使用
し、結合に必要なアミノ末端機をフルオレニルメチルオ
キシカルボニル（Fmoc）残基で誘導体化する。使用する
アミノ酸の反応性側基は、ペプチド合成の完了後に容易
に切り離せる保護基を含む。このような保護基の好適な
例は、トリフェニルメチル（Trt）、Ｃ−ブチルエーテ
ル（tBu）、ｔ−ブチルエステル（0 tBu）、ｔ−ブトキ
シカルボニル（Boc）又は2,2,5,7,8−ペンタメチルクロ
マン−６−スルホニル（Pmc）などである。ハプテンで
後から誘導体化しようとするペプチドの位置に第１級ア
ミノ側基を有するリジン残基又は他のアミノ酸誘導体の
アミノ側鎖は、特定の反応条件下、例えば酸の存在下で
定量的に切り離せるように選択された第１のアミノ保護
基で保護する。このような酸に不安定な保護基の１例は
Bocである。ハプテンが結合しないことを望まれる第１
級アミノ側をもつリジン残基又は他のアミノ酸残基の側
基は、第１の保護基を切り離せるような条件下ではそれ
自体切り離せないように選択された第２のアミノ保護基
で保護する。第２の保護基はまた、ペプチドを固相から
切り離し、他の全ての保護基を切り離す条件の下で安定
であることが好ましい。このような第２の保護基の例
は、フェニルアセチルなどの酸に耐性の保護基である。
20種の天然アミノ酸に加えて、このペプチドはβ−アラ
ニン、γ−アミノ酪酸、ε−アミノカプロン酸、ノルロ
イシン又はオルニチンなどの合成アミノ酸を含み得る。
これらの合成アミノ酸は、天然アミノ酸と同様に保護さ
れた形態で合成に用いられる。
合成の完了後、ハプテンを結合しようとする位置に配
置された保護基（第１のアミノ保護基を含む）は、固相
からペプチドを遊離した後に任意に切り離される。その
後、こうして得られた生成物を好ましくはHPLCにより精
製する。次いで各場所に所望され且つ遊離の第１級アミ
ノ基、即ちペプチドのアミノ末端基又は／及びアミノ側
基と反応するハプテン活性エステル誘導体とペプチドと
を反応させることにより、ハプテン標識を導入する。好
ましくは、遊離の第１級アミノ基当たり1.5〜2.5当量の
活性エステルを用いる。次いで反応生成物を、好ましく
はHPLCにより精製する。
ペプチドがフェニルアセチルなどの第２の保護基で誘
導体化されたアミノ基を未だ含んでいる場合には、最終
段階でこれらの保護基を除去する。フェニルアセチル保
護基は、例えば、有機溶媒を含む水溶液に可溶なペニシ
リンＧアミダーゼ又は固定されたペニシリンＧアミダー
ゼを用いて、室温で酵素的に除去することができる。
本発明の方法により製造されるペプチドが分子内ジス
ルフィド結合を含む場合には、合成の完了後で且つ最後
のアミノ酸のＮ末端のFmoc保護基を切り離す前に、例え
ばヘキサフルオロイソプロパノール／ジクロロメタン中
のヨウ素を用いて固相上でこのペプチド配列を酸化する
ことができ（Kamber and Hiskey in Gross E.and Meinh
ofer J., The Peptides,Academic Press,New York, 198
1年,145〜147頁）、その後、Ｎ末端のFroc保護基を切り
離す。
好ましくは、免疫学的に反応するエピトープ領域、即
ち抗体が結合しているペプチド配列、とスペーサー領域
を含むペプチドとを合成する。この場合、少なくとも１
個のハプテン標識をスペーサー領域に結合するのが好ま
しい。ペプチドのスペーサー領域にある標識は、多くの
場合、免疫学的試験で良好な感度を示す。
好ましくは１〜10アミノ酸長のスペーサー領域は、電
荷を有するか又は／及び水素結合を好適に形成するの
で、安定化及び可溶化効果を発揮する。また、このよう
なスペーサー領域は、数個の高分子量レセプターがハプ
テンで標識されたペプチドに結合するのを立体的に促進
することができる。スペーサー領域のアミノ酸は、好ま
しくは、グリシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、ε
−アミノカプロン酸、リジン及びNH2−［（CH2）nO］ｘ
−CH2−CH2−COOH（式中、ｎは２又は３であり、ｘは〜
10である）で表される構造式を有する化合物からなる群
から選択される。更に、スペーサー領域は、好ましくは
少なくとも数個の合成アミノ酸誘導体を含む。スペーサ
ー領域は、好ましくは、ペプチドのアミノ末端又は／及
びカルボキシ末端に配置される。
例えば、細菌、ウイルス及び原生動物などの病原生物
や、自己免疫抗体からのエピトープ領域を含むペプチド
は、本発明の方法により、好適に合成される。免疫反応
性エピトープ領域は、好ましくは、HIV I、HIV II、HIV
サブタイプ０又はＣ型肝炎ウイルス（HCV）などのウイ
ルス性抗原から誘導される。
好ましくは、HIV I、HIV II又はHIVサブタイプ０のエ
ピトープはgp32、gp41及びgp120の領域から選択され
る。HCVエピトープは、好ましくは、非構造タンパク質
領域であるNS3、NS4又はNS5のコア／エンベロープ領域
から選択される。
HIV I、HIV II又はHIVサブタイプ０のアミノ酸配列の
エピトープ領域は、特に好ましくは、アミノ酸配列群： 又は、少なくとも６、好ましくは少なくとも８アミノ
酸長を有するそれらの部分配列から選択される。
アミノ酸配列Ｉ〜IIIはHIV Iのgp120領域に由来し、ア
ミノ酸配列IV〜IXはHIV Iのgp41領域に由来し、アミノ
酸配列ＸはHIV IIのgp32領域に由来する。アミノ酸配列
Ｉ〜Ｘは、配列表にも配列番号１〜10として示す。配列
Ｖ、VIII及びＸは各々、好ましくはジスルフィルド結合
の形で存在する２個のシステインを含む。これらの配列
はハプテン標識、好ましくはジゴキシゲニン又はジゴキ
シン標識、上記Ｎ末端又は／及びＣ末端スペーサーを含
み、ここには、特に好ましくはジゴキシゲニン−３−カ
ルボキシメチルエーテル標識を有する。エピトープ領域
内に位置するリジン残基はまた、標識された形で任意に
存在し得る。
HCVのアミノ酸配列のエピトープ領域は、好ましく
は、アミノ酸配列群： 又は、少なくとも６、好ましくは少なくとも８アミノ
酸長を有するそれらの部分配列から選択される。配列XI
はHCVのNS5に由来し、配列XII及びXVIはHCVのコア領域
に由来し、配列XIII、XIV及びXVはHCVのNS4領域に由来
し、配列XVIIはHCVのNS3領域に由来する。アミノ酸配列
XI〜XVIIは配列表に配列番号11〜17として示す。上記エ
ピトープを有するペプチドは、好ましくは、ハプテン標
識された付加的なスペーサー領域を含む。
本発明の別の主題は、ハプテンで標識されたペプチド
であり、このペプチドは、最長50アミノ酸、好ましくは
30アミノ酸長を有し、そのアミノ末端又は／及びアミノ
側基が少なくとも１個のハプテン活性エステル誘導体と
結合されている。このハプテンは、好ましくはジゴキシ
ゲニン又はジゴキシンであり、活性エステル、好ましく
はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
本発明のペプチドは、好ましくは、例えばヒト血清か
らの抗体と反応することが可能な免疫学的に反応するエ
ピトープ領域と、少なくとも１個のハプテン標識を有す
る免疫学的に反応しないスペーサー領域とを含む。スペ
ーサー領域は、好ましくはペプチドのアミノ末端に位置
し、１〜10アミノ酸長をもつ。エピトープ領域は、HIV
I、HIV II又はHCV、HIVサブタイプＯなどのサブタイプ
を含む変種も含めたアミノ酸配列に由来することが好ま
しく、アミノ酸配列Ｉ〜XVIIの１種又はそれらの部分配
列である。
本発明は、また、試料液体中の特異抗体の免疫測定法
における抗原としてハプテンで標識されたペプチドの使
用に関する。これらの抗体は、好適に定量され、細菌、
ウイルス又は原生動物などの微生物による感染を示す。
ウイルスに対する抗体、例えばHIV又は肝炎ウイルスに
対する抗体は特に好適に定量される。試料液体は、好ま
しくは血清、特に好ましくはヒト血清である。更に、本
発明のハプテンで標識されたペプチドを架橋試験方式の
免疫学的方法で使用することが好ましい。
本発明はまた、試料液体中の特異抗体の免疫測定法に
関する。該方法は、（ａ）被検定抗体に対する抗原であ
って、すでに定義したハプテンで標識されたペプチドを
含む第１の標識抗原と、（ｂ）シグナル生成基を有する
ハプテンのレセプターと共に試料液体をインキュベート
し、ペプチドへの結合によって抗体を測定することを特
徴とする。ジゴキシン又はジゴキシゲニンで標識したペ
プチドを第１の抗原として使用することが好ましく、ジ
ゴキシゲニン又は／及びジゴキシンに対する抗体をレセ
プターとして使用することが好ましい。この点につい
て、「抗体」という用語は、抗体のフラグメント、例え
ばFab、Fab'、Ｆ（ab）２、Ｆ（ab'）２フラグメントな
ど又は他の抗体フラグメント例えば遺伝子工学により修
飾された他の抗体フラグメントをも包含する。レセプタ
ーをシグナル生成基、好ましくはペルオキシダーゼ、ア
ルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレア
ーゼ又はＱ−β−レプリカーゼなどの酵素に結合する。
しかしなから、シグナル生成基は色原基、放射活性のあ
る基、NMR活性基又は金属粒子（例えば金）でもよい。
シグナル生成基は、酵素であることが好ましい。
本発明の免疫測定法は実際に、公知異の試験方法、例
えば単一の反応相からなる均一系イムノアッセイ又は２
反応相以上からなる不均一系イムノアッセイに従って行
うことができる。不均一系試験方式が好適に使用され、
固相の存在下で抗体の存在が検出される。この試験方式
の１例は、所謂二重抗原架橋試験法である。この場合に
は、試料液体を固相の存在下で第１の抗原及び、第２の
抗原と共にインキュベートする。第２の抗原は被検定抗
体に対するものであり、（ａ）固相に結合しているか又
は（ｂ）固相に結合できる形で存在する。固相又は／及
び液相中の標識を測定することにより、試料液体中の被
検定抗体を定量する。第２の抗原はビオチンで標識さ
れ、ストレプトアビジン又はアビジンで被覆した固相と
結合できることが好ましい。ビオチンで標識したペプチ
ドを第２の抗原として使用することが好ましい。
試験手順は、好ましくは、試料液体を固相上で第１の
抗原及び第２の抗原と混合し、第１の抗原、抗体及び固
相に結合した第２の抗原の標識された固定化複合体を得
る段階を含む。他の抗体測定用試験フォーマットに比較
して、架橋試験方式は感度と特異性を改善をもたらし、
即ち、IgG、IgM、IgA及びIgEなどの全ての免疫グロブリ
ンのクラスが認識され、非特異的な反応性を低下させ
る。二重抗原架橋試験の特異性と感度とは、２段階の試
験手順が用いられ、この手順が、試料液体を第１及び第
２の抗原と第１段階で混合し、ついでシグナル生成基を
有する第１の抗原のハプテン標識のためのレセプターを
添加するものである場合、さらに改善される。
固相に結合されたペプチドとハプテンで標識されたペ
プチドを抗原として用いる二重抗原架橋試験方式は、高
力価の被検定抗体を含む試料を偽陰性と判定する危険を
減らすことができる利点もある。これは、フック校歌の
結果、即ちペプチド当たりのマーカー基の数を好ましく
は２〜10マーカー基まで増加することによる。ペプチド
当たりのハプテンマーカー基の数が増加すると、レセプ
ターによるシグナル増幅の結果、直接検出可能なマーカ
ー基を用いる試験手順と比較してフック感度が向上す
る。
本発明の更に別の主題は、特異抗体の免疫学的測定用
試薬であり、この試薬は被検定抗体と反応する本発明の
少なくとも１種のハプテン標識されたペプチドを含む。
二重抗原架橋試験でこのような試薬を使用する場合に
は、試薬が（ａ）ハプテンで標識されたペプチドと、
（ｂ）シグナル生成基を有するハプテンのレセプター
と、（ｃ）被検定抗体と反応し、固相と結合しているか
又は固相と結合できる形で存在する別の抗原を含むこと
が好ましい。ハプテンは、カルデノリド又はカルデノリ
ド−配糖体であるとが好ましく、特に、ジゴキシン又は
ジゴキシゲニンであることが好ましい。ハプテンのレセ
プターはハプテンに対する抗体であることが好ましく、
シグナル生成基は酵素であることが好ましく、他の抗体
はビオチン化され、ストレプトアビジン又はアビジンで
被覆された固相に結合できることが好ましい。
以下、実施例と配列表とにより本発明を更に説明す
る。
配列番号1 :HIV Iのgp120領域からのエピトープのアミ
ノ酸配列を示す； 配列番号2 :HIV Iのgp120領域からの別のエピトープの
アミノ酸配列を示す； 配列番号3 :HIV I、サブタイプＯのgp1210領域からの別
のエピトープのアミノ酸配列を示す； 配列番号4 :HIV Iのgp41領域からのエピトープのアミノ
酸配列を示す； 配列番号5 :HIV Iのgp41領域からの別のエピトープのア
ミノ酸配列を示す； 配列番号6 :HIV Iのgp41領域からの更に別のエピトープ
のアミノ酸配列を示す； 配列番号7 :HIV I、サブタイプＯのgp41領域からのエピ
トープのアミノ酸配列を示す； 配列番号8 :HIV I、サブタイプＯのgp41領域からの別の
エピトープのアミノ酸配列を示す； 配列番号9 :HIV I、サブタイプＯのgp41領域からの更に
別のエピトープのアミノ酸配列を示す； 配列番号10:HIV IIのgp32領域からのエピトープのアミ
ノ酸配列を示す； 配列番号11:HCVのNS5領域からのエピトープのアミノ酸
配列を示す； 配列番号12:HCVのコア領域からのエピトープのアミノ酸
配列を示す； 配列番号13:HCVのNS4領域からのエピトープのアミノ酸
配列を示す； 配列番号14:HCVのNS4領域からの別のエピトープのアミ
ノ酸配列を示す； 配列番号15:HCVのNS4領域からの更に別のエピトープの
アミノ酸配列を示す； 配列番号16:HCVのコア領域かの別のエピトープのアミノ
酸配列を示す； 配列番号17:HCVのNS3領域からのエピトープのアミノ酸
配列を示す。
実施例１ ハプテンで標識されたペプチドの製造 ハプテンで標識したペプチドを、バッチ式のペプチド
合成機（例えば、Applied Biosystems製A431又はA433）
を用いて、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmo
c）固相ペプチド合成により合成した。このために、表
１に示すアミノ酸誘導体を各4.0当量使用した。
リジン誘導体K1を、ハプテン標識を導入しない位置に
用いた。リジン誘導体K2を、ハプテン標識を導入しよう
とする位置に用いた。リジン誘導体K3を、ε−アミノ基
をペプチドのスペーサー領域にカップリングさせるため
に用いた。
アミノ酸又はアミノ酸誘導体をＮ−メチルピロリドン
に溶解した。４−（2',4'−ジメトキシフェニル−Fmoc
−アミノメチル）フェノキシ樹脂（Tetrahedron Letter
s、28巻（1987年）,2107頁）400〜500mg上に0.4〜0.7mm
ol/gをロードしてペプチドを合成した（JACS 95巻（197
3年）,1328頁）。カップリング反応は、反応媒体として
のジメチルホルムアミド中で、Fmoc−アミノ酸誘導体に
体して４当量のジシクロヘキシルカルボジイミド及び４
当量のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いて20分
間行った。各合成段階終了後に20％ピペリジンを含むジ
メチルホルムアミド溶液を用いて、Fmoc基を20分以内に
切り離した。
システイン残基がペプチド配列中に存在する場合に
は、合成の完了直後にヨウ素のヘキサフルオロイソプロ
パノール／ジクロロメタン溶液を用いて、固相上で酸化
を行う。
合成用樹脂からのペプチドの遊離と、酸に不安定な保
護基（フェニルアセチル保護基を除く）の切り離しは、
40分以内に、室温で、トリフルオロ酢酸20ml、エタンジ
チオール0.5ml、チオアニソール1ml、フェノール1.5g及
び水1mlを用いて行われた。次に、反応溶液に冷ジイソ
プロピルエーテル300mlを加え、40分０℃に保ち、ペプ
チドを完全に沈殿させた。沈殿を濾過し、ジイソプロピ
ルエーテルで再び洗浄し、少量の50％酢酸に溶解し、凍
結乾燥した。得られた粗生成物を、デルタ−PAK RP C18
樹脂（カラム50×300mm、100Å、15μ）上で、適当な濃
度勾配溶離液（溶離液A:水、0.1％トリフルオロ酢酸、
溶離液B:アセトニリル、0.1％トリフルオロ酢酸）を用
いる分取HPLCにより、約120分間精製した。イオンスプ
レー質量分析法により溶出された物質を同定した。
ハプテン標識、例えば、ジゴキシゲニン又はジゴキシ
ン標識を、適当な活性エステル誘導体及びペプチドの遊
離アミノ酸を用いて溶液中で導入した。誘導体化するペ
プチドをDMSOと0.1Mリン酸カリウム緩衝液pH8.5の混合
液に溶解した。次いで、遊離の第１級アミノ基当たり２
当量の活性エステルを少量のDMSOに溶解して滴下し、室
温で撹拌した。分析用HPLCにより反応をモニターした。
生成物を分取HPLCにより精製する。
ペプチドがフェニルアセチルで保護されたリジンをま
だ含んでいる場合には、最終段階で、有機溶媒を含むペ
ニシリンＣアミダーゼ水溶液を用いて、この保護基を室
温で酵素的に切り離した。酵素は、例えば濾過によって
分離し、ペプチドを分取HPLCにより精製した。溶出され
た物質をイオンスプレー質量分析法により固定した。
表２に示すペプチド化合物はHIV I及びHIV Iの領域gp
120、gp41及びgp32に由来するものであり、ジゴキシゲ
ニン−３−カルボキシメチルエーテル−Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステル（ドイツ国、マンハイム、Boeh
ringer Mannheim GmbH）を用いて調製した。
下記表３に示すペプチドは、HCVのNS5領域、NS4領域
及びコア領域から合成した。
ビオチンで標識されたペプチドは、ビオチン−ε誘導
体化リジン残基（Fmoc−Lys（ビオチン）−OH）を用い
て、Ｎ末端側を樹脂（ビオチン活性エステル）上で誘導
体化するか又は配列中で誘導体化することにより、合成
した。
実施例２ 好ましい試験手順による特異性と感度の改善 本発明のペプチドを用いる二重抗原橋試験の特異性と
感度はまた、試料、ハプテンで標識された抗原及び固相
抗原を第１段階で混合し、ついで好ましくは１〜４時間
後、特に好ましくは1.5〜2.5時間後に、抗ハプテン抗体
を加える試験手順により、改善することができる。
HIVエピトープgp41/1及びgp41/2（表２）を抗原とし
て用いた。
好ましい２段階試験の試験条件は以下の通りであっ
た： −50mmol/1の中性のリン酸カリウム緩衝液（pH7.2）、
0.2％ウシ血清アルブミン（BSA）、0.2％ラウリル硫酸
ナトリウム（SDS）界面活性剤 −インキュベーション時間 −ハプテンで標識された抗原と固相抗原と血清とのイ
ンキュベーション:120分 −抗ジゴキシゲニン抗体とペルオキシダーゼの複合体
（＜Dig＞−POD）とのインキュベーション:60分 −2,2'−アジノ−ジ−［３−エチルベンジルチアゾリ
ン−スルホネート（６）］（ABTS）とのインキュベーシ
ョン:60分 −インキュベーション温度:25℃ −全てのインキュベーション段階の間で結合体／遊離体
を分離 選択できる別の２段階試験の試験条件は以下の通りで
あった： −50mmol/1の中性のリン酸カリウム緩衝液（pH7.2）、
0.2％BSA、0.2％SLS界面活性剤。
−インキュベーション時間 −固相抗原と血清とのインキュベーション:90分 −ハプテンで標識された抗原と＜Dig＞−PODとのイン
キュベーション:90分 −ABTSとのインキュベーション:60分 −インキュベーション温度:25℃ −全てのインキュベーション段階の間で結合体／遊離体
を分離 １段階試験の試験条件は以下の通りであった： −50mmol/1の中性のリン酸カリウム緩衝液（pH7.2）、
0.2％BSA、0.2％SLS界面活性剤。
−インキュベーション時間 −両抗原と血清及び＜Dig＞−PODとのインキュベーシ
ョン:120分 ABTSとのインキュベーション:60分 −インキュベーション温度:25℃ −全てのインキュベーション段階の間で結合体／遊離体
を分離 試験の結果を表４に示す。この結果から明らかなよう
に、好ましい試験手順において、著しく高いシグナルの
相違、即ち陽性試料と陰性試料の測定のシグナルの比が
得られる。
実施例３ 本発明のペプチド抗原を、二重抗原架橋試験で、組換
えポリペプチド抗原と比較した。本発明の実施例では、
ジゴキシゲン化ペプチド抗原gp41/2（表２）を同一配列
のビオチン化ペプチド抗原と組み合わせて試験した。比
較例では、ジゴキシゲン化ポリペプチド抗原組替え gp
41（Changら,Science228巻（1985年）,93〜96頁）を、
同一配列のビオチン化ポリペプチドと組み合わせて試験
した。
試験の結果を表５に示す。「NC」は陰性対照を表し、
「PC」は陽性対照を表す。「カットオフ」指数は実験の
陽性判定と陰性判定の境界である。この指数は２×NCと
して定義される。表５から明らかなように、組換えポリ
ペプチド抗原では陰性試料と陽性試料の差がほとんどな
いが、ペプチド抗原は非常に明瞭な差が認められる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 7/06 Ｃ０７Ｋ 7/06 7/08 7/08 14/16 14/16 14/18 14/18 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｊ 33/532 33/532 Ｚ (72)発明者 ヴィーンフース，ウルスラ−ヘンリケ ドイツ連邦共和国 ディー―82152 ク レイリング，ブルグフリーデンシュトラ ーセ ８番地 (72)発明者 ファーツ，エルケ ドイツ連邦共和国 ディー―82396 ペ ール，クラメルシュトラーセ ３番地 (72)発明者 シュミット，ウルバン ドイツ連邦共和国 ディー―82386 オ ーバーハウゼン，ヴァルトシュトラーセ 36番地 (56)参考文献 特開 昭59−170769（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−260095（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 14/155,14/16,14/18 C07K 1/13,1/04,1/06 C07K 7/06,7/08 G01N 33/53 A61K 47/48 ＣＡ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (31)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ハプテンで標識されたペプチドを製造する
    方法であって、 （ａ）前記ハプテンが結合されるペプチドの位置に所定
    の反応条件下で定量的に切り離すことができるアミノ側
    鎖の第１の保護基をもつアミノ酸誘導体および、前記ヘ
    プテンが結合されない位置に第１の保護基が切り離され
    る反応条件の下ではそれ自身が切り離されないアミノ側
    鎖の第２の保護基であるフェニルアセチル基を有するア
    ミノ酸誘導体から所望のアミノ酸配列を有するペプチド
    を固相上で合成する段階と、 （ｂ）保護基を切り離し、少なくとも１個の遊離の第一
    級アミノ基を形成する段階と、 （ｃ）ペプチドの遊離の第一級アミノ基の少なくとも１
    個にハプテン活性エステル誘導体を結合する段階と、 （ｄ）所望により残存する、前記ハプテンが結合されな
    い位置に第１の保護基が切り離される反応条件の下では
    それ自身が切り離されないアミノ側鎖の第２の保護基を
    切り離す段階とを含み、ハプテンが、ステロール、胆汁
    酸、性ホルモン、コルチコイド、カルデノリド、カルデ
    ノリド配糖体、ブファジエノリド、ステロイド−サポゲ
    ニン及びステロイドアルカロイドを含む群から選択され
    るハプテンで標識されたペプチドの製造方法。
  2. 【請求項２】請求項１に記載の方法であって、 前記ハプテンが、カルデノリド及びカルデノリド配糖体
    を含む群から選択されるハプテンで標識されたペプチド
    の製造方法。
  3. 【請求項３】請求項２に記載の方法であって、 前記ハプテンがジゴキシゲニン、ジギトキシゲニン、ジ
    トキシゲニン、ストロファンチジン、ジゴキシン、ジギ
    トキシン、ジトキシン及びストロファンチンを含む群か
    ら選択されるハプテンで標識されたペプチドの製造方
    法。
  4. 【請求項４】請求項３に記載の方法であって、 ジゴキシゲニン又はジゴキシンを前記ハプテンとして使
    用するハプテンで標識されたペプチドの製造方法。
  5. 【請求項５】請求項１〜４のいずれかに記載の方法であ
    って、 酸に不安定な第１の保護基と酸に安定な第２の保護基で
    あるフェニルアセチル基とを使用するハプテンで標識さ
    れたペプチドの製造方法。
  6. 【請求項６】請求項１〜５のいずれかに記載の方法であ
    って、 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを前記活性エス
    テル誘導体として使用するハプテンで標識されたペプチ
    ドの製造方法。
  7. 【請求項７】請求項１〜６のいずれかに記載の方法であ
    って、 免疫学的に反応するエピトープ領域とスペーサー領域と
    を含むペプチドを合成し、少なくとも１個のハプテン標
    識を前記スペーサー領域に結合するハプテンで標識され
    たペプチドの製造方法。
  8. 【請求項８】請求項７に記載の方法であって、 前記スペーサー領域が１〜10アミノ酸長を有するハプテ
    ンで標識されたペプチドの製造方法。
  9. 【請求項９】請求項７または８に記載の方法であって、 前記スペーサー領域がペプチドのアミノ又は／及びカル
    ボキシ末端に位置するハプテンで標識されたペプチドの
    製造方法。
  10. 【請求項１０】請求項７〜９のいずれかに記載の方法で
    あって、 前記スペーサー領域が電荷を有するアミノ酸又は／及び
    水素結合を形成することが できるアミノ酸を含むハプ
    テンで標識されたペプチドの製造方法。
  11. 【請求項１１】請求項７〜10のいずれかに記載の方法で
    あって、 前記スペーサー領域のアミノ酸が、グリシン、β−アラ
    ニン、γ−アミノ酪酸、ε−アミノカプロン酸、リジン
    及びNH2−［（CH2）nO］ｘ−CH2−CH2−COOH（式中、ｎ
    は２又は３であり、ｘは１〜10である）で表される構造
    式を有する化合物を含む群から選択されるハプテンで標
    識されたペプチドの製造方法。
  12. 【請求項１２】請求項１〜11のいずれかに記載の方法で
    あって、 HIV I、HIV II又はHCVのアミノ酸配列からのエピトープ
    領域を含む前記ペプチドを合成するハプテンで標識され
    たペプチドの製造方法。
  13. 【請求項１３】請求項12に記載の方法であって、 前記エピトープ領域がHIV I又はHIV IIのアミノ酸配列
    群： 又は少なくとも６アミノ酸長をもつそれらの部分配列か
    ら選択されるハプテンで標識されたペプチドの製造方
    法。
  14. 【請求項１４】請求項12に記載の方法であって、 前記エピトープ領域がHCVのアミノ酸配列群： 又は少なくとも６アミノ酸長をもつそれらの部分配列か
    ら選択されるハプテンで標識されたペプチドの製造方
    法。
  15. 【請求項１５】最大50アミノ酸長を有し、アミノ末端又
    は／及びアミノ側基を介して少なくとも１個のハプテン
    活性エステル誘導体と結合し、ステロール、胆汁酸、コ
    ルチコイド、カルデノリド、カルデノリド−グリコシ
    ド、ブファジエノリド、ステロイド−サポゲニン及びス
    テロイドアルカロイドを含む群から選択されるハプテン
    で標識されたペプチド。
  16. 【請求項１６】請求項15に記載のペプチドであって、 前記ハプテンがジゴキシゲニン又はジゴキシンであるハ
    プテンで標識されたペプチド。
  17. 【請求項１７】請求項15または16に記載のペプチドであ
    って、 前記ペプチドが免疫学的に反応するエピトープ領域とス
    ペーサー領域とを含み、前記スペーサー領域が少なくと
    も１種のハプテン標識を有するハプテンで標識されたペ
    プチド。
  18. 【請求項１８】請求項17に記載のペプチドであって、 前記スペーサー領域がペプチドのアミノ末端又は／及び
    カルボキシ末端に位置するハプテンで標識されたペプチ
    ド。
  19. 【請求項１９】請求項15〜18のいずれかに記載のペプチ
    ドであって、 前記エピトープ領域がHIV I、HIV II又はHCVのアミノ酸
    配列に由来するハプテンで標識されたペプチド。
  20. 【請求項２０】請求項19に記載のペプチドであって、 前記エピトープ領域がHIV I又はHIV IIのアミノ酸配列
    群： 又は少なくとも６アミノ酸長をもつそれらの部分配列か
    ら選択されるハンプテンで標識されたペプチド。
  21. 【請求項２１】請求項19に記載のペプチドであって、 前記エピトープ領域がHCVのアミノ酸配列群： 又は少なくとも６アミノ酸長をもつそれらの部分配列か
    ら選択されるハプテンで標識されたペプチド。
  22. 【請求項２２】請求項１〜14のいずれかに記載の方法に
    より製造したハプテンで標識されたペプチド、または請
    求項15〜21のいずれかに記載のペプチドを抗原として使
    用することを特徴とする試料液体中の特異抗体の免疫検
    定法。
  23. 【請求項２３】架橋試験方式である請求項22に記載の免
    疫学的方法。
  24. 【請求項２４】試料液体中の特異抗体の免疫検定法であ
    って、 （ａ）被検定抗体に対する抗原であり、請求項１〜14の
    いずれかに記載の方法により製造したハプテンで標識さ
    れたペプチド又は請求項15〜21のいずれかに記載のペプ
    チドを含む第一の標識抗原と、 （ｂ）シグナル生成基を有するハプテンのレセプター と共に試料液体をインキュベートし、 前記ペプチドに結合させて前記抗体を検出する試料液体
    中の特異抗体の免疫検定法。
  25. 【請求項２５】請求項24に記載の方法であって、 ジゴキシン又はジゴキシゲニンで標識したペプチドが前
    記第一の抗原として使用され、ジゴキシゲニン又は／及
    びジゴキシンに対する抗体が前記レセプターとして使用
    される試料液体中の特異抗体の免疫検定法。
  26. 【請求項２６】請求項24または25に記載の方法であっ
    て、 固相の存在下で第１の抗原及び（ａ）固相に結合してい
    るか又は（ｂ）固相に結合できる形で存在する、被検定
    抗体に対する第二の抗原と共に試料液体をインキュベー
    トし、固相又は／及び液相中の標識を検定することによ
    り被検定抗体を検出する試料液体中の特異抗体の免疫検
    定法。
  27. 【請求項２７】請求項26に記載の方法であって、 ビオチンで標識された抗原を前記第二の抗原として使用
    し、ストレプトアビジン又はアビジンで被覆された固相
    を使用する試料液体中の特異抗体の免疫検定法。
  28. 【請求項２８】請求項27に記載の方法であって、 ビオチンで標識したペプチドを前記第二の抗原として使
    用する試料液体中の特異抗体の免疫検出法。
  29. 【請求項２９】請求項26〜28いずれかに記載の方法であ
    って、 試料液体を第一及び第二の抗原と混合し、次いで前記第
    一の抗原のハプテンのレセプターを添加する試料液体中
    の特異抗体の免疫検定法。
  30. 【請求項３０】被検定抗体と反応し且つ請求項１〜14の
    いずれかに記載の方法により製造された少なくとも１種
    のハプテンで標識されたペプチド、又は被検定抗体と反
    応し且つ請求項15〜21のいずれかに記載のハプテンで標
    識されたペプチドを含む特異抗体の免疫検定用試薬。
  31. 【請求項３１】請求項30に記載の試薬であって、 （ａ）被検定抗体と反応する前記ハプテンで標識された
    ペプチドと、 （ｂ）シグナル生成基を有するハプテンのレセプター
    と、 （ｃ）被検定抗体と反応し、固相に結合されている別の
    抗原又は固相と結合できる形で存在する別の抗原を含む
    特異抗体の免疫検定用試薬。
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