WO2009082020A1 - アミノオキシ基を含有する反応性化合物 - Google Patents

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WO2009082020A1
WO2009082020A1 PCT/JP2008/073896 JP2008073896W WO2009082020A1 WO 2009082020 A1 WO2009082020 A1 WO 2009082020A1 JP 2008073896 W JP2008073896 W JP 2008073896W WO 2009082020 A1 WO2009082020 A1 WO 2009082020A1
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group
compound
substituted
unsubstituted
salt
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PCT/JP2008/073896
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Inventor
Yasuo Komatsu
Naoshi Kojima
Ken Nonaka
Original Assignee
National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
Dna Chip Research Inc.
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Publication date
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C279/00—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C279/18—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of guanidine groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07C235/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms
    • C07C235/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton
    • C07C235/04—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
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    • C07C279/14—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of guanidine groups bound to acyclic carbon atoms of a carbon skeleton being further substituted by carboxyl groups
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
    • G01N2458/15—Non-radioactive isotope labels, e.g. for detection by mass spectrometry
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to a compound having high reactivity with a molecule having an aldehyde group, a hemiacetal group, a carboxyl group or a keto group, a labeling reagent containing the compound, and a biomolecule immobilization using the compound. It relates to a support. Background art
  • reagents having aminooxy groups have been widely used as reagents for efficiently detecting molecules having an aldehyde group (Non-patent Documents 1 and 2).
  • This reagent (ARP; Aldehydereactiva Probe) has a simple structure in which an aminooxy group and piotin are bonded via a linker. This reagent is allowed to react with and bind to the target molecule, and the target molecule can be detected by spectroscopic detection methods such as fluorescence or luminescence using the formation of a piotine-avidin complex.
  • Typical molecules to be quantified using this reagent include 1 1 ⁇ 8 and 0 8 nucleic acids.
  • various functional RNAs exist in addition to mRNA encoding a gene, rRNA involved in protein synthesis, and tRNA. It has been reported that these functional RNAs function in protein expression in cells and are involved in canceration. Therefore, accurate quantification of mRNA and the intracellular content of these functional RNAs leads to detailed elucidation of gene interactions and disease diagnosis.
  • DNA is damaged by various environmental factors, and there is an abasic site (aponic site; AP site) in which the base portion is lost due to the typical damage.
  • By measuring and estimating the degree of damage of various chemical substances and environmental factors to DNA it is useful for evaluating the chemical mutagenicity of chemical substances in foods and ultraviolet rays.
  • a reagent having high reactivity with the target molecule is required.
  • the reagents that have been used so far have insufficient reaction efficiency, and a large amount of reagents must be allowed to act. For this reason, when it was necessary to quantify the target molecule under many conditions, it was expensive and time consuming.
  • amino groups are also used for reactions such as sugar chains, but the reactivity was insufficient.
  • Non-patent literature l B i o c h em i s t r y 3 1, 3703— 3708 (1 9 92)
  • Non-Patent Document 2 BioChem i st ry 32, 8276-8283 (1 9 93) Disclosure of the Invention
  • An object of the present invention is to provide a compound having high reactivity with a biomolecule having a functional group reactive with an aminooxy group such as an aldehyde group.
  • the present inventors have found that a compound having an aminooxy group, an aromatic group and a hydrophilic group has a high reactivity with a biomolecule having a functional group reactive with an aminooxy group such as an aldehyde group, The present invention has been completed.
  • the present invention includes the following inventions.
  • A is at least one group selected from the group consisting of a substituted or unsubstituted guanidino group, a substituted or unsubstituted polyethylene glycol group, a carboxyl group, an aminooxy group, and a hydroxyl group as a hydrophilic group.
  • D represents a substituted or unsubstituted phenylene group, a substituted or unsubstituted anthrylene group, a substituted or unsubstituted naphthylene group, a substituted or unsubstituted phenanthrylene group, a substituted or unsubstituted anthraquinolylene.
  • R 3 is a substituted or unsubstituted C 9 alkylene group or — (CH 2 ) 1, (OCH 2 CH 2 ) p- (CH 2 ) q —, where o to q Are each independently an integer of 0 to 15 and o + p + q is 1 to: 15)
  • L 2 is represented by the following general formula 5 or 6: s IT H s
  • R 4 is a substituted or unsubstituted C ⁇ 9 alkylene group or one (CH 2 ) r- (OCH 2 CH 2 ) s — (CH 2 ) t —, where!: ⁇ T Are each independently an integer from 0 to 15 and r + s + t is from 1 to 15)
  • n is an integer of 1 to 5
  • m is an integer of 1 to 5
  • R a to R f are each independently A hydrogen atom or a substituent, and ⁇ or a hydrogen atom or an organic group
  • n is an integer of 1 to 5
  • R a to R f are each independently a hydrogen atom or a substituent
  • 2 is a hydrogen atom or an organic group
  • shaku and shaku are each independently a protecting group for a hydrogen atom or an amino group, and n and i are each independently an integer of 1 to 5, and R a to R f Each independently represents a hydrogen atom or a substituent
  • the one least also the X 2 is an organic group, the organic group is a labeling group, (4), (8), or (9) The compound or a salt thereof according.
  • a reagent for labeling a biomolecule having an aldehyde group, a hemiacetal group, a carboxyl group or a keto group the reagent comprising the compound according to (11) or (12) or a salt thereof .
  • a labeled biomolecule obtained by binding the compound according to (11) or (12) and a biomolecule having an aldehyde group, a hemiacetal group, a carboxyl group, or a keto group, The labeled biomolecule, wherein a group and a aldehyde group, a hemiacetal group, a carboxyl group, or a keto group of the biomolecule react to form a covalent bond.
  • a compound having high reactivity to a biomolecule having a functional group reactive with an aminooxy group such as an aldehyde group is provided.
  • Fig. 1a shows the abasic site of DNA
  • Fig. 1b shows the reaction of DNA to the abasic site
  • Fig. 1c shows the 3 'end oxidation reaction of RNA.
  • Fig. 2 shows the binding reaction of ARP and aoNg to RNA (FL r 17Xo x) oxidized at the 3 'end.
  • ss represents a single strand, and the combination of base pairs (XY) formed at the reaction site is shown in parentheses.
  • Figure 3 shows the binding reaction of ARP and aoNg to DNA with an abasic site. The graphs of rate constants when reaction was performed at 37 ° C, 42 ° C and 47 ° C for single-stranded (s s) and double-stranded (d s) of DNA with abasic sites are shown.
  • Figure 4 shows the binding reaction of ARP, aoNg, aoNg_bio to DNA containing 2'-deoxyuridine. 2
  • labeling reagents ARP, aoNg, aoNg—bio
  • Figure 5 shows the results of a cross-linking reaction between double-stranded DNA containing abasic sites.
  • 2′ DNA containing deoxyuridine was treated with UDG to generate abasic sites, and then reacted with aoNa o.
  • the analysis results of the reaction solution using polyacrylamide gel and the graph of reaction rate for each time are shown.
  • the present invention provides compounds of the general formula 1:
  • Examples of the salt include a salt with an inorganic acid, a salt with an organic acid, and a salt with a basic or acidic amino acid.
  • Preferable examples of the salt with inorganic acid include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like.
  • Suitable examples of salts with organic acids include acetic acid, trifluoroacetic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, succinic acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfone And salts with acids.
  • Preferable examples of the salt with basic amino acid include salts with arginine, lysine, ornithine and the like.
  • Preferable examples of the salt with acidic amino acid include salts with aspartic acid, glutamic acid and the like.
  • the compound of the present invention may be an anhydride or a solvate.
  • a compound of the general formula 1 or a solvate of a salt thereof is also encompassed in the compound of the present invention.
  • the solvent is the solute
  • the compound is not particularly limited as long as it does not interfere with the biological activity of the compound of general formula 1 or a salt thereof.
  • suitable solvents include water, methanol, ethanol and acetic acid.
  • the solvent is water.
  • the protecting group of the amino group in general formula 1 is not particularly limited to ⁇ IJ, but for example, an acyl group, a strong rubamate group, a trialkylsilyl group, a phthalyl group, a carboxyalkylcarbonyl group, a tosyl group, a trifluoroacetyl group A trityl group, and a mono- or di-substituted trityl group, preferably an alkyl group. These groups may be substituted.
  • R! Is a substituted or unsubstituted alkyl group having preferably 1 to 10 carbon atoms, more preferably 1 to 6 carbon atoms.
  • the alkyl group may be linear or branched.
  • substituents include, for example, a halogen atom selected from fluorine, chlorine, bromine and iodine, a hydroxyl group, a mercapto group, an amino group, an alkyl group, an alkylamino group, a strong rumoyl group, a thiocarboxy group, a sulfo group.
  • each substituent may be the same or different.
  • the number of substituents is preferably 1 to 3.
  • the expression “0, ⁇ 6” or the like in the description of “ji ⁇ alkyl group” means that the group contains 1 to 6 carbon atoms, and the group may be linear or branched. Good.
  • the divalent aromatic group in D of the general formula 1 may be any group having a benzene ring, and may have a benzene ring in the condensed ring.
  • Examples of the divalent aromatic group include monocyclic or polycyclic divalent aromatic groups containing 5 to 25 carbon atoms, preferably 6 to 20 carbon atoms.
  • a substituted or unsubstituted phenylene group a substituted or unsubstituted pyridylene group, a substituted or unsubstituted pyridazinyl group, a substituted or unsubstituted pyrimidylene group, a substituted or unsubstituted pyradylene group Group, substituted or unsubstituted furylene group, substituted or unsubstituted chainylene group, substituted or unsubstituted pyrrolylene group, substituted or unsubstituted imidazolylene group, substituted or unsubstituted thiazolylene group, substituted or unsubstituted Oxazolylene group, substituted or unsubstituted naphthylene group, substituted or unsubstituted anthrylene group, substituted or unsubstituted pyrenylene group, substituted or unsubstituted indanylene group, substituted or
  • D includes a substituted or unsubstituted phenyl group, a substituted or unsubstituted anthrylene group, a substituted or unsubstituted naphthylene group, a substituted or unsubstituted phenanthrylene group, a substituted or unsubstituted anthraquinolylene, or a substituted group.
  • an unsubstituted atalidinylene is preferable, and a substituted or unsubstituted anthrylene group and a substituted or unsubstituted naphthylene group are particularly preferable.
  • D is the following general formula:
  • D is the following general formula:
  • a divalent aromatic group represented by the formula (1) and an aromatic group in which the aromatic ring has 1 to 3 substituents are also preferred.
  • Examples of the substituent of the aromatic group in D in the general formula 1 include, for example, a halogen atom selected from fluorine, chlorine, bromine and iodine, a hydroxyl group, a mercapto tomb, an amino group, an oxo group, an alkyl group, C 6 alkylamino group, a force Rubamoiru group, Chioka Rubokishi group, sulfo group, sulfino group, isocyanato group, a nitro group, Shiano group, C 2 - 6 alkenyl group, C 3 - i. A cycloalkyl group, Ci—i. An alkoxy group; Cyl group, C!
  • Alkoxycarbonyl group and carboxyl group can be exemplified.
  • each substituent may be the same or different.
  • the number of substituents is preferably 1 to 10, and preferably 1 to 3.
  • the linker group in 1 ⁇ of the general formula 1 is not particularly limited as long as it is a group that bonds the oxygen atom of the aminooxy group and the aromatic group D and does not inhibit the reactivity of the compound of the formula 1.
  • a linker group usually contains a divalent organic group, for example 1 to 15 carbon atoms, preferably 1 to 12 carbon atoms and / or a hetero atom (oxygen, nitrogen or sulfur atom) in the main chain. It is a divalent organic group.
  • the number of atoms in the main chain refers to the number of atoms in the chain that forms the shortest distance between the atoms connected by a single linker. For example, 1 ⁇ -(CH 2 ). One (OCH 2 CH 2 ) p — (CH 2 ) q —.
  • o to q are each independently an integer of 0 to 15 and o + p + q is 1 to 15.
  • R 3 is a substituted or unsubstituted C alkylene group or — (CH 2 ).
  • R 3 is bonded to the oxygen atom of the aminooxy group, and one NH— nitrogen atom is bonded to the aromatic group D.
  • R 3 is bonded to the oxygen atom of the aminooxy group, and one (CO) — carbon atom is bonded to the aromatic group D.
  • the substituent of the alkylene group for example, a halogen atom selected from fluorine, chlorine, bromine and iodine, a hydroxyl group, a mercapto group, an amino group, a C- 6 alkyl group, a C- 6 alkylamino group, a strong rubermoyl group , Thiocarboxy group, sulfo group, sulfino group, isocyanato group, nitro group, cyan group, C 2 — 6 alkenyl group, C 3 —!
  • a halogen atom selected from fluorine, chlorine, bromine and iodine
  • a hydroxyl group for example, a hydroxyl group, a mercapto group, an amino group, a C- 6 alkyl group, a C- 6 alkylamino group, a strong rubermoyl group , Thiocarboxy group, sulfo group, sulfino group, is
  • each substituent may be the same or different.
  • the number of substituents is preferably 1 to 3.
  • the linker group in L 2 of the general formula 1 is a group that binds the aromatic group D and the organic group A containing the hydrophilic group, and is not particularly limited as long as it does not inhibit the reactivity of the compound of the formula 1.
  • a linker group usually contains a divalent organic group, for example 1 to 15, preferably 1 to 12 carbon and / or hetero atoms (oxygen, nitrogen or sulfur atoms) in the main chain. It is a divalent organic group.
  • Examples of L 2 include one (CH 2 ) r ⁇ (OCH 2 CH 2 ) s one (CH 2 ) t —.
  • r to t are each independently an integer of 0 to 15 and r + s + t is 1 to 15.
  • R 4 represents a substituted or unsubstituted C alkylene group or one (CH 2 ) r —
  • the bivalent group represented by these can also be illustrated.
  • —the nitrogen atom of NH_ is bonded to the aromatic group D, and R 4 is bonded to the organic group A having a hydrophilic group.
  • one (CO) — carbon atom is bonded to the aromatic group D, and R 4 is bonded to the organic group A having a hydrophilic group.
  • the substituent for the alkylene group is the same as that described for general formula 3 or 4.
  • the organic group containing a hydrophilic group in A of formula 1 is not particularly limited as long as it is an organic group containing at least one hydrophilic group, and may contain a plurality of, for example, 23, hydrophilic groups. When A contains a plurality of hydrophilic groups, they may be the same or different. In the compound of the present invention, when A contains a hydrophilic group, the water solubility of the compound is improved and the interaction with the target molecule can be improved. As a result, the reactivity with a molecule having an aldehyde group, a hemiacetal group, a carboxyl group or a keto group can be improved.
  • the organic group A is preferably at least one hydrophilic group selected from the group consisting of a substituted or unsubstituted guanidino group, a substituted or unsubstituted polyethylene glycol group, a carboxyl group, an aminooxy group and a hydroxyl group as a hydrophilic group. Group, more preferably a substituted or unsubstituted guanidino group.
  • Examples of the substituent of the guanidino group and the polyethylene glycol group include a halogen atom selected from fluorine, chlorine, bromine and iodine, a hydroxyl group, a mercapto group, an amino group, a C! -E alkyl group, and a Ci- 6 alkylamino group.
  • Substituted or unsubstituted guanidino groups include, for example, the following general formula 2:
  • the organic group in X and ⁇ 2 is not particularly limited as long as it does not interfere with the hydrophilicity of the guanidino group.
  • the substituent of the above guanidino group can be exemplified.
  • the substituted or unsubstituted guanidino group includes the following general formulas 2 ′ and 2 ′′:
  • the organic group in X 3 X 7 is not particularly limited as long as it does not interfere with the hydrophilicity of the guanidino group, and examples thereof include the substituent of the above guanidino group.
  • the aminooxy group in the compound of the present invention can form a covalent bond with high reactivity with an aldehyde group, a hemiacetal group, a carboxyl group or a keto group, particularly an aldehyde group
  • the compound of the present invention has an aminooxy group It can be bonded with high reactivity to a compound having an aldehyde group, a hemiacetyl group, a carboxyl group or a keto group, such as a biomolecule.
  • the compound of the present invention containing a substituted or unsubstituted guanidino group as a hydrophilic group can be bound with high reactivity to a nucleic acid, particularly a double-stranded nucleic acid.
  • the organic group A may further have a labeling group. Since the compound of the present invention can bind to a biomolecule having an aldehyde group, a hemiacetal group, a carboxyl group or a keto group with high reactivity, the compound of the present invention in which the organic group A has a labeling group is used. By reacting with a biomolecule, the biomolecule can be labeled efficiently. Therefore, in one embodiment, the present invention provides a reagent for labeling a biomolecule having an aldehyde group, a hemiacetal group, a force carboxyl group or a keto group, the label comprising the compound of the present invention having a labeling group. It relates to a reagent.
  • the present invention also provides a labeled biomolecule formed by binding the compound of the present invention to a biomolecule having an aldehyde group, a hemiacetal group, a carboxyl group or a keto group, wherein the aminooxy group of the compound And the labeled biomolecule, wherein the aldehyde group, hemiacetal group, carboxyl group or keto group of the biomolecule reacts to form a covalent bond.
  • biomolecules having an aldehyde group, a hemiacetal group, a carboxyl group, or a ketone group include polypeptides, polynucleotides, and sugar chains.
  • Poly Peptides include peptides, oligopeptides and proteins.
  • Polynucleotides include nucleic acids such as DNA, RNA, and non-natural nucleic acids, which may be single-stranded or double-stranded, and polynucleotides include oligonucleotides.
  • the base length of the polynucleotide is usually 2 to 10,000 bases, preferably 2 to 1000 bases.
  • Non-natural nucleic acid having a ketone group is also included in the polynucleotide.
  • Polynucleotides also include derivatives of DNA and RNA, such as RNA having an aldehyde group in which the hydroxyl group at the 3 'end is oxidized, DNA having an abasic site, and aldehyde in which the hydroxyl group is oxidized. Also included are those that have become the base group. In particular, the introduction, generation and labeling of these groups in nucleic acids is described below.
  • Methods for generating aldehyde groups in nucleic acids can be divided into several types.
  • One typical method is the formation of an aldehyde structure through the formation of an abasic site (or apnic site (AP site)).
  • the abasic site of a nucleic acid shows the structure of a sugar part from which the base part of the nucleic acid has been removed (Fig. 1a), and exists in an equilibrium between a closed and an open structure.
  • the abasic site has a hemiacetal structure in the ring-closed state, but has an aldehyde structure in the ring-opened form, and reacts with the aldehyde structure when the aminooxy group is acted on (Fig. 1-b).
  • This abasic site can be generated by treating natural or non-natural nucleic acids under acidic conditions.
  • Non-natural nucleic acids include 2-pyrimidone (T etrahedron Letters, 3 1, 1 75— 1 78 (1 99 0)), 2′-dexyl xanthosine (Nucleic Acids Re search, 31, 1045) — 1051 (2003)), 1-Daza-1, 2, Deoxyguanosine (Org Letter, 7, 709-712 (2005)).
  • 2'-deoxy_D-ribose derivatives Non-Patent Document 6; Non-Patent Document 7 that form an abasic site by deprotecting the protecting group of the hemiacetal structure under special reaction conditions are also known. ing.
  • a method of generating an abasic site by introducing a damaged base into an oligonucleotide or polynucleotide and then treating with an enzyme that removes the damaged base.
  • damaged bases include 2'-deoxyuridine, 5-hydroxymethyl-1 'and deoxycytidine, and uracil N-glycosylase acts on 2'-deoxyuridine.
  • 2'-deoxyuridines can be introduced into oligonucleotides and polynucleotides by chemical synthesis or by performing an extension reaction with DNA polymerase using the triphosphate (dUTP) as a substrate.
  • dUTP triphosphate
  • This 2'-deoxyuridine is incorporated into DNA and labeled with abasic sites generated by the action of uracil N daricosylase, then DNA is fragmented and the fragment is chemically labeled (R ibo— SPIA ( (Registered trademark)) is also commercially available (Special Table 2005-534304).
  • the structure of the labeling reagent contained in this commercially available kit is different from that of the reagent of the present invention. By using the reagent of the present invention, it becomes possible to label the target nucleic acid more rapidly and with a high yield.
  • an aldehyde group in a nucleic acid without going through an abyssic site.
  • it is possible to generate an aldehyde group by introducing a non-natural nucleic acid into an oligonucleotide in advance and then performing an oxidation reaction (Te tr a h ed r rn r t ter s, 37, 9067-9070 (1996)).
  • an aldehyde group can be formed even in a natural type.
  • RNA is labeled at the 2′-position or the 3′-position.
  • the labeling group refers to a group containing a labeling substance.
  • the labeling substance include labeling substances commonly used for labeling biomolecules, such as radioisotopes, dyes (fluorescent dyes, luminescent dyes), digoxigenin (DIG), biotin, methylene blue, and fuescene. It is not limited to.
  • the organic group A contains a guanidino group of the above general formula 2 or is a guanidino group of the general formula 2, either X or X 2 It is an organic group, and the organic group is preferably the labeling group. Also when the organic group A is a guanidino group of the above general formula 2 ′ or 2 ′′ or contains it, any of X 3 to X 5 , or X 6 or X 7 is preferably a labeling group.
  • the labeling substance may be directly bonded to the nitrogen atom of the guanidino group, or may be bonded via a linker.
  • the linker is not particularly limited, but is usually a divalent organic group, for example, 1 to 15 carbon atoms, preferably 1 to 12 carbon atoms in the main chain. And / or a divalent organic group containing a hetero atom (oxygen, nitrogen or sulfur atom).
  • a hetero atom oxygen, nitrogen or sulfur atom
  • v, w and x are each independently an integer of 0 to 15, and v + w + x is 1 to 15.
  • Preferred is one (CH 2 ) 2 — (OCH 2 CH 2 ) 2 —NH—.
  • a labeling group containing piotin as a labeling substance (in the general formula 2, or as ⁇ , the following formula:
  • a group represented by biotin can be exemplified.
  • the compound of the present invention in which the organic group is an organic group containing a guanidino group to which a labeling group is bonded can be preferably used for labeling a nucleic acid.
  • Biomolecules labeled with the labeling reagent of the present invention can be quantified by various detection systems. Therefore, this labeling reagent is not affected by the detection system and detection equipment, and has high versatility, so it can be widely used.
  • the organic group A may contain a biomolecular group.
  • the biomolecule group refers to a group containing a biomolecule such as a sugar chain, a polynucleotide (including an oligonucleotide), and a polypeptide (for example, an enzyme).
  • a contains a polynucleotide it can be used as a PCR primer.
  • a primer extension reaction is carried out in the presence of a ⁇ -type DNA and a substrate labeled with fluorescence or piotin (dNTP), a fluorescent substance (or (Piotin, etc.) is taken in and the target molecule is labeled accordingly.
  • the organic group A contains a guanidino group of the above general formula 2 or is a guanidino group of the general formula 2
  • either of and X 2 is an organic group
  • the organic group is the above biomolecule group.
  • the organic group A includes the group of the above general formula 2, or is the group of the general formula 2 ′
  • any one of X 3 to X 5 is an organic group
  • the organic group is the biomolecular group.
  • the group of the general formula 2 ′′ is included or is the group of the general formula 2 ′′
  • either X 6 or X 7 is an organic group
  • the organic group is It is preferably a molecular group.
  • the biomolecule may be directly bonded to the nitrogen atom of the guanidino group or may be bonded via a linker.
  • the linker is the same as the linker in the labeling group.
  • the aminooxy group in the compound of the present invention binds to a molecule having an aldehyde group, a hemiacetal group, a carboxyl group, or a keto group, such as a biomolecule, with high reactivity.
  • a layer can be formed and the biomolecule can be immobilized on the carrier via the compound of the present invention. Therefore, in one embodiment, the present invention provides a biomolecule immobilization support for immobilizing a biomolecule having an aldehyde group, a hemiacetal group, a carboxyl group, or a keto group, comprising: a carrier and a surface of the carrier; It relates to a support comprising a layer of the compound of the invention present.
  • Formation of the layer of the compound of the present invention may be carried out simply by coating the compound of the present invention on a carrier or by forming a covalent bond with a functional group on the carrier. .
  • the organic group A in the compound of the present invention preferably contains a functional group suitable for binding to the carrier.
  • a functional group include groups capable of forming a covalent bond with a functional group present on the carrier to be immobilized.
  • examples thereof include a group that can be covalently bonded to an isocyanate group or an isocyanate group (for example, an amino group, an aminooxy group, etc.), or a group that can react with a maleimide group or a disulfide group (for example, a mercapto group).
  • These functional groups may be in a protected form.
  • the protected form means a form in which a hydrogen atom of a functional group is substituted with a protecting group.
  • Protecting groups such as amino group and aminooxy group are not particularly limited, but alkyl group, acyl group, strong rubamate group, trialkylsilyl group, phthalyl group, strong ruxyalkylcarbonyl group, tosinore group, trifluoroacetyl group And trityl group, and mono- or di-substituted trityl group.
  • Examples of the mono-substituted trityl group include a monoalkoxytrityl group, preferably a monoalkoxytrityl group having an alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms, more preferably 1 carbon atom, specifically, a monomethoxytrityl group, mono Examples thereof include an ethoxytrityl group, a monopropoxytrityl group, a monoisopropoxytrityl group, and a monobutoxytrityl group.
  • Examples of the material of the carrier to which the compound of the present invention is bound include glass such as quartz glass, borosilicate glass and soda lime glass, silicon, metal, fiber, wood, paper, ceramics, plastic (for example, polyester resin, Polyethylene resin, Polypropylene resin, ABS resin, Nylon, Acrylic resin, Fluorine resin, Polycarbonate resin, Polyurethane resin, Methylpentene resin, Phenolic resin, Melami Resin, epoxy resin, vinyl chloride resin).
  • glass, silicon, ceramics or plastic it is preferable to use glass, silicon, ceramics or plastic.
  • a layer of the compound of the present invention is formed on the surface of the carrier.
  • examples of the functional group to be introduced include an active ester group, an epoxy group, an amino group, a black mouth group, a disulfide group, an aldehyde group, a maleimide group, a carbodiimide group, and an isothiocyanate. Nato tomb, isocyanato group, etc.
  • a carrier into which an active ester grave, an epoxy group, an aldehyde group, a carbohydride group, an isothiocyanate group, or an isocyanate group is introduced.
  • a compound of the present invention having a mercapto group is bound, it is preferable to use a carrier into which a maleimide group or a disulfide group has been introduced.
  • the shape of the carrier is not particularly limited, and examples include a substrate shape, a thread shape, a spherical shape, a bead shape, a polygonal shape, a powder shape, and a porous shape.
  • the substrate shape is preferable.
  • an excellent support for immobilizing nucleic acid can be obtained by binding the compound to a carrier.
  • a microarray can be efficiently produced by immobilizing nucleic acid such as DNA on the obtained support for immobilizing nucleic acid.
  • the labeling reaction to nucleic acids such as RNA and DNA can be made efficient, and the time required for gene detection can be shortened. Furthermore, the high reactivity of the compounds of the present invention makes it possible to improve the detection sensitivity and to quantify the detected values, so that more detailed information on the gene can be obtained accurately. In addition, even when a layer of the compound of the present invention is formed on a carrier and a binding reaction with a target biomolecule is performed on the surface, the target biomolecule can be efficiently captured on the carrier. It can be applied to molecular identification.
  • N 1 — (tritylaminooxyacetyl) 1,1,5-diaminonaphthalene (compound 2) 1.00 g (2.1 1 mmo 1) and N-trifluoroacetyl 1] 3-alanine 78
  • EDC hydrochloric acid 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbopositimide
  • 8 10 mg (4.22 mmo 1) The mixture was stirred at room temperature for 17 hours.
  • Ethyl acetate 22 Om 1 was added to the reaction solution, and washed 4 times with water 8 Om 1.
  • N 1 - (2-aminoethyl carbonyl) - N 5 - (Torichinoreami Nookishiasechiru) -1, 5- ⁇ amino naphthalene (Compound 4) (synthesized by the method described above from the compound 3, 1. O Ommo l ) was dissolved in 15 ml of a mixed solution of methylene chloride-acetonitrile (1: 2). In a separate glass container, add fluorenylmethyloxycarbonyl isothiocyanate 3 1 Omg (1.1 Ommo 1) and diisopropylethylamine 0.19 ml (1.1 Ommo 1) to 20 ml methylene chloride.
  • N 1- [2- (N 3- ⁇ 2- [2- (2-Piochelaminoethoxy) ethoxy] ethyl ⁇ -N 2 -fluorenylmethyloxycarbonyldanidino) in an argon atmosphere chill carbonyl] - N 5 - (amino o carboxymethyl ⁇ cetyl) -1, 5- ⁇ amino naphthalene (compound 9) 5 Omg a (0. 054 mm o 1) 1 , 4 - Jiokisan 3 m 1 and methanol 3 It was dissolved in a mixed solvent of m 1, piperidine 220 ⁇ (2.2 mmo 1) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 20 hours.
  • Oligonucleotide synthesis was performed on an Ap p lie e Bios ys tem s type 394 DNAZRNA synthesizer. Synthesized on 0.2 or 1 ⁇ mo 1 scale. The HP lines used a 0 i 1 son device, and the analysis was performed using a Waters 996 photodiode array detector.
  • the column used was a / Bondersphere (C— 1 8) column ⁇ 3.9 x 15 Omm (manufactured by Woods).
  • the column used was TSK—GEL DEAE—2 SW ⁇ 4.6 ⁇ 2500 mm (Tosoh Corporation).
  • ARP A1dehydeReactiveProbe; DOJINDO
  • the oxidation reaction was carried out at 37 ° C for 60 minutes.
  • 2mM Add DTT 5 ⁇ 1 and heat at 37 ° C for 30 minutes add 240 ⁇ a oNg (or a oNg-bio) 5 1 and perform labeling reaction at 37 ° C (total reaction volume 30 1).
  • the sample was sampled and analyzed after a certain time. As a result of the reaction, it was confirmed that the excess sodium periodate used in the oxidation could be reduced to continuously perform the oxidation to the labeling reaction.
  • oligonucleotide (F-20Z) containing an abasic site (Z) was synthesized.
  • F—20 Z represents 5 ′ F-GAATTGCTTGGAAGAZGTTT 3 ′.
  • the synthesized oligonucleotide was deprotected with concentrated aqueous ammonia according to a normal method, and then 4 mL of 40% acetic acid was added and stirred at room temperature for 4 hours to deprotect the TBDMS group. After the reaction, acetic acid was distilled off under reduced pressure, water was further added, and the solvent was distilled off under reduced pressure. This operation was repeated several times to remove acetic acid.
  • oligonucleotide was dissolved in sterilized water and purified by reverse phase HP LC and ion exchange HP LC.
  • Sp35 which is the complementary strand of F-20Z, was synthesized and purified in the same manner (Tables 4 and 5).
  • S p 35 C represents 3 ′ CGAAAGT AAC CTTAACGAAC CTTCTCC AAAGAAC GA 5 ′.
  • the conditions for each HP LC were the same as the purification of F—L r 17 X and AS 32 Y.
  • Oligonucleotide F containing an abasic site prepared in Example 7 was dissolved in 100 mM phosphate buffer (pH 7) and 10 mM sodium periodate, and an oxidation reaction was performed at 37 ° C. for 60 minutes. After the reaction, it was desalted with a NA P5 column (GE Healthcare), concentrated, and purified with a modified 20% polyacrylamide gel (19: 1). The gel pieces were desalted using a YMC cartridge (100 mg / 1 m 1). The obtained oxidized oligonucleotide (F-20Z o X) was quantified by UV and subjected to the reaction.
  • Oxidized F-20Z o x (12 pmo 1) was dissolved in 3 ⁇ 1 of 1M phosphate buffer (pH 7) and 15 ⁇ 1 of sterilized water, heated at 90 ° C. for 1 minute, and ice-cooled. After 10 seconds, it was left at room temperature for 5 minutes and preincubated at 37 ° C for 5 minutes. Subsequently, a labeling reagent (5 mM ARP or aoNg) 12 ⁇ 1 dissolved in sterilized water in advance was added, and the labeling reaction was started at 37 ° C, 42 ° C or 47 ° C.
  • a labeling reagent 5 mM ARP or aoNg 12 ⁇ 1 dissolved in sterilized water in advance was added, and the labeling reaction was started at 37 ° C, 42 ° C or 47 ° C.
  • the reagent reacted to Abasic Site Z in F-20Z.
  • AoNg also showed higher reactivity with DNA.
  • the reaction efficiency of ARP was the same as that of single strands, but with a o N g, the reaction efficiency was greatly improved.
  • Oligonucleotides labeled with fluorescein at the 5 'end and dU in the chain (F-20 dU) and its complementary strand (S p 20 dU) are 2'-deoxyuridine phosphoramidite reagents (G 1 en R es. Was synthesized using an automated DNA synthesizer.
  • F_20 dU represents 5 ′ F-GAATTGCT dUGGAAGAG GTTT 3 ′
  • S p 20 dU represents 3 ′ CTTAACGA d UCCTTCTC CAAA 5 ′.
  • Synthetic oligonucleotides were deprotected according to conventional methods, and then separated and purified by reversed-phase HPLC (Table 6). The conditions of HP LC are shown below. Table 6 Oliconucleotide Nucleotide Reverse HPLC conditions Retention time: (min)
  • ACGAACCTTCTCCAAAGAACGA 5 Heat the reaction solution at 90 ° C for 1 minute and ice-cool, preincubate at 37 ° C for 5 minutes, add UDG (lunit, 0.5 ⁇ 1) to it, and add a total volume of 30 ⁇ 1 to 37 ° C The reaction was performed for 60 minutes. Thereafter, the enzyme was inactivated by heating at 90 minutes for 1 minute, and allowed to stand for 10 minutes on ice and 5 minutes at room temperature.
  • a labeling reaction was started at 37 ° C. by adding 6 ⁇ l of a labeling reagent (ARP, aONg, aONg-bio) adjusted to 1 OmM previously dissolved in this reaction solution.
  • ARP labeling reagent
  • reaction rate constants of a oNg, ARP, and a oNg_b i ⁇ were 0.5 1m in 1 and 0.03 min ⁇ ⁇ 0.17 min 1 , respectively. It became clear that ao N g-bio showed higher reaction efficiency.
  • the enzyme was inactivated by heating at 90 for 1 minute, and allowed to stand at ice-cooled for 10 minutes and at room temperature for 5 minutes.
  • the labeling reaction was started at 37 ° C by adding 2 mM ao Nao 6 ⁇ 1 dissolved beforehand in this reaction solution.
  • a similar reaction was performed with F-20OdU, single strand only. Sampling 3 ⁇ 1 after a certain period of time and mixing 1 oadingsolutionmix 5 ⁇ 1 (50 mM EDTA, 1 OM urea, 0.1% BPB; 4 / zl, 20 mM glutaraldehyde; 1 ⁇ 1
  • the reaction was stopped in addition to (preparation).
  • Fluorenylmethyloxycarbonyl isothiocyanate 85 Omg (3.0 1 mm o 1) and diisopropylethylamine 0.5 2 ml (3.01 mmo 1) in methylene chloride under an argon atmosphere Dissolved in 30 ml and cooled to 0 ° C.
  • N 1 - (trityl ⁇ Mino O carboxymethyl ⁇ cetyl) - 1 5-di ⁇ amino naphthalene (Compound 2) 1.
  • 1 9 g (2. 5 1 mmo 1) methylene chloride solution (30 m l) Oyutsukuri Was added dropwise, and the mixture was further returned to room temperature and stirred for 1.5 hours.
  • Lysine 0.40 ml (4. Ommo 1) was added and stirred at room temperature for 16 hours. After the reaction solution was concentrated under reduced pressure, the residue was dissolved in 35 ml of water and washed 3 times with 15 ml of ethyl acetate. The aqueous layer was concentrated under reduced pressure and purified by C 18 cartridge column chromatography (elution solvent: acetonitrile 0.1M TEAA solution) to obtain a crude product (52 mg). A portion of this crude product was dissolved in 5 ml of 2% aqueous acetic acid and purified again by C18 cartridge column chromatography (elution solvent: acetonitrile, water) to give the title compound (compound 16, acetic acid). Salt) 9.2 mg was obtained as a white flocculent material.
  • Example 11 Using the same oligonucleotide as in Example 1, the reaction efficiency of ao N dg-bio was examined under the same conditions. As a result of the reaction, the reaction rate constant of ao N dg—bio was 0.23 min— 1 , and as with ao N g and ao N g—bio, ao N dg It became clear that _b io showed higher reaction efficiency.

Abstract

　本発明は、アルデヒド基などの官能基に対して高い反応性を有する化合物を提供する。本発明は、一般式１：Ｒ１-ＮＨ-Ｏ-Ｌ１-Ｄ-Ｌ２-Ａ　　（１）（式中、Ｒ１は、水素原子、アルキル基又はアミノ基の保護基であり、Ｄは、２価の芳香族基であり、Ｌ１は、直接結合又はリンカー基であり、Ｌ２は、直接結合又はリンカー基であり、Ａは親水性基を含む有機基である）で表される化合物又はその塩に関する。

Description

明 細 書 ァミノォキシ基を含有する反応性化合物 技術分野
本発明は、 アルデヒド基、 へミアセタール基、 カルボキシル基又はケト基を有す る分子に対して高い反応性を有する化合物、 該化合物を含む標識試薬、 及び該化合 物を用いた生体分子固定化用支持体に関する。 背景技術
アルデヒド基、 へミアセタール基、 カルボキシル基又はケト基に反応する構造と して、 一級アミノ基、 アミノォキシ基などが知られている。 一級アミノ基の場合は、 不安定なシッフベースを形成するため、 その結合を還元して安定化させる必要があ る。 一方、 アミノォキシ基は高い反応性を有し、 アミノ基のように還元剤を必要と しない。 このため、 アルデヒ ド基を有する分子を効率的に検出する試薬として、 ァ ミノォキシ基をもった試薬がこれまで広く利用されてきた （非特許文献 1、 非特許 文献 2) 。 この試薬 （ARP ; A l d e h y d e Re a c t i v e P r o b e) は、 アミノォキシ基とピオチンがリンカ一を介して結合したシンプルな構造を 有する。 この試薬を、 標的分子に反応させて結合させ、 ピオチン一アビジン複合体 形成を利用して、 蛍光又は発光など分光学的な検出法により標的分子を検出するこ とができる。
この試薬を用いて定量する代表的な分子として、 1 1^八及び0 八などの核酸が ある。 RNAには、 遺伝子をコードした mRNA、 タンパク質合成に関与する r R NA、 及び t RNAの他に、 種々の機能性 RNAが存在していることが近年明らか になってきた。 これらの機能性 RNAは、 細胞内でタンパク質の発現などにおいて 機能し、 癌化にも関与していることが報告されている。 そのため、 mRNAとこれ ら機能性 RN Aの細胞内量を正確に定量することは、 遺伝子相互作用の詳細な解明 や疾病の診断にもつながる。 また、 DNAは種々の環境因子によって損傷を受け、 その代表的な損傷に塩基部が失われたアベィシックサイト （アプリニックサイト ； APサイト） がある。 アベィシックサイトはへミアセタール構造とアルデヒド構造 の平衡状態で存在し、 上記 ARP試薬を作用させるとアルデヒド構造に反応するた め、 アベィシックサイトを検出することが可能になっている。 種々の化学物質、 環 境因子の DNAに対する損傷度を測定して見積もることで、 食品に含まれる化学物 質、 紫外線等の遺伝子変異原性評価にも役立つ。 生体分子の中でも特に DN A及び RN Aを正確に定量するには、 標的分子に対し て高い反応性を有する試薬が必要である。 しかしながら、 これまでに用いられてき た試薬はその反応効率が不十分で、 多量の試薬を作用させる必要があった。 そのた め、 多くの条件下で標的分子を定量する必要がある場合には、 コスト高となり時間 を要していた。 この他、 糖鎖などの反応にもァミノォキシ基が用いられているが、 反応性が不十分であった。
そのため、 生体分子のなかでも特にこれら RNA、 DNAなどの分子に対し、 少 量でも迅速に反応する新規な試薬の開発が望まれていた。
非特許文献 l : B i o c h em i s t r y 3 1, 3703— 3708 (1 9 92)
非特許文献 2 : B i o c h em i s t r y 32， 8276— 8283 (1 9 93) 発明の開示
本発明の課題は、 アルデヒド基などのアミノォキシ基と反応性の官能基を有する 生体分子に対して高い反応性を有する化合物を提供することである。
本発明者らは、 アミノォキシ基、 芳香族基及び親水性基を有する化合物が、 アル デヒド基などのアミノォキシ基と反応性の官能基を有する生体分子に対して高い反 応性を有することを見出し、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は以下の発明を包含する。
(1) 一般式 1 ：
Figure imgf000004_0001
(式中、 は、 水素原子、 アルキル基又はアミノ基の保護基であり、 Dは、 2価 の芳香族基であり、 1^は、 直接結合又はリンカ一基であり、 L2は、 直接結合又 はリンカ一基であり、 Aは親水性基を含む有機基である）
で表される化合物又はその塩。
(2) Aが、 親水性基として、 置換又は無置換のグァニジノ基、 置換又は無置換の ポリエチレングリコ一ル基、 カルボキシル基、 アミノォキシ基及びヒドロキシル基 からなる群から選択される少なくとも 1つの基を含む、 （1) 記載の化合物又はそ の塩。
(3) Aが、 親水性基として、 置換又は無置換のグァニジノ基を含む、 （2) 記載 の化合物又はその塩。
(4) Aが、 以下の一般式 2 ：
Figure imgf000005_0001
(式中、 1及び 2は、 水素原子又は有機基である）
で表される、 （1) 〜 （3) のいずれかに記載の化合物又はその塩。
(5) Dが、 置換若しくは無置換のフエ二レン基、 置換若しくは無置換のアントリ レン基、 置換若しくは無置換のナフチレン基、 置換若しくは無置換のフエナントリ レン基、 置換若しくは無置換のアントラキノリレン、 又は置換若しくは無置換のァ クリジ二レンである、 （1) 〜 （4) のいずれかに記載の化合物又はその塩。
(6) Dが、 以下の一般式：
Figure imgf000005_0002
(式中、 一方の結合部位が L i又は Oに結合し、 他方の結合部位が L2又は Aに結 合する）
で表される 2価の芳香族基、 及ぴこれらの芳香族基において芳香環が 1〜 3個の置 換基を有する芳香族基から選択される、 （5) 記載の化合物又はその塩。
(7) 1^が、 以下の一般式 3又は 4 ：
. I？ H .
- 3-C-N-| (3) H M
-R3-N— C— J (4)
(式中、 R3は、 置換若しくは無置換の C ,— 9アルキレン基又は— （CH2) 。一 (OCH2CH2) p- (CH2) q—であり、 ここで、 o〜qは、 それぞれ独立し て 0〜 1 5の整数であり、 o + p + qは、 1〜： 1 5である）
のいずれかで表される 2価の基であり、 L2が、 以下の一般式 5又は 6 ：
Figure imgf000006_0001
s IT H s
-C-N-R4-| (6)
(式中、 R4は、 置換若しくは無置換の C ^9アルキレン基又は一 （CH2) r - (OCH2CH2) s— (CH2) t—であり、 ここで、 ！：〜 tは、 それぞれ独立し て 0〜 1 5の整数であり、 r + s + tは、 1〜1 5であるである）
のいずれかで表される 2価の基である、 （1) 〜 （6) のいずれかに記載の化合物 又はその塩。
(8) 以下の一般式 7 ：
Figure imgf000006_0002
(式中、 は、 水素原子又はアミノ基の保護基であり、 nは、 1〜5の整数であ り、 mは、 1〜 5の整数であり、 Ra〜Rfは、 それぞれ独立して、 水素原子又は 置換基であり、 及び ^ま、 水素原子又は有機基である）
で表される、 （1) 記載の化合物又はその塩。
(9) 以下の一般式 8 ：
Figure imgf000006_0003
(式中、 は、 水素原子又はアミノ基の保護基であり、 nは、 1〜 5の整数であ り、 Ra〜Rfは、 それぞれ独立して、 水素原子又は置換基であり、 X2は、 水素原 子又は有機基である）
で表される、 （1) 記載の化合物又はその塩。
(10) 以下の一般式：
Figure imgf000007_0001
(式中、 尺 及び尺^ま、 それぞれ独立して、 水素原子又はアミノ基の保護基であ り、 n及び iは、 それぞれ独立して、 1〜5の整数であり、 Ra〜Rfは、 それぞ れ独立して、 水素原子又は置換基である）
で表される、 （1) 記載の化合物又はその塩。
(11) Aが標識基をさらに含む、 （1) 〜 （9) のいずれかに記載の化合物又は その塩。
(12) 及び X2の少なく とも一方が有機基であり、 該有機基が標識基である、 (4) 、 （8) 、 又は （9) 記載の化合物又はその塩。
(13) アルデヒ ド基、 へミアセタール基、 カルボキシル基又はケト基を有する生 体分子を標識するための試薬であって、 （1 1) 又は （12) 記載の化合物又はそ の塩を含む前記試薬。
(14) (11) 又は （12) 記載の化合物と、 アルデヒ ド基、 へミアセタール基、 カルボキシル基又はケト基を有する生体分子とが結合してなる標識化生体分子であ つて、 該化合物のアミノォキシ基と該生体分子のアルデヒ ド基、 へミアセタール基、 カルボキシル基又はケト基とが反応して共有結合を形成している、 前記標識化生体 分子。
(15) アルデヒ ド基、 へミアセタール基、 カルボキシル基又はケト基を有する生 体分子を固定化するための生体分子固定化用支持体であって、 担体及び該担体表面 に存在する （1) 〜 （10) のいずれかに記載の化合物又はその塩の層を含む、 前 記支持体。
本発明により、 アルデヒ ド基などのアミノォキシ基と反応性の官能基を有する生 体分子に対して高い反応性を有する化合物が提供される。 図面の簡単な説明
図 1 aは DNAのアベィシックサイ トを表し、 図 1 bは DNAのアベィシックサ ィ トへの反応を表し、 図 1 cは RNAの 3' 末端酸化反応を表す。
図 2は、 3' 末端が酸化された RNA (F-L r 17Xo x) に対する ARPと a oNgの結合反応を示す。 s sは 1本鎖を表し、 括弧内に反応部位で形成される 塩基対 （XY) の組み合わせを示す。 G r a y b a r, AR P ； b 1 a c k b a r, a o N g
図 3は、 アベィシックサイトを有する DNAへの AR Pと a oNgの結合反応を 示す。 アベィシックサイトを有する DN Aの一本鎖 （s s) 及び二本鎖 （d s) に 対し、 37で、 42°C、 47°Cで反応を行ったときの速度定数のグラフを示す。 図 4は、 2' —デォキシゥリジンを含む DNAに対する AR P、 a oNg、 a o Ng_b i oの結合反応を示す。 2， 一デォキシゥリジンを含む DNA2本鎖を U DGで処理した後に、 標識試薬 （ARP、 a oNg、 a oNg— b i o) を添加し、 各時間の反応産物の精製率を調べた。 反応液のポリアクリルアミ ドゲルによる分析 の結果と、 各時間の反応率のグラフを示した。
図 5は、 アベィシックサイトを含む 2本鎖 DNA間の架橋反応の結果を示す。 2 ' —デォキシゥリジンを含む DNAを UDGで処理してアベィシックサイトを生 成させた後に a oNa oを反応させた。 反応液のポリアクリルアミドゲルによる分 析の結果と、 各時間の反応率のグラフを示した。
本明細書は、 本願の優先権の基礎である特願 2007-330315号の明細書、 特許請求の範囲、 及び図面に記載された内容を包含する。 発明を実施するための最良の形態
一実施形態において本発明は、 一般式 1 ：
Figure imgf000008_0001
(式中、 は、 水素原子、 アルキル基 （好ましくは Cぃ6アルキル基） 又はアミ ノ基の保護基であり、 Dは、 2価の芳香族基であり、 は、 直接結合又はリンカ 一基であり、 L2は、 直接結合又はリンカ一基であり、 Aは、 親水性基を含む有機 基である） で表される化合物又はその塩 （以下、 本発明の化合物と称する場合があ る） に関する。
塩としては、 例えば、 無機酸との塩、 有機酸との塩、 及び塩基性又は酸性アミノ 酸との塩などが挙げられる。 無機酸との塩の好適な例としては、 塩酸、 臭化水素酸、 硝酸、 硫酸、 リン酸などとの塩が挙げられる。 有機酸との塩の好適な例としては、 酢酸、 トリフルォロ酢酸、 フマル酸、 シユウ酸、 酒石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コハク酸、 リンゴ酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸、 p-トルエンスル ホン酸などとの塩が挙げられる。 塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、 アル ギニン、 リジン、 オル二チンなどとの塩が挙げられる。 酸性アミノ酸との塩の好適 な例としては、 ァスパラギン酸、 グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
本発明の化合物は、 無水物であっても、 溶媒和物であってもよい。 一般式 1の化 合物又はその塩の溶媒和物もまた本発明の化合物に包含される。 ここで溶媒は溶質 (一般式 1の化合物又はその塩）の生物活性を妨げるものでなければ特に制限されな レ、。 適当な溶媒の具体例としては、 水、 メタノール、 エタノール及び酢酸が含まれ る。 好ましくは、 溶媒は水である。
一般式 1の におけるァミノ基の保護基は、 特に^ IJ限されないが、 例えば、 ァ シル基、 力ルバメート基、 トリアルキルシリル基、 フタリル基、 カルボキシアルキ ルカルポニル基、 トシル基、 トリフルォロアセチル基、 トリチル基、 及びモノ又は ジ置換トリチル基が挙げられ、 好ましくはアルキル基である。 これらの基は置換さ れていてもよい。
R！は、 好ましくは炭素数 1〜 1 0、 より好ましくは炭素数 1〜 6の、 置換若し くは無置換のアルキル基である。 アルキル基は、 直鎖でも分岐鎖でもよい。 ここで、 置換基としては、 例えば、 フッ素、 塩素、 臭素及びヨウ素から選ばれるハロゲン原 子、 ヒ ドロキシル基、 メルカプト基、 アミノ基、 アルキル基、 アルキ ルァミノ基、 力ルバモイル基、 チォカルボキシ基、 スルホ基、 スルフィノ基、 イソ シアナト基、 ニトロ基、 シァノ基、 c 2 _ 6アルケニル基、 c 3 1 0シクロアルキル 基、 じい 。アルコキシ基、 。ァシル基、 Cい 。アルコキシカルボ二ル基並 びにカルボキシル基等を挙げることができる。 置換基が複数存在する場合、 各置換 基は同一でも異なっていてもよい。 置換基の数は、 好ましくは 1〜3個である。 本明細書において 「じ ^アルキル基」 等の記載における 「0 , - 6」 等の表現は、 その基が 1〜 6個の炭素原子を含むことをさす、 該基は直鎖でも分岐鎖でもよい。 一般式 1の Dにおける 2価の芳香族基は、 ベンゼン環を有するものであればよく、 縮合環中にベンゼン環を有するものでもよい。 2価の芳香族基としては、 5 ~ 2 5 個の炭素原子、 好ましくは 6〜 2 0個の炭素原子を含む単環式又は多環式の 2価の 芳香族基が挙げられる。 より具体的には、 置換又は無置換のフエ二レン基、 置換又 は無置換のピリジレン基、 置換又は無置換のピリダジニル基、 置換又は無置換のピ リミジ二レン基、 置換又は無置換のピラジュレン基、 置換又は無置換のフリ レン基、 置換又は無置換のチェ二レン基、 置換又は無置換のピロリレン基、 置換又は無置換 のイミダゾリレン基、 置換又は無置換のチアゾリレン基、 置換又は無置換のォキサ ゾリレン基、 置換又は無置換のナフチレン基、 置換又は無置換のアントリ レン基、 置換又は無置換のピレニレン基、 置換又は無置換のインダニレン基、 置換又は無置 換のテトラヒ ドロナフチレン基、 置換又は無置換のキノリレン基、 ィソキノリレン 基、 置換又は無置換のシンノリ二レン基、 置換又は無置換のキナゾリ二レン基、 置 換又は無置換のキノキサリニレン基、 置換又は無置換のナフチリジニレン基、 置換 又は無置換のフタラジニレン基、 置換又は無置換のインドリレン基、 置換又は無置 換のイソインドリレン基、 置換又は無置換のベンゾフリレン基、 置換又は無置換の ベンゾチェ二レン基、 置換又は無置換のインダゾリレン基、 置換又は無置換のベン ゾイミダゾリレン基、 置換又は無置換のベンゾチアゾリレン基、 置換若しくは無置 換のフエナントリレン基、 置換若しくは無置換のアントラキノリレン、 又は置換若 しくは無置換のアタリジニレンが挙げられる。 Dとしては、 置換又は無置換のフエ 二レン基、 置換又は無置換のアントリレン基、 置換又は無置換のナフチレン基、 及 び置換若しくは無置換のフエナントリレン基、 置換若しくは無置換のアントラキノ リレン、 又は置換若しくは無置換のアタリジニレンが好ましく、 特に置換又は無置 換のアントリレン基及び置換又は無置換のナフチレン基が好ましい。
より具体的には、 Dは、 以下の一般式：
Figure imgf000010_0001
(式中、 一方の結合部位が L 又は Oに結合し、 他方の結合部位が L 2又は Aに結 合する）
で表される 2価の芳香族基、 及びこれらの芳香族基において芳香環が 1〜 3個の置 換基を有する芳香族基から選択される。
あるいは、 Dは、 以下の一般式：
Figure imgf000010_0002
(式中、 一方の結合部位が L i又は Oに結合し、 他方の結合部位が L 2又は Aに結 合する）
で表される 2価の芳香族基、 及びこれらの芳香族基において芳香環が 1〜 3個の置 換基を有する芳香族基から選択される。
あるいは、 Dとしては、 以下の一般式：
Figure imgf000011_0001
で表される 2価の芳香族基、 及びこれらの芳香族基において芳香環が 1〜 3個の置 換基を有する芳香族基もまた好ましい。
一般式 1の Dにおける芳香族基の置換基としては、 例えば、 フッ素、 塩素、 臭素 及ぴヨウ素から選ばれるハロゲン原子、 ヒ ドロキシル基、 メルカプト墓、 アミノ基、 ォキソ基、 アルキル基、 Cぃ6アルキルアミノ基、 力ルバモイル基、 チォカ ルボキシ基、 スルホ基、 スルフィノ基、 イソシアナト基、 ニトロ基、 シァノ基、 C 2— 6アルケニル基、 C 3— i。シクロアルキル基、 Ci— i。アルコキシ基、 〇ぃ】。ァ シル基、 C！ _ i 0アルコキシカルボニル基並びにカルボキシル基等を挙げることが できる。 置換基が複数存在する場合、 各置換基は同一でも異なっていてもよい。 置 換基の数は、 好ましくは 1~ 10個、 好ましくは 1〜3個である。
一般式 1の 1^におけるリンカ一基は、 アミノォキシ基の酸素原子と芳香族基 D を結合する基であって、 式 1の化合物の反応性を阻害しないものであれば特に制限 されない。 リンカ一基は、 通常、 2価の有機基、 例えば主鎖に 1〜1 5個、 好まし くは 1~1 2個の炭素原子並びに 又は複素原子 （酸素、 窒素又は硫黄原子） を含 む 2価の有機基である。 主鎖に含まれる原子の数は、 リンカ一基がつなぐ原子間に おいて最短距離を形成する鎖に含まれる原子の数をさす。 1^としては、 例えば、 - (CH2) 。一 （OCH2CH2) p— (CH2) q—が挙げられる。 ここで、 o〜 qは、 それぞれ独立して 0〜1 5の整数であり、 o + p + qは、 1〜1 5である。
としては、 例えば、 以下の一般式 3又は 4 ：
Figure imgf000012_0001
j H I? .
-R3-N-C— f (4)
(式中、 R3は、 置換若しくは無置換の C アルキレン基又は— （CH2) 。一 (OCH2CH2) p- (CH2) q—であり、 ここで、 o〜qは、 それぞれ独立し て 0〜 1 5の整数であり、 o + p + qは、 1〜： 1 5である）
で表される 2価の基も例示できる。 一般式 3においては、 R3がァミノォキシ基の 酸素原子に結合し、 一 NH—の窒素原子が芳香族基 Dに結合する。 一般式 4におい ては、 R3がアミノォキシ基の酸素原子に結合し、 一 （CO) —の炭素原子が芳香 族基 Dに結合する。
ここで アルキレン基の置換基としては、 例えば、 フッ素、 塩素、 臭素及び ヨウ素から選ばれるハロゲン原子、 ヒドロキシル基、 メルカプト基、 アミノ基、 C ぃ6アルキル基、 C — 6アルキルアミノ基、 力ルバモイル基、 チォカルボキシ基、 スルホ基、 スルフィノ基、 イソシアナト基、 ニトロ基、 シァノ基、 C2— 6アルケニ ル基、 C 3—！ 0シクロアルキル基、 C i— 10アルコキシ基、 じ〗— 10ァシル基、 C !_ 10アルコキシカルボニル基並びにカルボキシル基等を挙げることができる。 置換 基が複数存在する場合、 各置換基は同一でも異なっていてもよい。 置換基の数は、 好ましくは 1〜3個である。
一般式 1の L2におけるリンカ一基は、 芳香族基 Dと親水性基を含む有機基 Aと を結合する基であって、 式 1の化合物の反応性を阻害しないものであれば特に制限 されない。 リンカ一基は、 通常、 2価の有機基、 例えば主鎖に 1〜1 5個、 好まし くは 1〜1 2個の炭素原子及ぴ 又は複素原子 （酸素、 窒素又は硫黄原子） を含む 2価の有機基である。 L2としては、 例えば、 一 （CH2) r- (OCH2CH2) s 一 (CH2) t—が挙げられる。 ここで、 r〜 tは、 それぞれ独立して 0〜1 5の 整数であり、 r + s + tは、 1〜1 5である。
L2としては、 例えば、 以下の一般式 5又は 6 ： u 0
)- -C-R4- (5)
Figure imgf000012_0002
(式中、 R4は、 置換若しくは無置換の C アルキレン基又は一 （CH2) r—
(OCH2CH2) s - (CH2) t一であり、 ここで、 r tは、 それぞれ独立し て 0~ 1 5の整数であり、 r + s + tは、 1 1 5である）
で表される 2価の基も例示できる。 一般式 5においては、 — NH_の窒素原子が芳 香族基 Dに結合し、 R4が親水性基を有する有機基 Aに結合する。 一般式 6におい ては、 一 （CO) —の炭素原子が芳香族基 Dに結合し、 R4が親水性基を有する有 機基 Aに結合する。 じ アルキレン基の置換基は、 一般式 3又は 4について記載 したのと同様である。
一般式 1の Aにおける親水性基を含む有機基は、 親水性基を少なくとも 1つ含む 有機基であれば特に制限されず、 親水性基を複数、 例えば、 2 3個含んでいても よい。 Aが複数の親水性基を含む場合、 それらは同一でも異なっていてもよい。 本 発明の化合物において Aが親水性基を含むことにより、 化合物の水溶性が向上し、 標的分子との相互作用を向上させることができる。 その結果、 アルデヒド基、 へミ ァセタール基、 カルボキシル基又はケト基を有する分子との反応性を向上させるこ とができる。
有機基 Aは、 好ましくは親水性基として、 置換又は無置換のグァニジノ基、 置換 又は無置換のポリエチレングリコール基、 カルボキシル基、 アミノォキシ基及びヒ ドロキシル基からなる群から選択される少なくとも 1つの親水性基、 より好ましく は置換又は無置換のグァニジノ基を含む。
グァニジノ基及びポリエチレングリコール基の置換基としては、 例えば、 フッ素、 塩素、 臭素及びヨウ素から選ばれるハロゲン原子、 ヒドロキシル基、 メルカプト基、 アミノ基、 C!-eアルキル基、 C i— 6アルキルアミノ基、 力ルバモイル基、 チォカ ルポキシ基、 スルホ基、 スルフィノ基、 イソシアナト基、 ニトロ基、 シァノ基、 C 2_6アルケニル基、 C3— 10シクロアルキル基、 じい 。アルコキシ基、 じい 。ァ シル基、 。アルコキシカルボニル基、 カルボキシル基並びにグァニジノ基等 を挙げることができる。
置換又は無置換のグァニジノ基は、 例えば、 以下の一般式 2 ：
(2)
Figure imgf000013_0001
(式中、 X,及び χ2は、 水素原子又は有機基である）
で表される。 ここで X,及び Χ2における有機基は、 グァニジノ基の親水性を妨げ るものでなければ特に制限されず、 例えば、 上記グァニジノ基の置換基が例示でき る。
本発明において、 置換又は無置換のグァニジノ基には、 以下の一般式 2 ' 及び 2 " ：
Figure imgf000014_0001
(式中、 X 3 X 7は、 水素原子又は有機基である）
で表される基も包含される。 ここで X 3 X 7における有機基は、 グァニジノ基の 親水性を妨げるものでなければ特に制限されず、 例えば、 上記グァニジノ基の置換 基が例示できる。
本発明の化合物におけるアミノォキシ基は、 アルデヒ ド基、 へミアセタール基、 カルボキシル基又はケト基、 特にアルデヒ ド基と高い反応性で共有結合を形成でき ることから、 本発明の化合物は、 アミノォキシ基は、 アルデヒ ド基、 へミアセタ一 ル基、 カルボキシル基又はケト基を有する化合物、 例えば生体分子に、 高い反応性 で結合させることができる。 親水性基として置換又は無置換のグァニジノ基を含む 本発明の化合物は、 核酸、 特に 2本鎖の核酸に対し、 高い反応性で結合させること ができる。
有機基 Aは、 さらに標識基を有していてもよい。 本発明の化合物は、 アルデヒ ド 基、 へミアセタール基、 カルボキシル基又はケト基を有する生体分子と高い反応性 をもって結合しうることから、 有機基 Aが標識基を有する本発明の化合物をこのよ うな生体分子と反応させることにより、 該生体分子を効率的に標識することができ る。 従って、 一実施形態において本発明は、 アルデヒ ド基、 へミアセタール基、 力 ルポキシル基又はケト基を有する生体分子を標識するための試薬であって、 標識基 を有する本発明の化合物を含む前記標識試薬に関する。 本発明はまた、 本発明の化 合物と、 アルデヒ ド基、 へミアセタール基、 カルボキシル基又はケト基を有する生 体分子とが結合してなる標識化生体分子であって、 該化合物のアミノォキシ基と該 生体分子のアルデヒ ド基、 へミアセタール基、 カルボキシル基又はケト基とが反応 して共有結合を形成している、 前記標識化生体分子に関する。
アルデヒ ド基、 へミアセタール基、 カルボキシル基、 又はケトン基を有する生体 分子としては、 ポリペプチド、 ポリヌクレオチド及び糖鎖などが挙げられる。 ポリ ペプチドには、 ペプチド、 オリゴペプチド及びタンパク質が包含される。 ポリヌク レオチドには、 DNA、 RN A及び非天然型核酸等の核酸が包含され、 これらは 1 本鎖でも 2本鎖でもよく、 又、 ポリヌクレオチドにはオリゴヌクレオチドも包含さ れる。 本発明においてポリヌクレオチドの塩基長は、 通常 2〜10000塩基、 好 ましくは 2〜 1000塩基である。 核酸の任意の位置に、 アルデヒ ド基、 へミアセ タール基、 カルボキシル基、 又はケトン基を複数導入または生成させることが可能 であり、 こうして得られたアルデヒ ド基、 へミアセタール基、 カルボキシル基、 又 はケトン基を有する非天然型核酸も本発明においてポリヌクレオチドに包含される。 また、 ポリヌクレオチドには、 DNA及び RNAの誘導体、 例えば、 3' 末端のヒ ドロキシル基が酸化されたアルデヒ ド基を有する RNA、 アベィシックサイ トを有 する DNA、 及びそのヒ ドロキシル基が酸化されてアルデヒ ド基となったものも包 含される。 特に、 核酸におけるこれらの基の導入、 生成、 及びそれらの基に対する 標識に関して以下に記載する。
核酸におけるアルデヒ ド基の生成方法は幾つかの種類に分けることができる。 そ の代表的な方法の一つに、 アベィシックサイ ト （またはアプリニックサイ ト （AP サイ ト） ） 形成を通してのアルデヒ ド構造の形成がある。 核酸のアベィシックサイ トは、 核酸の塩基部分が除去された糖部分の構造を示し （図 1一 a) 、 閉環と開環 構造の平衡で存在している。 アベィシックサイ トは、 閉環状態ではへミアセタール 構造であるが、 開環型ではアルデヒ ド構造となっており、 アミノォキシ基を作用さ せるとそのアルデヒ ド構造に反応する （図 1—b) 。
このアベィシックサイ トは、 天然の核酸や非天然型核酸を酸性条件で処理するこ とによって生成させることができる。 非天然型核酸としては、 2—ピリミジドン体 (T e t r a h e d r o n L e t t e r s , 3 1, 1 75— 1 78 ( 1 99 0) ) 、 2 ' —デォキシ一キサントシン体 （Nu c l e i c Ac i d s Re s e a r c h, 31， 1045— 1051 (2003) ) 、 1—デァザ一 2， —デォ キシグアノシン体 （O r g L e t t, 7, 709-712 (2005) ) などが挙 げられる。 また、 その他にも特別な反応条件でへミアセタール構造の保護基を脱保 護させてアベィシックサイ トを形成する 2' —デォキシ _D—リボース誘導体 （非 特許文献 6 ；非特許文献 7) なども知られている。
また、 上記のように誘導体を用いてアベィシックサイ トを生成させる他に、 損傷 塩基をオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドに導入後、 その損傷塩基を除去す る酵素で処理し、 アベィシックサイ トを生成させる方法もある。 この損傷塩基には、 2 ' —デォキシゥリジン、 5—ヒ ドロキシメチル一 2' —デォキシシチジンなどが 挙げられ、 2' —デォキシゥリジンに対してはゥラシル Nグリコシラーゼを作用さ せることによってアベィシックサイトを生成させることができる。 2' —デォキシ ゥリジンは、 化学合成によっても、 またそのトリリン酸体 （dUTP) を基質に用 いて DNAポリメラーゼによる伸張反応を行うことによつても、 オリゴヌクレオチ ドおよびポリヌクレオチド中に複数導入することが可能である。 この 2' —デォキ シゥリジンを DNA中に取り込ませてゥラシル Nダリコシラーゼを作用させて生成 したアベィシックサイトを標識後に DNAを断片化させ、 その断片を化学的に標識 するキット （R i b o— S P I A (登録商標） ） も市販されている （特表 2005 -534304) 。 この市販キット中に含まれる標識試薬と本発明の試薬の構造は 異なり、 本発明の試薬を用いることによって、 より迅速、 かつ高収率で標的核酸を 標識することが可能となる。
アベィシックサイトを経由せずにアルデヒド基を核酸中に生成させる方法もある。 例えばあらかじめ非天然型核酸をオリゴヌクレオチドに導入し、 その後酸化反応を 行うことでアルデヒド基を生成させることが可能である （Te t r a h e d r o n Le t t e r s, 37, 9067-9070 (1996) ) 。 また、 RNAの場合 には、 天然型であってもアルデヒド基を形成可能である。 例えば RNAの 3' 末端 の 2' 位、 3' 位の水酸基を過ヨウ素酸等によって酸化させ、 その 3' 末端にアル デヒド基を発生させることが可能である （図 1— c) 。 この場合、 2' 位と 3' 位 にアルデヒド基が生じるため、 アミノォキシ基及び標識基を有する化合物を作用さ せると 2' 位または 3' 位において RN Aが標識される。
ケトン基を持つ非天然型核酸も報告されており （Or g L e t t, 3, 398 3- 3986 (2001) ) 、 これらを導入した核酸に対し、 本発明のアミノォキ シ基を有する化合物を反応させることでケト基に対して標識することも可能である。 標識基は、 標識物質を含む基をさす。 標識物質としては、 生体分子の標識に慣用 される標識物質、 例えば、 放射性同位元素、 色素 （蛍光色素、 発光色素） 、 ジゴキ シゲニン （D I G) 、 ビォチン、 メチレンブルー、 フエ口センなどを例示できるが これらに限定されない。
本発明の化合物が標識基を含む態様において、 有機基 Aが、 上記一般式 2のグァ 二ジノ基を含むか、 又は一般式 2のグァニジノ基である場合は、 X 及び X2のど ちらかが有機基であり、 該有機基が上記標識基であることが好ましい。 有機基 Aが、 上記一般式 2' 又は 2" のグァニジノ基であるかこれを含む場合も、 X3〜X5の いずれか、 又は X 6若しくは X 7が標識基であることが好ましい。
その場合、 標識物質は、 グァニジノ基の窒素原子に直接結合していてもよいし、 リンカ一を介して結合していてもよい。 リンカ一としては、 特に制限されないが、 通常、 2価の有機基、 例えば主鎖に 1〜15個、 好ましくは 1〜12個の炭素原子 及び 又は複素原子 （酸素、 窒素又は硫黄原子） を含む 2価の有機基である。 例え ば、 一 （CH2) v- (OCH2CH2) w- (CH2) X— NH—が挙げられる。 こ こで、 v、 w及び xは、 それぞれ独立して 0〜15の整数であり、 v+w+xは、 1〜15である。 好ましくは、 一 （CH2) 2— (OCH2CH2) 2— NH—であ る。
標識物質としてピオチンを含む標識基 （一般式 2においては、 又は ^ と しては、 以下の式：
Figure imgf000017_0001
ビォチン で表される基を例示することができる。
有機基 Αが、 標識基が結合したグァニジノ基を含む有機基である本発明の化合物 は、 特に、 核酸に標識を付すために好適に用いることができる。
本発明の標識試薬によつて標識された生体分子は、 様々な検出系によつて定量可 能である。 そのため、 本標識試薬は検出系、 検出機器の影響を受けず、 高い汎用性 をもっため、 広く利用される可能性を有する。
あるいは、 有機基 Aは、 生体分子基を含んでいてもよい。 生体分子基は、 糖鎖、 ポリヌクレオチド （オリゴヌクレオチドを含む） 、 ポリペプチド （例えば、 酵素） などの生体分子を含む基をさす。 Aがポリヌクレオチドを含む場合、 PCRのブラ イマ一として用いることができる。 例えば、 本発明の化合物を標的分子に結合させ た後、 铸型 DNAと蛍光またはピオチンなどで標識された基質 （dNTP) 共存下 でプライマーの伸長反応を行った場合、 ポリヌクレオチドに蛍光物質 （またはピオ チンなど） が取り込まれ、 それによつて標的分子が標識される。
有機基 Aが、 上記一般式 2のグァニジノ基を含むか、 又は一般式 2のグァニジノ 基である場合は、 及び X2のどちらかが有機基であり、 該有機基が上記生体分 子基であることが好ましい。 有機基 Aが、 上記一般式 2， の基を含むか、 又は一般 式 2' の基である場合は、 X3〜X5のいずれかが有機基であり、 該有機基が上記 生体分子基であることが好ましい。 上記一般式 2" の基を含むか、 又は一般式 2" の基である場合は、 X 6及び X 7のどちらかが有機基であり、 該有機基が上記生体 分子基であることが好ましい。 その場合、 生体分子は、 グァニジノ基の窒素原子に 直接結合していてもよいし、 リンカ一を介して結合していてもよい。 リンカ一は、 上記標識基におけるリンカーと同様である。
本発明の化合物におけるアミノォキシ基は、 アルデヒ ド基、 へミアセタール基、 カルボキシル基又はケト基を有する分子、 例えば生体分子に、 高い反応性で結合す ることから、 担体の表面に本発明の化合物の層を形成し、 本発明の化合物を介して 生体分子を担体に固定化することができる。 従って、 一実施形態において本発明は、 アルデヒ ド基、 へミアセタール基、 カルボキシル基又はケト基を有する生体分子を 固定化するための生体分子固定化用支持体であって、 担体及び該担体表面に存在す る本発明の化合物の層を含む、 前記支持体に関する。
本発明の化合物の層の形成は、 単に本発明の化合物を担体上に塗布することによ り実施してもよいし、 担体上の官能基と共有結合を形成することにより実施しても よい。
担体上の官能基と共有結合を形成する場合、 本発明の化合物における有機基 Aは、 担体への結合に適した官能基を含むことが好ましい。 そのような官能基としては、 固定化しようとする担体上に存在する官能基と共有結合を形成しうる基が挙げられ、 例えば、 活性エステル基、 エポキシ基、 アルデヒ ド基、 カルポジイミ ド基、 イソチ オシァネート基又はイソシァネート基と共有結合しうる基 （例えば、 アミノ基、 ァ ミノォキシ基など） 、 あるいはマレイミ ド基又はジスルフイ ド基と反応しうる基 (例えば、 メルカプト基など） 等が挙げられる。 これらの官能基は保護された形態 でもよい。 保護された形態とは、 官能基の水素原子が保護基で置換された形態を意 味する。 アミノ基、 アミノォキシ基などの保護基としては、 特に制限されないが、 アルキル基、 ァシル基、 力ルバメート基、 トリアルキルシリル基、 フタリル基、 力 ルボキシアルキルカルボニル基、 トシノレ基、 トリフルォロアセチル基、 トリチル基、 及びモノ又はジ置換トリチル基が挙げられる。 モノ置換トリチル基としては、 例え ば、 モノアルコキシトリチル基、 好ましくは炭素数 1〜4、 より好ましくは炭素数 1のアルコキシ基を有するモノアルコキシトリチル基、 具体的には、 モノメ トキシ トリチル基、 モノエトキシトリチル基、 モノプロポキシトリチル基、 モノイソプロ ポキシトリチル基及びモノブトキシトリチル基が挙げられる。
本発明の化合物を結合させる担体の材料としては、 例えば、 石英ガラス、 ホウ珪 酸ガラス及びソーダライムガラスなどのガラス、 シリコン、 金属、 繊維、 木材、 紙、 セラミックス、 プラスチック （例えば、 ポリエステル榭脂、 ポリエチレン樹脂、 ポ リプロピレン樹脂、 A B S樹脂、 ナイロン、 アクリル樹脂、 フッ素樹脂、 ポリカー ボネート樹脂、 ポリウレタン樹脂、 メチルペンテン樹脂、 フエノール樹脂、 メラミ ン榭脂、 エポキシ樹脂、 塩化ビニル榭脂） が挙げられる。 本発明においては、 ガラ ス、 シリコン、 セラミックス又はプラスチックを使用するのが好ましい。 上記担体 の表面に本発明の化合物の層を形成する。 担体に官能基を導入する場合、 導入する 官能基としては、 例えば、 活性エステル基、 エポキシ基、 アミノ基、 クロ口基、 ジ スルフィ ド基、 アルデヒ ド基、 マレイイミ ド基、 カルボジィミ ド基、 イソチオシァ ナト墓、 イソシアナト基等が挙げられる。 アミノ基またはアミノォキシ基を有する 本発明の化合物を結合する場合は、 活性エステル墓、 エポキシ基、 アルデヒ ド基、 カルポジイミ ド基、 イソチオシァネート基、 イソシァネート基が導入された担体を 用いるのが好ましく、 メルカプト基を有する本発明の化合物を結合する場合は、 マ レイミ ド基、 ジスルフイ ド基が導入された担体を用いるのが好ましい。
担体の形状は、 特に制限されず、 基板状、 糸状、 球状、 ビーズ状、 多角形状、 粉 末状、 多孔質状などが挙げられ、 本発明においては基板状が好ましい。
置換又は無置換のグァニジノ基を含む有機基 Aを有する本発明の化合物は、 核酸 に特異的に結合し得ることから、 当該化合物を担体に結合させることにより、 優れ た核酸固定化用支持体を製造することができる。 得られた核酸固定化用支持体に D N Aなどの核酸を固定化することにより、 効率的にマイクロアレイを製造するがで さる。
本発明の化合物により、 特に、 RNA及び DNAなどの核酸への標識反応を効率 化することができ、 遺伝子検出に要する時間を短縮することができる。 さらに本発 明の化合物の高い反応性によって、 検出感度の向上、 及び検出値の定量化が可能と なり、 遺伝子に関わるより詳細な情報を正確に得ることができる。 また、 担体上に 本発明の化合物の層を形成し、 その表面上で標的生体分子との結合反応を行う場合 にも、 担体上で効率的に標的生体分子の捕捉が行えるようになり、 生体分子の同定 に応用することができる。
以下、 本発明を実施例により説明するが、 本発明の範囲は実施例に限定されない。 実施例
(実施例 1) アミノォキシナフタレン試薬 （a oNg、 化合物 6および a oNg— b i o t i n、 化合物 10) の合成
薄層クロマトグラフィーは K i e s e 1 g e 1 60F 254プレート （Me r c k社） 上で行った。 カラムクロマトグラフィ一には W a k o g e l C— 200
(和光純薬工業） を用いた。 〗H NMR及び13 C NMRはテトラメチルシラン を内部標準とし、 J EOL J NM— EX 270を用いて測定した。
a o N g、 化合物 6の合成 スキーム
Figure imgf000020_0001
卜リエチレアミン
ジメチルホルムアミド、室温
Figure imgf000020_0002
66%(2工程収率）
S塩酸，堪化メチレン
室温
62%
Figure imgf000020_0003
N1- (トリチルアミノォキシァセチル） 一 1 5—ジァミノナフタレン （化合物 2)_
アルゴン雰囲気下、 1， 5—ジァミノナフタレン （化合物 1) 440mg (2. 8 0 mm o 1 ) 及び N—トリチルァミノォキシ酢酸 1. 0 0 g (3. 0 0 mm o 1 ) をジメチルホルムアミ ド （DMF) 30m lに溶解し、 EDC [塩酸 1—ェチ ルー 3— （ 3—ジメチルァミノプロピル） カルボジィミ ド] 5 90mg (3. 1 0 mmo 1 ) を加え、 室温で 20時間撹拌した。 反応液に酢酸ェチル 200 m 1を加 え、 水 70m 1で 4回洗浄した。 溶液を減圧下濃縮した後、 酢酸ェチルで 3回共沸 し、 生じた沈殿を酢酸ェチル （20m l ) とへキサン （1 20m l ) の混合溶液に 懸濁させた。 沈殿を吸引濾過により濾取して標記化合物 （化合物 2) 1. 0 3 g (収率 7 2%) を淡茶色粉状物質として得た。
FAB-LRMS ra/z 473.3 (M + )； FAB-HRMS 計算値 ： 473.2103 (C31H27N302 [M+])， 実測 値： 473.2093.
Ή NMR (270 MHz, DMS0-d6) δ ： 9.33 (br s, 1 H, NH), 8.38 (br s, 1 H, NH), 7.93 (d, 1 H, naph, J = 8.6 Hz), 7.64 (d, 1 H, naph, J = 7.3 Hz), 7.34— 7.25 (m， 16 H, Tr and naph) , 7.20 (t， 1 H, naph, J = 8.2 Hz) , 6.99 (d, 1 H: naph, J = 8.2 Hz), 6.70 (d, 1 H， naph, J = 7.3 Hz), 5.78 (br s, 2 H, NH2) , 4.20 (s, 2 H， CH2) .
13C NMR (67.8 MHz, DMSO - d6) δ : 168.26 (C), 144.96 (C), 144.01 (C), 132.13 (C), 128.70 (CH), 127.57 (CH), 126.68 (CH), 123.05 (C), 122.76 (CH), 121.06 (CH), 119.88 (CH), 109.15 (CH), 107.58 (CH), 73.64 (C), 73.31 (CH2)。 N1- [2 - (トリフルォロアセチルァミノ） ェチルカルボニル] — N5— (トリ チルアミノォキシァセチル） _ 1， 5—ジァミノナフタレン （化合物 3)
アルゴン雰囲気下、 N1— (トリチルアミノォキシァセチル） 一 1， 5—ジアミ ノナフタレン （化合物 2) 1. 00 g (2. 1 1 mmo 1 ) 及び N—トリフルォロ ァセチル一 ]3—ァラニン 78 Omg (4. 22mm o 1 ) をジメチルホルムアミ ド 25m lに溶解し、 EDC [塩酸 1ーェチルー 3— ( 3—ジメチルァミノプロピ ル） カルポジイミ ド] 8 10mg (4. 22 mmo 1 ) を加え、 室温で 1 7時間撹 拌した。 反応液に酢酸ェチル 22 Om 1を加え、 水 8 Om 1で 4回洗浄した。 溶液 を減圧下濃縮後、 シリカゲルカラムクロマトグラフィー （溶出溶媒：酢酸ェチルー へキサン） により精製して標記化合物 （化合物 3) 96 lmg (収率 71 %) を白 色固体状物質として得た。
FAB-LRMS m/z 640.3 (M+)； FAB-HRMS 計算値： 640· 2297 (C36H31F3N404 [M+]), 実測 値： 640.2308.
Ή NMR (270 MHz, DMS0 - d6) 6： 10.04 (s, 1 H, NH), 9.61 (s, 2 H, NH and NH), 8.36 (s, 1 H， NH), 7.94 (d, 1 H, naph, J = 8.6 Hz), 7.74—7.69 (m, 3 H, naph), 7.55—7.48 (m, 2 H, naph), 7.35—7.25 (m， 15 H, Tr), 4.23 (s, 2 H,
CH2) , 3.56 (br t, 2 H, CH2, J = 6.8 Hz), 2.78 (t, 2 H， CH2， J = 6.8 Hz) .
13C NMR (67.8 MHz, DMSO— d6) S ： 169.27 (C), 168.76 (C)， 156.12 (C, q, J =
35.8 Hz), 144.01 (C), 133.57 (C), 132.73 (C), 128.73 (CH), 128.46 (C)， 128.41 (C), 127.58 (CH), 126.70 (CH), 125.36 (CH), 125.11 (CH), 122.04
(CH), 120.52 (CH), 119.67 (CH), 115.80 (C， q, J = 287.9 Hz), 73.67 (C),
73.33 (CH2)， 36.04 (CH2), 34.80 (CH2)。
N1- (2—アミノエチルカルボニル） 一 N5— (トリチルァミノォキシァセチ ル） 一 1, 5—ジァミノナフタレン （化合物 4)
N1- [2- (トリフルォロアセチルァミノ） ェチルカルボニル] 一 N5— （ト リチルアミノォキシァセチル） 一 1, 5—ジァミノナフタレン （化合物 3) 950 m g (1. 48 mm o 1 ) にエタノール 4 O m 1及び濃アンモニア水 20 m 1を加 えて耐圧ガラス容器に密封し、 6 で 4時間加熱した。 溶液を室温に戻した後、 減圧下濃縮し、 残渣をァセトニトリルで 3回共沸して標記化合物 （化合物 4) を淡 黄色泡状物質として得た。 本化合物はこれ以上の精製を行わず、 次の反応に用いた。 FAB-LRMS m/z 545.4 (MH+)； FAB-HRMS 計算値： 545.2553 (C34H33N403 [MH+]), 実測 値： 545.2573.
Ή NMR (270 MHz, DMS0-d6) δ： 10.19 (s， 1 H, NH), 9.62 (s, 1 H, NH), 8.34 (s, 1 H， NH), 7.98 (d, 1 H， naph, J = 8.2 Hz), 7.80 (br s, 2 H, NH2), 7.75-7.70 (m, 3 H, naph) , 7.58-7.49 (m, 2 H, naph) , 7.38-7.25 (m, 15 H, Tr), 4.23 (s, 2 H, CH2), 3.16 (t, 2 H, CH2, J = 6.6 Hz), 2.89 (t, 2 H, CH2， J = 6.6 Hz).
13C NMR (67.8 MHz, DMS0_d6) δ : 168.89 (C), 168.78 (C), 143.98 (C), 133.29 (C)， 132.77 (C)， 128.70 (CH), 128.49 (C), 128.29 (C), 127.56 (CH), 126.70 (CH), 125.32 (CH), 125.19 (CH), 122.13 (CH), 121.94 (CH), 120.49 (CH), 119.82 (CH), 73.64 (C), 73.30 (CH2) , 35.11 (CH2), 32.82 (CH2)。
N1- (2—グァニジノエチルカルボニル） 一 N5— (トリチルアミノォキシァセ チル） 一 1 , 5—ジァミノナフタレン （化合物 5)
アルゴン雰囲気下、 前反応により合成した N1— ( 2 _アミノエチルカルボ二 ル） 一 N5— (トリチルアミノォキシァセチル） 一 1 , 5—ジァミノナフタレン (化合物 4) 全量 （1. 48mmo 1 ) をジメチルホルムアミ ド 1 5m 1に溶解し、 塩酸 1 H—ピラゾール一 1一カルボキシアミジン 32 Omg (2. 20 mm o 1 ) 及びトリェチルァミン 0. 6 1m l (4. 40 mm o 1 ) を加え、 室温で 6時間撹 拌した。 反応液に酢酸ェチル 1 5 Om 1を加え、 水 5 Om 1で 4回洗浄した。 溶液 を減圧下濃縮後、 シリカゲルカラムクロマトグラフィー （溶出溶媒：エタノール一 クロ口ホルム） により精製して標記化合物 （化合物 5) 56 7mg (収率 66%) を淡茶色泡状物質として得た。
FAB-LRMS m/z 587.3 (MH+)； FAB-HRMS 計算値 ： 587.2771 (C35H35N603 [MHつ）， 実測 値： 587.2772.
Ή NMR (270 MHz, DMS0— d6) δ： 10.11 (s， 1 H, NH), 9.61 (s， 1 H, NH), 8.34 (s， 1 H, NH) , 7.96 (ra, 1 H, naph) , 7.75-7· 70 (m, 3 H, naph) , 7.67 (br s， 1 H, NH), 7.57-7.48 (m, 2 H, naph) , 7.38—7.26 (m, 15 H, Tr), 7.25 (br s， 3 H, NH2 and NH) , 4.23 (s, 2 H, CH2) , 3.49 (dt, 2 H, CH2, J = 5.6, 6.3 Hz) , 2.79 (t, 2 H, CH2, J = 6.3 Hz).
13C NMR (67.8 MHz, DMSO— d6) δ： 169.39 (C), 168.60 (C), 156.52 (C), 143.83 (C), 133.30 (C)， 132.60 (C), 128.55 (CH), 128.33 (C), 128.22 (C), 127.40 (CH), 126.53 (CH), 125.17 (CH), 125.02 (CH), 121.93 (CH), 121.79 (CH), 120.36 (CH), 119.62 (CH), 73.49 (C), 73.14 (CH2)， 36.97 (CH2), 34.88 (CH2)。 N5- (アミノォキシァセチル） —N1— (2—グァニジノエチルカルボニル） 一 1, 5—ジァミノナフタレン · 2塩酸塩 （化合物 6)
アルゴン雰囲気下、 N1— (2—グァニジノエチルカルボニル） 一 N5— (トリ チルアミノォキシァセチル） 一 1, 5—ジァミノナフタレン （化合物 5) 59mg (0. l Ommo l ) を塩化メチレン 4. 0 m 1に溶解し、 濃塩酸 60 μ 1を加え、 室温で 2. 5時間撹拌した。 反応液中に生じた白色の沈殿物質を塩化メチレンで洗 浄した後に、 エタノール （2m l ) とジェチルエーテル （3m l ) の混合溶液に懸 濁させ、 沈殿を吸引濾過により濾取して標記化合物 （化合物 6) 26mg (収率 6 2%) を白色粉状物質として得た。
FAB-LRMS m/z 345.2 (MH+)； FAB-HRMS 計算値 ： 345.1675 (C16H21N603 [MH+]), 実測 値： 345.1687.
Ή NMR (270 MHz, DMS0 - d6) δ： 11.01 (br s, 1 H, NH), 10.40 (s, 1 H, NHCO) , 10.24 (s, 1 H, NHCO) , 7.99 (t, 2 H, naph, J = 8.1 Hz) , 7.78 (br t, 1 H, NH, J = 5.8 Hz), 7.73-7.69 (m, 2 H, naph) , 7.56 (dd, 1 H, naph, J = 4.0, 8.3 Hz), 7.53 (dd, 1 H, naph, J = 4.0， 7.9 Hz), 7.28 (br s, 4 H), 4.92 (s， 2 H, CH2) , 3.50 (dt, 2 H, CH2, J = 5.8， 6.3 Hz) , 2.80 (t, 2 H, CH2, J = 6· 3 Hz)。
13C NMR (67.8 MHz, DMS0—d6) δ： 169.50 (C), 166.87 (C)， 156.81 (C), 133.43 (C), 132.58 (C), 128.53 (C), 128.47 (C), 125,25 (CH), 125.11 (CH), 122.13 (CH)， 122.06 (CH), 120.76 (CH), 120.19 (CH), 72.15 (CH2), 37.17 (CH2)， 35.18 (CH2)。
a oNg-b i t i n試薬 （以下 a o N g-b i o ；化合物 1 0) の合成
スキーム 2
Figure imgf000024_0001
N1- [2- (N3-フルォレニルメチルォキシカルボ二ルチオウレイ ド） ェチルカル ボニル〕 - N5- (トリチルアミノォキシァセチル） -1 , 5-ジァミノナフタレン (化合物 7 )
アルゴン雰囲気下、 N1- ( 2-アミノエチルカルボニル） - N5- (トリチノレアミ ノォキシァセチル） -1， 5-ジァミノナフタレン （化合物 4) (化合物 3より前述 の方法により合成、 1. O Ommo l ) を塩化メチレン-ァセトニトリルの混合溶 液 （1 ： 2) 1 5m lに溶解した。 別のガラス容器にフルォレニルメチルォキシカ ルボニルイソチオシアナート 3 1 Om g (1. 1 Ommo 1 ) およびジイソプロピ ルェチルァミン 0. 1 9m l (1. 1 Ommo 1 ) を塩化メチレン 20 m 1に溶解 し、 ここに上記化合物 4の溶液をゆっくりと滴下して加え、 さらに室温で 1時間撹 拌した。 反応液を減圧下濃縮した後、 生じた沈殿を酢酸ェチル （1 5m l ) とへキ サン （30m l ) の混合溶液に懸濁させた。 沈殿を吸引濾過により濾取して標記化 合物 （化合物 7) 78 Omg (収率 94%) を淡茶色粉状物質として得た。
FAB-LRMS m/z 825.2 (M+)； FAB-HRMS 計算値： 825.2985 (C50H43N505S [M+])， 実測 値： 825.2985.
Ή NMR (270 MHz, D S0-d6) δ： 11.42 (br s, 1 H， NH), 10.16 (br t, 1 H, NH, J = 5.5 Hz), 10.07 (br s, 1 H, NH), 9.58 (br s, 1 H， NH), 8.35 (br s， 1 H, NH), 7.93 (m, 1 H, naph) , 7.91-7.82 (m, 4 H, Fmoc) , 7.73—7.67 (m， 3 H, naph) , 7.52—7.38 (m, 4 H, naph and Fmoc), 7.36—7.24 (m, 17 H, Fmoc and Tr)， 4.36-4.33 (ra, 2 H, Fmoc— CH2), 4.29-4.25 (m, 1 H， Fmoc-CH) , 4.23 (s, 2 H, CH2) , 3.95 (dd, 2 H, CH2, J = 5.5, 6.1 Hz)， 2.89 (t, 2 H, CH2, J = 6.1 Hz)。
13C NMR (67.8 MHz, DMSO— d6) δ : 179.14 (C), 169.96 (C), 168.71 (C), 153.10 (C), 143.98 (C), 143.10 (C), 140.50 (C), 133.47 (C), 132.71 (C)， 128.70 (CH), 128.41 (C), 128.31 (C), 127.64 (CH), 127.56 (CH)， 126.95 (CH), 126.69 (CH), 125.42 (CH), 125.34 (CH), 125.10 (CH), 121.93 (CH), 120.44 (CH), 119.97 (CH), 119.63 (CH), 73.64 (C)， 73.31 (CH2), 67.14 (CH2), 45.99 (CH), 40.93 (CH2)， 34.19 (CH2)。
N 1- 〔2 - (N 3- { 2- 〔2- ( 2-ビォチニルアミノエトキシ） エトキシ〕 ェチ ル} -N2-フルォレニルメチルォキシカルボニルダァニジノ） ェチルカルボニル〕 - N5- (トリチルアミノォキシァセチル） - 1 , 5-ジァミノナフタレン （化合物 8J_
アルゴン雰囲気下、 N1- 〔2- (N3-フルォレニルメチルォキシカルボ二ルチオ ゥレイ ド） ェチルカルボニル〕 - N5- (トリチルアミノォキシァセチル） - 1， 5 - ジァミノナフタレン （化合物 7) 4 1 Om g (0. 5 O mm o 1 ) をジメチルホル ムアミ ド 1 5m 1に溶解し、 0°Cに冷却した。 この溶液にジイソプロピルェチルァ ミン 0. 2 6 m l ( 1. 5 O mm o 1 ) を加えた後、 （+ ) -ピオチュル- 3 , 6- ジォキサオクタンジァミン · 2 3酢酸塩 3 1 Om g (0. 7 5 mmo l ) および 塩化第二水銀 2 0 5 m g (0. 7 5 mmo 1 ) のジメチルホルムアミ ド溶液 （7m 1 ) をゆっく りと滴下して加え、 さらに 0°Cで 1時間撹拌した。 反応液に酢酸ェチ ル 8 0 m lを加えた後、 セライ ト濾過により沈殿物を除去した。 ろ液に酢酸ェチル を加えて全量を 1 5 O m 1 とし、 水 5 0 m 1で 4回洗浄した。 溶液を減圧下濃縮後、 シリカゲルカラムクロマトグラフィー （溶出溶媒：エタノール一クロ口ホルム） に より精製して標記化合物 （化合物 8) 3 0 O m g (収率 5 1 %) を白色泡状物質と して得た。
FAB-LRMS m/z 1166.6 (MH+)； FAB-HRMS 計算値： 1166.5174 (C66H72N909S [MH+] ) , 実 測値： 1166.5165。
Ή NMR (270 MHz, DMS0 - d6) δ： 10.05 (br s, 1 H， NH), 9.58 (br s, 1 H, NH), 8.35 (br s， 1 H, NH), 7.95-7.87 (m， 3 H, naph and Fmoc) , 7.81 (br t, 1 H, NH, J = 5.6 Hz), 7.72-7.63 (m, 5 H， naph and Fmoc) , 7.52-7.37 (m, 4 H, naph and Fmoc) , 7.34-7.24 (m, 17 H, Fmoc and Tr), 6.40 (br s， 1 H, NH), 6.35 (br s, 1 H, NH), 4.30—4.23 (m, 6 H), 4.09 (m, 1 H), 3.51 (m, 8 H), 3.40-3.36 (m, 4 H), 3.18 (m, 2 H), 3.05 (m, 1 H) , 2.82—2.76 (m, 3 H) , 2.56 (d, 1 H, J = 12.2 Hz), 2.05 (t, 2 H, J = 7.3 Hz), 1.62—1.37 (m, 4 H)， 1.33-1.27 (m, 2 H)。
N 1- 〔2 - (N 3- { 2- [ 2 - ( 2-ピオチュルアミノエトキシ） エトキシ〕 ェチ ル} -N2-フルォレニルメチルォキシカルボ二ルグァ二ジノ） ェチルカルボニル〕 - N5- (アミノォキシァセチル） -1， 5-ジァミノナフタレン （化合物 9)
アルゴン雰囲気下、 N1- [2- (N3- {2- 〔2- (2 -ピオチニルアミノエトキ シ） エトキシ〕 ェチル } -N2-フルォレニルメチルォキシカルボニルダァニジノ） ェチルカルボニル〕 -N5- (トリチルァミノォキシァセチル） - 1， 5-ジアミノナ フタレン （化合物 8) 2 9 2 m g (0. 2 5 mmo 1 ) を塩化メチレン 1 0 m 1に 溶解し、 トリフルォロ酢酸 2 8 0 1 ( 3. 8 mm o 1 ) およびトリイソプロピル シラン 5 1 0 1 ( 2. 5 mm o 1 ) を加えて室温で 3 0分撹拌した。 反応液にク ロロホルム 6 O m 1を加え、 飽和炭酸水素ナトリウム溶液 3 O m 1で 2回、 水 3 0 m lで 1回、 飽和食塩水 3 Om lで 1回洗浄し、 硫酸ナトリゥムにより乾燥した。 有機層を減圧下濃縮した後、 生じた沈殿をクロ口ホルム 2. 5 m l とエタノール 2. 5 m lの混合溶媒に溶解し、 この溶液を撹拌させたジェチルエーテル 2 5 m 1に滴 下した。 生じた白色の沈殿物質を吸引濾過により濾取して標記化合物 （化合物 9) 1 8 4 m g (収率 8 0 %) を白色粉状物質として得た。
FAB-LRMS m/z 924.4 (MH+)； FAB-HRMS 計算値： 924.4078 (C47H58N909S [廳+]), 実測 値： 924.4053.
lH NMR (270 MHz, DMSO_d6) δ： 10.17 (br s, 1 H, NH), 9.95 (br s, 1 H, NH), 7.97-7.89 (m, 4 H, naph and Fmoc) , 7.82 (br t， 1 H, NH, J = 5.5 Hz), 7.71- 7.66 (m, 4 H), 7.53 (t, 2 H, J = 7.6 Hz), 7.42 (t, 2 H, J = 7.3 Hz), 7.31 (m, 2 H), 6.41 (br s, 1 H， NH) , 6.37 (br s, 1 H, NH) , 4.46 (m, 2 H) , 4.37 (s, 2 H, CH2), 4.34-4.26 (ra, 2 H), 4.10 (m, 1 H), 3.55-3.47 (m, 8 H), 3.39-3.34 (m, 4 H)， 3.17 (m, 2 H), 3.05 (m, 1 H), 2.87 (m, 2 H), 2.79 (dd, 1 H, J = 5.3, 12.2 Hz), 2.56 (d, 1 H, J = 12.2 Hz), 2.04 (t, 2 H, J = 7.4 Hz), 1.62-1.37 (ra, 4 H), 1.27 (ra, 2 H).
13C NMR (67.8 MHz, DMSO— d6) 8 172.05 (C), 169.16 (C), 162.59 (C), 143.41 (C), 140.64 (C), 133.36 (C), 133.16 (C)， 128.92 (C), 128.54 (C), 127.65 (CH), 127.03 (CH), 125.31 (CH), 125.23 (CH), 125.04 (CH), 122.50 (CH), 122.17 (CH), 120.56 (CH), 120.38 (CH), 120.10 (CH), 73.88 (CH2) , 69.57 (CH2), 69.29 (CH2), 69.01 (CH2) , 67.02 (CH2)， 60.91 (CH), 59.06 (CH), 55.31 (CH), 46.22 (CH), 39.72 (CH2), 38.26 (CH2) , 34.97 (CH2), 28.08 (CH2), 27.92 (CH2) , 25.14 (CH2)。
N1- [2- (N3- { 2- [2- ( 2 -ピオチニルアミノエトキシ） エトキシ〕 ェチ ル} グァニジノ） ェチルカルボニル〕 - N5- (アミノォキシァセチル） -1 , 5-ジ ァミノナフタレン （化合物 10)
アルゴン雰囲気下、 N1- 〔2- (N3- { 2- 〔2- (2-ピオチェルアミノエトキ シ） エトキシ〕 ェチル } -N2-フルォレニルメチルォキシカルボニルダァニジノ） ェチルカルボニル〕 - N5 - （アミノォキシァセチル） -1, 5-ジァミノナフタレン (化合物 9) 5 Omg (0. 054 mm o 1 ) を 1, 4 -ジォキサン 3 m 1 とメタ ノール 3 m 1の混合溶媒に溶解し、 ピぺリジン 220 μΐ (2. 2mmo 1 ) を加 えて室温で 20時間撹拌した。 反応液を減圧下濃縮した後、 残渣を水 30m lに溶 解し、 クロ口ホルム 2 Om 1で 6回洗浄した。 水層を減圧下濃縮後、 凍結乾燥して 標記化合物 （化合物 10) 35mg (収率 93%) を白色綿状物質として得た。 FAB-LRMS m/z 702.4 (MH+)； FAB-HRMS 計算値： 702.3397 (C32H48N907S [MH+]), 実測 値： 702.3405.
Ή NMR (270 MHz, DMSO— d6) 6： 10.11 (br s, 1 H， NH), 9.88 (br s, 1 H, NH), 7.96 (d， 1 H, naph, J = 8.6 Hz), 7.90 (d, 1 H, naph, J = 8.3 Hz), 7.84 (t, 1 H, NH, J = 5.3 Hz), 7.71—7.65 (m, 2 H, naph), 7.58-7.50 (m, 2 H, naph) , 6.57 (br s, 2 H， NH20), 6.41 (br s, 1 H, NH), 6.37 (br s, 1 H, NH), 4.30 (m, 1 H， bio), 4.27 (s， 2 H， CH2), 4.11 (m， 1 H), 3.52 (m, 8 H)， 3.39 (t， 2 H, J = 5.8 Hz), 3.31 (m, 2 H), 3.19 (m, 2 H), 3.07 (m, 1 H)， 2.84—2.78 (m， 3 H)， 2.57 (d, 1 H, J = 12.2 Hz), 2.06 (t, 2 H, J = 7.3 Hz) , 1.64-1.41 (m, 4 H)， 1.29 (m, 2 H).
13C NMR (67.8 MHz, DMS0-d6) δ ·· 172.10 (C)， 169.73 (C), 169.69 (C), 162.59 (C), 155.86 (C), 133.39 (C), 133.30 (C)， 129.03 (C), 128.47 (C), 125.31 (CH), 125.23 (CH), 122.63 (CH), 122.00 (CH), 120.53 (CH), 120.37 (CH), 74.30 (CH2), 69.57 (CH2) , 69.31 (CH2), 69.01 (CH2) , 68.46 (CH2)， 60.91 (CH), 59.06 (CH), 55.31 (CH), 40.96 (CH2), 39.83 (CH2) , 38.25 (CH2), 37.28 (CH2) , 34.98 (CH2), 34.91 (CH2) , 28.08 (CH2), 27.93 (CH2) , 25.15 (CH2)。
(実施例 2) B i sアミノォキシナフタレン試薬 （以下 a oNa o ;_化合物 1 2) の合成 スキー A 3
Figure imgf000028_0001
-.トリフルォ口酢酸
トリイソプロビルシラン クロ口ホルム、 oc~室温
72%
Figure imgf000028_0002
12
N1, N5-ビス （トリチルアミノォキシァセチル） -1 5-ジァミノナフタレン (化合物 1 1 )
アルゴン雰囲気下、 1, 5-ジァミノナフタレン （化合物 1) 1 58mg (1. O Ommo l ) をピリジン 30 m 1に溶解し、 N-トリチルァミノォキシ酢酸 33 3mg (1. 0 Ommo 1 ) および EDC [塩酸 1-ェチル -3- (3-ジメチルアミ ノプロピル） カルボジイミ ド] 230mg (1. 2 Ommo 1 ) を加え、 室温で撹 拌した。 反応開始 3時間後、 6時間後にそれぞれ N-トリチルァミノォキシ酢酸 3 33 m g (1. 0 Ommo 1 ) および EDC 23 Omg (1. 2 Ommo 1 ) を追 加して、 さらに室温で 1 6時間撹拌した。 反応液を減圧下濃縮した後、 沈殿を水 2 0 m 1に懸濁し、 酢酸ェチル 50m lで 1回、 クロ口ホルム 20 m 1で 3回洗浄し た。 水層の白色沈殿物質を吸引濾過により濾取し、 さらにエタノールおよびエーテ ルで洗浄して標記化合物 （化合物 1 1) 55 Omg (収率 70%) を白色粉状物質 として得た。
FAB-LRMS m/z (+NaI) 789.3 (MH+), 811.3 ([M+Na]+)； FAB-HRMS 計算値： 811.3260 (C52H44N404Na [M+Na]+)， 実測値： 811.3274
Ή NMR (270 MHz, DMSO— d6) 8 ： 9.62 (br s, 2 H, NH), 8.36 (br s, 2 H, NH), 7.77-7.71 (m, 4 H， naph) , 7.52 (t， 2 H, naph, J = 7.9 Hz), 7.41-7.25 (m, 30 H, Tr), 4.23 (s, 4 H, CH2)。
13C NMR (67.8 MHz, DMSO-d6) δ ·· 168.89 (C), 144.07 (C), 132.90 (C), 128.78 (CH), 127.63 (CH), 126.76 (CH), 125.43 (CH), 123.80 (C), 122.15 (CH)， 120.11 (CH), 73.61 (C), 73.27 (CH2)。
N1,— N5-ビス _ (アミノォキシァセチル） -1._ 5-ジァミノナフタレン （化合物 1 2)
アルゴン雰囲気下、 N1, N5-ビス （トリチルアミノォキシァセチル） -1, 5 - ジァミノナフタレン （化合物 1 1) 394mg (0. 5 Ommo 1 ) をクロロホル ム 2 Om 1に懸濁して氷冷し、 トリフルォロ酢酸 0. 94m l (1 0. Ommo 1 ) およびトリイソプロビルシラン 1. 02m l (5. Ommo 1 ) を加えた。 反 応液を室温に戻して 3. 5時間撹拌した。 反応液に水 4 Om 1およびクロ口ホルム 条条条条
10m lを加えて沈殿件件件件物を溶解した後に分液し、 さらに水層をクロロホルム 30m 1で 2回、 酢酸ェチル 3 Om 1で 1回洗浄した。 続いて、 水層にァセトニトリル 6
Om lを加えた後、 DOWEW( 1 X 4-1 00 (OfTフォーム） により中和し た。 DOWEW( 1 X 4- 1 00を濾過して除き、 さらに 80 %のァセトニトリル 水溶液で DOWEW( 1 X 4- 100を洗浄した。 溶液を合わせて減圧下濃縮した 後、 残渣を水 3 Om 1に溶解して C- 1 8カラムカラムクロマトグラフィー （溶出 溶媒：水ーァセトニトリル） により精製することで、 標記化合物 （化合物 1 2) 1 09mg (収率 72%) を白色粉状物質として得た。
FAB-LRMS m/z 305.2 (MH+)； FAB-HRMS 計算値 ： 305.1250 (C14H17N404 [MH+]), 実測 値： 305.1259.
¾ NMR (270 MHz, DMS0_d6) δ ·· 9.88 (s， 2 H, NH), 7.93 (d, 2 H, naph, J = 8.6 Hz), 7.66 (d， 2 H, naph, J = 7.2 Hz), 7.54 (dd, 2 H, naph, J = 7.2, 8.6 Hz) , 6.57 (s， 4 H, NH2) , 4.28 (s, 4 H, CH2)。
13C NMR (67.8 MHz, DMSO— d6) δ ·· 169.75 (C), 133.35 (C), 129.11 (C), 125.41 (CH), 122.66 (CH), 120.75 (CH), 74.42 (CH2)。
(実施例 3) オリゴヌクレオチドの合成と精製
オリゴヌクレオチドの合成は A p p l i e d B i o s y s t em s 394型 DNAZRNAシンセサイザー上で行った。 0. 2又は 1 μ mo 1スケールで合成 した。 HPしじには0 i 1 s o nの装置を用い、 分析は Wa t e r s 996フォト ダイォードアレイ検出器を用いて行った。
ォリコ"ヌクレオチト 逆相 HPLC条件 保持時間 （分)
(F-Lrl7X)
F-Lrl7A 14.
F-Lrl7G 14.
F-Lrl7C 10.
F-Lrl7U 11. 表 2 ォリコ 'ヌクレオチド イオン交換 HPLC条 保持時間 (分）
(F-Lrl7X) 件
F-Lrl7A 条件 2 16.9
F-Lrl7G 条件 2 16.6
F- Lrl7C 条件 2 15.8
F-Lrl7U 条件 2 16.0 表 3 ォリコ 'ヌクレオチド HPLC条件 保持時間 (分）
(AS32Y)
AS32A 条件 1 9.9
AS32G 条件 1 11.8
AS32C 条件 1 10.1
AS32T 条件 1 11.7 逆相 HP LC溶液
A溶液 5% ァセトニトリル 0. 1M TEAA (p H 7. 0)
B溶液 2 5% ァセトニトリル 0. 1M TEAA (pH 7. 0)
カラム温度： 5 0°C
カラムは、 / —ボンダスフィァ一 （C— 1 8) カラム Φ 3. 9 x 1 5 Omm (ゥォ —タ一ズ製） を使用した。
イオン交換 HP LC溶液
A溶液 20 % ァセトニトリル
B溶液 20% ァセトニトリル、 2M ギ酸アンモニゥム
カラム温度： 50°C
カラムは、 T S K— GE L DEAE— 2 SW Φ 4. 6 x 2 5 0mm (東ソ一 社） を使用した。
HP LC条件
条件 1 B溶液の％ 20→40%Z20分
条件 2 B溶液の％ 3 5→ 5 5 %/ 20分
(実施例 4) オリゴヌクレオチド （RNA) の酸化反応
オリゴヌクレオチド （F_ L r l 7 X : X = A, G, C, U) ( 1. 6 nmo 1 ) を、 1 0 OmMリン酸バッファー （pH 7) 及び 8 00 ζ M過ヨウ素酸ナトリ ゥムに溶解し （反応液総量 200 μ 1 ) 、 3 7°C、 90分で酸化反応を行った。 反 応後、 NAP 1 0カラム （GEヘルスケア） で脱塩し、 得られた酸化オリゴヌタレ ォチド （F_L r 17 X o x) を UV定量した。
(実施例 5) 酸化オリゴヌクレオチド （RNA) への ARP、 a oNgの標識反応 一本鎖への反応
酸化オリゴヌクレオチド （F— L r l 7Xo x ; X = A， G, C, U) ( 12 p mo 1 ) を 1Mリン酸バッファー （pH7) 3 χ 1及び滅菌水 21 μ 1に溶解した 後、 あらかじめ滅菌水に溶解させた 2 mM 標識試薬 （ARP又は実施例 1で調製 した a oNg) 6 /i lを加え、 37°Cで反応を開始した。 ARP (A 1 d e h y d e Re a c t i v e P r o b e ; DO J I NDO社） は、 以下の構造を有する。
Figure imgf000031_0001
—定時間後に 2. 5 /X 1をサンプリングして 1 o a d i n g s o l u t i o n m i x 5 1 (5 OmM EDTA, 10 M 尿素， 0. 1% ΒΡΒ ; 4 μ 1、 4 OmM ダルタルアルデヒド； 1 μ 1を混合して調製） に加えて反応を止めた。 その後、 変性 20%ポリアクリルアミドゲル （19 ： 1) で解析した。 各バンドの フルォレセインの蛍光強度を測定し、 反応効率を算出した。 反応の結果を図 2に示 した。
二本鎖での反応
二本鎖で反応を行う場合は、 酸化オリゴヌクレオチド （F_L r 17 X o x) ( 12 pmo 1 ) に相補鎖 A S 32Y (24 pmo 1 ) を加えて、 その他の反応条 件は一本鎖の反応と同様に行った。
F— L r 17Xo Xの一本鎖 （s s F— L r 17 X o x ) 、 及び相補鎖 （ A S 32 Y) の 2本鎖について、 ARP又は a oNgとの結合率を測定し、 見かけの反 応速度定数を算出した。 RNAの 3' 末端の塩基の種類がいずれの場合でも、 a o Ngは ARPよりも高い反応性を示した。 また、 一本鎖よりも二本鎖を形成した場 合に、 反応効率が上がることが明らかになった。
(実施例 6) RNAの、 酸化から標識の連続反応
実施例 4、 5では、 あらかじめ RNAを酸化して精製した後に標識反応を行った。 次に R N Aの酸化から標識までを連続して行うことが可能であるかを確かめる実験 を行った。 RNA (F-L r 17 X； X = A, G, C, U) ( 12 p m o 1 ) を、 15 OmMリン酸バッファー （pH7) 及び 150 μΜ過ョゥ素酸ナトリゥムに溶 解し （反応液総量 20 1 ) 、 37°C、 60分で酸化反応を行った。 続いて 2mM DTT 5 μ 1を添加して 3 7°C、 30分加温し、 240 μΜ a oNg (又は a oNg— b i o) 5 1を加えて 3 7 °Cで標識反応を行った （反応液総量 30 1 ) 。 実施例 5と同様に一定時間後にサンプリングして解析した。 反応の結果、 酸 化に用いた過剰の過ヨウ素酸ナトリウムを還元することで、 酸化から標識反応まで 連続して行えることを確認した。
(実施例 7 ) アベィシックサイ トを含むォリゴヌクレオチドの合成
アベィシックホスホロアミダイ ト試薬 （G l e n R e s . 社） を用いて、 アベ ィシックサイ ト （Z) を含むオリゴヌクレオチド （F—20 Z) を合成した。 F— 20 Zは、 5' F-GAATTGCTTGGAAGAZGTTT 3 ' を表す。 合成したオリゴヌクレオチドは、 通常の方法に従い濃アンモニア水で脱保護反応を 行った後、 40%酢酸 4mLを加えて室温で 4時間攪拌し TBDMS基の脱保護を 行った。 反応後、 減圧下酢酸を留去し、 さらに水を加えて減圧下で溶媒を留去した。 この操作を数回繰り返して酢酸を取り除いた。 その後、 滅菌水にオリゴヌクレオチ ドを溶解し、 逆相 HP LC、 イオン交換 HP LCによって精製した。 F—20 Zの 相補鎖となる S p 3 5も同様に合成し精製した （表 4、 表 5) 。 S p 35 Cは、 3 ' CGAAAGT AAC CTTAACGAAC CTTCTCC AAAGAAC GA 5 ' を表す。 各 HP L Cの条件は、 F— L r 1 7 X及ぴ AS 32 Yの精製と 同様とした。
表 4 ォリコ"ヌタレれに 逆相 HPLC条件 保持時間 （分）
F-20Z 条件 1 17.8
Sp35C 条件 1 13.1 表 5 オ コ'ヌクレオチド イオン交換 HPLC条件 保挎時間 （分）
F-20Z 条件 3 18.8
Sp35C 条件 2 11.3
HP LC条件
条件 1 B溶液の％ 20→ 40 %/ 20分
条件 2 B溶液の％ 35→ 55 %/ 20分
条件 3 B溶液の％ 30→ 50 %/ 20分
(実施例 8) アベィシックサイ トを含むオリゴヌクレオチドの酸化
実施例 7で調製したアベィシックサイ トを含むオリゴヌクレオチド F (2. 6 nmo 1 ) を、 100 mMリン酸バッファー （ p H 7 ) 及び 10 mM 過 ヨウ素酸ナトリウムに溶解し、 37°C、 60分で酸化反応を行った。 反応後、 NA P5カラム （GEヘルスケア） で脱塩し、 濃縮後、 変性 20%ポリアクリルアミ ド ゲル （19 : 1) によって精製した。 ゲル片からは YMCカートリッジ （100m g/1 m 1 ) を用いて脱塩した。 得られた酸化オリゴヌクレオチド （F—20Z o X) を UVで定量し、 反応に供した。
(実施例 9) アベィシックサイ トへの ARP、 a oNgの標識反応
一本鎖への反応
酸化された F— 20Z o x (12 pmo 1 ) を 1M リン酸緩衝液 （ p H 7 ) 3 μ 1及び滅菌水 15 μ 1に溶解し、 90°Cで 1分加熱し氷冷した。 10秒後に室温 で 5分放置して 37°Cで 5分間プレインキュベーションした。 続いて、 あらかじめ 滅菌水に溶解しておいた標識試薬 （5 mM ARP又は a oNg) 12 μ 1を加え て 37°C、 42°C又は 47 °Cで標識反応を開始した。 一定時間後に 2. 5 μ 1をサ ンプリングして l o a d i n g s o l u t i o n m i x 5 μ 1 I, 50 mM EDTA, 10M 尿素， 0. 1% ΒΡΒ ; 4μ 1、 200 mM ダルタルアル デヒ ド； 1 1を混合して調製） に加えて反応を止めた。 その後、 変性 20%ポリ アクリルアミ ドゲル （19 : 1) で解析した。 各バンドのフルォレセインの蛍光強 度を測定し、 反応効率を算出した。 反応の結果を図 3に示す。
二本鎖での反応
二本鎖で反応を行う場合は、 酸化オリゴヌクレオチド （F— 20 Z o X ) (12 pmo 1 ) に相補鎖 S p 35 C (14. 4 p m o 1 ) を加え、 その他の反応条件は 一本鎖の反応と同様に行った。 反応の結果を図 3に示す。
F- 20 Z中のアベィシックサイ ト Zに対して試薬が反応した。 DNAに対して も、 a oNgの方が高い反応性を示した。 特に二本鎖に対しては ARPの反応効率 は一本鎖と同じであつたが、 a o N gでは反応効率が大きく向上した。
(実施例 10) 2' —デォキシゥリジン （dU) を含むオリゴヌクレオチドの合成 と精製
5' 末端がフルォレセインで標識され、 dUを鎖内にもったオリゴヌクレオチド (F- 20 dU) およびその相補鎖 （S p 20 dU) は、 2' —デォキシゥリジン ホスホロアミダイ ト試薬 （G 1 e n R e s . 社） を用いて D N A自動合成機によ つて合成した。 F_20 dUは、 5' F-GAATTGCT dUGGAAGAG GTTT 3 ' を、 S p 20 dUは、 3' C T T A A C G A d U C C T T C T C CAAA 5 ' を表す。 合成オリゴヌクレオチドは通常の方法に従って脱保護した 後、 逆相 H PLCで分取、 精製した （表 6) 。 HP LCの条件などを以下に示す。 表 6 ォリコ'ヌクレオチド 逆棺 HPLC条件 保持時間：（分)
F - 20 dU 条件 4 15.3
S p 20 dU 条件 1 10.2 逆相 HP LC溶液
A溶液 5% ァセ トニ ト リル 0. 1M TEAA (pH 7. 0) ；
B溶液 25% ァセ トニ ト リル ZO. 1M TEAA (pH 7. 0)
カラム温度：室温
カラムは、 I n e r t s i l ODS— 3 (C— 1 8) カラム Φ 3. 0 x 30 Om m (GL S c i e n c e社） を使用した。
HP LC条件
条件 4 B溶液の％ 40→ 60 %/ 20分
(実施例 1 1) 2' —デォキシゥリジンを含む DNAへの ARP、 a oNg、 a o Ng-b i oの標識反応
本発明の化合物が 2' —デォキシゥリジン （dU) とゥラシル DNAグリコシラ ーゼ （UDG) から生成したアベィシックサイトに反応するかどうかを評価する実 験を行った。
dUを含むDNA、 F - 20 d U ( 1 2 p m o 1 ) と、 その相補鎖 （S p 35 C； 24 pmo 1 ) を、 UDGバッファー （x l O, 3 ^ 1 ) を含む溶液 （総量 2 9. に溶解させた。 S p 35 Cは、 3' C G A A AG T A A C C T T A
ACGAACCTTCTCCAAAGAACGA 5 ' を表す。 反応液を 90°Cで 1分加熱し氷冷した後、 37でで 5分間プレインキュベーションし、 そこに UDG (l u n i t, 0. 5 μ 1 ) を加え、 総量 30 μ 1で 3 7°C、 60分間反応を行つ た。 その後、 90でで 1分加熱して酵素を失活させ、 氷冷で 10分、 室温で 5分放 置した。 この反応液にあらかじめ溶解させた 1 OmMに調整した標識試薬 （ARP、 a oNg、 a o N g - b i o ) 6 μ 1を加えて 37 °Cで標識反応を開始した。 一定 時間後に 2. 5 μ 1をサンプリングして 1 o a d i n g s o l u t i o n m i x 5 μ 1 (5 OmM EDTA, 1 0 M 尿素， 0. 1% Β ΡΒ ; 4 μ 1、 2 0 OmM ダルタルアルデヒド； 1 μ 1を混合して調製） に加えて反応を止めた。 その後、 変性 20%ポリアクリルアミ ドゲル （1 9 : 1) で解析した （図 4) 。 各 バンドのフルォレセインの蛍光強度を測定し、 反応効率を算出した （図 4) 。
a oNg、 ARP、 a oNg_b i οの反応速度定数は、 それぞれ 0. 5 1m i n一1、 0. 03 m i n~\ 0. 1 7 m i n 1であったことから、 a oNgおよび a o N g - b i oの方が高い反応効率を示すことが明らかとなった。
(実施例 1 2) a o N a oの DNAへの反応
111を含む13 八、 F - 2 0 d U ( 1 2 p m o 1 ) と、 その相補鎖 （S p 2 0 d U； 1 3. 2 p m o l ) を、 UDGバッファー （x l O, 3 μ I ) を含む溶液 （総 量 2 9. 5 μ 1 ) に溶解させた。 S ρ 2 0 d Uは、 3 ' CTTAACGA d UC CTT CTC C AAA 5 ' を表す。 反応液を 9 0 °Cで 1分加熱し氷冷した後、 3 7°Cで 5分間プレインキュベーションし、 そこに UDG ( 1 u n i t， 0. 5 μ 1 ) を加え、 総量 3 0 /χ 1で 3 7°C、 6 0分間反応を行った。 その後、 9 0でで1 分加熱して酵素を失活させ、 氷冷で 1 0分、 室温で 5分放置した。 この反応液にあ らかじめ溶解させた 2 mM a o N a o 6 μ 1を加えて 3 7 °Cで標識反応を開始 した。 同様の反応を F— 2 0 d U、 1本鎖のみでも行った。 一定時間後に 3 μ 1を サンプリングして 1 o a d i n g s o l u t i o n m i x 5 μ 1 ( 5 0 mM EDTA, 1 OM 尿素， 0. 1 % B P B ; 4 /z l、 2 0 0mM グルタルアル デヒ ド； 1 μ 1を混合して調製） に加えて反応を止めた。 その後、 変性 2 0 %ポリ アクリルアミ ドゲル （1 9 : 1 ) で解析した （図 5) 。 各バンドのフルォレセイン の蛍光強度を測定し、 反応効率を算出した （図 5) 。 a o N a οは 2本鎖間を架橋 するように反応できることを確認した。
(実施例 1 3) a oNd g- b i o t i n試薬 （以下 a o N d g - b i o ；化合物 16) の合成
スキーム 4
Figure imgf000036_0001
1- (N3- フルォレニルメチルォキシカルボ二ルチオゥレイ ド） - N5- (トリ チルアミノォキシァセチル） - 5- ァミノナフタレン （化合物 1 3)
アルゴン雰囲気下、 フルォレニルメチルォキシカルボ二ルイソチオシアナ一ト 8 5 Om g (3. 0 1 mm o 1 ) およびジイソプロピルェチルァミン 0. 5 2m l (3. 01 mmo 1 ) を塩化メチレン 30 m 1に溶解し、 0°Cに冷却した。 ここに N1- (トリチルァミノォキシァセチル） - 1 5- ジァミノナフタレン （化合物 2) 1. 1 9 g (2. 5 1 mmo 1 ) の塩化メチレン溶液 （30m l ) をゆつくり と滴下して加え、 さらに室温に戻して 1. 5時間撹拌した。 反応液を減圧下濃縮後、 シリカゲルカラムクロマトグラフィー （溶出溶媒：酢酸ェチル一へキサン） により 精製して標記化合物 （化合物 1 3) 1. 04 g (収率 55%) を白色固体状物質と して得た。
FAB-LRMS m/z 755.3 (MH+), 777.2 ([M+Na]+)； FAB-HRMS 計算値 ： 777.2511 (C47H38N404SNa [M+Na]+), 実測値： 777.2486.
¾ NMR (270 MHz, DMS0-d6) S： 11.81 (s， 1 H, NH), 11.60 (s, 1 H, NH), 9.66 (s, 1 H, NH),
8.37 (s, 1 H, NH), 7.94—7.85 (m, 6 H), 7.78-7.68 (m, 3 H), 7.61-7.53 (m, 1 H), 7.49-7.41 (m, 2 H), 7.38-7.27 (m, 17 H), 4.49 (d， 2 H, Fmoc- CH2, J = 7.3 Hz) , 4.37 (t, 1 H, Fmoc-CH, J = 7.3 Hz), 4.23 (s, 2 H, CH2) .
13C NMR (67.8 MHz, DMSO— d6) δ 180.59 (C), 168.96 (C), 153.56 (C)， 144.08 (C), 143.23 (C), 140.65 (C), 134.68 (C), 133.14 (C), 129.79 (C), 128.79 (CH)， 128.61 (C), 127.77 (CH), 127.64 (CH), 127.07 (CH), 126.77 (CH), 126.10 (CH), 125.58 (CH), 125.43 (CH), 125.31 (CH), 122.34 (CH), 121.98 (CH), 121.28 (CH), 120.08 (CH), 119.93 (CH), 73.62 (C), 73.30 (CH2)， 67.42 (CH2) , 45.99 (CH)。
1- (N3- {2- 〔2— (2—ピオチュルアミノエトキシ） エトキシ〕 ェチル } -N2 —フルォレニルメチルォキシカルボニルダァニジノ） -N5- (トリチルアミノォキ シァセチル） -5-ァミノナフタレン （化合物 14)
アルゴン雰囲気下、 1- (N3- フルォレニルメチルォキシカルボ二ルチオウレ ィ ド） ― N5- (トリチルァミノォキシァセチル） - 5- ァミノナフタレン （化合 物 1 3) 9 1 Omg (1. 20 mm o 1 ) をジメチルホルムアミ ド 20 m 1に溶解 して 0°Cに冷却した。 この溶液に （+ ) - ピオチュル- 3, 6- ジォキサオクタン ジァミン 540mg (1. 44mmo 1 ) 、 塩化第二水銀 360mg (1. 32m mo 1 ) およぴジイソプロピルェチルァミン 0. 50m l (2. 88 mm o 1 ) の ジメチルホルムアミ ド溶液 （1 5m l ) をゆっく りと滴下して加え、 さらに で 1. 5時間撹拌した。 反応液に酢酸ェチル 1 5 Om 1を加えた後、 セライ ト濾過に より沈殿物を除去した。 ろ液に酢酸ェチルを加えて全量を 350m l とし、 水 1 2 Om lで 4回、 飽和食塩水 1 20m lで 1回洗浄し、 硫酸ナトリゥムにより乾燥し た。 溶液を減圧下濃縮後、 シリカゲルカラムクロマトグラフィー （溶出溶媒：エタ ノールークロロホルム） により精製して標記化合物 （化合物 14) 963mg (収 率 73%) を白色泡状物質として得た。
FAB-LRMS m/z 1095.5 (MH+)； FAB-HRMS 計算値： 1095.4803 (C63H67N808S [MH+]), 実 測値： 1095.4796.
NMR (270 MHz, DMS0 - d6) δ 9.61 (br s, 1 H， NH), 8.33 (br s, 1 H, NH), 7.89-7.75 (m, 6 H), 7.61-7.47 (m, 3 H)， 7.42-7.25 (m, 20 H), 6.39 (br s, 1 H, NH), 6.33 (br s, 1 H, NH), 4.30—4.24 (m, 6 H), 4.10 (m, 1 H), 3.49 (m, 6 H), 3.38-3.33 (m, 4 H), 3.16 (m， 2 H) , 3.06 (m, 1 H) , 2.79 (dd， 1 H, J = 5.3, 12.2 Hz), 2.56 (d, 1 H, J = 12.2 Hz), 2.04 (t, 2 H, J = 7.3 Hz),
I.63-1.37 (m, 4 H), 1.32—1.23 (m， 2 H)。
1- (N3- { 2- [2- (2—ピオチェルアミノエトキシ） エトキシ〕 ェチル } -N2 -フルォレニルメチルォキシカルボニルダァニジノ） - N5- (ァミノォキシァセチ ル） —5—ァミノナフタレン （化合物 1 5)
アルゴン雰囲気下、 1— (N3— {2— [2- (2—ピオチュルアミノエトキシ） ェ トキシ〕 ェチル } -N2-フルォレニルメチルォキシカルボニルダァニジノ） - N5- (トリチルァミノォキシァセチル） - 5-ァミノナフタレン （化合物 1 4) 1 70 mg (0. 1 6mmo 1 ) を塩化メチレン 1 5m 1に溶解して 0°Cに冷却し、 トリ フルォロ酢酸 1 80 μΐ (2. 4mmo 1 ) およびトリイソプロビルシラン 3 30 u\ (1. 6mmo 1 ) を加えた。 反応液を室温に戻して 30分撹拌した後、 反応 液にクロ口ホルム 6 5m lを加え、 飽和炭酸水素ナトリゥム溶液 35m lで 1回、 水 35m lで 1回、 飽和食塩水 35 m 1で 1回洗浄し、 硫酸ナトリウムにより乾燥 した。 溶液を減圧下濃縮後、 シリカゲルカラムクロマトグラフィー （溶出溶媒： メ タノ一ルークロロホルム） により精製して標記化合物 （化合物 1 5) 86mg (収 率 65%) を白色泡状物質として得た。
FAB-LRMS m/z 853.4 (MH+)； FAB-HRMS 計算値： 853.3707 (C44H53N808S [MH+] )， 実測 値： 853.3713.
lR NMR (270 MHz, DMS0-d6) 6 ： 9.90 (br s, 1 H, NH), 8.02 (m, 1 H), 7.89- 7.71 (m, 5 H)， 7.78 (br s, 1 H， NH), 7.62-7.31 (m, 8 H), 6.56 (br s, 2 H, NH2)， 6.39 (br s, 1 H, NH) , 6.33 (br s, 1 H, NH), 4.29—4.26 (ra, 6 H) , 4.10 (m, 1 H), 3.48 (m, 6 H), 3.36 (m， 4 H), 3.16 (m, 2 H), 3.06 (m, 1 H)， 2.80 (dd, 1 H， J = 5.0， 12.5 Hz), 2.56 (d， 1 H, J = 12.5 Hz), 2.04 (t, 2 H, J = 7.3 Hz), 1.66-1.38 (m, 4 H), 1.28 (ra, 2 H).
13C NMR (67.8 MHz, DMSO— d6) δ : 172.07 (C), 169.68 (C), 162.64 (C), 144.15 (C), 140.63 (C)， 127.45 (CH), 126.98 (CH), 125.04 (CH)， 120.04 (CH)， 74.37 (CH2) , 69.47 (CH2) , 69.14 (CH2) , 68.81 (CH2) , 66.04 (CH2) , 60.99 (CH)， 59.15 (CH) , 55.37 (CH) , 46.67 (CH) , 39.79 (CH2) , 38.37 (CH2) , 35.04 (CH2) , 28.14 (CH2), 27.99 (CH2), 25.21 (CH2)。
1- (N3- { 2- 〔2— (2— ピオチュルアミノエトキシ） エトキシ〕 ェチル } グァニジノ） - N5 - （アミノォキシァセチル） - 5- ァミノナフタレン （化合物 1 6、 酢酸塩） アルゴン雰囲気下、 1— (N3— { 2- 〔2- (2—ピオチュルアミノエトキシ） ェ トキシ〕 ェチル } —N2 -フルォレニルメチルォキシカルボニルダァニジノ） -N5 - (アミノォキシァセチル） —5—ァミノナフタレン （化合物 1 5) 8 5m g (0. 1 Ommo 1 ) を 1 , 4- ジォキサン 4 m 1 とメタノール 4 m 1の混合溶媒に溶解 し、 ピぺリジン 0. 4 0m l (4. Ommo 1 ) を加えて室温で 1 6時間撹拌した。 反応液を減圧下濃縮した後、 残渣を水 3 5m lに溶解し、 酢酸ェチル 1 5 m 1で 3 回洗浄した。 水層を減圧下濃縮後、 C 1 8カートリッジカラムクロマトグラフィー (溶出溶媒：ァセトニトリル一 0. 1M TEAA溶液） により精製して粗精製物 (5 2mg) を得た。 この粗精製物の一部を 2%酢酸水溶液 5m 1に溶解して、 再 度 C 1 8カートリ ッジカラムクロマトグラフィー （溶出溶媒： ァセトニトリル一 水） により精製して標記化合物 （化合物 1 6、 酢酸塩） 9. 2m gを白色綿状物質 として得た。
FAB-LRMS m/z 631.3 (MH+)； FAB-HRMS 計算値： 631.3026 (C29H43N806S [廳 +])， 実測 値： 631.3005.
Ή NMR (270 MHz, DMSO— d6) δ 9.94 (s, 1 H, NH)， 9.64 (br s, 1 H, NH), 8.07 (m， 1 H, nap), 7.82 (m， 1 H), 7.81 (d, 1 H, J = 8.2 Hz, nap), 7.73 (d, 1 H, J = 6.9 Hz, nap), 7.62 (m, 2 H， nap), 7.55 (m, 2 H), 7.51 (m, 1 H， nap), 6.55 (s， 2 H, NH20) , 6.39 (s, 1 H, NH), 6.35 (s, 1 H, NH), 4.31 (m, 1 H), 4.29 (s, 2 H, CH2), 4.12 (br dd, 1 H, J = 4.3, 7.6 Hz), 3.58 (m, 6 H), 3.42 (m, 4 H), 3.21 (m, 2 H), 3.09 (m, 1 H)， 2.81 (dd, 1 H, J = 5.0, 12.5 Hz), 2.57 (d, 1 H, J = 12.5 Hz), 2.07 (t, 2 H, J = 7.3 Hz), 1.64—1.42 (m, 4 H), 1.30 (m, 2 H).
13C NMR (67.8 MHz, DMSO - d6) 8 172.10 (C), 169.68 (C)， 162.59 (C), 155.75 (C)， 133.72 (C), 130.44 (C), 129.39 (C)， 126.32 (CH), 125.81 (CH), 123.00 (CH), 119.87 (CH), 74.27 (CH2) , 69.66 (CH2) , 69.38 (CH2), 69.06 (CH2), 68.52 (CH2), 60.92 (CH), 59.08 (C), 55.31 (CH), 41.22 (CH2), 39.73 (CH2)， 38.27 (CH2), 35.00 (CH2), 28.08 (CH2) , 27.94 (CH2), 25.16 (CH2)。
(実施例 1 4 )
実施例 1 1と同様のオリゴヌクレオチドを用い、 同じ条件で a o N d g - b i o の反応効率を調べた。 反応の結果、 a o N d g— b i oの反応速度定数は、 0. 2 3 m i n— 1であったこと力 ら、 a o N g、 a o N g— b i oと同様に、 AR Pよ りも a o N d g _b i oの方が高い反応効率を示すことが明らかとなった。
本明細書中で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願をそのまま参考として本 明細書中にとり入れるものとする。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 一般式 1 ：
Rj-NH-O-L !-D-L2-A (1)
(式中、 は、 水素原子、 アルキル基又はアミノ基の保護基であり、 Dは、 2価 の芳香族基であり、 1^は、 直接結合又はリンカ一基であり、 L2は、 直接結合又 はリンカ一基であり、 Aは親水性基を含む有機基である）
で表される化合物又はその塩。
2. Aが、 親水性基として、 置換又は無置換のグァニジノ基、 置換又は無置換のポ リエチレングリコール基、 カルボキシル基、 アミノォキシ基及びヒ ドロキシル基か らなる群から選択される少なくとも 1つの基を含む、 請求項 1記載の化合物又はそ の塩。
3. Aが、 親水性基として、 置換又は無置換のグァニジノ基を含む、 請求項 2記載 の化合物又はその塩。
4. Aが、 以下の一般式 2 ：
NH
ト N人 2 (2)
Χι
(式中、 1及び 2は、 水素原子又は有機基である）
で表される、 請求項 1〜 3のいずれか 1項記載の化合物又はその塩。
5. Dが、 置換若しくは無置換のフエ二レン基、 置換若しくは無置換のアントリレ ン基、 置換若しくは無置換のナフチレン基、 置換若しくは無置換のフエナントリ レ ン基、 置換若しくは無置換のアントラキノリレン、 又は置換若しくは無置換のァク リジニレンである、 請求項 1〜4のいずれか 1項記載の化合物又はその塩。
6. Dが、 以下の一般式
Figure imgf000041_0001
(式中、 一方の結合部位が L ,又は Oに結合し、 他方の結合部位が L2又は Aに結 合する）
で表される 2価の芳香族基、 及びこれらの芳香族基において芳香環が 1〜 3個の置 換基を有する芳香族基から選択される、 請求項 5記載の化合物又はその塩。
7. 以下の一般式 3又は 4 ：
}- 3-C-N-| (3)
Figure imgf000041_0002
(式中、 R3は、 置換若しくは無置換の Cぃ9アルキレン基又は— （CH2) 。― (OCH2CH2) p- (CH2) q—であり、 ここで、 o~qは、 それぞれ独立し て 0~ 15の整数であり、 o + p + qは、 1〜15である）
のいずれかで表される 2価の基であり、 L2が、 以下の一般式 5又は 6 ： 卜 N-C-R4- (5)
S H j
(6)
(式中、 R4は、 置換若しくは無置換の C卜9アルキレン基又は一 （CH2) r - (OCH2CH2) s— (CH2) t一であり、 ここで、 r〜tは、 それぞれ独立し て 0〜 15の整数であり、 r + s + tは、 1〜： 15であるである）
のいずれかで表される 2価の基である、 請求項 1〜6のいずれか 1項記載の化合物 又はその塩。
8. 以下の一般式 7 ：
Figure imgf000042_0001
(式中、 は、 水素原子又はアミノ基の保護基であり、 nは、 1〜5の整数であ り、 mは、 1〜5の整数であり、 Ra〜Rfは、 それぞれ独立して、 水素原子又は 置換基であり、 及び ま、 水素原子又は有機基である）
で表される、 請求項 1記載の化合物又はその塩。
9. の一般式 8
Figure imgf000042_0002
(式中、 は、 水素原子又はアミノ基の保護基であり、 nは、 1〜5の整数であ り、 Ra〜Rfは、 それぞれ独立して、 水素原子又は置換基であり、 X2は、 水素原 子又は有機基である）
で表される、 請求項 1記載の化合物又はその塩。 一般式：
Figure imgf000042_0003
(式中、 ！^ 及び ^ま、 それぞれ独立して、 水素原子又はアミノ基の保護基であ り、 n及び iは、 それぞれ独立して、 1〜5の整数であり、 Ra〜Rfは、 それぞ れ独立して、 水素原子又は置換基である）
で表される、 請求項 1記載の化合物又はその塩。
1 1 . Aが標識基をさらに含む、 請求項 1〜9のいずれか 1項記載の化合物又はそ の塩。 1 2 . 及び X 2の少なく とも一方が有機基であり、 該有機基が標識基である、 請求項 4、 8、 又は 9記載の化合物又はその塩。
1 3 . アルデヒ ド基、 へミアセタール基、 カルボキシル基又はケト基を有する生体 分子を標識するための試薬であって、 請求項 1 1又は 1 2記載の化合物又はその塩 を含む前記試薬。
1 4 . 請求項 1 1又は 1 2記載の化合物と、 アルデヒ ド基、 へミアセタール基、 力 ルポキシル基又はケト基を有する生体分子とが結合してなる標識化生体分子であつ て、 該化合物のアミノォキシ基と該生体分子のアルデヒ ド基、 へミアセタール基、 カルボキシル基又はケト基とが反応して共有結合を形成している、 前記標識化生体 分子。
1 5 . アルデヒ ド基、 へミアセタール基、 カルボキシル基又はケト基を有する生体 分子を固定化するための生体分子固定化用支持体であって、 担体及び該担体表面に 存在する請求項 1〜 1 0のいずれか 1項記載の化合物又はその塩の層を含む、 前記 支持体。
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