CN1434726A - 包含高分子量聚环氧乙烷的多价平台分子 - Google Patents

包含高分子量聚环氧乙烷的多价平台分子 Download PDF

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Abstract

本发明提供了包含高分子量聚环氧乙烷基团的化合价平台分子及其与生物学活性分子的缀合物以及它们的制备方法。高分子量聚环氧乙烷基团的分子量为例如大于22,000道尔顿，例如至少40,000道尔顿。在一种实施方式中，提供了包含化合价平台分子的组合物，其中该分子的多分散性小于约1.2。还提供了化合价平台分子与生物学活性分子的缀合物，所述生物学活性分子是例如糖、多(糖)、氨基酸、多(氨基酸)、核酸或脂质。还提供了包含如本文所公开的缀合物和药学上可接受的载体的药学上可接受的组合物以及制备和使用这些缀合物和组合物的方法。

Description

包含高分子量聚环氧乙烷的多价平台分子
                  相关申请的交叉参考
本申请要求2000年6月8日提交的美国临时申请系列号60/210,439的优先权，其公开内容结合在此作为参考。
                     技术领域
本申请涉及包含聚环氧乙烷基团的化合价平台分子，一个或多个分子、例如生物学活性分子可以与之结合构成缀合物。
                       背景技术
“化合价平台”是具有一个或更多(通常为多个)结合位点的分子，这些位点可以用于共价结合有关生物学活性分子至共同的支架。将生物学活性分子结合于共同的支架可提供多价的缀合物，其中多个生物学活性分子副本共价连接在同一平台上。“确定的”或“化学上确定的”化合价平台是具有确定结构、从而具有确定数量的结合点和确定的化合价的平台。确定的化合价平台缀合物是具有确定结构的缀合物，并且结合有确定数量的生物学活性化合物。生物学活性分子的实例包括寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体、糖、多糖、表位、模拟表位、药物等。例如，生物学活性化合物可以特异性地相互作用于蛋白质受体。
某些种类的化学上确定的化合价平台、它们的制备方法、包含它们的缀合物和这类缀合物的制备方法已经描述在美国专利号5,162,515、5,391,785、5,276,013、5,786,512、5,726,329、5,268,454、5,552,391、5,606,047和5,663,395中。包含氨基甲酸酯键的化合价平台分子描述在美国临时专利申请系列号60/111,641、1999年12月8日提交的U.S.系列号09/457,607和WO 00/34231中。包含氨基氧基的化合价平台分子描述在1999年6月8日提交的美国临时专利申请号60/138,260和PCT/US00/15968中。
聚乙二醇缀合物描述在例如1999年9月16日公布的PCT WO99/45964、美国专利号5,672,662、美国专利号5,932,462、PCT WO99/34833、PCT WO 95/34326和美国专利号5,990,237中。包括线性与树状嵌段的聚醚共聚物描述在Gitsov等，Angew Chem.Int.Ed.Engl.，1992，31：1200-1203中。作为抗癌药阿霉素载体的聚乙二醇多嵌段共聚物描述在Pechar等，Bioconjugate Chem.(生物缀合物化学)，11：131-139(2000)中。用于携带和释放多个肽副本的聚乙二醇共聚物描述在Huang等，Bioconjugate Chem.(生物缀合物化学)，9：612-617(1998)中。聚乙二醇共聚物和它们与DNA的自体组装描述在Choi等，J.Am.Chem.Soc.(美国化学会志)，122：474-480(2000)中。含有叶酸残基的聚醚树状化合物描述在Kono等，Bioconjugate Chemistry，(生物缀合物化学)10：1115-1121(1999)中。
多肽的直接PEG化作用一般是通过结合于赖氨酸的氨基或其他侧链官能团而进行的。这经常生成产物的异种混合物，并且可以引起生物活性的丧失。因此，需要生成生物学活性分子与聚环氧乙烷基团的多价缀合物的改进方法。
                         发明的公开
本发明提供了包含至少一个高分子量聚环氧乙烷基团的化学上确定的化合价平台分子。该化合价平台分子可以包含例如至少2、3、4个或更多高分子量聚环氧乙烷基团。高分子量聚环氧乙烷基团的分子量为例如大于18,000道尔顿；大于22,000道尔顿；大于40,000道尔顿；大于50,000道尔顿；大于80,000道尔顿；大于100,000道尔顿或者至少为40,000道尔顿。
在一种实施方式中，在化合价平台分子中，高分子量聚环氧乙烷基团具有下式：
                   -(CH2CH2O)n-
其中n大于500；n大于400；n大于500；n大于600；n大于700；或n大于800。
在一种实施方式中，化合价平台分子包含一个核心基团和至少三条臂，其中每条臂包含一个末端。核心基团和/或臂可以包含高分子量聚环氧乙烷基团。高分子量聚环氧乙烷基团也可以结合于核心或臂。
在一种实施方式中，提供了包含如本文所公开的化合价平台分子的组合物，其中这些分子的多分散性小于1.2。
在一种实施方式中，化合价平台分子可以包含至少三个反应性缀合基团，例如羟基、硫醇、异氰酸酯、异硫氰酸酯、胺、烷基卤化物、烷基汞卤化物、醛、酮、羧酸卤化物、α-卤代羰基、α，β-不饱和羰基、卤代甲酸酯、羧酸、羧酸酯、羧酸酐、O-酰基异脲、酰肼、马来酰亚胺、亚氨酸酯、磺酸酯、磺酰卤、α，β-不饱和砜、氨基氧基、氨基脲或β-氨基硫醇。在一种实施方式中，化合价平台分子包含至少3个氨基氧基和/或至少3个氨基甲酸酯基。
在一种实施方式中，提供了如本文所公开的化合价平台分子与一个或多个、例如3个或多个生物学活性分子的缀合物，所述生物学活性分子为例如糖、多糖、氨基酸、多(氨基酸)、核酸或脂质。在一种实施方式中，缀合物是B细胞耐受原。
在一种实施方式中，生物学活性分子是核酸或其类似物，该缀合物可有效降低抗双链DNA抗体的水平，例如用于治疗或减轻狼疮。在另一种实施方式中，生物学活性分子是包含β2GPI结构域1多肽的多肽或其类似物，该缀合物可有效降低抗磷脂(aPL)抗体的水平和/或治疗例如与抗磷脂综合征有关的疾病，例如抗体介导的血栓形成。在一种实施方式中，生物学活性分子是αGal表位或其类似物，它特异性地结合抗αGal抗体；并且，任选地，该缀合物可有效诱导异种移植中的免疫耐受性。
在一种实施方式中，生物学活性分子是T细胞依赖性免疫原的类似物，其中该类似物可特异性结合B细胞上与T细胞依赖性免疫原特异性结合的表面抗体，并且该缀合物缺乏能够激活所述个体T细胞的T细胞表位。
本发明还提供了药学上可接受的组合物，其包含如本文所公开的缀合物和药学上可接受的载体。
本发明的进一方面是在需要接受治疗的个体中治疗抗体介导的疾病或其他病症的方法，该方法包括对该个体给以有效量的缀合物，其中，任选地，该缀合物可特异性结合与抗体介导的疾病有关的抗体。
本发明的另一方面是在个体中诱导对免疫原无反应性的特异性B细胞的方法，该方法包括对该个体给以有效量的缀合物。
本发明的另一方面是在个体中治疗抗体介导的病变的方法，其中，在病变中产生响应于免疫原的不需要的抗体，该方法包括对该个体给以有效量的缀合物。
在一种实施方式中，优选缀合物的总分子量不大于例如约200,000道尔顿，以便缀合物能有效充当功能性耐受原而不充当T细胞不依赖的免疫原。
本发明还提供了组合物和它们的使用方法，其中该组合物包含含有高分子量聚环氧乙烷基团的化合价平台分子，其中组合物中化合价平台分子中聚环氧乙烷基团的平均分子量为例如大于约18,000、大于约20,000、大于约22,000、大于约30,000、大于约40,000、大于约50,000或大于约100,000道尔顿。
本发明还提供了化学上确定的化合价平台分子，其包含联合具有高分子量的聚环氧乙烷基团。还提供了组合物和它们的使用方法，其中该组合物包含含有联合具有高分子量的聚环氧乙烷基团的化合价平台分子，组合物中化合价平台分子上联合聚环氧乙烷基团的平均分子量为例如大于约18,000、大于约20,000或例如大于约22,000道尔顿。
还提供了包含化合价平台分子的组合物和它们的使用方法，其中该化合价平台分子包含至少一个高分子量聚环氧乙烷基团；其中该分子的多分散性小于约1.2；其中该组合物中高分子量聚环氧乙烷基团的平均分子量至少是约18,000。
还提供了化学上确定的化合价平台分子与包含β2GPI结构域1多肽之多肽的缀合物，其中该缀合物包含至少一个高分子量聚环氧乙烷基团。高分子量聚环氧乙烷基团的分子量为例如大于22,000道尔顿。在一种实施方式中，多肽可特异性地结合β2GPI依赖性抗磷脂抗体，并且可任选地缺乏能够激活具有β2GPI依赖性抗磷脂抗体的个体T细胞的T细胞表位。
在缀合物中，β2GPI结构域1多肽包含例如图19(SEQ ID NO：2)的至少五个相邻氨基酸或图19(SEQ ID NO：2)的氨基酸Nos.2-63。缀合物是例如图7所示的化合物200、202、203或205，或图16所示的化合物300，其中所述结构中的D1是例如由SEQ ID No：2的氨基酸No.2-63组成的多肽。
本发明的进一方面是用于制备上述缀合物的方法，包括：使生物学活性分子与化学上确定的化合价平台分子共价结合，生成缀合物。
在一种实施方式中，提供了如本文所公开的缀合物，其中该缀合物适合于在患有抗体介导的病变的个体中诱导对与所述病变有关的T细胞依赖性免疫原无反应性的特异性B细胞，该缀合物包含优选无免疫原性的本文所述化合价平台分子和免疫原的至少两个相似分子，其中(a)相似分子可特异性结合B细胞上与T细胞依赖性免疫原特异性结合的表面抗体，(b)缀合物缺乏能够激活所述个体中T细胞的T细胞表位。相似分子可以是例如肽、多肽、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、糖、脂质或脂多糖。
在另一种实施方式中，提供了包含化合价平台分子的组合物，该化合价平台分子包含高分子量聚环氧乙烷基团，其中该聚环氧乙烷基团的平均分子量大于约18,000、大于约20,000或大于约22,000。
                       附图的简要说明
图1是显示化合物8合成的反应流程。
图2是显示化合物11合成的反应流程。
图3是显示化合物17合成的反应流程。
图4是显示化合物23合成的反应流程。
图5显示包含高分子量聚环氧乙烷基团的示例性化合价平台分子缀合物。
图6显示包含高分子量聚环氧乙烷基团的示例性化合价平台分子缀合物。
图7显示包含聚环氧乙烷基团的示例性化合价平台分子缀合物。
图8显示包含氨基氧基和聚环氧乙烷基团的化合价平台分子的结构式。
图9显示包含不同分子量的聚环氧乙烷基团的多价平台分子的合成流程。
图10显示包含聚环氧乙烷基团和臂的多价平台分子的合成流程。
图11显示化合物132的合成流程。
图12显示化合物136的合成流程。
图13显示化合物143的合成流程。
图14显示示例性八聚bPEG平台的合成，其中n例如是113或以上，例如500或以上。
图15显示包含两个聚环氧乙烷基团的化合价平台分子的合成，其中n例如是500或以上。
图16显示示例性缀合物300的结构。
图17是化合物303和306的合成流程。
图18显示一些示例性缀合物309和310的结构。
图19描绘β2GPI结构域1的核苷酸(SEQ ID NO：1)和氨基酸(SEQID NO：2)序列。横线下的数字表示氨基酸的位置。
图20是显示合成转氨基多肽的流程。
                     实施发明的方式
本发明提供了包含高分子量聚环氧乙烷基团的化合价平台分子和其与生物学活性分子的缀合物以及它们的合成与使用方法。还提供了药学上可接受的组合物，该组合物包含如本文所公开的缀合物，且该缀合物任选地存在于药学上可接受的载体中。
在包含高分子量聚环氧乙烷基团与生物学活性分子的化合价平台分子复合物中，在优选的实施方式中有利的是，聚环氧乙烷基团没有直接结合在生物学活性分子例如多肽上。有利的是，聚环氧乙烷基团直接结合在平台而非蛋白质或其他试剂上，从而潜在地减少干扰结合的可能。选定分子量或分子量范围的聚环氧乙烷与平台的结合是十分确定的，从而生物学活性分子与包含高分子量聚环氧乙烷基团的化合价平台分子的缀合物也是均一和十分确定的。
本文所公开的化合价平台分子包含一个或多个高分子量聚环氧烷基团。化合价平台分子上聚环氧烷基团的存在也能够有利地延长血清半衰期，提高与之缀合的生物学活性分子的活性。在本文所述的实施方式中使用了术语聚环氧乙烷，但在本发明范围内还包括其他聚环氧烷，例如聚环氧丙烷。
药学上可接受的组合物
本发明提供了包含高分子量聚环氧乙烷的药学上可接受的化合价平台分子和其与生物学活性分子的缀合物以及它们的合成与使用方法。还提供了药学上可接受的组合物，该组合物包含如本文所公开的分子和缀合物，且该分子和缀合物任选地存在于药学上可接受的载体中。
本领域描述过用于不同给药途径、包括口服、静脉内和气雾剂给药的载体，例如＂Remington：The Science and Practice of Pharmacy＂(药学科学与实践)Mack Publishing Company，Pennsylvania，1995，其公开的内容结合在此作为参考。载体可以包括例如水、糖、多糖、缓冲剂、赋形剂和生物可降解的聚合物，例如聚酯、聚酐、聚氨基酸和脂质体。
药学上可接受的组合物是适合于对个体给药形式的组合物，例如以单元剂型、无菌的肠胃外溶液或悬液、无菌的非肠胃外溶液或口服溶液或悬液、水包油型或油包水型乳剂等对个体全身或局部给药。
聚环氧乙烷
在一种实施方式中，化合价平台分子包含一个或多个聚环氧乙烷基团，其分子量例如大于约5,000、大于约10,000、大于约15,000或大于约20,000。聚环氧乙烷基团的分子量可以是例如约5,000至10,000、约8,000至20,000、约10,000至20,000或约15,000至20,000。
在包含化合价平台分子的组合物中，化合价平台分子中聚环氧乙烷基团的分子量可以是聚环氧乙烷基团的平均分子量，因为可以存在分子量的分布。优选分子量的分布窄。本文所公开的分子量在一种实施方式中指包含化合价平台分子的组合物的平均分子量。
在优选的实施方式中，化合价平台分子包含至少一个高分子量聚环氧乙烷基团。化合价平台分子还可以包含多个高分子量聚环氧乙烷基团，例如2个、3个或更多。或者，高分子量聚环氧乙烷可以以大量不同的聚环氧乙烷基团的形式存在于平台上的不同位置，它们联合具有高分子量。联合的高分子量可以是例如大于约18,000、大于约20,000或者大于例如约22,000。
本文所用的术语“高分子量聚环氧乙烷”基团指分子量大于约18,000、大于约20,000或者例如大于约22,000道尔顿的聚环氧乙烷基团。分子量可以是例如约20,000-22,000或约18,000-22,000。
例如，高分子量聚环氧乙烷可以是具有下式的基团：
-(CH2CH2O)n-
其中n例如大于约400、大于约450、大于约500或大于约550。例如，n是约400-550、520-600、550-700、600-800、600-900或600-1000或以上。在另一种实施方式中，n是至少约600、至少约700、至少约800、至少约900或至少约1000。
高分子量聚环氧乙烷基团的分子量例如可以大于约25,000、大于约30,000或大于约40,000道尔顿。高分子量聚环氧乙烷基团的分子量进一步可以大于约50,000，例如约50,000至100,000或以上，例如约50,000至100,000。
在某些实施方式中，化合价平台分子包括核心基团和大量从核心延伸出的臂，其中所述的臂包含一个末端。例如参见图14-16。任选地，臂还可以分支，以增加末端的数量。高分子量聚环氧乙烷基团可以存在于核心或者一条或多条臂中，或者可以结合于化合价平台分子上。例如，化合价平台分子可以具有下式：
Rc[G1AG2]y    式20
其中Rc代表核心，A代表两条或更多条臂，其中Rc和A相互独立地是有机部分，并且Rc和A至少有一个包含高分子量聚环氧乙烷；
G1如果存在的话，是有机部分；
G2如果存在的话，是有机部分，例如包含反应性缀合基团；且
y是2或以上，例如3、4、5、6、7、8、16或以上。
因此，化合价平台分子的核心基团或其中的一条臂可以包含聚环氧乙烷基团，或者聚环氧乙烷基团可以任选地结合于化合价平台分子上的选定位置，例如核心或一条或更多条臂上。优选地，臂上含有用于结合生物学活性分子的末端。化合价平台分子还可以包含分支基团以增加臂的数量，并因此增加平台分子末端的数量。
分子量为例如约10,000至40,000道尔顿的聚环氧乙烷基团可以用于适当延长血浆半衰期。
化合价平台
可以合成各种本领域已知的化合价平台分子，以包括如本文所公开的高分子量聚环氧乙烷基团。用于制备化合价平台分子的方法描述在例如美国专利号5,162,515、5,391,785、5,276,013、5,786,512、5,726,329、5,268,454、5,552,391、5,606,047、5,663,395和5,874,409以及U.S.系列号60/111,641和PCT US97/10075中。一般而言，这些平台含有核心基团或分支的核心基团，它们可以终止于例如羟基、硫醇、羧基、氨基、醛、酮、烷基卤化物或氨基氧基，其任选地可以进一步被修饰，以提供预选的反应性缀合基团，以便选定的分子进一步与之结合。优选地，化合价平台分子包含至少三个反应性缀合基团。反应性缀合基团的实例包括羟基、硫醇、异氰酸酯、异硫氰酸酯、胺、烷基卤化物、烷基汞卤化物、醛、酮、羧酸卤化物、α-卤代羰基、α，β-不饱和羰基、卤代甲酸酯、羧酸、羧酸酯、羧酸酐、O-酰基异脲、酰肼、马来酰亚胺、亚氨酸酯、磺酸酯、磺酰卤、α，β-不饱和砜、氨基氧基、氨基脲和β-氨基硫醇。
化合价平台是从含有所需化合价的核心基团制备的，或者可以通过用带有分支的部分衍生末端官能团来增加核心基团的化合价。
本领域已知用于制备化合价平台分子的方法包括例如增殖法或分段法。可以使用适当的试剂修饰这些方法，可以提供所需的化合价。
本发明一方面提供了基本上单分散的化合价平台分子。化合价平台分子有利地具有窄的分子量分布。化合价平台分子样本的分子量分布宽度的量度是样本的多分散性。多分散性用作聚合物样本的分子量均一性或非均一性的量度。多分散性是这样计算的：用重均分子量(Mw)除以数均分子量(Mn)。对于极佳的单分散聚合物，Mw/Mn的值是一致的。多分散性(Mw/Mn)可用本领域已知的方法例如凝胶渗透色谱法测得。化合价平台分子样本的多分散性(Mw/Mn)优选小于2，更优选小于1.5，或小于1.2、小于1.07、小于1.02，或者例如约1.05至1.5或约1.05至1.2。典型的聚合物一般具有2-5的多分散性，或者在有些情况下为20或以上。化合价平台分子的低多分散性的优点包括生物相容性和生物利用度提高了，因为分子基本上是大小均匀的，由分子量的广泛差异引起的生物活性差异也最小化了。低多分散性分子从而在药学上最适合配制，容易分析。此外还控制了样本中分子群体的化合价。
在包含包含高分子量聚环氧乙烷基团的化合价平台分子的组合物中，组合物中化合价平台分子上聚环氧乙烷基团的平均分子量为例如大于约18,000、大于约20,000或者例如大于约22,000道尔顿。
在包含包含联合具有高分子量的聚环氧乙烷基团的化合价平台分子的组合物中，组合物中化合价平台分子上聚环氧乙烷基团的联合平均分子量为例如大于约18,000、大于约20,000或者例如大于约22,000道尔顿。
在某些实施方式中，由于连续分支点的存在，化合价平台分子可能被描述为“树状的”。树状化合价平台分子具有多个末端，通常为4个或更多末端，例如8个末端或16个末端。
请注意本文所公开的结构式打算涵盖对称的和不对称的化合价平台。参见例如图14中的对称分子M和图16中的不对称分子300。
利用下列详细说明和实施例所述方法，使用适当的原料和试剂，可以容易地向化合价平台内掺入高分子量聚环氧乙烷基团，以便使聚环氧乙烷单位在分子内部，例如在核心中或者在一个或多个从核心延伸出的臂中，或者经由分子上的反应性基团结合于化合价平台分子。
示例性化学上确定的化合价平台分子
可以使用根据它们的化学结构、化合价、均一性和定义的化学性质而定义的化合价平台分子，所述化学性质适于和适当的生物和/或化学分子有效的结合。
适合用于本发明的化学上确定的非聚合化合价平台分子包括但不限于如下结构式的生物学相容的无免疫原性含碳化合物：
G[1]{T[1]}n[1]                                 式1a
G[2]{L[2]-J[2]-Z[2](T[2])p[2]}n[2]       式2a
其中
G[1]和G[2](如果存在的话)彼此独立地是直链、支链或多分支的链，包含1-2000或10,000或更多选自C、N、O、Si、P和S的链原子；
更优选地，G[2](如果存在的话)是从多元醇、聚胺或聚乙二醇衍生的原子团；例如，G[2]选自-(CH2)q-，其中q＝0至20；-CH2(CH2OCH2)rCH2-，其中r＝0至300和C(CH2OCH2CH2-)s(OH)4-s，其中s＝1至4，更优选地s＝3至4；
n[1]个T[1]所示部分中的每一个和p[2]×n[2]个T[2]所示部分中的每一个分别独立地选自NHRSUB(胺)、C(＝O)NHNHRSUB(酰肼)、NHNHRSUB(肼)、C(＝O)OH(羧酸)、C(＝O)OR酯(活化的酯)、C(＝O)OC(＝O)RB(酸酐)、C(＝O)X(酰卤)、S(＝O)2X(磺酰卤)、C(＝NRSUB)ORSUB(亚氨酸酯)、NCO(异氰酸酯)、NCS(异硫氰酸酯)、OC(＝O)X(卤代甲酸酯)、C(＝O)OC(＝NRSUB)NHRSUB(碳二亚胺加合物)、C(＝O)H(醛)、C(＝O)RB(酮)、SH(巯基或硫醇)、OH(醇)、C(＝O)CH2X(卤代乙酰基)、RALKX(烷基卤化物)、S(＝O)2ORALKX(烷基磺酸酯)、NR1R2，其中R1R2是-C(＝O)CH＝CHC(＝O)-(马来酰亚胺)、C(＝O)CRB＝CRB 2(α，β-不饱和羰基)、RALK-Hg-X(烷基汞)和S(＝O)CRB＝CRB 2(α，β-不饱和砜)；
在一种实施方式中，n[1]个T[1]所示部分中的每一个和p[2]×n[2]个T[2]所示部分中的每一个分别独立地选自NHRSUB(胺)、C(＝O)CH2X(卤代乙酰基)、RALKX(烷基卤化物)、S(＝O)2ORALKX(烷基磺酸酯)、NR1R2，其中R1R2是-C(＝O)CH＝CHC(＝O)-(马来酰亚胺)、C(＝O)CRB＝CRB 2(α，β-不饱和羰基)、RALK-Hg-X(烷基汞)和S(＝O)CRB＝CRB 2(α，β-不饱和砜)；
例如，n[1]个T[1]所示部分中的每一个和p[2]×n[2]个T[2]所示部分中的每一个分别独立地选自NHRSUB(胺)、C(＝O)CH2X(卤代乙酰基)、NR1R2，其中R1R2是-C(＝O)CH＝CHC(＝O)-(马来酰亚胺)和C(＝O)CRB＝CRB 2(α，β-不饱和羰基)；
在一种实施方式中，所有n[1]个T[1]所示部分和所有p[2]×n[2]个T[2]所示部分均是相同的；
其中
每个X独立地是原子数大于16且小于54的卤原子或其他良好的离去基团(也就是弱碱，例如烷基或烷基-取代的磺酸酯或硫酸酯等、芳基或芳基-取代的磺酸酯或硫酸酯等，它们在这种情况下起到类似于卤素的作用)；
每个RALK独立地是直链、支链或环状的烷基(1-20C)；
每个RSUB独立地是H、直链、支链或环状的烷基(1-20C)、芳基(6-20C)或芳烷基(7-30C)；
每个R酯独立地是N-琥珀酰亚氨基、对-硝基苯基、五氟苯基、四氟苯基、五氯苯基、2，4，5-三氯苯基、2，4-二硝基苯基、氰基甲基等，或其他活化基团，例如5-氯、8-喹诺酮、1-哌啶、N-苯并三唑等；
每个RB独立地是包含1-50个选自C、H、N、O、Si、P和S的原子的原子团；
n[2]个L[2]所示部分中的每一个(如果存在的话)独立地选自O、NRSUB和S；
n[2]个J[2]所示部分中的每一个(如果存在的话)独立地选自C(＝O)和C(＝S)；
n[1]＝1至32，更优选地，n[1]＝2至16，进而更优选地，n[1]＝2至8，最优选地，n[1]＝2至4；
n[2]＝1至32，更优选地，n[2]＝1至16，进而更优选地，n[2]＝1至8，仍更加优选地，n[2]＝1至4，最优选地，n[2]＝1至2；
p[2]＝1至8，更优选地，p[2]＝1至4，最优选地，p[2]＝1至2；
其条件是乘积n[2]×p[2]大于1且小于33；
n[2]个Z[2]所示部分中的每一个独立地是包含1-200个选自C、H、N、O、Si、P和S的原子的原子团，并且在烷基、链烯基或芳族碳原子上含有至少p[2]个官能团的结合位点；
在一种实施方式中，所有n[2]个Z[2]所示的部分是相同的；
在一种实施方式中，n[2]个Z[2]所示部分中的每一个分别独立地如选自下组的结构式所述：
Z[2]是W[3]-Y[3](结合位点)p[2]             式3a
Z[2]是W[4]-N{Y[4](结合位点)p[2]/2}2     式4a
Z[2]是W[5]-CH{Y[5](结合位点)p[2]/2}2    式5a其中
n[2]个如W[3]、W[4]或W[5]所示的部分中的每一个(如果存在的话)分别独立地是包含1-100个选自C、H、N、O、Si、P和S的原子的原子团；
n[2]个如Y[3]所示部分中的每一个、2×n[2]个如Y[4]所示部分中的每一个以及2×n[2]个如Y[5]所示部分中的每一个分别独立地是包含1-100个选自C、H、N、O、Si、P和S的原子的原子团，并且在烷基、链烯基或芳族碳原子上含有至少p[2]个(对于Y[3]而言)或p[2]/2个(对于Y[4]和Y[5]而言，其中p[2]/2是整数)官能团的结合位点；
在一种实施方式中，n[2]个如W[3]所示的部分中的每一个(如果存在的话)分别独立地选自(CH2)r、(CH2CH2O)r、NRSUB(CH2CH2O)rCH2CH2和NRSUB(CH2)rNRSUBC(＝O)，其中r＝1至10；
在一种实施方式中，n[2]个如Y[3]所示的部分中的每一个分别独立地是直链、支链或环状的烷基(1-20C)、芳基(6-20C)或芳烷基(7-30C)；最优选地，n[2]个如Y[3]所示的部分中的每一个分别独立地选自C6H4(苯基-1，4-二基)、C6H3(苯基-1，3，5-三基)和(CH2)r，其中r＝1至10；
例如，n[2]个如W[4]所示的部分中的每一个(如果存在的话)分别独立地选自(CH2)rC(＝O)和(CH2)rNRSUBC(＝O)，其中r＝1至10；
例如，2×n[2]个如Y[4]所示的部分中的每一个分别独立地选自(CH2)r、(CH2)rNRSUBC(＝O)(CH2)q、(CH2)rC(＝O)NRSUB(CH2)q、(CH2)rNRSUBC(＝O)(CH2)qNRSUBC(＝O)(CH2)r、(CH2)rC(＝O)NRSUB(CH2)qNRSUBC(＝O)(CH2)r、(CH2)rNRSUBC(＝O)(CH2CH2O)qCH2CH2和(CH2)rC(＝O)NRSUB(CH2CH2O)qCH2CH2，其中r＝1至10，更优选地，r＝2至6，q＝1至10，更优选地，q＝1至3；
在一种实施方式中，n[2]个如W[5]所示的部分中的每一个(如果存在的话)分别独立地选自(CH2)rC(＝O)NRSUB和(CH2)rNRSUBC(＝O)NRSUB，其中r＝1至10；
在一种实施方式中，2×n[2]个如Y[5]所示的部分中的每一个分别独立地选自(CH2)r和(CH2)rC(＝O)NRSUB(CH2)q，其中r＝1至10，q＝1至10。
在进一步的实施方式中，提供了包含化学上确定的非聚合化合价平台分子和生物学活性分子的缀合物。生物学活性分子在与化合价平台分子偶联之前可以与连接分子偶联。
适合的连接分子的实例是6碳硫醇，例如HAD(一种巯基-6碳链磷酸酯)和HADpS(一种巯基-6碳链硫代磷酸酯)。化学上确定的化合价平台分子是这样形成的，例如，使氨基修饰的PEG与3，5-双-(碘代乙酰氨基)苯甲酰氯(以下称为“DABA”)、3-羧基丙酰胺-N，N-二-[(6’-N’-苄酯基氨基-己基)乙酰胺]4”-硝基苯基酯(以下称为“BAHA”)、3-羧基丙酰胺-N，N-二-[(8’-N’-苄酯基氨基-3’，6’-二氧杂辛基)乙酰胺]4”-硝基苯基酯(以下称为“BAHAOX”)反应，或者使PEG-双-氯甲酸酯与N，N-二(2-[6’-N’-苄酯基氨基-己酰氨基]乙基)胺(以下称为“AHAB”)反应，生成化学上确定的化合价平台分子。
还提供了如下结构式的化学上确定的非聚合化合价平台分子：
G[6]{O-C(＝O)-NRSUB-Q[6](T[6])p[6]}n6          式6a
G[7]{O-C(＝O)-N(Q[7](T[7])p[7]/2)2}n[7]        式7a其中
G[6]和G[7](如果存在的话)分别独立地是直链、支链或多分支的链，包含1-2000或10,000或更多选自C、N、O、Si、P和S的链原子；更优选地，G[6]和G[7]分别是从多元醇、聚胺或聚乙二醇衍生的原子团；最优选地，G[6]和G[7]分别选自-(CH2)q-，其中q＝0至20；-CH2(CH2OCH2)rCH2-，其中r＝0至300和C(CH2OCH2CH2-)s(OH)4-s，其中s＝1至4，更优选s＝3至4；
n[6]×p[6]个T[6]所示部分中的每一个和n[7]×p[7]个T[7]所示部分中的每一个分别独立地选自NHRSUB(胺)、C(＝O)NHNHRSUB(酰肼)、NHNHRSUB(肼)、C(＝O)OH(羧酸)、C(＝O)OR酯(活化的酯)、C(＝O)OC(＝O)RB(酸酐)、C(＝O)X(酰卤)、S(＝O)2X(磺酰卤)、C(＝NRSUB)ORSUB(亚氨酸酯)、NCO(异氰酸酯)、NCS(异硫氰酸酯)、OC(＝O)X(卤代甲酸酯)、C(＝O)OC(＝NRSUB)NHRSUB(碳二亚胺加合物)、C(＝O)H(醛)、C(＝O)RB(酮)、SH(巯基或硫醇)、OH(醇)、C(＝O)CH2X(卤代乙酰基)、RALKX(烷基卤化物)、S(＝O)2ORALKX(烷基磺酸酯)、NR1R2，其中R1R2是-C(＝O)CH＝CHC(＝O)-(马来酰亚胺)、C(＝O)CRB＝CRB 2(α，β-不饱和羰基)、RALK-Hg-X(烷基汞)和S(＝O)CRB＝CRB 2(α，β-不饱和砜)；
更优选地，n[6]×p[6]个T[6]所示部分中的每一个和n[7]×p[7]个T[7]所示部分中的每一个分别独立地选自NHRSUB(胺)、C(＝O)CH2X(卤代乙酰基)、RALKX(烷基卤化物)、S(＝O)2ORALKX(烷基磺酸酯)、NR1R2，其中  R1R2是-C(＝O)CH＝CHC(＝O)-(马来酰亚胺)、C(＝O)CRB＝CRB 2(α，β-不饱和羰基)、RALK-Hg-X(烷基汞)和S(＝O)CRB＝CRB 2(α，β-不饱和砜)；
进而更优选地，n[6]×p[6]个T[6]所示部分中的每一个和n[7]×p[7]个T[7]所示部分中的每一个分别独立地选自NHRSUB(胺)、C(＝O)CH2X(卤代乙酰基)、NR1R2，其中R1R2是-C(＝O)CH＝CHC(＝O)-(马来酰亚胺)和C(＝O)CRB＝CRB 2(α，β-不饱和羰基)；
最优选地，所有n[6]×p[6]个T[6]所示部分和所有n[7]×p[7]个T[7]所示部分均是相同的；其中
每个X独立地是原子数大于16且小于54的卤原子或其他良好的离去基团；
每个RALK独立地是直链、支链或环状的烷基(1-20C)；
每个RSUB独立地是H、直链、支链或环状的烷基(1-20C)、芳基(1-20C)或烷芳基(1-30C)；
每个R酯独立地是N-羟基琥珀酰亚氨基、对-硝基苯氧基、五氟苯氧基或其他活化基团；
每个RB独立地是包含1-50个选自C、H、N、O、Si、P和S的原子的原子团；
n[6]＝1至32，更优选地，n[6]＝1至16，进而更优选地，n[6]＝1至8，更加优选地，n[6]＝1至4，最优选地，n[6]＝1至2；
p[6]＝1至8，更优选地，p[6]＝1至4，最优选地，p[6]＝1至2；
其条件是乘积n[6]×p[6]大于1且小于33；
n[7]＝1至32，更优选地，n[7]＝1至16，进而更优选地，n[7]＝1至8，更加优选地，n[7]＝1至4，最优选地，n[7]＝1至2；
p[7]＝1至8，更优选地，p[7]＝1至4，最优选地，p[7]＝1至2；
其条件是乘积n[7]×p[7]大于1且小于33；
n[6]个Q[6]所示部分中的每一个和2×n[7]个Q[7]所示部分中的每一个分别独立地是包含1-100个选自C、H、N、O、Si、P和S的原子的原子团，并且在烷基、链烯基或芳族碳原子上含有至少p[6]个(对于Q[6]而言)或p[7]/2个(对于Q[7]而言，其中p[7]/2是整数)官能团的结合位点；
更优选地，所有n[6]个Q[6]所示的部分均是相同的；
更优选地，所有2×n[7]个Q[7]所示的部分均是相同的；
更优选地，n[6]个Q[6]所示部分中的每一个分别独立地选自CH[(CH2)r(结合位点)]2和CH[(CH2)rC(＝O)NRSUB(CH2)q(结合位点)]2，其中r＝1至10，q＝1至10；
更优选地，2×n[7]个Q[7]所示部分中的每一个分别独立地选自(CH2)r、(CH2)rNRSUBC(＝O)(CH2)q、(CH2)rC(＝O)NRSUB(CH2)q、(CH2)rNRSUBC(＝O)(CH2)qNRSUBC(＝O)(CH2)r、(CH2)rC(＝O)NRSUB(CH2)qNRSUBC(＝O)(CH2)r、(CH2)rNRSUBC(＝O)(CH2CH2O)qCH2CH2和(CH2)rC(＝O)NRSUB(CH2CH2O)qCH2CH2，其中r＝1至10，更优选地，r＝2至6，q＝1至10，更优选地，q＝1至3。
如美国专利号5,552,391所述的这些化学上确定的平台分子可以进一步如本文所述被修饰，以包含高分子量聚环氧乙烷基团。
氨基氧基化合价平台分子
在一种实施方式中，化合价平台分子包含一个或多个高分子量聚环氧乙烷基团以及氨基氧基，例如1至100个、例如1-50、2-16、4-16个、或者例如2、3、4、8、16、32个或更多个氨基氧基。在一种实施方式中，化合价平台分子具有至少2、3、4、5个或更多个氨基氧基。氨基氧基化合价平台分子描述在1999年6月8日提交的美国临时专利申请号60/138,260中。
还提供了含有其他分子、例如生物学活性分子的缀合物和它们的合成方法。氨基氧基为其他分子的共价结合提供结合位点。分子例如可以包含至少3个氨基氧基，或者4、5个或更多氨基氧基。
在一种实施方式中，提供了具有下式的化合价平台分子：
            R-(ONH2)m               式1b
其中在一种实施方式中：
m是1-50或以上，例如3-50；
R是包含1-10,000个或更多原子的有机部分，所述原子选自H、C、N、O、P、Si和S原子；
其中化合价平台分子包含至少一个例如具有式-(CH2CH2O)n-的高分子量聚环氧乙烷基团，其中n大于500，例如500至700，或600至800，或1000或以上。
在另一种实施方式中，提供了具有下式的化合价平台分子：
           Rc[G1(ONH2)n]y              式2b
其中在一种实施方式中：
y是1至16；
n是1至32；
    其中在一种实施方式中，y*n(y乘以n)的乘积至少是3；
Rc和每个G1独立地是有机部分；
其中化合价平台分子包含至少一个例如具有式-(CH2CH2O)n-的高分子量聚环氧乙烷基团，其中n大于500，例如500至700，或600至800，或1000或以上。
在一种实施方式中，Rc和每个G1相互独立地是含有选自H、C、N、O、P、Si和S原子的原子的有机部分。例如可以在多分散性小于1.2的组合物中提供这些分子。
在另一种实施方式中，提供了具有下式的化合价平台分子，选自下组：
Rc[O-C(＝O)-NR1-G2-(ONH2)n]y               式3b；
Rc[C(＝O)-NR1-G2-(ONH2)n]y                 式4b；
Rc[NR1-C(＝O)-G2-(ONH2)n]y                 式5b；
Rc[NR1-C(＝O)-O-G2-(ONH2)n]y               式6b；
Rc[R1C＝N-O-G2-(ONH2)n]y                   式7b；和
Rc[S-G2-(ONH2)n]y                           式8b
其中，例如：
y是1至16；
n是1至32；
    其中在一种实施方式中，y*n(y乘以n)的乘积至少是3；
R1是H、烷基、杂烷基、芳基、杂芳基或G2-(ONH2)n；
Rc和每个G2独立地是含有选自H、C、N、O、P、Si和S原子的原子的有机部分；
其中化合价平台分子包含至少一个例如具有式-(CH2CH2O)n-的高分子量聚环氧乙烷基团，其中n大于500，例如500至700，或600至800，或1000或以上。
在一种实施方式中，Rc和每个G2独立地选自下组：
仅由H和C原子组成的烃基，具有1至5,000个或1至200个碳原子；
仅由碳、氧和氢原子组成的有机基团，具有1至5,000个或1至200个碳原子；
仅由碳、氧、氮和氢原子组成的有机基团，具有1至5,000个或1至200个碳原子；
仅由碳、氧、硫和氢原子组成的有机基团，具有1至5,000个或1至200个碳原子；
仅由碳、氧、硫、氮和氢原子组成的有机基团，具有1至5,000个或1至200个碳原子。
在化合价平台分子的一种实施方式中，Rc选自C1-200烃部分、C1-200烷氧基部分和包含芳族基团的C1-200烃部分。
Rc可任选地可以包含氧化烯部分，例如氧化乙烯部分(-CH2CH2O-)。在一种实施方式中，Rc包含氧化乙烯单元：
                    -(CH2CH2O)n-
其中n是1-500，例如1-200、1-100或1-20。可任选地，n大于500，例如500-700或600-800或1000或以上。
本文所用的“氧化乙烯、氧化丙烯和氧化烯”可与“环氧乙烷、环氧丙烷和环氧烷”互换使用。
在一种实施方式中，每个G2独立地包含一种选自烷基、杂烷基、芳基和杂芳基的官能团。
在另一种实施方式中，每个G2独立地包含一种选自C1-200烃部分、C1-200烷氧基部分和包含芳族基团的C1-200烃部分的官能团。
每个G2可以独立地包含氧化烯部分，例如氧化乙烯部分(-CH2CH2O-)。在一种实施方式中，每个G2独立地包含氧化乙烯单元：
                    -(CH2CH2O)n-
其中n是1-500，例如1-200、1-100或1-20。可任选地，n大于500，例如500-700或600-800或1000或以上。
在化合价平台分子的一种实施方式中，每个G2独立地包含这样一种选自胺、酰胺、酯、醚、酮、醛、氨基甲酸酯、硫醚、哌嗪基、哌啶基、醇、聚胺、聚醚、酰肼、肼、羧酸、酸酐、卤素、磺酰基、磺酸酯、砜、氰酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、甲酸酯、碳二亚胺、硫醇、肟、亚胺、氨基氧基和马来酰亚胺的官能团。
在另一种实施方式中，提供了图8所示的式9-13的化合物。式9-13中，在一种实施方式中，Rc和G2定义同上，n是约1-500，例如1-200、1-100或1-50。可任选地，n大于500，例如500-700或600-800或1000或以上。
在一种实施方式中，在式3b-8b和9-13中，Rc和G2至少有一个包含至少一个例如具有式-(CH2CH2O)n-的高分子量聚环氧乙烷基团，其中n大于500，例如500-700或600-800或1000或以上。
包含氨基甲酸酯键的化合价平台分子
在另一种实施方式中，可以修饰如PCT US99/29338和1999年12月8日提交的U.S.系列号09/47,607所述的包含氨基甲酸酯键的化合价平台分子，以包含高分子量聚环氧乙烷。
在一种实施方式中，化合价平台化合物包含氨基甲酸酯键，例如具有式Ic、IIc、IIIc、IVc、Vc和VIc所示结构，其中化合价平台化合物进一步包含至少一个高分子量聚环氧乙烷基团：式Ic
Figure A0181080700251
式IIc
Figure A0181080700252
式IIIc
Figure A0181080700253
其中：n是从1至10的正整数；y1、y2和y3独立地是1或2；J独立地表示氧原子或共价键；Rc选自：
具有1至20个碳原子的烃基；
仅由碳、氧和氢原子组成的具有1至20个碳原子的有机基团；
仅由碳、氧、氮和氢原子组成的具有1至20个碳原子的有机基团；
仅由碳、氧、硫和氢原子组成的具有1至20个碳原子的有机基团；各G1、G2和G3独立地选自：
具有1至20个碳原子的烃基；
  仅由碳、氧和氢原子组成的具有1至20个碳原子的有机基团；
  仅由碳、氧、氮和氢原子组成的具有1至20个碳原子的有机基团；
各RN独立地选自：
  氢；
  具有1至15个碳原子的直链或支链烷基；
  具有1至15个碳原子的包含脂环族结构的烷基；
  具有6至20个碳原子的芳族基团；
  具有3至20个碳原子的杂芳族基团；
各Z独立地选自：
 -H
 -C(＝O)ORCARB
  -C(＝O)R酯
 -C(＝O)NRARB
其中：
每个RCARB是含有1至约20个碳原子的有机基团；
每个R酯是含有1至约20个碳原子的有机基团；
每个基团-NRARB独立地选自：
 -NH2
 -NHRA
 -NRARB
 -NRAB
其中每个一价RA与RB和每个二价RAB独立地是包含1至20个碳原子的有机基团，并且还包含反应性结合官能团；
其中该化合价平台分子包含至少一个例如具有式-(CH2CH2O)n-的高分子量聚环氧乙烷基团，其中n大于500，例如500-700或600-800或1000或以上。
在一种实施方式中，所述化合物具有式Ic的结构。在一种实施方式中，所述化合物具有式Iic的结构。在一种实施方式中，所述化合物具有式IIIc的结构。在一种实施方式中，所述化合物具有式Ivc的结构。在一种实施方式中，n是从2至4的正整数。在一种实施方式中，y1、y2和y3各自是2。在一种实施方式中，J是氧原子。在一种实施方式中，J是共价键。在一种实施方式中，Rc选自具有1至20个碳原子的烃基。在一种实施方式中，Rc选自下组：
                  -CH2-；
                  -CH2CH2-；
                  -CH2CH2CH2-；
                    
Figure A0181080700271
和
                    
Figure A0181080700272
在一种实施方式中，Rc选自仅由碳、氧和氢原子组成的具有1至20个碳原子的有机基团。在一种实施方式中，Rc是：
其中p是从2至20的正整数。在一种实施方式中，每个G1、G2和G3独立地选自具有1至20个碳原子的烃基。在一种实施方式中，每个G1、G2和G3是-(CH2)q-，其中q是从1至20的正整数。在一种实施方式中，每个G1、G2和G3独立地选自仅由碳、氧和氢原子组成的具有1至20个碳原子的有机基团。在一种实施方式中，每个G1、G2和G3是：
其中p是从2至20的正整数。在一种实施方式中，RN独立地选自-H、-CH3和-CH2CH3。在一种实施方式中，每个基团-NRARB独立地选自：
Figure A0181080700281
和本发明的另一方面涉及化合价平台化合物，其具有下式之一的结构：式IVc
Figure A0181080700283
式Vc
Figure A0181080700284
式VIc
Figure A0181080700291
其中：
n是从1至10的正整数；
y1、y2和y3独立地是从1至10的正整数；
J独立地表示氧原子或共价键；
Rc选自下组：
  具有1至20个碳原子的烃基；
  仅由碳、氧和氢原子组成的具有1至20个碳原子的有机基团；
  仅由碳、氧、氮和氢原子组成的具有1至20个碳原子的有机基团；
  仅由碳、氧、硫和氢原子组成的具有1至20个碳原子的有机基团；
各G1、G2和G3独立地选自：
  具有1至20个碳原子的烃基；
  仅由碳、氧和氢原子组成的具有1至20个碳原子的有机基团；
  仅由碳、氧、氮和氢原子组成的具有1至20个碳原子的有机基团；各RN独立地选自：
  氢；
  具有1至15个碳原子的直链或支链烷基；
  具有1至15个碳原子的包含脂环族结构的烷基；
  具有6至20个碳原子的芳族基团；
  具有3至20个碳原子的杂芳族基团；
各Z独立地选自：
 -H
 -C(＝O)ORCARB
  -C(＝O)R酯
  -C(＝O)NRARB
其中：
每个RCARB是含有1至约20个碳原子的有机基团；
每个R酯是含有1至约20个碳原子的有机基团；
每个基团-NRARB独立地选自：
 -NH2
 -NHRA
 -NRARB
 -NRAB
其中每个一价RA与RB和每个二价RAB独立地是包含1至20个碳原子的有机基团，并且还包含反应性结合官能团；
其中该化合价平台分子包含至少一个例如具有式-(CH2CH2O)n-的高分子量聚环氧乙烷基团，其中n大于500，例如500-700或600-800或1000或以上。
在一种实施方式中，所述化合物具有式Ivc的结构。在一种实施方式中，所述化合物具有式Vc结构。在一种实施方式中，所述化合物具有式VIc结构。在一种实施方式中，n是从2至4的正整数。在一种实施方式中，y1、y2和y3各自是2。在一种实施方式中，J是氧原子。在一种实施方式中，J是共价键。在一种实施方式中，Rc选自具有1至20个碳原子的烃基。在一种实施方式中，Rc选自下组：
                    -CH2-；
                    -CH2CH2-；
                    -CH2CH2CH2-；
                       
Figure A0181080700301
和
                       
在一种实施方式中，Rc选自仅由碳、氧和氢原子组成的具有1至20个碳原子的有机基团。在一种实施方式中，Rc是：
其中p是从2至20的正整数。在一种实施方式中，每个G1、G2和G3独立地选自具有1至20个碳原子的烃基。在一种实施方式中，每个G1、G2和G3选自下组：
Figure A0181080700312
和
Figure A0181080700313
在一种实施方式中，每个G1、G2和G3独立地选自仅由碳、氧和氢原子组成的具有1至20个碳原子的有机基团。在一种实施方式中，每个RN独立地选自-H、-CH3和-CH2CH3。在一种实施方式中，每个基团-NRARB独立地选自下组：
Figure A0181080700314
式Ic、IIc、IIIc、IVc、Vc和VIc中，在一种实施方式中，Rc、G1、G2和G3中至少有一个包含至少一个例如具有式-(CH2CH2O)n-的高分子量聚环氧乙烷基团，其中n大于500，例如500-700或600-800或1000或以上。
化合价平台分子的制备
可以对本领域已知的制备化合价平台分子的方法进行修饰，以便在分子中掺入高分子量聚环氧乙烷。用于制备化合价平台分子的方法例如描述在美国专利号5,162,515；5,391,785；5,276,013；5,786,512；5,726,329；5,268,454；5,552,391；5,606,047；5,663,395和5,874,409；以及U.S.系列号60/111,641；U.S.系列号09/457,607；PCT WO 00/34231；PCTUS97/10075；U.S.系列号09/590,592和PCT/US/00/15968中。
本领域已知用于制备化合价平台分子的方法包括例如增殖法或分段法。可以使用适当的试剂修饰这些方法，以在所得分子上提供聚环氧乙烷基团。文中的实施例描述了示例性的方法。
化合价平台可以从分段法制备，在该方法中，独立地合成各片段然后将其结合于核心基团。核心增殖法的替代选择是复接法(iterativeprocess)，它可用于生成树状结构。
核心化合物的实例包括含醇的核心化合物甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇，和甲氧基聚乙二醇、单羟基胺、乙二醇、二甘醇、三甘醇、四甘醇、五甘醇、六甘醇、1，4-双-(羟甲基)苯和聚乙二醇HO(CH2CH2O)nH，其中例如n是约1-200，例如1-10或1-5，或具有两个羟基的伯胺或仲胺。核心化合物还可以是如本文所公开的高分子量聚环氧乙烷分子。
下面是化合价平台分子的示例性合成，包括高分子量聚环氧乙烷基团和其缀合物。这些实例涉及以氨基为末端的含有聚环氧乙烷的平台中间体的制备。这些氨基用适合与生物学活性分子结合的反应性基团衍生。
图1显示如何合成末端氨基被Cbz保护、核心中的氨基被Fmoc保护的四聚平台。化合物1按照美国专利号5,552,391的描述制得。除去Fmoc基团，用甲氧基-PEG链代替。除去Cbz基团，得到游离的四胺，即化合物6，使其转化为四氯乙酰基衍生物7。化合物7可以与任意含有巯基的分子反应，生成四价结合物化合物8。图1中，n是例如大于500，例如500-800或500-1000。
图2显示如何用丝氨酸修饰四胺6，得到化合物9。丝氨酸化合物9经历高碘酸盐的氧化性裂解，得到末端醛基，它可以与含有氨基氧基或其他可生成稳定亚胺的基团(酰肼、氨基脲、卡巴肼等)的生物学活性分子反应，生成11所示的肟缀合物。图2中，n是例如大于500，例如500-800或500-1000。
图3描述了如何制备PEG置于内部作为平台核心的一部分的高分子量PEG平台。在这种实施方式中，将2当量化合物13(如美国专利号5,552,391所述制备)与1当量化合物12(PEG20K-双-BTC，ShearwaterPolymers)反应制得化合物14。通过氢化或酸解作用除去Cbz保护基团，得到四胺(化合物15)。用氯乙酸酐进行氯乙酰化，得到氯乙酰化的平台(化合物16)。将化合物16用含有巯基的生物学活性分子处理，得到17，即生物学活性分子的四价平台缀合物。图3中，n是例如大于500，例如500-800或500-1000。
图4描述了如何制备PEG置于平台臂内部的高分子量PEG平台。在提到环氧乙烷的聚合物时，“PEG”或“聚乙二醇”或“聚环氧乙烷”在本文中可互换使用。用TFA除去化合物20中的Boc保护基团，将所得四胺(化合物21)用氯乙酸酐氯乙酰化，得到氯乙酰化的平台(化合物22)。将化合物22用含有巯基的生物学活性分子处理，得到23，即生物学活性分子的四价平台缀合物。图4中，n是例如大于500，例如500-800或500-1000。
如图14所示，通过这样一种过程合成bPEG八聚平台M，其中使八聚PNP碳酸酯(化合物50a)与化合物133反应，生成化合物K。除去化合物K中的Boc保护基团，将所得八胺用化合物106处理，生成化合物L。除去化合物L中的Boc保护基团，生成化合物M。
如图15所示，从已经结合有两条PEG链的中间体122合成结合有两条PEG链的四价氨基氧基平台。因此使化合物122与NHS酯O(Shearwater Polymers)反应生成平台P。
缀合物、其制备方法和用途
术语“生物学活性分子”在本文中用于表示优选具有体内生物活性的分子。例如，生物活性包括与靶结合。在一种实施方式中，生物学活性分子是特异性相互作用于受体蛋白质者。在另一种实施方式中，生物学活性分子与抗体结合，如果是体内使用的话，抗体可以是循环中的或者是位于细胞表面上，例如B细胞表面。生物学活性分子包括一种或多种任意长度的核酸(多核苷酸)，包括寡核苷酸；肽；多肽；蛋白质；任意类型(例如单克隆、多克隆和抗独特型)的抗体，包括其片段；糖；多糖；表位；模拟表位；酶(包括其结构域)；激素；药物；脂质；脂肪酸；和它们的混合物。
根据平台的化合价，平台分子缀合物例如可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多生物学活性分子，或者例如16、18、32、36个或更多。
生物学活性分子与包含高分子量聚环氧乙烷的化合价平台分子的缀合物可以用作耐受原(它导致对免疫原的免疫应答程度的减轻和/或稳定化)，可以用于各种关于降低与疾病有关的抗体水平的应用，因此可用于治疗抗体介导的疾病。可用作B细胞耐受原的用于治疗狼疮的缀合物实例如图5所示。在这些实施方式中，生物学活性分子一般包含特异性结合抗双链DNA抗体的核酸，例如美国专利号5,552,391所述。可用作B细胞耐受原的用于异种移植的缀合物实例如图6和PCT WO00/34296所示。或者，本文所公开的缀合物可以包括其他生物学活性分子，例如活性结构域1β2GPI多肽序列。
本文所用的“治疗有效量”表示足以缓和、改善、稳定化、逆转、延缓或推迟病症、例如疾病状态的进展的量。
在一种实施方式中，生物学活性分子包含β2GPI的结构域1多肽或其类似物，例如U.S.系列号60/103,088、1999年6月8日提交的U.S.系列号09/328,199和PCT WO 99/64595所述。缀合物的示例性结构如图7所示。在一种实施方式中，多肽不包括β2GPI的结构域4。
结构域1β2GPI多肽含有图19(SEQ ID NO：2)中的至少五个(或更多)相邻氨基酸，该图描绘了结构域1。在一种实施方式中，结构域1β2GPI多肽由(或者在有些实施方式中，本质上由)图19所示氨基酸序列(SEQ ID NO：2)组成，它代表结构域1。
结构域1β2GPI多肽优选可特异性结合β2GPI依赖性抗磷脂抗体。在某些实施方式中，多肽包含结构域1的片段。在其他实施方式中，多肽包含构象表位。在其他实施方式中，多肽由结构域1组成。还提供了包含结构域1β2GPI多肽的多肽，其中该多肽缺乏(可检测的)能够激活具有β2GPI依赖性抗磷脂抗体的个体T细胞的T细胞表位。
结构域1β2GPI多肽可以例如(a)从约第一半胱氨酸至约第四半胱氨酸(当从N-末端开始测定时)；(b)从约N-末端至约第五半胱氨酸(更准确地，第五半胱氨酸之前的最后一个氨基酸)；(c)从约第一半胱氨酸至约第五半胱氨酸。在有些实施方式中，可以在任意适合的位置加入另外的半胱氨酸，以充当缀合的反应性基团。因此，可以在任意位置包含另外的半胱氨酸(在有些实施方式中它是β2GPI的第五半胱氨酸)，特别是在C-末端或N-末端或其附近。结构域1β2GPI多肽还可以包含任意下列(或者由其组成，或者本质上由其组成)：(a)SEQ ID NO：2的氨基酸1至氨基酸59；(b)SEQ ID NO：2的氨基酸2至氨基酸60；(c)SEQ ID NO：2的氨基酸2至氨基酸63；(d)SEQ ID NO：2的约氨基酸1至约氨基酸60；(e)SEQ ID NO：2的氨基酸1至氨基酸61；和(f)SEQ IDNO：2的氨基酸1至氨基酸62。含有第五半胱氨酸的结构域1β2GPI多肽特别适合于缀合作用。
结构域1β2GPI多肽可特异性地结合β2GPI依赖性抗磷脂抗体。结构域1β2GPI多肽仅需结合一个β2GPI依赖性抗磷脂抗体，不过也可能(例如在检测背景下)结构域1β2GPI多肽结合一个以上β2GPI依赖性抗磷脂抗体。
结构域1β2GPI多肽的大小可以各不相同，只要满足必要的官能团(基于与β2GPI依赖性抗磷脂抗体的特异性结合)即可。例如，足以特异性结合β2GPI依赖性抗磷脂抗体的长度例如可能小至5聚氨基酸序列。在有些实施方式中，结构域1β2GPI多肽的长度小于约350个氨基酸、长度小于约250个氨基酸、长度小于约150个氨基酸、长度小于约100个氨基酸、长度小于约50个氨基酸、长度小于约25个氨基酸、长度小于约15个氨基酸或长度小于约10个氨基酸。
还可以理解的是，可以向结构域1β2GPI多肽引入某些序列变化，这可以保持或增强其反应性。这些变异的和经过修饰的序列统称“功能等价变体”，其在与另一种结构域1β2GPI多肽相比时可以具有相等的、增强的或减弱的结合性，之所以称为“等价”是因为它们保留了特异性结合β2GPI依赖性抗磷脂抗体的能力。
结构域1缀合物可以用在检测样本β2GPI依赖性抗磷脂抗体(或特异性结合结构域1β2GPI多肽的抗体)的方法中，该方法包括，使样本中的抗体与缀合物在允许稳定的抗原-抗体复合体生成的条件下接触；检测所生成的稳定复合体(如果有的话)。缀合物还可以用在诱导个体耐受性的方法中，该方法包括对个体给以有效量的缀合物，特别是包含缺乏T细胞表位的结构域1β2GPI多肽的缀合物，其中有效量是足以诱导耐受性的量。组合物可以用于例如治疗抗体介导的血栓形成。
在另一种实施方式中，提供了化合价平台分子与至少一个特异性结合抗αGal抗体的αGal表位或其类似物的缀合物。在另一方面，提供了减少个体抗αGal抗体的循环水平的方法，包括对个体给以有效量的缀合物，其中有效量是足以减少抗αGal抗体的循环水平或者中和抗αGal抗体的循环水平的量。在另一方面，提供了诱导免疫耐受性(一般对异种移植抗原而言，更具体为αGal)的方法，该方法包括给以有效量的包含αGal表位或其类似物的缀合物。缀合物还可以用于检测生物样本中抗αGal抗体的有无和/或含量。还提供了进行个体异种移植的方法，包括对个体给以缀合物，再向个体引入异种组织。在另一方面，提供了抑制所移植组织的排斥作用的方法，包括对个体给以缀合物，给药量足以抑制排斥作用。这些方法一般性地描述在PCT US99/29338中。
缀合物还可以用于狼疮的免疫耐受性治疗，可任选地基于个体最初抗体(也就是与狼疮有关的抗体，即抗双链DNA抗体)亲和性的评估，并用作选择治疗个体的基础，或者用在基于评估抗体亲和性的鉴别适合(或不适合)治疗的个体的方法中。治疗个体系统性红斑狼疮(SLE)的方法包括对个体给以缀合物，所述缀合物包含：(a)无免疫原性化合价平台分子，和(b)两个或多个多核苷酸或其类似物，它们特异性结合来自个体的特异性结合双链DNA的抗体。这些方法一般性地描述在PCTUS99/29336中。
因此，化合价平台可以共价连接一个或多个生物学活性分子而形成缀合物。生物学活性分子包括一种或多种任意长度的核酸(多核苷酸)，包括寡核苷酸；肽；多肽；蛋白质；任意类型(例如单克隆、多克隆和抗独特型)的抗体，包括其片段；糖；多糖；表位；模拟表位；酶(包括其结构域)；激素；药物；脂质；脂肪酸；和它们的混合物。
术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用，表示任意长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是直链或支链的，它可以包含经过修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。它还可以被天然或人工修饰；例如二硫键形成、糖基化、肉豆蔻基化、乙酰化、烷基化、磷酸化或脱磷酸化。在该定义内还包括含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸)以及本领域已知的其他修饰的多肽。
化合价平台缀合物的一个优点是增强所结合的生物学活性分子对其结合配体的亲和性的能力，例如当结合配体参与聚簇时。大量生物分子与化合价平台分子的共价结合提高生物分子的局部浓度，因为它们一起缔合在平台分子上。化合价平台的另一个优点是促进多个配体结合的能力，这在B细胞耐受性中是有用的。例如，缀合物可以用作现有多价表位的耐受原，以诱导B细胞表面上的簇群。因此，对于作为耐受原的用途，优选的是缀合物包含两个或更多生物学活性分子或表位。化合价平台的另一个优点是在“核心”上包含官能团的能力，使核心能够被独立地进行修饰以制备能够适应特定目的的缀合物。
为了形成缀合物，一般使包含反应性基团、例如氨基氧基的分子与第二个包含反应性基团、例如羰基的分子、例如醛或酮反应，生成例如肟缀合物。
在一种实施方式中，提供了制备天然多肽或蛋白质与包含氨基氧基的多价的优选无免疫原性化合价平台分子的化学上确定的多价缀合物的方法，其中如果需要的话，对多肽进行选择性地修饰，在多肽上的特定位置生成醛或酮部分。多肽然后与含有氨基氧基的多价化合价平台分子反应，在平台与多肽之间生成一条或更多的肟键。事实上任意多肽或其他分子的胺、例如N-末端的胺都可以通过本领域已知的氨基转移反应转化为醛或酮。
另一种在N-末端生成乙醛酰基的方法是用高碘酸钠氧化N-末端丝氨酸或苏氨酸。这种氧化作用裂解N-末端丝氨酸或苏氨酸的羟基与氨基之间的碳-碳键，得到乙醛酰基。因此在一种实施方式中，通过在N-末端生成酮或醛，可以位点特异性地修饰多肽。可以类似地修饰合成多肽和其他药物或生物学活性分子，以包括可以用于生成肟键的醛或酮。
含有氨基氧基反应性基团的多价平台允许经过选择性修饰的多肽共价结合在平台上。氨基氧基例如可以是氨基氧基乙酰基或氨基氧基烷基。在一种优选的实施方式中，平台分子中的氨基氧基是氨基氧基烷基，例如-CH2CH2ONH2。
具有醛或酮官能团的生物分子经由肟键形成而与氨基氧基平台结合是可以实现的。转氨基多肽或者用醛或酮基团修饰的多肽可以与氨基氧基平台反应。在一种实施方式中，将四价平台用乙醛酰-多肽的酸性水溶液处理，使氨基转移的结构域1结合于平台。优选的酸性条件是100mMpH4.6的乙酸钠。在制备四价结构域1缀合物的情况下，使用超过四当量、例如六当量的氨基转移的结构域1。
图5的缀合物是按照关于美国专利号5,552,391图6B中化合物20-II的描述制备的。将适当卤乙酰化的平台7、17或23用具有5’-末端硫醇接头的寡核苷酸(HS(CH2)6OPO3 -(CA)10)处理，后者如美国专利号5,552,391实施例5所述制备。所得寡核苷酸缀合物用互补链((TG)10)退火，得到相应的四聚双链寡核苷酸缀合物。图5中，n是例如大于500，例如500-800或500-1000。
图6的缀合物按照图5的缀合物所述制备，使用2-[2-(2-硫代乙氧基)乙氧基]乙基3-O-(α-D-吡喃半乳糖基)-β-D-吡喃半乳糖(如PCTUS99/29338所述)代替具有5’-末端硫醇接头的寡核苷酸。因此，将适当卤乙酰化的平台7、17或23用2-[2-(2-硫代乙氧基)乙氧基]乙基3-O-(α-D-吡喃半乳糖基)-β-D-吡喃半乳糖处理，得到相应的α-1，3-digal缀合物。图6中，n是例如大于500，例如500-800或500-1000。
本文所引用的所有出版物、专利、专利申请和已公布的专利申请的公开内容全文结合在此作为参考。
借助下列非限制性实施例可以进一步理解本发明。
                         实施例
下列实施例中，使用下列缩写：DCC，1，3-二环己基碳二亚胺；DIC，1，3-二异丙基碳二亚胺；DBU，1，8-二氮杂二环并[5.4.0]十一碳-7-烯；NHS，N-羟基琥珀酰亚胺；HOBt，1-羟基苯并三唑；DMF，二甲基甲酰胺。
实施例1-结构域1多肽的氨基转移作用
氨基转移的结构域1(TA/D1)的合成：合成如图20所示。向水和乙酸钠缓冲液喷以氦，备用。使用具有图19所示SEQ ID NO：2的氨基酸1至63序列的结构域1β2GPI多肽，它描述在1998年6月9日提交的美国临时申请系列号60/103,088、1999年6月8日提交的U.S.系列号09/328,199和PCT WO 99/64595中。结构域1具有N-末端甘氨酸。在聚丙烯试管内将结构域1多肽(10.55mg，1.49μmol)溶于0.5ml H2O，加入4.0ml 2MpH 5.5 NaOAc缓冲液。向混合物加入3.73mg(14.9μmol)CuSO4的0.5ml H2O溶液，然后加入2.75mg(29.9μmol)水合乙醛酸在0.5ml 2M pH5.5 NaOAc缓冲液中的溶液。将混合物保持在氮气氛下，轻微搅拌18小时，此时分析型HPLC显示反应完全，所述分析型HPLC使用4.6mm×250mm，300埃，5μm二苯基柱(Vydac，Hesperia，CA)，在280nm下检测(1ml/分钟；梯度25％-45％B，0-20分钟，A＝0.1％TFA/H2O，B＝0.1％TFA/CH3CN)。大约的保留时间如下：D1，13.2分钟；TA/D1，13.7分钟；氧化的TA/D1，13.4分钟。将混合物用H2O稀释至体积为20ml，过滤，经过HPLC纯化(22.4mm×250mm，300埃，10μm，二苯基柱(Vydac)；12ml/分钟；梯度25％-40％B，0-40分钟，A＝0.1％TFA/H2O，B＝0.1％TFA/CH3CN)。收集由分析型HPLC证实含有纯TA/D1的部分，冷冻干燥，得到5.0mg(48％)TA/D1。该反应转化TA/D1中的N-末端甘氨酸为N-末端乙醛酰，因此D1部分具有SEQ ID NO：2氨基酸2至63的序列(见图20)。
实施例2-化合物125的合成
化合物115：向8.00g(13.4mmol)化合物13(如美国专利号5,552,391所述制备)的80ml无水DMF溶液中加入4.00g(16.1mmol)N-(苄氧羰基氧基)琥珀酰亚胺(Aldrich Chemical Co.)。将混合物在氮气和室温下搅拌2小时，此时将其倒入600ml冰水中，用四份100ml CH2Cl2萃取。合并CH2Cl2层，用100ml H2O洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤，浓缩。从庚烷中浓缩有助于使粗产物固化。用EtOAc重结晶，得到化合物115，为白色固体：1H NMR(CDCl3)δ1.26(m，4H)，1.43-1.62(m，8H)，2.05(m，4H)，3.16(q，4H)，3.40(brd s，8H)，4.98(s，2H)，与5.08(s，4H)和5.11(s，2H)重叠，6.31(s，1H)，6.44(s，1H)，7.26-7.38(m，15H)。
三胺化合物116的合成：向9.0g(12.3mmol)化合物115的18ml环己烷与36ml无水乙醇溶液中通入N2气，使其脱氧。向溶液中加入1.80g10％Pd/C，将混合物在回流下加热3小时。冷却后，将混合物通过Celite盐过滤，用MeOH冲洗。浓缩滤液，使浓缩物从CH2Cl2中浓缩，得到4.20g(87％)化合物116，为灰白色固体。
化合物117的合成：向5.39g(21.8mmol)化合物105的10ml无水乙腈溶液中加入3.02g(23.9mmol)CDI(羰基二咪唑)，将混合物在氮气氛下搅拌1.5小时。将所得溶液中加入到4.20g(10.7mmol)化合物116的15ml无水DMF溶液中，将混合物搅拌2小时，然后倒入500ml冰水中。所得混合物用四份100ml CH2Cl2萃取。合并CH2Cl2层，用100mlH2O洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤，浓缩。所得半固体残余物从10％异丙醇/EtOAc中结晶，得到4.0g(44％)117，为白色固体：1H NMR CDCl3(δ)1.35(m，4H)，1.42(m，4H)，1.49(s，18H)，1.63(m，16H)，2.01(brd s，1H)，2.20(t，4H)，3.23(m，4H)，3.34(m，4H)，3.85(t，4H)，6.34(t，2H)，6.70(t，2H)，7.98(brd s，1H)。
化合物119：向3.65g(14.11mmol)9-芴基甲基氯甲酸酯(Fmoc-Cl)的15ml二噁烷溶液中加入3.00g(15.5mmol)化合物118(Bondunov等，J.Org.Chem.(有机化学杂志)1995，60卷，6097-6102页)的15ml二噁烷溶液，然后加入1.95g(14.11mmol)碳酸钾的30ml H2O溶液。将混合物在室温下搅拌18小时然后浓缩。使所得的油在50ml 1N NaOH溶液与三份150ml CH2Cl2之间分配。合并CH2Cl2层，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩至黄色的油。经过硅胶色谱纯化(步骤梯度；90/10 EtOAc/AcOH至90/10/1 EtOAc/AcOH/MeOH)，得到3.85g(66％)119，为粘性的油：1HNMR CDCl3(δ)3.26(m，4H)，3.39(m，2H)，3.49(m，2H)，3.59(m，2H)，3.65(m，4H)，3.69(m，2H)，4.25(t，1H)，4.60(d，2H)，7.35(t，2H)，7.41(t，2H)，7.59(d，2H)，7.78(d，2H)。
化合物120：在0℃下，向3.77g(9.08mmol)化合物119与7.32g(36.3mmol)4-硝基苯基氯甲酸酯的50ml CH2Cl2溶液中加入5.88ml(5.75g，72.6mmol)吡啶。将混合物在室温和氮气氛下搅拌72小时，使混合物在200ml CH2Cl2与四份100ml 10％碳酸氢钠水溶液之间分配。将CH2Cl2层依次用100ml H2O、100ml 1N HCl和100ml盐水洗涤。将溶液干燥(MgSO4)，过滤，浓缩，得到橙色的油。经过硅胶色谱纯化(15/50/35/1 EtOAc/CH2Cl2/己烷/AcOH)，得到2.67g(39％)化合物120，为黄色胶状物：1H NMR(CDCl3)δ3.32(m，4H)，3.52(m，2H)，3.60(m，4H)，3.74(m，2H)，4.23(t，1H)，4.38(m，2H)，4.41(m，2H)，4.57(d，2H)，7.37(m，8H)，7.59(d，2H)，7.78(d，2H)，8.26(重叠的d，4H)；质谱(ESI)(M+H)C37H36N3O14的计算值：746。实测值746。
化合物121：向482mg(0.612mmol)化合物117的5ml CH2Cl2溶液中加入182mg(0.245mmol)化合物120，然后加入171μl(124mg，1.22mmol)Et3N和26mg(0.490mmol)HOBt。将混合物在室温下搅拌，直至根据TLC的判断(1/9 MeOH/CH2Cl2)反应完全。使混合物在300mlCH2Cl2与三份50ml 1N HCl之间分配。将CH2Cl2层用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩至黄色的油。经过硅胶色谱纯化(多步梯度；5/1/94至10/1/89至15/1/84至20/1/79 MeOH/HOAc/CH2Cl2)，得到317mg(63％)化合物121，为粘性白色固体：1H NMR(CD3OD)δ1.34(m，16H)，1.43(m，8H)，1.48(s，36H)，1.64(m，24H)，2.20(m，16H)，3.19(m，12H)，3.25-3.52(m，18H)，3.55(m，2H)，3.79(t，8H)，4.16(m，4H)，4.28(t，1H)，4.59(d，2H)，7.33(t，2H)，7.41(t，2H)，7.60(d，2H)，7.84(d，2H)；13C NMR(CD3OD)δ14.6，23.8，26.7，26.7，26.9，27.7，28.8，28.9，30.3，37.1，38.8，39.1，40.3，65.8，66.0，68.1，70.2，70.3，77.3，82.0，121.2，126.0，128.4，129.0，142.9，145.6，157.9，158.2，159.2，176.1，176.3；质谱(ESI)(M+2Na)/2 C101H171Na2N15O28的计算值：1044。实测值1044。
化合物122：向163mg(79.8mmol)化合物121的2.4ml DMF溶液中加入600μl二乙胺。将混合物搅拌3小时，浓缩。经过硅胶色谱纯化(多步梯度；10/1/89至12.5/6/86.5至15/1/84 MeOH/浓NH4OH/CH2Cl2)，得到127mg(81％)化合物122，为玻璃状胶：1H NMR(CD3OD)δ1.38(m，16H)，1.48(m，44H)，1.65(m，24H)，2.20(t，16H)，2.83(t，4H)，3.17(t，8H)，3.38(m，16H)，3.63(t，4H)，3.69(t，4H)，3.78(t，4H)，4.21(m，4H)；13C NMR(CD3OD)δ26.7，27.0，27.8，28.8，28.9，30.3，37.1，38.8，39.1，40.3，49.9，66.0，70.4，70.9，77.3，82.0，158.2，159.2，176.1，176.3；质谱(ESI)(M+H)C86H162N15O26的计算值：1821。实测值1821。
化合物124b：向20mg(11.0μmol)化合物122的5ml DMF溶液中加入103mg(8.8μmol)分子量为11,690g/mol的甲氧基聚乙二醇苯并三唑基碳酸酯(mPEG12K-BTC，化合物123b，Shearwater Polymers)，然后加入5μl(3.6mg，35.9μmol)Et3N。将混合物在室温下搅拌18小时，浓缩。残余物经过硅胶色谱纯化(多步梯度；5/95至15/85至20/80MeOH/CH2Cl2)，得到109mg化合物124b，为蜡状灰白色固体：1H NMR(CDCl3)δ1.37(m，16H)，1.49(m，44H)，1.65(m，24H)，2.20(t，16H)，3.20(q，8H)，3.36(m，16H)，3.61(m，4H)，3.68(m，约1056H)，3.84(t，8H)，3.91(m，4H)，4.23(m，4H)。
化合物124a：使用本质上与制备化合物124b相同的方法制备该化合物；不过使用分子量为5,215g/mol的甲氧基聚乙二醇苯并三唑基碳酸酯(mPEG5K-BTC，化合物123a，Shearwater Polymers)：1H NMR(4∶1CDCl3/CD3OD)δ1.37(m，16H)，1.49(m，44H)，1.65(m，24H)，2.20(t，16H)，3.20(q，8H)，3.36(m，16H)，3.61(m，4H)，3.68(m，约468H)，3.84(t，8H)，3.91(m，4H)，4.23(m，4H)。
化合物124c：使用本质上与制备化合物124b相同的方法制备该化合物；不过使用分子量为22,334g/mol的甲氧基聚乙二醇苯并三唑基碳酸酯(mPEG20K-BTC，化合物123c，Shearwater Polymers)：1H NMR(5∶1CDCl3/CD3OD)δ1.37(m，16H)，1.49(m，44H)，1.65(m，24H)，2.20(t，16H)，3.20(q，8H)，3.36(m，16H)，3.61(m，4H)，3.68(m，约2024H)，3.84(t，8H)，3.91(m，4H)，4.23(m，4H)。
类似地，可以利用所需分子量，例如23,000、25,000、40,000或以上的mPEG-BTC进行合成。因此在图9中，n可任选地大于500，例如为550、600、800或以上。
化合物125b：按照本质上类似于制备化合物16所述的方式除去化合物124a-c中的B0c保护基团，得到化合物125a-c。
反应流程如图9所示。
实施例3-化合物129的合成
化合物126：向14mg(18.6μmol)化合物120与29mg(186.3μmol)HOBT的5ml无水DMF溶液中加入56μl(38mg，373μmol)Et3N。将混合物搅拌1小时，加入85mg(46.6μmol)化合物122的1ml DMF溶液。将混合物在室温下搅拌5小时，在150ml CH2Cl2与50ml 1N HCl之间分配。将CH2Cl2层用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。经过硅胶色谱纯化，得到34mg(44％)化合物126，为蜡状白色固体：1H NMR(CD3OD)δ1.37(m，32H)，1.49(m，与在1.48的单峰重叠，88H)1.62(m，48H)，2.20(t，32H)，3.18(t，16H)，3.36(m，32H)，3.50(m，12H)，3.64(m，24H)，3.79(t，16H)4.17(m，12H)，4.29(t，1H)，4.60(d，2H)，7.37(t，2H)，7.43 (t，2H)，7.65 (d，2H)，7.84 (d，2H)；质谱(ESI)(M+3Na)/3C197H347Na3N31O60：1393。实测值1393。
化合物126的另一种合成方法：将吡啶(5ml)加入到装有136mg(74.7μmol)化合物122、22.3mg(29.9μmol)化合物120与18.3mg(119.5μmol)羟基苯并三唑一水合物(HOBt)的烧瓶内。将所得溶液搅拌18小时，在真空下通过旋转蒸发除去吡啶。经过硅胶色谱纯化(梯度1/13/86至1/20/79 AcOH/MeOH/CH2Cl2)，得到104mg(85％)化合物126，为白色固体。
化合物127：向34mg(8.27μmol)化合物126的1.6ml DMF溶液中加入400μl二乙胺。将混合物在室温下搅拌4小时，浓缩。浓缩物经过硅胶色谱纯化(1/10/89浓NH4OH/MeOH/CH2Cl2)，得到13mg(40％)化合物127：1H NMR(CD3OD)δ1.35(m，32H)，1.49(m，与在1.48的单峰重叠，88H)，1.63(m，48H)，2.19(t，32H)，3.08(brd t，4H)3.17(t，16H)，3.38(m，36H)，3.52(m，8H)，3.63(t，8H)，3.70(m，12H)，3.78(t，16H)，4.21(m，12H)；质谱(ESI)(M+3Na)/3 C182H337Na3N31O58：1319。实测值1319。
化合物128：向13mg(3.34μmol)化合物127的5ml吡啶溶液中加入60mg(2.68μmol)分子量为22,334g/mol的甲氧基聚乙二醇苯并三唑基碳酸酯(mPEG20K-BTC，Shearwater Polymers)，然后加入5μl(3.6mg，35.9μmol)Et3N。将混合物在室温下搅拌18小时，浓缩。残余物经过硅胶色谱纯化(多步梯度；10/90至15/85至20/80 MeOH/CH2Cl2)，得到45mg化合物128，为蜡状固体：1H NMR(CDCl3)δ1.30(m，32H)，1.50(m，与在1.48的单峰重叠，88H)，1.67(m，48H)，2.24(t，32H)，3.23(m，16H)，3.41(m，32H)，3.65(m，约2024H)，3.70(t，24H)，3.89(m，16H)，4.21(m，12H)。
类似地，可以利用所需分子量，例如23,000、25,000、40,000或以上的mPEG-BTC进行合成。因此在图10中，n可任选地大于500，例如为550、600、800或以上。
化合物129：按照本质上类似于制备化合物16所述的方式除去化合物128中的Boc保护基团，得到化合物129，如图10所示。
实施例4-化合物132的合成
化合物131：向22mg(27.3μmol)化合物117的5ml吡啶溶液中加入236mg(10.9μmol)分子量为21,529g/mol的聚乙二醇双苯并三唑基碳酸酯(PEG20K-双BTC，化合物130，Shearwater Polymers)，然后加入8μl(5.8mg，57.4μmol)Et3N。将混合物在室温下搅拌18小时，浓缩。残余物经过硅胶色谱纯化(多步梯度；5/95至10/90至15/85至20/80MeOH/CH2Cl2)，得到242mg(96％)化合物131，为白色固体：1H NMR(CDCl3)δ1.35(m，16H)，1.48(m，44H)，1.61(m，24H)，2.20(m，16H)，3.22(m，8H)，3.52-3.96(m，约2000H)，4.23(m，4H)。
类似地，可以利用所需分子量，例如23,000、25,000、40,000或以上的PEG-双-BTC进行合成。因此在图11中，n可任选地大于500，例如为550、600、800或以上。
化合物132：按照本质上类似于制备化合物16所述的方式除去化合物131中的Boc保护基团，得到化合物132。
反应流程如图11所示。
实施例5-化合物136的合成
化合物134：向3.87mg(4.85μmol)季戊四醇四-(4-硝基苯基碳酸酯)(通过季戊四醇与对硝基苯基氯甲酸酯的反应制备，得到四对-硝基苯基碳酸酯化合物)的5ml吡啶溶液中加入124mg(24.2μmol)分子量为5094g/mol的单-Boc-保护的二氨基聚乙二醇(化合物133，BocNH-PEG(5K)-NH2，Shearwater)和5μl(3.63mg，35.9μmol)Et3N。将混合物搅拌18小时，浓缩。残余物经过硅胶色谱纯化(步骤梯度；5/95至15/85 MeOH/CH2Cl2)，得到77mg(77％)化合物134，为白色固体：1HNMR(CDCl3)δ1.48(s，36H)，3.32(m，16H)，3.52-3.96(m，约1818H)，4.10(m，8H)。
类似地，可以利用所需分子量，例如23,000、25,000、40,000或以上的BocNH-PEG-NH2进行合成。因此在图12中，n可任选地大于500，例如为550、600、800或以上。
化合物106的合成：向磁搅拌的5.2g(20.2mmol，1.1当量)二琥珀酰亚氨基碳酸酯的200ml乙腈溶液中加入4.54g(18.3mmol，1.0当量)化合物105的100ml乙腈溶液。加入吡啶(2.67ml，2.61g，33.03mmol，1.8当量)，将混合物搅拌过夜。浓缩混合物，将残余物溶于20ml二氯甲烷。有机层用两份20ml 1N HCl和20ml饱和NaCl水溶液洗涤。将有机层干燥(MgSO4)，过滤，浓缩，得到5.7g黄色的油。将一部分该物质(2.732g)进一步经过硅胶色谱纯化(15/85丙酮/甲苯)，得到4.38g(68％)化合物106，为无色的油。1H NMR CDCl3(δ)1.48(s，9H)，1.51(m，2H)，1.68(p，2H)，1.79(p，2H)，2.63(t，2H)，2.84(br.s，4H)，3.87(t，2H)，7.18(br.s，1H)；13C NMR CDCl3(δ)24.32，25.07，25.53，27.42，28.16，30.77，76.13，81.51，156.89，168.45，169.15。
化合物135：将化合物134(77mg，3.73μmol)溶于5ml三氟乙酸，将混合物放置3小时。在N2气流下除去TFA，将残余物溶于5ml CH2Cl2。向所得溶液中加入7.72mg(22.4μmol)化合物106的5ml CH2Cl2溶液，然后加入35μl(25.4mg，251μmol)Et3N(注意：应当检查混合物的pH，相应地用Et3N调节之，以确定它是碱性的)。将混合物在氮气下搅拌18小时。使混合物在50ml CH2Cl2与三份25ml 1N HCl之间分配。将CH2Cl2层用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。经过硅胶色谱纯化(步骤梯度；5/95至10/90 MeOH/CH2Cl2)，得到42mg(53％)化合物135，为蜡状固体：1H NMR(CDCl3)δ1.40(m，8H)，1.48(s，36H)，1.66(m，16H)，2.18(t，8H)，3.32(m，16H)，3.38-3.89(m，约1818H)，4.10(m，8H)，4.97(t，4H)，6.43(t，4H)，7.47(s，4H)。
化合物136：按照本质上类似于制备化合物16所述的方式除去化合物135中的Boc保护基团，得到化合物136，如图12所示。
实施例6-化合物143的合成
化合物137：在氮气氛下，向0℃的200mg(1.11mmol)3，5-二氨基苯甲酸乙酯的5ml CH2Cl2溶液中加入928μl(674mg，6.66mmol)Et3N。向混合物中滴加510μl(710mg，3.33mmol)6-溴己酰氯的5ml CH2Cl2溶液。将混合物在室温下搅拌1.5小时，在50ml 1N HCl与两份50mlCH2Cl2之间分配。将CH2Cl2层用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。产物经过硅胶色谱纯化(6/4己烷/EtOAc)，得到554mg(93％)油状的化合物137，为油：1H NMR(CDCl3)：δ1.39(t，3H)，1.52(m，4H)，1.75(m，，4H)，1.90(m，4H)，2.40(t，4H)，3.42(t，4H)，4.36(q，2H)，7.60(s，2H)，7.88(s，2H)，8.17(s，1H)。
化合物138：将DBU(612μl，623mg，4.01mmol)加入到547mg(1.02mmol)化合物137与272mg(2.05mmol)N-(叔丁氧羰基)羟胺(Aldrich Chemical Co.)的溶液中。将混合物在室温下搅拌18小时，在50ml 1N HCl与三份50ml CH2Cl2之间分配。合并CH2Cl2层，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。产物经过硅胶色谱纯化(1/1己烷/EtOAc)，得到216mg(33％)化合物138，为白色固体，mp 55-60℃：1H NMR(CDCl3)：δ1.38(t，3H)，1.48(s，18H；掩盖的m，4H)，1.60(m，4H)，1.73(m，4H)，2.40(m，4H)，3.86(t，4H)，4.36(q，2H)，7.41(s，2H)，7.90(s，2H)，8.06(s，2H)，8.11(s，1H)；质谱(ESI)(M+Na)C31H50NaN4O10的计算值：661。实测值661。
化合物139：向205mg(0.32mmol)化合物138的1/1丙酮/EtOH溶液中加入256μl(2.56mmol)10N NaOH，将混合物加热至60℃达4小时。冷却后，使混合物在50ml 1N HCl与四份50ml 4/1 CH2Cl2/MeOH之间分配。合并有机层，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。产物经过硅胶色谱纯化(3/97/1 MeOH/CH2Cl2/HOAc)，得到184mg(94％)化合物139，为粘性的油：1H NMR(CDCl3)：δ1.38(m，4H)，1.42(s，18H)，1.60(m，4H)，1.70(m，4H)，2.38(m，4H)，3.80(t，4H)，7.77(s，2H)，8.00(s，2H)，8.11(s，1H)，8.91(s，2H)；质谱(ESI)(M+Na)C29H46NaN4O10的计算值：633。实测值633。
化合物140：向0℃的164mg(0.268mmol)化合物139的2.0ml无水THF溶液中加入31mg(0.268mmol)N-羟基琥珀酰亚胺，然后加入83mg(0.403mmol)DCC。使混合物恢复至室温，在氮气氛下搅拌18小时，加入200μl HOAc。将混合物继续搅拌一小时，用大约5ml的EtOAc稀释，放置一小时。过滤除去形成的沉淀，浓缩滤液。经过硅胶色谱纯化(3/97MeOH/CH2Cl2)，得到129mg(68％)化合物140，为白色固体：1H NMR(CDCl3)：δ1.40(m，4H)，1.43(s，18H)，1.65(m，4H)，1.80(m，4H)，2.34(m，4H)，2.93(s，4H)，3.85(t，4H)，7.68(s，2H)，7.87(s，2H)，8.36(s，1H)，8.61(s，2H)。
化合物142：向60mg(0.85mmol)化合物140的0.5ml CH2Cl2溶液中加入14μl(13.3mg，0.168mmol)吡啶。将混合物冷却至0℃，加入71mg(0.021mmol)二氨基-PEG(化合物141)的0.5ml CH2Cl2溶液。将混合物在氮气氛和室温下搅拌18小时，然后在10ml 1N HCl与三份10ml CH2Cl2之间分配。合并CH2Cl2层，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。经过硅胶色谱纯化(步骤梯度；5/95 MeOH/CH2Cl2至10/90 MeOH/CH2Cl2)，得到66mg(69％)化合物142，为粘性的油：1H NMR(CDCl3)：δ1.45(s，36H)，1.60-1.80(m，24H)，2.39(t，8H)，3.39(m，8H)，3.50-3.80(brd s，约318H)，3.87(t，8H)，4.22(t，4H)，7.50(brd s，2H)，7.63(s，4H)，7.77(s，2H)，8.08(s，2H)，8.60(s，2H)；质谱(MALDI)(M+H)C207H389N12O93的计算值：4535。实测值分布中心位于大约4324。
类似地，可以利用所需分子量的化合物141进行合成，例如n可任选地大于500，例如为550、600、800或以上，如图13所示。
化合物143：按照本质上类似于制备化合物16所述的方式除去化合物142中的Boc保护基团，得到化合物143，如图13所示。
化合物302的合成：向209mg(9.36μmol)化合物123c与8.84mg(11.2μmol)化合物117的5ml无水吡啶溶液中加入3.26μl(2.36mg，23.4μmol)三乙胺。将混合物在N2气氛下搅拌18小时，在真空下通过旋转蒸发除去吡啶，残余物通过制备型HPLC在22mm×250mm氨基丙基二氧化硅柱上纯化(梯度，10％A至30％B，历经60分钟；A＝H2O，B＝CH3CN)，得到200mg(93％)化合物302。
化合物303的合成：按照本质上类似于制备化合物16所述的方式除去化合物302中的Boc保护基团，得到化合物303。
化合物304的合成：向4.43ml(4.48g，30.2mmol)2，2’-(亚乙二氧基)双(乙胺)(Aldrich Chemical Co.)的50ml EtOAc溶液中加入1.04g(3.0mmol)化合物106的溶液。过滤除去所生成的沉淀。浓缩滤液，将残余物溶于100ml CH2Cl2，与50ml 1N NaOH一起摇动。含水层用四份50ml CH2Cl2萃取，合并所有CH2Cl2萃取液，浓缩至黄色的油。经过硅胶色谱纯化(1.25/13.75/85浓NH4OH/MeOH/CH2Cl2)，得到520mg(46％)化合物304，为淡黄色油。
化合物305的合成：向500mg(23.2μmol)化合物130的9ml无水吡啶溶液中加入21.9mg(58.1μmol)化合物304的1ml吡啶溶液，然后加入26μl(18.8mg，186μmol)三乙胺，将混合物在氮气氛下搅拌18小时。在真空下通过旋转蒸发除去吡啶，残余物通过制备型HPLC在22mm×250mm氨基丙基二氧化硅柱上纯化(梯度，13％A至33％B，历经60分钟；A＝H2O，B＝CH3CN)，得到428mg(84％)化合物305。
化合物306的合成：按照本质上类似于制备化合物16所述的方式除去化合物305中的Boc保护基团，得到化合物306(图17)。
实施例7-缀合物的制备方法
缀合物200、201、202、203、204和205(图7)按照如下描述制备。
化合物200：向68.8mg(9.74μmol，6当量)TA/D1在10ml喷以氦的0.1M，pH 4.6乙酸钠缓冲液中的溶液中加入36.8mg(1.62μmol)化合物125c在6.15ml 1/1乙腈/0.1M，pH8.0 TRIS乙酸盐缓冲液中的溶液。小心地保持混合物在氮气氛下，同时在室温下搅拌18小时。当反应完全时，直接经过阳离子交换色谱使用由PolyLC Inc.制造的PolyCat AWCX柱纯化(梯度，10％B至25％B，A＝10mM磷酸钠pH7的1/9乙腈/H2O溶液)，得到57mg(40％)化合物200。
化合物201：按照本质上与化合物200相似的方式制备化合物201。因此，向6当量TA/D1在喷以氦的0.1M pH4.6乙酸钠缓冲液中的大约1mM溶液中加入1当量化合物125a，后者是在1/1乙腈/0.1M，pH8.0TRIS乙酸盐缓冲液中的0.25至10mM溶液。小心地保持混合物在氮气氛下，同时在室温下搅拌18小时。当反应完全时，直接经过阳离子交换色谱纯化，得到化合物201。
化合物202：按照本质上与化合物200相似的方式制备化合物202。因此，向6当量TA/D1在喷以氦的0.1M pH4.6乙酸钠缓冲液中的大约1mM溶液中加入1当量化合物132，后者是在1/1乙腈/0.1M，pH8.0TRIS乙酸盐缓冲液中的0.25至10mM溶液。小心地保持混合物在氮气氛下，同时在室温下搅拌18小时。当反应完全时，直接经过阳离子交换色谱纯化，得到化合物202。
还分离出了两种低价的少量杂质。分离到由聚丙烯酰胺凝胶电泳和质谱证明结合有三个结构域1多肽的化合物，称之为202三聚物。还分离到由聚丙烯酰胺凝胶电泳和质谱证明结合有两个结构域1多肽的化合物，称之为202二聚物。
化合物203：按照本质上与化合物200相似的方式制备化合物203。因此，向6当量TA/D1在喷以氦的0.1M pH4.6乙酸钠缓冲液中的大约1mM溶液中加入1当量化合物136，后者是在1/1乙腈/0.1M，pH8.0TRIS乙酸盐缓冲液中的0.25至10mM溶液。小心地保持混合物在氮气氛下，同时在室温下搅拌18小时。当反应完全时，直接经过阳离子交换色谱纯化，得到化合物203。
化合物204：按照本质上与化合物200相似的方式制备化合物204。因此，向6当量TA/D1在喷以氦的0.1M pH4.6乙酸钠缓冲液中的大约1mM溶液中加入1当量化合物143，后者是在1/1乙腈/0.1M，pH8.0TRIS乙酸盐缓冲液中的0.25至10mM溶液。小心地保持混合物在氮气氛下，同时在室温下搅拌18小时。当反应完全时，直接经过阳离子交换色谱纯化，得到化合物204。
化合物205：按照本质上与化合物200相似的方式制备化合物205。因此，向6当量TA/D1在喷以氦的0.1M pH4.6乙酸钠缓冲液中的大约1mM溶液中加入1当量化合物125b，后者是在1/1乙腈/0.1M，pH8.0TRIS乙酸盐缓冲液中的0.25至10mM溶液。小心地保持混合物在氮气氛下，同时在室温下搅拌18小时。当反应完全时，直接经过阳离子交换色谱纯化，得到化合物205。
化合物300：按照本质上与化合物200相似的方式制备化合物300。因此，向12当量TA/D1在喷以氦的0.1M pH4.6乙酸钠缓冲液中的大约1mM溶液中加入1当量化合物129，后者是在1/1乙腈/0.1M，pH8.0TRIS乙酸盐缓冲液中的0.25至10mM溶液。小心地保持混合物在氮气氛下，同时在室温下搅拌18小时。当反应完全时，直接经过阳离子交换色谱纯化，得到化合物300(图16)。
化合物309：按照本质上与化合物200相似的方式制备化合物309。因此，向3当量TA/D1在喷以氦的0.1M pH4.6乙酸钠缓冲液中的大约1mM溶液中加入1当量化合物303，后者是在1/1乙腈/0.1M，pH8.0TRIS乙酸盐缓冲液中的0.25至10mM溶液。小心地保持混合物在氮气氛下，同时在室温下搅拌18小时。当反应完全时，直接经过阳离子交换色谱纯化，得到化合物303。
化合物310：按照本质上与化合物200相似的方式制备化合物310。因此，向3当量TA/D1在喷以氦的0.1M pH4.6乙酸钠缓冲液中的大约1mM溶液中加入1当量化合物306，后者是在1/1乙腈/0.1M，pH8.0TRIS乙酸盐缓冲液中的0.25至10mM溶液。小心地保持混合物在氮气氛下，同时在室温下搅拌18小时。当反应完全时，直接经过阳离子交换色谱纯化，得到化合物310(图18)。
实施例8-耐受原效力和血清半衰期的评价
制备结构域1-匙孔血蓝蛋白缀合物(D1 CYS-KLH)用于动物免疫。利用杆状病毒表达载体系统，在昆虫细胞内将具有第五半胱氨酸的重组结构域1表达为与谷胱甘肽混和的二硫化物。结构组成为存在于天然的人β2-糖蛋白I中的前66个氨基-末端氨基酸，继之为C-末端leu-(his)5表达标签。位于C-末端上的多聚组氨酸表达标签是镍亲和色谱纯化步骤的基础。Iverson等(1998)Proc.Nat′l.Acad.Sci.(美国国家科学院院报)95：15542-15546。
用马来酰亚氨基-KLH烷基化所得到的具有游离巯基的结构域1(D1 CYS-SH)。按照厂商的指导，将马来酰亚氨基-活化的KLH(PierceChemical Co.；Rockford，IL)按10mg/ml溶于水。立即向D1 CYS-SH加入KLH，每mg D1-SH加入1.27mg。通过在室温下旋转试管2小时，使KLH与D1 CYS混和。培育结束时，利用＞25,000MW截留膜在4℃下将内容物对冷的PBS进行透析以除去未缀合的D1 CYS。取经过透析的样本，用来自患者的亲和纯化的抗磷脂抗体(aPL)通过ELISA法检测免疫反应性D1的存在。
利用致免疫的大鼠模型测定耐受原效力。i.p.给以含有百日咳佐剂的在明矾中的10μg D1 CYS-KLH，使Lewis大鼠(Harlan Sprague Dawley，Indianapolis，IN)致免疫。接触抗原后三周，每四只动物为一组，i.v.给以耐受原或PBS对照。处理后五天，i.p.给以10μgD1 CYS-KLH进行加强，加强后七天，采集血清样本。
利用ELISA法检测大鼠血清中的抗结构域1抗体。在4℃下，将Nunc Maxisorp Immunoplates(Nalge Nunc International，Rochester，NY)用50μl 5μg/ml重组人β2-GPI的碳酸盐缓冲溶液(Sigma，St.Louis，MO)，pH 9.6包被过夜。随后的步骤是在室温下进行的。将平板用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤3次，然后用250μl 2％脱脂奶粉(Carnation，Solon，OH)的PBS溶液封闭1小时。洗涤后，将小孔用50μl在PBS中连续稀释的每种血清样本培育1小时，一式三份。使用未免疫的血清作为对照，使用从致免疫的动物采集的混合血清生成标准曲线。洗涤后，将小孔用50μl在PBS/0.1％BSA中按1∶2000稀释的与碱性磷酸酶缀合的山羊抗大鼠IgG(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)培育1小时。将小孔用dIH2O洗涤3次，用PPMP溶液(10mg酚酞单磷酸盐(Sigma，St.Louis MO)、97.4ml 2-氨基-2-甲基-1-丙醇(Sigma)、9.62ml dIH2O、21mlHCl)显色20分钟。用50μl 0.2M Na2HPO4终止显色，在Bio-TekInstruments PowerWave 340微孔板分光光度计(Winooski，VT)上读取OD550。将标定的抗体单位指定给标准的混合血清，从标准曲线推导供试血清中抗结构域1抗体的浓度(单位/ml)。用缀合物200、201、202和203处理，并与PBS处理的对照相比，计算多价平台缀合物对抗结构域1抗体的抑制百分率。结果如下表1所示。
表1：致免疫大鼠中抗结构域1抗体的抑制百分率
                 纳摩尔药物/大鼠
    化合物     0.17     1.7     17     2.4     3.5
    200     61     82     89
    201     34     73     86
    202     72     89     96
    203     73     93     94
    202三聚物     83
    202二聚物     70
根据定义，PBS对照＝0％抑制
在小鼠、大鼠和猕猴中测量化合物的血浆药动学。利用一氯化碘法将化合物用125I进行放射性标记。Contreras等，1983，Methods inEnzymology(酶学方法)92：277-292。将经过标记的化合物i.v.注射给雌性Balb/c小鼠、雄性Sprague-Dawley大鼠和雌性Cynomologous猕猴。在小鼠中经过1小时、在大鼠和猕猴中经过24小时采集血浆样本。利用Packard Instruments Cobra Gamma计数器(Dowers Grove，Ill.)检测放射性标记的药物的量。利用Pharsight WinNonLin软件(MountainView，Ca.)计算药动学参数。利用式t1/2＝ln2(AUC/0.5*Cmax)计算总血浆半衰期。所有三种动物的清除率(CL，ml/小时)和半衰期(t1/2，小时)如下表2所示。
表2：小鼠、大鼠和猕猴中的药动学参数
  小鼠    大鼠     猕猴
    #    Cl     t1/2     Cl     t1/2     Cl    t1/2
    204    62     0.05     1.70     8.0     64    3.3
    200    1.2     0.61     0.67     20.2     34    7.5
    201    9.0     0.28     1.48     9.8     89    2.2
    205    6.7     0.30     0.78     14.0     48    4.7
    202    2.3     0.73     0.69     18.4     28    5.7
    203    1.5     1.84     0.65     20.0     12    13.2
    300    4.2     0.27     0.98     14.7     ND    ND
    301    1.1     2.07     0.52     37.7     ND    ND

Claims (34)

1、化学上确定的化合价平台分子，其包含至少一个高分子量聚环氧乙烷基团。
2、权利要求1的化合价平台分子，其包含至少2个高分子量聚环氧乙烷基团。
3、权利要求1的化合价平台分子，其中该高分子量聚环氧乙烷基团的分子量大于22,000道尔顿。
4、权利要求1的化合价平台分子，其中该高分子量聚环氧乙烷基团的分子量至少为40,000道尔顿。
5、权利要求1的化合价平台分子，其中该高分子量聚环氧乙烷基团具有下式：
                   -(CH2CH2O)n-其中n大于500。
6、权利要求5的化合物平台分子，其中n大于600。
7、权利要求5的化合物平台分子，其中n大于700。
8、权利要求5的化合物平台分子，其中n大于800。
9、权利要求1的化合价平台分子，其中该化合价平台分子包含一个核心基团和至少三条臂，其中每条臂包含一个末端。
10、权利要求9的化合价平台分子，其中的核心基团包含高分子量聚环氧乙烷基团。
11、权利要求9的化合价平台分子，其中至少一条所述的臂包含高分子量聚环氧乙烷基团。
12、权利要求9的化合价平台分子，其中的高分子量聚环氧乙烷基团结合于核心或臂上。
13、组合物，其包含权利要求1的化合价平台分子，其中该分子的多分散性小于1.2；其中该组合物中该高分子量聚环氧乙烷基团的平均分子量至少是18,000。
14、权利要求1的化合价平台分子，其包含至少三个反应性缀合基团，所述基团选自羟基、硫醇、异氰酸酯、异硫氰酸酯、胺、烷基卤化物、烷基汞卤化物、醛、酮、羧酸卤化物、α-卤代羰基、α，β-不饱和羰基、卤代甲酸酯、羧酸、羧酸酯、羧酸酐、O-酰基异脲、酰肼、马来酰亚胺、亚氨酸酯、磺酸酯、磺酰卤、α，β-不饱和砜、氨基氧基、氨基脲和β-氨基硫醇。
15、权利要求1的化合价平台分子，其包含至少3个氨基氧基。
16、权利要求1的化合价平台分子，其包含至少3个氨基甲酸酯基团。
17、权利要求1的化合价平台分子与生物学活性分子的缀合物。
18、权利要求17的缀合物，其中的生物学活性分子选自多(糖)、多(氨基酸)、核酸和脂质。
19、权利要求17的缀合物，其中的缀合物是B细胞耐受原。
20、权利要求18的缀合物，其中的生物学活性分子包含可特异性结合抗双链DNA抗体的核酸或其类似物。
21、权利要求19的缀合物，其中的生物学活性分子是β2GPI结构域1多肽或其类似物。
22、权利要求21的缀合物，其中的缀合物对于抗体介导的血栓形成的治疗是有效的。
23、权利要求18的缀合物，其中的生物学活性分子是特异性结合抗αGal抗体的αGal表位或其类似物。
24、药学上可接受的组合物，其包含权利要求17的缀合物和药学上可接受的载体。
25、化学上确定的化合价平台分子与包含β2GPI结构域1多肽的多肽的缀合物，其中的缀合物包含至少一个高分子量聚环氧乙烷基团。
26、权利要求25的缀合物，其中该化合价平台分子包含至少3个氨基氧基。
27、权利要求25的缀合物，其中的化合价平台分子包含至少3个氨基甲酸酯基团。
28、权利要求25的缀合物，其中的高分子量聚环氧乙烷基团的分子量大于22,000道尔顿。
29、权利要求25的缀合物，其中的化合价平台分子包含一个核心基团和至少三条臂，其中每条臂包含一个末端。
30、权利要求25的缀合物，其中的多肽可特异性结合β2GPI依赖性抗磷脂抗体。
31、权利要求30的缀合物，其中的多肽缺乏能够激活具有β2GPI依赖性抗磷脂抗体之个体的T细胞的T细胞表位。
32、权利要求25的缀合物，其中的β2GPI结构域1多肽包含至少五个图19的相邻氨基酸(SEQ ID NO：2)。
33、权利要求25的缀合物，其中的β2GPI结构域1多肽包含SEQID NO：2的氨基酸No.2-63。
34、权利要求25的缀合物，其中该缀合物选自图7所示的化合物200、202、203和205和图16所示的化合物300，其中在所述结构中的D1是由SEQ ID NO：2的氨基酸No.2-63组成的多肽。
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