CN1762990A - 包含氨基氧基的化合价平台分子 - Google Patents

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Abstract

提供了包含氨基氧基的分子，其中该氨基氧基提供了用于与其他分子共价结合的结合位点。在一种实施方式中，提供了包含氨基氧基的聚氧乙烯分子，它们能够与包括多(氨基酸)在内的多种生物活性分子共轭化合。在另一种实施方式中，提供了包含氨基氧基的化合价平台分子。氨基氧基可以用来与生物分子、例如多(氨基酸)形成共价键。氨基氧基例如可以与经过修饰含有羰基、例如乙醛基的多(氨基酸)反应，生成化合价平台分子与生物活性分子经由肟键结合的轭合物。包含氨基氧基的化合价平台分子在轭合物形成中有利地是反应性的，它们还可以是易于合成的，形成多分散性非常低的组合物。

Description

包含氨基氧基的化合价平台分子
本申请是申请日为2000年6月8日、申请号为00808613.3、发明名称为“包含氨基氧基的化合价平台分子”的中国专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求1999年6月8日提交的美国临时申请Serial No.60/138,260的优先权，其公开内容全文引用在此作为参考文献。
技术领域
本申请涉及包含氨基氧基的分子，它们能够以共价方式与其他分子结合。确切地说，本申请涉及包含氨基氧基的化合价平台分子，一个或多个分子、例如生物活性分子可以与之结合形成轭合物。
背景技术
“化合价平台”是具有一个或多个(通常为多个)结合位点的分子，可以用来以共价方式与有关生物活性分子结合形成共用的脚手架。与生物活性分子结合形成共用脚手架提供了多价轭合物，其中有多个生物活性分子拷贝以共价方式连接于相同的平台。“限定的”或“化学限定的”化合价平台是具有限定结构的平台，因而具有限定数量的结合点和限定的化合价。限定的化合价平台轭合物是具有限定结构并且具有限定数量的所结合的生物活性化合物的轭合物。生物活性分子的实例包括寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体、糖、多糖、表位、mimotope、药物等。例如，生物活性化合物可以特异性地与蛋白质受体发生相互作用。
某些种类的化学限定的化合价平台、它们的制备方法、包含它们的轭合物和这些轭合物的制备方法已经描述在美国专利Nos.5,162,515；5,391,785；5,276,013；5,786,512；5,726,329；5,268,454；5,552,391；5,606,047和5,663,395中。包含氨基甲酸酯键的化合价平台分子描述在1999年12月8日提交的美国临时专利申请No.60/111,641和09/457,607中。
发明的公开
本申请提供了包含氨基氧基的分子及其与其他分子、例如生物活性分子的轭合物和它们的合成方法。氨基氧基提供了用于与其他分子共价结合的结合位点。
在一种实施方式中，提供了包含氨基氧基的聚氧化乙烯分子、或者更确切为聚乙二醇分子，它们能够与包括多(氨基酸)在内的多种生物活性分子共轭化合。在另一种实施方式中，提供了包含氨基氧基的化合价平台分子。氨基氧基可以用来与生物分子、例如多(氨基酸)形成共价键。氨基氧基例如可以与经过修饰含有羰基、例如乙醛酸化多(氨基酸)反应，生成化合价平台分子与生物活性分子经由肟键结合的轭合物。包含氨基氧基的化合价平台分子在轭合物形成中有利地是反应性的，它们还可以是易于合成的，形成多分散性非常低的组合物。
包含氨基氧基、优选为3个或以上氨基氧基的分子、例如包含氨基氧基的化合价平台分子可以以共价方式连接一个或多个、例如3个或以上生物活性分子，例如包括寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体、糖、多糖、表位、mimotope或药物。
在一种实施方式中，提供了包含氨基氧基的分子，其中该分子包含氧化烯基，例如氧乙烯基或聚氧乙烯基。该分子例如可以包含至少3个氨基氧基，或者4、5个或以上氨基氧基。
本文所用的“氧乙烯、氧丙烯和氧化烯”与“氧化乙烯、氧化丙烯和烯化氧”是可互换使用的。
在另一种实施方式中，提供了包含氨基氧基的化合价平台分子。在一种优选的实施方式中，化合价平台分子包含至少3个氨基氧基。化合价平台分子可以进一步包含氧化烯基，例如氧乙烯基或聚氧乙烯基，例如-(CH2CH2O)n-，其中n是200至500。
还提供了组合物，它包含一种分子、例如化合价平台分子、例如本文所公开的那些，包含氨基氧基，并且多分散性小于1.2、例如小于1.1或者小于1.07。
在一种实施方式中，提供了具有下式结构的化合价平台分子：
                       R-(ONH2)m
                         式1
其中在一种实施方式中：
m是1-50或以上，例如3-50；
R是有机部分，包含1-1000或10000个原子或以上，选自由H、C、N、O、P、Si和S原子组成的组。
在另一种实施方式中，提供了具有下式结构的化合价平台分子：
                    Rc[G1(ONH2)n]y
                         式2
其中在一种实施方式中：
y是1至16；
n是1至32；
其中在一种实施方式中，y*n(y乘以n)的结果至少是3；
Rc和每个G1独立地是有机部分。
在一种实施方式中，Rc和每个G1独立地是有机部分，包含选自H、C、N、O、P、Si和S原子的原子，并且可选地包含氧化烯基。在多分散性小于1.2的组合物中可以提供这些分子。
在另一种实施方式中，提供了具有下式结构的化合价平台分子，选自下组：
              Rc[O-C(＝O)-NR1-G2-(ONH2)n]y
                         式3；
              Rc[C(＝O)-NR1-G2-(ONH2)n]y
                         式4；
              Rc[NR1-C(＝O)-G2-(ONH2)n]y
                         式5；
              Rc[NR1-C(＝O)-O-G2-(ONH2)n]y
                         式6；
              Rc[R1C＝N-O-G2-(ONH2)n]y
                         式7；和
              Rc[S-G2(ONH2)n]y
                         式8；
其中，例如：
y是1至16；
n是1至32；
其中在一种实施方式中，y*n(y乘以n)的结果至少是3；
R1是H、烷基、杂烷基、芳基、杂芳基或G2-(ONH2)n；
Rc和每个G2独立地是有机部分，包含选自H、C、N、O、P、Si和S原子的原子。
在一种实施方式中，Rc和每个G2独立地选自下组：
烃基，仅由H和C原子组成，并且具有1至200个碳原子；
有机基团，仅由碳、氧和氢原子组成，并且具有1至200个碳原子；
有机基团，仅由碳、氧、氮和氢原子组成，并且具有1至200个碳原子；
有机基团，仅由碳、氧、硫和氢原子组成，并且具有1至200个碳原子；
有机基团，仅由碳、氧、硫、氮和氢原子组成，并且具有1至200个碳原子。
在化合价平台分子的一种实施方式中，Rc选自由C1-200烃部分、C1-200烷氧基部分和包含芳族基团的C1-200烃部分组成的组。
Rc可选地可以包含氧化烯部分，例如氧乙烯部分(-CH2CH2O-)。在一种实施方式中，Rc包含氧乙烯单元：
                    -(CH2CH2O)n-；
其中n是1-500，例如200-500、1-200、1-100或1-20。
在一种实施方式中，每个G2独立地包含官能团，选自由烷基、杂烷基、芳基和杂芳基组成的组。
在另一种实施方式中，每个G2独立地包含官能团，选自由C1-200烃部分、C1-200烷氧基部分和包含芳族基团的C1-200烃部分组成的组。
每个G2独立地可以包含氧化烯部分，例如氧乙烯部分(-CH2CH2O-)。
在一种实施方式中，每个G2独立地包含氧乙烯单元：
                       -(CH2CH2O)n-；
其中n是1-500，例如1-200、200-500、1-100或1-20。
在化合价平台分子的一种实施方式中，每个G2独立地包含选自下组的官能团：胺；酰胺；酯；醚；酮；醛；氨基甲酸酯；硫醚；哌嗪基；哌啶基；醇；聚胺；聚醚；酰肼；肼；羧酸；酸酐；卤素；磺酰基；磺酸酯；砜；氰酸酯；异氰酸酯；异硫氰酸酯；甲酸酯；碳二亚胺；硫醇；肟；亚胺；氨基氧基；和马来酰亚胺。
在一种实施方式中，在化合价平台分子中，每个G2-ONH2独立地选自图17所示部分。
在另一种实施方式中，化合价平台分子是用连接剂合成的，该连接剂在一个末端包含氨基氧基或被保护的氨基氧基。另一端可以包括胺，如化合物11与100、实施例3与17和图3与25所述；碳酸酯，如化合物18与28和实施例4与6以及图4与7所述；硫醇，如化合物22a与22b、实施例5a与5b和图5与6所述；氨基氧基，如化合物37、实施例8和图9所述；羧酸或活化衍生物，如化合物105与106、实施例16与20和图24与28所述。
在另一种实施方式中，提供了图19所示式9-13化合物。式9-13中，在一种实施方式中，Rc和G2是如上定义的，n是约1-500，例如200-500、1-200、1-100或1-50。
在进一步的实施方式中，提供了具有下式结构的化合价平台分子：
Figure A20051011611700221
其中n是约503，或者例如大于约500、大于约600或大于约700或800或以上；
其中n是约112，或者例如大于约500、大于约600或大于约700或800或以上；
或者
Figure A20051011611700232
其中n是约481，或者例如大于约500、大于约600或大于约700或800或以上。
还提供了包含氨基氧基的分子与生物活性分子的轭合物，前者分子例如本文所公开的任意化合价平台分子。生物活性分子例如可以包括多糖、多(氨基酸)、核酸、脂质和药物，和它们的组合。轭合物包括肟轭合物或其修饰形式，例如还原产物，例如氨基氧基，和烷基化形式。
还提供了制备包含氨基氧基的分子与生物活性分子的轭合物的方法，前者分子例如本文所公开的任意化合价平台分子，其中该方法包括使包含氨基氧基的分子、例如化合价平台分子上的氨基氧基与生物活性分子上的反应性官能团、例如醛基或酮基的羰基反应，生成肟轭合物。在其中生物活性分子是多(氨基酸)的实施方式中，该方法可以进一步包括在共轭之前修饰该多(氨基酸)，以包括末端醛基。
还提供了药学上可接受的组合物，包含本文公开的轭合物和可选的药学上可接受的载体。
附图的简要说明
图1显示氨基转移多肽的合成。
图2显示氨基氧基乙酰基化合价平台分子的合成。
图3显示烷基氨基氧基化合价平台分子的合成。
图4显示烷基氨基氧基化合价平台分子合成的另一种实施方式。
图5和6显示包含硫醚团能度的烷基氨基氧基化合价平台分子的合成。
图7显示烷基氨基氧基化合价平台分子合成的另一种实施方式。
图8显示烷基氨基氧基化合价平台分子合成的另一种实施方式。
图9显示包含哌嗪部分和肟键的烷基氨基氧基化合价平台分子的合成。
图10显示烷基氨基氧基化合价平台分子的合成。
图11显示包含哌嗪部分的氨基氧基乙酰基化合价平台分子与多肽的轭合物的合成。
图12显示烷基氨基氧基化合价平台分子与多肽的轭合物的合成。
图13是模型烷基氨基氧基化合物和模型氨基氧基乙酰基化合物的轭合物生成速率对比图。
图14显示模型烷基氨基氧基化合物和模型氨基氧基乙酰基化合物的合成和它们与乙醛酸化多肽的反应。
图15显示烷基氨基氧基化合价平台分子与多(氨基酸)的轭合物合成的另一种实施方式。
图16显示利用含有氨基氧基连接剂的硫醇和卤代乙酰基平台制备多肽的另一种方法。
图17显示化合价平台分子上的示范性G2-ONH2。
图18显示包含氨基氧基的化合价平台分子的一些示范性结构式。
图19显示包含氨基氧基的化合价平台分子结构式的另一种实施方式。
图20显示包含氨基氧基的化合价平台分子的实施方式。
图21显示包含氨基氧基的化合价平台分子的其他实施方式。
图22显示包含氨基氧基的化合价平台分子的另一些实施方式。
图23显示化合物85的合成图。
图24显示化合物86的合成图。
图25显示化合物91的合成图。
图26显示化合物92的合成图。
图27显示化合物113的合成图。
图28显示包含不同分子量聚氧化乙烯基的多价平台分子的合成图。
图29显示包含聚氧化乙烯基和分支基团的多价平台分子的合成图。
图30显示包含一个聚氧化乙烯基和一个分支基团的一个多价平台分子的合成图。
图31显示包含聚乙二醇基的多价平台分子的合成图。
图32显示包含一个聚乙二醇基的一个多价分子的合成图。
图33显示化合价平台分子与生物活性分子的一些示范性轭合物的结构。
图34显示包含聚氧化乙烯的八聚平台的合成，其中n例如是112。
图35显示包含两个聚氧化乙烯基的化合价平台分子的合成，其中n例如是500或以上。
实施发明的方式
提供了包含氨基氧基的分子。氨基氧基可以被提供在诸如聚合物等分子上，例如在末端位置，以提供结合位点，用于与其他分子、例如生物活性分子结合。例如，多种聚合物经过修饰可以含有氨基氧基，例如聚环氧烷聚合物，包括聚(氧化乙烯)聚合物，确切为聚乙二醇。氨基氧基是有利的，因为它们可以用来与含有反应性基团、例如醛基或酮基的其他分子迅速反应，生成与其他分子的共价轭合物，收率良好。氨基氧基在与醛或酮反应生成C＝N键形式的稳定轭合物中，提供优于其他含氮官能团的结果，例如胺、酰肼、卡巴肼和半卡巴肼。氨基氧基缩短了反应时间，提高了产物收率。
经过修饰可以包括氨基氧基的其他分子包括分支、线性、嵌段和星形聚合物与共聚物，例如包含聚氧化烯部分的那些，例如聚氧乙烯分子，确切为聚乙二醇。聚乙二醇的分子量优选地小于约10000道尔顿。在一种实施方式中，可以使用多分散性低的聚合物。例如，聚氧丙烯和聚氧乙烯聚合物与共聚物、包括聚乙二醇经过修饰可以包括氨基氧基，其中聚合物具有低的多分散性，例如小于1.5或小于1.2，或者可选地小于1.1或1.07。优选地，聚合物包含至少3个氨基氧基，或者至少4、5、6、7、8个或以上。
非聚合分子经过修饰也可以包括如本文公开的氨基氧基。例如，化学限定的非聚合化合价平台分子经过修饰可以包括氨基氧基，例如美国专利No.5,552,391所述的那些。
还提供了包含这些分子和轭合物的组合物，例如是药学上可接受的形式，例如包含药学上可接受的载体。本领域所述用于不同给药途径、包括口服、静脉内和气雾剂给药的载体例如参见《Remington药学科学与实践》(“Remington：The Science and Practice of Pharmacy”)，Mack Publishing Company，Pennsylvania，1995，其公开内容引用在此作为参考文献。载体例如可以包括水、糖、多糖、缓冲剂、赋形剂和生物可降解的聚合物，例如聚酯、聚酐、聚氨基酸和脂质体。
药学上可接受的组合物是适合于对个体给药的组合物，例如对个体进行全身或局部给药，采取单位剂型、无菌的肠胃外溶液或悬液、无菌的非肠胃外溶液或口服溶液或悬液、水包油或油包水型乳剂等。
化合价平台
在一方面提供了包含氨基氧基的化合价平台分子、其与诸如生物活性分子等分子的轭合物和这些平台与轭合物的制备方法。
各种化合价平台分子是本领域已知的。优选的是化学限定的化合价平台分子。制备化合价平台分子的方法例如描述在美国专利Nos.5,162,515；5,391,785；5,276,013；5,786,512；5,726,329；5,268,454；5,552,391；5,606,047；5,663,395和5,874,409以及U.S.Serial No.60/111,641和PCT US 97/10075。一般来说，这些平台含有核心基团或分支的核心基团，它们终止于羟基、羧基、氨基、醛、酮或烷基卤。这些基团经过进一步修饰，可以得到所需的反应性基团，得到优选包含至少三个氨基氧基的化合价平台分子。
化合价平台是从含有所需化合价的核心基团制备的。链的化合价可以是一或二，这取决于链是如何终止的。分支的链的化合价可以是三或以上，这取决于分支或侧链的数量。例如，三甘醇的化合价为二，乙醇的化合价为一，季戊四醇的化合价为四。它们是终止于羟基的链，经过进一步修饰可以提供所需的反应性基团。链也可以终止于其他基团，例如胺、硫醇、烷基卤、羧基、醛、酮或可被进一步修饰的其他基团。
这些链可以充当核心基团。通过用分支部分衍生末端官能度可以增加核心基团的化合价。例如，通过将三甘醇转化为双-氯甲酸酯衍生物，化合价为二的三甘醇可以转化为化合物为四的平台。双-氯甲酸酯与适当取代的二亚乙基三胺衍生物反应，得到四价平台，如实施例6所述。类似地，三甘醇双-氯甲酸酯与亚氨基二乙酸反应，可以得到终止于羧基的四价平台，如实施例7所示。
本领域已知用于制备化合价平台分子的方法例如包括增长法或分段法。这样的方法经过适当试剂的修饰，可以在所得分子上提供氨基氧基。例如，可以使反应性基团反应，例如卤化物基团、羟基、氨基、醛、酮或羧基，而与诸如连接剂等分子结合，后者包含可选被保护的氨基氧基。本文实施例证明了示范性方法。
使用化合价平台分子的优点包括易于合成，利用例如不同的烯氧基或二醇胺基能够调节化合价平台“臂”的长度与水溶性，通过选择核心基团能够进一步减弱化合价平台的性质。
在一方面，提供了基本上是单分散的化合价平台分子。氨基氧基化合价平台分子有利地具有较窄的分子量分布。氨基氧基化合价平台分子样本分子量分布宽度的量度是样本的多分散性。多分散性用作聚合物样本分子量均一性或非均一性的量度。多分散性是重均分子量(Mw)除以数均分子量(Mn)的计算值。Mw/Mn值对完全单分散的聚合物来说是一致的。多分散性(Mw/Mn)是用本领域可得到的方法测量的，例如凝胶渗透色谱法。氨基氧基化合价平台分子样本的多分散性(Mw/Mn)优选地小于2，更优选地小于1.5，或者小于1.2、小于1.07、小于1.02，或者例如约1.05至约1.5或约1.05至1.2。典型的聚合物的多分散性一般是2-5，或者在有些情况下是20或以上。低多分散性化合价平台分子的优点包括提高了生物可相容性与生物利用度，因为这些分子基本上是大小均匀的，并且减少了由分子量差异大而引起的生物活性差异。低多分散性分子因而是药物制剂的优选，并且是易于分析的。进而在样本中存在化合价受控制的分子群。
在有些实施方式中，由于连续分支点的存在，化合价平台分子可以被描述为“树状”。树状化合价平台分子具有多个末端，通常为4个或以上末端，例如8个末端或16个末端。
在一种实施方式中，提供了化学限定的化合价平台分子，它们包含氨基氧基，并且包含除氨基甲酸酯以外的官能团。
请注意，本文公开的结构式试图涵盖“对称的”和“不对称的”化合价平台。在一种实施方式中，化合价平台是对称的。在另一种实施方式中，化合价平台是不对称的。
通式
在一种实施方式中，提供了包含末端氨基氧基的化合价平台分子，例如1至100个、例如1-50、2-16、4-16个、或者例如2、3、4、8、16、32个或以上氨基氧基。在一种实施方式中，提供了这样的化合价平台分子，它具有至少3或4个氨基氧基，并且可选地进一步包含氧化烯基，例如氧乙烯基或其聚合物。
在一种实施方式中，提供了具有下式结构的化合价平台分子：
                      R-(ONH2)m
                         式1
其中：
m是1至100，例如1-50、1-16、2-16、4-16，或者例如2、4、8、16、32或以上，在一种实施方式中，至少是3，例如3-50；
R是有机部分，例如包含1至10000个原子、1至1000个原子，或者例如1-100个原子，例如包括H、C、N、O、P、Si和S原子以及卤原子。例如，R可以包括1至1000、或者例如1-100个C、H、N和O原子。
在另一种实施方式中，化合价平台分子具有下式结构：
                    Rc[G1(ONH2)n]y
                          式2
其中：
y例如是1至100，例如1-50、1-32、1-16、2-16、4-16，或者例如1、2、3、4、8、16、32或以上；
n例如是1至100，例如1-50、1-32、1-16、2-16、4-16，或者例如2、3、4、8、16、32或以上；
其中在一种实施方式中，y*n(y乘以n)的结果至少是3；
Rc和每个G1独立地是有机部分，例如包含选自H、C、N、O、P、Si和S原子的原子，例如小于1000个原子、1000至10000个或以上。
在一种实施方式中，Rc是如下定义的，G1同G2是如下所定义的。在一种实施方式中，式2分子包含氧化烯基。
在另一种实施方式中，提供了具有下式之一结构的化合价平台分子，也如图18所示：
             Rc[O-C(＝O)-NR1-G2-(ONH2)n]y
                        式3；
             Rc[C(＝O)-NR1-G2-(ONH2)n]y
                        式4；
             Rc[NR1-C(＝O)-G2-(ONH2)n]y
                        式5；
             Rc[NR1-C(＝O)-O-G2-(ONH2)n]y
                        式6；
             Rc[R1C＝N-O-G2-(ONH2)n]y
                       式7；和
             Rc[S-G2(ONH2)n]y
                       式8；
其中，在一种实施方式中：
y是1至100，例如1-50、1-32、1-16、2-16、4-16，或者例如1、2、3、4、6、8、16、32、64或以上；
n是1至100，例如1-50、1-32、1-16、2-16、4-16，或者例如2、3、4、6、8、16、32、64或以上；
其中在一种实施方式中，y*n(y乘以n)的结果至少是3；
R1如果存在的话，例如是H、烷基、杂烷基、芳基、杂芳基或者可选地是如本文所定义的G2-(ONH2)n；
Rc和每个G2独立地是有机部分，例如包含选自H、C、N、O、P、Si和S原子的原子，或者可选地包含卤原子，例如1至10000个、1至1000个原子或1至100个原子。
R1因而可以在一种实施方式中是任意包括碳和氢的烷基部分，例如甲基、乙基或丙基或者其他包括直链、支链或环状结构的烃，它们可以是饱和或不饱和的；或者可以是杂烷基，进一步包含例如O、S或N原子；或者可以是芳基或杂芳基。
在一种实施方式中，Rc和每个G2独立地包含例如直链、支链或环状结构，并且独立地选自下组：
烃基，仅由H和C原子组成，并且具有1至5000、1-500、1至200、1至100个、或者例如1至20个碳原子；
有机基团，仅由碳、氧和氢原子组成，并且具有1-5000、1至500、1至200、1至100个、或者例如1至20个碳原子；
有机基团，仅由碳、氧、氮和氢原子组成，并且具有1-5000、1至500、1至200、1至100个、或者例如1至20个碳原子；
有机基团，仅由碳、氧、硫和氢原子组成，并且具有1至5000、1至500、1至200、1至100个、或者例如1至20个碳原子；或
有机基团，仅由碳、氧、硫、氮和氢原子组成，并且具有1-5000、1至500、1至200、1至100个、或者例如1至20个碳原子。
式中Rc表示“核心基团”，也就是构成化合价平台核心的有机基团，一个或多个有机基团与之结合。在一种实施方式中，核心基团的化合价相当于y。如果y是1，那么Rc是一价的；如果y是2，那么Rc是二价的；如果y是3，那么Rc是三价的；如果y是4，那么Rc是四价的，等等。
Rc例如可以是烷基、杂烷基、芳基、杂芳基，并且例如可以是直链、支链或环状的。
在一种实施方式中，Rc是烃基(即仅由碳和氢组成)，具有1-2000或1至200个碳原子，例如1至100个碳原子或1至50个碳原子。Rc例如可以是线性的或分支的，或者可以包含环状结构。在一种实施方式中，Rc是环状的。Rc可以是饱和的或者完全或部分不饱和的。Rc可以包含或者是芳族结构。在一种实施方式中，Rc是芳族基团，例如苄基，其化合价例如是1至6。Rc例如可以是-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-或C(CH2-)4。Rc进一步例如可以是-(CH2)n-，其中n是1至20。
在一种实施方式中，Rc是这样的有机基团，它仅由碳、氧和氢原子组成，并且例如具有1至5000、1至500、1-200、1至50或1-20个碳原子，或者例如1至10个碳原子或1至6个碳原子。Rc可以是或者包含烷氧基。在一种实施方式中，Rc是或包含聚氧化烯基或者是从其衍生的，例如聚氧乙烯基或聚氧丙烯基。Rc可以是或者包含二价聚氧化烯基，例如二价聚氧乙烯基或聚氧丙烯基。在一种实施方式中，Rc是或者包含二价聚氧丙烯基，例如包括约1-5000、1至500、1-200、1-100或1-50个氧丙烯单元，或者例如1-20、1-10个或1、2、3、4或5个氧丙烯单元。在另一种实施方式中，Rc是或者包含二价氧乙烯基，例如包括约1至5000、1至500、1-200、1-100或1-50个氧乙烯单元，或者例如1-20、1-10个或1、2、3、4或5个氧乙烯单元。
在一种实施方式中，Rc是：
其中p是从2至约500的正整数，例如2-200，例如2至约50、2至约20、2至约10或2至约6。在一种实施方式中，p是2、3、4、5或6。
在一种实施方式中，Rc是这样的有机基团，它仅由碳、氧、氮和氢原子组成，并且具有1至5000、1至500个、例如1-200或1至20个碳原子，例如1至10个碳原子或1至6个碳原子。这类核心基团的实例包括但不限于仅由碳、氧、氮和氢原子组成的那些。
在一种实施方式中，Rc是这样的有机基团，它仅由碳、氧、硫和氢原子组成，并且具有1至5000、1至500或1至200个碳原子，例如1至100个碳原子或1至10个碳原子。
Rc例如可以是C1-200烃部分、C1-200烷氧基部分或包含芳族基团的C1-200烃部分。
Rc可以是或者包含具有两个羟基的含有核心化合物的醇，例如乙二醇、二甘醇(也称为DEG)、三甘醇(也称为TEG)、四甘醇、五甘醇、六甘醇、聚乙二醇(也称为PEG)，其中n通常从1至约200，和1，4-二羟甲基苯。具有三个羟基的含有核心化合物的醇实例包括藤黄酚(也已知为1，3，5-三羟基苯)、1，3，5-三羟甲基苯和1，3，5一三羟基环己烷。
具有四个羟基的含有核心化合物的醇实例包括季戊四醇。
式中G2可以表示有机“连接剂”。G2在一种实施方式中是或者包含诸如烷基、杂烷基、芳基或杂芳基等有机基团，并且可以是或者可以含有例如直链、支链或环状结构。G2例如可以包含烃基、乙烯氧基、聚乙烯氧基、丙烯氧基或聚丙烯氧基，或者它们的组合。G2可选地可以包含其他杂原子，包括S和N。
G2也可以包含这样的官能团，例如胺、酰胺、酯、醚、酮、醛、氨基甲酸酯和硫醚。G2也可以包含这样的官能团，例如伯、仲与叔、饱和或不饱和的烷基胺基，例如哌嗪基或哌啶基。G2也可以包含这样的官能团，包括聚醇；聚胺；聚醚；酰肼；肼；羧酸；酸酐；卤素；磺酰基；磺酸酯；砜；亚氨酸酯；氰酸酯；异氰酸酯；异硫氰酸酯；甲酸酯；硫醇；醇；肟；亚胺；氨基氧基；和马来酰亚胺。
在一种实施方式中，G2是烃基(即仅由碳和氢组成)，包含1至5000、1至约500或1至约200个碳原子，例如1至100个碳原子或1至10个碳原子。在一种实施方式中，G2是或者包含烷基，例如-(CH2)q-，其中q是1至20。在一种实施方式中，G2是或者包含线性、分支或环状结构。G2可以是完全或部分不饱和的或饱和的。
在一种实施方式中，G2包含芳族结构。在一种实施方式中，G2是芳香性的。在一种实施方式中，G2是二价的。在一种实施方式中，G2是或者包含-(CH2)q-，其中q是1至约20，例如1至约10或1至约6或1至约4。在一种实施方式中，G2是-CH2-。在一种实施方式中，G2是或者包含-CH2CH2-。在一种实施方式中，G2是或者包含-CH2CH2CH2-。
在一种实施方式中，G2是这样的有机基团，它仅由碳、氧和氢原子组成，并且具有1至5000、1至500、1至200、1至50个、例如1-20个碳原子，或者例如1至10个碳原子或1至6个碳原子。在一种实施方式中，G2是从聚氧化烯基衍生的。在一种实施方式中，G2是或者包含二价聚氧化烯基。在一种实施方式中，G2是或者包含二价聚氧乙烯基。在一种实施方式中，G2是二价聚氧丙烯基。在一种实施方式中，G2是或者包含：
其中p是2至约200或500，例如2至约50，或2至约20，或2至约10，或2至约6。在一种实施方式中，p是2、3、4、5或6。
在一种实施方式中，G2是这样的有机基团，它仅由碳、氧、氮和氢原子组成，并且具有1至5000、1至500个、例如1至200个碳原子，例如1至100个碳原子或1至10个碳原子。
G2例如可以是C1-200烃部分、C1-200烷氧基部分或包含芳族基团的C1-200烃部分。
在一种实施方式中，化合价平台分子具有图19所示任意式9-13结构之一。式9-13中，在一种实施方式中，Rc和G2是如上定义的，n是约1-500，例如1-200、1-100或1-50，例如1-20、1-10，或者例如1、2、3、4或5。在一种实施方式中，G2-ONH2具有图17所示任意结构。
在进一步的实施方式中，化合价平台分子具有图20、21和22所示任意结构。
在本文公开的每种化合物和结构式的一种优选实施方式中，化合价平台分子所包含的氨基氧基是氨基氧基烷基，例如-CH2CH2ONH2。
包含氨基氧基的分子的制备
各种分子经过修饰可以包含如本文公开的反应性氨基氧基。例如，多种聚合物经过修饰可以含有氨基氧基，例如聚(烯化氧)聚合物，包括聚(氧化乙烯)聚合物，确切为聚乙二醇，其分子量例如小于10000道尔顿。
其他经过修饰可以包括氨基氧基的分子包括分支、线性、嵌段和星形聚合物与共聚物，例如包含聚(烯化氧)部分的那些，例如聚(氧化乙烯)分子。在优选的实施方式中，提供了聚乙二醇分子，它们包括至少三个氨基氧基，并且可选地分子量小于约10000。
在一方面，化合价平台分子经过修饰可以包含氨基氧基。用于制备化合价平台分子的方法例如描述在美国专利Nos.5,162,515；5,391,785；5,276,013；5,786,512；5,726,329；5,268,454；5,552,391；5,606,047；5,663,395和5,874,409以及U.S.SerialNo.60/111,641和PCT US97/10075中。
本领域已知用于制备化合价平台分子的方法例如包括增长法或分段法。这样的方法经过适当试剂的修饰，可以在所得分子上提供氨基氧基。例如，可以使反应性基团反应，例如卤化物基团或羟基，而与诸如连接剂等分子结合，后者包含可选被保护的氨基氧基。本文实施例证明了示范性方法。
化合价平台可以从分段法制备，其中片段是独立地合成的，随后与核心基团连接。分段法的替代选择是核心繁殖过程，这是一种可以用于产生树状结构的反复过程。
核心化合物的实例包括含有核心化合物的醇甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇与甲氧基聚乙二醇、单羟基胺、乙二醇、二甘醇、三甘醇、四甘醇、五甘醇、六甘醇、1，4-双-(羟甲基)苯和聚乙二醇HO(CH2CH2O)nH，其中例如n是约1-500或1-200，例如1-10或1至5，或者具有两个羟基的伯胺或仲胺。
氨基氧基平台例如可以制备成四价。
式2化合价平台分子可以如实施例所述进行制备，例如实施例9。这些分子可以从四价的化合价平台分子制备，后者具有可以转化为氨基氧基的端基。一般来说，可以使用良好的离去基团，例如卤化物或磺酸酯，它们可以用被保护的羟胺衍生物的氧置换。利用氧杂环乙亚胺(oxaziridine)型试剂或Mitsunobu化学，羟基也能够转化为氨基氧基。本例制备了四烷基卤化物平台，将卤化物用N-(四丁氧羰基)羟胺的氧原子置换。除去Boc(N-(叔丁氧羰基))保护基团得到氨基氧基平台。
其他实施例涉及制备适当被保护的烷氧基胺双官能连接剂，它与平台的端基连接。式3化合价平台分子可以用实施例所述方法、例如实施例3所述从终止于羟基的化合价平台分子进行制备。羟基被转化为活化的碳酸酯。所制备的二价连接剂具有游离氨基和被保护的氨基氧基。通过游离氨基与碳酸酯反应生成氨基甲酸酯键，使连接剂连接到平台上，再除去氨基氧基的保护基团，释放出氨基氧基平台。
式4化合价平台分子例如可以经由实施例、例如实施例7详细描述的方法从终止于羧基的化合价平台分子进行制备。所制备的二价连接剂具有游离氨基和被保护的氨基氧基。将羧基活化，通过游离氨基与活化的羧基反应生成酰胺键，使连接剂连接到平台上。除去氨基氧基的保护基团，释放出氨基氧基平台。
式5化合价平台分子例如可以经由实施例、例如实施例2详细描述的方法从终止于氨基的化合价平台分子进行制备。所制备的二价连接剂具有活化的羧基和被保护的氨基氧基。平台上的氨基与连接剂上的活化羧基反应，生成酰胺键。除去氨基氧基的保护基团，释放出氨基氧基平台。
式6化合价平台分子例如可以经由实施例详细描述的方法、例如实施例4和6所述从终止于氨基的化合价平台分子进行制备。所制备的二价连接剂具有活化的碳酸酯基和被保护的氨基氧基。平台上的氨基与连接剂上的活化碳酸酯基反应，生成氨基甲酸酯键。除去氨基氧基的保护基团，释放出氨基氧基平台。
式7化合价平台分子例如可以经由实施例详细描述的方法、例如实施例8所述从终止于醛或酮基的化合价平台分子进行制备。所制备的二价连接剂具有两个游离的氨基氧基。平台上的醛或酮基(实施例8为酮)与过量的二价双-氨基氧基连接剂反应，得到氨基氧基平台。
式8化合价平台分子例如可以经由实施例详细描述的方法、例如实施例5a和5b所述从终止于烷基卤基团的化合价平台分子进行制备。在所提供的实施例中，使用反应性卤代乙酰基。所制备的二价连接剂具有游离硫醇和被保护的氨基氧基。平台上的卤化物(或其他适合的离去基团)与连接剂上的游离硫醇反应，生成硫醚键。除去氨基氧基的保护基团，释放出氨基氧基平台。
如图34所示，在一种实施方式中，bPEG八聚平台M是通过这样一种过程合成的，四聚PNP碳酸酯(化合物50a)与化合物133反应，导致化合物K的生成。除去化合物K的Boc保护基团，所得八胺与化合物106反应，导致化合物L的生成。除去化合物M的Boc保护基团，导致化合物M的生成。
在另一种实施方式中，结合有两条PEG链的四价氨基氧基平台是如图35所示从结合有两条PEG链的中间体122合成的。化合物122与NHS酯O(Shearwater Polymer)反应，生成平台P。“PEG”或“聚乙二醇”或“聚氧化乙烯”在本文中可互换地用来称谓氧化乙烯的聚合物。
轭合物、其制备方法和用途
诸如聚氧乙烯聚合物和各种化合价平台分子等分子上的氨基氧基是反应性基团，一个或多个分子、例如生物活性分子可以以共价方式与之结合形成轭合物。
术语“生物活性分子”在本文中用于称谓具有生物活性的分子，优选为体内活性。在一种实施方式中，生物活性分子是特异性地与受体蛋白质相互作用者。生物活性分子例如可以是多肽或核酸。根据平台的化合价，平台分子轭合物可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或以上生物活性分子，或者例如16、18、32、36个或以上。
轭合物可以用在治疗需要这类治疗的个体的抗体介导疾病或其他疾病的方法中，包括将有效量的轭合物对该个体给药。轭合物还可以用在诱导个体特异性B细胞对免疫原无变应性的方法中，包括将有效量的轭合物对该个体给药。轭合物还可以用在治疗个体的抗体介导病变的方法中，其中响应于免疫原而产生了所不需要的抗体，该方法包括将有效量的轭合物对该个体给药。
在一种实施方式中，优选的是轭合物的总分子量不超过200,000道尔顿，例如为了使轭合物是有效的功能耐受原。
在一种实施方式中，生物活性分子是β2GPI的第1结构域多肽，例如U.S.Serial No.60/103,088；1999年6月8日提交的U.S.Serial No.09/328,199；和1999年12月16日公布的PCTUS99/13194，其公开内容引用在此作为参考文献。第1结构域轭合物可以用在样本β2GPI-依赖性抗磷脂抗体(或特异性与第1结构域β2GPI多肽结合的抗体)的检测方法中：使样本中的抗体与轭合物在允许生成稳定的抗原-抗体配合物的条件下接触；检测所生成的稳定配合物，若有的话。轭合物还可以用在诱发个体耐受性的方法中，该方法包括将有效量的轭合物对个体给药，确切为包含缺乏T细胞表位的第1结构域β2GPI多肽的轭合物，其中的有效量是足以诱发耐受性的量。
在另一种实施方式中，提供了化合价平台分子与至少一种与抗αGal抗体特异性结合的αGal表位或其类似物的轭合物。在另一方面，提供了减少个体抗αGal抗体循环水平的方法，包括将有效量的轭合物对该个体给药，其中的有效量是足以减少抗αGal抗体循环水平或中和抗αGal抗体循环水平的量。在另一方面，提供了诱发免疫耐受性(一般是对异种移植抗原、更具体为αGal的耐受性)的方法，该方法包括将有效量的包含αGal表位或其类似物的轭合物给药。轭合物还可以用于检测生物样本中抗αGal抗体的存在和/或含量。还提供了进行个体异种移植术的方法，包括将轭合物对该个体给药；再向个体引入异种组织。在另一方面，提供了抑制移植组织排斥的方法，包括将足以抑制排斥的量的轭合物对该个体给药。这些方法一般描述在PCT US99/29338中。
轭合物还可以用于狼疮的免疫耐受性治疗，可选地根据对个体抗体(即与狼疮有关的抗体，也就是抗双链DNA抗体)的最初亲和性的评价结果，用作选择治疗个体的基础，或者根据评价抗体亲和性，用在鉴别适合于治疗的个体的方法中。治疗个体系统性红斑狼疮(SLE)的方法包括将轭合物对该个体给药，该轭合物包含(a)非免疫原性化合价平台分子和(b)两个或以上与个体抗体特异性结合的多核苷酸，该抗体与双链DNA特异性结合。这些方法一般描述在PCT US99/29336中。
因而，化合价平台可以以共价方式连接一个或多个生物活性分子形成轭合物，该生物活性分子包括寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体、糖、多糖、表位、mimotope、酶、激素与药物、脂质、脂肪酸或它们的混合物。
术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换地用来称谓任意长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是线性的或分支的，它可以包含经过修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸所中断。它还可以是天然修饰的或者被干涉修饰；例如二硫键形成、葡基化、肉豆蔻基化、乙酰化、烷基化、磷酸化或脱磷酸化。该定义还包括含有一种或多种氨基酸类似物(例如包括非天然氨基酸)以及本领域已知其他修饰的多肽。
化合价平台与其他包含氨基氧基的分子的轭合物的一个优点是能够增强所结合的生物活性分子对其结合配偶体的亲和性，例如当结合配偶体缔合成簇时。大量生物活性分子与化合价平台分子的共价结合提高了生物分子的局部浓度，因为它们例如在平台分子上缔合在一起。化合价平台的另一个优点是能够促进多配体的结合，这对B细胞耐受性是有用的。例如，轭合物可以用作呈递多价表位的耐受原，诱发B细胞表面上成簇。化合价平台的另一个优点是能够在“核心”上包括官能度，核心经过独立地修饰，可以使适应特定目的的轭合物的制备成为可能。
一般来说，包含氨基氧基的分子与第二种包含羰基、例如醛或酮的分子反应，生成肟轭合物。第二种分子经过修饰可以含有该反应性醛或酮。肟键可以被进一步修饰。例如，按照已知方法，它可以经由还原或与亲核试剂的反应转化为氨基氧基键，生成氨基氧基轭合物。
在一种实施方式中，提供了制备天然多肽或蛋白质与包含氨基氧基的多价(优选为非免疫原性)化合价平台分子的、化学限定的多价轭合物的方法，其中如果需要的话，该多肽经过选择性修饰，在该多肽的特定位置产生醛或酮部分。多肽然后与含有氨基氧基的多价化合价平台分子反应，在平台与多肽之间形成一条或多条肟键。
事实上为任意多肽或其他分子的胺、例如N-末端的胺通过本领域已知为氨基转移反应的反应可以转化为醛或酮。实质上，氨基转移反应将碳-氮单键转化为碳-氧双键。例如，N-末端甘氨酸可以反应生成乙醛基、醛，如图1所示。大多数其他氨基酸依靠氨基酸侧链反应生成酮。
另一种在N-末端产生乙醛基的方法是用高碘酸钠氧化N-末端丝氨酸或苏氨酸。这种氧化作用裂解N-末端丝氨酸或苏氨酸羟基与氨基之间的碳-碳键，得到乙醛基。因而在一种实施方式中，通过在N-末端生成醛或酮，可以对多肽进行位置特异性修饰。合成多肽和其他药物或生物活性分子经过类似修饰，可以包括可用于生成肟键的醛或酮。
含有氨基氧基反应性基团的多价平台允许经过选择性修饰的多肽与该平台结合。化合价平台分子例如可以包含氨基氧基乙酰基或氨基氧基烷基。
本文所用的“氨基氧基乙酰基”指的是具有α羰基的氨基氧基，例如-COCH2-ONH2，而“氨基氧基烷基”指的是第一个碳上的氨基氧基，其中该第一个碳优选地不直接与吸电子基团结合，例如作为羰基一部分的第二个碳。一种优选的氨基氧基烷基是-CH2-CH2-ONH2。氨基氧基烷基的其他实施方式包括-CH(OH)CH2ONH和CH2CH(CH3)ONH2。
通过用N-保护的氨基氧基乙酰基酰化，然后除去保护基团，可以使氨基氧基乙酰基(AOA)与含有胺基的多价平台结合。乙醛基多肽与氨基氧基乙酰基的反应进行缓慢，在多肽与氨基氧基官能化平台之间生成肟键。长反应时间对该反应来说是必要的，这可能发生副反应。由除甘氨酸以外的N-末端氨基酸的氨基转移作用所生成的N-末端α-酮基-酰胺甚至反应更加缓慢，或者根本不反应生成多价轭合物。
氨基氧基烷基(AO烷基)是优选的，它们比氨基氧基乙酰基更容易与酮和醛反应生成肟。烷基链(例如三甘醇链)上的氨基氧基例如在生成肟的反应性上十倍于相似的氨基氧基乙酰基。氨基氧基乙酰基的反应性一般小于其他不与羰基相邻的氨基氧基(氨基氧基烷基)。据信由于吸电子效应，氨基氧基乙酰基的羰基降低了反应性。
在一种实施方式中，提供了能够与平台上的乙醛基多肽反应的末端氨基氧基烷基，它们预期增强了生成肟的反应性。在一种实施方式中，提供了三甘醇或己基链上的氨基氧基；不过任意其他链也是可能的，包括包含碳、氧、氮或硫原子的那些。在一种优选的实施方式中，平台分子中的氨基氧基是氨基氧基烷基，例如-CH2CH2ONH2。
实施例中提供了生物分子与醛或酮官能度经由肟键生成作用结合成为氨基氧基平台的实例。实施例10和11描述氨基转移的多肽或者经过醛或酮基修饰的多肽如何与氨基氧基平台反应。在这些情况下，在酸性水溶液中将平台用乙醛基多肽处理，使氨基转移的第1结构域与四价平台结合。优选的酸性条件是100mM pH4.6乙酸钠。在制备四价第1结构域轭合物的情况下，使用超过四当量、例如六当量的氨基转移的第1结构域。氨基氧基烷基的反应性大于氨基氧基乙酰基，使反应更容易发生，生成副产物的机会更小。实施例10描述与氨基氧基乙酰基平台生成轭合物。实施例11描述与氨基氧基烷基平台生成轭合物。
制备四价第1结构域轭合物的两种替代方法如实施例13和14所示。这两种实施例都涉及使连接剂经由肟键与氨基转移的第1结构域结合，然后利用该连接剂使平台与适合的反应性基团结合。连接剂先与氨基转移的第1结构域结合的优点是可以加入过量的连接剂，以驱使肟生成反应完全。
实施例13描述双-氨基氧基连接剂如何先与第1结构域结合，结合有氨基氧基连接剂的多肽再与酮衍生的平台反应，得到所需的四价轭合物。
实施例14证明杂二官能连接剂如何能够用来使硫醇连接剂经由肟键与第1结构域结合。结合有硫醇连接剂的第1结构域再与反应性烷基卤平台反应，得到四价轭合物。
显然，实施例13和14所生成的轭合物与若连接剂先与平台结合、再与氨基转移的第1结构域共轭化合所生成的轭合物是相同的。
本文所引用的所有出版物、专利、专利申请和公布的专利申请都全文引用在此作为参考文献。
下列非限制性实施例将有助于进一步理解发明。
实施例
下列实施例中，使用下列缩写：DCC：1，3-二环已基碳二亚胺；DIC：1，3-二异丙基碳二亚胺；DBU：1，8-二氮杂二环并[5.4.0]十一碳-7-烯；NHS：N-羟基琥珀酰亚胺；HOBt：1-羟基苯并三唑；DMF：二甲基甲酰胺。
实施例1-第1结构域的氨基转移反应
氨基转移的第1结构域(TA/D1)的合成：将水和乙酸钠缓冲液用氦喷射备用。使用β2GPI的第1结构域多肽，参见1998年10月5日提交的U.S.Serial No.60/103,088，filed October 5，1998；1999年6月8日提交的U.S.Serial No.09/328,199；和PCT US99/13194，其公开内容引用在此作为参考文献。第1结构域多肽如图1所示，具有N-末端甘氨酸。在聚丙烯试管内，将第1结构域(10.55mg，1.49μmol)溶于0.5mL H2O，加入4.0mL 2M pH5.5NaOAc缓冲液。向混合物中加入3.73mg(14.9μmol)CuSO4的0.5mL H2O溶液，再加入2.75mg(29.9μmol)乙醛酸在0.5mL 2M pH5.5NaOAc缓冲液中的溶液。将混合物保持在氮气氛下，轻微搅拌18h，此时经分析型HPLC显示反应完全，条件是4.6mm×250mm，300A，5μm，二苯基柱(Vydac，Hesperia，CA)，在280nm下检测(1mL/min；梯度25％-45％B，0-20min，A＝0.1％TFA/H2O，B＝0.1％ TFA/CH3CN)。大致的保留时间如下：D1，13.2min；TA/D1，13.7min；氧化的TA/D1，13.4min。将混合物用0.1％TFA/H2O稀释至体积为20mL，过滤，经HPLC纯化(22.4mm×250mm，300A，10μm，二苯基柱(Vydac)(12mL/min；梯度25％-40％B，0-40min，A＝0.1％TFA/H2O，B＝0.1％ TFA/CH3CN)。收集经分析型HPLC证实含有纯TA/D1的部分，冷冻干燥，得到5.0mg(48％)TA/D1。反应流程如图1所示。
实施例2-氨基氧基乙酰基/PITG平台的合成
合成流程如图2所示。
4-硝基苯基-N-(叔丁氧羰基)氨基氧基乙酸酯，2：在0℃下，向搅拌着的1.5g(7.85mmol)N-(叔丁氧羰基)氨基氧基乙酸(AldrichChemical Co.，St.Louis，MO)、即化合物1的35mL无水THF溶液中加入1.09g(7.85mmol)4-硝基苯酚，再加入1.62g(7.85mmol)DCC。将混合物在0℃氮气氛下搅拌0.5h，在室温下搅拌18h。将混合物过滤，以除去二环己脲，将滤液浓缩，经硅胶色谱纯化(95/5 CHCl3/异丙醇)，得到2.30g(94％)化合物2，为白色固体：
1H NMR(CDCl3)δ1.51(s，9H)，4.73(s，2H)，7.36(d，2H)，7.73(s，1H)，8.32(d，2H).
Boc-保护的氨基氧基乙酰基/PITG平台4的合成：将化合物3(300mg，0.235mmol；如PCT/US97/10075所述制备)用1.5mL 30％HBr的乙酸溶液处理30min。加入二乙醚使所得四胺的HBr盐沉淀出来。将混合物离心，取出上清液，弃去。将剩余固体用乙醚洗涤，在真空下干燥，溶于9mL DMF。向所得混合物中加入294μL(1.69mmol)二异丙基乙胺，再加入410mg(1.31mmol)化合物2的3mL DMF溶液。将混合物在氮气氛下搅拌4h，在15/1 CHCl3/MeOH与盐水之间分配。将含水层用15/1 CHCl3/MeOH洗涤两次，将合并后的有机层干燥(Na2SO4)，浓缩，得到680mg油。经过硅胶色谱纯化(分级梯度95/5至75/25CHCl3/MeOH)，得到215mg(65％)化合物4，为白色固体：
1H NMR(CDCl3)δ1.49(s，36H)，3.40-3.73(m，40H)，4.24(m，12H)，4.59(重叠的单峰，8H)，8.21(s，2H)，8.32(s，2H).
氨基氧基乙酰基/PITG平台，化合物5：向搅拌着的67mg(.047mmol)化合物4的10/1/1 EtOAc/CHCl3/MeOH溶液中通入HCl气达15min，另将混合物搅拌15min。将混合物在真空下浓缩，在真空下保持16h，得到43mg(78％)化合物5，为白色固体：
1H NMR(DMSO)δ3.33-3.67(m，40H)，4.08(m，4H)，4.18(s，8H)，4.90(s，8H)；质谱(ES)m/z  计算：C40H69N14O18 (M+H)：1033.实测：1033.
实施例3-AOTEG/DEA/DEG平台的合成
合成流程如图3所示。
2-[2-(2-碘乙氧基)乙氧基]乙醇，化合物7：将2-[2-(2-氯乙氧基)乙氧基]乙醇(Aldrich Chemical Co.)(12.66g，75.1mmol)和碘化钠(33.77g，225.3mmol)溶于250mL丙酮。在烧瓶上连接回流冷凝器，将混合物加热回流18h。冷却后，将混合物浓缩，将残余物用400mLCH2Cl2和300mL水与100mL饱和亚硫酸氢钠水溶液的混合物摇动。含水层用400mL CH2Cl2洗涤两次，将合并后的CH2Cl2层干燥(MgSO4)，过滤，浓缩，得到18.3g(94％)7，为浅黄色油，无需进一步纯化即可用在下一步：1H NMR(CDCl3)δ2.43(brd s，1H)，3.28(t，2H)，3.61(m，2H)，3.68(s，4H)，3.78(m，4H)；质谱(ES)m/z计算：C6H13O3INa (M+Na)：283.0.实测：283.0.
2-[2-(2-N-(叔丁氧羰基)氨基氧基乙氧基)乙氧基]乙醇，化合物8：向5.85g(1.50mmol)2-[2-(2-碘乙氧基)乙氧基]乙醇、即化合物7中加入2.00g(1.00mmol)N-(叔丁氧羰基)羟胺(AldrichChemical Co.)和3.36mL(3.42g，1.50mmol)DBU。将混合物搅拌，得到粘性液体，触摸可知变热，在55℃油浴中放置18h，导致白色沉淀的生成，使混合物固化。将混合物溶于20mL CH2Cl2，加入到500mL搅拌着的EtOAc中，导致沉淀的生成，过滤除去之，将滤液浓缩，得到棕黄色油。经过快速色谱纯化(50％丙酮/己烷)，得到2.61g(67％)8，为一种油：
1H NMR(CDCl3)δ1.50(s，9H)，3.65(t，2H)，3.70(brd s，4H)，3.76(m，4H)，4.06(t，2H)，7.83(brd s，1H)；13C NMR(CDCl3)δ28.0，61.3，68.9，70.1，70.3，72.5，72.6，75.1，81.2，157.1.
2-[2-(2-N-(叔丁氧羰基)氨基氧基乙氧基)乙氧基]乙基溴，化合物9：将溴(约0.283mmol)滴加到50mg(0.188mmol)化合物8、74mg(0.283mmol)三苯膦与31μL(30mg，0.377mmol)吡啶的2mL CH2Cl2溶液中，直至持续为橙色。将混合物在室温下搅拌0.5h，加入1mL饱和亚硫酸氢钠溶液，以猝灭过量的溴。然后使混合物在10mL H2O与2x15mL EtOAc之间分配。将合并后的有机层用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤，浓缩。残余物经过硅胶色谱纯化(35/65丙酮/己烷)，得到54mg化合物9，为一种油：1H NMR(CDCl3)δ1.49(s，9H)，3.48(t，2H)，3.68(s，4H)，3.73(m，2H)，3.84(t，2H)，4.03(t，2H)，7.50(s，1H)；13C NMR(CDCl3)δ28.3，30.4，69.4，70.6(两种信号)，713，75.5，81.7，156.9.
2-[2-(2-N-(叔丁氧羰基)氨基氧基乙氧基)乙氧基]乙基叠氮化物，化合物10：
从化合物9合成：将100mg(0.305mmol)化合物9的0.25mL无水DMF溶液加入到159mg(2.44mmol)叠氮化钠的0.5mL无水DMF溶液中。另用0.25mL DMF将残留的9冲洗到反应混合物中，将混合物在115℃下加热3h。冷却后，使混合物在3mL H2O与4×3mL CH2Cl2之间分配。将合并后的有机层用10mL H2O洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤，浓缩，得到黄色的油。经过硅胶色谱纯化(35/65丙酮/己烷)，得到67mg(76％)10，为一种油：1H NMR(CDCl3)δ1.47(s，9H)，3.41(t，2H)，3.69(brd s，4H)，3.73(m，4H)，4.03(t，2H)，7.50(s，1H)；13C NMR(CDCl3)δ28.1，50.5，69.1，70.1，70.4(两种信号)，75.2，81.3，156.7.
从化合物13合成10：在氮气氛下，向258mg(0.69mmol)化合物13的5mL DMF溶液中加入358mg(5.50mmol)叠氮化钠。将混合物在室温下搅拌18小时，加入100mL水，将混合物用3×50mL EtOAc萃取。合并EtOAc层，用50mL水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤，浓缩，得到294mg无色的油。经过硅胶色谱纯化(30/70丙酮/己烷)，得到化合物10，为无色的油。
化合物11：将化合物10(1.36g，4.70mmol)和三苯膦(1.48g，5.64mmol)溶于24mL THF与8mL H2O，将所得溶液在室温下搅拌2小时。加入约160μL(八滴)1N NaOH，将混合物搅拌18小时。将混合物在真空下浓缩，浓缩液经过硅胶色谱纯化(80/8/2 CH3CN/H2O/浓NH4OH)，得到1.16g(94％)11，为黄色的油：1H NMR(CDCl3)δ1.50(s，9H)，1.90(brd，2H)，2.88(t，2H)，3.56(t，2H)，3.65(m，4H)，3.71(m，2H)，4.01(m，2H).
1，2-双(2-碘乙氧基)乙烷，化合物12：将10.0g(5.3mmol)1，2-双(2-氯乙氧基)乙烷(Aldrich Chemical Co.)与16.0g(107mmol)碘化钠的110mL丙酮溶液加热回流18h。将混合物浓缩，将残余物用CHCl3研制，以溶解产物，所剩余的盐是不溶的。将混合物过滤，将滤液浓缩，得到橙色的油。经过硅胶色谱纯化(分级梯度，10/90 EtOAc/己烷至15/85 EtOAc/己烷)，得到17.8g(90％)橙色的油：
1H NMR(CDCl3)δ3.28t，4H)，3.67(s，4H)，3.78(t，4H)；13C NMR(CDCl3)δ3.6，70.5，72.2.
化合物13：将DBU(284μL，290mg，1.90mol)加入到266mg(2.0mmol)N-(叔丁氧羰基)羟胺(Aldrich Chemical Co.)与2.96g(8.0mmol)化合物12的混合物中，将混合物密封，摇动直至均匀。15分钟后，混合物固化，放置45分钟。向混合物中加入5mL CH2Cl2，再次摇动混合物，以溶解固体。将所得溶液加入到200mL EtOAc中。另加入50mL EtOAc，将混合物过滤以除去固体。将滤液浓缩，得到一种油，使其在100mL EtOAc与3×50mL 1N HCl溶液之间分配。将EtOAc层用2×50ml 1N NaOH洗涤，再用2×50mL 5％亚硫酸氢钠溶液洗涤，浓缩，得到2.6g黄色的油。经过硅胶色谱纯化(分级梯度，20/80至45/55 EtOAc/己烷)，得到515mg(69％)化合物13，为黄色的油：
1H NMR(CDCl3)δ1.50(s，9H)，3.28(t，2H)，3.68(s，4H)，3.72(m，4H)，4.02(t，2H)，7.72(s，1H)；13C NMR(CDCl3)δ2.9，28.3，68.9，69.4，70.2，70.6，72.0，75.4，81.6，156.9.
二甘醇双-4-硝基苯基碳酸酯，化合物60：将吡啶(30.5mL，377mmol)缓慢加入到0℃的5.0g(47.11mmol)二甘醇与23.74g(118mmol)4-硝基苯基氯甲酸酯的500mL THF溶液中。除去冷却浴，将混合物在室温下搅拌18小时。将混合物冷却回至0℃，用6N HCl酸化，在400mL 1N HCl与2×400mL CH2Cl2之间分配。将合并后的有机层干燥(MgSO4)，过滤，浓缩，得到24.3g白色固体。从己烷/EtOAc中结晶，得到16.0g(78％)化合物60，为白色粉末：mp 110℃；1H NMR(CDCl3)δ3.89(t，4H)，4.50(t，4H)，7.40(d，4H)，8.26(d，4H).
化合物61：将2.5g(5.73mmol)化合物60的17mL吡啶溶液加入到0℃的1.8g(17.2mmol)二乙醇胺的3mL吡啶溶液中。除去冷却浴，将混合物在室温下搅拌5小时，得到化合物61，不经分离而原样用在下一步中。
化合物14：将来自前步的混合物冷却回至0℃，加入40mL CH2Cl2，再加入11.55g(57.3mmol)4-硝基苯基氯甲酸酯的60mL CH2Cl2溶液，将混合物在室温下搅拌20小时。将混合物冷却回至0℃，用1N HCl酸化，在300mL 1N HCl与2×200mL CH2Cl2之间分配。将合并后的有机层干燥(MgSO4)，过滤，浓缩，得到13.6g黄色固体。经过硅胶色谱纯化(CH2Cl2/MeOH和EtOAc/己烷)，得到4.91g(83％)化合物14，为粘性无定形固体：1H NMR(CDCl3)δ3.72(m，12H)，4.31(t，4H)，4.48(m，8H)，7.40(m，8H)，8.29(m，8H).
Figure A20051011611700461
BOC-保护的AOTEG/DEA/DEG平台，化合物15：将三乙胺(157μL，114mg，1.13mmol)加入到搅拌着的193mg(0.188mmol)化合物14(如上所述和1998年12月9日提交的U.S.Serial No.60/111,641所述制备)中，再加入298mg(1.13mmol)化合物11。使混合物达到室温，搅拌过夜。将混合物冷却至0℃，用1N HCl酸化，在20mL 1N HCl与4×20mL CH2Cl2之间分配。将合并后的有机层用饱和NaHCO3溶液洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩，得到279mg黄色的油。经过硅胶色谱纯化(97/3 CH2Cl2/MeOH)，得到138mg(48％)15，为一种油：
1H NMR(CDCl3)δ1.49(s，36H)，3.35(m，8H)，3.46-3.78(m，44H)，4.04(t，8H)，4.21(m，12H)，5.80(m，4H)，7.91(s，4H)；质谱(ES)m/z  计算：C62H117N10O33 (M+H)：1528.8.实测：1528.5.
化合物16：将化合物15(60mg，39.2μmol)溶于10mL 1/9三氟乙酸/CH2Cl2，将混合物在室温下保持3h。利用微弱的氮气流蒸发溶剂，将残余物溶于少量色谱溶剂(5/7.5/87.5浓NH4OH/H2O/CH3CN)，用来将混合物装上硅胶柱。经过硅胶色谱纯化(分级梯度，5/7.5/87.5至5/10/85浓NH4OH/H2O/CH3CN)，得到36mg(82％)16，为无色的油：
1H NMR(CDCl3)δ3.37(m，8H)，3.58(m，16H)，3.67(s，16H)，3.71(m，12H)，3.86(m，8H)，4.17-4.29(m，12H)，4.93(brd，8H)，5.91(m，4H)；13C NMR(CDCl3)□40.9，47.7，48.2，62.9，64.7，69.4，69.6，70.2，70.3，70.5，74.8，156.1，156.6；质谱(ES)m/z  计算：C42H85N10O25 (M+H)：1129.实测：1129.
为了用分析型HPLC检查纯度，如下制备四丙酮肟。在HPLC样本小瓶内，将化合物16(0.38mg，0.34μmol)溶于240μL 0.1M NaOAc缓冲液。向该溶液中加入49μL丙酮在2.0mL 0.1M NaOAc缓冲液中的10μL溶液。将混合物放置1h，用HPLC分析试样(4.6mm C柱，1mL/min，210nm检测，梯度，10-60％B 20min，A＝0.1 ％TFA/H2O，B＝0.1％ TFA/CH3CN，tR＝19min)；所收集洗脱部分的质谱(ES)m/z C54H101N10O25 (M+H)计算：1289.实测：1289.
实施例4-AOTEG/PIZ/DEA/DEG平台的合成
合成流程如图4所示。
化合物17：将吡啶(610μL，596mg，7.54mmol)缓慢加入到搅拌着的500mg(1.88mmol)化合物8与760mg(3.77mmol)对-硝基苯基氯甲酸酯的14mL CH2Cl2溶液中，将混合物在室温下搅拌18小时。将混合物冷却至0℃，用1N含水HCl酸化。使所得混合物在100mL 1N含水HCl与3×100mL CH2Cl2之间分配。将合并后的有机层干燥(MgSO4)，过滤，浓缩，得到1.05g粘型固体。经过硅胶色谱纯化(6/4己烷/EtOAc)，得到505mg(62％)化合物17，为浅黄色油：1H NMR(CDCl3)δ1.47(s，9H)，3.67-3.78(m，6H)，3.80(m.2H)，4.02(m，2H)，4.48(m，2H)，7.40(d，2H)，7.50(s，1H)，8.29(d，2H)；质谱(ES)m/z  计算：C18H26N2O10Na(M+Na)：453.1.实测：453.0.
Boc-保护的AOTEG/PIZ/DEA/DEG平台，化合物19：向化合物18
(如1998年12月9日提交的U.S.Serial No：60/111,641所述制备)的含水碳酸氢钠与二噁烷溶液中加入四当量化合物17的二噁烷溶液。反应一旦完全，使混合物在水与CH2Cl2之间分配。将CH2Cl2层浓缩，干燥，经过硅胶色谱纯化，得到化合物19。
AOTEG/PIZ/DEA/DEG平台，化合物20：按照本质上类似于化合物16制备所述方式，除去化合物19的Boc-保护基团，得到化合物20。
实施例5a-AOTEG/SA/AHAB/TEG平台的合成
合成流程如图5所示。
S-乙酰基-2-[2-(2-N-叔丁氧羰基氨基氧基乙氧基)乙氧基]乙基硫醇，化合物21a：向500mg(1.52mmol)化合物9a的30mL丙酮溶液中加入191mg(1.68mmol)硫代乙酸钾(Aldrich Chemical Co.)。将混合物在室温下搅拌18小时，过滤除去所得沉淀。将滤液浓缩，在300mLEtOAc与2×80mL盐水之间分配。将EtOAc层干燥(Na2SO4)，过滤，浓缩，得到460mg(93％)化合物21a，为浅棕色油：1HNMR(CDCl3)δ1.48(s，9H)，2.35(s，3H)，3.12(t，2H)，3.61(t，2H)，3.64(m，4H)，3.73(m，2H)，4.02(m，2H)，5.52(s，1H)；13C NMR(CDCl3)δ28.3，28.8，30.6，69.3，69.8，70.2，70.5，75.3，81.5，156.8，195.3.
2-[2-(2-N-叔丁氧羰基氨基氧基乙氧基)乙氧基]乙基硫醇，化合物22a：在室温氮气氛中，将化合物21a用氮喷射的4/16N NH4OH/CH3CN溶液处理1小时。将混合物在真空下浓缩，得到化合物22a，无需进一步纯化即可使用。
Boc-保护的AOTEG/SA/AHAB/TEG平台，24a：将化合物23(如Jones等《医药化学杂志》(J.Med.Chem.)1995，38，2138-2144所述制备)加入到四当量化合物22a的氮喷射10/90 H2O/CH3CN溶液中。向所得溶液中加入四当量二异丙基乙胺。反应一旦完全，使混合物在水与CH2Cl2之间分配。将CH2Cl2层浓缩，干燥，经过硅胶色谱纯化，得到化合物24a。
AOTEG/SA/AHAB/TEG平台，25a：按照本质上类似于化合物16制备所述方式，除去化合物24a的Boc-保护基团，得到化合物25a。
实施例5b-AOHEX/SA/AHAB/TEG平台的合成
合成流程如图6所示。
1-碘-6-(N-叔丁氧羰基)氨基氧基己烷，化合物9b：向140mg(1.05mmol)N-(叔丁氧羰基)羟胺(Aldrich Chemical Co.)与658μL(1.35mg，4.0mmol)化合物12的不均匀混合物中加入149μL(152mg，1.0mmol)DBU。将混合物在室温下搅拌30秒钟，此时反应混合物固化。将固体物质放置过夜，溶于50mL CH2Cl2。将溶液用2×25mL 1N NaOH和3×25mL 1N HCl洗涤。将合并后的碱性含水层用25mL CH2Cl2萃取，将合并后的酸性含水层用25mL CH2Cl2萃取。将合并后的CH2Cl2层干燥(Na2SO4)，过滤，浓缩，得到黄色的油。经过硅胶色谱纯化(分级梯度；1/99/0.1至15/85/0.1 EtOAc/己烷/MeOH)，得到216mg(68％)9b，为黄色的油：
1H NMR(CDCl3)δ1.40(m，4H)，1.48(s，9H)，1.62(m，2H)，1.83(m，2H)，3.20(t，2H)，3.84(t，2H)，7.10(s，1H).
S-乙酰基-6-(N-叔丁氧羰基)氨基氧基己-1-硫醇，化合物21b：将化合物9b(209mg，0.61mmol)加入到硫代乙酸钾的15mL丙酮溶液中，将混合物在室温下搅拌18小时。在真空下除去丙酮，使残余物在50mLCH2Cl2与3×25mL 1N NaOH之间分配。将CH2Cl2层干燥(Na2SO4)，过滤，浓缩，得到棕色的油。经过硅胶色谱纯化(15/85 EtOAc/己烷)，得到166mg(94％)化合物21b，为无色的油：1H NMR(CDCl3)δ1.39(m，4H)，1.48(s，9H)，1.59(m，4H)，2.32(s，3H).2.86(t，2H)，3.82(t，2H)，7.10(s，1H).
6-(N-叔丁氧羰基)氨基氧基己-1-硫醇，化合物22b：如下制备22b的纯净样本。将化合物21b(50mg，172μmol)和22μL(17.4mg，85.8μmol)三正丁膦放置在氮下，向混合物中加入2mL氮喷射的1MNaOH的MeOH溶液。将混合物在室温下搅拌18小时，加入172μL(180mg，3mmol)三氟乙酸。使混合物在25mL EtOAc与3×25mL 1N HCl之间分配。将合并后的含水层用25mL EtOAc萃取，干燥(Na2SO4)，过滤，浓缩，得到一种油。经过硅胶色谱纯化(15/85/0.1 EtOAc/己烷/MeOH)，得到28mg 22b，为无色的油：
1H NMR(CDCl3)δ1.32(t，1H)，1.40(m，4H)，1.49(s，9H)，1.62(m，4H)，2.53(d of t，2H).3.84(t，2H)，7.09(s，1H).
Boc-保护的AOHEX/SA/AHAB/TEG平台，24b：将化合物21b(13mg，45μmol)和6μL(4.5mg，22.3μmol)三正丁膦放置在氮下，向混合物中加入3mL氮喷射的4/16N NH4OH/CH3CN溶液。将混合物在室温下搅拌1小时，在真空下浓缩。将残余物溶于3mL氮喷射的10/90水/CH3CN溶液。向保持在氮气氛下的所得溶液中加入10mg(7.44μmol)化合物23，再加入8μL(5.77mg，44.6μmol)二异丙基乙胺。将混合物搅拌18小时，在真空下浓缩。残余物经过硅胶色谱纯化(多级梯度，1/99至5/95至7.5/92.5至10/90至15/85MeOH/CH2Cl2)，得到14mg(93％)24b，为无色的油：TLC(10/90 MeOH/CH2Cl2)，Rf＝0.3；质谱(ES)m/zm/z  计算：C92H174N14O26S4(M+2H)/2：1010.实测：1010.
AOHEX/SA/AHAB/TEG平台，25b：按照本质上类似于化合物16制备所述方式，除去化合物24b的Boc-保护基团。
实施例6-AOHOC/DT/TEG平台的合成
合成流程如图7所示。
6-(叔丁氧羰基氨基氧基)己-1-醇，化合物27：向179μL(183mg，1.2mmol)DBU的1mL CH2Cl2溶液中加入133mg(1.0mmol)N-(叔丁氧羰基)羟胺(Aldrich Chemical Co.)和157μL(217mg，1.2mmol)6-溴己-1-醇(Aldrich Chemical Co.)，将混合物在室温下搅拌18小时。将混合物浓缩，得到黄色的油。经过硅胶色谱纯化(35/5/65EtOAc/MeOH/己烷)，得到180mg(77％)化合物27，为无色的油：
1H NMR(CDCl3)δ1.39(m，4H)，1.48(s，9H)，1.59(m，4H)，3.63(t，2H)，3.85(t，2H)，7.42(s，1H)；13C NMR(CDCl3)δ25.6，25.8，28.1，28.4，62.8，76.8，81.7，157.2.
化合物28：在0℃下，向100mg(0.428mmol)化合物27的2mLCH2Cl2溶液中加入90μL(88.1mg，1.11mmol)吡啶，再加入113mg(0.557mg)对-硝基苯基氯甲酸酯(Aldrich Chemical Co.)。将混合物在室温下搅拌4小时。冷却至0℃，用1N HCl酸化，在20mL 1N HCl与3×20mL CH2Cl2之间分配。将合并后的CH2Cl2层用NaHCO3饱和溶液洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。经过硅胶色谱纯化，得到化合物28。
化合物29：向二亚乙基三胺的EtOAc溶液中加入两当量二异丙基乙胺，再加入两当量化合物28。将混合物搅拌，直至反应完全。除去溶剂，产物、即化合物29经过硅胶色谱纯化。
Boc-保护的AOHOC/DT/TEG平台，30：向三甘醇双-氯甲酸酯(Aldrich Chemical Co.)的吡啶溶液中加入两当量化合物29。将混合物搅拌，直至反应完全，在1N HCl与CH2Cl2之间分配。将CH2Cl2层干燥，浓缩，产物经过硅胶色谱纯化，得到化合物30。
AOHOC/DT/TEG平台，化合物31：按照本质上类似于化合物16制备所述方式，除去化合物30的Boc-保护基团。
实施例7-AOTEG/IDA/TEG平台的合成
合成流程如图8所示。
化合物32：向三甘醇双-氯甲酸酯(Aldrich Chemical Co.)的吡啶溶液中加入两当量亚氨基二乙酸(Aldrich Chemical Co.)。将混合物搅拌，直至反应完全，在1N HCl与CH2Cl2之间分配。将CH2Cl2层干燥，浓缩，产物经过硅胶色谱纯化，得到化合物32。
化合物33：将化合物32的THF溶液用6当量NHS和6当量DCC处理1小时。向混合物中加入4当量化合物11，将混合物搅拌，直至反应完全。加以乙酸以猝灭过量的DCC，过滤除去所得固体。将滤液浓缩，经过硅胶色谱纯化，得到化合物33。
化合物34：按照本质上类似于化合物16制备所述方式，除去化合物33的Boc-保护基团。
实施例8-AOTEGO/LEV/PITG平台的合成
合成流程如图9所示。
对-硝基苯基乙酰丙酸酯，化合物35：向800mg(6.89mmol)乙酰丙酸(Aldrich Chemical Co.)的4.25mL吡啶溶液中加入1.78g(7.58mmol)4-硝基苯基三氟乙酸酯(Aldrich Chemical Co.)。将所得溶液搅拌15分钟，在28mL水与2×28mL CH2Cl2之间分配。将合并后的CH2Cl2层干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。浓缩液经过硅胶色谱纯化(分级梯度，25/75至30/70 EtOAc/己烷)，得到1.06g(74％)化合物35：1H NMR(CDCl3)δ2.28(s，3H)，2.87(m，4H)，7.29(d，2H)，8.28(d，2H).
1，2-Bis(2-(叔丁氧羰基)氨基氧基乙氧基)乙烷，化合物36：向243mg(0.66mmol)化合物12中加入219mg(1.64mmol)N-(叔丁氧羰基)羟胺(Aldrich Chemical Co.)，再加入246μL(250mg，1.64mmol)DBU。将混合物在室温下搅拌，直至固化(约1小时)。另放置一小时后，将混合物溶于2mL CH2Cl2，将所得溶液加入到100mL EtOAc中，以沉淀出DBU的碘化氢盐。另加入50mL EtOAc，将混合物过滤。将滤液用2×50mL 1N HCl、2×50mL 5％亚硫酸氢钠溶液和25mL盐水洗涤。将EtOAc层干燥(Na2SO4)，过滤，浓缩，得到一种油。经过硅胶色谱纯化(分级梯度，40/60至50/50至80/20 EtOAc/己烷)，得到164mg(65％)化合物36，为无色的油：
1H NMR(CDCl3)δ1.48(s，18H)，3.65(s，4H)，3.72(t，4H)，4.02(t，4H)，7.80(s，2H)；13C NMR(CDCl3)δ28.2，69.0，70.3，75.2，81.3，156.8.
1，2-Bis(2一氨基氧基乙氧基)乙烷，化合物37：将化合物36(559mg，1.47mmol)溶于15mL EtOAc，向溶液中通入HCl气达30分钟。将混合物在真空下浓缩，得到72mg(90％)化合物37的HCl盐，为粘性残余物：1H NMR(D2O)δ3.75(s，4H)，3.87(m，4H)，4.27(m，4H)；
质谱(ES)m/z  计算：C6H17N2O4(M+H)：181.1.实测：181.1.
化合物38：将化合物3用30％HBr的乙酸溶液处理，以除去CBZ保护基团，得到四胺的溴化氢盐。将四胺溶于碳酸氢钠的水与二噁烷溶液，向所得溶液中加入四当量化合物35。反应一旦完成，使混合物在水与CH2Cl2之间分配。将CH2Cl2层浓缩，干燥，经过硅胶色谱纯化，得到化合物38。
AOTEGO/LEV/PITG平台，化合物39：向化合物38在0.1M pH4.6乙酸钠缓冲液中的溶液中加入二十当量化合物37。反应一旦完全，使混合物在水与CH2Cl2之间分配。将CH2Cl2层浓缩，干燥，经过硅胶色谱纯化，得到化合物39。
实施例9-AO/DEGA/DEG平台的合成
合成流程如图10所示。
化合物41：将溴(约六当量)滴加到化合物40、六当量三苯膦与8当量吡啶的CH2Cl2溶液中，直至持续为橙色。将混合物在室温下搅拌0.5h或者直至反应完全，加入亚硫酸氢钠饱和溶液以破坏过量的溴。然后使混合物在H2O与EtOAc之间分配。将合并后的有机层用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤，浓缩，经过硅胶色谱纯化，得到化合物41。
化合物42：向化合物41中加入六当量N-(叔丁氧羰基)羟胺(Aldrich Chemical Co.)和六当量DBU。必要时将混合物加热足够的时间，使反应完全。冷却后，将混合物溶于CH2Cl2，将所得溶液加入到EtOAc中，导致沉淀的生成，过滤除去之，将滤液浓缩。经过快速色谱纯化，得到42。
化合物43：按照本质上类似于化合物16制备所述方式，除去化合物42的Boc-保护基团。
实施例10-四价D1轭合物的合成
合成流程如图11所示。
四价D1轭合物、即化合物44的合成：在聚丙烯试管内，将如实施例1所述制备的TA/D1(0.90mg，1.28×10-7mol)溶于250μL 0.1M乙酸钠pH 4.60缓冲液。向该混合物中加入16.6μL(18.9μg，1.60×10-8mol)0.97μmol/mL AOA/PITG平台、即化合物5在0.1M乙酸钠pH 4.60缓冲液中的溶液。将混合物在氮下轻微搅拌6天，此时经分析型HPLC显示反应完全，条件是4.6mm×250mm，300A，5μm，二苯基柱(Vydac)，在280nm下检测(1mL/min；梯度25％-45％B，0-20min，A＝0.1％TFA/H2O，B＝0.1％TFA/CH3CN)。大致的保留时间如下：TA/D1，13.7min；化合物44，17.2min。将混合物用95/5水/乙腈稀释至体积为1mL，经HPLC纯化(10mm×250mm，300A，5μm，二苯基柱(Vydac)(3mL/min；梯度25％-45％B，0-40min，A＝0.1％TFA/H2O，B＝0.1％TFA/CH3CN)。收集经分析型HPLC证实含有纯44的部分，冷冻干燥，得到0.4mg(25％)44：质谱(ES，平均m/z)C1320H2032N338O370S20计算：29,198.实测：29,218.
实施例11-四价D1轭合物的合成
合成流程如图12所示。
四价D1轭合物、即化合物45的合成：在聚丙烯试管内，将如实施例1所述制备的TA/D1(5.20mg，7.37×10-7mol)溶于2.0mL He喷射的0.1M乙酸钠pH4.60缓冲液。向该混合物中加入15.07μL(139μg，1.23×10-7mol)8.147μmol/mL AOTEG/DEA/DEG平台、即化合物16在0.1M乙酸钠pH4.60缓冲液中的溶液。将混合物在氮下轻微搅拌23天，此时经分析型HPLC显示反应完全，条件是4.6mm×250mm，300A，5μm，二苯基柱(Vydac)，在280nm下检测(1mL/min；梯度25％-45％B，0-20min，A＝0.1％ TFA/H2O，B＝0.1％ TFA/CH3CN)。大致的保留时间如下：TA/D1，13.7min；44，17.2min。将混合物用水稀释至体积为5mL，经HPLC纯化(10mm×250mm，300A，5μm，二苯基柱(Vydac)(3mL/min；梯度25％-45％B，0-40min，A＝0.1％TFA/H2O，B＝0.1％TEA/CH3CN)。收集经分析型HPLC证实含有纯45的部分，冷冻干燥，45：质谱(ES，平均m/z)计算：C1322H2048N334O377S20：29,294.实测：29,294.
实施例12-模型氨基氧基化合物的制备和与乙醛基肽的反应性比较
合成流程如图14所示。
乙醛基肽、即化合物47的合成：利用N-Fmoc保护的氨基酸，在Wang树脂上按照标准的固相合成法制备化合物46(SEQ.ID No.1)。用3当量N-Fmoc保护的氨基酸、3当量DIC和3当量HOBt的DMF溶液进行偶联。用20％吡啶的DMF溶液进行去保护。肽从树脂上裂解，经过反相HPLC纯化(C梯度，10-30％B，0-40min，A＝0.1％ TFA/H2O，B＝0.1％ TFA/CH3CN)。将经分析型HPLC(4.6×250mm C18，1mL/min，梯度，10-60％B，0-20min，A＝0.1％ TFA/H2O，B＝0.1％ TFA/CH3CN，Tr＝10.3min)证实为纯的部分冷冻干燥，得到化合物46，为绒毛状白色固体：质谱(ES)(M+H)C4) H67Ni20n计算：903.5.实测：903.5.
向163mg(0.18mmol)化合物46在3.67mL CH3CN与19mL 10mM磷酸钠pH7.0缓冲液中的溶液中加入77.2mg(0.361mmol)高碘酸钠的5.4mL水溶液。将混合物在室温下搅拌30分钟，加入100μL乙酸。将混合物过滤，滤液经过HPLC纯化(C18，梯度，15-30％B，0-40min，A＝0.1％ TFA/H2O，B＝0.1％ TFA/CH3CN)。将经分析型HPLC(4.6×250mm C18，1mL/min，梯度，10-35％B，0-20min，A＝0.1％ TFA/H2O，B＝0.1％ TFA/CH3CN，Tr＝10.3min)证实为纯的部分冷冻干燥，得到124mg(79％)化合物47(SEQ ID No.2)，为白色固体：质谱(ES)(M+H)C40H62N11O11：872.5.实测：872.5.
化合物49的合成：向250mg(0.801mmol)化合物2的5mL CH2Cl2溶液中加入158μL(166mg，1.58mmol)氨基二甘醇(Aldrich ChemicalCo.)。向所得溶液中加入298μL(221mg，1.71mmol)二异丙基乙胺，将混合物在室温氮气氛下搅拌1.5小时。使混合物在100mL CH2Cl2与20mL饱和Na2CO3溶液之间分配，将CH2Cl2层连续用两份20mL饱和Na2CO3溶液、两份20mL 1N HCl和20mL盐水洗涤。将含水HCl层用五份50mL CH2Cl2萃取；将含水Na2CO3层用两份50mL CH2Cl2萃取。将合并后的有机层干燥(MgSO4)，过滤，浓缩，得到黄色的油。经过硅胶色谱纯化(70/30 EtOAc/己烷)，得到164mg(73％)化合物49的Boc-保护的前体，为粘性无色的油：1H NMR(CDCl3)δ1.48(s，9H)，3.52(m，2H)，3.62(m，4H)，3.77(m，2H)，4.35(s，2H)，7.64(s，1H)，8.33(brds，1H).
如下除去Boc保护基团。将Boc保护的前体(164mg，0.59mmol)溶于5mL 50/50三氟乙酸/CH2Cl2，将混合物在室温下搅拌两小时。在微弱氮气流下蒸发混合物，将残余物再次溶于CH2Cl2。将溶液在真空下浓缩，得到179mg(理论收率104％，其余假定为TFA)化合物49的三氟乙酸盐，为无色的油：质谱(ES)(M+H) C6H15N2O4计算：179.2.实测：179.1.
化合物50的合成：向5.0mg(5.62μmol)化合物47在7.6mL 0.1MpH 4.6乙酸钠缓冲液中的溶液中加入3.29mg化合物49(估计纯度96％，1.70mg，5.82μmol)在10mL 0.1M pH4.6乙酸钠缓冲液中的582μL溶液，将混合物搅拌六天。混合物直接经过HPLC纯化(C18；梯度，25％-45％ B，0-40min，A＝含水pH7.0磷酸三乙铵(制备方法是将500mL 0.1％ H3PO4与约500mL 0.3％ Et3N混合，得到pH为7.0)，B＝CH3CN)。将含有产物的部分冷冻干燥，得到0.3mg化合物50：质谱(ES)(M+H) C46H74N13O14计算：1032.5.实测：1032.6.
化合物51的合成：将化合物8(100mg，0.38mmol)溶于25mL 1/9三氟乙酸/CH2Cl2，将混合物在室温下放置2小时。在微弱氮气流下蒸发混合物，将残余物再次溶于CH2Cl2。将溶液在真空下浓缩，得到152mg(理论收率145％，其余假定为TFA)化合物51的三氟乙酸盐，为无色的油：质谱(ES)(M+H) C6H16NO4计算：165.1.实测：165.1.
化合物52的合成：向5.0mg(5.62μmol)化合物47在7.6mL 0.1MpH 4.6乙酸钠缓冲液中的溶液中加入845μL 3.29mg化合物51(估计纯度69％，1.63mg，5.82μmol)在在10mL 0.1M pH4.6乙酸钠缓冲液中的溶液，将混合物搅拌21小时。混合物直接经过HPLC纯化(C18；梯度，25％-45％B，0-40min，A＝含水pH7.0磷酸三乙铵(制备方法是将500mL 0.1％H3PO4与约500mL 0.3％ Et3N混合，得到pH为7.0)，B＝CH3CN)。将含有产物的部分冷冻干燥，得到3mg化合物52：质谱(ES)计算：(M+H) C46H75N12O14：1019.5.实测：1019.5.
49转化为50和51转化为52的速率比较：49(AOA-ADEG-OH，包含氨基氧基乙酰基)转化为产物50和51(AO-TEG-OH，包含氨基氧基烷基)转化为52的速率是这样测量的，在不同时间点将反应混合物试样注射到分析型HPLC上，用分析型HPLC测量该时间的产物含量(C18，梯度，10-60％B，0-40min，A＝0.1％ TFA/H2O，B＝0.1％ TFA/CH3CN)。如图13所述，包含氨基氧基烷基的化合价平台分子更加迅速地与模型肽生成肟轭合物。
实施例13-利用化合物37作为双官能连接剂制备四价轭合物的替代方法
作为使氨基转移的第1结构域β2GPI多肽或任意其他乙醛基化多肽直接与四价氨基氧基平台反应的替代选择，可以使氨基转移的多肽与过量化合物37在pH4.6 100mM乙酸钠缓冲液中反应，得到化合物53，其中氨基氧基连接剂经由肟键与该多肽(这里是第1结构域多肽)结合。合成流程如图15所示。从过量连接剂中分离化合物53，使四价的化合物53与平台38在pH4.6 100mM乙酸钠缓冲液中反应，生成第二套肟键，得到四价轭合物、即化合物54。
实施例14-利用化合物21作为双官能连接剂前体制备四价轭合物的替代方法
将化合物21a用氢氧化铵处理，以除去乙酰基硫保护基团，然后用三氟乙酸处理，以Boc保护基团，得到连接剂55。含有乙醛基的多肽在这种情况下是TA/D1，使其与化合物55反应，得到化合物56，即经由肟键结合有巯基连接剂的第1结构域。四价化合物56可以与平台23反应，得到四价的第1结构域多肽轭合物，即化合物57。合成流程如图16所示。
实施例15-化合物85的合成，图21
按照本质上与化合物20的合成(如图4所示)相同的方式进行氨基氧基平台、即化合物85的合成；不过，使用化合物28代替化合物17。使化合物18与化合物28反应，如图23所示，得到Boc-保护的平台99。按照本质上类似于化合物16制备所述方式，除去化合物99的Boc-保护基团，得到85。
实施例16-化合物86的合成，图21
化合物86的制备涉及制备Boc-保护的氨基氧基己酸、即化合物105，再用其酰化四氨基平台、即化合物108，如图24流程B所示。
6-(N-叔丁氧羰基)氨基氧基己酸乙酯，化合物104：历经约一分钟的时间，向磁搅拌着的500mg(3.76mmol)N-(叔丁氧羰基)羟胺(Aldrich Chemical Co.)与267μL(335mg，1.50mmol)6-溴己酸乙酯的混合物中加入1.12mL(1.14g，7.51mmol)DBU。将混合物搅拌24小时，此时它已部分固化。将混合物溶于100mL CH2Cl2，将所得溶液在分液漏斗内与四份25mL 1N HCl和25mL盐水摇动。弃去含水层，将CH2Cl2层干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。所得黄色的油经过硅胶色谱纯化(3/7 EtOAc/己烷)，得到285mg化合物104：1H NMRCDCl3(δ)1.25(t，3H)，1.42(m，2H)，1.50(s，9H)，1.65(m，4H)，2.30(t，2H)，3.83(t，2H)，4.12(q，2H)，7.28(s，1H)；13C NMR CDCl3(δ)14.4，24.9，25.6，27.8，28.4，34.3，60.4，76.6，81.7，157.1，173.8；HRMS(MALDI-FTMS)计算：(M+Na) C13H25NaNO5：298.1630.实测：298.1631.
6-(N-叔丁氧羰基)氨基氧基己酸，化合物105：向1.50g(5.44mmol)化合物104的20mL EtOH溶液中加入5.44mL(54.4mmol)10N NaOH，将混合物搅拌18小时。使混合物在100mL 1N HCl与四份100mL CH2Cl2之间分配。将CH2Cl2层合并，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩，得到黄色的油。经过硅胶色谱纯化(50/50/1己烷/EtOAc/HOAc)，得到1.22g(90％)化合物105，为无色的油：
1HNMR CDCl3(δ)1.45(m，2H)，1.48(s，9H)，1.66(m，4H)，2.37(t，2H)，3.85(t，2H)，7.21(s，1H)；13C NMR CDCl3(δ)24.6，25.5，27.8，28.4，34.0，76.6，82.0，157.5，179.3.
N-羟基琥珀酰亚胺基6-(N-叔丁氧羰基)氨基氧基己酸酯，化合物106：向1.07g(4.32mmol)化合物105与497mg(4.32mmol)N-羟基琥珀酰亚胺的20mL CH2Cl2溶液中加入818mg(1.01mL，6.48mmol)二异丙基碳二亚胺。将反应混合物在室温下搅拌18小时，加入1mL HOAc。另将混合物搅拌3小时，在真空下浓缩。将残余物溶于75％EtOAc/己烷，过滤除去不溶物。浓缩滤液，所得黄色的油经过硅胶色谱纯化(50/50 EtOAc/己烷)，得到1.31g(88％)化合物106，为无色的油：
1H NMR CDCl3(δ)1.50(s，9H)，1.52(m，2H)，1.69(m，2H)，1.80(m，2H)，2.63(t，2H)，2.84(s，4H)，3.88(t，2H)，7.25(s，1H)；13C NMR CDCl3(δ)24.4，25.1，25.6，27.5，28.2，30.8，76.1，81.5，157.3，168.6，169.4.
Boc-保护的氨基氧基己酰基/AHAB/TEG平台、即109的合成：如前人所述(美国专利No.5,633,395反应流程4)得到化合物107并转化为化合物108。向50mg(0.058mmol)化合物108的1mL THF溶液中加入38μL(37mg，0.464mmol)吡啶，再加入120mg(0.348mmol)化合物106的1mL THF溶液。将混合物搅拌18小时，用1N HCl酸化，在15mL 1N HCl与三份15mL CH2Cl2之间分配。将合并后的CH2Cl2层干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。所得的油经过硅胶色谱纯化(分级梯度；95/5CH2Cl2/MeOH至90/10CH2Cl2/MeOH至80/20CH2Cl2/MeOH)，得到25mg(24％)化合物109，为一种胶：
1H NMR CDCl3(δ)1.32(M，18H)，1.47(s，9H)，1.65(m，18H)，2.20(t，16H)，1.80(m，2H)，3.21(m，8H)，3.40(brd s，16H)，3.68(m，8H)，3.82(t，8H)，6.52(t，2H)，6.60(t，2H)，7.13(t，2H)，7.21(t，2H)，7.88(s，1H)；
质谱(ESI)(M+H)计算：C84H157N14O26：1777.实测1778.
氨基氧基己酰基/AHAB/TEG平台，86：按照本质上类似于化合物16制备所述方式，除去化合物109的Boc-保护基团，得到86。
实施例17-化合物91的合成，图22
1-叠氮基-6-(N-叔丁氧羰基)氨基氧基己烷、即化合物99的合成：将300mg(0.874mmol)1-碘-6-(N-叔丁氧羰基)氨基氧基己烷(化合物98，如Jones et al.《四面体快报》(Tetrahedron Letters)2000，41，1531-1533所述制备)与455mg(7.00mmol)叠氮化钠的4mL DMF溶液在氮下搅拌72小时。使混合物在50mL EtOAc与三份25mL H2O之间分配。将EtOAc层干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。经过硅胶色谱纯化(15/85EtOAc/己烷)，得到219mg(97％)化合物99，为无色的油：
1H NMRCDCl3(δ)1.41(m，4H)，1.49(s，9H)，1.63(m，4H)，3.28(t，2H)，3.83(t，2H)，7.22(s，1H)；13C NMR CDCl3(δ)25.7，26.7，28.0，2g.4，28.9，51.5，76.7，81.7，157.1.
化合物96的合成：在装有干冰冷凝器的反应容器内，将液氨加入到化合物22a(6.6-8.8mmol)中，将所得混合物搅拌5min。加入全-6-脱氧-6-碘-环糊精(1mmol，Ashton等《有机化学杂志》(J.Org.Chem.)1996，61，903；Gadelle和Defaye，《应用化学国际英文版》(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.)1991，30，78)。搅拌6h后，蒸发氨，将残余物在真空下进一步干燥，经过快速色谱纯化，得到化合物96。
1-氨基-6-(N-叔丁氧羰基)氨基氧基己烷、即化合物100的合成：将180mg(0.697mmol)化合物99与219mg(0.836mmol)三苯膦的4mLTHF与1mL H2O溶液在室温下搅拌18小时。经TLC证实仍然存在原料，因此另加入55mg(0.209mmol)三苯膦，将混合物搅拌7小时。将混合物浓缩，经过硅胶色谱纯化(分级梯度；2/5/93至2/10/88浓NH4OH/H2O/CH3CN)，得到151mg化合物100，为无色的油：
1H NMR CDCl3(δ)1.35(m，4H)，1.49(s，9H)，1.61(m，4H)，2.69(t，2H)，3.82(t，2H)；13C NMR CDCl3(δ)25.8，26.7，28.1，28.3，33.2，41.9，76.7，81.3，157.1.
化合物101的合成：向84mg(81.8μmol)化合物14的1mL CH2Cl2溶液中加入114mg(491μmol)化合物100的0.5mL CH2Cl2溶液，再加入86μL(63mg，491μmol)二异丙基乙胺。将混合物在室温下搅拌18小时，用38μL(39mg，654μmol)乙酸猝灭，浓缩得到一种油。经过硅胶色谱纯化(分级梯度；2/98至7.5/92.5MeOH/CH2Cl2)，得到115mg(100％)101，为一种油：1HNMR CDCl3(δ)1.38(m，16H)，1.47(s，36H)，1.59(m，16H)，3.13(m，8H)，3.50(m，8H)，3.69(t，4H)，3.82(t，8H)，4.18(m，4H)，4.22(m，8H)，5.42(m，2H)，5.56(m，2H)；
质谱(ESI)(M+Na)计算：C62H116NaN10O25：1423.实测：1423
化合物91：按照本质上类似于化合物16制备所述方式，除去化合物101的Boc-保护基团，得到91。反应流程如图25所示。
实施例18-化合物92的合成，图22
如图26所述制备化合物92。如PCT US99/29338所述制备四N-Boc-氨基平台39b’。使二甘醇与对-硝基苯基氯甲酸酯反应，得到二对-硝基苯基碳酸酯化合物，然后与二乙醇胺反应，生成四羟基化合物，进而与对-硝基苯基氯甲酸酯反应，得到四对-硝基苯基碳酸酯化合物，进而与四丁基N-(2-氨基乙基)氨基甲酸酯反应，得到39b’。将化合物39b’用三氟乙酸去保护，得到四胺化合物102。
化合物103：向20mg(0.023mmol)化合物102在0.5mL饱和碳酸氢钠溶液中的溶液中加入60mg(0.140mmol)化合物17的0.5mL二噁烷溶液。将混合物在室温下搅拌5小时，冷却至0℃，滴加1N HCl进行酸化。使混合物在7mL H2O与四份10mL CH2Cl2之间分配。将合并后的CH2Cl2层用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。经过制备型HPLC纯化(C18，梯度，30％ B至50％ B 40min，A＝0.1％ TFA/H2O，B＝0.1％ TFA/CH3CN)，得到12mg(27％)103，为粘性的油：
1H NMR CDCl3(δ)1.48(s，36H)，3.26(m，16H)，3.51(m，8H)，3.68(m，44H)，4.02(m，8H)，4.21(m.12H)，6.12(brd m，8H)，8.09(brd s，4H)；质谱(ESI)(M+Na)计算：C79H136NaN14O41：1900.实测1900.
化合物92：按照本质上类似于化合物16制备所述方式，除去化合物103的Boc-保护基团，得到92。反应流程如图26所示。
实施例19-八聚平台113的合成
在0℃下，向氮喷射的0.50g(1.71mmol)化合物21b的8mL MeOH溶液中加入537μL 25％ NaOMe的MeOH溶液(2.57mmol)，将混合物在0℃下搅拌2小时，加入5.14mL(5.14mmol)氮喷射的1M KHCO3溶液，将混合物在0℃氮下搅拌15分钟。向混合物中滴加283mg(0.14mmol)化合物111(如Xeno专利所述制备)的10mL 2/1MeOH/水溶液。浓缩反应混合物，以除去MeOH，将浓缩液再次溶于乙腈。然后将反应混合物在室温氮下搅拌3天，浓缩，在40mL EtOAc与20mL水之间分配。浓缩EtOAc层，产物经过Amberchrom色谱纯化(70/30乙腈/H2O)，得到100mg化合物112，为白色粉末：
1H NMR(CD3OD)：δ1.36(m，48H)，1.42(s，72H)，1.57(m，64H)，2.14(m，8H)，2.55(m，16H)，3.11(m，36H)，3.24(m，8H)，3.30(brd s，16H)，3.71(t，16H)，4.2(m，4H)；13C NMR(CD3OD)：δ24.31，25.58，26.73，27.77，28.82，29.16，29.73，29.78，30.17，30.24，30.35，33.21，33.69，36.35，36.53，37.17，38.87，39.09，40.43，40.53，54.95，66.07，70.50，71.65，77.44，82.00，158.25，159.20，172.63，172.78，173.97，176.28；质谱(ESI)(M+2Na)/2计算：C168H312Na2N26O46S8：1866.实测1866.
化合物113：按照本质上类似于化合物16制备所述方式，除去化合物112的Boc-保护基团，得到113。反应流程如图27所示。
实施例20-化合物125的合成
化合物115：向8.00g(13.4mmol)化合物114(如美国专利No.5,552,391所述制备)的80mL无水DMF溶液中加入4.00g(16.1mmol)N-(苄氧羰基氧基)琥珀酰亚胺(Aldrich Chemical Co.)。将混合物在室温氮下搅拌2小时，此时将其倒入600mL冰水中，用四份100mL CH2Cl2萃取。将合并后的CH2Cl2层用100mL H2O洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤，浓缩。从庚烷中浓缩有助于使粗产物固化。从EtOAc中重结晶，得到化合物115，为白色固体：1H NMR(CDCl3)δ12.6(m，4H)，1.43-1.62(m，8H)，2.05(m，4H)，3.16(q，4H)，3.40(brd s，8H)，4.98(s，2H)重叠与5.08(s，4H)和5.11(s，2H)，6.31(s，1H)，6.44(s，1H)，7.26-7.38(m，15H).
三胺化合物116的合成：向9.0g(12.3mmol)化合物115的18mL环己烷与36mL无水乙醇溶液中通入N2气进行脱氧。向溶液中加入1.80g 10％ Pd/C，将混合物加热回流3小时。冷却后，使混合物通过Celite过滤，用MeOH清洗。浓缩滤液，将浓缩液从CH2Cl2中浓缩，得到4.20g(87％)化合物116，为不完全白色固体。
化合物117的合成：向5.39g(21.8mmol)化合物105的10mL无水乙腈溶液中加入3.02g(23.9mmol)CDI(羰基二咪唑)，将混合物在氮气氛下搅拌1.5小时。将所得溶液加入到4.20g(10.7mmol)化合物116的15mL无水DMF溶液中，将混合物搅拌2小时，倒入500mL冰水中。将所得混合物用四份100mL CH2Cl2萃取。将合并后的CH2Cl2层用100mL H2O洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤，浓缩。所得半固体残余物从10％异丙醇/EtOAc中结晶，得到4.0g(44％)117，为白色固体：1H NMRCDCl3(δ)1.35(m，4H)，1.42(m，4H)，1.49(s，18H)，1.63(m，16H)，2.01(brd s，1H)，2.20(t，4H)，3.23(m，4H)，3.34(m，4H)，3.85(t，4H)，6.34(t，2H)，6.70(t，2H)，7.98(brd s，1H).
化合物119：向3.65g(14.11mmol)9-芴甲基氯甲酸酯(Fmoc-Cl)的15mL二噁烷溶液中加入3.00g(15.5mmol)化合物118(Bondunov等《有机化学杂志》(J.Org.Chem.)1995，Vol.60，pp.60976102)的15mL二噁烷溶液，再加入1.95g(14.11mmol)碳酸钾的30mL H2O溶液。将混合物在室温下搅拌18小时，浓缩。使所得的油在50mL 1NNaOH溶液与三份150mL CH2Cl2之间分配。将合并后的CH2Cl2层干燥(MgSO4)，过滤，浓缩，得到黄色的油。经过硅胶色谱纯化(分级梯度；90/10 EtOAc/AcOH至90/10/1 EtOAc/AcOH/MeOH)，得到3.85g(66％)119，为粘性的油：
1H NMR CDCl3(δ)3.26(m，4H)，3.39(m，2H)，3.49(m，2H)，3.59(m，2H)，3.65(m，4H)，3.69(m，2H)，4.25(t，1H)，4.60(d，2H)，7.35(t，2H)，7.41(t，2H)，7.59(d，2H)，7.78(d，2H).
化合物120：在0℃下，向3.77g(9.08mmol)化合物119与7.32g(36.3mmol)4-硝基苯基氯甲酸酯的50mL CH2Cl2溶液中加入5.88mL(5.75g，72.6mmol)吡啶。将混合物在室温氮气氛下搅拌72小时，使混合物在200mL CH2Cl2与四份100mL 10％碳酸氢钠水溶液之间分配。将CH2Cl2层连续用100mL H2O、100mL 1N HCl和100mL盐水洗涤。将溶液干燥(MgSO4)，过滤，浓缩，得到橙色的油。经过硅胶色谱纯化(15/50/35/1 EtOAc/CH2Cl2/己烷/AcOH)，得到2.67g(39％)化合物120，为黄色的胶：1H NMR(CDCl3)δ3.32(m，4H)，3.52(m，2H).3.60(m，4H)，3.74(m，2H)，4.23(t，1H)，4.38(m，2H)，4.41(m，2H)，4.57(d，2H)，7.37(m，8H)，7.59(d，2H)，7.78(d，2H)，8.26(重叠的d，4H)；
质谱(ESI)(M+H)  计算：C37H36N3O14：746.实测：746.
化合物121：向482mg(0.612mmol)化合物117的5mL CH2Cl2溶液中加入182mg(0.245mmol)化合物120，再加入171μL(124mg，1.22mmol)Et3N和26mg(.490mmol)HOBt。将混合物在室温下搅拌，直至用TLC(1/9 MeOH/CH2Cl2)判断反应完全。使混合物在300mL CH2Cl2与三份50mL 1N HCl之间分配。将CH2Cl2层用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩，得到黄色的油。经过硅胶色谱纯化(多级梯度；5/1/94至10/1/89至15/1/84至20/1/79 MeOH/HOAc/CH2Cl2)，得到317mg(63％)化合物121，为粘性白色固体：1H NMR(CD3OD)δ1.34(m，16H)，1.43(m，8H)，1.48(s，36H)，1.64(m，24H)，2.20(m，16H)，3.19(m，12H)，3.25-3.52(m，18H)，3.55(m，2H)，3.79(t，8H)，4.16(m，4H)，4.28(t，1H)，4.59(d，2H)，7.33(t，2H)，7.41(t，2H)，7.60(d，2H)，7.84(d，2H)；13C NMR(CD3OD)δ14.6，23.8，26.7，26.7，26.9，27.7，28.8，28.9，30.3，37.1，38.8，39.1，40.3，65.8，66.0，68.1，70.2，70.3，77.3，82.0，121.2，126.0，128.4，129.0，142.9，145.6，157.9，158.2，159.2，176.1，176.3；质谱(ESI)(M+2Na)/2
计算：C101H171Na2N15O28：1044.实测1044.
化合物122：向163mg(79.8mmol)化合物121的2.4mL DMF溶液中加入600μL二乙胺。将混合物搅拌3小时，浓缩。经过硅胶色谱纯化(多级梯度；10/1/89至
至15/1/84 MeOH/浓NH4OH/CH2Cl2)，得到127mg(81％)化合物122，为玻璃状胶：
1H NMR(CD3OD)δ1.38(m，16H)，1.48(m，44H)，1.65(m，24H)，2.20(t，16H)，2.83(t，4H)，3.17(t，8H)，3.38(m，16H)，3.63(t，4H)，3.69(t，4H)，3.78(t，4H)，4.21(m，4H)；13C NMR(CD3OD)δ26.7，27.0，27.8，28.8，28.9，30.3，37.1，38.8，39.1，40.3，49.9，66.0，70.4，70.9，77.3，82.0，158.2，159.2，176.1，176.3；质谱(ESI)(M+H)计算：C86H162N15O26：1821.实测：1821.
化合物124b：向20mg(11.0μmol)化合物122的5mL DMF溶液中加入103mg(8.8μmol)分子量为11,690g/mol的甲氧基聚乙二醇苯并三唑基碳酸酯(mPEG12K-BTC，化合物123b，Shearwater Polymers)，再加入5μL(3.6mg，35.9mmol)Et3N。将混合物在室温下搅拌18小时，浓缩。残余物经过硅胶色谱纯化(多级梯度；5/95至15/85至20/80MeOH/CH2Cl2)，得到109mg化合物124b，为蜡状不完全白色固体：
1H NMR(CDCl3)δ1.37(m，16H)，1.49(m，44H)，1.65(m，24H)，2.20(t，16H)，3.20(q，8H)，3.36(m，16H)，3.61(m.4H)，3.68(m，约1056H)，3.84(t，8H)，3.91(m，4H)，4.23(m，4H).
化合物124a：利用本质上与化合物124b制备所用相同的操作制备该化合物；不过，使用分子量为5,215g/mol的甲氧基聚乙二醇苯并三唑基碳酸酯(mPEG5K-BTC，化合物123a，Shearwater Polymers)：1H NMR(4∶1CDCl3/CD3OD)δ1.37(m，16H)，1.49(m，44H)，1.65(m，24H)，2.20(t，16H)，3.20(q，8H)，3.36(m，16H)，3.61(m，4H)，3.68(m，约468H)，3.84(t，8H)，3.91(m，4H)，4.23(m，4H).
化合物124c：利用本质上与化合物124b制备所用相同的操作制备该化合物；不过，使用分子量为22,334g/mol的甲氧基聚乙二醇苯并三唑基碳酸酯(mPEG20K-BTC，化合物123c，Shearwater Polymers)：1H NMR(5∶1CDCl3/CD3OD)δ1.37(m，16H)，1.49(m，44H)，1.65(m，24H)，2.20(t，16H)，3.20(q，8H)，3.36(m，16H)，3.61(m，4H)，3.68(m，约2024H)，3.84(t，8H)，3.91(m，4H)，4.23(m，4H).
化合物125b：按照本质上类似于化合物16制备所述方式，除去化合物124a-c的Boc-保护基团，得到化合物125a-c。
反应流程如图28所示。
实施例21-化合物129的合成
化合物126：向14mg(18.6μmol)化合物120与29mg(186.3μmol)HOBT的5mL无水DMF溶液中加入56μL(38mg，373μmol)Et3N。将混合物搅拌1小时，加入85mg(46.6μmol)化合物122的1mL DMF溶液。将混合物在室温下搅拌5小时，在150mL CH2Cl2与50mL 1N HCl之间分配。将CH2Cl2层用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。经过硅胶色谱纯化，得到34mg(44％)化合物126，为蜡状白色固体：
                                                        1H NMR(CD3OD)δ1.37(m，32H)，1.49(m与s重叠在1.48，88H)1.62(m，48H)，2.20(t，32H)，3.18(t，16H)，3.36(m，32H)，3.50(m，12H)，3.64(m，24H)，3.79(t，16H)4.17(m，12H)，4.29(t，1H)，4.60(d，2H)，7.37(t，2H)，7.43(t，2H)，7.65(d，2H)，7.84(d，2H)；质谱(ESI)(M+3Na)/3  计算：C197H347Na3N31O60：1393.实测：1393.
化合物127：向34mg(8.27μmol)化合物126的1.6mL DMF溶液中加入400μL二乙胺。将混合物在室温下搅拌4小时，浓缩。浓缩液经过硅胶色谱纯化(1/10/89浓NH4OH/MeOH/CH2Cl2)，得到13mg(40％)化合物127：1H NMR(CD3OD)δ1.35(m，32H)，1.49(与s重叠在1.48，88H)，1.63(m，48H)，2.19(t，32H)，3.08(brd t，4H)3.17(t，16H)，3.38(m，36H)，3.52(m，8H)，3.63(t，8H)，3.70(m，12H)，3.78(t，16H)，4.21(m，12H)；质谱(ESI)(M+3Na)/3计算：C182H337Na3N31O58：1319.实测：1319.
化合物128：向13mg(3.34μmol)化合物127的5mL吡啶溶液中加入60mg(2.68μmol)分子量为22，334g/mol的甲氧基聚乙二醇苯并三唑基碳酸酯(mPEG20K-BTC，Shearwater Polymers)，再加入5μL(3.6mg，35.9μmol)Et3N。将混合物在室温下搅拌18小时，浓缩。残余物经过硅胶色谱纯化(多级梯度；10/90至15/85至20/80MeOH/CH2Cl2)，得到45mg化合物128，为蜡状固体：
1H NMR(CDCl3)δ1.30(m，32H)，1.50(mc(m与s重叠在1.48，88H)，1.67(m，48H)，2.24(t，32H)，3.23(m，16H)，3.41(m，32H)，3.65(m，约2024H)，3.70(t，24H)，3.89(m，16H)，4.21(m，12H).
化合物129：按照本质上类似于化合物16制备所述方式，除去化合物128的Boc-保护基团，得到129，如图29所示。
实施例22-化合物132的合成
化合物131：向22mg(27.3μmol)化合物117的5mL吡啶溶液中加入236mg(10.9μmol)分子量为21,529g/mol的聚乙二醇双-苯并三唑基碳酸酯(PEG20K-bis-BTC，化合物130，Shearwater Polymers)，再加入8μL(5.8mg，57.4mmol)Et3N。将混合物在室温下搅拌18小时，浓缩。残余物经过硅胶色谱纯化(多级梯度；5/95至15/85至20/80MeOH/CH2Cl2)，得到242mg(96％)化合物131，为白色固体：1H NMR(CDCl3)δ1.35(m，16H)，1.48(m，44H)，1.61(m，24H)，2.20(m，16H)，3.22(m，8H)，3.52-3.96(m，约2000H)，4.23(m，4H).
化合物132：按照本质上类似于化合物16制备所述方式，除去化合物131的Boc-保护基团，得到132。
反应流程如图30所示。
实施例23-化合物136的合成
化合物134：向3.87mg(4.85μmol)季戊四醇四-(4-硝基苯基碳酸酯)(通过季戊四醇与对-硝基苯基氯甲酸酯的反应制备，得到四对-硝基苯基碳酸酯化合物)的5mL吡啶溶液中加入124mg(24.2μmol)分子量为5094g/mol的单-Boc-保护的二氨基聚乙二醇(化合物133，BocNH-PEG(5K)-NH2)和5μL(3.63mg，35.9μmol)Et3N。将混合物搅拌18小时，浓缩。残余物经过硅胶色谱纯化(分级梯度；5/95至15/85MeOH/CH2Cl2)，得到77mg(77％)化合物134，为白色固体：1H NMR(CDCl3)δ1.48(s，36H)，3.32(m，16H)，3.52-3.96(m，约1818H)，4.10(m，8H).
化合物135：将化合物134(77mg，3.73μmol)溶于5mL三氟乙酸，将混合物放置三小时。在N2气流下除去TFA，将残余物溶于5mL CH2Cl2。向所得溶液中加入7.72mg(22.4μmol)化合物106的5mL CH2Cl2溶液，再加入35μL(25.4mg，251μmol)Et3N(注：应当检查混合物的pH，并相应地用Et3N进行调整，以确保其为碱性)。将混合物在氮下搅拌18小时。使混合物在50mL CH2Cl2与三份25mL 1N HCl之间分配。将CH2Cl2层用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。经过硅胶色谱纯化(分级梯度；5/95至10/90 MeOH/CH2Cl2)，得到42mg(53％)化合物135，为蜡状固体：
1H NMR(CDCl3)δ1.40(m，8H)，1.48(s，36H)，1.66(m，16H)，2.18(t，8H)，3.32(m.16H)，3.38-3.89(m，约1818H)，4.10(m，8H)，4.97(t，4H)，6.43(t，4H)，7.47(s，4H).
化合物136：按照本质上类似于制备化合物16所述方式，除去化合物135的Boc-保护基团，得到化合物136，如图31所示。
实施例24-化合物143的合成
化合物137：在氮气氛下，向0℃的200mg(1.11mmol)3，5-二氨基苯甲酸乙酯的5mL CH2Cl2溶液中加入928μL(674mg，6.66mmol)Et3N。向混合物中滴加510μl(710mg，3.33mmol)6-溴己酰氯的5mLCH2Cl2溶液。将混合物在室温下搅拌1.5小时，在50mL 1N HCl与两份50mL CH2Cl2之间分配。将CH2Cl2层用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。产物经过硅胶色谱纯化(6/4己烷/EtOAc)，得到554mg(93％)化合物137，为一种油：
1H NMR(CDCl3)：δ1.39(t，3H)，1.52(m，4H)，1.75(m，4H)，1.90(m，4H)，2.40(t，4H)，3.42(t，4H)，4.36(q，2H)，7.60(s，2H)，7.88(s，2H)，8.17(s，1H).
化合物138：将DBU(612μL，623mg，4.01mmol)加入到547mg(1.02mmol)化合物137与272mg(2.05mmol)N-(叔丁氧羰基)羟胺(Aldrich Chemical Co.)的溶液中。将混合物在室温下搅拌18小时，在50mL 1N HCl与三份50mL CH2Cl2之间分配。将合并后的CH2Cl2层干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。产物经过硅胶色谱纯化(1/1己烷/EtOAc)，得到216mg(33％)化合物138，为白色固体：mp55-60℃；
                                          1H NMR(CDCl3)：δ1.38(t，3H)，1.48(s，18H；buried m，4H)，1.60(m，4H)，1.73(m，4H)，2.40(m，4H)，3.86(t，4H)，4.36(q，2H)，7.41(s，2H)，7.90(s，2H)，8.06(s，2H)，8.11(s，1H)；质谱(ESI)(M+Na)  计算：C31H50NaN4O10：661.实测：661.
化合物139：向205mg(0.32mmol)化合物138的1/1丙酮/EtOH溶液中加入256μL(2.56mmol)10N NaOH，将混合物加热至60℃达4小时。冷却后，使混合物在50mL 1N HCl与四份50mL 4/1 CH2Cl2/MeOH之间分配。将合并后的有机层干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。产物经过硅胶色谱纯化(3/97/1 MeOH/CH2Cl2/HOAc)，得到184mg(94％)化合物139，为粘性的油：
    1H NMR(CDCl3)：δ1.38(m，4H)，1.42(s，18H)，1.60(m，4H)，1.70(m，4H)，2.38(m，4H)，3.80(t，4H)，7.77(s，2H)，8.00(s，2H)，8.11(s，1H)，8.91(s，2H)；
质谱(ESI)(M+Na)  计算：C29H46NaN4O10：633.实测：633.
化合物140：向0℃的164mg(0.268mmol)化合物139的2.0mL无水THF溶液中加入31mg(0.268mmol)N-羟基琥珀酰亚胺，再加入83mg(0.403mmol)DCC。使混合物达到室温，在氮气氛下搅拌18小时，加入200μL HOAc。另将混合物搅拌一小时，用约5mL EtOAc稀释，放置一小时。过滤除去所得沉淀，浓缩滤液。经过硅胶色谱纯化(3/97MeOH/CH2Cl2)，得到129mg(68％)化合物140，为白色固体：
1H NMR(CDCl3)：δ1.40(m，4H)，1.43(s，18H)，1.65(m，4H)，1.80(m，4H)，2.34(m，4H)，2.93(s，4H)，3.85(t，4H)，7.68(s，2H)，7.87(s，2H)，8.36(s，1H)，8.61(s，2H).
化合物142：向60mg(0.85mmol)化合物140的0.5mL CH2Cl2溶液中加入14μL(13.3mg，0.168mmol)吡啶。将混合物冷却至0℃，加入71mg(0.021mmol)二氨基-PEG、即化合物141的0.5mL CH2Cl2溶液。将混合物在室温氮气氛下搅拌18小时，在10mL 1N HCl与三份10mL CH2Cl2之间分配。将合并后的CH2Cl2层干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。经过硅胶色谱纯化(分级梯度；5/95 MeOH/CH2Cl2至10/90MeOH/CH2Cl2)，得到66mg(69％)化合物142，为粘性的油：
                                                                          1HNMR(CDCl3)：δ1.45(s，36H)，1.60-1.80(m，24H)，2.39(t，8H)，3.39(m，8H)，3.50-3.80(brd s，约318H)，3.87(t，8H)，4.22(t，4H)，7.50(brd s，2H)，7.63(s，4H)，7.77(s，2H)，8.08(s，2H)，8.60(s，2H)；质谱(MALDI)(M+H)计算：C207H389N12O93：4535.实测以约4324为中心分布.
化合物143：按照本质上类似于化合物16制备所述方式，除去化合物142的Boc-保护基团，得到143，如图32所示。
化合物25-轭合物的制备方法
如下制备轭合物200、201、202、203、204和205(图33)。
化合物200：向68.8mg(9.74μmol，6当量)TA/D1在10mL氦喷射的0.1M pH4.6乙酸钠缓冲液中的溶液中加入36.8mg(1.62μmol)化合物125c在6.15mL 1/1乙腈/0.1M pH8.0tris乙酸盐缓冲液中的溶液。小心地使混合物保持在氮气氛下，同时在室温下搅拌18小时。反应完全后，直接经过阳离子交换色谱纯化，使用由PolyLC Inc.生产的PolyCat A WCX柱(梯度10％ B至25％B，A＝10mM磷酸钠pH7的1/9乙腈/H2O溶液)，得到57mg(40％)化合物200。
化合物201：按照本质上类似于化合物200的方式制备化合物201。因而，向6当量TA/D1在氦喷射的0.1M pH4.6乙酸钠缓冲液中的1mM溶液中加入1当量化合物125a在1/1乙腈/0.1M pH8.0tris乙酸盐缓冲液中的0.25至10mM溶液。小心地使混合物保持在氮气氛下，同时在室温下搅拌18小时。反应完全后，直接经过阳离子交换色谱纯化，得到化合物201。
化合物202：按照本质上类似于化合物200的方式制备化合物201。因而，向6当量TA/D1在氦喷射的0.1M pH4.6乙酸钠缓冲液中的1mM溶液中加入1当量化合物132在1/1乙腈/0.1M pH8.0tris乙酸盐缓冲液中的0.25至10mM溶液。小心地使混合物保持在氮气氛下，同时在室温下搅拌18小时。反应完全后，直接经过阳离子交换色谱纯化，得到化合物202。
化合物203：按照本质上类似于化合物200的方式制备化合物201。因而，向6当量TA/D1在氦喷射的0.1M pH4.6乙酸钠缓冲液中的1mM溶液中加入1当量化合物136在1/1乙腈/0.1M pH8.0tris乙酸盐缓冲液中的0.25至10mM溶液。小心地使混合物保持在氮气氛下，同时在室温下搅拌18小时。反应完全后，直接经过阳离子交换色谱纯化，得到化合物203。
化合物204：按照本质上类似于化合物200的方式制备化合物201。因而，向6当量TA/D1在氦喷射的0.1M pH4.6乙酸钠缓冲液中的1mM溶液中加入1当量化合物143在1/1乙腈/0.1M pH8.0tris乙酸盐缓冲液中的0.25至10mM溶液。小心地使混合物保持在氮气氛下，同时在室温下搅拌18小时。反应完全后，直接经过阳离子交换色谱纯化，得到化合物204。
化合物205：按照本质上类似于化合物200的方式制备化合物201。因而，向6当量TA/D1在氦喷射的0.1M pH4.6乙酸钠缓冲液中的1mM溶液中加入1当量化合物125b在1/1乙腈/0.1M pH8.0tris乙酸盐缓冲液中的0.25至10mM溶液。小心地使混合物保持在氮气氛下，同时在室温下搅拌18小时。反应完全后，直接经过阳离子交换色谱纯化，得到化合物205。
实施例26：耐受原效率和血清半衰期的评价
制备第1结构域-钥孔血蓝蛋白轭合物(D1-KLH)，用于动物免疫法。利用杆状病毒表达载体系统，在昆虫细胞内表达具有第五个半胱氨酸的重组第1结构域为与谷胱甘肽混合的二硫化物。结构组成为天然人β2-糖蛋白I中存在的前66个氨基末端氨基酸，然后是C-末端leu-(his)5表达标记。C-末端的多组氨酸表达标记是镍亲和色谱纯化操作的基础。Iverson等(1998)《美国国家科学院院报》(Proc.Nat’l.Acad.Sci.)95：15542-15546。
所得具有游离巯基的第1结构域(D1-SH)被马来酰亚胺基-KLH烷基化。根据厂商的指导，将马来酰亚胺基-活化的KLH(Pierce ChemicalCo.；Rockford，IL)按10mg/mL溶于水。立即将KLH加入到D1-SH中，比例为1.27mg/mg D1-SH。将含有KLH与D1的试管在RT下旋转混合2h。恒温结束时，利用＞25,000MW截留膜将内容物透析到4℃的PBS中，以除去未共轭化合的D1。对透析后的样本取样，用ELISA试验与来自患者的亲和性纯化的抗磷脂抗体(aPL)的免疫反应性D1的存在。
使用致免疫的大鼠模型，测量耐受原功效。将含有10μg D1-KLH的明矾以及百日咳佐剂i.p.给药，使Lewis大鼠(Harlan SpragueDawley，Indianapolis，IN)致免疫。初次给药三周后，将耐受原或PBS对照i.v.给药，每组四只动物。治疗五天后，将10μg D1-KLHi.p.给药，加强给药七天后采集血清样本。
使用ELISA检测大鼠血清中的抗-第1结构域抗体。在4℃下，将Nunc Maxisorp Immunoplates(Nalge Nunc International，Rochester，NY)涂以50μl 5μg/ml重组人β2-GPI在碳酸盐缓冲液(Sigma，St.Louis，MO)pH9.6中的溶液过夜。随后的步骤在室温下进行。将平皿用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤3次，然后用250μl 2％脱脂干乳(Carnation，Solon，OH)的PBS溶液封阻1h。洗涤后，将小孔用50μl血清样本的PBS连续稀释液恒温1h，每种样本一式三份。使用未致免疫的血清作为对照，使用从致免疫动物收集的血清绘制标准曲线。洗涤后，将小孔用50μl与碱性磷酸酶共轭的山羊抗-大鼠IgG(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)在PBS/0.1％ BSA中的1∶2000稀释液恒温1h。将小孔用dIH2O洗涤3次，用PPMP溶液(10gm酚酞单-磷酸盐(Sigma，St.Louis MO)、97.4ml 2-氨基-2-甲基-1-丙醇(Sigma)、9.62ml dIH2O、21ml HCl)显色20分钟。用50μl 0.2MNa2HPO4停止显色，在Bio-Tek Instruments PowerWave 340Microplate分光光度计(Winooski，VT)上读取OD550。把正常抗体单位指定为标准池，从标准曲线推导供试血清中抗-第1结构域抗体的浓度(单位/ml)。使用轭合物200、201、202和203，通过与PBS-治疗的对照进行对比，计算多价平台轭合物对抗-第1结构域抗体的抑制作用百分率。结果如下表1所示。
表1：致免疫大鼠抗-第1结构域抗体的抑制作用百分率
                                                                                                         纳摩尔药物/大鼠
  化合物   0.17   1.7   17
  200   61   82   89
  201   34   73   86
  202   72   89   96
  203   73   93   94
  以PBS对照＝0％抑制作用为基准
还测定了化合物在大鼠血浆中的半衰期。利用一氯化碘法，将化合物用125I标记。Contreras等，1983，《酶学方法》(Methods inEnzymology)92：277-292。i.v.注射标记后的化合物，在24h内定期采集血浆样本。利用Packard Instruments Cobra型γ计数器(Downers Grove，IL)检测血浆中的药物含量。利用WinNonLin软件(Pharsight Corp.，Mountain View，CA)计算药动学参数，利用公式t1/2＝0.693(MRT)测定血浆半衰期。结果如下表2所示。
表2：化合物在大鼠血浆中的半衰期(小时)
 204   8
 200   20.2
 201   9.8
 205   14
 202   18.4
 203   20

Claims (105)

1、具有下式结构的化合价平台分子，选自下组：
             Rc[O-C(＝O)-NR1-G2-(ONH2)n]y；
             Rc[C(＝O)-NR1-G2-(ONH2)n]y；
             Rc[NR1-C(＝O)-G2-(ONH2)n]y；
             Rc[NR1-C(＝O)-O-G2-(ONH2)n]y；
             Rc[R1C＝N-O-G2-(ONH2)n]y；和
             Rc[S-G2(ONH2)n]y；
其中：
y是1至16；
n是1至32；
R1是H、烷基、杂烷基、芳基、杂芳基或G2-(ONH2)n；
Rc和每个G2独立地是有机部分，包含选自H、C、N、O、P、Si和S原子的原子，和
其中化合价平台分子包含至少4个末端氨氧基。
2、权利要求1的化合价平台分子，其中Rc和每个G2独立地包含直链、支链或环状结构，并选自下组：
烃基，仅由H和C原子组成，并且具有1至5000个碳原子；
有机基团，仅由碳、氧和氢原子组成，并且具有1至5000个碳原子；
有机基团，仅由碳、氧、氮和氢原子组成，并且具有1至5000个碳原子；
有机基团，仅由碳、氧、硫和氢原子组成，并且具有1至5000个碳原子；和
有机基团，仅由碳、氧、硫、氮和氢原子组成，并且具有1至5000个碳原子。
3、权利要求1的化合价平台分子，其中Rc选自由C1-200烃部分、C1-200烷氧基部分和包含芳族基团的C1-200烃部分组成的组。
4、权利要求1的化合价平台分子，其中Rc包含氧化烯部分。
5、权利要求4的化合价平台分子，其中Rc包含氧乙烯部分。
6、权利要求1的化合价平台分子，其中Rc包含氧乙烯单元：-(CH2CH2O)n-；其中n是1-5000。
7、权利要求1的化合价平台分子，其中G2包含官能团，选自由烷基、杂烷基、芳基和杂芳基组成的组。
8、权利要求1的化合价平台分子，其中G2包含官能团，选自由C1-200烃部分、C1-200烷氧基部分和包含芳族基团的C1-200烃部分组成的组。
9、权利要求1的化合价平台分子，其中G2包含氧化烯部分。
10、权利要求1的化合价平台分子，其中G2包含氧乙烯部分。
11、权利要求1的化合价平台分子，其中G2包含氧乙烯单元：-(CH2CH2O)n-；其中n是1-5000。
12、权利要求1的化合价平台分子，其中每个G2独立地包含选自下组的官能团：胺；酰胺；酯；醚；酮；醛；氨基甲酸酯；硫醚；哌嗪基；哌啶基；醇；聚胺；聚醚；酰肼；肼；羧酸；酸酐；卤素；磺酰基；磺酸酯；砜；亚氨酸酯；氰酸酯；异氰酸酯；异硫氰酸酯；甲酸酯；碳二亚胺；硫醇；肟；亚胺；氨基氧基；和马来酰亚胺。
13、权利要求1的化合价平台分子，具有下式结构：
            Rc[O-C(＝O)-NR1-G2-(ONH2)n]y。
14、权利要求1的化合价平台分子，具有下式结构：
            Rc[C(＝O)-NR1-G2-(ONH2)n]y。
15、权利要求1的化合价平台分子，具有下式结构：
            Rc[NR1-C(＝O)-G2-(ONH2)n]y。
16、权利要求1的化合价平台分子，具有下式结构：
            Rc[NR1-C(＝O)-O-G2-(ONH2)n]y。
17、权利要求1的化合价平台分子，具有下式结构：
            Rc[R1C＝N-O-G2-(ONH2)n]y。
18、权利要求1的化合价平台分子，具有下式结构：
            Rc[S-G2(ONH2)n]y。
19、包含权利要求1-18任一项的两个或多个化合价平台分子的组合物，其中该化合价平台分子的多分散性小于1.2。
20、权利要求1的化合价平台分子，其中每个G2-ONH2独立地选自下组：
Figure A2005101161170005C1
Figure A2005101161170005C2
和
Figure A2005101161170005C3
21、权利要求1的化合价平台分子，具有选自下式的结构：
Figure A2005101161170006C1
和
Figure A2005101161170006C2
其中n是1至100。
22、权利要求21的化合价平台分子，其中G2包含氧乙烯基。
23、具有下列结构的化合价平台分子：
Figure A2005101161170007C1
其中n是503；或
其中n是481。
24、具有下式结构的化合价平台分子：
Figure A2005101161170007C3
其中n是112。
25、权利要求1的分子与一个或多个生物活性分子的轭合物。
26、权利要求21的分子与一个或多个生物活性分子的轭合物。
27、权利要求23的分子与一个或多个生物活性分子的轭合物。
28、权利要求24的分子与一个或多个生物活性分子的轭合物。
29、权利要求25或26的轭合物，其中生物活性分子选自寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体、糖、多糖、表位、mimotope、酶、激素、药物、核酸、脂质、脂肪酸和它们的混合物。
30、权利要求29的轭合物，其中生物活性分子包括第1结构域β2GPI多肽。
31、权利要求30的轭合物，其中多肽缺乏T细胞表位。
32、权利要求30的轭合物，其中轭合物包含将第1结构域β2GPI多肽连接到化合价平台分子上的连接剂。
33、权利要求29的轭合物，其中生物活性分子包括一种与抗αGal抗体特异性结合的αGal表位或其类似物。
34、权利要求1的化合价平台分子，具有下式的结构：
其中(CH2CH2O)n部分具有20Kg/mol的分子量。
35、权利要求34的分子与一个或多个生物活性分子的轭合物。
36、权利要求35的轭合物，其中生物活性分子选自寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体、糖、多糖、表位、mimotope、酶、激素、药物、核酸、脂质、脂肪酸和它们的混合物。
37、权利要求36的轭合物，其中生物活性分子包括第1结构域β2GPI多肽。
38、权利要求37的轭合物，其中多肽缺乏T细胞表位。
39、权利要求37的轭合物，其中轭合物包含将第1结构域β2GPI多肽连接到化合价平台分子上的连接剂。
40、权利要求36的轭合物，其中生物活性分子包括一种与抗αGal抗体特异性结合的αGal表位或其类似物。
41、权利要求1的化合价平台分子，具有下式的结构：
Figure A2005101161170009C1
其中(CH2CH2O)n部分具有20Kg/mol的分子量。
42、权利要求41的分子与一个或多个生物活性分子的轭合物。
43、权利要求42的轭合物，其中生物活性分子选自寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体、糖、多糖、表位、mimotope、酶、激素、药物、核酸、脂质、脂肪酸和它们的混合物。
44、权利要求43的轭合物，其中生物活性分子包括第1结构域β2GPI多肽。
45、权利要求44的轭合物，其中多肽缺乏T细胞表位。
46、权利要求44的轭合物，其中轭合物包含将第1结构域β2GPI多肽连接到化合价平台分子上的连接剂。
47、权利要求43的轭合物，其中生物活性分子包括一种与抗αGal抗体特异性结合的αGal表位或其类似物。
48、权利要求1的化合价平台分子，具有下式的结构：
Figure A2005101161170010C1
其中(CH2CH2O)n部分具有5Kg/mol的分子量。
49、权利要求48的分子与一个或多个生物活性分子的轭合物。
50、权利要求49的轭合物，其中生物活性分子选自寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体、糖、多糖、表位、mimotope、酶、激素、药物、核酸、脂质、脂肪酸和它们的混合物。
51、权利要求50的轭合物，其中生物活性分子包括第1结构域β2GPI多肽。
52、权利要求51的轭合物，其中多肽缺乏T细胞表位。
53、权利要求51的轭合物，其中轭合物包含将第1结构域β2GPI多肽连接到化合价平台分子上的连接剂。
54、权利要求50的轭合物，其中生物活性分子包括一种与抗αGal抗体特异性结合的αGal表位或其类似物。
55、权利要求13的化合价平台分子，其中：
Rc是C(CH2-)4；
R1是H；
n是1；
y是4；
其中G2包含-(CH2CH2O)p-，其中p是2-500；和
其中G2进一步包含酰胺部分和末端氨氧基部分。
56、权利要求13的化合价平台分子，其中：
Rc是C(CH2-)4；
R1是H；
n是1；
y是4；
其中G2包含-(CH2CH2O)p-，其中p是200-500；和
其中G2进一步包含酰胺部分和末端氨氧基部分。
57、权利要求1的化合价平台分子，具有下式的结构：
Figure A2005101161170012C1
其中n是200-500。
58、包含权利要求55、56或57任一项的化合价平台分子与一个或多个生物活性分子的轭合物。
59、权利要求58的轭合物，其中生物活性分子选自寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体、糖、多糖、表位、mimotope、酶、激素、药物、核酸、脂质、脂肪酸和它们的混合物。
60、权利要求59的轭合物，其中生物活性分子包括第1结构域β2GPI多肽。
61、权利要求60的轭合物，其中多肽缺乏T细胞表位。
62、权利要求60的轭合物，其中轭合物包含将第1结构域β2GPI多肽连接到化合价平台分子上的连接剂。
63、权利要求59的轭合物，其中生物活性分子包括一种与抗αGal抗体特异性结合的αGal表位或其类似物。
64、权利要求25的轭合物的制备方法，包括将生物活性分子共价结合到化合价平台分子上，这样形成肟键或其修饰形式。
65、权利要求64的方法，其中修饰的肟键是还原的或烷基化的肟键。
66、权利要求64的方法，其中化合价平台分子包含氨氧基，和生物活性分子包含反应性官能团，这样通过将生物活性分子结合到化合价平台分子上形成肟键。
67、权利要求66的方法，其中反应性官能团是醛或酮部分的羰基。
68、权利要求67的方法，其中生物活性分子包括多肽，并且其中该方法包括在化合价平台分子上结合氨基氧基之前修饰多肽，这样使得多肽包含末端的醛基。
69、权利要求1的化合价平台分子，具有下式的结构：
Figure A2005101161170013C1
其中每个(CH2CH2O)n部分具有小于10Kg的分子量。
70、权利要求6的化合价平台分子，其中n是1-500。
71、包含权利要求6的分子和一个或多个生物活性分子的轭合物。
72、权利要求71的轭合物，其中生物活性分子选自寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体、糖、多糖、表位、mimotope、酶、激素、药物、核酸、脂质、脂肪酸和它们的混合物。
73、权利要求72的轭合物，其中生物活性分子包括第1结构域β2GPI多肽。
74、权利要求73的轭合物，其中多肽缺乏T细胞表位。
75、权利要求73的轭合物，其中轭合物包含将第1结构域β2GPI多肽连接到化合价平台分子上的连接剂。
76、权利要求72的轭合物，其中生物活性分子包括一种与抗αGal抗体特异性结合的αGal表位或其类似物。
77、权利要求6的化合价平台分子，其中n是200-500。
78、权利要求1的化合价平台分子，其中G2包含一个由碳、氧和氢原子组成的并具有1-5000个碳原子的有机基团。
79、权利要求78的化合价平台分子，其中G2包含氧乙烯基单元：-(CH2CH2O)-；其中n是1-200。
80、权利要求78的化合价平台分子，其中G2包含氧乙烯基单元：-(CH2CH2O)-；其中n是200-500。
81、权利要求1的化合价平台分子，其中该化合价平台分子是对称的。
82、权利要求1的化合价平台分子，其中该化合价平台分子的化合价是4。
83、权利要求1、6、11或21的化合价平台分子，其中该化合价平台分子包含一种或多种二价连接剂分子，所述连接剂分子用于将生物活性分子连接到化合价平台分子上，其中连接剂分子包含氨基氧基，该氨基氧基未被保护或被氨基氧基保护基团保护，并且其中所述二价连接剂分子结合到化合价平台分子上，这样使得在二价连接剂分子和化合价平台分子之间形成连接键。
84、权利要求83的化合价平台分子，其中形成的连接键选自酰胺键、氨基甲酸酯键、硫醚键和肟键。
85、权利要求84的化合价平台分子，其中通过使化合价平台分子与二价连接剂分子反应形成连接键，其中二价连接剂分子包含选自氨、碳酸酯、硫醇、氨基氧基和羧酸的官能团部分。
86、权利要求1的化合价平台分子，其中该化合价平台分子是树状的。
87、权利要求2的化合价平台分子，其中Rc和每个G2独立地包含一个直链、支链或环状结构，并且独立地选自：
只由H和C组成的并且具有1-500个碳原子的烃基；
只由C、O和H原子组成的并且具有1-500个碳原子的有机基团；
只由C、O、N和H原子组成的并且具有1-500个碳原子的有机基团；
只由C、O、S和H原子组成的并且具有1-500个碳原子的有机基团；和
只由C、O、S、N和H原子组成的并且具有1-500个碳原子的有机基团。
88、包含权利要求15的化合价平台分子和一个或多个生物活性分子的轭合物。
89、权利要求88的轭合物，其中生物活性分子选自寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体、糖、多糖、表位、mimotope、酶、激素、药物、核酸、脂质、脂肪酸和它们的混合物。
90、权利要求89的轭合物，其中生物活性分子包括第1结构域β2GPI多肽。
91、权利要求90的轭合物，其中多肽缺乏T细胞表位。
92、权利要求90的轭合物，其中轭合物包含将第1结构域β2GPI多肽连接到化合价平台分子上的连接剂。
93、权利要求89的轭合物，其中生物活性分子包括一种与抗αGal抗体特异性结合的αGal表位或其类似物。
94、药物组合物，包含权利要求25-28、29-33和35-40任一项的轭合物和药学上可接受的载体。
95、包含权利要求14的化合价平台分子和一个或多个生物活性分子的轭合物。
96、权利要求95的轭合物，其中生物活性分子选自寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体、糖、多糖、表位、mimotope、酶、激素、药物、核酸、脂质、脂肪酸和它们的混合物。
97、权利要求96的轭合物，其中生物活性分子包括一种与抗αGal抗体特异性结合的αGal表位或其类似物。
98、权利要求96的轭合物，其中生物活性分子包括第1结构域β2GPI多肽。
99、包含两种或多种权利要求20-24、34、41、48、55-57、69、70和77-87中任一项的化合价平台分子的组合物，其中该化合价平台分子的多分散性小于1.2。
100、权利要求1-18、20-24、34、41、48、55-57、69、70和77-87中任一项的化合价平台分子，其中该化合价平台分子的化合价是4。
101、权利要求25-28、29、36、43、50、59、72、89和96中任一项的轭合物，其中生物活性分子包括多肽。
102、权利要求25-28、29、36、43、50、59、72、89和96中任一项的轭合物，其中生物活性分子包括核酸。
103、权利要求25-28、29、36、43、50、59、72、89和96中任一项的轭合物，其中生物活性分子包括寡核苷酸。
104、权利要求101的轭合物，其中多肽缺乏T细胞表位。
105、权利要求36的化合价平台分子，其中n是1-500。
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