ES2307865T3 - Metodo para preparar conjugados polimericos. - Google Patents

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Abstract

Un método para preparar un conjugado polimérico, comprendiendo dicho método: la unión covalentemente a un polímero soluble en agua que tiene la estructura (Ver fórmula) donde POLI es una estructura polimérica lineal o ramificada soluble en agua, Y es un enlace hidrolíticamente estable, W y W'' son grupos de unión opcionales no reactivos, y Z y Z'' son cada uno grupos reactivos seleccionados independientemente comprendiendo un agente biológicamente activo un resto capaz de reaccionar con al menos uno de Z y Z''.

Description

Método para preparar conjugados poliméricos.
Campo de la invención
La invención se refiere a un método para preparar un conjugado polimérico, en el que se emplea un polímero soluble en agua, teniendo el polímero una estructura polimérica lineal o ramificada soluble en agua y, en un extremo de la estructura, un resto ramificado unido a dos grupos reactivos libres capaces de unirse de forma covalente a otra molécula. El polímero soluble en agua es preferiblemente un derivado de polietilenglicol o de un polímero hidrófilo relacionado y es adecuado para el acoplamiento químico a otra molécula, incluyendo, por ejemplo, proteínas, enzimas, fármacos pequeños y similares.
Antecedentes de la invención
La unión química del polímero hidrófilo poli(etilenglicol) ("PEG") a moléculas y superficies es de gran utilidad en biotecnología. En su forma más común, el PEG es un polímero lineal terminado en cada extremo con grupos hidroxilo:
1
Este polímero se puede representar en forma breve como HO-PEG-OH donde se entiende que el símbolo -PEG- representa la siguiente unidad estructural:
2
En la forma típica, n varía de aproximadamente 10 a aproximadamente 2000.
El PEG se usa de forma común como metoxi PEG-OH o mPEG de forma resumida, donde un extremo es el grupo metoxi relativamente inerte, mientras que el otro extremo es un grupo hidroxilo que está sometido a modificación química rápida.
3
El PEG también se usa de forma común en formas ramificadas que se pueden preparar por adición de óxido de etileno a diversos polioles, tales como glicerol, pentaeritritol y sorbitol. Por ejemplo, a continuación se muestra el PEG ramificado de cuatro brazos preparado a partir de pentaeritritol:
4
Los PEG ramificados se pueden representar de forma general como R-(PEG-OH)_{n}, donde R representa la molécula "núcleo" central, tal como glicerol o pentaeritritol y n representa el número de brazos.
También pueden prepararse PEG ramificados en los que dos "brazos" de PEG están unidos a un resto de unión central que tiene un único grupo funcional capaz de unirse a otras moléculas; por ejemplo, Matsushima et al., (Chem. Lett., 773, 1980) han acoplado dos PEG a un resto de cloruro cianúrico central.
El PEG es un polímero bien conocido que tiene las propiedades de solubilidad en agua y muchos disolventes orgánicos, ausencia de toxicidad y ausencia de inmunogenicidad. Un uso de PEG es unir de forma covalente el polímero a moléculas insolubles para convertir la molécula de PEG resultante de "conjugado" soluble. Por ejemplo se ha demostrado que el fármaco insoluble en agua paclitaxel, cuando está acoplado a PEG, se convierte en soluble en agua. Greenwald, et al., J. Org. Chem. 60: 331-336 (1995).
En un trabajo relacionado, la Patente de Estados Unidos Nº 4.179.337 de Davis et al., describe que proteínas acopladas a PEG han mejorado la semivida de circulación sanguínea debido a velocidad disminuida de aclaramiento por riñón e inmunogenicidad disminuida. Estas y otras aplicaciones también se describen en Biomedical and Biotechnical Applications of Polyethylene Glycol Chemistry, J. M. Harris, Ed., Plenum, Nueva York (1992) y Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, J. M. Harris y S. Zalipsky, Eds., ACS, Washington DC (1997).
Para acoplar PEG a una molécula tal como una proteína a menudo es necesario "activar" el PEG para preparar un derivado del PEG que tenga un grupo funcional en el extremo. El grupo funcional puede reaccionar con determinados restos de la proteína tales como un grupo amino, formando por tanto un conjugado de PEG-proteína. Se han descritos muchos derivados activados de PEG. Un ejemplo de tal derivado activado es el "éster activo" de succinato de succinimidilo'':
5
donde NS =
6
En lo sucesivo en la presente memoria, el resto de éster activo de succinimidilo se representará como -CO_{2}-NS en los dibujos químicos.
El éster activo de succinimidilo es un compuesto útil debido a que reacciona rápidamente con grupos amino de proteínas y otras moléculas para formar un enlace amina (-CO-NH-). Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.179.337 de Davis et al., describe el acoplamiento de este derivado a proteínas (representadas como PRO-NH_{2}):
100
Los PEG bifuncionales con grupos activos en ambos extremos de la cadena polimérica lineal también son compuestos útiles cuando se desea formación de una red insoluble reticulada. Se conocen muchos de tales PEG bifuncionales en la técnica. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.162.430 de Rhee et al., describe el uso de tales PEG bifuncionales para reticular colágeno.
También se han sintetizado PEG reactivos en los que se colocan varios grupos funcionales activos a lo largo de la estructura del polímero. Por ejemplo se han preparado en la técnica conjugados de lisina-PEG en los que se colocan varios grupos activados a lo largo de la estructura del polímero. Zalipsky et al., Bioconjugate Chemistry, 4: 54-62 (1993).
La Patente de Estados Unidos Nº 5.283.339 de Arnold et al., describe compuestos de PEG capaces de quelar metales. Los compuestos de PEG tienen un grupo quelante de metal terminal que tiene dos grupos de ácido carboxílico o amino libres unidos típicamente a un átomo de nitrógeno. Los compuestos de PEG se usan para extraer y precipitar proteínas de soluciones con los grupos de ácido carboxílico o amino junto con el átomo de nitrógeno capaz de formar complejos iónicos con iones metálicos. Sin embargo, los grupos quelantes de metal descritos en la patente generalmente no son útiles para acoplar de forma covalente los compuestos de PEG a proteínas, péptidos o fármacos pequeños que llevan grupos funcionales tales como aminas. La patente no describe como formar un derivado de PEG activado para unirse covalentemente a otra molécula para formar un conjugado.
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Sumario de la invención
La invención descrita en la presente memoria proporciona un polímero soluble en agua tal como poli(etilenglicol) o polímeros relacionados que tienen un resto ramificado en un extremo de la cadena polimérica y dos grupos reactivos libres unidos al resto ramificado para la unión covalente a otra molécula. Cada resto reactivo puede tener un grupo de unión, tal como una cadena de alquilo, que une un grupo reactivo al resto ramificado. Por tanto, el extremo ramificado permite que el polímero soluble en agua activado de esta invención reaccione con dos moléculas para formar conjugados.
Debido a que un grupo de unión que tiene una longitud deseable se puede seleccionar para preparar un polímero activado, los dos grupos reactivos se pueden mantener a una distancia predeterminada entre sí. Las dos moléculas conjugadas al polímero activado por los dos grupos reactivos también se pueden mantener a una distancia predeterminada. En consecuencia se proporciona un PEG activado de acuerdo con la invención que tiene dos restos reactivos libres que se ramifican de una cadena de PEG en un resto ramificado. Los dos restos reactivos libres son capaces de reaccionar con agentes biológicamente activos tales como proteínas, uniendo de este modo el polímero activado a los agentes biológicamente activos.
\newpage
De acuerdo con una realización de esta invención, se proporciona un polímero soluble en agua activado que tiene la fórmula:
7
en la que
POLI es una estructura polimérica soluble en agua, sustancialmente no inmunogénica,
Y es un enlace hidrolíticamente estable, y
X e X' son grupos reactivos capaces de reaccionar con un resto en otra molécula tal como una proteína.
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Típicamente, la estructura polimérica se selecciona del grupo compuesto por poli(etilenglicol), lineal y ramificado, poli(óxido de alquileno), lineal y ramificado, poli(vinilpirrolidona) lineal y ramificada, poli(alcohol vinílico) lineal y ramificado, polioxazolina lineal y ramificada, poli(acriloilmorfolina) lineal y ramificada y derivados de los mismos. Preferiblemente, la estructura polimérica es poli(etilenglicol) o un derivado del mismo. La estructura polimérica POLI puede tener un grupo de sellado seleccionado del grupo compuesto por -OH, O-alquilos y -Y-CHXX', donde Y, X y X' son como se han descrito anteriormente y pueden ser iguales o diferentes en cada extremo del PEG.
X y X' se representan por -W-Z y -W'-Z' respectivamente, donde Z y Z' representan restos reactivos para conjugar el polímero a otra molécula. W y W' representan grupos de unión que comprenden una cadena sustancialmente lineal de átomos, por ejemplo, cadenas de alquilo, cadenas de éter, cadenas de éster, cadenas de amida y combinaciones de las mismas. Los ejemplos de restos reactivos incluyen, pero sin limitación, ésteres activos, carbonatos activos, aldehídos, isocianatos, isotiocianatos, epóxidos, alcoholes, maleimidas, vinilsulfonas, hidracidas, ditiopiridinas y yodoacetamidas.
En otra realización del polímero activado de esta invención, el polímero soluble en agua activado tiene la fórmula:
8
en la que
R es un núcleo de rama centra;
POLI es polímero soluble en agua sustancialmente no inmunogénico;
Y es un enlace hidrolíticamente estable;
n es de 2 a 200; y
X y X' son grupos reactivos capaces de reaccionar con un resto en otra molécula tal como una proteína.
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Se conocen muchas moléculas de núcleo de rama central para preparar PEG ramificados o dendríticos y se pueden usar todas para R. Típicamente, R puede ser un resto obtenido de lisina, glicerol, pentaeritritol o sorbitol. Las estructuras poliméricas adecuadas incluyen, pero sin limitación, poli(etilenglicol) lineal y ramificado, poli(óxido de alquileno) lineal y ramificado, poli(vinil pirrolidona) lineal y ramificada, poli(alcohol vinílico) lineal y ramificado, polioxazolina lineal y ramificada, poli(acriloilmorfolina) lineal y ramificada y derivados de los mismos.
Preferiblemente, POLI es poli(etilenglicol) o un derivado del mismo y se usa como la estructura polimérica.
Los grupos reactivos X y X' pueden ser restos activos unidos directamente al resto de ramificación -CH- o X y X' pueden incluir adicionalmente un grupo de unión y se representan por -W-Z y -W'-Z' respectivamente, donde Z y Z' representan grupos reactivos para conjugar el polímero a otra molécula. W y W' representan grupos de unión que comprenden una cadena sustancialmente lineal de átomos, por ejemplo, cadenas de alquilo, cadenas de éter, cadenas de éster, cadenas de amida y combinaciones de las mismas. Los ejemplos de restos reactivos incluyen, pero sin limitación, ésteres activos, carbonatos activos, aldehídos, isocianatos, isotiocianatos, epóxidos, alcoholes, maleimidas, vinilsulfonas, hidracidas, ditiopiridinas y yodoacetamidas.
El polímero soluble en agua activado se puede unir de forma covalente a un agente biológicamente activo para formar un conjugado. Una agente biológicamente activo puede ser cualquiera de los que tienen un resto capaz de reaccionar con al menos uno de los dos grupos reactivos en el extremo del polímero activado. El agente biológicamente activo puede tener dos de tales restos y cada uno de los mismos se puede unir a uno de los dos grupos reactivos. Como alternativa, el conjugado puede tener dos agentes biológicamente activos uniéndose cada uno a uno de los dos restos reactivos del polímero activado. Ya que los polímeros activados que tienen diferentes grupos de unión se pueden preparar de acuerdo con esta invención, se puede proporcionar un polímero activado en el que los dos grupos reactivos en un extremo del polímero activado están a una distancia deseable entre sí. Cuando se conjuga tal polímero activado con dos moléculas de agente biológicamente activo, las dos moléculas se pueden mantener a una distancia
deseada.
En consecuencia, el PEG activado se puede usar con mayor versatilidad en comparación con otros derivados de PEG conocidos en la técnica antes de esta solicitud para formar diversos conjugados con moléculas tales como proteínas o péptidos. Ya que las moléculas de PEG conjugadas a otra molécula pueden impartir solubilidad en agua e inmunogenicidad disminuida a la otra molécula, los derivados de PEG activados de esta invención permiten un mayor control y precisión en la modificación de tales características en un conjugado.
Por tanto se proporciona un polímero soluble en agua activado que tiene grupos reactivos proximales. La estructura polimérica tiene al menos un extremo que tiene dos grupos reactivos. El extremo tiene un resto de ramificación y dos restos reactivos libres unidos al resto de ramificación. El resto de ramificación a su vez está unido a la estructura polimérica por un enlace estable.
Descripción detallada de la invención
Las expresiones "grupo", "grupo funcional", "resto", "resto activo", "sitio reactivo", "grupo reactivo" y "resto reactivo" se usan en la técnica y en la presente memoria para referirse y para distinguir partes o unidades definibles de una molécula. Las expresiones son ligeramente sinónimas en las técnicas químicas y se usan en la presente memoria para indicar que las partes de las moléculas realizan cierta función o actividad y son reactivas con otras partes de moléculas.
La expresión "unión" se usa en la presente memoria para referirse a grupos o enlaces que se forman normalmente como el resultado de una reacción química y son típicamente uniones covalentes. Las uniones hidrolíticamente estables se refieren a que las uniones son sustancialmente estables en agua y no reaccionan con agua a pH útiles, por ejemplo, en condiciones fisiológicas durante un periodo de tiempo prolongado, preferiblemente indefinidamente.
La expresión "agente biológicamente activo" cuando se usa en la presente memoria significa cualquier sustancia que pueda afectar a cualquier propiedad física o bioquímica de un organismo biológico, incluyendo pero sin limitación, virus, bacterias, hongos, plantas, animales y seres humanos. En particular, como se usa en la presente memoria, un agente biológicamente activo incluye cualquier sustancia que tiene por objeto el diagnóstico, la curación, la mitigación, el tratamiento o la prevención de enfermedades en seres humanos u otros animales o para mejorar de otro modo el bienestar físico o mental de seres humanos o animales. Los ejemplos de agentes biológicamente activos incluyen, pero sin limitación, compuestos orgánicos e inorgánicos, proteínas, péptidos, lípidos, polisacáridos, nucleótidos, ADN, ARN, otros polímeros y derivados de los mismos. Los ejemplos de agentes biológicamente activos incluyen antibióticos, fungicidas, agentes antivirales, agentes anti-inflamatorios, agentes anti-tumorales, agentes cardiovasculares, agentes ansiolíticos, hormonas, factores del crecimiento, agentes esteroideos y similares. Otros ejemplos incluyen microorganismos tales como bacterias y células de levadura, partículas virales, células vegetales o animales o de seres humanos y similares.
La estructura polimérica es un polímero soluble en agua sustancialmente no inmunogénico y es preferiblemente poli(etilenglicol) (PEG). Sin embargo se debe entender que también son adecuados otros polímeros relacionados para usar en la práctica de esta invención y que el uso del término PEG o poli(etilenglicol) tiene por objeto ser incluyente y no excluyente a este respecto.
El poli(etilenglicol) o PEG es útil en aplicaciones biológicas debido a que tiene propiedades que son altamente deseables y está aprobado generalmente para aplicaciones biológicas o biotécnicas. El PEG típicamente es claro, incoloro, inodoro, soluble en agua, estable a calor, inerte a muchos agentes químicos, no se hidroliza o deteriora y generalmente es no tóxico. Se considera que el poli(etilenglicol) es biocompatible, lo que quiere decir que el PEG es capaz de coexistir con tejidos vivos u organismos sin provocar daño. Más específicamente, el PEG es no inmunogénico, lo que quiere decir que el PEG no tiende a producir una respuesta inmune en el cuerpo. Cuando se une a una molécula que tiene alguna función deseable en el cuerpo, tal como un agente biológicamente activo para formar un conjugado, el PEG tiende a enmascarar el agente y puede disminuir o eliminar cualquier respuesta inmune de tal forma que el organismo puede tolerar la presencia del agente. En consecuencia, el conjugado es sustancialmente no tóxico. Los conjugados de PEG tienden a no producir una respuesta inmuno sustancial o provocar coagulación u otros efectos indeseables. El PEG que tiene la fórmula -CH_{2}CH_{2}-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-, en la que n es de aproximadamente 8 a aproximadamente 4000, es un polímero útil en la práctica de la invención. Se usa preferiblemente PEG que tiene un peso molecular de aproximadamente 200 a aproximadamente 100.000 Da como una estructura polimérica.
La estructura polimérica puede ser lineal o ramificada. Las estructuras poliméricas ramificadas se conocen generalmente en la técnica. Típicamente, un polímero ramificado tiene un resto de núcleo ramificado central y una pluralidad de cadenas poliméricas lineales unidas al núcleo de ramas central. El PEG se usa comúnmente en formas ramificadas que se pueden preparar por adición de óxido de etileno a diversos polioles, tales como glicerol, pentaeritritol y sorbitol. Por ejemplo, a continuación se muestra el PEG ramificado de cuatro brazos preparado a partir de pentaeritritol:
9
El resto de rama central también se puede obtener de varios aminoácidos, por ejemplo, de lisina.
Los polietilenglicoles ramificados se pueden representar de forma general como R(-PEG-OH)_{n} en la que R representa el resto del núcleo, tal como glicerol o pentaeritritol y n representa el número de brazos. Se pueden preparar PEG ramificados adecuados de acuerdo con la Publicación Internacional Nº WO 96/21469 titulada Multi-Armed, Monofunctional and Hydrolytically Stable Derivatives of Poly(Ethylene Glycol) and Related Polymers For Modification of Surfaces and Molecules, que se presentó el 11 de enero de 1996. Estos PEG ramificados se pueden modificar después de acuerdo con las enseñanzas de la presente memoria.
También son adecuados para la presente invención muchos otros polímeros solubles en agua y sustancialmente no inmunogénicos diferentes del PEG. Estos otros polímeros pueden estar en forma lineal o en forma ramificada e incluyen, pero sin limitación, otros poli(óxido de alquileno) tales como poli(propilenglicol) ("PPG"), copolímeros de etilenglicol y propilenglicol y similares; poli(alcohol vinílico) ("PVA") y similares. Los polímeros pueden ser homopolímeros o copolímeros aleatorios o en bloque y terpolímeros basados en los monómeros de los anteriores polímeros, de cadena lineal o ramificada.
Los ejemplos específicos de polímeros adicionales adecuados incluyen, pero sin limitación, poli(acriloilmorfolina) difuncional ("PAcM") y poli(vinilpirrolidona) ("PVP"). La PVP y la poli(oxazolina) son polímeros bien conocidos en la técnica y su preparación será evidente para el especialista en la técnica. La PAcM y su síntesis y uso se describen en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.629.384 y 5.631.322.
Aunque el peso molecular de cada cadena de la estructura polimérica puede variar, típicamente está en el intervalo de aproximadamente 100 a aproximadamente 100.000 preferiblemente de aproximadamente 6.000 a aproximadamente 80.000.
Los especialistas en la técnica reconocerán que la anterior lista para estructuras poliméricas no inmunogénicas sustancialmente solubles en agua de ningún modo es extensa y es solamente ilustrativa y que se consideran todos los materiales poliméricos que tienen las cualidades que se han descrito anteriormente.
El polímero activado de esta invención también tiene grupos reactivos proximales unidos al menos a un brazo de la estructura polimérica. Como será evidente, en la presente memoria se usa el término "proximal" para referirse a que el extremo tiene dos restos reactivos libres capaces de reaccionar con otros dos restos en otra molécula o en otras dos moléculas, que pueden ser iguales o diferentes.
El extremo tiene típicamente un resto de ramificación unido covalentemente a una cadena polimérica de la estructura polimérica por una unión hidrolíticamente estable. Típicamente hay dos grupos reactivos libres del resto de ramificación que se ramifican.
El término "libre" como se usa en la presente memoria significa que cada uno de los dos grupos reactivos libres tiene dos extremos, uno de los cuales está unido covalentemente al resto de ramificación y el otro extremo no está unido en ningún otro resto o grupo por unión covalente y (está disponible para la reacción con otro resto o grupo, por ejemplo de otra molécula).
Típicamente, el resto de ramificación es un resto estable no reactivo e inerte que está unido covalentemente a una cadena polimérica y a los dos grupos reactivos. El resto de ramificación no debe formar un enlace de hidrógeno o un enlace iónico con iones de metal o restos o moléculas. Se cree que la capacidad para formar fuertes enlaces de hidrógeno o enlaces iónicos interferiría con la función del resto de ramificación. El átomo de ramificación, es decir, el átomo al que los dos grupos reactivos libres están unidos no es un átomo de nitrógeno (N), pero típicamente es un átomo de carbono (C).
Al menos uno de los dos grupos reactivos libres pueden comprender dos partes: un resto reactivo en el extremo libre y un grupo de unión que une el resto reactivo al resto de ramificación. El resto reactivo es un resto capaz de reaccionar con un resto en otra molécula, por ejemplo, un agente biológicamente activo tal como una proteína, un péptido, etc. Los ejemplos de restos reactivos adecuados incluyen, pero sin limitación, ésteres activos, carbonatos activos, aldehídos, isocianatos, isotiocianatos, epóxidos, alcoholes, maleimidas, vinil sulfonas, hidrazidas, ditiopiridinas, N-succinimidilo, y yodoacetamidas. La selección de un resto reactivo libre se determina por el resto en otra molécula con la que tiene que reaccionar el resto reactivo libre. Por ejemplo, cuando el resto en otra molécula es un resto tiol, entonces se prefiere un resto de vinil sulfona para el resto reactivo libre del polímero activado. Por otro lado se prefiere que un resto N-succinimidilo reaccione con un resto amino en un agente biológicamente activo.
El grupo de unión puede tener una longitud predeterminada, de tal forma que el resto reactivo unido al mismo esté a una distancia predeterminada del resto de ramificación y, en consecuencia, a una distancia predeterminada del otro resto reactivo del extremo. Típicamente, el grupo de unión es no reactivo y es una cadena sustancialmente lineal de átomos, por ejemplo, cadenas de alquilo, cadenas de éter, cadenas de éster, cadenas de amida y combinaciones de las mismas. Por tanto, en una realización preferida, el polímero activado de esta invención se puede representar por la fórmula I:
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o por la fórmula II:
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En la anterior fórmula, POLI es una cadena polimérica lineal de una estructura polimérica soluble en agua sustancialmente no inmunogénica preferiblemente es poli(etilenglicol) o un derivado del mismo. En el polímero activo representado por la fórmula I, la estructura polimérica tiene solamente una cadena polimérica. Y es un enlace hidrolíticamente estable que comprender un átomo o un grupo tal como -O-, -S- y -CO-NH-. Será evidente para el especialista en la técnica que también se pueden emplear en esta realización muchos otros enlaces hidrolíticamente estables.
X y X' son grupos reactivos libres que pueden ser iguales o diferentes teniendo cada uno un resto reactivo capaz de reaccionar con un resto en otra molécula tal como una proteína. En el polímero activado representado por la fórmula I, la estructura polimérica POLI puede tener un grupo de sellado en el extremo opuesto al extremo que tiene grupos de reactivos proximales. El grupo de sellado puede ser, por ejemplo, -OH, diversos alquilos y puede contener también grupos reactivos proximales -Y-CHXX' donde Y, X y X' son como se han descrito anteriormente. En consecuencia, el polímero activado puede tener dos extremos con grupos reactivos proximales, uno en cada extremo de la estructura polimérica.
En la fórmula II, R es el núcleo central como se ha descrito anteriormente. POLI es una cadena polimérica de la estructura polimérica soluble en agua sustancialmente no inmunogénica. Y es un enlace hidrolíticamente estable. n es de 2 a 200 representando el número de cadenas poliméricas o brazos en la estructura polimérica, como se ha descrito anteriormente.
Como será evidente, el resto de ramificación como se ha descrito anteriormente es CH en esta realización del polímero activado. Típicamente no se carga en condiciones normales y no forma un enlace iónico con un ión metálico.
X y X' pueden tener un grupo de unión además de un resto reactivo y se pueden representar por -W-Z y -W'-Z', respectivamente, donde Z y Z' representan restos reactivos libres para conjugar el polímero a otra molécula. W y W' representan grupos de unión. Z y Z' pueden ser restos reactivos diferentes o iguales.
A continuación se proporcionan algunos ejemplos de realizaciones preferidas de los polímeros activados de esta invención:
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En estos ejemplos, -NS representa el resto N-succinimidilo.
De acuerdo con otro aspecto de esta invención también se proporciona un método para preparar el polímero soluble en agua activado de esta invención. Típicamente, en la primera etapa se proporciona un primer polímero intermedio que tiene una estructura polimérica y un grupo terminal reactivo unido covalentemente a la estructura polimérica.
Además se proporciona un compuesto que tiene tres grupos reactivos unidos a restos de ramificación. Este compuesto tiene típicamente un resto de ramificación que forma un núcleo central y tres grupos libres que se ramifican en el núcleo central. Cuando los tres grupos libres se unen al mismo átomo en el resto de ramificación, el átomo no es un átomo de nitrógeno. Uno de los tres grupos libres puede reaccionar con el grupo terminal reactivo del primer polímero intermedio para formar un enlace hidrolíticamente estable. Los otros dos grupos libres se pueden convertir finalmente en los dos grupos reactivos libres en el extremo del polímero activado de esta invención. Los ejemplos de estos compuestos incluyen, H_{2}NCH(CH_{2}-OH)_{2}, NaO-CH(CH_{2}-O-Bz)_{2}, H_{2}N-CH(CH_{2}CO_{2}H)_{2} y similares. Como será evidente, en estos ejemplos, el resto de ramificaciones es CH. Los restos H_{2}N- y NaO- se pueden usar para unir el compuesto del primer polímero intermedio para formar un enlace hidrolíticamente estable, mientras que los grupos hidroxilo, grupos de ácido carboxílico y grupos -CH_{2}-O-Bz se pueden convertir finalmente en restos reactivos libres del polímero activado de esta invención.
Por tanto, en la segunda etapa del método, el compuesto que tiene tres grupos reactivos reacciona con el primer polímero intermedio para formar un segundo polímero intermedio que incluye un enlace hidrolíticamente estable que une el primer polímero intermedio y el compuesto que tiene tres grupos reactivos, dejando de este modo solamente dos grupos libres en el extremo de la cadena polimérica.
En la tercera etapa, los dos grupos libres del compuesto se convierten en dos restos reactivos libres unidos al resto de ramificación. Se pueden emplear varios métodos conocidos en la técnica en la conversión. Por ejemplo, los grupos libres se pueden hacer reaccionar hasta obtener un compuesto que puede impartir un resto reactivo libre. Alternativamente, los dos grupos libres en el segundo polímero intermedio se pueden oxidar o reducir o sustituir para formar dos nuevos restos reactivos libres. Tales métodos serán evidentes para el especialista en la técnica a la vista de los Ejemplos proporcionados a continuación.
De acuerdo con otro aspecto más de esta invención se proporciona un conjugado formado uniendo covalentemente el polímero soluble en agua activado de esta invención a otra molécula, por ejemplo, un agente biológicamente activo. Típicamente, un agente biológicamente activo adecuado puede ser cualquier agente biológicamente activo que tiene un resto capaz de reaccionar con al menos uno de los dos grupos reactivos proximales en el extremo del polímero activado.
El agente biológicamente activo puede tener dos de tales restos y cada uno de los mismos se puede unir a uno de los grupos reactivos. Alternativamente, el conjugado puede tener dos agentes biológicamente activos estando unidos cada uno de ellos a uno de los dos restos reactivos del polímero activado. Por ejemplo, los restos reactivos en el polímero activado pueden ser restos de vinil sulfona que pueden reaccionar con un resto tiol. Si una proteína tiene solamente un resto tiol, entonces dos de tales moléculas de proteína se pueden unir al polímero activado por los dos restos de vinil sulfona. Cuando una proteína tiene dos restos tiol, la reacción entre la proteína y el polímero activado se puede controlar de tal forma que cada molécula polimérica activada se conjugue con dos moléculas de proteína. Alternativamente, la reacción también se puede controlar de tal forma que los dos restos de vinil sulfona de un polímero activado reaccionen con dos restos tiol en la misma molécula de proteína.
Otros restos en agentes biológicamente activos útiles para reaccionar con los reactivos libres del extremo bivalente de un polímero activado de esta invención incluyen, por ejemplo, grupos aminos, grupos de ácido carboxílico, etc. Será evidente para el especialista en la técnica, una vez consciente de la presente invención, seleccionar restos reactivos libres apropiados en un polímero activado para la reacción con un resto dado en un agente biológicamente activo. Por ejemplo, si la conjugación es por reacción con un grupo amino en un agente biológicamente activo, preferiblemente se usan restos tales como -CO_{2}NS o aldehído como resto reactivo libre en el polímero activado para la conjugación.
Ya que se pueden preparar polímeros activados que tienen diferentes grupos de unión de acuerdo con esta invención, se puede proporcionar un polímero activado en el que los dos grupos reactivos en un extremo bivalente del polímero activo estén a una distancia deseable entre sí. Cuando un polímero activado de este tipo se conjuga a dos moléculas de agentes biológicamente activo, las dos moléculas se pueden mantener a una distancia deseada.
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Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar la invención, pero no se deben considerar como limitantes de la misma:
Ejemplo 1
Síntesis de mPEG_{20K}-OCH_{2}CH_{2}CONHCH (CH_{2}O_{2}CCH_{2} CH_{2}CO_{2}NS)_{2} (NS = N-succinimidilo)
Ejemplo 2:
Síntesis de mPEG_{20K}-OCH(CH_{2}-SO_{2}CH=CH_{2})_{2}
Ejemplo 3:
Síntesis de mPEG_{5K}-O_{2}CNH-CH(CH_{2}CO_{2}NS)_{2}
Ejemplo 4:
Síntesis de mPEG_{5K}-O-CH_{2}CH_{2}CH(CO_{2}H)_{2}
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Ejemplo 1 Reacciones
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Preparaciones 1. mPEG_{20K}-OCH_{2}CH_{2}CONHCH(CH_{2}OH)_{2}
Se agitó una solución de mPEG_{20K}-OCH_{2}CH_{2}CO_{2}NS (mSPA 20K, 20 g, 0,001 mol)), H_{2}NCH(CH_{2}-OH)_{2} (serinol, 0,14 g, 0,00154 mol) y trietilamina (0,3 ml) en acetonitrilo (100 ml) con nitrógeno durante una noche y se retiró el disolvente por destilación. El producto se sometió a cromatografía en DEAE sepharose eluído con agua y el eluato se saturó con NaCl y se extrajo con cloroformo. La fase de cloroformo resultante se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y el filtrado se evaporó hasta sequedad al vacío para producir 20 g de producto en forma de un sólido blanco que muestra un único pico con cromatografía de permeación en gel (Ultrahidrogel 250, tampón a pH 7,2).
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2. mPEG_{20K}-OCH_{2}CH_{2}CONHCH(CH_{2}-O_{2}CCH_{2}CH_{2}CO_{2}H)_{2}
Se sometió una solución del producto de (1) (20 g, 0,002 mol) e hidroxitolueno butilado (BHT) (0,02 g) en 220 ml de cloroformo a destilación hasta que se hubieron destilado aproximadamente 150 ml de disolvente. Se añadió anhídrido succínico (2,0 g, 0,02 mol), piridina (1,62 ml, 0,02 mol) y 40 ml de tolueno y la mezcla resultante se calentó a 84ºC durante 20 horas con nitrógeno. Se precipitó el producto con 850 ml de éter y se recogió por filtración. Después del secado se disolvió el producto en 200 ml de agua, se añadieron 20 g de NaCl y el pH se ajustó a 3 con ácido fosfórico acuoso. El producto se extrajo con cloroformo (200 + 150 + 100 ml) y los extractos combinados se secaron sobre sulfato de magnesio. La evaporación de la solución produjo el producto en forma de un sólido blanco (16 g). Se determinó que el peso molecular era 20.940 Da por titulación potenciométrica.
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3. mPEG_{20K}-OCH_{2}CH_{2}CONHCH(CH_{2}-O_{2}CCH_{2}CH_{2}CONS)_{2}
Se agitó una solución del producto de (2) (15 g, 0,0015 mol), N-hidroxisuccinimida (0,21 g, 0,00179 mol) y diciclohexilcarbodiimida, 0,37 g, 0,00177 mol) en cloruro de metileno (100 ml) a temperatura ambiente con hidrógeno durante una noche. La suspensión se filtró, el producto se precipitó dos veces de cloruro de metileno por adición de éter (850 ml) y se recogió por filtración para obtener un sólido blanco (13,0 g) que tenía un 97,9% de sustitución por rmn de protones. La rmn de protones mostró un multiplete ancho a 3,50 ppm (grupos de metileno de estructura de PEG), un singlete a 3,23 ppm (de metil PEG), un singlete 2,80 ppm (metileno de NS) y multipletes a 2,68 y 2,95 ppm (metilenos de succinato).
Ejemplo 2
14
Preparaciones 1. mPEG_{20K}-O-CH(CH_{2}OBz)_{2}
Se destiló una solución de 18 g (0,0641 mol) de 1,3-dibenciloxi-2-propanol en 80 ml de tolueno hasta que se retiraron 15 ml de tolueno. La solución secada de forma azeotrópica se añadió después a una suspensión de 2,56 g (0,064 mol) de NaH en 80 ml de tolueno y la mezcla resultante se agitó con calentamiento hasta 37-40ºC antes del filtrado. Después se añadió el filtrado a una solución de mesilato de mPEG_{20K} secado de forma azeotrópica en aproximadamente 350 ml de tolueno y la mezcla resultante se calentó durante 20 horas a 125ºC con N_{2}. El producto se precipitó con éter frío, se lavó sobre el filtro con hexano y se secó al vacío para proporcionar 70,4 g de un sólido blanco que demostró que era puro por rmn de protones.
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2. mPEG_{20K}-O-CH(CH_{2}OH)_{2}
A una solución de 15 g (0,00075 mol) del producto de (1) en 9,2 ml de ácido fórmico y 0,8 ml de agua se le añadieron 2,0 g de Pd/C (10%) y la mezcla se agitó durante 2 horas con nitrógeno. La mezcla después se filtró y el pH del filtrado se ajustó a 7,2. La solución resultante se extrajo con CH_{2}Cl_{2} y el extracto se secó sobre MgSO_{4}. La evaporación de la solución produjo 12,9 g de producto que no mostró grupos bencilo en la rmn de protones.
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3. mPEG_{20K}-O-CH(CH_{2}OMs)_{2}
A una solución secada de forma azeotrópica del producto de (2) (8,0 g, 0,000889 mol) en tolueno (100 ml) que contenía 0,08 g de BHT se le añadió una solución de cloruro de mesilo (0,090 ml, 0,00116 mol) y trietilamina (0,210 ml, 0,0011 mol) en 10 ml de ET_{3}N y la solución resultante se agitó durante una noche a temperatura ambiente con nitrógeno. Se añadió etanol (1 ml) y se retiraron 50 ml del disolvente por destilación antes de añadir 500 ml de éter para precipitar el producto. El producto se recogió por filtración y se secó al vacío para proporcionar 7,6 g del derivado de mesilato que mostró por rmn que estaba sustituido al 100%.
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4. mPEG_{20K}-O-CH(CH_{2}SCH_{2}CH_{2}OH)_{2}
Se calentó una solución del producto (3) (7,0 g, 0,00035 mol), mercaptoetanol (0,56, 0,0080 mol) ml, NaOH (0,22 g) en tolueno (30 ml y etanol (60 ml) a 60ºC durante 2 horas con N_{2}. El pH se ajustó a 7 y el producto se extrajo con cloruro de metileno (3 x 100 ml). Después de secar el extracto sobre MgSO_{4}, se retiró el disolvente y el producto se precipitó con 250 ml de éter etílico. El producto se recogió por filtración y se secó al vacío para proporcionar 6,6 g de un sólido blanco que según mostró la rmn estaba sustituido al 97,3%.
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5. mPEG_{20K}-O-CH(CH_{2}SO_{2}CH_{2}CH_{2}OH)_{2}
Se preparó una solución que contiene el producto de (4) (6,5 g (0,00065 mol) y ácido túngstico (0,16 g) en agua (14 ml) y el pH se ajustó a 6,6. Se añadió peróxido de hidrógeno (30%, 0,65 ml) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante una noche. El pH se ajustó a 7,5 y la mezcla se agitó durante 1 hora antes de la extracción con CH_{2}Cl_{2} (3 x 30 ml). La mezcla se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y el filtrado se concentró hasta 25 ml. El producto se precipitó con 200 ml de éter y se recogió por filtración para obtener 5,3 g de producto después del secado al vacío. La rmn mostró que el producto tenía un 86% de sustitución.
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6. mPEG_{20K}-O-CH(CH_{2}SO_{2}CH=CH_{2})_{2}
Una solución a temperatura ambiente del producto de (5) (5,2 g, 0,00052 mol), Et_{3}N (0,63 ml, 0,00452 mol), BHT (0,005 g) y MsCl (0,15 ml, 0,001938 mol) en CH_{2}Cl_{2} (25 ml) se agitó durante 42 horas a temperatura ambiente. Se añadió etanol (1 ml) y la mezcla se agitó durante 15 minutos. Se añadió cloruro de metileno (50 ml) y la solución resultante se lavó con HCl 1 M acuoso seguido de Na_{2}HPO_{4} acuoso al 5%. Después del secado sobre MgSO_{4}, la solución se concentró hasta 30 ml y el producto se precipitó con 300 ml de éter. Se recogió el producto por filtración y se secó al vacío para producir el producto (4,6 g) en forma de un sólido blanco. El grado de sustitución era del 92,5% según mostró la rmn. El espectro de ^{1}H rmn (dmso-d6) mostró absorciones a 3,51 ppm (estructura de PEG CH_{2}), 3,23 ppm (CH_{3}O), 6,2 y 7,0 ppm, m, vinil H. Obsérvese en este ejemplo que Y = O, W =CH_{2} y Z = SO_{2}CH=CH_{2}.
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Ejemplo 3
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Preparaciones 1. mPEG_{5K}-O_{2}CNHCH(CH_{2}CO_{2}H)_{2}
A una solución de ácido \beta-glutámico (0,10 g, 0,00068 mol) y ácido bórico (0,1 g) en 10 ml de agua a pH 8 se le añadió mPEG_{5K}BTC durante 15 m mientras se mantenía el pH a 8,15-8,25 por adición de una solución de NaOH. Se añadió NaCl (6 g) y el pH de la solución se ajustó a 2 con H_{3}PO_{4} al 10%. El producto se extrajo en CH_{2}Cl_{2} (100 + 80 + 50 ml) y los extractos combinados se secaron sobre MgSO_{4}. La mezcla se filtró y el filtrado se evaporó al vacío para proporcionar 7,8 g de producto. Se determinó que la mezcla era el 75,5% del derivado de ácido glutámico de mPEG y el 24,5% de mPEG. Esta mezcla se purificó por cromatografía sobre DEAE sepharose eluyendo en primer lugar con agua y después eluyendo el producto deseado con NaCl 0,5 M. La extracción del producto de la solución de NaCl (pH 2) con cloruro de metileno seguido del secado del extracto sobre MgSO_{4} y de la evaporación del disolvente produjo 6,1 g de material que, según mostró el análisis por GPC era 100% puro.
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2. mPEG_{ 5K}-O_{2}CNHCH(CH_{2}-CO_{2}NS)_{2}
Se agitó una solución de mPEG_{5K}-O_{2}CNHCH(CH_{2}-CO_{2}NS)_{2} (6,0 g, 0,00116 mol), NHS (0,385 g, 0,001627 mol) y DCC (0,676 g, 0,00162 mol) en cloruro de metileno (50 ml) durante una noche a temperatura ambiente con nitrógeno. La suspensión resultante se filtró y el filtrado se añadió a 500 ml de éter etílico frío. El precipitado se recogió por filtración y se secó al vacío para obtener 5,5 g de producto que, según mostró el análisis por rmn, tenía un grado de sustitución del 100%. El espectro de ^{1}H rmn (dmso-d6) mostró absorciones a 3,51 ppm (estructura de PEG CH_{2}), 3,23 ppm, CH_{3}) 4,29 ppm (-NHCH-), 4,05 ppm (-CH_{2}-O-CONH-, 3,24 ppm (CH_{2}CO2NS), 2,81 (NS CH_{2}).
Ejemplo 4 Reacciones
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Preparaciones 1. Preparación de CH_{3}-O-PEG-O-CH_{2}CH_{2}CH(CO_{2}H)_{2} (Etapas 1 y 2 anteriores)
Se añadió gota a gota malonato de dietilo (8,8 ml) en 150 ml de dioxano a NaH (2,4 g) en 60 ml de tolueno en una atmósfera de argón. Se destiló de forma azeotrópica el mesilato de MPEG_{5000} (30 g) en 250 ml de tolueno para retirar 150 ml de tolueno y el resto se añadió a la anterior solución de malonato de dietilo. Después de someter la mezcla a reflujo durante 3-4 horas, se evaporó al vacío a sequedad y se secó al vacío durante una noche. Después, el material seco se disolvió en 200 ml de NaOH normal, la solución se agitó durante 2 días a temperatura ambiente y el pH se ajustó a 3 con HCl 1 N. Se añadió NaCl a la solución hasta una concentración de aproximadamente 15% y la mezcla se extrajo después con 350 ml de CH_{2}Cl_{2} en varias porciones. Los extractos combinados se secaron sobre Na_{2}SO_{4}, se concentraron al vacío y el producto se precipitó por la adición de isopropanol/éter (1:1). El producto se recogió por filtración y se secó al vacío durante una noche para obtener 24,7 g del producto en forma de un polvo blanco. La GPC (Ultrahidrogel 250) mostró que el producto era puro al 98%.
^{1}H RMN (dmso-d6, ppm): 1,96 (t, CH_{2}CH_{2}-C), 3,51 (m a, PEG -CH_{2}CH_{2}-O-)
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2. Preparación de CH_{3}-O-PEG_{5000}-O-CH_{2}CH_{2}CH(CH_{2}OH)_{2}
Se disolvió CH_{3}-O-PEG_{5000}-O-CH_{2}CH_{2}CH(CO_{2}H)_{2} (5 g) en 50 ml de tolueno y se añadieron 9,8 ml de LiAlH_{4} (1 M en THF). Después de la agitación durante una noche a temperatura ambiente, la mezcla se evaporó a sequedad al vacío y se añadieron 150 ml de agua y 22,5 g de NaCl. Se ajustó el pH hasta 6,5 con HCl acuoso y la solución resultante se extrajo con 3 x 50 ml de cloruro de metileno. Los extractos combinados se secaron sobre Na_{2}SO_{4} y la solución se evaporó a sequedad. El producto se precipitó con éter etílico y se recogió por filtración. Después de la cromatografía sobre DEAD sepharose, el producto tenía una pureza del 90% según mostró el análisis por GPC (Ultrahidrogel 250).
H RMN (dmso-d6, ppm): 3,51 (m a, PEG -CH_{2}CH_{2}-O-), 1,5 (mult a, CH; 4,32 (t, OH).

Claims (25)

1. Un método para preparar un conjugado polimérico, comprendiendo dicho método:
la unión covalentemente a un polímero soluble en agua que tiene la estructura
18
donde
POLI
es una estructura polimérica lineal o ramificada soluble en agua,
Y
es un enlace hidrolíticamente estable,
W y W'
son grupos de unión opcionales no reactivos, y
Z y Z'
son cada uno grupos reactivos seleccionados independientemente
comprendiendo un agente biológicamente activo un resto capaz de reaccionar con al menos uno de Z y Z'.
2. El método de la reivindicación 1, en el que POLI se selecciona del grupo compuesto por polietilenglicol, poli(vinilpirrolidona), poli(alcohol vinílico), polioxazolina, poli(acriloilmorfolina), y homopolímeros, copolímeros aleatorios o de bloque y terpolímeros que comprende monómeros de dichas estructuras polimérica.
3. El método de la reivindicación 1, en el que dicho POLI es polietilenglicol.
4. El método de la reivindicación 3, en el que POLI está ramificado.
5. El método de la reivindicación 3, en el que POLI es lineal.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el peso molecular de POLI varía de aproximadamente 100 a aproximadamente 100.000 o de aproximadamente 6.000 a aproximadamente 80.000.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que W y W' se seleccionan independientemente del grupo compuesto por cadenas de alquilo, cadenas de éter, cadenas de éster, cadenas de amida y combinaciones de las mismas.
8. El método de la reivindicación 7, en el que W y W' son iguales.
9. El método de la reivindicación 7, en el que W y W' son diferentes.
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que Y es un enlace hidrolíticamente estable que comprende -O-, S-, o CO-NH-.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho agente biológicamente activo se selecciona del grupo compuesto por microorganismos, compuestos orgánicos e inorgánicos, proteínas, péptidos, lípidos, polisacáridos, nucleótidos, ADN, ARN, fármacos pequeños y agentes farmacéuticos.
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho agente biológicamente activo es una proteína.
13. El método de la reivindicación 1, en el que POLI comprende un grupo de sellado.
14. El método de la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en el que POLI es metoxi-PEG.
15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que Z y Z' se seleccionan cada uno independientemente del grupo compuesto por éster activo, carbonato activo, aldehído, isocianato, isotiocianato, epóxido, alcohol, maleimida, vinil sulfona, hidrazida, ditiopiridina y yodoacetamida.
16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que Z y Z' son iguales.
17. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, que comprende unir covalentemente dicho polímero soluble en agua o un resto sobre dicho agente biológicamente activo seleccionado del grupo compuesto por amino, ácido carboxílico y tiol.
18. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, que comprende unir covalentemente dicho agente biológicamente activo a dicho polímero en condiciones eficaces para formar un conjugado que tiene dos de los mismos agentes biológicamente activos unidos covalentemente a dicho polímero.
19. El método de la reivindicación 16, en el que Z y Z' son ambos -CO_{2}-N-succinimidilo o aldehído, y dicha etapa de unión covalente comprende unir covalentemente dicho polímero a grupos amino de dicho agente biológicamente activo.
20. El método de la reivindicación 16, en el que Z y Z' son ambos vinil sulfona y dicha etapa de unión covalente comprende unir covalentemente dicho polímero a grupos tiol de dicho agente biológicamente activo.
21. El método de la reivindicación 4, en el que POLI es un poli(etilenglicol) ramificado que comprende un resto de núcleo de rama central derivado de un aminoácido.
22. El método de la reivindicación 21, en el que el aminoácido es lisina.
23. El método de la reivindicación 21, en el que Z y Z' son maleimida.
24. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 ó 19 a 23, en el que dicho agente biológicamente activo comprende al menos dos restos cada uno capaz de reaccionar con Z o Z', y dicha etapa de unión covalente se realiza en condiciones eficaces para formar un conjugado que tiene un agente biológicamente activo unido a dicho polímero por reacción con Z y Z'.
25. Un conjugado preparado por el método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
ES03028370T 1998-03-12 1999-03-11 Metodo para preparar conjugados polimericos. Expired - Lifetime ES2307865T3 (es)

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