CN114981283A - 新型核苷酸类似物和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了多种正交核苷酸类似物和用于使用所述多种正交核苷酸类似物的组合进行边合成边测序的方法。
Description
本申请要求于2019年7月9日提交的美国临时申请第62/872,164号的优先权，所述美国临时申请的内容特此通过引用并入。
贯穿本申请，引用了各种出版物和专利。这些参考文献的完整引用在紧接在权利要求书前的说明书的结尾处可见。这些出版物和专利的公开内容以其全文通过引用特此并入本申请中，以更全面地描述本发明所属领域的现状。
本申请通过引用并入了核苷酸和/或氨基酸序列，所述核苷酸和/或氨基酸序列存在于名为“200824_90884-A-PCT_Sequence_Listing_BI.txt”的文件中，所述文件大小为2.81千字节，并且所述文件于2020年8月19日以与MS-Windows具有操作系统兼容性的的IBM-PC机器格式创建，所述文件包含在于2020年8月24日提交的文本文件中作为本申请的一部分。
背景技术
DNA测序是生物和医学研究中的基本工具，并且对于个性化医疗范式而言尤其重要。为了最终实现1,000美元基因组的目标，已经研究了各种新的DNA测序方法；主要的方法是边合成边测序(SBS)，这是一种在聚合酶反应期间确定DNA序列的方法(Hyman 1988；Ronaghi等人1998；Ju等人2003；Li 2003；Braslavsky等人2003；Ruparel等人2005；Margulies等人2005；Ju等人2006；Wu等人2007；Guo等人2008；Bentley等人2008；Harris等人2008；Eid等人2009；Rothberg等人2011)。
发明内容
本发明提供了一种核苷酸类似物，其具有以下结构：
其中：
碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或其类似物；
可切割接头包括DTM、偶氮基、2-硝基苄基、烯丙基、叠氮基甲基或TCO衍生物并通过嘧啶(C、U)的5位置或去氮嘌呤(A、G、I)的7位置连接到所述碱基；并且
标记包括荧光染料、pH响应性荧光染料、荧光染料簇、pH响应性荧光染料簇、用于染料连接的锚定物、用于染料连接的锚定物簇、或锚定物和染料。
本发明提供了一种核苷酸类似物，其具有以下结构：
其中：
碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或其类似物；
R包括甲基、乙基、丙基、叔丁基、芳基、烷基芳基；
可切割接头包括DTM、偶氮基、2-硝基苄基、烯丙基、叠氮基甲基或TCO衍生物；并且
标记包括荧光染料、pH响应性荧光染料、荧光染料簇、pH响应性荧光染料簇、用于连接荧光染料的锚定物、用于连接荧光染料的锚定物簇、或锚定物和染料。
本发明提供了一种核苷酸类似物，其具有以下结构：
其中：
碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或其类似物；
可切割接头包括DTM、偶氮基、2-硝基苄基、烯丙基、叠氮基甲基或TCO衍生物或这些可切割接头中的多于一个可切割接头，包含其中一个可切割接头存在于所述碱基与阻断剂之间并且第二个不同的可切割接头存在于所述阻断剂与标记之间的特殊情况；
阻断剂是包括无碱基糖或经修饰的核苷或其组合的2-50个单体单元的核苷酸或寡核苷酸；并且阻断剂通过可切割接头连接到嘧啶(C、U)的5位置和去氮嘌呤(A、G、I)的7位置；
其中阻断剂是在掺入之后防止另外的核苷酸或核苷酸类似物进一步掺入到引物链中的部分；并且
标记包括荧光染料、pH响应性荧光染料、荧光染料簇、pH响应性荧光染料簇、用于连接荧光染料的锚定物、用于连接荧光染料的锚定物簇、或锚定物和染料，其中所述标记连接到所述阻断剂。
本发明提供了一种核苷酸类似物，其具有以下结构：
其中：
碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、次黄嘌呤或其类似物；并且
R是可切割化学基团，所述可切割化学基团包括烷基DTM、偶氮基、2-硝基苄基、烯丙基和叠氮基甲基衍生物。
本发明提供了一种核苷酸类似物，其具有以下结构：
其中：
碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或其类似物；并且
标记包括荧光染料、pH响应性荧光染料、荧光染料簇、pH响应性荧光染料簇、用于染料连接的锚定物、用于染料连接的锚定物簇、或锚定物和染料。
本发明提供了一种核苷酸类似物，其具有以下结构：
其中碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或其类似物。
本发明提供了一种核苷酸类似物，其具有以下结构：
其中：
碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或其类似物；
标记包括荧光染料、pH响应性荧光染料、荧光染料簇、pH响应性荧光染料簇、用于染料连接的锚定物、用于染料连接的锚定物簇、或锚定物和染料；并且
R包括甲基、乙基、丙基、叔丁基、芳基、烷基芳基。
本发明提供了一种核苷酸类似物，其具有以下结构：
其中：
碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或其类似物；并且
R包括甲基、乙基、丙基、叔丁基、芳基、烷基芳基。
本发明提供了一种核苷酸类似物，其具有以下结构：
其中碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或其类似物。
本发明提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板和核酸聚合酶，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列；
b)使所述核酸模板与两种不同的经标记的核苷酸类似物接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，以及(B)锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，所述锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的锚定物，
其中所述可切割接头可由相同的切割剂切割；
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(B)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，
其中所述可切割接头和所述3'-OH基团可由相同的切割剂切割；或者
(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(B)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，
其中所述可切割接头可由相同的切割剂切割；
c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)鉴定由于掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)使来自步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物与锚定物结合基团接触，所述锚定物结合基团结合到步骤(b)的所提供的锚定物标记的核苷酸类似物的所述锚定物，其中所述锚定物结合基团包括与步骤(b)的所述荧光标记的核苷酸类似物的所述荧光标记相同的荧光标记；
f)鉴定由于所述锚定物结合基团与步骤(b)的任何掺入的锚定物标记的核苷酸类似物的所述锚定物的结合而产生的任何荧光信号；
g)用两种不同的经标记的核苷酸类似物重复步骤(b)-(f)，所述两种不同的经标记的核苷酸类似物不同于来自步骤(b)的先前迭代的所述两种不同的经标记的核苷酸类似物；
h)从所掺入的核苷酸类似物中切割所述可切割接头，由此从步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物中去除任何标记、锚定物或阻断基；
i)从来自步骤(c)的任何掺入的核苷酸类似物中切割所述3'-O阻断基；以及
j)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(i)，
由此获得所述核酸的序列。
本发明提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列，并且提供核酸聚合酶；
b)使所述核酸模板与四种不同的经标记的核苷酸类似物(A、C、T、G)接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，(B)pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，(C)两种不同的锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，其中每种类似物包括通过可切割接头与碱基连接的不同锚定物，
其中所述可切割接头可由相同的切割剂切割；
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，和(B)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(C)两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物，所述两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中每种类似物包括通过可切割接头与所述碱基连接的不同锚定物，
其中所述可切割接头和所述3'-O阻断基可由相同的切割剂切割；或者
(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(C)两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物，所述两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中每种类似物包括通过可切割接头与所述碱基连接的不同锚定物，
其中所述可切割接头可由相同的切割剂切割；
c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)在所述pH响应性荧光标记具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)使来自步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物与以下接触：(A)与步骤(b)的所述锚定物标记的核苷酸类似物中的仅一种锚定物标记的核苷酸类似物的所述锚定物结合的锚定物结合基团，其中所述锚定物结合基团包括与步骤(b)的所述荧光标记的核苷酸类似物相同的荧光标记；以及(B)仅与剩余的锚定物标记的核苷酸类似物的所述锚定物结合的锚定物结合基团，其中所述锚定物结合基团包括与步骤(b)的所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物相同的pH响应性荧光标记；
f)在所述pH响应性荧光标记具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的锚定物标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
g)在所述pH响应性荧光标记不再具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗涤来自步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
h)从所掺入的核苷酸类似物中切割所述可切割接头，由此从步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物中去除任何标记、锚定物或阻断基；
i)从来自步骤(c)的任何掺入的核苷酸类似物中切割所述3'-O阻断基；以及
j)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(i)，
由此获得所述核酸的序列。
本发明提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板和核酸聚合酶，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列；
b)使所述核酸模板与两种不同的经标记的核苷酸类似物接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，以及(B)pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，
其中所述可切割接头可由相同的切割剂切割；
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(B)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，
其中所述可切割接头和所述3'-O阻断基可由相同的切割剂切割；或者
(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(B)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述可切割接头可由相同的切割剂切割；
c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)在所述pH响应性荧光标记具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)用两种不同的经标记的核苷酸类似物重复步骤(b)-(d)，所述两种不同的经标记的核苷酸类似物不同于来自步骤(b)的先前迭代的所述两种不同的经标记的核苷酸类似物；
f)在所述pH响应性荧光标记具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
其中步骤(e)和(f)可以以相反的顺序执行；
g)从所掺入的核苷酸类似物中切割所述可切割接头，由此从步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物中去除任何标记或阻断基；
h)从来自步骤(c)的任何掺入的核苷酸类似物中切割所述3'-O阻断基；以及
i)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(h)，
由此获得所述核酸的序列。
本发明提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板和核酸聚合酶，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列；
b)使所述核酸模板与四种不同的经标记的核苷酸类似物接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过第一可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，(B)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的荧光标记，(C)锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，所述锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头与所述碱基连接的锚定物，以及(D)锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，所述锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的锚定物；
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过第一可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头与所述碱基连接的锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述3'-O阻断基和所述第一可切割接头可由相同的切割剂切割；或者
(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过第一可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基、通过第一可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基、通过氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，
其中每种类似物上的所述荧光标记是相同的，
其中每种类似物上的所述锚定物是相同的；
c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)鉴定由于掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)使来自步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物与锚定物结合基团接触，所述锚定物结合基团结合到步骤(b)的所提供的锚定物标记的核苷酸类似物的所述锚定物，其中所述锚定物结合基团包括与步骤(b)的所述荧光标记的核苷酸类似物的所述荧光标记相同的荧光标记；
f)鉴定由于所述锚定物结合基团与步骤(b)的任何掺入的锚定物标记的核苷酸类似物的所述锚定物的结合而产生的任何荧光信号；
g)使所掺入的核苷酸类似物与四嗪衍生物接触以点击所述氨甲酰基TCO接头的TCO部分以释放通过氨甲酰基TCO接头连接的任何标记或锚定物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
h)使所掺入的核苷酸类似物与切割所述第一可切割接头和任何3'-O阻断基的切割剂接触；以及
i)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(h)，
由此获得所述核酸的序列。
本发明提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板和核酸聚合酶，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列；
b)使所述核酸模板与四种不同的经标记的核苷酸类似物接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，(B)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基以及通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记和第一锚定物，(C)锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，所述锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基以及通过可切割接头与所述碱基连接的所述第一锚定物和第二锚定物，以及(D)锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，所述锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的所述第二锚定物，其中所述可切割接头可由相同的切割剂切割；
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记和第一锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述可切割接头与所述碱基连接的所述第一锚定物和第二锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的所述第二锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述可切割接头和所述3'-O阻断基可由相同的切割剂切割；或者
(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基以及在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记和第一锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基以及在所述阻断基的远端与所述碱基连接的所述第一锚定物和第二锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链，以及(D)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的所述第二锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述可切割接头可由相同的切割剂切割，
其中每种类似物上的所述荧光标记是相同的；
c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)鉴定由于掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)使来自步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物与锚定物结合基团接触，所述锚定物结合基团结合到步骤(b)的所述核苷酸类似物的所述第二锚定物，其中所述锚定物结合基团包括与步骤(b)的所述荧光标记的核苷酸类似物的荧光标记相同的荧光标记；
f)鉴定由于所述锚定物结合基团与步骤(b)的任何掺入的核苷酸类似物的所述锚定物的结合而产生的任何荧光信号；
g)使所掺入的核苷酸类似物与第二锚定物结合基团接触，所述第二锚定物结合基团结合到步骤(b)的所述核苷酸类似物的所述第一锚定物并且包括使与所述锚定物结合基团连接到的所述核苷酸类似物连接的任何荧光标记的所述荧光信号猝灭的部分，并且鉴定由于掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
h)使所掺入的核苷酸类似物与切割所述可切割接头和任何3'-O阻断基的切割剂接触；以及
i)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(h)，
由此获得所述核酸的序列。
本发明提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板和核酸聚合酶，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列；
b)使所述核酸模板与四种不同的经标记的核苷酸类似物接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过第一可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，(B)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头和在所述第一可切割接头的远端连接的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的荧光标记，(C)锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，所述锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头和在所述第一可切割接头的远端连接的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的锚定物，以及(D)锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，所述锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头与所述碱基连接的锚定物；
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过第一可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头和在所述第一可切割接头的远端连接的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头与所述碱基连接的锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头和在所述第一可切割接头的远端连接的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述3'-OH阻断基和所述第一可切割接头可由相同的试剂切割；或者
(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过第一可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过所述第一可切割接头与所述碱基连接的阻断基和通过所述阻断基远端的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基、通过第一可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基、通过所述第一可切割接头与所述碱基连接的阻断基和通过所述阻断基远端的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，
其中每种类似物上的所述荧光标记是相同的，
其中每种类似物上的所述锚定物是相同的；
c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)鉴定由于在步骤(b)中掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)使来自步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物与锚定物结合基团接触，所述锚定物结合基团结合到步骤(b)的所提供的锚定物标记的核苷酸类似物的所述锚定物，其中所述锚定物结合基团包括与步骤(b)的所述荧光标记的核苷酸类似物的所述荧光标记相同的荧光标记；
f)鉴定由于所述锚定物结合基团与步骤(b)的任何掺入的锚定物标记的核苷酸类似物的所述锚定物的结合而产生的任何荧光信号；
g)使所掺入的核苷酸类似物与四嗪衍生物接触以点击所述氨甲酰基TCO接头的TCO部分以释放通过氨甲酰基TCO接头连接的任何标记或锚定物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
h)使所掺入的核苷酸类似物与切割所述第一可切割接头和任何3'-O阻断基的切割剂接触；以及
i)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(h)，
由此获得所述核酸的序列。
本发明提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板和核酸聚合酶，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列；
b)使所述核酸模板与四种不同的经标记的核苷酸类似物接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过第一可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，(B)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头和在所述第一可切割接头的远端连接的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的荧光标记，(C)pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头和在所述第一可切割接头的远端连接的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，以及(D)pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记；
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过第一可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头和在所述第一可切割接头的远端连接的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头和在所述第一可切割接头的远端连接的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述3'-OH阻断基和所述第一可切割接头可由相同的试剂切割；或者
(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过第一可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过所述第一可切割接头与所述碱基连接的阻断基和通过所述阻断基远端的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物核苷酸类似物包括碱基、通过第一可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过所述第一可切割接头与所述碱基连接的阻断基和通过所述阻断基远端的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，
c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)在所述pH响应性荧光标记不具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)在所述pH响应性荧光标记具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号，其中步骤(d)和(e)可以以相反的顺序执行；
f)使所掺入的核苷酸类似物与四嗪接触以点击所述氨甲酰基TCO接头的TCO部分以释放通过氨甲酰基TCO接头连接的任何标记；
g)在所述pH响应性荧光标记具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
h)使所掺入的核苷酸类似物与切割所述第一可切割接头和任何3'-O阻断基的切割剂接触；以及
i)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(h)，
由此获得所述核酸的序列。
本发明提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板和核酸聚合酶，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列；
b)使所述核酸模板与四种不同的经标记的核苷酸类似物接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，(B)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基以及通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记和锚定物，(C)pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，以及(D)pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基以及通过可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记和锚定物，其中所述可切割接头可由相同的切割剂切割；
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记和锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记和锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述可切割接头和所述3'-O阻断基可由相同的切割剂切割；或者
(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基以及在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记和锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基以及在所述阻断基的远端与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基以及在所述阻断基的远端与所述碱基连接的pH响应性荧光标记和锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述可切割接头可由相同的切割剂切割，
c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)在所述pH响应性荧光标记不具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)在所述pH响应性荧光标记具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号，其中步骤(d)和(e)可以以相反的顺序执行；
f)使来自步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物与锚定物结合基团接触，所述锚定物结合基团结合到步骤(b)的所述核苷酸类似物的所述锚定物，其中所述锚定物结合基团包括使步骤(b)的所述荧光标记的核苷酸类似物的所述荧光标记猝灭的部分；
g)在所述pH响应性荧光标记具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未结合的包括猝灭部分的锚定物结合基团，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
h)使所掺入的核苷酸类似物与切割所述可切割接头和任何3'-O阻断基的切割剂接触；以及
i)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(h)，
由此获得所述核酸的序列。
本发明提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板和核酸聚合酶，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列；
b)使所述核酸模板与两种不同的经标记的核苷酸类似物接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，以及(B)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基以及通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记和锚定物，其中所述可切割的接头可由相同的切割剂切割；
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记和锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述可切割接头和所述3'-O阻断基可由相同的切割剂切割；或者
(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基以及在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记和锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述可切割接头可由相同的切割剂切割，
c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)鉴定由于掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)用两种不同的经标记的核苷酸类似物重复步骤(b)-(d)，所述两种不同的经标记的核苷酸类似物不同于来自步骤(b)的先前迭代的所述两种不同的经标记的核苷酸类似物；
f)使来自步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物与锚定物结合基团接触，所述锚定物结合基团结合到步骤(b)的所述核苷酸类似物的所述锚定物，其中所述锚定物结合基团包括使步骤(b)的所述荧光标记的核苷酸类似物的所述荧光标记猝灭的部分；
g)鉴定由于在步骤(b)中掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
h)从所掺入的核苷酸类似物中切割所述可切割接头，由此从步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物中去除任何标记、锚定物或阻断基；
i)从来自步骤(c)的任何掺入的核苷酸类似物中切割所述3'-O阻断基；以及
j)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(i)，
由此获得所述核酸的序列。
本发明提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列，并且提供核酸聚合酶；
b)使所述核酸模板与四种不同的经标记的核苷酸类似物(A、C、T、G)接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，(B)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过不可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，(C)锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，所述锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的锚定物，以及(D)锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，所述锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过不可切割接头与所述碱基连接的锚定物；
c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)鉴定由于在步骤(b)中掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)使来自步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物与锚定物结合基团接触，所述锚定物结合基团结合到步骤(b)的所述锚定物标记的核苷酸类似物的所述锚定物；
f)鉴定由于在步骤(b)中掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
g)使步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物与切割步骤(b)的所述核苷酸类似物的所述可切割接头并切割步骤(c)的所述核苷酸类似物的所述3'-O阻断基的试剂接触；
h)鉴定由于在步骤(b)中掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
i)光漂白步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物以由此光漂白任何剩余的荧光标记；以及
j)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(i)，
由此获得所述核酸的序列。
本发明提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板和核酸聚合酶，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列；
b)使所述核酸模板与两种不同的经标记的核苷酸类似物接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，以及(B)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的不同的荧光标记，其中所述可切割接头可由相同的切割剂切割；
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的不同的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述可切割接头和所述3'-O阻断基可由相同的切割剂切割；或者
(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基以及在所述阻断基的远端与所述碱基连接的不同的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述可切割接头可由相同的切割剂切割；
c)使所述核酸模板与不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的未标记的核苷酸类似物(A、C、T、G)接触，其中所述3'-O阻断基可由与步骤(b)的所述两种经标记的核苷酸类似物的所述可切割接头和/或所述阻断基相同的切割剂切割，并且用所述未标记的核苷酸类似物延伸任何未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)鉴定由于掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)用不同于来自步骤(b)的先前迭代的所述两种不同的经标记的核苷酸类似物的两种不同的经标记的核苷酸类似物重复步骤(b)-(d)，但仅使用与此步骤中添加的所述两种经标记的核苷酸类似物不同的包括3'-O阻断基的两种未标记的核苷酸进行重复；
f)从所掺入的核苷酸类似物中切割所述可切割接头，由此从步骤(b)和(c)的所掺入的核苷酸类似物中去除任何标记或阻断基；
g)鉴定由于在步骤(b)中掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；以及
h)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(g)，
由此获得所述核酸的序列。
本发明提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列，并且提供核酸聚合酶；
b)使所述核酸模板与四种不同的经标记的核苷酸类似物(A、C、T、G)接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，(B)pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，(C)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基以及通过可切割接头与所述碱基连接接的荧光标记和锚定物，以及(D)pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基以及通过可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记和相同的锚定物，
其中所述可切割接头可由相同的切割剂切割；
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记和锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记和相同的锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，
其中所述可切割接头和所述3'-O阻断基可由相同的切割剂切割；或者
(iii)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基以及在所述阻断基的远端与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基以及在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记和锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基以及在所述阻断基的远端与所述碱基连接的pH响应性荧光标记和相同的锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，
其中所述可切割接头可由相同的切割剂切割；
c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)在所述pH响应性荧光标记不具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)在所述pH响应性荧光标记具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的锚定物标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
f)使所掺入的核苷酸类似物与锚定物结合基团接触，所述锚定物结合基团结合到步骤(b)的所述核苷酸类似物的所述锚定物并且包括使与所述锚定物结合基团连接到的所述核苷酸类似物连接的任何荧光标记的所述荧光信号猝灭的部分，并且鉴定由于掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
g)使所掺入的核苷酸类似物与切割所述可切割接头和任何3'-O阻断基的切割剂接触；以及
h)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(g)，
由此获得所述核酸的序列。
本发明提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板；
b)使所述核酸模板与两种不同的经标记的核苷酸类似物接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)两种荧光标记的核苷酸类似物，所述两种荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的用作能量转移供体的荧光标记、用于连接能量转移受体标记的锚定物、以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，
其中所述可切割接头和所述3'-O阻断基可由相同的切割剂切割；
其中所述核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物具有不同的锚定物；或者
(ii)两种荧光标记的核苷酸类似物，所述两种荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基、以及与所述阻断基远端的碱基接头连接的荧光能量转移供体标记和用于连接能量转移受体标记的锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，
其中所述可切割接头可由相同的切割剂切割，并且
其中所述核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物具有不同的锚定物；
c)洗去任何未掺入的核苷酸类似物并且使所掺入的核苷酸类似物与两种锚定物结合基团接触，所述两种锚定物结合基团特异性地结合到步骤(b)的所述核苷酸类似物的所述锚定物中的每一种锚定物并且包括用作能量转移受体的部分，
其中所述锚定物结合基团中的一种锚定物结合基团上的所述能量转移受体是pH不响应性标记，并且另一种锚定物结合基团上的所述能量转移受体是pH响应性标记；
d)在所述pH响应性荧光能量转移受体染料标记具有与所述pH不响应性荧光能量转移受体标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何游离标记；
e)将所掺入的核苷酸暴露于能够激发所述能量转移供体染料的波长，并且鉴定由于因在步骤(c)中执行的标记反应而与所述核苷酸类似物连接的所述能量转移受体染料的能量转移和发射而产生的任何荧光信号；
f)用两种不同的经标记的核苷酸类似物重复步骤(b)到(e)，所述两种不同的经标记的核苷酸类似物不同于(b)中的所述两种不同的经标记的核苷酸类似物，但除此之外具有(b)中所描述的所有其它性质；
g)将缓冲液改变到所述pH响应性荧光标记不具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述pH不响应性荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线时的pH，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)或(f)的锚定物标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号，其中步骤(e)和(g)的顺序可以相反；
h)使所掺入的核苷酸类似物与切割所述可切割接头和所述3'-O阻断基的切割剂接触；以及
i)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(h)，
由此获得所述核酸的序列。
本发明提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列，并且提供核酸聚合酶；
b)使所述核酸模板与四种不同的经标记的核苷酸类似物(A、C、G、T)接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、和通过第一可切割接头(可切割接头1)与所述碱基连接的用作能量转移供体的荧光标记和用于连接pH不响应性能量转移受体标记的锚定物(锚定物1)、以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、和通过相同的可切割接头(可切割接头1)与所述碱基连接的用作能量转移供体的荧光标记和用于连接pH响应性能量转移受体标记的第二锚定物(锚定物2)两者、以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、和通过第二可切割接头(可切割接头2)与所述碱基连接的用作能量转移供体的荧光标记和用于连接pH不响应性能量转移受体标记的所述第一锚定物(锚定物1)两者、以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、和通过所述第二可切割接头(可切割接头2)与所述碱基连接的用作能量转移供体的荧光标记、用于连接pH响应性能量转移受体标记的所述第二锚定物(锚定物2)两者、以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，
其中所述第一可切割接头和所述3'-O阻断基可由相同的切割剂切割，并且所述第二可切割接头可由不同的切割剂切割；或者
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过第一可切割接头(可切割接头1)与所述碱基连接的阻断基、以及与所述阻断基远端的碱基接头连接的荧光能量转移供体标记和用于连接pH不响应性能量转移受体标记的锚定物(锚定物1)，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过第一可切割接头(可切割接头1)与所述碱基连接的阻断基、以及与所述阻断基远端的碱基接头连接的荧光能量转移供体标记和用于连接pH响应性能量转移受体标记的第二锚定物(锚定物2)，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过第二可切割接头(可切割接头2)与所述碱基连接的阻断基、以及与所述阻断基远端的碱基接头连接的荧光能量转移供体标记和用于连接pH不响应性能量转移受体标记的所述第一锚定物(锚定物1)，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过第二可切割接头(可切割接头2)与所述碱基连接的阻断基、以及与所述阻断基远端的碱基接头连接的荧光能量转移供体标记和用于连接pH响应性能量转移受体标记的所述第二锚定物(锚定物2)，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，
其中每个可切割接头可由不同的切割剂切割；
c)洗去任何未掺入的核苷酸类似物并且使所掺入的核苷酸类似物与两种锚定物结合基团接触，所述两种锚定物结合基团特异性地结合到步骤(b)的所述核苷酸类似物的所述锚定物中的每一种锚定物并且包括用作能量转移受体的部分，
其中所述锚定物结合基团中的一种锚定物结合基团上的所述能量转移受体是pH不响应性标记，并且另一种锚定物结合基团上的所述能量转移受体是pH响应性标记；
d)在所述pH响应性荧光能量转移受体染料标记具有与所述pH不响应性荧光能量转移受体标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何游离标记；
e)将所掺入的核苷酸暴露于能够激发所述能量转移供体染料的波长，并且鉴定由于因在步骤(c)中执行的标记反应而与步骤(b)中掺入的所述核苷酸类似物连接的所述能量转移受体染料的能量转移和发射而产生的任何荧光信号；
f)将缓冲液改变到所述pH响应性荧光标记不具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述pH不响应性荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线时的pH，并且鉴定由于因在步骤(c)中执行的标记反应而掺入来自步骤(b)的锚定物标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号，其中步骤(d)和(f)可以相反；
g)使所掺入的核苷酸类似物与切割所述第二可切割接头的切割剂接触；
h)在所述pH响应性荧光能量转移受体染料标记具有与所述pH不响应性荧光能量转移受体标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去所述切割剂和所释放的标记；
i)重复步骤(e)；
j)使所掺入的核苷酸类似物与切割所述第一可切割接头和所述3'-O阻断基的切割剂接触；以及
k)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(j)，
由此获得所述核酸的序列。
附图说明
图1：通用的一组用于单色SBS的染料和锚定物标记的可切割ddNTP类似物和标记试剂：双脱氧核苷酸类似物中的两种具有锚定物(例如，生物素)并且两种具有染料(例如，Cy5)。标记分子由能够与锚定物特异性地结合的分子(链霉亲和素)和相同的染料组成。这种杂交SBS方法的要求是单独的一组四种未标记的可逆终止子(例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)。
图2：用于使用可切割核苷酸类似物(如在图3中所呈现的可切割核苷酸类似物)进行单色SBS的方案的简化表示。ddNTP中的两种具有通过SS接头连接的Cy5，并且其它两种具有通过SS接头连接的生物素。矩形表示含有所连接的引物-环-模板分子(或其它模板-结合引物布置)的许多拷贝的基材上的区域，其中模板链中的下一个碱基从左到右是C、G、T或A。在使用Therminator IX聚合酶，与用于延伸大部分引物的四种未标记的核苷酸可逆终止子(NRT，例如3'-O-叠氮基甲基dNTP)和ddNTP类似物中的两种ddNTP类似物(即具有Cy5的ddT和具有生物素的ddA)温育后，成像将揭示右侧矩形区域中的阳性信号(表示用T延伸引物链)和剩余区域中的背景信号。在用链霉亲和素-Cy5进行标记后，成像将揭示在第三个区域中的新的阳性信号，从而指示A的掺入。接下来，执行与剩余的ddNTP类似物(即具有生物素的ddC和具有Cy5的ddG)(以及过量的A和T NRT)的温育，并且成像将揭示在左侧区域中的新的阳性信号，从而指示G的掺入。再次用链霉亲和素-Cy5进行标记将使得在剩余的矩形区域中出现信号，从而指示C的掺入。最后，用THP处理以切割SS接头并去除任何用NRT延伸的引物上的叠氮基甲基基团以为下一个测序循环做准备。左侧的1、2、3和4数字代码表示四个所指示的成像步骤中的每一个成像步骤处的累积信号，即由1指示的阳性信号和由0指示的背景信号。四种可能的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物的掺入将通过独特的数字代码揭示(考虑到所有这四个成像步骤，则0111表示A，0001表示C，0011表示G并且1111表示T；仅考虑这些成像步骤中的前三个，则011表示A，000表示C，001表示G并且111表示T)。
图3：用于图4的示例ddNTP类似物。
图4A-4B：使用一组ddNTP类似物进行单色边合成边测序，所述一组ddNTP类似物中的两种具有生物素并且两种具有Cy5，仅具有SS接头。使用ddNTP-可切割接头-染料(ddGTP-7-SS-Cy5、ddTTP-5-SS-Cy5)、ddNTP-可切割接头-锚定物(ddCTP-5-SS-生物素、ddATP-7-SS-生物素)、3'-O-叠氮基甲基-dNTP(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)和锚定物结合分子-染料(链霉亲和素-Cy5)执行单色DNA SBS。步骤1，将Therminator IX DNA聚合酶、ddNTP类似物中的两种(ddTTP-5-SS-Cy5、ddATP-7-SS-生物素)和四种可逆终止子(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够将互补核苷酸可逆终止子类似物掺入到大多数增长的DNA链中(>90％)以终止DNA合成，并且使得能够用ddA或ddT类似物(与模板链中的T或A互补)延伸一小部分引物。步骤2，在洗去未掺入的核苷酸类似物后，针对Cy5荧光的成像将揭示那些用ddTTP-5-SS-Cy5延伸的引物。步骤3，添加链霉亲和素-Cy5以标记任何掺入的ddATP-7-SS-生物素类似物。步骤4，在洗去未使用的标记试剂后，第二个成像步骤将揭示ddA的掺入。步骤5，随后用Therminator IX DNA聚合酶和剩余的ddNTP类似物(ddGTP-SS-Cy5、ddCTP-5-SS-生物素)以及用于确保掺入保真度的3'-O-叠氮基甲基-dATP和3'-O-叠氮基甲基dTTP进行延伸将延伸大部分剩余的固定的结合有引物的DNA模板，尤其是模板链中与G和C相对的那些模板。在此步骤之后，增长的DNA链终止于四种染料标记的双脱氧核苷酸类似物(A、C、G、T)中的一种染料标记的双脱氧核苷酸类似物或不具有染料的四种3'-阻断的可逆终止子核苷酸类似物(A、C、G、T)中的相同的一种核苷酸类似物。步骤6，在洗去未掺入的核苷酸后，执行第三个成像步骤。阳性信号将指示ddG的掺入。此时，可以用四种3'-O-叠氮基甲基dNTP执行任选的追加延伸步骤以确保几乎每个引物都已经用ddNTP或NRT类似物中的一种进行了延伸。步骤7，再次用链霉亲和素-Cy5进行标记，以将Cy5连接到任何掺入的ddC-5-SS-生物素类似物。步骤8，在洗去未使用的标记试剂之后，执行第四轮成像。Cy5信号的增益指示ddC的掺入。步骤9，通过将THP添加到延长的DNA链来切割SS接头，使得ddNTP类似物上的所有染料被去除，并且还恢复了用3'-O-叠氮基甲基-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。在洗去所切割的染料之后，执行任选的最后一轮成像。DNA产物准备好用于DNA测序反应的下一个循环。图3中呈现了此方案中使用的核苷酸的结构。在每一步骤处的成像动画中，黑色指示阳性Cy5信号，并且白色指示背景信号。最后的概要动画中的编码指示模板序列，而不是所掺入的核苷酸。
图5：通用的一组用于单色SBS的染料和锚定物标记的可切割dNTP-阻断剂(虚拟终止子)类似物和标记试剂：虚拟终止子类似物中的两种具有锚定物(例如，生物素)并且两种具有染料(例如，Cy5)。标记分子由能够与锚定物特异性地结合的分子(链霉亲和素)和相同的染料组成。使用四种未标记的可逆终止子(例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)进行追加延伸。
图6：用于使用可切割核苷酸类似物(如在图5中所呈现的可切割核苷酸类似物)进行单色SBS的方案的简化表示。dNTP-阻断剂虚拟终止子中的两种具有通过SS接头连接的Cy5，并且其它两种具有通过SS接头连接的生物素。矩形表示含有所连接的引物-环-模板分子(或其它模板-结合引物布置)的许多拷贝的基材上的区域，其中模板中的下一个碱基从左到右是C、G、T或A。在使用Therminator IX聚合酶，与用于延伸大部分引物的四种未标记的核苷酸可逆终止子(NRT，例如3'-O-叠氮基甲基dNTP)和虚拟终止子类似物中的两种(即具有Cy5的dT和具有生物素的dA)温育后，成像将揭示右侧矩形区域中的阳性信号(表示用T延伸引物链)和剩余区域中的背景信号。在用链霉亲和素-Cy5进行标记后，成像将揭示在第三个区域中的新的阳性信号，从而指示A的掺入。接下来，执行与剩余的虚拟终止子类似物(即具有生物素的dC和具有Cy5的dG)(以及过量的A和T NRT)的温育，并且成像将揭示在左侧区域中的新的阳性信号，从而指示G的掺入。再次用链霉亲和素-Cy5进行标记将使得在剩余的矩形区域中出现信号，从而指示C的掺入。最后，用THP处理以切割SS接头并去除任何用NRT延伸的引物上的叠氮基甲基基团以为下一个测序循环做准备。左侧的1、2、3和4数字代码表示四个所指示的成像步骤中的每一个成像步骤处的累积信号，即由1指示的阳性信号和由0指示的背景信号。四种可能的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物的掺入将通过独特的数字代码揭示(考虑到所有这四个成像步骤，则0111表示A，0001表示C，0011表示G并且1111表示T；仅考虑这些成像步骤中的前三个，则011表示A，000表示C，001表示G并且111表示T)。
图7：用于图8的虚拟终止子类似物和标记分子的实例。
图8A-8B：使用一组dNTP-阻断剂(虚拟终止子)类似物进行单色边合成边测序，所述一组dNTP-阻断剂(虚拟终止子)类似物中的两种具有生物素并且两种具有Cy5，仅具有SS接头。使用dNTP-可切割接头-阻断剂-染料(dGTP-7-SS-阻断剂-Cy5、dTTP-5-SS-阻断剂-Cy5)、dNTP-可切割接头-阻断剂-锚定物(dCTP-5-SS-阻断剂-生物素、dATP-7-SS-阻断剂-生物素)、3'-O-叠氮基甲基-dNTP(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)和锚定物结合分子-染料(链霉亲和素-Cy5)执行单色DNA SBS。步骤1，将Therminator IX DNA聚合酶、dNTP-阻断剂(虚拟终止子)类似物中的两种(dTTP-5-SS-阻断剂-Cy5、dATP-7-SS-阻断剂-生物素)和四种可逆终止子(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够将互补核苷酸可逆终止子类似物掺入到大多数增长的DNA链中(>90％)以终止DNA合成，并且使得能够用dA或dT类似物(与模板链中的T或A互补)延伸一小部分引物。步骤2，在洗去未掺入的核苷酸类似物后，针对Cy5荧光的成像将揭示那些用dTTP-5-SS-阻断剂-Cy5延伸的引物。步骤3，添加链霉亲和素-Cy5以标记任何掺入的dATP-7-SS-阻断剂-生物素类似物。步骤4，在洗去未使用的标记试剂后，第二个成像步骤将揭示dA的掺入。步骤5，随后用Therminator IX DNA聚合酶和剩余的dNTP-阻断剂(虚拟终止子)类似物(dGTP-SS-阻断剂-Cy5、dCTP-5-SS-阻断剂-生物素)以及用于确保掺入保真度的3'-O-叠氮基甲基-dATP和3'-O-叠氮基甲基dTTP进行延伸将延伸大部分剩余的固定的结合有引物的DNA模板，尤其是模板链中与G和C相对的那些模板。在此步骤之后，增长的DNA链终止于四种经标记的虚拟终止子核苷酸类似物(A、C、G、T)中的一种经标记的虚拟终止子核苷酸类似物或不具有染料的四种3'-阻断的可逆终止子核苷酸类似物(A、C、G、T)中的相同的一种核苷酸类似物。步骤6，在洗去未掺入的核苷酸后，执行第三个成像步骤。阳性信号将指示dG的掺入。此时，可以用四种3'-O-叠氮基甲基dNTP执行任选的追加延伸步骤以确保几乎每个引物都已经用dNTP虚拟终止子或NRT类似物中的一种进行了延伸。步骤7，再次用链霉亲和素-Cy5进行标记，以将Cy5连接到任何掺入的dC-5-SS-阻断剂-生物素类似物。步骤8，在洗去未使用的标记试剂之后，执行第四轮成像。Cy5信号的增益指示dC的掺入。步骤9，通过将THP添加到延长的DNA链来切割SS接头，使得dNTP虚拟终止子核苷酸类似物上的所有染料被去除，并且还恢复了用3'-O-叠氮基甲基-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。在洗去所切割的染料之后，执行任选的最后一轮成像。DNA产物准备好用于DNA测序反应的下一个循环。图7中呈现了此方案中使用的核苷酸的结构。在每一步骤处的成像动画中，黑色指示阳性Cy5信号，并且白色指示背景信号。最后的概要动画中的编码指示模板序列，而不是所掺入的核苷酸。
图9：通用的一组用于单色SBS的染料和锚定物标记的可切割3'-阻断的可逆终止子类似物和标记试剂：可逆终止子类似物中的两种具有锚定物(例如，生物素)并且两种具有染料(例如，Cy5)。标记分子由能够与锚定物特异性地结合的分子(链霉亲和素)和相同的染料组成。使用四种未标记的可逆终止子(例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)进行追加延伸。
图10：用于使用可切割核苷酸类似物(如在图9中所呈现的可切割核苷酸类似物)进行单色SBS的方案的简化表示。3'-阻断的核苷酸可逆终止子中的两种具有通过SS接头连接的Cy5，并且其它两种具有通过SS接头连接的生物素。矩形表示含有所连接的引物-环-模板分子(或其它模板-结合引物布置)的许多拷贝的基材上的区域，其中模板中的下一个碱基从左到右是C、G、T或A。在使用Therminator IX聚合酶，与用于延伸大部分引物的四种未标记的核苷酸可逆终止子(NRT，例如3'-O-叠氮基甲基dNTP)和经标记的可逆终止子类似物中的两种(即具有Cy5的dT和具有生物素的dA)温育后，成像将揭示右侧矩形区域中的阳性信号(表示用T延伸引物链)和剩余区域中的背景信号。在用链霉亲和素-Cy5进行标记后，成像将揭示在第三个区域中的新的阳性信号，从而指示A的掺入。接下来，执行与剩余的可逆终止子类似物(即具有生物素的dC和具有Cy5的dG)(以及过量的未标记的A和T NRT)的温育，并且成像将揭示在左侧区域中的新的阳性信号，从而指示G的掺入。再次用链霉亲和素-Cy5进行标记将使得在剩余的矩形区域中出现信号，从而指示C的掺入。最后，用THP处理以切割SS接头并去除任何用NRT延伸的引物上的叠氮基甲基基团以为下一个测序循环做准备。左侧的1、2、3和4数字代码表示四个所指示的成像步骤中的每一个成像步骤处的累积信号，即由1指示的阳性信号和由0指示的背景信号。四种可能的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物的掺入将通过独特的数字代码揭示(考虑到所有这四个成像步骤，则0111表示A，0001表示C，0011表示G并且1111表示T；仅考虑这些成像步骤中的前三个，则011表示A，000表示C，001表示G并且111表示T)。
图11：用于图12的示例经标记的可逆终止子类似物和标记分子。
图12A-12B：使用一组3'-O-阻断的核苷酸可逆终止子类似物进行单色边合成边测序，所述一组3'-O-阻断的核苷酸可逆终止子类似物中的两种具有生物素并且两种具有Cy5，仅具有SS接头。使用3'-O-SS-dNTP-可切割接头-染料(3'-O-SS-dGTP-7-SS-Cy5、3'-O-SS-dTTP-5-SS-Cy5)、3'-O-SS-dNTP-可切割接头-锚定物(3'-O-SS-dCTP-5-SS-生物素、3'-O-SS-dATP-7-SS-生物素)、3'-O-叠氮基甲基-dNTP(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)和锚定物结合分子-染料(链霉亲和素-Cy5)执行单色DNASBS。步骤1，将Therminator IX DNA聚合酶、3'-O-SS-dNTP-染料类似物或3'-O-SS-dNTP-锚定物类似物中的两种(3'-O-SS-dTTP-5-SS-Cy5、3'-O-SS-dATP-7-SS-生物素)和四种可逆终止子(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够将互补未标记的核苷酸可逆终止子类似物掺入到大多数增长的DNA链中(>90％)以终止DNA合成，并且使得能够用经标记的dA或dT类似物(与模板链中的T或A互补)延伸一小部分引物。步骤2，在洗去未掺入的核苷酸类似物后，针对Cy5荧光的成像将揭示那些用3'-O-SS-dTTP-5-SS-Cy5延伸的引物。步骤3，添加链霉亲和素-Cy5以标记任何掺入的3'-O-SS-dATP-7-SS-生物素类似物。步骤4，在洗去未使用的标记试剂后，第二个成像步骤将揭示dA的掺入。步骤5，随后用Therminator IX DNA聚合酶和剩余的3'-O-SS-dNTP-染料类似物或3'-O-SS-dNTP-锚定物类似物(3'-O-SS-dGTP-SS-Cy5、3'-O-SS-dCTP-5-SS-生物素)以及用于确保掺入保真度的3'-O-叠氮基甲基-dATP和3'-O-叠氮基甲基dTTP进行延伸将延伸大部分剩余的固定的结合有引物的DNA模板，尤其是模板链中与G和C相对的那些模板。在此步骤之后，增长的DNA链终止于四种经标记的可逆终止子核苷酸类似物(A、C、G、T)中的一种经标记的可逆终止子核苷酸类似物或不具有标记的四种3'-阻断的可逆终止子核苷酸类似物(A、C、G、T)中的相同的一种核苷酸类似物。步骤6，在洗去未掺入的核苷酸后，执行第三个成像步骤。阳性信号将指示dG的掺入。可以用四种3'-O-叠氮基甲基dNTP执行任选的追加延伸步骤以确保几乎每个引物都已经用经标记的dNTP可逆终止子或未标记的NRT类似物中的一种进行了延伸。步骤7，再次用链霉亲和素-Cy5进行标记，以将Cy5连接到任何掺入的3'-O-SS-dC-5-SS-生物素类似物。步骤8，在洗去未使用的标记试剂之后，执行第四轮成像。Cy5信号的增益指示dC的掺入。步骤9，通过将THP添加到延长的DNA链来切割SS接头，使得经标记的可逆终止子核苷酸类似物上的所有染料被去除，并且还恢复了任何增长的链上的3'-OH基团。在洗去所切割的染料之后，执行任选的最后一轮成像。DNA产物准备好用于DNA测序反应的下一个循环。图11中呈现了此方案中使用的核苷酸的结构。在每一步骤处的成像动画中，黑色指示阳性Cy5信号，并且白色指示背景信号。最后的概要动画中的编码指示模板序列，而不是所掺入的核苷酸。
图13：通用的一组用于具有两种光谱等效染料(即Cy5和HCyC-646，其中后一种染料是pH响应性的)的单色SBS的染料和锚定物标记的可切割ddNTP类似物和标记试剂：双脱氧核苷酸类似物中的一种具有生物素锚定物，一种具有四嗪锚定物，一种具有Cy5染料并且一种具有HCyC-646。标记分子由能够特异性地结合到锚定物之一的分子(对于生物素，所述分子为链霉亲和素；或者对于四嗪，所述分子为TCO)和相同的两种染料组成。这种杂交SBS方法的要求是单独的一组四种未标记的可逆终止子(例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)。
图14：用于使用可切割核苷酸类似物(如在图15中所呈现的可切割核苷酸类似物)进行单色SBS的方案的简化表示。ddNTP中的一种具有通过SS接头与碱基连接的Cy5，一种具有通过SS接头与碱基连接的HCyC-646，一种具有通过SS接头与碱基连接的生物素，并且一种具有通过SS接头与碱基连接的四嗪。矩形表示含有所连接的引物-环-模板分子(或其它模板-结合引物布置)的许多拷贝的基材上的区域，其中模板链中的下一个碱基从左到右是C、G、T或A。在使用Therminator IX聚合酶，与用于延伸大部分引物的四种未标记的核苷酸可逆终止子(NRT，例如3'-O-叠氮基甲基dNTP)温育后，用Thermo Sequenase和以下四种ddNTP类似物执行进一步延伸：与生物素连接的ddA、与Cy5连接的ddT、与四嗪连接的ddC以及与HCyC-646连接的ddG。最后，在pH 5下进行洗涤以确保HCyC-646将发射信号(与Cy5的发射波长相同或相似)。成像将揭示左侧和右侧矩形区域中的阳性信号(表示用G或T延伸引物链)和剩余区域中的背景信号。在用将分别与生物素和四嗪结合的链霉亲和素-Cy5和TCO-HCyC-646同时进行标记后，之后在pH 5下再次洗涤，成像将揭示在两个中心矩形区域中的新的阳性信号，从而指示A或C的掺入。接下来，在pH 8.5-9下洗涤将消除来自HCyC-646染料的信号，所述染料现在存在于C和G ddNTP类似物上。用四种3'-O-叠氮基甲基dNTP进行任选的追加延伸以确保基本上所有引物均已经延伸。最后，用THP处理以切割SS接头，从而去除所掺入的ddNTP上的染料，并去除任何用NRT延伸的引物上的叠氮基甲基基团以为下一个测序循环做准备。左侧的1、2和3数字代码表示三个所指示的成像步骤中的每一个成像步骤处的累积信号，即由1指示的阳性信号和由0指示的背景信号。四种可能的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物的掺入将通过独特的数字代码揭示(考虑到所有这三个成像步骤，则011表示A，010表示C，110表示G并且111表示T；仅考虑这些成像步骤中的第一个和第三个步骤，则01表示A，00表示C，10表示G并且11表示T)。
图15：用于图16的示例ddNTP类似物和经标记的结合分子。
图16A-16B：使用一组ddNTP类似物进行单色边合成边测序，所述一组ddNTP类似物中的一种具有Cy5，一种具有HCyC-646，一种具有生物素并且一种具有四嗪，均具有SS接头。使用ddNTP-可切割接头-染料(ddGTP-7-SS-HCyC-646、ddTTP-5-SS-Cy5)、ddNTP-可切割接头-锚定物(ddCTP-5-SS-四嗪、ddATP-7-SS-生物素)、3'-O-叠氮基甲基-dNTP(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)和锚定物结合分子-染料(链霉亲和素-Cy5、TCO-HCyC-646)执行单色DNA SBS。步骤1，将Therminator IX DNA聚合酶和四种可逆终止子(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够将互补核苷酸类似物掺入到大多数增长的DNA链中(>90％)以终止DNA合成。步骤2，将Thermo Sequenase和四种ddNTP类似物(ddGTP-7-SS-HCyC-646、ddTTP-5-SS-Cy5、ddCTP-5-SS-四嗪、ddATP-7-SS-生物素)添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够在大多数剩余的模板-环-引物上掺入ddNTP。步骤3，在pH 5下洗去未掺入的核苷酸类似物后，荧光成像将揭示那些用ddTTP-5-SS-Cy5或ddGTP-SS-HCyC-646延伸的引物。步骤4，添加链霉亲和素-Cy5和TCO-HCyC-646以标记任何掺入的ddATP-7-SS-生物素或ddCTP-5-SS-四嗪类似物。步骤5，在pH 5下洗去未使用的标记试剂后，第二个成像步骤将揭示ddA或ddC的掺入。步骤6，在此次在pH 9下的另外的洗涤步骤之后，执行第三次成像。由于HCyC-646发荧光的能力是pH响应性的，在低于pH 6时才发荧光，因此在此步骤中不会显示出荧光。因此，在步骤3中首次展现的荧光损失将指示ddG类似物的延伸，而剩余的荧光将指示ddT类似物被掺入。类似地，在步骤5中首次可视化的荧光损失将指示ddC类似物延伸，并且剩余的荧光将指示ddA类似物掺入。此时，可以用四种3'-O-叠氮基甲基dNTP执行任选的追加延伸步骤以确保几乎每个引物都已经用ddNTP或NRT类似物中的一种进行了延伸。步骤8，通过将THP添加到延长的DNA链来切割SS接头，使得ddNTP类似物上的所有染料被去除，并且还恢复了用3'-O-叠氮基甲基-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。在洗去所切割的染料之后，执行任选的最后一轮成像。DNA产物准备好用于DNA测序反应的下一个循环。图15中呈现了此方案中使用的核苷酸的结构。在每一步骤处的成像动画中，黑色指示阳性荧光信号，并且白色指示背景信号。最后的概要动画中的编码指示模板序列，而不是所掺入的核苷酸。
图17：通用的一组用于具有两种光谱等效染料(即Cy5和HCyC-646，其中后一种染料是pH响应性的)的单色SBS的染料和锚定物标记的可切割dNTP-阻断剂(虚拟终止子)类似物和标记试剂：虚拟终止子类似物中的一种具有生物素锚定物，一种具有四嗪锚定物，一种具有Cy5染料并且一种具有HCyC-646。标记分子由能够特异性地结合到锚定物之一的分子(对于生物素，所述分子为链霉亲和素；或者对于四嗪，所述分子为TCO)和相同的两种染料组成。追加延伸分子是单独的一组四种未标记的可逆终止子(例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)。
图18：用于使用可切割核苷酸类似物(如在图17中所呈现的可切割核苷酸类似物)进行单色SBS的方案的简化表示。dNTP-阻断剂(虚拟终止子)核苷酸中的一种具有通过SS接头与碱基连接的Cy5，一种具有通过SS接头与碱基连接的HCyC-646，一种具有通过SS接头与碱基连接的生物素，并且一种具有通过SS接头与碱基连接的四嗪。矩形表示含有所连接的引物-环-模板分子(或其它模板-结合引物布置)的许多拷贝的基材上的区域，其中模板链中的下一个碱基从左到右是C、G、T或A。用Thermo Sequenase和以下四种虚拟终止子类似物(在碱基与标记之间含有阻断基)执行延伸：与生物素连接的dA、与Cy5连接的dT、与四嗪连接的dC以及与HCyC-646连接的dG。然后使用Therminator IX聚合酶，用四种未标记的核苷酸可逆终止子(NRT，例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)执行追加延伸，以延伸剩余的引物。最后，在pH 5下进行洗涤以确保HCyC-646将发射信号(与Cy5的发射波长相同或相似)。成像将揭示左侧和右侧矩形区域中的阳性信号(表示用G或T延伸引物链)和剩余区域中的背景信号。在用将分别与生物素和四嗪结合的链霉亲和素-Cy5和TCO-HCyC-646同时进行标记后，之后在pH 5下再次洗涤，成像将揭示在两个中心矩形区域中的新的阳性信号，从而指示A或C的掺入。接下来，在pH 8.5-9下洗涤将消除来自HCyC-646染料的荧光信号，所述染料现在存在于C和G ddNTP类似物上。用四种3'-O-叠氮基甲基dNTP进行任选的追加延伸以确保基本上所有引物均已经延伸。最后，用THP处理以切割SS接头，从而去除所掺入的虚拟终止子上的染料，并去除任何用NRT延伸的引物上的叠氮基甲基基团以为下一个测序循环做准备。左侧的1、2和3数字代码表示三个所指示的成像步骤中的每一个成像步骤处的累积信号，即由1指示的阳性信号和由0指示的背景信号。四种可能的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物的掺入将通过独特的数字代码揭示(考虑到所有这三个成像步骤，则011表示A，010表示C，110表示G并且111表示T；仅考虑这些成像步骤中的第一个和第三个步骤，则01表示A，00表示C，10表示G并且11表示T)。
图19：用于图20的示例3'-阻断剂(虚拟终止子)类似物和标记分子。
图20A-20B：使用一组dNTP-阻断剂(虚拟终止子)类似物进行单色边合成边测序，所述一组dNTP-阻断剂(虚拟终止子)类似物中的一种具有Cy5，一种具有HCyC-646，一种具有生物素并且一种具有四嗪，均具有SS接头。使用dNTP-可切割接头-阻断剂-染料(dGTP-7-SS-阻断剂-HCyC-646、dTTP-5-SS-阻断剂-Cy5)、dNTP-可切割接头-阻断剂-锚定物(dCTP-5-SS-阻断剂-四嗪、dATP-7-SS-阻断剂-生物素)、3'-O-叠氮基甲基-dNTP(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)和锚定物结合分子-染料(链霉亲和素-Cy5、TCO-HCyC-646)执行单色DNA SBS。步骤1，将ThermoSequenase和四种dNTP-阻断剂虚拟终止子类似物(dGTP-7-SS-阻断剂-HCyC-646、dTTP-5-SS-阻断剂-Cy5、dCTP-5-SS-阻断剂-四嗪、dATP-7-SS-阻断剂-生物素)添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够掺入这些虚拟终止子。步骤2，将Therminator IX DNA聚合酶和四种可逆终止子(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够将互补核苷酸类似物掺入到任何未用虚拟终止子延伸的引物链中。步骤3，在pH 5下洗去未掺入的核苷酸类似物后，荧光成像将揭示那些用dTTP-5-SS-阻断剂-Cy5或dGTP-SS-阻断剂-HCyC-646延伸的引物。步骤4，添加链霉亲和素-Cy5和TCO-HCyC-646以标记任何掺入的dATP-7-SS-阻断剂-生物素或dCTP-5-SS-阻断剂-四嗪类似物。步骤5，在pH 5下洗去未使用的标记试剂后，第二个成像步骤将揭示dA或dC的掺入。步骤6，在此次在pH 9下的另外的洗涤步骤之后，执行第三次成像。由于HCyC-646发荧光的能力是pH响应性的，在低于pH 6时才发荧光，因此在此步骤中不会显示出荧光。因此，在步骤3中展现的荧光损失将指示dG类似物的延伸，而剩余的荧光将指示dT类似物被掺入。类似地，在步骤5中首次可视化的荧光损失将指示dC类似物延伸，并且剩余的荧光将指示dA类似物掺入。此时，可以用四种3'-O-叠氮基甲基dNTP执行任选的追加延伸步骤以确保几乎每个引物都已经用虚拟终止子或NRT类似物中的一种进行了延伸。步骤7，通过将THP添加到延长的DNA链来切割SS接头，使得虚拟终止子类似物上的所有染料被去除，并且还恢复了用3'-O-叠氮基甲基-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。在洗去所切割的染料之后，执行任选的最后一轮成像。DNA产物准备好用于DNA测序反应的下一个循环。图19中呈现了此方案中使用的核苷酸的结构。在每一步骤处的成像动画中，黑色指示阳性荧光信号，并且白色指示背景信号。最后的概要动画中的编码指示模板序列，而不是所掺入的核苷酸。
图21：通用的一组用于具有两种光谱等效染料(即Cy5和HCyC-646，其中后一种染料是pH响应性的)的单色SBS的染料和锚定物标记的3'-阻断的可逆终止子类似物和标记试剂：3'-阻断的可逆终止子类似物中的一种具有生物素锚定物，一种具有四嗪锚定物，一种具有Cy5染料并且一种具有HCyC-646。标记分子由能够特异性地结合到锚定物之一的分子(对于生物素，所述分子为链霉亲和素；或者对于四嗪，所述分子为TCO)和相同的两种染料组成。追加延伸分子是单独的一组四种未标记的可逆终止子(例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)。
图22：3'-阻断的核苷酸可逆终止子中的一种具有通过SS接头与碱基连接的Cy5，一种具有通过SS接头与碱基连接的HCyC-646，一种具有通过SS接头与碱基连接的生物素，并且一种具有通过SS接头与碱基连接的四嗪。矩形表示含有所连接的引物-环-模板分子(或其它模板-结合引物布置)的许多拷贝的基材上的区域，其中模板链中的下一个碱基从左到右是C、G、T或A。用Therminator IX和以下四种3'-阻断的经标记的核苷酸可逆终止子类似物进执行延伸：与生物素连接的dA、与Cy5连接的dT、与四嗪连接的dC以及与HCyC-646连接的dG。然后使用Therminator IX聚合酶，用四种未标记的核苷酸可逆终止子(NRT，例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)执行追加延伸，以延伸剩余的引物。最后，在pH 5下进行洗涤以确保HCyC-646将发射信号(与Cy5的发射波长相同或相似)。成像将揭示左侧和右侧矩形区域中的阳性信号(表示用G或T延伸引物链)和剩余区域中的背景信号。在用将分别与生物素和四嗪结合的链霉亲和素-Cy5和TCO-HCyC-646同时进行标记后，之后在pH 5下再次洗涤，成像将揭示在两个中心矩形区域中的新的阳性信号，从而指示A或C的掺入。接下来，在pH8.5-9下洗涤将消除来自HCyC-646染料的荧光信号，所述染料现在存在于C和G可逆终止子类似物上。用四种3'-O-叠氮基甲基dNTP进行任选的追加延伸以确保基本上所有引物均已经延伸。最后，用THP处理以切割SS接头，从而去除所掺入的核苷酸可逆终止子上的染料，并去除用经标记的或未标记的NRT延伸的引物上的阻断基以为下一个测序循环做准备。左侧的1、2和3数字代码表示三个所指示的成像步骤中的每一个成像步骤处的累积信号，即由1指示的阳性信号和由0指示的背景信号。四种可能的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物的掺入将通过独特的数字代码揭示(考虑到所有这三个成像步骤，则011表示A，010表示C，110表示G并且111表示T；仅考虑这些成像步骤中的第一个和第三个步骤，则01表示A，00表示C，10表示G并且11表示T)。
图23：用于图24-25的示例经标记的可逆终止子类似物和标记分子。
图24-25：使用一组可逆地3'-阻断的核苷酸终止子类似物进行单色边合成边测序，所述一组可逆地3'-阻断的核苷酸终止子类似物中的一种具有Cy5，一种具有HCyC-646，一种具有生物素并且一种具有四嗪，均具有SS接头。使用3'-O-SS-dNTP-可切割接头-染料(3'-O-SS-dGTP-7-SS-HCyC-646、3'-O-SS-dTTP-5-SS-Cy5)、3'-O-SS-dNTP-可切割接头-锚定物(3'-O-SS-dCTP-5-SS-四嗪、3'-O-SS-dATP-7-SS-生物素)、3'-O-叠氮基甲基-dNTP(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)和锚定物结合分子-染料(链霉亲和素-Cy5、TCO-HCyC-646)执行单色DNA SBS。步骤1，将Therminator IX和四种3'-O-SS-dNTP可逆终止子类似物(3'-O-SS-dGTP-7-SS-HCyC-646、3'-O-SS-dTTP-5-SS-Cy5、3'-O-SS-dCTP-5-SS-四嗪、3'-O-SS-dATP-7-SS-生物素)添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够掺入这些核苷酸可逆终止子。步骤2，将Therminator IX DNA聚合酶和四种未标记的可逆终止子(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够将互补核苷酸类似物掺入到任何未用经标记的可逆终止子延伸的引物链中。步骤3，在pH 5下洗去未掺入的核苷酸类似物后，荧光成像将揭示那些用3'-O-SS-dTTP-5-SS-Cy5或3'-O-SS-dGTP-7-SS-HCyC-646延伸的引物。步骤4，添加链霉亲和素-Cy5和TCO-HCyC-646以标记任何掺入的3'-O-SS-dATP-7-SS-生物素或3'-O-SS-dCTP-5-SS-四嗪类似物。步骤5，在pH 5下洗去未使用的标记试剂后，第二个成像步骤将揭示dA或dC的掺入。步骤6，在此次在pH 9下的另外的洗涤步骤之后，执行第三次成像。由于HCyC-646发荧光的能力是pH响应性的，在低于pH 6时才发荧光，因此在此步骤中不会显示出荧光。因此，在步骤3中展现的荧光损失将指示dG类似物的延伸，而剩余的荧光将指示dT类似物被掺入。类似地，在步骤5中首次可视化的荧光损失将指示dC类似物延伸，并且剩余的荧光将指示dA类似物掺入。此时，可以用四种3'-O-叠氮基甲基dNTP执行任选的追加延伸步骤以确保几乎每个引物都已经用未标记的或经标记的NRT类似物中的一种进行了延伸。步骤7，通过将THP添加到延长的DNA链来切割SS接头，使得3'-O-SS-dNTP终止子类似物上的所有染料被去除，并且还恢复了3'-OH基团3'-O-SS-dNTP或3'-O-叠氮基甲基-dNTP。在洗去所切割的染料之后，执行任选的最后一轮成像。DNA产物准备好用于DNA测序反应的下一个循环。图23中呈现了此方案中使用的核苷酸的结构。在每一步骤处的成像动画中，黑色指示阳性荧光信号，并且白色指示背景信号。最后的概要动画中的编码指示模板序列，而不是所掺入的核苷酸。
图26：用于具有光漂白的单色SBS的染料和锚定物标记的可切割和不可切割ddNTP类似物和标记试剂：双脱氧核苷酸类似物中的两种具有连接的Cy5，一种通过可切割接头并且一种通过不可切割接头。其它两种双脱氧核苷酸类似物具有连接的生物素锚定物，一种通过可切割接头并且一种通过不可切割接头。标记分子可以特异性地结合到生物素锚定物之一并且具有相同的染料。需要可以光漂白的染料，如Cy5。这种杂交SBS方法的要求是单独的一组四种未标记的可逆终止子(例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)。
图27：用于使用可切割和不可切割核苷酸类似物(如在图26中所呈现的可切割和不可切割核苷酸类似物)进行单色SBS的方案的简化表示。ddNTP中的两种具有通过SS接头或不可切割接头连接的Cy5，并且其它两种具有通过SS接头或不可切割接头连接的生物素。矩形表示含有所连接的引物-环-模板分子(或其它模板-结合引物布置)的许多拷贝的基材上的区域，其中模板链中的下一个碱基从左到右是C、G、T或A。在与四种未标记的核苷酸可逆终止子(NRT，例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)和Therminator IX温育以延伸大部分引物后，用Thermo Sequenase和四种ddNTP类似物(即，通过SS接头与生物素连接的ddATP、通过SS接头与Cy5连接的ddTTP、通过不可切割接头与Cy5连接的ddGTP以及通过不可切割接头与生物素连接的ddCTP)进行延伸。成像将揭示左侧和右侧矩形区域中的阳性信号(表示用G或T延伸引物链)和剩余区域中的背景信号。用链霉亲和素-Cy5进行标记之后，成像将揭示在剩余区域中的新的阳性信号，从而指示A或C的掺入。用THP处理以切割A和T ddNTP类似物上的SS接头，并去除任何用NRT延伸的引物上的叠氮基甲基基团以为下一个测序循环做准备。最后，执行光漂白以破坏与C和G连接的剩余染料，所述染料不具有可切割接头。左侧的1、2和3数字代码表示三个所指示的成像步骤中的每一个成像步骤处的累积信号，即由1指示的阳性信号和由0指示的背景信号。四种可能的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物的掺入将通过独特的数字代码揭示(考虑到所有这三个成像步骤，则010表示A，011表示C，111表示G并且110表示T；仅考虑这些成像步骤中的第一个和最后一个步骤，则00表示A，01表示C，11表示G并且10表示T)。
图28：用于图29的示例ddNTP类似物。
图29A-29B：利用光漂白步骤，使用一组ddNTP类似物进行单色边合成边测序，所述一组ddNTP类似物中的一种具有SS接头和Cy5，一种具有SS接头和生物素，一种具有不可切割接头和Cy5并且一种具有不可切割接头和生物素。使用ddNTP-可切割接头-染料(ddTTP-5-SS-Cy5)、ddNTP-可切割接头-锚定物(ddATP-7-SS-生物素)、ddNTP-不可切割接头-染料(ddGTP-7-Cy5)、ddNTP-不可切割接头-染料(ddCTP-5-生物素)、3'-O-叠氮基甲基-dNTP(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)和锚定物结合分子-染料(链霉亲和素-Cy5)执行单色DNA SBS。步骤1，将Therminator IX DNA聚合酶和四种可逆终止子(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够将互补核苷酸类似物掺入到大多数增长的DNA链中(>90％)以终止DNA合成。步骤2，将Thermo Sequenase和四种ddNTP类似物(ddATP-7-SS-生物素、ddTTP-5-SS-Cy5、ddCTP-5-生物素、ddGTP-7-Cy5)添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够在大多数剩余的引物上掺入ddNTP。步骤3，在洗去未掺入的核苷酸类似物后，针对Cy5荧光的成像将揭示那些用ddTTP-5-SS-Cy5或ddGTP-7-Cy5延伸的引物。步骤4，添加链霉亲和素-Cy5以标记任何掺入的ddATP-7-SS-生物素或ddCTP-5-生物素类似物。步骤5，在洗去未使用的标记试剂后，第二个成像步骤将揭示ddA或ddC的掺入。此时，可以用四种3'-O-叠氮基甲基dNTP执行任选的追加延伸步骤以确保几乎每个引物都已经用ddNTP或NRT类似物中的一种进行了延伸。步骤6，通过将THP添加到延长的DNA链来切割SS接头，使得ddATP和ddTTP类似物上的染料被去除，并且还恢复了用3'-O-叠氮基甲基-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。步骤7，在洗涤以去除THP后，执行成像步骤。在先前确定的ddGTP或ddTTP类似物掺入的情况下，Cy5信号的损失指示ddT，并且剩余的信号指示ddG掺入。类似地，在先前确定的ddATP或ddCTP类似物掺入的情况下，Cy5信号的损失指示ddA，并且剩余的信号指示ddC掺入。步骤8，执行光漂白步骤以消除由于掺入ddCTP或ddGTP类似物而产生的任何荧光。DNA产物准备好用于DNA测序反应的下一个循环。图28中呈现了此方案中使用的核苷酸的结构。在每一步骤处的成像动画中，黑色指示阳性Cy5信号，并且白色指示背景信号。最后的概要动画中的编码指示模板序列，而不是所掺入的核苷酸。
图30：用于图31的示例ddNTP类似物。
图31：使用一组ddNTP类似物进行双色边合成边测序，其中所述一组ddNTP类似物中的两种具有Alexa488并且两种具有Cy5，仅具有SS接头。使用ddNTP-可切割接头-染料(ddTTP-5-SS-Cy5、ddATP-7-SS-Alexa488、ddGTP-7-SS-Cy5、ddCTP-5-SS-Alexa488)和3'-O-叠氮基甲基-dNTP(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)执行双色DNA SBS。步骤1，将Therminator IX DNA聚合酶、四种ddNTP类似物中的两种(ddTTP-5-SS-Cy5、ddATP-7-SS-Alexa488)和过量的四种3'-阻断的dNTP(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够将互补核苷酸可逆终止子掺入到大多数增长的DNA链中(>90％)并且将ddA或ddT类似物掺入到一些剩余的引物(与模板T或A部分相反)以终止DNA合成。步骤2，在洗去未掺入的核苷酸类似物后，针对Cy5和Alexa488荧光的成像将揭示那些具体地用ddTTP-5-SS-Cy5和ddATP-7-Alexa488延伸的引物。步骤3，将Therminator IX DNA聚合酶，四种ddNTP类似物中的其它两种(ddGTP-7-SS-Cy5、ddCTP-5-SS-Alexa488)和用于确保掺入保真度的四种3'-阻断的dNTP中的其它两种(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够将ddC或ddG类似物掺入到一些剩余的引物(与模板G或C部分相反)以终止DNA合成。步骤4，在洗去未使用的标记试剂后，第二个成像步骤将揭示ddC或ddG的掺入。此时，可以用四种3'-O-叠氮基甲基dNTP执行任选的追加延伸步骤以确保几乎每个引物都已经用ddNTP或NRT类似物中的一种进行了延伸。步骤5，通过将THP添加到延长的DNA链来切割SS接头，使得ddNTP类似物上的所有染料被去除，并且还恢复了用3'-O-叠氮基甲基-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。DNA产物准备好用于DNA测序反应的下一个循环。图30中呈现了此方案中使用的核苷酸的结构。由Cy5引起的荧光被示出为黑色方块，并且由Alexa488引起的荧光被示出为黑色圆圈。
图32：通用的一组用于使用点击释放化学的单色SBS的染料和锚定物标记的可切割ddNTP类似物和标记试剂：双脱氧核苷酸类似物中的两种具有连接的Cy5，一种通过SS接头并且一种通过氨甲酰基TCO接头。其它两种双脱氧核苷酸类似物具有连接的生物素锚定物，一种通过SS接头并且一种通过氨甲酰基TCO接头。标记分子可以特异性地结合到生物素锚定物之一并且具有相同的染料。将四嗪点击到TCO引起触发染料或锚定物切割的消除反应。这种杂交SBS方法的要求是单独的一组四种未标记的可逆终止子(例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)。
图33：用于使用可切割核苷酸类似物(如在图32中所呈现的可切割核苷酸类似物)进行单色SBS的方案的简化表示。ddNTP中的两种具有通过SS接头或氨甲酰基TCO接头连接的Cy5，并且其它两种具有通过SS接头或氨甲酰基TCO接头连接的生物素。矩形表示含有所连接的引物-环-模板分子(或其它模板-结合引物布置)的许多拷贝的基材上的区域，其中模板链中的下一个碱基从左到右是T、G、C或A。在与四种未标记的核苷酸可逆终止子(NRT，例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)和Therminator IX温育以延伸大部分引物后，用ThermoSequenase和四种ddNTP类似物(即，通过SS接头与Cy5连接的ddATP、通过氨甲酰基TCO接头与Cy5连接的ddTTP、通过SS接头与生物素连接的ddGTP以及通过氨甲酰基TCO接头与生物素连接的ddCTP)进行延伸。成像将揭示左侧和右侧矩形区域中的阳性信号(表示用A或T延伸引物链)和剩余区域中的背景信号。在用链霉亲和素-Cy5标记后，成像将揭示在剩余区域中的新的阳性信号，从而指示C或G的掺入。用四嗪处理以切割ddC和ddT类似物上的TCO接头。最后，用THP处理以切割掉剩余的染料并去除任何用NRT延伸的引物上的叠氮基甲基基团以为下一个测序循环做准备。左侧的1、2和3数字代码表示三个所指示的成像步骤中的每一个成像步骤处的累积信号，即由1指示的阳性信号和由0指示的背景信号。四种可能的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物的掺入将通过独特的数字代码揭示(考虑到所有这三个成像步骤，则111表示A，010表示C，011表示G并且110表示T；仅考虑这些成像步骤中的第一个和最后一个步骤，则11表示A，00表示C，01表示G并且10表示T)。
图34：用于图35的示例ddNTP类似物。
图35A-35B：使用一组ddNTP类似物进行单色边合成边测序，所述一组ddNTP类似物中的一种具有SS接头和Cy5，一种具有SS接头和生物素，一种具有TCO-氨基甲酸酯接头和Cy5，并且一种具有TCO-氨基甲酸酯接头和生物素。使用ddNTP-可切割接头-染料(ddATP-7-SS-Cy5、ddTTP-5-TCO-Cy5)、ddNTP-可切割接头-锚定物(ddGTP-7-SS-生物素、ddCTP-5-TCO-生物素)、3'-O-叠氮基甲基dNTP(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)和锚定物结合分子-染料(链霉亲和素-Cy5)执行单色DNA SBS。这与最近提交的专利申请(Ju等人PCT/US2019/022326)中提出的双接头方案基本上相同，但这里使用的不是可由连二亚硫酸钠切割的偶氮基接头，而是与四嗪发生点击释放反应的TCO氨基甲酸酯接头。步骤1，将Therminator IX DNA聚合酶和四种可逆终止子(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够将互补核苷酸类似物掺入到大多数增长的DNA链中(>90％)以终止DNA合成。步骤2，将Thermo Sequenase和四种ddNTP类似物(ddATP-7-SS-Cy5、ddTTP-5-TCO-Cy5、ddGTP-7-SS-生物素、ddCTP-5-TCO-生物素)添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够在大多数剩余的模板-环-引物上掺入ddNTP。步骤3，在洗去未掺入的核苷酸类似物后，针对Cy5荧光的成像将揭示那些用ddATP-7-SS-Cy5或ddTTP-5-TCO-Cy5延伸的引物。步骤4，添加链霉亲和素-Cy5以标记任何掺入的ddGTP-7-SS-生物素或ddCTP-5-TCO-生物素类似物。步骤5，在洗去未使用的标记试剂后，第二个成像步骤将揭示ddC或ddG的掺入。此时或恰好在此之前，可以用四种3'-O-叠氮基甲基dNTP执行任选的追加延伸步骤以确保几乎每个引物都已经用ddNTP或NRT类似物中的一种进行了延伸。步骤6，通过将四嗪添加到延长的DNA链来切割SS接头，使得ddCTP和ddTTP类似物上的染料被去除，并且还恢复了用3'-O-叠氮基甲基-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。步骤7，在洗去多余的四嗪后，进行成像。在先前确定的ddATP或ddTTP类似物掺入的情况下，Cy5信号的损失指示ddT，并且剩余的信号指示ddA掺入。类似地，在先前确定的ddCTP或ddGTP类似物掺入的情况下，Cy5信号的损失指示ddC，并且剩余的信号指示ddG掺入。步骤8，通过将THP添加到延长的DNA链来切割SS接头，使得ddATP和ddGTP类似物上的染料被去除，并且还恢复了用3'-O-叠氮基甲基-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。DNA产物准备好用于DNA测序反应的下一个循环。图34中呈现了此方案中使用的核苷酸的结构。在每一步骤处的成像动画中，黑色指示阳性Cy5信号，并且白色指示背景信号。最后的概要动画中的编码指示模板序列，而不是所掺入的核苷酸。
图36：通用的一组用于使用猝灭的单色SBS的染料和锚定物标记的可切割ddNTP类似物、标记和猝灭试剂：双脱氧核苷酸类似物中的一种具有与碱基连接的Cy5，一种连接有生物素，一种连接有呈支链构型的生物素和TCO两者，并且最后一种连接有也呈支链构型的Cy5和TCO，所有四种双脱氧核苷酸类似物均通过SS接头来实现所述连接。标记分子可以特异性地结合到生物素锚定物之一并且具有相同的染料。猝灭分子(例如，BHQ3)通过TCO锚定物结合。这种杂交SBS方法的要求是单独的一组四种未标记的可逆终止子(例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)。
图37：用于使用可切割核苷酸类似物(如在图36中所呈现的可切割核苷酸类似物)进行单色SBS的方案的简化表示。每种类型的ddNTP均具有通过SS接头连接的以下中的一种：Cy5、生物素、生物素-TCO或Cy5-TCO。矩形表示含有所连接的引物-环-模板分子(或其它模板-结合引物布置)的许多拷贝的基材上的区域，其中模板链中的下一个碱基从左到右是T、G、C或A。在与四种未标记的核苷酸可逆终止子(NRT，例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)和Therminator IX温育以延伸大部分引物后，用Thermo Sequenase和四种ddNTP类似物(即，与Cy5连接的ddATP、与Cy5-TCO连接的ddTTP、与生物素连接的ddGTP以及与生物素-TCO连接的ddCTP)进行延伸。成像将揭示左侧和右侧矩形区域中的阳性信号(表示用A或T延伸引物链)和剩余区域中的背景信号。在用链霉亲和素-Cy5进行标记后，成像将揭示在剩余区域中的新的阳性信号，从而指示C或G的掺入。用四嗪-BHQ3处理以猝灭C和T ddNTP类似物上的Cy5荧光。最后，用THP处理以切割掉剩余的染料并去除任何用NRT延伸的引物上的叠氮基甲基基团以为下一个测序循环做准备。左侧的1、2和3数字代码表示三个所指示的成像步骤中的每一个成像步骤处的累积信号，即由1指示的阳性信号和由0指示的背景信号。四种可能的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物的掺入将通过独特的数字代码揭示(考虑到所有这三个成像步骤，则111表示A，010表示C，011表示G并且110表示T；仅考虑这些成像步骤中的第一个和最后一个步骤，则11表示A，00表示C，01表示G并且10表示T)。
图38：用于图39的示例ddNTP类似物和猝灭剂-锚定物结合分子。
图39A-39B：利用染料猝灭剂，使用一组ddNTP类似物进行单色边合成边测序，所述一组ddNTP类似物中的一种具有Cy5，一种具有生物素，一种具有Cy5和生物素并且一种具有生物素和TCO锚定物，均具有SS接头。使用ddNTP-可切割接头-染料(ddATP-7-SS-Cy5)、ddNTP-可切割接头-锚定物1(ddGTP-7-SS-生物素)、ddNTP-可切割接头-支链锚定物1和2(ddCTP-5-SS-生物素/TCO)、ddNTP-可切割接头-染料-锚定物(ddTTP-5-SS-Cy5-TCO)、3'-O-叠氮基甲基-dNTP(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)、锚定物结合分子-染料(链霉亲和素-Cy5)和锚定物结合分子-猝灭剂(四嗪-BHQ)执行单色DNA SBS。步骤1，将Therminator IX DNA聚合酶和四种可逆终止子(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够将互补核苷酸类似物掺入到大多数增长的DNA链中(>90％)以终止DNA合成。步骤2，将Thermo Sequenase和四种ddNTP类似物(ddATP-7-SS-Cy5、ddGTP-7-SS-生物素、ddCTP-5-SS-生物素/TCO、ddTTP-5-SS-Cy5-TCO)添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够在大多数剩余的引物上掺入ddNTP。步骤3，在洗去未掺入的核苷酸类似物后，针对Cy5荧光的成像将揭示那些用ddATP-7-SS-Cy5或ddTTP-5-SS-Cy5-TCO延伸的引物。步骤4，添加链霉亲和素-Cy5以标记任何掺入的ddGTP-7-SS-生物素或ddCTP-5-SS-生物素/TCO类似物。步骤5，在洗去未使用的标记试剂后，执行第二个成像步骤，并且新的荧光信号将证实ddC或ddG的掺入。此时或恰好在此之前，可以用四种3'-O-叠氮基甲基dNTP执行任选的追加延伸步骤以确保几乎每个引物都已经用ddNTP或NRT类似物中的一种进行了延伸。步骤6，与四嗪-BHQ一起温育以猝灭ddC或ddT类似物上的染料的荧光。步骤7，在洗涤以去除任何游离四嗪-BHQ之后，进行第三个成像步骤。在先前确定的ddATP或ddTTP类似物掺入的情况下，Cy5信号的显著损失指示ddT，并且剩余的信号指示ddA掺入。类似地，在先前确定的ddCTP或ddGTP类似物掺入的情况下，Cy5信号的显著损失指示ddC，并且剩余的信号指示ddG掺入。步骤8，通过将THP添加到延长的DNA链来切割SS接头，使得核苷酸类似物上的染料和猝灭剂被去除，并且还恢复了用3'-O-叠氮基甲基-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。DNA产物准备好用于DNA测序反应的下一个循环。图38中呈现了此方案中使用的核苷酸的结构。在每一步骤处的成像动画中，黑色指示阳性Cy5信号，并且白色或浅灰色指示背景信号。最后的概要动画中的编码指示模板序列，而不是所掺入的核苷酸。
图40：通用的一组用于使用猝灭的单色SBS的染料和锚定物标记的可切割虚拟终止子核苷酸类似物、标记和猝灭试剂：虚拟终止子类似物中的一种具有与碱基连接的Cy5，一种连接有生物素，一种连接有呈支链构型的生物素和TCO两者，并且最后一种连接有也呈支链构型的Cy5和TCO，所有四种虚拟终止子类似物均通过SS接头来实现所述连接。标记分子可以特异性地结合到生物素锚定物之一并且具有相同的染料。猝灭分子通过TCO锚定物结合。追加延伸反应用四种未标记的可逆终止子(例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)执行。
图41：用于使用可切割核苷酸类似物(如在图40中所呈现的可切割核苷酸类似物)进行单色SBS的方案的简化表示。每种类型的虚拟终止子均具有通过SS接头连接的以下中的一种：Cy5、生物素、生物素-TCO或Cy5-TCO。矩形表示含有所连接的引物-环-模板分子(或其它模板-结合引物布置)的许多拷贝的基材上的区域，其中模板链中的下一个碱基从左到右是T、G、C或A。用Thermo Sequenase和四种虚拟终止子类似物(即，与Cy5连接的dATP、与Cy5-TCO连接的dTTP、与生物素连接的dGTP以及与生物素-TCO连接的dCTP)进行延伸。用四种未标记的核苷酸可逆终止子(NRT，例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)和Therminator IX执行追加延伸以延伸所有剩余的引物。成像将揭示左侧和右侧矩形区域中的阳性信号(表示用A或T延伸引物链)和剩余区域中的背景信号。在用链霉亲和素-Cy5进行标记后，成像将揭示在剩余区域中的新的阳性信号，从而指示C或G的掺入。用四嗪-BHQ处理以猝灭C和T虚拟终止子类似物上的Cy5荧光。最后，用THP处理以切割掉剩余的染料并去除任何用NRT延伸的引物上的叠氮基甲基基团以为下一个测序循环做准备。左侧的1、2和3数字代码表示三个所指示的成像步骤中的每一个成像步骤处的累积信号，即由1指示的阳性信号和由0指示的背景信号。四种可能的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物的掺入将通过独特的数字代码揭示(考虑到所有这三个成像步骤，则111表示A，010表示C，011表示G并且110表示T；仅考虑这些成像步骤中的第一个和最后一个步骤，则11表示A，00表示C，01表示G并且10表示T)。
图42：用于图43的示例dNTP类似物(虚拟终止子)和猝灭剂-锚定物结合分子。
图43A-43B：利用染料猝灭剂，使用一组虚拟终止子核苷酸类似物进行单色边合成边测序，所述一组虚拟终止子核苷酸类似物中的一种具有Cy5，一种具有生物素，一种具有Cy5和生物素并且一种具有生物素和TCO锚定物，均具有SS接头。使用dNTP-可切割接头-阻断剂-染料(dATP-7-SS-阻断剂-Cy5)、dNTP-可切割接头-阻断剂锚定物(ddGTP-7-SS-阻断剂-生物素)、dNTP-可切割接头-阻断剂-支链锚定物1和2(dCTP-5-SS-阻断剂-生物素/TCO)、ddNTP-可切割接头-阻断剂-染料-锚定物(ddTTP-5-SS-阻断剂-Cy5-TCO)、3'-O-叠氮基甲基-dNTP(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)、锚定物结合分子-染料(链霉亲和素-Cy5)和锚定物结合分子-猝灭剂(四嗪-BHQ)执行单色DNA SBS。步骤1，将Thermo Sequenase和四种dNTP-阻断剂虚拟终止子类似物(dATP-7-SS-阻断剂-Cy5、ddGTP-7-SS-阻断剂-生物素、dCTP-5-SS-阻断剂-生物素/TCO、ddTTP-5-SS-阻断剂-Cy5-TCO)添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够掺入这些虚拟终止子。步骤2，用Therminator IX DNA聚合酶和四种未标记的可逆终止子(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)追加延伸固定的结合有引物的DNA模板使得能够将互补核苷酸类似物掺入到任何未用虚拟终止子终止的引物链中。步骤3，在洗去未掺入的核苷酸类似物后，针对Cy5荧光的成像将揭示那些用ddATP-7-SS-阻断剂-Cy5或ddTTP-5-SS-阻断剂-Cy5-TCO延伸的引物。步骤4，添加链霉亲和素-Cy5以标记任何掺入的ddGTP-7-SS-阻断剂-生物素或ddCTP-5-SS-阻断剂-生物素/TCO类似物。步骤5，在洗去未使用的标记试剂后，执行第二个成像步骤，并且新的荧光信号将证实C或G虚拟终止子的掺入。如果在早前、此时或恰好在此之前未执行追加延伸步骤，则可以用四种3'-O-叠氮基甲基dNTP执行任选的追加延伸步骤以确保几乎每个引物都已经用虚拟终止子或NRT类似物中的一种进行了延伸。步骤6，与四嗪-BHQ一起温育以猝灭C或T虚拟终止子上的染料的荧光。步骤7，在洗涤以去除任何游离四嗪-BHQ之后，进行第三个成像步骤。在先前确定的dATP或dTTP虚拟终止子类似物掺入的情况下，Cy5信号的显著损失指示dT，并且剩余的信号指示dA掺入。类似地，在先前确定的dCTP或dGTP虚拟终止子类似物掺入的情况下，Cy5信号的显著损失指示dC，并且剩余的信号指示dG掺入。步骤8，通过将THP添加到延长的DNA链来切割SS接头，使得核苷酸类似物上的染料和猝灭剂被去除，并且还恢复了用3'-O-叠氮基甲基-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。DNA产物准备好用于DNA测序反应的下一个循环。图42中呈现了此方案中使用的核苷酸的结构。在每一步骤处的成像动画中，黑色指示阳性Cy5信号，并且白色或浅灰色指示背景信号。最后的概要动画中的编码指示模板序列，而不是所掺入的核苷酸。
图44：通用的一组用于使用猝灭的单色SBS的染料和锚定物标记的可切割3'-阻断的核苷酸可逆终止子类似物、标记和猝灭试剂：可逆终止子类似物中的一种具有与碱基连接的Cy5，一种连接有生物素，一种连接有呈支链构型的生物素和TCO两者，并且最后一种连接有也呈支链构型的Cy5和TCO，所有四种可逆终止子类似物均通过SS接头来实现所述连接。标记分子可以特异性地结合到生物素锚定物之一并且具有相同的染料。猝灭分子通过TCO锚定物结合。追加延伸反应用四种未标记的可逆终止子(例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)执行。
图45：用于使用可切割核苷酸类似物(如在图44中所呈现的可切割核苷酸类似物)进行单色SBS的方案的简化表示。每种类型的核苷酸可逆终止子(A、C、G和T)均具有通过SS接头连接的以下中的一种：Cy5、生物素、生物素和TCO或Cy5-TCO。矩形表示含有所连接的引物-环-模板分子(或其它模板-结合引物布置)的许多拷贝的基材上的区域，其中模板链中的下一个碱基从左到右是T、G、C或A。用Therminator IX和四种核苷酸可逆终止子类似物(即，与Cy5连接的3'-O-叔丁基-SS-ATP、与Cy5-TCO连接的3'-O-叔丁基-SS-dTTP、与生物素连接的3'-O-叔丁基-SS-dGTP以及与生物素和TCO两者连接的3'-O-叔丁基-SS-dCTP，均通过SS接头实现所述连接)进行延伸。用四种未标记的核苷酸可逆终止子(NRT，例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)和Therminator IX执行追加延伸以延伸所有剩余的引物。成像将揭示左侧和右侧矩形区域中的阳性信号(表示用A或T延伸引物链)和剩余区域中的背景信号。在用链霉亲和素-Cy5进行标记后，成像将揭示在剩余区域中的新的阳性信号，从而指示C或G的掺入。用四嗪-BHQ处理以猝灭C和T可逆终止子类似物上的Cy5荧光。最后，用THP处理以切割掉剩余的染料并去除任何用NRT延伸的引物上的叠氮基甲基基团以为下一个测序循环做准备。左侧的1、2和3数字代码表示三个所指示的成像步骤中的每一个成像步骤处的累积信号，即由1指示的阳性信号和由0指示的背景信号。四种可能的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物的掺入将通过独特的数字代码揭示(考虑到所有这三个成像步骤，则111表示A，010表示C，011表示G并且110表示T；仅考虑这些成像步骤中的第一个和最后一个步骤，则11表示A，00表示C，01表示G并且10表示T)。
图46：用于图47的示例3'-SS-dNTP类似物(可逆终止子)和猝灭剂-锚定物结合分子。
图47A-47B：利用染料猝灭剂，使用一组核苷酸可逆终止子类似物进行单色边合成边测序，所述一组核苷酸可逆终止子类似物中的一种具有Cy5，一种具有生物素，一种具有Cy5和生物素并且一种具有生物素和TCO锚定物，均具有SS接头。使用3'-SS-dNTP-可切割接头-染料(3'-O-SS-dATP-7-SS-Cy5)、3'-O-SS-dNTP-可切割接头-锚定物(3'-O-SS-ddGTP-7-SS-生物素)、3'-O-SS-dNTP-可切割接头-阻断剂-支链锚定物1和2(3'-O-SS-dCTP-5-SS-生物素/TCO)、3'-O-SS-ddNTP-可切割接头-染料-锚定物(3'-O-SS-dTTP-5-SS-Cy5-TCO)、3'-O-叠氮基甲基-dNTP(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)、锚定物结合分子-染料(链霉亲和素-Cy5)和锚定物结合分子-猝灭剂(四嗪-BHQ)执行单色DNA SBS。步骤1，将Therminator IX和四种3'-阻断的可逆终止子类似物(3'-O-SS-dATP-7-SS-Cy5、3'-O-SS-dGTP-7-SS-生物素、3'-O-SS-dCTP-5-SS-生物素/TCO、3'-O-SS-dTTP-5-SS-Cy5-TCO)添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够掺入这些虚拟终止子。步骤2，用Therminator IX DNA聚合酶和四种未标记的可逆终止子(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)追加延伸固定的结合有引物的DNA模板使得能够将互补核苷酸类似物掺入到任何未用经标记的可逆终止子终止的引物链中。步骤3，在洗去未掺入的核苷酸类似物后，针对Cy5荧光的成像将揭示那些用3'-O-SS-dATP-7-SS-Cy5或3'-O-SS-dTTP-5-SS-Cy5-TCO延伸的引物。步骤4，添加链霉亲和素-Cy5以标记任何掺入的3'-O-SS-ddGTP-7-SS-生物素或3'-O-SS-dCTP-5-SS-生物素/TCO类似物。步骤5，在洗去未使用的标记试剂后，执行第二个成像步骤，并且新的荧光信号将证实C或G可逆终止子的掺入。如果在早前、此时或恰好在此之前未执行追加延伸步骤，则可以用四种3'-O-叠氮基甲基dNTP执行任选的追加延伸步骤以确保几乎每个引物都已经用未标记或经标记的NRT类似物中的一种进行了延伸。步骤6，与四嗪-BHQ一起温育以猝灭3'-阻断的可逆终止子C或T上的染料的荧光。步骤7，在洗涤以去除任何游离四嗪-BHQ之后，进行第三个成像步骤。在先前确定的ATP或TTP可逆终止子类似物掺入的情况下，Cy5信号的显著损失指示T，并且剩余的信号指示A掺入。类似地，在先前确定的CTP或GTP可逆终止子类似物掺入的情况下，Cy5信号的显著损失指示C，并且剩余的信号指示G掺入。步骤8，通过将THP添加到延长的DNA链来切割SS接头，使得可逆终止子类似物上的染料被去除，并且还恢复了用3'-O-SS-dNTP或3'-O-叠氮基甲基-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。DNA产物准备好用于DNA测序反应的下一个循环。图46中呈现了此方案中使用的核苷酸的结构。在每一步骤处的成像动画中，黑色指示阳性Cy5信号，并且白色或浅灰色指示背景信号。最后的概要动画中的编码指示模板序列，而不是所掺入的核苷酸。
图48：通用的一组用于使用pH响应性染料和猝灭的单色SBS的染料标记的可切割ddNTP类似物、标记和猝灭试剂：双脱氧核苷酸类似物中的一种具有与碱基连接的Cy5，一种连接有HCyC-646，一种连接有呈支链构型的Cy5和TCO，并且最后一种连接有也呈支链构型的HCyC-646和TCO，所有双脱氧核苷酸类似物均通过SS接头实现所述连接。HCyC-646显示出pH响应性荧光。猝灭分子通过TCO锚定物结合。这种杂交SBS方法的要求是单独的一组四种未标记的可逆终止子(例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)。
图49：用于使用可切割核苷酸类似物(如在图48中所呈现的可切割核苷酸类似物)进行单色SBS的方案的简化表示。每种类型的ddNTP均具有通过SS接头连接的以下中的一种：Cy5、HCyC-646、Cy5-TCO或HCyC-646-TCO。矩形表示含有所连接的引物-环-模板分子(或其它模板-结合引物布置)的许多拷贝的基材上的区域，其中模板链中的下一个碱基从左到右是T、G、C或A。在与四种未标记的核苷酸可逆终止子(NRT，例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)和Therminator IX温育以延伸大部分引物后，用Thermo Sequenase和四种ddNTP类似物(即，与Cy5连接的ddATP、与HCyC-646连接的ddTTP、与Cy5-TCO连接的ddGTP以及与HCyC-646-TCO连接的ddCTP)进行延伸。在pH 9下洗涤之后，成像将揭示在第一和第三矩形区域中的阳性信号(表示用A或G延伸引物链)和剩余区域中的背景信号。在pH 5下洗涤之后，由于HCyC-646的质子化，成像将揭示在剩余区域中的新的阳性信号，从而指示C或T的掺入。用四嗪-BHQ处理以猝灭C和G ddNTP类似物上的HCyC-646和Cy5的荧光。最后，用THP处理以切割掉剩余的染料并去除任何用NRT延伸的引物上的叠氮基甲基基团以为下一个测序循环做准备。左侧的1、2和3数字代码表示三个所指示的成像步骤中的每一个成像步骤处的累积信号，即由1指示的阳性信号和由0指示的背景信号。四种可能的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物的掺入将通过独特的数字代码揭示(考虑到所有这三个成像步骤，则111表示A，010表示C，110表示G并且011表示T；仅考虑这些成像步骤中的第一个和最后一个步骤，则11表示A，00表示C，10表示G并且01表示T)。
图50：用于图51的示例ddNTP类似物和猝灭剂-锚定物结合分子。
图51A-51B：使用与四嗪连接的染料猝灭剂，使用一组ddNTP类似物进行单色边合成边测序，所述一组ddNTP类似物中的一种具有Cy5，一种具有pH响应性荧光染料HCyC-646，一种具有Cy5和TCO锚定物并且一种具有HCyC-646和TCO锚定物，均通过SS接头与碱基连接。使用ddNTP-可切割接头-染料(ddATP-7-SS-Cy5、ddTTP-5-SS-HCyC-646)、ddNTP-可切割接头-染料-锚定物(ddGTP-7-SS-Cy5-TCO、ddCTP-5-SS-HCyC-646-TCO)、3'-O-叠氮基甲基-dNTP(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)和锚定物结合分子-猝灭剂(四嗪-BHQ)执行单色DNA SBS。步骤1，将Therminator IX DNA聚合酶和四种可逆终止子(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够将互补核苷酸类似物掺入到大多数增长的DNA链中(>90％)以终止DNA合成。步骤2，将Thermo Sequenase和四种ddNTP类似物(ddATP-7-SS-Cy5、ddTTP-5-SS-HCyC-646、ddGTP-7-SS-Cy5-TCO、ddCTP-5-SS-HCyC-646)添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够在大多数剩余的模板-环-引物上掺入ddNTP。步骤3，在pH 9下洗去未掺入的核苷酸类似物后，针对Cy5荧光的成像将揭示那些用ddATP-7-SS-Cy5或ddGTP-7-SS-Cy5-TCO延伸的引物。步骤4，在pH 5下进行第二次洗涤将允许ddTTP-5-SS-HCyC-646和ddCTP-5-SS-HCyC-646-TCO上的HCyC-646发出荧光。在pH5下执行第二个成像步骤，并且新的荧光信号将证实ddC或ddT的掺入。此时或恰好在此之前，可以用四种3'-O-叠氮基甲基dNTP执行任选的追加延伸步骤以确保几乎每个引物都已经用ddNTP或NRT类似物中的一种进行了延伸。步骤5，与四嗪-BHQ一起温育以猝灭ddG或ddC类似物上的染料。步骤6，在洗涤以去除任何游离四嗪-BHQ之后，在pH 5下进行第三个成像步骤。在先前确定的ddATP或ddGTP类似物掺入的情况下，Cy5信号的损失指示ddG，并且剩余的信号指示ddA掺入。类似地，在先前确定的ddCTP或ddTTP类似物掺入的情况下，荧光信号的损失指示ddC，并且剩余的信号指示ddT掺入。步骤7，通过将THP添加到延长的DNA链来切割SS接头，使得核苷酸类似物上的染料被去除，并且还恢复了用3'-O-叠氮基甲基-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。DNA产物准备好用于DNA测序反应的下一个循环。图50中呈现了此方案中使用的核苷酸的结构。在每一步骤处的成像动画中，黑色指示阳性荧光信号，并且白色或浅灰色指示背景信号。最后的概要动画中的编码指示模板序列，而不是所掺入的核苷酸。
图52：通用的一组用于使用点击切割接头和猝灭的单色SBS的染料或锚定物标记的可切割ddNTP类似物和标记试剂：双脱氧核苷酸类似物中的一种具有通过SS接头与碱基连接的Cy5，一种具有通过SS接头与碱基连接的生物素，一种具有通过含有SS(示出为可切割接头1)和TCO(示出为可切割接头2)的接头与碱基连接的Cy5，并且最后一种具有通过含有SS和TCO的接头与碱基连接的生物素。结合分子是染料标记的链霉亲和素，并且可以通过在可切割接头2处的点击切割反应或在可切割接头1处的标准切割来释放染料。这种杂交SBS方法的要求是单独的一组四种未标记的可逆终止子(例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)。
图53：用于使用可切割核苷酸类似物(如在图52中所呈现的可切割核苷酸类似物)进行单色SBS的方案的简化表示。每种类型的ddNTP具有通过SS接头或具有SS和TCO基团两者的接头连接的以下中的一种：Cy5或生物素。矩形表示含有所连接的引物-环-模板分子(或其它模板-结合引物布置)的许多拷贝的基材上的区域，其中模板链中的下一个碱基从左到右是T、G、C或A。在与四种未标记的核苷酸可逆终止子(NRT，例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)和Therminator IX温育以延伸大部分引物后，用Thermo Sequenase和四种ddNTP类似物(即，通过SS接头与Cy5连接的ddATP、通过SS接头与生物素连接的ddTTP、通过含有SS和TCO两者的接头与Cy5连接的ddGTP以及通过含有SS和TCO两者的接头与生物素连接的ddCTP)进行延伸。在洗涤之后，成像将揭示在第一和第三矩形区域中的阳性信号(表示用A或G延伸引物链)和剩余区域中的背景信号。用链霉亲和素-Cy5处理将标记ddCTP和ddTTP。在洗涤之后，成像将揭示在第二和第四矩形区域中的新的阳性信号(表示用C或T延伸引物链)。四嗪与TCO的反应将释放ddCTP和ddGTP核苷酸类似物上的Cy5。在洗涤之后，荧光损失将具体地揭示C和G的掺入，而剩余的荧光将分别揭示A和T的掺入。最后，用THP处理以切割掉剩余的染料并去除任何用NRT延伸的引物上的叠氮基甲基基团以为下一个测序循环做准备。左侧的1、2和3数字代码表示三个所指示的成像步骤中的每一个成像步骤处的累积信号，即由1指示的阳性信号和由0指示的背景信号。四种可能的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物的掺入将通过独特的数字代码揭示(考虑到所有这三个成像步骤，则111表示A，010表示C，110表示G并且011表示T；仅考虑这些成像步骤中的第一个和最后一个步骤，则11表示A，00表示C，10表示G并且01表示T)。
图54：用于图55的示例ddNTP类似物。
图55A-55B：使用链霉亲和素-Cy5标记步骤，使用一组正交的ddNTP类似物进行单色边合成边测序，所述一组正交的ddNTP类似物含有Cy5或生物素以及仅SS接头或SS加TCO接头。使用ddNTP-可切割接头-染料(ddATP-7-SS-Cy5、ddGTP-7-SS-TCO-Cy5)、ddNTP-可切割接头-染料-锚定物(ddTTP-5-SS-生物素、ddCTP-5-SS-TCO-生物素)、3'-O-叠氮基甲基-dNTP(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)和锚定物结合分子-染料(链霉亲和素-Cy5)执行单色DNA SBS。步骤1，将Therminator IX DNA聚合酶和四种可逆终止子(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够将互补核苷酸类似物掺入到大多数增长的DNA链中(>90％)以终止DNA合成。步骤2，将Thermo Sequenase和四种ddNTP类似物(ddATP-7-SS-Cy5、ddGTP-7-SS-TCO-Cy5、ddTTP-5-SS-生物素、ddCTP-5-SS-TCO-生物素)添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够在大多数剩余的模板-环-引物上掺入ddNTP。步骤3，在洗去未掺入的核苷酸类似物后，针对Cy5荧光的成像将揭示那些用ddATP-7-SS-Cy5或ddGTP-7-SS-TCO-Cy5延伸的引物。步骤4，用链霉亲和素-Cy5进行标记将通过生物素锚定物将Cy5连接到ddTTP-5-SS-生物素和ddCTP-5-SS-TCO-生物素上。步骤5，执行第二个成像步骤，并且新的荧光信号将证实ddC或ddT的掺入。此时或恰好在此之前，可以用四种3'-O-叠氮基甲基dNTP执行任选的追加延伸步骤以确保几乎每个引物都已经用ddNTP或NRT类似物中的一种进行了延伸。步骤6，与四嗪一起温育以切割ddC或ddG类似物上的染料。步骤7，在洗涤以去除任何游离四嗪之后，进行第三个成像步骤。在先前确定的ddATP或ddGTP类似物掺入的情况下，Cy5信号的损失指示ddG，并且剩余的信号指示ddA掺入。类似地，在先前确定的ddCTP或ddTTP类似物掺入的情况下，Cy5信号的损失指示ddC，并且剩余的信号指示ddT掺入。步骤8，通过将THP添加到延长的DNA链来切割SS接头，使得核苷酸类似物上的染料被去除，并且还恢复了用3'-O-叠氮基甲基-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。DNA产物准备好用于DNA测序反应的下一个循环。图54中呈现了此方案中使用的核苷酸的结构。在每一步骤处的成像动画中，黑色指示阳性Cy5信号，并且白色指示背景信号。最后的概要动画中的编码指示模板序列，而不是所掺入的核苷酸。
图56：通用的一组用于使用点击切割接头和猝灭的单色SBS的染料或锚定物标记的可切割虚拟终止子核苷酸类似物和标记试剂：虚拟终止子类似物中的一种具有通过SS接头与碱基连接的Cy5，一种具有通过SS接头与碱基连接的生物素，一种具有通过含有SS(示出为可切割接头1)和TCO(示出为可切割接头2)的接头与碱基连接的Cy5，并且最后一种具有通过含有SS和TCO的接头与碱基连接的生物素。结合分子是染料标记的链霉亲和素，并且可以通过在可切割接头2处的点击切割反应或在可切割接头1处的标准切割来释放染料。追加延伸反应用四种未标记的可逆终止子(例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)执行。
图57：用于使用可切割核苷酸类似物(如在图56中所呈现的可切割核苷酸类似物)进行单色SBS的方案的简化表示。每种类型的虚拟终止子核苷酸类似物具有通过SS接头或具有SS和TCO基团两者的接头连接的以下中的一种：Cy5或生物素。矩形表示含有所连接的引物-环-模板分子(或其它模板-结合引物布置)的许多拷贝的基材上的区域，其中模板链中的下一个碱基从左到右是T、G、C或A。用Thermo Sequenase和四种虚拟终止子类似物(即，通过SS接头与Cy5连接的dATP、通过SS接头与生物素连接的dTTP、通过含有SS和TCO两者的接头与Cy5连接的dGTP以及通过含有SS和TCO两者的接头与生物素连接的dCTP)进行延伸。用四种未标记的核苷酸可逆终止子(NRT，例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)和Therminator IX执行追加延伸以延伸所有剩余的引物。在洗涤之后，成像将揭示在第一和第三矩形区域中的阳性信号(表示用A或G延伸引物链)和剩余区域中的背景信号。用链霉亲和素-Cy5处理将标记dCTP和dTTP虚拟终止子类似物。在洗涤之后，成像将揭示在第二和第四矩形区域中的新的阳性信号(表示用C或T延伸引物链)。四嗪与TCO之间的反应将释放dCTP和dGTP虚拟终止子类似物上的Cy5。在洗涤之后，荧光损失将具体地揭示C和G的掺入，而剩余的荧光将分别揭示A和T的掺入。最后，用THP处理以切割掉剩余的染料并去除任何用NRT延伸的引物上的叠氮基甲基基团以为下一个测序循环做准备。左侧的1、2和3数字代码表示三个所指示的成像步骤中的每一个成像步骤处的累积信号，即由1指示的阳性信号和由0指示的背景信号。四种可能的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物的掺入将通过独特的数字代码揭示(考虑到所有这三个成像步骤，则111表示A，010表示C，110表示G并且011表示T；仅考虑这些成像步骤中的第一个和最后一个步骤，则11表示A，00表示C，10表示G并且01表示T)。
图58：用于图59的示例虚拟终止子核苷酸类似物。
图59A-59B：使用链霉亲和素-Cy5标记步骤，使用一组正交的虚拟终止子核苷酸类似物进行单色边合成边测序，所述一组正交的虚拟终止子核苷酸类似物含有Cy5或生物素以及仅SS接头或SS加TCO接头。使用dNTP-阻断剂-可切割接头-染料(dATP-7-SS-阻断剂-Cy5、dGTP-7-SS-阻断剂-TCO-Cy5)、dNTP-可切割接头-阻断剂-染料-锚定物(dTTP-5-SS-阻断剂-生物素、dCTP-5-SS-阻断剂-TCO-生物素)、3'-O-叠氮基甲基-dNTP(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)和锚定物结合分子-染料(链霉亲和素-Cy5)执行单色DNA SBS。步骤1，将Thermo Sequenase和四种虚拟终止子类似物(dATP-7-SS-阻断剂-Cy5、dGTP-7-SS-阻断剂-TCO-Cy5、dTTP-5-SS-阻断剂-生物素、dCTP-5-SS-阻断剂-TCO-生物素)添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够在模板-环-引物(或其它模板-结合引物布置)上掺入虚拟终止子。步骤2，用TherminatorIX DNA聚合酶和四种未标记的可逆终止子(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)追加延伸使得能够将互补核苷酸类似物掺入到剩余增长的DNA链中。步骤3，在洗去未掺入的核苷酸类似物后，针对Cy5荧光的成像将揭示那些用dATP-7-SS-阻断剂-Cy5或dGTP-7-SS-阻断剂-TCO-Cy5延伸的引物。步骤4，用链霉亲和素-Cy5进行标记将通过生物素锚定物将Cy5连接到dTTP-5-SS-阻断剂-生物素和dCTP-5-SS-阻断剂-TCO-生物素上。步骤5，执行第二个成像步骤，并且新的荧光信号将证实dC或dT虚拟终止子的掺入。此时或恰好在此之前，可以用四种3'-O-叠氮基甲基dNTP执行任选的追加延伸步骤以确保几乎每个引物都已经用虚拟终止子或NRT类似物中的一种进行了延伸。步骤6，与四嗪一起温育以切割dC或dG虚拟终止子类似物上的染料。步骤7，在洗涤以去除任何游离四嗪之后，进行第三个成像步骤。在先前确定的dATP或dGTP虚拟终止子类似物掺入的情况下，Cy5信号的损失指示dG，并且剩余的信号指示dA掺入。类似地，在先前确定的dCTP或dTTP虚拟终止子类似物掺入的情况下，Cy5信号的损失指示dC，并且剩余的信号指示dT掺入。步骤8，通过将THP添加到延长的DNA链来切割SS接头，使得虚拟终止子类似物上的染料被去除，并且还恢复了用3'-O-叠氮基甲基-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。DNA产物准备好用于DNA测序反应的下一个循环。图58中呈现了此方案中使用的核苷酸的结构。在每一步骤处的成像动画中，黑色指示阳性Cy5信号，并且白色指示背景信号。最后的概要动画中的编码指示模板序列，而不是所掺入的核苷酸。
图60：通用的一组用于使用点击切割接头的单色SBS的染料或锚定物可切割核苷酸可逆终止子类似物和标记试剂：核苷酸可逆终止子类似物中的一种具有通过SS接头与碱基连接的Cy5，一种具有通过SS接头与碱基连接的生物素，一种具有通过含有SS(示出为可切割接头1)和TCO(示出为可切割接头2)的接头与碱基连接的Cy5，并且最后一种具有通过含有SS和TCO的接头与碱基连接的生物素。结合分子是染料标记的链霉亲和素，并且可以通过在可切割接头2处的点击切割反应或在可切割接头1处的标准切割来释放染料。追加延伸反应用四种未标记的可逆终止子(例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)执行。
图61：用于使用可切割核苷酸类似物(如在图60中所呈现的可切割核苷酸类似物)进行单色SBS的方案的简化表示。每种类型的核苷酸可逆终止子类似物具有通过SS接头或具有SS和TCO基团两者的接头连接的以下中的一种：Cy5或生物素。矩形表示含有所连接的引物-环-模板分子(或其它模板-结合引物布置)的许多拷贝的基材上的区域，其中模板链中的下一个碱基从左到右是T、G、C或A。用Therminator IX和四种可逆终止子类似物(即，通过SS接头与Cy5连接的3'-O-叔丁基-SS-dATP、通过SS接头与生物素连接的3'-O-叔丁基-SS-dTTP、通过含有SS和TCO两者的接头与Cy5连接的3'-O-叔丁基-SS-dGTP以及通过含有SS和TCO两者的接头与生物素连接的3'-O-叔丁基-SS-dCTP)进行延伸。用四种未标记的核苷酸可逆终止子(NRT，例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)和Therminator IX执行追加延伸以延伸所有剩余的引物。在洗涤之后，成像将揭示在第一和第三矩形区域中的阳性信号(表示用A或G延伸引物链)和剩余区域中的背景信号。用链霉亲和素-Cy5处理将标记dCTP和dTTP可逆终止子类似物。在洗涤之后，成像将揭示在第二和第四矩形区域中的新的阳性信号(表示用C或T延伸引物链)。四嗪与TCO的反应将释放dCTP和dGTP可逆终止子类似物上的Cy5。在洗涤之后，荧光损失将具体地揭示C和G的掺入，而剩余的荧光将分别揭示A和T的掺入。最后，用THP处理以切割掉剩余的染料并去除任何用NRT延伸的引物上的叠氮基甲基基团以为下一个测序循环做准备。左侧的1、2和3数字代码表示三个所指示的成像步骤中的每一个成像步骤处的累积信号，即由1指示的阳性信号和由0指示的背景信号。四种可能的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物的掺入将通过独特的数字代码揭示(考虑到所有这三个成像步骤，则111表示A，010表示C，110表示G并且011表示T；仅考虑这些成像步骤中的第一个和最后一个步骤，则11表示A，00表示C，10表示G并且01表示T)。
图62：用于图63的示例3'-SS-dNTP类似物(可逆终止子)。
图63A-63B：使用链霉亲和素-Cy5标记步骤，使用一组正交的核苷酸可逆终止子类似物进行单色边合成边测序，所述一组正交的核苷酸可逆终止子类似物含有Cy5或生物素以及仅SS接头或SS加TCO接头。使用3'-O-SS-dNTP-可切割接头-染料(3'-O-SS-ATP-7-SS-Cy5、3'-O-SS-dGTP-7-SS-TCO-Cy5)、3'-O-SS-dNTP-可切割接头-染料-锚定物(3'-O-SS-dTTP-5-SS-生物素、3'-O-SS-dCTP-5-SS-TCO-生物素)、3'-O-叠氮基甲基-dNTP(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)和锚定物结合分子-染料(链霉亲和素-Cy5)执行单色DNA SBS。步骤1，将Therminator IX和四种虚拟终止子类似物(3'-O-SS-ATP-7-SS-Cy5、3'-O-SS-dGTP-7-SS-TCO-Cy5、3'-O-SS-dTTP-5-SS-生物素、3'-O-SS-dCTP-5-SS-TCO-生物素)添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够在模板-环-引物上掺入3'-阻断的可逆终止子。步骤2，用Therminator IX DNA聚合酶和四种未标记的可逆终止子(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)追加延伸使得能够将互补核苷酸类似物掺入到剩余增长的DNA链中。步骤3，在洗去未掺入的核苷酸类似物后，针对Cy5荧光的成像将揭示那些用3'-O-SS-ATP-7-SS-Cy5或3'-O-SS-dGTP-7-SS-TCO-Cy5延伸的引物。步骤4，用链霉亲和素-Cy5进行标记将通过生物素锚定物将Cy5连接到3'-O-SS-dTTP-5-SS-生物素和3'-O-SS-dCTP-5-SS-TCO-生物素上。步骤5，执行第二个成像步骤，并且新的荧光信号将证实dC或dT可逆终止子的掺入。此时或恰好在此之前，可以用四种3'-O-叠氮基甲基dNTP执行任选的追加延伸步骤以确保几乎每个引物都已经用经标记的或未标记的NRT类似物中的一种进行了延伸。步骤6，与四嗪一起温育以切割dC或dG可逆终止子类似物上的染料。步骤7，在洗涤以去除任何游离四嗪之后，进行第三个成像步骤。在先前确定的dATP或dGTP可逆终止子类似物掺入的情况下，Cy5信号的损失指示dG，并且剩余的信号指示dA掺入。类似地，在先前确定的dCTP或dTTP可逆终止子类似物掺入的情况下，Cy5信号的损失指示dC，并且剩余的信号指示dT掺入。步骤8，通过将THP添加到延长的DNA链来切割SS接头，使得dATP和dGTP可逆终止子类似物上的染料被去除，并且还恢复了用3'-O-SS-dNTP或3'-O-叠氮基甲基-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。DNA产物准备好用于DNA测序反应的下一个循环。图62中呈现了此方案中使用的核苷酸的结构。在每一步骤处的成像动画中，黑色指示阳性Cy5信号，并且白色指示背景信号。最后的概要动画中的编码指示模板序列，而不是所掺入的核苷酸。
图64：通用的一组用于使用点击切割接头和pH响应性染料的单色SBS的染料标记的可切割ddNTP类似物：双脱氧核苷酸类似物中的一种具有通过SS接头与碱基连接的Cy5，一种具有通过SS接头与碱基连接的HCyC-646，一种具有通过含有SS(示出为可切割接头1)和TCO(示出为可切割接头2)的接头与碱基连接的Cy5，并且最后一种具有通过含有SS和TCO的接头与碱基连接的HCyC-646。HCyC-646是在低于pH 6时会发出荧光的pH响应性染料。可以通过在可切割接头2处的点击切割反应或在可切割接头1处的标准切割来释放染料。这种杂交SBS方法的要求是单独的一组四种未标记的可逆终止子(例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)。
图65：用于使用可切割核苷酸类似物(如在图64中所呈现的可切割核苷酸类似物)进行单色SBS的方案的简化表示。每种类型的ddNTP具有通过SS接头或具有SS和TCO基团两者的接头连接的以下中的一种：Cy5或HCyC-646。矩形表示含有所连接的引物-环-模板分子(或其它模板-结合引物布置)的许多拷贝的基材上的区域，其中模板链中的下一个碱基从左到右是T、G、C或A。在与四种未标记的核苷酸可逆终止子(NRT，例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)和Therminator IX温育以延伸大部分引物后，用Thermo Sequenase和四种ddNTP类似物(即，通过SS接头与Cy5连接的ddATP、通过SS接头与HCyC-646连接的ddTTP、通过含有SS和TCO两者的接头与Cy5连接的ddGTP以及通过含有SS和TCO两者的接头与HCyC-646连接的ddCTP)进行延伸。在pH 9下洗涤之后，成像将揭示在第一和第三矩形区域中由于Cy5荧光而产生的阳性信号(表示用A或G延伸引物链)和剩余区域中的背景信号。在pH 5下洗涤之后，由于HCyC-646能够在低于pH 6下发出荧光，成像将揭示在第二和第四矩形区域中的新的阳性信号(表示用C或T延伸引物链)。四嗪与TCO的反应将释放ddCTP和ddGTP核苷酸类似物上的Cy5。在洗涤之后，荧光损失将具体地揭示C和G的掺入，而剩余的荧光将分别揭示A和T的掺入。最后，用THP处理以切割掉剩余的染料并去除任何用NRT延伸的引物上的叠氮基甲基基团以为下一个测序循环做准备。左侧的1、2和3数字代码表示三个所指示的成像步骤中的每一个成像步骤处的累积信号，即由1指示的阳性信号和由0指示的背景信号。四种可能的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物的掺入将通过独特的数字代码揭示(考虑到所有这三个成像步骤，则111表示A，010表示C，110表示G并且011表示T；仅考虑这些成像步骤中的第一个和最后一个步骤，则11表示A，00表示C，10表示G并且01表示T)。
图66：用于图67的示例ddNTP类似物。
图67A-67B：使用一组正交的ddNTP类似物进行单色边合成边测序，所述一组正交的ddNTP类似物含有Cy5或HCyC-646以及仅SS接头或SS加TCO接头。使用ddNTP-可切割接头-染料(ddATP-7-SS-Cy5、ddGTP-7-SS-TCO-Cy5、ddTTP-5-SS-HCyC-646、ddCTP-5-SS-TCO-HCyC-646)和3'-O-叠氮基甲基-dNTP(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)执行单色DNA SBS。步骤1，将Therminator IXDNA聚合酶和四种可逆终止子(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够将互补核苷酸类似物掺入到大多数增长的DNA链中(>90％)以终止DNA合成。步骤2，将ThermoSequenase和四种ddNTP类似物(ddATP-7-SS-Cy5、ddGTP-7-SS-TCO-Cy5、ddTTP-SS-HCyC-646、ddCTP-SS-TCO-HCyC-646)添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够在大多数剩余的引物上掺入ddNTP。步骤3，在pH 9下洗去未掺入的核苷酸类似物后，针对Cy5荧光的成像将揭示那些用ddATP-7-SS-Cy5或ddGTP-7-SS-TCO-Cy5延伸的引物。步骤4，在pH 5下洗涤将允许ddTTP-5-SS-HCyC-646和ddCTP-5-SS-TCO-HCyC-646上的HCyC-646染料发出荧光。在pH 5下执行第二个成像步骤，并且新的荧光信号将证实ddC或ddT的掺入。此时或恰好在此之前，可以用四种3'-O-叠氮基甲基dNTP执行任选的追加延伸步骤以确保几乎每个引物都已经用ddNTP或NRT类似物中的一种进行了延伸。步骤5，与四嗪一起温育以切割ddC或ddG类似物上的染料。步骤6，在pH 5下洗涤以去除任何游离四嗪之后，在pH 5下进行第三个成像步骤。在先前确定的ddATP或ddGTP类似物掺入的情况下，HCyC-646荧光信号的损失指示ddG，并且剩余的信号指示ddA掺入。类似地，在先前确定的ddCTP或ddTTP类似物掺入的情况下，Cy5信号的损失指示ddC，并且剩余的信号指示ddT掺入。步骤7，通过将THP添加到延长的DNA链来切割SS接头，使得虚拟终止子核苷酸类似物上的剩余阻断剂和染料被去除，并且还恢复了用3'-O-叠氮基甲基-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。DNA产物准备好用于DNA测序反应的下一个循环。图66中呈现了此方案中使用的核苷酸的结构。在每一步骤处的成像动画中，黑色指示阳性荧光信号，并且白色指示背景信号。最后的概要动画中的编码指示模板序列，而不是所掺入的核苷酸。
图68：通用的一组用于使用点击切割接头和pH响应性染料的单色SBS的染料标记的可切割dNTP-阻断剂(虚拟终止子)类似物：虚拟终止子类似物中的一种具有通过SS接头与碱基连接的Cy5，一种具有通过SS接头与碱基连接的HCyC-646，一种具有通过含有SS(示出为可切割接头1)和TCO(示出为可切割接头2)的接头与碱基连接的Cy5，并且最后一种具有通过含有SS和TCO的接头与碱基连接的HCyC-646。HCyC-646是在低于pH 6时会发出荧光的pH响应性染料。可以通过在可切割接头2处的点击切割反应或在可切割接头1处的标准切割来释放染料。还需要用四种未标记的可逆终止子(例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)进行追加延伸步骤。
图69：用于使用可切割核苷酸类似物(如在图68中所呈现的可切割核苷酸类似物)进行单色SBS的方案的简化表示。每种类型的虚拟终止子具有通过SS接头或具有SS和TCO基团两者的接头连接的以下中的一种：Cy5或HCyC-646。矩形表示含有所连接的引物-环-模板分子(或其它模板-结合引物布置)的许多拷贝的基材上的区域，其中模板链中的下一个碱基从左到右是T、G、C或A。用Thermo Sequenase和四种虚拟终止子类似物(即，通过SS接头与Cy5连接的dATP、通过SS接头与HCyC-646连接的dTTP、通过含有SS和TCO两者的接头与Cy5连接的dGTP以及通过含有SS和TCO两者的接头与HCyC-646连接的dCTP)进行延伸。用四种未标记的核苷酸可逆终止子(NRT，例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)和Therminator IX执行追加延伸以延伸所有剩余的引物。在pH 9下洗涤之后，成像将揭示在第一和第三矩形区域中由于Cy5荧光而产生的阳性信号(表示用A或G延伸引物链)和剩余区域中的背景信号。在pH 5下洗涤之后，由于HCyC-646能够在低于pH 6下发出荧光，成像将揭示在第二和第四矩形区域中的新的阳性信号(表示用C或T延伸引物链)。四嗪与TCO的反应将释放dCTP和dGTP核苷酸类似物上的Cy5。在洗涤之后，荧光损失将具体地揭示C和G的掺入，而剩余的荧光将分别揭示A和T的掺入。最后，用THP处理以切割掉剩余的染料并去除任何用NRT延伸的引物上的叠氮基甲基基团以为下一个测序循环做准备。左侧的1、2和3数字代码表示三个所指示的成像步骤中的每一个成像步骤处的累积信号，即由1指示的阳性信号和由0指示的背景信号。四种可能的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物的掺入将通过独特的数字代码揭示(考虑到所有这三个成像步骤，则111表示A，010表示C，110表示G并且011表示T；仅考虑这些成像步骤中的第一个和最后一个步骤，则11表示A，00表示C，10表示G并且01表示T)。
图70：用于图71的示例dNTP类似物。
图71A-71B：使用一组正交的dNTP-阻断剂(虚拟终止子)类似物进行单色边合成边测序，所述一组正交的dNTP-阻断剂(虚拟终止子)类似物含有Cy5或HCyC-646以及仅SS接头或SS加TCO接头。使用dNTP-可切割接头-阻断剂-染料(dATP-7-SS-阻断剂-Cy5、dGTP-7-SS-阻断剂-TCO-Cy5、dTTP-5-SS-阻断剂-HCyC-646、dCTP-5-SS-阻断剂-TCO-HCyC-646)和3'-O-叠氮基甲基-dNTP(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)执行单色DNA SBS。步骤1，将Thermo Sequenase和四种dNTP-阻断剂虚拟终止子类似物(dATP-7-SS-阻断剂-Cy5、dGTP-7-SS-阻断剂-TCO-Cy5、dTTP-5-SS-阻断剂-HCyC-646、dCTP-5-SS-阻断剂-TCO-HCyC-646)添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够将这些dNTP掺入到模板-环-引物(或其它模板-结合引物布置中的引物)的3'端以与模板链上的互补碱基相对。步骤2，用Therminator IX DNA聚合酶和四种可逆终止子(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)追加延伸固定的结合有引物的DNA模板使得能够将互补核苷酸类似物掺入到大多数剩余增长的DNA链中以终止DNA合成。步骤3，在pH 9下洗去未掺入的核苷酸类似物后，针对Cy5荧光的成像将揭示那些用dATP-7-SS-阻断剂-Cy5或dGTP-7-SS-阻断剂-TCO-Cy5延伸的引物。步骤4，在pH 5下洗涤将允许dTTP-5-SS-阻断剂-HCyC-646和dCTP-5-SS-阻断剂-TCO-HCyC-646上的HCyC-646染料发出荧光。在pH 5下执行第二个成像步骤，并且新的荧光信号将证实dC或dT的掺入。此时或恰好在此之前，可以用四种3'-O-叠氮基甲基dNTP执行任选的追加延伸步骤以确保几乎每个引物都已经用虚拟终止子或NRT类似物中的一种进行了延伸。步骤5，与四嗪一起温育以切割dC或dG类似物上的染料。步骤6，在pH 5下洗涤以去除任何游离四嗪之后，在pH 5下进行第三个成像步骤。在先前确定的dATP或dGTP类似物掺入的情况下，HCyC-646荧光信号的损失指示dG，并且剩余的信号指示dA掺入。类似地，在先前确定的dCTP或dTTP类似物掺入的情况下，Cy5信号的损失指示dC，并且剩余的信号指示dT掺入。步骤7，通过将THP添加到延长的DNA链来切割SS接头，使得从所掺入的虚拟终止子中去除任何剩余的阻断剂和染料，并且还恢复了用3'-O-叠氮基甲基-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。DNA产物准备好用于DNA测序反应的下一个循环。图70中呈现了此方案中使用的核苷酸的结构。在每一步骤处的成像动画中，黑色指示阳性荧光信号，并且白色指示背景信号。最后的概要动画中的编码指示模板序列，而不是所掺入的核苷酸。
图72：通用的一组用于使用点击切割接头和pH响应性染料的单色SBS的染料标记的可切割3'-阻断的可逆终止子类似物：可逆终止子类似物中的一种具有通过SS接头与碱基连接的Cy5，一种具有通过SS接头与碱基连接的HCyC-646，一种具有通过含有SS(示出为可切割接头1)和TCO(示出为可切割接头2)的接头与碱基连接的Cy5，并且最后一种具有通过含有SS和TCO的接头与碱基连接的HCyC-646。HCyC-646是在低于pH 6时会发出荧光的pH响应性染料。可以通过在可切割接头2处的点击切割反应或在可切割接头1处的标准切割来释放染料。还需要用四种未标记的可逆终止子(例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)进行追加延伸步骤。
图73：用于使用可切割核苷酸类似物(如在图72中所呈现的可切割核苷酸类似物)进行单色SBS的方案的简化表示。每种类型的3'-阻断的核苷酸可逆终止子具有通过SS接头或具有SS和TCO基团两者的接头连接的以下中的一种：Cy5或HCyC-646。矩形表示含有所连接的引物-环-模板分子(或其它模板-结合引物布置)的许多拷贝的基材上的区域，其中模板链中的下一个碱基从左到右是T、G、C或A。用Therminator IX和四种可逆终止子类似物(即，通过SS接头与Cy5连接的dATP、通过SS接头与HCyC-646连接的dTTP、通过含有SS和TCO两者的接头与Cy5连接的dGTP以及通过含有SS和TCO两者的接头与HCyC-646连接的dCTP)进行延伸。用四种未标记的核苷酸可逆终止子(NRT，例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)和Therminator IX执行追加延伸以延伸所有剩余的引物。在pH 9下洗涤之后，成像将揭示在第一和第三矩形区域中由于Cy5荧光而产生的阳性信号(表示用A或G延伸引物链)和剩余区域中的背景信号。在pH 5下洗涤之后，由于HCyC-646能够在低于pH 6下发出荧光，成像将揭示在第二和第四矩形区域中的新的阳性信号(表示用C或T延伸引物链)。四嗪与TCO的反应将释放dCTP和dGTP核苷酸可逆终止子类似物上的Cy5。在洗涤之后，荧光损失将具体地揭示C和G的掺入，而剩余的荧光将分别揭示A和T的掺入。最后，用THP处理以切割掉剩余的染料并去除任何用NRT延伸的引物上的叠氮基甲基基团以为下一个测序循环做准备。左侧的1、2和3数字代码表示三个所指示的成像步骤中的每一个成像步骤处的累积信号，即由1指示的阳性信号和由0指示的背景信号。四种可能的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物的掺入将通过独特的数字代码揭示(考虑到所有这三个成像步骤，则111表示A，010表示C，110表示G并且011表示T；仅考虑这些成像步骤中的第一个和最后一个步骤，则11表示A，00表示C，10表示G并且01表示T)。
图74：用于图75的示例3'-SS-dNTP类似物。
图75A-75B：使用一组正交的3'-O-阻断的核苷酸可逆终止子类似物进行单色边合成边测序，所述类似物含有Cy5或HCyC-646以及仅SS接头或SS加TCO接头。使用3'-O-SS-dNTP-可切割接头-染料(3'-O-SS-dATP-7-SS-Cy5、3'-O-SS-dGTP-7-SS-TCO-Cy5、3'-O-SS-dTTP-5-SS-HCyC-646、3'-O-SS-dCTP-5-SS-TCO-HCyC-646)和3'-O-叠氮基甲基-dNTP(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)执行单色DNA SBS。步骤1，将Therminator IX和四种3'-O-SS-dNTP类似物(3'-O-SS-dATP-7-SS-Cy5、3'-O-SS-dGTP-7-SS-TCO-Cy5、3'-O-SS-dTTP-5-SS-HCyC-646、3'-O-SS-dCTP-5-SS-TCO-HCyC-646)添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够将这些染料标记的可逆终止子掺入到模板-环-引物(或其它模板-结合引物布置中的引物)的3'端以与模板链上的互补碱基相对。步骤2，用Therminator IX DNA聚合酶和四种可逆终止子(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)追加延伸固定的结合有引物的DNA模板使得能够将互补核苷酸类似物掺入到大多数剩余增长的DNA链中以终止DNA合成。步骤3，在pH 9下洗去未掺入的核苷酸类似物后，针对Cy5荧光的成像将揭示那些用3'-O-SS-dATP-7-SS-Cy5或3'-O-SS-dGTP-7-SS-TCO-Cy5延伸的引物。步骤4，在pH 5下洗涤将允许3'-O-SS-dTTP-5-SS-HCyC-646和3'-O-SS-dCTP-5-SS-TCO-HCyC-646上的HCyC-646染料发出荧光。在pH 5下执行第二个成像步骤，并且新的荧光信号将证实dC或dT的掺入。此时或恰好在此之前，可以用四种3'-O-叠氮基甲基dNTP执行任选的追加延伸步骤以确保几乎每个引物都已经用染料标记的核苷酸可逆终止子或未标记的NRT类似物中的一种进行了延伸。步骤5，与四嗪一起温育以切割dC或dG类似物上的染料。步骤6，在pH 5下洗涤以去除任何游离四嗪之后，进行第三个成像步骤。在先前确定的dATP或dGTP类似物掺入的情况下，HCyC-646荧光信号的损失指示dG，并且剩余的信号指示dA掺入。类似地，在先前确定的dCTP或dTTP类似物掺入的情况下，Cy5信号的损失指示dC，并且剩余的信号指示dT掺入。步骤7，通过将THP添加到延长的DNA链来切割SS接头，使得核苷酸类似物上的剩余染料被去除，并且还恢复了用3'-O-SS-dNTP或3'-O-叠氮基甲基-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。DNA产物准备好用于DNA测序反应的下一个循环。图74中呈现了此方案中使用的核苷酸的结构。在每一步骤处的成像动画中，黑色指示阳性荧光信号，并且白色指示背景信号。最后的概要动画中的编码指示模板序列，而不是所掺入的核苷酸。
图76：通用的一组用于使用pH响应性染料的单色SBS的染料标记的可切割ddNTP类似物：双脱氧核苷酸类似物中的两种具有通过SS接头与碱基连接的Cy5，并且其它两种具有通过SS接头与碱基连接的HCyC-646。HCyC-646是在低于pH 6时会发出荧光的pH响应性染料。这种杂交SBS方法的要求是单独的一组四种未标记的可逆终止子(例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)。
图77：用于使用可切割核苷酸类似物(如在图76中所呈现的可切割核苷酸类似物)进行单色SBS的方案的简化表示。每种类型的ddNTP均具有通过SS接头连接的以下中的一种：Cy5或HCyC-646。矩形表示含有所连接的引物-环-模板分子(或其它模板-结合引物布置)的许多拷贝的基材上的区域，其中模板链中的下一个碱基从左到右是T、G、C或A。用Therminator IX和ddNTP类似物中的两种(即，通过SS接头与Cy5连接的ddATP和通过SS接头与HCyC-646连接的ddTTP)以及过量的3'-O-叠氮基甲基dNTP进行延伸。在pH 5下洗涤之后，由于Cy5或HCyC-646荧光，成像将揭示在第一和第四矩形区域中的阳性信号，从而指示A或T的掺入。接下来，与通过SS接头与Cy5连接的ddGTP和通过SS接头与HCyC-646连接的ddCTP以及用于确保保真度的过量的3'-O-叠氮基甲基-dATP和3'-O-叠氮基甲基-dTTP一起温育并且在pH 5下洗涤，将使得在第二和第三矩形区域中出现新的阳性信号，从而指示C或G掺入。在pH 9下洗涤之后，由于HCyC-646能够在低于pH 6下发出荧光，但在pH 9下不发出荧光，成像将揭示在第二和第四矩形区域中的阳性信号的损失。因此，如果先前确定掺入了A或T，则荧光损失将指示T的掺入，并且如果先前确定掺入了C或G，则荧光损失将指示C的掺入。剩余的荧光分别指示A和G的掺入。最后，用THP处理以切割掉剩余的染料并去除任何用NRT延伸的引物上的叠氮基甲基基团以为下一个测序循环做准备。左侧的1、2和3数字代码表示四个所指示的成像步骤中的每一个成像步骤处的累积信号，即由1指示的阳性信号和由0指示的背景信号。四种可能的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物的掺入将通过独特的数字代码揭示(考虑到所有这四个成像步骤，则111表示A，010表示C，011表示G并且110表示T)。
图78：用于图79的示例ddNTP类似物。
图79A-79B：使用一组ddNTP类似物进行单色边合成边测序，所述一组ddNTP类似物含有Cy5或HCyC-646。使用ddNTP-可切割接头-染料(ddATP-7-SS-Cy5、ddGTP-7-SS-Cy5、ddTTP-5-SS-HCyC-646、ddCTP-5-SS-HCyC-646)和3'-O-叠氮基甲基-dNTP(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)执行单色DNA SBS。步骤1，将Therminator IX DNA聚合酶、ddNTP-可切割接头-染料中的两种(ddATP-7-SS-Cy5、ddTTP-5-SS-HCyC-646)和过量的四种可逆终止子(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够将互补3'-O-叠氮基甲基-dNTP掺入到大多数增长的DNA链中(>95％)并且将ddATP-7-SS-Cy5、ddTTP-5-SS-HCyC-646掺入在大多数剩余引物上以终止DNA合成。步骤2，在pH 5下洗去未掺入的核苷酸类似物之后，针对Cy5或HCyC-646荧光的成像(所述两种染料吸收和发射彼此波长基本上相同的光)将揭示那些用ddATP-7-SS-Cy5或ddT-5-SS-HCyC-646延伸的引物。步骤3，将Therminator IX DNA聚合酶、剩余的两种ddNTP-可切割接头-染料(ddGTP-7-SS-Cy5、ddCTP-SS-HCyC-646)和其它两种可逆终止子(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够高保真地掺入ddCTP-5-SS-HCyC-646和ddGTP-7-SS-Cy5。步骤4，在pH 5下洗去未掺入的核苷酸之后，执行第二个成像步骤以揭示Cy5或HCyC-646荧光，并且新的荧光信号将证实ddC或ddG的掺入。步骤5，在pH 9下洗涤以消除ddCTP-SS-HCyC-646和ddTTP-SS-HCyC-646上的HCyC-646染料的荧光后，第三个成像步骤将揭示哪种核苷酸被掺入。因此，如果在成像步骤2中确定添加了ddA或ddT，则荧光信号的损失指示T的掺入，并且剩余信号指示A的掺入。如果在成像步骤4中确定添加了ddC或ddG，则荧光信号的损失指示C的掺入，并且剩余信号指示G的掺入。此时或恰好在此之前，可以用四种3'-O-叠氮基甲基dNTP执行任选的追加延伸步骤以确保几乎每个引物都已经用ddNTP或NRT类似物中的一种进行了延伸。步骤6，通过将THP添加到延长的DNA链来切割SS接头，使得核苷酸类似物上的染料被去除，并且还恢复了用3'-O-叠氮基甲基-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。DNA产物准备好用于DNA测序反应的下一个循环。图78中呈现了此方案中使用的核苷酸的结构。在每一步骤处的成像动画中，黑色指示阳性荧光信号，并且白色指示背景信号。最后的概要动画中的编码指示模板序列，而不是所掺入的核苷酸。
图80：通用的一组用于使用pH响应性染料和用于连接染料猝灭剂分子的锚定物的单色SBS的染料标记的可切割ddNTP类似物：双脱氧核苷酸类似物中的两种具有通过SS接头与碱基连接的Cy5，并且其它两种具有通过SS接头与碱基连接的HCyC-646。用于连接猝灭剂的锚定物存在于含有Cy5的ddNTP之一和含有HCyC-646的一种ddNTP上。HCyC-646是在低于pH 6时会发出荧光的pH响应性染料。这种杂交SBS方法的要求是单独的一组四种未标记的可逆终止子(例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)。
图81：用于使用可切割核苷酸类似物(如在图80中所呈现的可切割核苷酸类似物)进行单色SBS的方案的简化表示。每种类型的ddNTP均具有通过SS接头连接的以下中的一种：Cy5、Cy5-四嗪、HCyC-646或HCyC-646-四嗪。矩形表示含有所连接的引物-环-模板分子(或其它模板-结合引物布置)的许多拷贝的基材上的区域，其中模板链中的下一个碱基从左到右是T、G、C或A。在与四种未标记的核苷酸可逆终止子(NRT，例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)和Therminator IX温育以延伸大部分引物后，用Thermo Sequenase和四种ddNTP类似物(即，与Cy5连接的ddATP、与HCyC-646连接的ddTTP、与四嗪和Cy5两者连接的ddGTP以及与四嗪和HCyC-646两者连接的ddCTP)进行延伸。在pH 9下洗涤之后，由于Cy5荧光，成像将揭示在第一和第三矩形区域中的阳性信号，从而指示A或G的掺入。在切换到pH 5之后，由于HCyC-646荧光的低pH依赖性，成像将揭示在第二和第四矩形区域中的新的荧光，从而指示C或T的掺入。与TCO-BHQ3温育将使猝灭剂连接到ddCTP和ddGTP上的四嗪锚定物，并且在pH 5下洗涤之后，成像将揭示使得这两种核苷酸类似物的荧光显著降低的荧光猝灭，从而具体地指示C或G的掺入，而无荧光损失将具体地指示A或T的掺入。最后，用THP处理以切割掉剩余的染料并去除任何用NRT延伸的引物上的叠氮基甲基基团以为下一个测序循环做准备。左侧的1、2和3数字代码表示三个所指示的成像步骤中的每一个成像步骤处的累积信号，即由1指示的阳性信号和由0指示的背景信号。四种可能的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物的掺入将通过独特的数字代码揭示(考虑到所有这三个成像步骤，则111表示A，010表示C，110表示G并且011表示T；或者仅考虑第一个和第三个成像步骤，则11表示A，00表示C，10表示G并且01表示T)。
图82：用于图83的示例ddNTP类似物和猝灭剂-锚定物结合分子。
图83A-83B：使用一组正交的ddNTP类似物进行单色边合成边测序，所述一组正交的ddNTP类似物含有Cy5、HCyC-646、四嗪-Cy5或四嗪-HCyC-646，并且用TCO-BHQ3进行猝灭。使用ddNTP-可切割接头-染料(ddATP-7-SS-Cy5、ddGTP-7-SS-四嗪/Cy5、ddTTP-5-SS-HCyC-646、ddCTP-5-SS-四嗪/HCyC-646)和3'-O-叠氮基甲基dNTP(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)和锚定物结合分子-猝灭剂(TCO-BHQ3)执行单色DNA SBS。步骤1，将Therminator IX DNA聚合酶和四种可逆终止子(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够将互补核苷酸类似物掺入到大多数增长的DNA链中(>90％)以终止DNA合成。步骤2，将Thermo Sequenase和四种ddNTP类似物(ddATP-7-SS-Cy5、ddGTP-7-SS-四嗪/Cy5、ddTTP-5-SS-HCyC-646、ddCTP-5-SS-四嗪/HCyC-646)添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够在大多数剩余的模板-环-引物上掺入ddNTP。步骤3，在pH 9下洗去未掺入的核苷酸类似物后，针对Cy5荧光的成像将揭示那些用ddATP-7-SS-Cy5或ddGTP-7-SS-四嗪/Cy5延伸的引物。步骤4，在pH 5下洗涤将允许ddTTP-5-SS-HCyC-646和ddCTP-5-SS-四嗪/HCyC-646上的HCyC-646染料发出荧光。在pH 5下执行第二个成像步骤，并且新的荧光信号将证实ddC或ddT的掺入。此时或恰好在此之前，可以用四种3'-O-叠氮基甲基dNTP执行任选的追加延伸步骤以确保几乎每个引物都已经用ddNTP或NRT类似物中的一种进行了延伸。步骤5，与TCO-BHQ3一起温育会将BHQ猝灭剂连接到ddC和ddG上的四嗪锚定物上。步骤6，在pH 5下洗涤以去除任何游离TCO-BHQ之后，进行第三个成像步骤。在先前确定的ddATP或ddGTP类似物掺入的情况下，荧光信号的显著减少指示ddG，并且剩余的信号指示ddA掺入。类似地，在先前确定的ddCTP或ddTTP类似物掺入的情况下，荧光信号的显著损失指示ddC，并且剩余的信号指示ddT掺入。步骤7，通过将THP添加到延长的DNA链来切割SS接头，使得ddNTP类似物上的染料被去除，并且还恢复了用3'-O-叠氮基甲基-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。DNA产物准备好用于DNA测序反应的下一个循环。图82中呈现了此方案中使用的核苷酸的结构。在每一步骤处的成像动画中，黑色指示阳性Cy5信号，并且白色或浅灰色指示背景信号。最后的概要动画中的编码指示模板序列，而不是所掺入的核苷酸。
图84：通用的一组用于单色SBS的染料标记的可切割ddNTP类似物和用于连接染料猝灭剂分子的锚定物：所有双脱氧核苷酸类似物均具有通过SS接头与碱基连接的Cy5，所述双脱氧核苷酸类似物中的两种具有用于连接染料猝灭剂的锚定物。这种杂交SBS方法的要求是单独的一组四种未标记的可逆终止子(例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)。
图85：用于使用可切割核苷酸类似物(如在图84中所呈现的可切割核苷酸类似物)进行单色SBS的方案的简化表示。每种类型的ddNTP均具有通过SS接头连接的以下中的一种：Cy5或Cy5和四嗪。矩形表示含有所连接的引物-环-模板分子(或其它模板-结合引物布置)的许多拷贝的区域，其中模板链中的下一个碱基从左到右是T、G、C或A。用TherminatorIX和ddNTP类似物中的两种(即，通过SS接头与Cy5连接的ddATP和通过SS接头与四嗪和Cy5两者连接的ddTTP)以及过量的3'-O-叠氮基甲基dNTP进行延伸。在洗涤之后，由于Cy5荧光，成像将揭示在第一和第四矩形区域中的阳性信号，从而指示A或T的掺入。接下来，与通过SS接头与Cy5连接的ddGTP和通过SS接头与四嗪和Cy5两者连接的ddCTP以及过量的3'-O-叠氮基甲基-dATP和3'-O-叠氮基甲基-dTTP一起温育，然后进行洗涤和成像，将在第二和第三矩形区域中产中生阳性信号，从而指示C或G的掺入。与TCO-BHQ3一起温育会将猝灭剂连接到ddCTP和ddTTP上的四嗪锚定物上以确保保真度，并且在洗涤之后，成像将揭示使得这两种核苷酸类似物的荧光显著降低(在第二和第四矩形区域中)的荧光猝灭，从而具体地指示C或T的掺入，而无荧光损失(在第一和第三矩形区域中)将具体地指示A或G的掺入。最后，用THP处理以切割掉剩余的染料并去除任何用NRT延伸的引物上的叠氮基甲基基团以为下一个测序循环做准备。左侧的1、2和3数字代码表示三个所指示的成像步骤中的每一个成像步骤处的累积信号，即由1指示的阳性信号和由0指示的背景信号。四种可能的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物的掺入将通过独特的数字代码揭示(考虑到所有这三个成像步骤，则111表示A，010表示C，011表示G并且110表示T；或者仅考虑第一个和第三个成像步骤，则11表示A，00表示C，01表示G并且10表示T)。
图86：用于图87的示例ddNTP类似物和猝灭剂-锚定物结合分子。
图87A-87B：使用一组ddNTP类似物以及猝灭步骤进行单色边合成边测序，所述一组ddNTP类似物含有Cy5或Cy5加锚定物。使用ddNTP-可切割接头-染料(ddATP-7-SS-Cy5、ddGTP-7-SS-Cy5、ddTTP-5-SS-四嗪/Cy5、ddCTP-5-SS-四嗪/Cy5)和3'-O-叠氮基甲基dNTP(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)和锚定物结合分子-猝灭剂(TCO-BHQ3)执行单色DNA SBS。步骤1，将TherminatorIX DNA聚合酶、ddNTP-可切割接头-染料中的两种(ddATP-7-SS-Cy5、ddTTP-5-SS-四嗪/Cy5)和过量的四种可逆终止子(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够将互补3'-O-叠氮基甲基-dNTP掺入到大多数增长的DNA链中(>95％)并且将ddATP-7-SS-Cy5、ddTTP-5-SS-四嗪/Cy5掺入在大多数剩余引物上以终止DNA合成。步骤2，在洗去未掺入的核苷酸类似物后，针对Cy5荧光的成像将揭示用ddATP-7-SS-Cy5或ddTTP-5-SS-四嗪/Cy5延伸的引物。步骤3，将Therminator IX DNA聚合酶、剩余的两种ddNTP-可切割接头-染料(ddGTP-7-SS-Cy5、ddCTP-5-SS-四嗪/Cy5)和其它两种可逆终止子(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够准确地掺入ddGTP-7-SS-Cy5和ddCTP-5-SS-四嗪/Cy5。步骤4，在洗去未掺入的核苷酸之后，执行第三个成像步骤以揭示Cy5荧光，并且新的荧光信号将证实ddC或ddG的掺入。此时或恰好在此之前，可以用四种3'-O-叠氮基甲基dNTP执行任选的追加延伸步骤以确保几乎每个引物都已经用ddNTP或NRT类似物中的一种进行了延伸。步骤5，与TCO-BHQ3一起温育会将BHQ猝灭剂连接到ddC和ddT上的四嗪锚定物。步骤6，在洗涤以去除任何游离四嗪-BHQ之后，进行第三个成像步骤。在先前确定的ddATP或ddTTP类似物掺入的情况下，Cy5信号的显著减少指示ddT，并且剩余的信号指示ddA掺入。类似地，在先前确定的ddCTP或ddGTP类似物掺入的情况下，Cy5信号的显著损失指示ddC，并且剩余的信号指示ddG掺入。步骤7，通过将THP添加到延长的DNA链来切割SS接头，使得ddATP和ddGTP类似物上的染料被去除，并且还恢复了用3'-O-叠氮基甲基-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。DNA产物准备好用于DNA测序反应的下一个循环。图86中呈现了此方案中使用的核苷酸的结构。在每一步骤处的成像动画中，黑色指示阳性Cy5信号，并且白色或浅灰色指示背景信号。最后的概要动画中的编码指示模板序列，而不是所掺入的核苷酸。
图88：ddNTP-SS-染料-TCO(以ddGTP-7-SS-Cy5-TCO作为实例)的合成。此类型的化合物用于实例6和7中。
图89：ddNTP-SS-染料-TCO(短接头型式)(以ddGTP-7-SS-Cy5-TCO作为实例)的合成。此类型的化合物用于实例6中。
图90：ddNTP-SS-锚定物-TCO(以ddCTP-5-SS-生物素-TCO作为实例)的合成。此类型的化合物用于实例6中。
图91：结合分子-猝灭剂(以四嗪-BHQ3作为实例)的合成。此类型的化合物用于实例6和7中。
图92：结合分子-染料(以TCO-HCyC-646作为实例)的合成。此类型的化合物用于实例2中。
图93：结合分子-猝灭剂(以TCO-BHQ3作为实例)的合成。此类型的化合物用于实例11和12中。
图94：HCyC-646NHS酯的合成。此类型的化合物用于实例2、7和10中。
图95：ddNTP-SS-染料(以ddTTP-5-SS-HCyc-646作为实例)的合成。此类型的化合物用于实例2、7和10中。
图96：染料-TCO接头-NHS酯(以Cy5-TCO-NHS酯作为实例)的合成。此类型的化合物用于实例5、8和9中。
图97：ddNTP-TCO接头-锚定物(以ddCTP-5-TCO-生物素作为实例)的合成。此类型的化合物用于实例5中。
图98：ddNTP-SS-染料-四嗪(以ddGTP-7-SS-Cy5-四嗪作为实例)的合成。此类型的化合物用于实例11和12中。
图99：ddNTP-SS-染料-四嗪(以ddGTP-7-SS-Cy5-四嗪作为实例)的合成。此类型的化合物用于实例11和12中。
图100：dNTP-SS-阻断剂-TCO-锚定物(以dCTP-SS-阻断剂-TCO-生物素作为实例，碱基可以是A、C、T或G)的合成。此类型的化合物用于实例8中。
图101：dNTP-SS-阻断剂-TCO-染料(以dCTP-SS-阻断剂-TCO-HCyC-646作为实例，碱基可以是A、C、T或G，染料可以是Cy5)的合成。此类型的化合物用于实例8和9中。
图102：3'-SS-dNTP-SS--TCO-染料(以3'-SS-dGTP-SS--TCO-HCyC-646作为实例，碱基可以是A、C、T或G，染料也可以是Cy5)的合成。此类型的化合物用于实例8中。
图103：3'-SS-dNTP-SS--TCO-锚定物(以3'-SS-dCTP-SS--TCO-生物素作为实例，碱基可以是A、C、T或G)的合成。此类型的化合物用于实例8和9中。
图104：针对两种不同的固定DNA模板使用ddCTP-5-SS-Cy5、ddGTP-7-SS-Cy5、ddATP-7-SS-生物素、ddTTP-5-SS-生物素、链霉亲和素-Cy5以及四种3'-O-叠氮基甲基dNTP进行十三个单色边合成边测序循环的结果。每个循环由以下步骤(具有中间洗涤步骤)组成：(1)使用Therminator IX DNA聚合酶，用四种3'-O-叠氮基甲基dNTP进行延伸，以在载玻片上的每个点中延伸～95％的引物-环-模板分子；(2)用ddCTP-SS-Cy5、ddATP-SS-生物素、3'-O-叠氮基甲基-dGTP和3'-O-叠氮基甲基-dTTP(“E-ddAddC”)进行延伸；(3)与链霉亲和素-Cy5温育(第1个“标记”步骤)；(4)用ddGTP-SS-Cy5、ddTTP-SS-生物素、3'-O-叠氮基甲基-dATP和3'-O-叠氮基甲基-dCTP(“E-ddGddT”)进行延伸；(5)与链霉亲和素-Cy5温育(第2个“标记”步骤)；(6)用四种3'-O-叠氮基甲基dNTP进行追加延伸；(7)用THP处理以去除染料并恢复掺入的可逆终止子(3'-O-叠氮基甲基dNTP)上的3'-OH基团(“切割”)。低于700的信号被视为背景并编码为“0”；高于850的信号被视为阳性并编码为“1”。在条形图中，每个由4个条柱构成的组表示1个循环，并且从左到右的条柱分别表示第1次延伸、第1次标记、第2次延伸和第2次标记的任意单位的荧光图像。检查顶部条形图，循环1的成像结果(0011)指示G的掺入，循环2(0111)指示A，循环3(0011)指示G，循环4(1111)指示C，循环5(0111)指示A，循环6(0001)指示T，依此类推，从而揭示模板序列的前13个碱基为3'-CTCGTAGTTCAAA-5'(SEQID NO：1)，与连接到所述载玻片区域的表面的预期模板序列完全匹配。类似地，检查底部条形图，获得的序列为3'-GTAGTTCAAACCC-5'(SEQ ID NO：2)，与连接到所述载玻片区域的表面的模板的预期序列完全一致。这些结果证明本申请的实例1中所描述的SBS方法可以用于成功且准确地对DNA进行测序。
图105：用于实现单色边合成边测序而无需实例2中的标记步骤的一组核苷酸类似物(ddCTP-SS-Cy5、ddGTP-SS-Cy5、ddTTP-SS-HCyC-646、ddATP-SS-HCyC-646、3'-O-CH2-N3-dATP、3'-O-CH2-N3-dCTP、3'-O-CH2-N3-dGTP和3'-O-CH2-N3-dTTP)。
图106：用于使用图105中示出的一组核苷酸进行单色边合成边测序的方案。
图107：pH响应性染料HCyC-646的合成以及HCyC-646NHS与5-氨基-SS-dTTP的缀合。详细方案在正文中的实例10中进行了描述。
图108：HCyC-646NHS与7-氨基-SS-dATP的连接。详细方案在正文中的实例10中进行了描述。
图109：如在实例10中所述的那样合成和纯化的ddTTP-5-SS-HCyC-646的MALDI-TOF-MS谱。预期MW(1298Da)；获得值(1302Da)。
图110：如在实例10中所述的那样合成和纯化的ddA-7-SS-HCyC-646的MALDI-TOF-MS谱。预期MW(1321Da)；获得值(1326Da)。
图111：连接到ddNTP(示出为ddATP)的HCyC-646的质子化和去质子化形式的实例。
图112：ddTTP-5-SS-HCyC-646延伸的引物的MALDI-TOF-MS谱。方案在正文中的实例10中进行了描述。预期产物大小(6286Da)；获得值(6287Da)。这表明ddTTP-5-SS-HCyC-646核苷酸被DNA聚合酶(在这种情况下为Therminator IX)识别。
图113：使用dTTP-5-SS-CyC-646以实例10的方式进行测序。执行了延伸、pH洗涤和切割的三个循环。实例10详细描述了所述方案，并且图中指示了各个步骤。针对循环1示出了四幅图像，并且针对循环2和3各示出了两幅图像。特别注意当先前在低pH缓冲液(低于7)下洗涤的载玻片然后使用高pH缓冲液(高于9)洗涤时的荧光损失。模板的前3个位置的预期序列在载玻片左侧矩形区域中是TAG、第2个区域是GAG、第3个区域是CAT并且载玻片最右侧区域是ATT。因此，使用dTTP-5-SS-CyC-646，预计其将被掺入循环1中的左侧区域、循环2中的右侧区域以及循环3中的载玻片的两个最右侧区域，这正是所观察到。还对dATP-SS-HCyC-646执行了类似的成功表征。
图114：使用图106中所展示的方案，使用ddCTP-5-SS-Cy5、ddATP-7-SS-HCyC-646、ddGTP-7-SS-Cy5、ddTTP-5-SS-HCyC-646和四种3'-O-叠氮基甲基dNTP进行的测序循环的实例。简化的方案在图左侧的方框中所展示，并且详细的方案在实例10随附的文本中提供。正如所预期的那样，在用ddCTP-5-SS-Cy5、ddATP-7-SS-HCyC-646以及3'-O-叠氮基甲基dGTP和3'-O-叠氮基甲基dTTP进行延伸以及pH 5洗涤后，获得Cy5或HCyC-646的阳性荧光信号，从而指示C或A的掺入。用ddGTP-7-SS-Cy5、ddTTP-5-SS-HCyC-646以及3'-O-叠氮基甲基dCTP和3'-O-叠氮基甲基dATP进行第二次延伸，然后进行pH 5洗涤，从而由于G或T的掺入而产生阳性荧光信号。用pH 9缓冲液洗涤消除了因HCyC-646荧光而产生的信号。因此，如果先前确定掺入了A或C，则荧光损失指示A的掺入，而剩余的荧光指示C的掺入。类似地，如果先前确定掺入了G或T，则荧光损失指示T的掺入，而剩余的荧光指示G的掺入。最后，THP处理会切割二硫键，从而使得从ddNTP类似物中去除染料(通过仅背景荧光来指示)并且恢复任何掺入的3'-O-叠氮基甲基dNTP上的3'-OH基团。
图115：针对四个不同模板使用ddCTP-5-SS-Cy5、ddATP-7-SS-HCyC-646、ddGTP-7-SS-Cy5、ddTTP-5-SS-HCyC-646和四种3'-O-叠氮基甲基dNTP进行四个循环的边合成边测序，所述四个不同模板中的两个模板在载玻片的不同部分复制。针对4个连续的边合成边测序循环执行在图106中描述并在图114中针对一个循环展示的程序。左上角的条形图示出了第一个循环的结果。六个由3个条柱构成的组表示不同的模板。每组的第一个条柱(E-ddAC5)表示在用ddATP-7-SS-HCyC-646和ddCTP-5-SS-Cy5进行第一次延伸以及pH 5洗涤后获得的荧光结果。每组的第二个条柱(E-ddGT5)表示在用ddTTP-7-SS-HCyC-646和ddGTP-5-SS-Cy5进行第二次延伸以及pH 5洗涤后获得的荧光结果。每组的最后一个条柱(pH 9)表示在切换到pH 9缓冲液以显著降低由于pH敏感性染料HCyC-646引起的荧光后获得的荧光结果。作为实例，第一次延伸后的背景荧光(低于700个任意单位)、第二次延伸后的阳性荧光和转变为pH 9后的背景荧光以数字方式记录为010并指示T的掺入。数字读数011、111和110分别指示G、C和A掺入。左下方的条形图指示第2个SBS循环的结果，右下方的条形图指示第3个SBS循环的结果，并且右上方的条形图指示第4个SBS循环的结果。在这4个模板DNA的每个循环中都获得了正确的结果。
图116：通用的一组用于单分子能量转移SBS的在碱基上具有阻断剂的锚定物和染料标记的核苷酸类似物(虚拟终止子)，所述单分子能量转移SBS使用供体染料和用于连接pH响应性或pH不响应性的染料受体分子的锚定物。所有的核苷酸类似物均具有通过SS接头与碱基连接的Cy3和生物素或四嗪锚定物。锚定物结合分子链霉亲和素和TCO分别连接到Cy5和HCyC-646。后者是在低于pH 6时会发出荧光的pH响应性染料。
图117：用于使用在碱基上具有阻断剂的核苷酸类似物(虚拟终止子)(如在图116中呈现的核苷酸类似物)进行单分子能量转移SBS的方案的简化表示。每种类型的核苷酸类似物均具有通过SS接头与碱基连接的Cy3和生物素或四嗪锚定物。矩形表示含有由所连接的引物-环-模板分子(或其它模板-结合引物布置)组成的单模板DNA分子的基材上的区域，其中模板链中的下一个碱基从左到右是T、G、C或A。用Thermo Sequenase和dNTP类似物中的两者(即，与Cy3和生物素连接的dATP以及与Cy3和四嗪连接的dTTP)进行延伸。然后用链霉亲和素-Cy5和TCO-HCyC-646两者执行标记。在pH 5下洗涤之后，由于从Cy3到Cy5或HCyC-646染料的能量转移，Cy3的激发和成像将揭示在第一和第四矩形区域中的阳性信号，从而指示A或T的掺入。用Thermo Sequenase和剩余的两种核苷酸类似物(即，与Cy3和生物素连接的dCTP以及与Cy3和四嗪连接的dGTP)进行第二次延伸。再次用链霉亲和素-Cy5和TCO-HCyC-646两者执行标记。在pH 5下洗涤之后，由于能量转移到Cy5或HCyC-646，Cy3的激发和成像将揭示在第二和第三矩形区域中的新的荧光，从而指示C或G的掺入。在pH 9下洗涤之后，成像将揭示T和G核苷酸类似物上的HCyC-646的荧光显著降低(载玻片上的第三和第四矩形区域)，但A和C核苷酸类似物上的Cy5荧光无损失(第一和第二矩形区域)。最后，用THP处理以切割掉剩余的染料并恢复这些核苷酸上的3'-OH基团。左侧的1、2和3数字代码表示三个所指示的成像步骤中的每一个成像步骤处的累积信号，即由1指示的阳性信号和由0指示的背景信号。四种可能的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物的掺入将通过独特的数字代码揭示(考虑到所有这三个成像步骤，则111表示A，011表示C，010表示G并且110表示T；或者仅考虑第一个和第三个成像步骤，则11表示A，01表示C，00表示G并且10表示T)。
图118：用于图119的连接有供体染料(Cy3)和锚定物分子(四嗪或生物素)的示例dNTP虚拟终止子类似物以及对应的结合分子(TCO或链霉亲和素)-受体染料(Cy5或HCyc-646)缀合物。
图119A-D：使用一组虚拟终止子类似物进行单分子能量转移边合成边测序，所述一组虚拟终止子类似物含有Cy3和用于连接Cy5或pH响应性染料HCyC-646的生物素或四嗪。使用dNTP-阻断剂-可切割接头-锚定物/染料(dATP-7-SS-阻断剂-生物素/Cy3、dTTP-5-SS-阻断剂-四嗪/Cy3、dCTP-5-SS-阻断剂-生物素/Cy3和dGTP-7-SS-阻断剂-四嗪/Cy3)和锚定物结合分子-染料分子(链霉亲和素-Cy5和TCO-HCyC-646)执行单分子能量转移DNA SBS。步骤1，将Thermo SequenaseDNA聚合酶和四种虚拟终止子类似物中的两种(dATP-7-SS-阻断剂-生物素/Cy3和dTTP-5-SS-阻断剂-四嗪/Cy3)添加到固定的结合有引物的DNA模板中。步骤2，在洗去任何未掺入的核苷酸之后，将链霉亲和素-Cy5和TCO-HCyC-646一起添加以通过生物素和四嗪锚定物标记dATP和dTTP核苷酸类似物。步骤3，在pH 5下洗涤并激发Cy3之后，由于来自Cy3的能量转移，Cy5和HCyC-646的荧光将揭示那些用dATP-7-SS-阻断剂-生物素/Cy3或dTTP-5-SS-阻断剂-四嗪/Cy3延伸的引物。步骤4，将Thermo SequenaseDNA聚合酶和剩余的虚拟终止子类似物(dCTP-5-SS-阻断剂-生物素/Cy3和dGTP-7-SS-阻断剂-四嗪/Cy3)添加到固定的结合有引物的DNA模板中。步骤5，在洗去任何未掺入的核苷酸之后，再次将链霉亲和素-Cy5和TCO-HCyC-646一起添加以通过生物素和四嗪锚定物标记dCTP和dGTP核苷酸类似物。步骤6，在pH 5下洗涤并激发Cy3之后，由于来自Cy3的能量转移而出现新的Cy5和HCyC-646荧光信号将揭示那些用dCTP-5-SS-阻断剂-生物素/Cy3或dGTP-7-SS-阻断剂-四嗪/Cy3延伸的引物。步骤7，在pH 9下洗涤之后，为了获得阳性Cy5荧光信号但仅背景HCyC-646荧光，进行第三个成像步骤。在先前确定的dATP或dTTP类似物掺入的情况下，荧光信号的显著减少指示dT，并且剩余的信号指示dA掺入。类似地，在先前确定的dCTP或dGTP类似物掺入的情况下，荧光信号的显著损失指示dG，并且剩余的信号指示dC掺入。步骤8，通过将THP添加到延长的DNA链来切割SS接头，使得可逆终止子类似物上的染料被去除，并且还恢复了其3'-OH基团。DNA产物准备好用于DNA测序反应的下一个循环。图118中呈现了此方案中使用的核苷酸的结构。在每一步骤处的成像动画中，黑色指示阳性Cy5或HCyC-646信号，并且白色指示背景信号。最后的概要动画中的编码指示模板序列，而不是所掺入的核苷酸。
图120：通用的一组用于单分子能量转移SBS的锚定物和染料标记的可切割3'-阻断的dNTP类似物(可逆终止子)，所述单分子能量转移SBS使用供体染料和用于连接pH响应性或pH不响应性的染料受体分子的锚定物。所有的核苷酸类似物均具有通过SS接头与碱基连接的Cy3和生物素或四嗪锚定物。锚定物结合分子链霉亲和素和TCO分别连接到Cy5和HCyC-646。后者是在低于pH 6时会发出荧光的pH响应性染料。
图121：用于使用可切割3'-阻断的核苷酸类似物(如在图120中所呈现的可切割3'-阻断的核苷酸类似物)进行单分子能量转移SBS的方案的简化表示。每种类型的dNTP均具有通过SS接头与碱基连接的Cy3和生物素或四嗪锚定物。矩形表示含有由所连接的引物-环-模板分子(或其它模板-结合引物布置)组成的单模板DNA分子的基材上的区域，其中模板链中的下一个碱基从左到右是T、G、C或A。用Therminator IX和dNTP类似物中的两者(即，与Cy3和生物素连接的3'-SS-dATP以及与Cy3和四嗪连接的3'-SS-dTTP)进行延伸。然后用链霉亲和素-Cy5和TCO-HCyC-646两者执行标记。在pH 5下洗涤之后，由于从Cy3到Cy5或HCyC-646染料的能量转移，Cy3的激发和成像将揭示在第一和第四矩形区域中的阳性信号，从而指示A或T的掺入。用Therminator IX和剩余的两种dNTP类似物(即，与Cy3和生物素连接的3'-SS-dCTP以及与Cy3和四嗪连接的3'-SS-dGTP)进行第二次延伸。再次用链霉亲和素-Cy5和TCO-HCyC-646两者执行标记。在pH 5下洗涤之后，由于能量转移到Cy5或HCyC-646，Cy3的激发和成像将揭示在第二和第三矩形区域中的新的荧光，从而指示C或G的掺入。在pH 9下洗涤之后，成像将揭示T和G核苷酸类似物上的HCyC-646的荧光显著降低(载玻片上的第三和第四矩形区域)，但A和C核苷酸类似物上的Cy5荧光无损失(第一和第二矩形区域)。最后，用THP处理以切割掉剩余的染料并恢复这些核苷酸上的3'-OH基团。左侧的1、2和3数字代码表示三个所指示的成像步骤中的每一个成像步骤处的累积信号，即由1指示的阳性信号和由0指示的背景信号。四种可能的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物的掺入将通过独特的数字代码揭示(考虑到所有这三个成像步骤，则111表示A，011表示C，010表示G并且110表示T；或者仅考虑第一个和第三个成像步骤，则11表示A，01表示C，00表示G并且10表示T)。
图122：用于图123的连接有供体染料(Cy3)和锚定物分子(四嗪或生物素)两者的示例3'-SS-dNTP可逆终止子类似物以及对应的结合分子(TCO或链霉亲和素)-受体染料(Cy5或HCyc-646)缀合物。
图123A-D：使用一组核苷酸可逆终止子类似物进行单分子能量转移边合成边测序，所述一组核苷酸可逆终止子类似物含有Cy3和用于连接Cy5或pH响应性染料HCyC-646的生物素或四嗪。使用3'-阻断的可逆终止子类似物(3'-O-SS-dATP-7-SS-生物素/Cy3、3'-O-SS-dGTP-7-SS-四嗪/Cy3、3'-O-SS-dTTP-5-SS-四嗪/Cy3、3'-O-SS-dCTP-5-SS-生物素/Cy3)和锚定物结合分子-染料分子(链霉亲和素-Cy5和TCO-HCyC-646)执行单分子能量转移DNA SBS。步骤1，将Therminator IX DNA聚合酶和四种3'-阻断的dNTP类似物中的两种(3'-O-SS-dATP-7-SS-生物素/Cy3和3'-O-SS-dTTP-5-SS-四嗪/Cy3)添加到固定的结合有引物的DNA模板中。步骤2，在洗去任何未掺入的核苷酸之后，将链霉亲和素-Cy5和TCO-HCyC-646一起添加以通过生物素和四嗪锚定物标记dATP和dTTP核苷酸类似物。步骤3，在pH 5下洗涤并激发Cy3之后，由于来自Cy3的能量转移，Cy5和HCyC-646的荧光将揭示那些用3'-O-SS-dATP-7-SS-生物素/Cy3或3'-O-SS-dTTP-5-SS-四嗪/Cy3延伸的引物。步骤4，将Therminator IX DNA聚合酶和剩余的3'-阻断的dNTP类似物(3'-O-SS-dCTP-5-SS-生物素/Cy3和3'-O-SS-dGTP-7-SS-四嗪/Cy3)添加到固定的结合有引物的DNA模板中。步骤5，在洗去任何未掺入的核苷酸之后，再次将链霉亲和素-Cy5和TCO-HCyC-646一起添加以通过生物素和四嗪锚定物标记dCTP和dGTP核苷酸类似物。步骤6，在pH 5下洗涤并激发Cy3之后，由于来自Cy3的能量转移而出现新的Cy5和HCyC-646荧光信号将揭示那些用3'-O-SS-dCTP-5-SS-生物素/Cy3或3'-O-SS-dGTP-7-SS-四嗪/Cy3延伸的引物。步骤7，在pH 9下洗涤之后，为了获得阳性Cy5荧光信号但仅背景HCyC-646荧光，进行第三个成像步骤。在先前确定的dATP或dTTP类似物掺入的情况下，荧光信号的显著减少指示dT，并且剩余的信号指示dA掺入。类似地，在先前确定的dCTP或dGTP类似物掺入的情况下，荧光信号的显著损失指示dG，并且剩余的信号指示dC掺入。步骤8，通过将THP添加到延长的DNA链来切割SS接头，使得可逆终止子类似物上的染料被去除，并且还恢复了其3'-OH基团。DNA产物准备好用于DNA测序反应的下一个循环。图122中呈现了此方案中使用的核苷酸的结构。在每一步骤处的成像动画中，黑色指示阳性Cy5或HCyC-646信号，并且白色指示背景信号。最后的概要动画中的编码指示模板序列，而不是所掺入的核苷酸。
图124：通用的一组用于单分子能量转移SBS的在碱基上具有阻断剂的锚定物和染料标记的核苷酸类似物(虚拟终止子)，所述单分子能量转移SBS使用供体染料和用于连接pH响应性或pH不响应性的染料受体分子的锚定物。所述核苷酸类似物中的两种具有通过SS接头与碱基连接的Cy3和生物素或四嗪锚定物。其它两种核苷酸类似物具有通过偶氮基(N＝N)接头与碱基连接的Cy3和生物素或四嗪锚定物。锚定物结合分子链霉亲和素和TCO分别连接到Cy5和HCyC-646。后者是在低于pH 6时会发出荧光的pH响应性染料。
图125：用于使用在碱基上具有阻断剂的核苷酸类似物(虚拟终止子)(如在图124中呈现的核苷酸类似物)进行单分子能量转移SBS的方案的简化表示。每种类型的核苷酸类似物均具有通过SS或偶氮基接头与碱基连接的Cy3和生物素或四嗪锚定物两者，具有接头和锚定物的所有组合：在A上的SS和生物素、在C上的SS和四嗪、在G上的偶氮基和四嗪以及在T上的偶氮基和生物素。矩形表示含有由所连接的引物-环-模板分子(或其它模板-结合引物布置)组成的单模板DNA分子的基材上的区域，其中模板链中的下一个碱基从左到右是T、G、C或A。用Thermo Sequenase和四种dNTP类似物进行延伸。然后用链霉亲和素-Cy5和TCO-HCyC-646两者执行标记。在pH 5下洗涤之后，由于从Cy3到Cy5或HCyC-646染料的能量转移，Cy3的激发和成像将揭示在所有四个矩形区域中的阳性信号，从而指示A、C、G或T的掺入。在pH 9下洗涤之后，由于HCyC-646荧光的低pH依赖性，Cy3的激发和成像将揭示在第二和第三矩形区域中的荧光损失，从而指示C或G的掺入。由于不具有pH响应性的Cy5而剩余的荧光指示A或T的掺入。用连二亚硫酸钠处理将切割G和T上的偶氮基接头，从而去除连接到这些核苷酸的染料。因此，荧光信号将仅存在于第一和第二矩形区域中。最后，用THP处理以切割掉剩余的染料并恢复这些核苷酸上的3'-OH基团。左侧的1、2和3数字代码表示三个所指示的成像步骤中的每一个成像步骤处的累积信号，即由1指示的阳性信号和由0指示的背景信号。四种可能的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物的掺入将通过独特的数字代码揭示(考虑到所有这三个成像步骤，则111表示A，101表示C，100表示G并且110表示T；或者仅考虑第二个和第三个成像步骤，则11表示A，01表示C，00表示G并且10表示T)。
图126：用于图127的通过正交可切割接头(SS和偶氮基接头)而连接有供体染料(Cy3)和锚定物分子(四嗪或生物素)两者的示例3'-dNTP虚拟终止子类似物以及对应的结合分子(TCO或链霉亲和素)-受体染料(Cy5或HCyc-646)缀合物。
图127A-D：使用一组正交的虚拟终止子类似物进行单分子能量转移边合成边测序，所述一组正交的虚拟终止子类似物含有Cy3和通过SS或偶氮基接头与碱基连接的用于缀合Cy5或pH响应性染料HCyC-646的生物素或四嗪。使用dNTP-阻断剂-可切割接头-锚定物/染料(dATP-7-SS-阻断剂-生物素/Cy3、dTTP-5-SS-阻断剂-偶氮基-生物素/Cy3、dCTP-5-SS-阻断剂-四嗪/Cy3和dGTP-7-SS-阻断剂-偶氮基-四嗪/Cy3)和锚定物结合分子-染料分子(链霉亲和素-Cy5和TCO-HCyC-646)执行单分子能量转移DNA SBS。步骤1，将ThermoSequenaseDNA聚合酶和四种虚拟终止子类似物(dATP-7-SS-阻断剂-生物素/Cy3、dTTP-5-SS-阻断剂-偶氮基-生物素/Cy3、dCTP-5-SS-阻断剂-四嗪/Cy3和dGTP-7-SS-阻断剂-偶氮基-四嗪/Cy3)添加到固定的结合有引物的DNA模板中。步骤2，在洗去任何未掺入的核苷酸之后，将链霉亲和素-Cy5和TCO-HCyC-646一起添加以通过生物素和四嗪锚定物标记核苷酸类似物。步骤3，在pH 5下洗涤并激发Cy3之后，由于来自Cy3的能量转移，Cy5和HCyC-646的荧光将揭示那些用四种虚拟终止子核苷酸类似物中的任一种延伸的引物。步骤4，在pH 9下洗涤并激发Cy3之后，由于来自Cy3的能量转移而产生的荧光信号的显著损失将揭示那些用标记有HCyC-646的dC或dG核苷酸类似物延伸的引物，而由于Cy5而剩余的荧光将指示dA和dT核苷酸类似物的掺入。步骤5，将染料和锚定物连接到dG和dT核苷酸类似物上的碱基的接头中的偶氮基的切割将使得这些核苷酸上的染料被去除。步骤6，激发Cy3，并对Cy5或HCyC-646荧光进行成像。在先前确定的dATP或dTTP类似物掺入的情况下，荧光信号的显著减少指示dT，并且剩余的信号指示dA掺入。类似地，在先前确定的dCTP或dGTP类似物掺入的情况下，荧光信号的显著损失指示dG，并且剩余的信号指示dC掺入。步骤7，通过将THP添加到延长的DNA链来切割SS接头，使得可逆终止子类似物上的染料被去除，并且还恢复了其3'-OH基团。DNA产物准备好用于DNA测序反应的下一个循环。图126中呈现了此方案中使用的核苷酸的结构。在每一步骤处的成像动画中，黑色指示阳性Cy5或HCyC-646信号，并且白色指示背景信号。最后的概要动画中的编码指示模板序列，而不是所掺入的核苷酸。
图128：通用的一组用于单分子能量转移SBS的锚定物和染料标记的可切割3'-阻断的dNTP类似物(可逆终止子)，所述单分子能量转移SBS使用供体染料和用于连接pH响应性或pH不响应性的染料受体分子的锚定物。所述核苷酸类似物中的两种具有通过SS接头与碱基连接的Cy3和生物素或四嗪锚定物。其它两种核苷酸类似物具有通过偶氮基(N＝N)接头与碱基连接的Cy3和生物素或四嗪锚定物。锚定物结合分子链霉亲和素和TCO分别连接到Cy5和HCyC-646。后者是在低于pH 6时会发出荧光的pH响应性染料。
图129：用于使用可切割3'-阻断的核苷酸类似物(如在图128中所呈现的可切割3'-阻断的核苷酸类似物)进行单分子能量转移SBS的方案的简化表示。每种类型的dNTP均具有通过SS或偶氮基接头与碱基连接的Cy3和生物素或四嗪锚定物两者，具有接头和锚定物的所有组合：在A上的SS和生物素、在C上的SS和四嗪、在G上的偶氮基和四嗪以及在T上的偶氮基和生物素。矩形表示含有由所连接的引物-环-模板分子(或其它模板-结合引物布置)组成的单模板DNA分子的基材上的区域，其中模板链中的下一个碱基从左到右是T、G、C或A。用Therminator IX和四种dNTP类似物进行延伸。然后用链霉亲和素-Cy5和TCO-HCyC-646两者执行标记。在pH 5下洗涤之后，由于从Cy3到Cy5或HCyC-646染料的能量转移，Cy3的激发和成像将揭示在所有四个矩形区域中的阳性信号，从而指示A、C、G或T的掺入。在pH 9下洗涤之后，由于HCyC-646荧光的低pH依赖性，Cy3的激发和成像将揭示在第二和第三矩形区域中的荧光损失，从而指示C或G的掺入。由于不具有pH响应性的Cy5而剩余的荧光指示A或T的掺入。用连二亚硫酸钠处理将切割G和T上的偶氮基接头，从而去除连接到这些核苷酸的染料。因此，荧光信号将仅存在于第一和第二矩形区域中。最后，用THP处理以切割掉剩余的染料并恢复这些核苷酸上的3'-OH基团。左侧的1、2和3数字代码表示三个所指示的成像步骤中的每一个成像步骤处的累积信号，即由1指示的阳性信号和由0指示的背景信号。四种可能的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物的掺入将通过独特的数字代码揭示(考虑到所有这三个成像步骤，则111表示A，101表示C，100表示G并且110表示T；或者仅考虑第二个和第三个成像步骤，则11表示A，01表示C，00表示G并且10表示T)。
图130：用于图131的通过正交可切割接头(SS和偶氮基接头)而连接有供体染料(Cy3)和锚定物分子(四嗪和生物素)两者的示例3'-SS-dNTP可逆终止子类似物以及对应的结合分子(TCO或链霉亲和素)-受体染料(Cy5或HCyc-646)缀合物。
图131A-D：使用一组正交的核苷酸可逆终止子类似物进行基于单分子能量转移的边合成边测序，所述一组正交的核苷酸可逆终止子类似物含有Cy3和通过SS或偶氮基接头与碱基连接的用于缀合Cy5或pH响应性染料HCyC-646的生物素或四嗪。使用3'-阻断的可逆终止子类似物(3'-O-SS-dATP-7-SS-生物素/Cy3、3'-O-SS-dGTP-7-偶氮基-四嗪/Cy3、3'-O-SS-dTTP-5-偶氮基-四嗪/Cy3、3'-O-SS-dCTP-5-SS-四嗪/Cy3)和锚定物结合分子-染料分子(链霉亲和素-Cy5和TCO-HCyC-646)执行单分子能量转移DNA SBS。步骤1，将Therminator IX DNA聚合酶和四种3'-阻断的dNTP类似物(3'-O-SS-dATP-7-SS-生物素/Cy3、3'-O-SS-dGTP-7-偶氮基-四嗪/Cy3、3'-O-SS-dTTP-5-偶氮基-生物素/Cy3和3'-O-SS-dCTP-5-SS-四嗪/Cy3)添加到固定的结合有引物的DNA模板中。步骤2，在洗去任何未掺入的核苷酸之后，将链霉亲和素-Cy5和TCO-HCyC-646一起添加以通过生物素和四嗪锚定物标记核苷酸可逆终止子类似物。步骤3，在pH 5下洗涤并激发Cy3之后，由于来自Cy3的能量转移，Cy5和HCyC-646的荧光将揭示用四种核苷酸可逆终止子核苷酸类似物中的任一种延伸的引物。步骤4，在pH 9下洗涤并激发Cy3之后，由于来自Cy3的能量转移而产生的荧光信号的显著损失将揭示那些用标记有HCyC-646的dC或dG核苷酸类似物延伸的引物，而由于Cy5而剩余的荧光将指示dA和dT核苷酸类似物的掺入。步骤5，将染料和锚定物连接到dG和dT核苷酸类似物上的碱基的接头中的偶氮基的切割将使得这些核苷酸上的染料被去除。步骤6，激发Cy3，并对Cy5或HCyC-646荧光进行成像。在先前确定的dATP或dTTP类似物掺入的情况下，荧光信号的显著减少指示dT，并且剩余的信号指示dA掺入。类似地，在先前确定的dCTP或dGTP类似物掺入的情况下，荧光信号的显著损失指示dG，并且剩余的信号指示dC掺入。步骤7，通过将THP添加到延长的DNA链来切割SS接头，使得可逆终止子类似物上的染料被去除，并且还恢复了其3'-OH基团。DNA产物准备好用于DNA测序反应的下一个循环。图130中呈现了此方案中使用的核苷酸的结构。在每一步骤处的成像动画中，黑色指示阳性Cy5或HCyC-646信号，并且白色指示背景信号。最后的概要动画中的编码指示模板序列，而不是所掺入的核苷酸。
图132：通用的一组用于使用pH响应性染料的单色SBS的染料标记的可切割可逆终止子：核苷酸类似物中的两种具有通过SS接头与碱基连接的Cy5，并且其它两种具有通过SS接头与碱基连接的HCyC-646。HCyC-646是在低于pH 6时会发出荧光的pH响应性染料。这种杂交SBS方法的要求是单独的一组四种未标记的可逆终止子(例如，3'-O-叠氮基甲基dNTP)。
图133：用于使用可切割核苷酸类似物(如在图132中所呈现的可切割核苷酸类似物)进行单色SBS的方案的简化表示。每种类型的可逆核苷酸均具有通过SS接头连接的以下中的一种：Cy5或HCyC-646。矩形表示含有所连接的引物-环-模板分子(或其它模板-结合引物布置)的许多拷贝的基材上的区域，其中模板链中的下一个碱基从左到右是T、G、C或A。用Therminator IX和dNTP类似物中的两种(即，通过SS接头与HCyC-646连接的3'-tBu-dATP和通过SS接头与Cy5连接的3'-tBu-dCTP)以及用于提高保真度的少量的3'-O-叠氮基甲基-dGTP和3'-O-叠氮基甲基-dTTP进行延伸。在pH 5下洗涤之后，由于Cy5或HCyC-646荧光，成像将揭示在第一和第二矩形区域中的阳性信号，从而指示A或C的掺入。接下来，与通过SS接头与Cy5连接的3'-tBu-dGTP、通过SS接头与HCyC-646连接的3'-tBu-dTTP、用于提高保真度的3'-O-叠氮基甲基-dATP和3'-O-叠氮基甲基-dCTP一起温育并在pH 5下洗涤将在第三和第四矩形区域中产生新的阳性信号，从而指示G或T掺入。在pH 9下洗涤之后，由于HCyC-646能够在低于pH 6下发出荧光，但在pH 9下不发出荧光，成像将揭示在第一和第四矩形区域中的阳性信号的损失。因此，如果先前确定掺入了A或C，则荧光损失将指示A的掺入，并且如果先前确定掺入了G或T，则荧光损失将指示T的掺入。剩余的荧光分别指示C和G的掺入。最后，用THP处理以切割掉剩余的染料并去除任何用NRT延伸的引物上的叠氮基甲基基团以为下一个测序循环做准备。左侧的1、2和3数字代码表示所指示的成像步骤中的每一个成像步骤处的累积信号，即由1指示的阳性信号和由0指示的背景信号。四种可能的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物的掺入将通过考虑到所有这三个成像步骤的独特的数字代码揭示(110表示A，111表示C，011表示G并且010表示T)。
图134：用于图133的可逆终止子的示例结构。
图135A-D：使用一组荧光3'-叔丁基-SS核苷酸类似物进行单色边合成边测序，所述类似物含有Cy5或HCyC-646。使用3'-tBu-SS-dNTP-可切割接头-染料(3'-tBu-SS-dATP-7-SS-HCyC-646、3'-tBu-SS-dCTP-5-SS-Cy5、3'-tBu-SS-dGTP-7-SS-Cy5、3'-tBu-SS-dTTP-5-SS-HCyC-646)和3'-O-叠氮基甲基-dNTP(3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP、3'-O-叠氮基甲基-dTTP)执行单色DNA SBS。步骤1，将Therminator IX DNA聚合酶、3'-叔丁基-SS-dNTP-可切割接头-染料中的两种(3'-tBu-SS-dATP-7-SS-HCyC-646和3'-tBu-SS-dCTP-5-SS-Cy5)以及用于提高保真度的少量的3'-O-叠氮基甲基-dGTP和3'-O-叠氮基甲基-dTTP添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够掺入3'-tBu-SS-dATP-7-SS-HCyC-646和3'-tBu-SS-dCTP-5-SS-Cy5或3'-O-叠氮基甲基-dNTP以终止DNA合成。步骤2，在pH 5下洗去未掺入的核苷酸类似物之后，针对Cy5或dCTP-646荧光的成像(所述两种染料吸收和发射彼此波长基本上相同的光)将揭示那些用3'-tBu-SS-dATP-7-SS-HCyC-646和3'-tBu-SS-dCTP-5-SS-Cy5延伸的引物。步骤3，将Therminator IX DNA聚合酶、剩余的两种3'-叔丁基-SS-可切割接头-染料(3'-tBu-SS-dGTP-7-SS-Cy5和3'-tBu-SS-dTTP-5-SS-HCyC-646)以及用于提高保真度的3'-O-叠氮基甲基-dATP和3'-O-叠氮基甲基-dCTP添加到固定的结合有引物的DNA模板中使得能够掺入3'-tBu-SS-dGTP-7-SS-Cy5和3'-tBu-SS-dTTP-5-SS-HCyC-646或3'-O-叠氮基甲基-dNTP。步骤4，在pH 5下洗去未掺入的核苷酸之后，执行第二个成像步骤以揭示Cy5或HCyC-646荧光，并且新的荧光信号将证实G或T的掺入。步骤5，在pH 9下洗涤以减少3'-tBu-SS-dATP-7-SS-HCyC-646或3'-tBu-SS-dTTP-5-SS-HCyC-646上的HCyC-646染料的荧光之后，第三个成像步骤将揭示哪种核苷酸被掺入。因此，如果在成像步骤1中确定添加了A或C，则荧光信号的损失指示A的掺入，并且剩余信号指示C的掺入。如果在成像步骤2中确定添加了G或T，则荧光信号的损失指示T的掺入，并且剩余信号指示G的掺入。此时或恰好在此之前，用四种3'-O-叠氮基甲基dNTP执行追加延伸步骤以确保几乎每个引物都已经用染料标记的3'-SS-dNTP或NRT类似物中的一种进行了延伸，尤其是在第一次和第二次延伸反应中未添加3'-O-叠氮基甲基dNTP的情况下。步骤6，通过将THP添加到延长的DNA链来切割SS接头，使得核苷酸类似物上的染料被去除，并且还恢复了用3'-O-叠氮基甲基-dNTP延伸的任何增长的链上的3'-OH基团。DNA产物准备好用于DNA测序反应的下一个循环。图134中呈现了此方案中使用的核苷酸的结构。在每一步骤处的成像动画中，黑色指示阳性荧光信号，并且白色指示背景信号。最后的概要动画中的编码指示模板序列，而不是所掺入的核苷酸。
图136：使用3'-tBu-SS-dATP-7-SS-HCyC-646、3'-tBu-SS-dCTP-5-SS-Cy5、3'-tBu-SS-dGTP-7-SS-Cy5、3'-tBu-SS-dTTP-5-SS-HCyC-646以及四种3'-O-叠氮基甲基dNTP进行二十个连续的边合成边测序循环。针对20个连续循环执行图133和135中所描述的程序，其中模板和引物在图顶部示出。然而，在步骤1和3中未添加3'-O-叠氮基甲基-dNTP，只是在步骤6中的追加延伸期间添加。每个循环中的白色条柱表示用第一2种核苷酸类似物(3'-tBu-SS-dATP-7-SS-HCyC-646和3'-tBu-SS-dCTP-5-SS-Cy5)进行延伸和pH 5洗涤后的荧光结果，黑色条柱表示用第二2种核苷酸类似物(3'-tBu-SS-dGTP-7-SS-Cy5和3'-tBu-SS-dTTP-5-SS-HCyC-646)进行延伸和pH 5洗涤后的荧光结果，并且阴影条柱表示pH 9洗涤后的荧光结果。获得了预期的编码(010表示T，011表示G，111表示C并且110表示A)，从而指示每个循环处的成功测序。在每个循环结束时，用THP处理会使荧光达到背景水平(未示出)。注意，在循环4和5中，用3'-tBu-SS-dGTP-7-SS-Cy5和3'-tBu-SS-dTTP-5-SS-HCyC-646进行第一次延伸，并且用3'-tBu-SS-dATP-7-SS-HCyC-646和3'-tBu-SS-dCTP-5-SS-Cy5进行第二次延伸。这与其它18个循环中的添加顺序相反，并且使得循环4和5的编码不同(010表示A，011表示C，111表示G并且110表示T)。
具体实施方式
目前广泛使用的高通量SBS技术(Bentley等人2008)使用先前开发的可切割荧光核苷酸可逆终止子(NRT)测序化学(Ju等人2003；Ju等人2006)。这些可切割荧光NRT是基于以下原理设计的：通过将独特的可切割荧光团连接到碱基的特定位置并用小的可逆部分对3'-OH基团进行封端来修饰四种核苷酸(A、C、G、T)中的每种核苷酸，使得其仍然被DNA聚合酶识别为底物。因此，可切割荧光NRT涉及两个位点修饰(Ju等人2003；Ju等人2006)：充当碱基上的报告基团的荧光染料和对3'-OH基团进行封端以在核苷酸并入后暂时终止聚合酶反应以进行序列测定的小的化学部分。在掺入和信号检测之后，荧光团被切割并且3'-OH封端部分被去除，以在下一个循环中恢复聚合酶反应。这些可切割荧光NRT已被证明是重新工程化的聚合酶的良好底物，并且已广泛用于下一代DNA测序系统(Ju等人2006；Bentley等人2008)。此外，所述可切割荧光NRT使得能够准确测定均聚物序列，因为在每个循环中鉴定了仅一个碱基。
使用可切割荧光核苷酸类似物作为可逆终止子对表面固定的DNA进行测序的SBS方法已经被使用(Ju等人2003；Li等人2003；Ruparel等人2005；Ju等人2006；Wu等人2007；Guo等人2008)。在此方法中，核苷酸在两个特定位置处被修饰，使得其仍被DNA聚合酶识别为底物：(i)具有不同荧光发射的不同荧光团通过可切割接头连接到四种碱基中的每一种碱基的特定位置，并且(ii)3'-OH基团被小的化学可逆部分封端。DNA聚合酶仅掺入与共价连接到表面的DNA模板上的碱基互补的单核苷酸类似物。掺入后，检测到独特的荧光发射以鉴定掺入的核苷酸。随后去除荧光团并且以化学方式再生3′-OH基团，这使得能够进行聚合酶反应的下一个循环。因为DNA芯片上的大表面可以具有高密度的不同的点状DNA模板，因此每个循环可以并行鉴别许多碱基，从而实现大量DNA分子的同时测序。先前研究成果已牢固地确立SBS的分子级策略，其通过将可切割荧光染料连接到碱基并且用小型部分以可逆方式封端3'-OH来合理地修饰核苷酸。
已经报道了一类具有未经保护的3'-OH和在碱基与荧光染料之间连接的可切割二硫键接头的核苷酸类似物(Turcatti等人2008；Mitra等人2003)。然而，在引物/模板上进行DNA聚合酶催化的延伸反应并对掺入的碱基进行成像之后，二硫键的切割会产生游离的反应性-SH基团，在可以进行第二次延伸反应之前，所述基团必须用烷基化剂碘乙酰胺封端。这一封端步骤不仅在过程中增加额外步骤，而且由于核苷酸碱基部分上的长残留尾区而限制连续添加多个核苷酸。在此方法中，测序读段长度仅限于10个碱基(Turcatti等人2008)。其它基于二硫化物的方法需要类似的封端反应以使游离的SH基团不具有反应性(Mitra等人2003)。
本发明提供了一种核苷酸类似物，其具有以下结构：
其中：
碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或其类似物；
可切割接头包括DTM、偶氮基、2-硝基苄基、烯丙基、叠氮基甲基或TCO衍生物并通过嘧啶(C、U)的5位置或去氮嘌呤(A、G、I)的7位置连接到所述碱基；并且
标记包括荧光染料、pH响应性荧光染料、荧光染料簇、pH响应性荧光染料簇、用于染料连接的锚定物、用于染料连接的锚定物簇、或锚定物和染料。
本发明提供了一种核苷酸类似物，其具有以下结构：
其中：
碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或其类似物；
R包括甲基、乙基、丙基、叔丁基、芳基、烷基芳基；
可切割接头包括DTM、偶氮基、2-硝基苄基、烯丙基、叠氮基甲基或TCO衍生物；并且
标记包括荧光染料、pH响应性荧光染料、荧光染料簇、pH响应性荧光染料簇、用于连接荧光染料的锚定物、用于连接荧光染料的锚定物簇、或锚定物和染料。
本发明提供了一种核苷酸类似物，其具有以下结构：
其中：
碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或其类似物；
可切割接头包括DTM、偶氮基、2-硝基苄基、烯丙基、叠氮基甲基或TCO衍生物或这些可切割接头中的多于一个可切割接头，包含其中一个可切割接头存在于所述碱基与阻断剂之间并且第二个不同的可切割接头存在于所述阻断剂与标记之间的特殊情况；
阻断剂是包括无碱基糖或经修饰的核苷或其组合的2-50个单体单元的核苷酸或寡核苷酸；并且阻断剂通过可切割接头连接到嘧啶(C、U)的5位置和去氮嘌呤(A、G、I)的7位置；
其中阻断剂是在掺入之后防止另外的核苷酸或核苷酸类似物进一步掺入到引物链中的部分；并且
标记包括荧光染料、pH响应性荧光染料、荧光染料簇、pH响应性荧光染料簇、用于连接荧光染料的锚定物、用于连接荧光染料的锚定物簇、或锚定物和染料，其中所述标记连接到所述阻断剂。
本发明提供了一种核苷酸类似物，其具有以下结构：
其中：
碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、次黄嘌呤或其类似物；并且
R是可切割化学基团，所述可切割化学基团包括烷基DTM、偶氮基、2-硝基苄基、烯丙基和叠氮基甲基衍生物。
本发明提供了一种核苷酸类似物，其具有以下结构：
其中：
碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或其类似物；并且
标记包括荧光染料、pH响应性荧光染料、荧光染料簇、pH响应性荧光染料簇、用于染料连接的锚定物、用于染料连接的锚定物簇、或锚定物和染料。
本发明提供了一种核苷酸类似物，其具有以下结构：
其中碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或其类似物。
本发明提供了一种核苷酸类似物，其具有以下结构：
其中：
碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或其类似物；
标记包括荧光染料、pH响应性荧光染料、荧光染料簇、pH响应性荧光染料簇、用于染料连接的锚定物、用于染料连接的锚定物簇、或锚定物和染料；并且
R包括甲基、乙基、丙基、叔丁基、芳基、烷基芳基。
本发明提供了一种核苷酸类似物，其具有以下结构：
其中：
碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或其类似物；并且
R包括甲基、乙基、丙基、叔丁基、芳基、烷基芳基。
本发明提供了一种核苷酸类似物，其具有以下结构：
其中碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或其类似物。
本发明提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板和核酸聚合酶，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列；
b)使所述核酸模板与两种不同的经标记的核苷酸类似物接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，以及(B)锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，所述锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的锚定物，
其中所述可切割接头可由相同的切割剂切割；
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(B)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，
其中所述可切割接头和所述3'-OH基团可由相同的切割剂切割；或者
(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(B)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，
其中所述可切割接头可由相同的切割剂切割；
c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)鉴定由于掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)使来自步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物与锚定物结合基团接触，所述锚定物结合基团结合到步骤(b)的所提供的锚定物标记的核苷酸类似物的所述锚定物，其中所述锚定物结合基团包括与步骤(b)的所述荧光标记的核苷酸类似物的所述荧光标记相同的荧光标记；
f)鉴定由于所述锚定物结合基团与步骤(b)的任何掺入的锚定物标记的核苷酸类似物的所述锚定物的结合而产生的任何荧光信号；
g)用两种不同的经标记的核苷酸类似物重复步骤(b)-(f)，所述两种不同的经标记的核苷酸类似物不同于来自步骤(b)的先前迭代的所述两种不同的经标记的核苷酸类似物；
h)从所掺入的核苷酸类似物中切割所述可切割接头，由此从步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物中去除任何标记、锚定物或阻断基；
i)从来自步骤(c)的任何掺入的核苷酸类似物中切割所述3'-O阻断基；以及
j)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(i)，
由此获得所述核酸的序列。
在一个实施例中，步骤(b)的核苷酸类似物选自由图3、图7或图11的核苷酸类似物组成的组。
本发明提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列，并且提供核酸聚合酶；
b)使所述核酸模板与四种不同的经标记的核苷酸类似物(A、C、T、G)接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，(B)pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，(C)两种不同的锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，其中每种类似物包括通过可切割接头与碱基连接的不同锚定物，
其中所述可切割接头可由相同的切割剂切割；
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，和(B)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(C)两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物，所述两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中每种类似物包括通过可切割接头与所述碱基连接的不同锚定物，
其中所述可切割接头和所述3'-O阻断基可由相同的切割剂切割；或者
(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(C)两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物，所述两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中每种类似物包括通过可切割接头与所述碱基连接的不同锚定物，
其中所述可切割接头可由相同的切割剂切割；
c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)在所述pH响应性荧光标记具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)使来自步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物与以下接触：(A)与步骤(b)的所述锚定物标记的核苷酸类似物中的仅一种锚定物标记的核苷酸类似物的所述锚定物结合的锚定物结合基团，其中所述锚定物结合基团包括与步骤(b)的所述荧光标记的核苷酸类似物相同的荧光标记；以及(B)仅与剩余的锚定物标记的核苷酸类似物的所述锚定物结合的锚定物结合基团，其中所述锚定物结合基团包括与步骤(b)的所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物相同的pH响应性荧光标记；
f)在所述pH响应性荧光标记具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的锚定物标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
g)在所述pH响应性荧光标记不再具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗涤来自步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
h)从所掺入的核苷酸类似物中切割所述可切割接头，由此从步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物中去除任何标记、锚定物或阻断基；
i)从来自步骤(c)的任何掺入的核苷酸类似物中切割所述3'-O阻断基；以及
j)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(i)，
由此获得所述核酸的序列。
在一个实施例中，步骤(b)的核苷酸类似物选自由图15、图18或图19的核苷酸类似物组成的组。在一个实施例中，所述具有pH响应性荧光的标记是HCyC-646，并且具有pH不响应性荧光的标记是Cy5。
本发明提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板和核酸聚合酶，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列；
b)使所述核酸模板与两种不同的经标记的核苷酸类似物接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，以及(B)pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，
其中所述可切割接头可由相同的切割剂切割；
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(B)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，
其中所述可切割接头和所述3'-O阻断基可由相同的切割剂切割；或者
(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(B)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述可切割接头可由相同的切割剂切割；
c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)在所述pH响应性荧光标记具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)用两种不同的经标记的核苷酸类似物重复步骤(b)-(d)，所述两种不同的经标记的核苷酸类似物不同于来自步骤(b)的先前迭代的所述两种不同的经标记的核苷酸类似物；
f)在所述pH响应性荧光标记具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
其中步骤(e)和(f)可以以相反的顺序执行；
g)从所掺入的核苷酸类似物中切割所述可切割接头，由此从步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物中去除任何标记或阻断基；
h)从来自步骤(c)的任何掺入的核苷酸类似物中切割所述3'-O阻断基；以及
i)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(h)，
由此获得所述核酸的序列。
在一个实施例中，步骤(b)的核苷酸类似物选自由图78的核苷酸类似物组成的组。在一个实施例中，所述具有pH响应性荧光的标记是HCyC-646，并且具有pH不响应性荧光的标记是Cy5。
本发明提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板和核酸聚合酶，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列；
b)使所述核酸模板与四种不同的经标记的核苷酸类似物接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过第一可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，(B)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的荧光标记，(C)锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，所述锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头与所述碱基连接的锚定物，以及(D)锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，所述锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的锚定物；
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过第一可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头与所述碱基连接的锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述3'-O阻断基和所述第一可切割接头可由相同的切割剂切割；或者
(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过第一可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基、通过第一可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基、通过氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，
其中每种类似物上的所述荧光标记是相同的，
其中每种类似物上的所述锚定物是相同的；
c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)鉴定由于掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)使来自步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物与锚定物结合基团接触，所述锚定物结合基团结合到步骤(b)的所提供的锚定物标记的核苷酸类似物的所述锚定物，其中所述锚定物结合基团包括与步骤(b)的所述荧光标记的核苷酸类似物的所述荧光标记相同的荧光标记；
f)鉴定由于所述锚定物结合基团与步骤(b)的任何掺入的锚定物标记的核苷酸类似物的所述锚定物的结合而产生的任何荧光信号；
g)使所掺入的核苷酸类似物与四嗪衍生物接触以点击所述氨甲酰基TCO接头的TCO部分以释放通过氨甲酰基TCO接头连接的任何标记或锚定物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
h)使所掺入的核苷酸类似物与切割所述第一可切割接头和任何3'-O阻断基的切割剂接触；以及
i)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(h)，
由此获得所述核酸的序列。
在一个实施例中，步骤(b)的核苷酸类似物选自由图34的核苷酸类似物组成的组。
本发明提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板和核酸聚合酶，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列；
b)使所述核酸模板与四种不同的经标记的核苷酸类似物接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，(B)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基以及通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记和第一锚定物，(C)锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，所述锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基以及通过可切割接头与所述碱基连接的所述第一锚定物和第二锚定物，以及(D)锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，所述锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的所述第二锚定物，其中所述可切割接头能由相同的切割剂切割；
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记和第一锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述可切割接头与所述碱基连接的所述第一锚定物和第二锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的所述第二锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述可切割接头和所述3'-O阻断基可由相同的切割剂切割；或者
(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基以及在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记和第一锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基以及在所述阻断基的远端与所述碱基连接的所述第一锚定物和第二锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链，以及(D)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的所述第二锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述可切割接头可由相同的切割剂切割，
其中每种类似物上的所述荧光标记是相同的；
c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)鉴定由于掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)使来自步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物与锚定物结合基团接触，所述锚定物结合基团结合到步骤(b)的所述核苷酸类似物的所述第二锚定物，其中所述锚定物结合基团包括与步骤(b)的所述荧光标记的核苷酸类似物的荧光标记相同的荧光标记；
f)鉴定由于所述锚定物结合基团与步骤(b)的任何掺入的核苷酸类似物的所述锚定物的结合而产生的任何荧光信号；
g)使所掺入的核苷酸类似物与第二锚定物结合基团接触，所述第二锚定物结合基团结合到步骤(b)的所述核苷酸类似物的所述第一锚定物并且包括使与所述锚定物结合基团连接到的所述核苷酸类似物连接的任何荧光标记的所述荧光信号猝灭的部分，并且鉴定由于掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
h)使所掺入的核苷酸类似物与切割所述可切割接头和任何3'-O阻断基的切割剂接触；以及
i)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(h)，
由此获得所述核酸的序列。
在一个实施例中，步骤(b)的核苷酸类似物选自由图38、图42或图46的核苷酸类似物组成的组。
本发明提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板和核酸聚合酶，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列；
b)使所述核酸模板与四种不同的经标记的核苷酸类似物接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过第一可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，(B)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头和在所述第一可切割接头的远端连接的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的荧光标记，(C)锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，所述锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头和在所述第一可切割接头的远端连接的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的锚定物，以及(D)锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，所述锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头与所述碱基连接的锚定物；
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过第一可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头和在所述第一可切割接头的远端连接的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头与所述碱基连接的锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头和在所述第一可切割接头的远端连接的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述3'-OH阻断基和所述第一可切割接头可由相同的试剂切割；或者
(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过第一可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过所述第一可切割接头与所述碱基连接的阻断基和通过所述阻断基远端的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基、通过第一可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基、通过所述第一可切割接头与所述碱基连接的阻断基和通过所述阻断基远端的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，
其中每种类似物上的所述荧光标记是相同的，
其中每种类似物上的所述锚定物是相同的；
c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)鉴定由于在步骤(b)中掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)使来自步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物与锚定物结合基团接触，所述锚定物结合基团结合到步骤(b)的所提供的锚定物标记的核苷酸类似物的所述锚定物，其中所述锚定物结合基团包括与步骤(b)的所述荧光标记的核苷酸类似物的所述荧光标记相同的荧光标记；
f)鉴定由于所述锚定物结合基团与步骤(b)的任何掺入的锚定物标记的核苷酸类似物的所述锚定物的结合而产生的任何荧光信号；
g)使所掺入的核苷酸类似物与四嗪衍生物接触以点击所述氨甲酰基TCO接头的TCO部分以释放通过氨甲酰基TCO接头连接的任何标记或锚定物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
h)使所掺入的核苷酸类似物与切割所述第一可切割接头和任何3'-O阻断基的切割剂接触；以及
i)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(h)，
由此获得所述核酸的序列。
在一个实施例中，步骤(b)的核苷酸类似物选自由图54、图58或图62的核苷酸类似物组成的组。
本发明提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板和核酸聚合酶，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列；
b)使所述核酸模板与四种不同的经标记的核苷酸类似物接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过第一可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，(B)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头和在所述第一可切割接头的远端连接的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的荧光标记，(C)pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头和在所述第一可切割接头的远端连接的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，以及(D)pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记；
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过第一可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头和在所述第一可切割接头的远端连接的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头和在所述第一可切割接头的远端连接的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述3'-OH阻断基和所述第一可切割接头可由相同的试剂切割；或者
(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过第一可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过所述第一可切割接头与所述碱基连接的阻断基和通过所述阻断基远端的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物核苷酸类似物包括碱基、通过第一可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过所述第一可切割接头与所述碱基连接的阻断基和通过所述阻断基远端的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，
c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)在所述pH响应性荧光标记不具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)在所述pH响应性荧光标记具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号，其中步骤(d)和(e)可以以相反的顺序执行；
f)使所掺入的核苷酸类似物与四嗪接触以点击所述氨甲酰基TCO接头的TCO部分以释放通过氨甲酰基TCO接头连接的任何标记；
g)在所述pH响应性荧光标记具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
h)使所掺入的核苷酸类似物与切割所述第一可切割接头和任何3'-O阻断基的切割剂接触；以及
i)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(h)，
由此获得所述核酸的序列。
在一个实施例中，步骤(b)的核苷酸类似物选自由图66、图70或图74的核苷酸类似物组成的组。在一个实施例中，所述具有pH响应性荧光的标记是HCyC-646，并且具有pH不响应性荧光的标记是Cy5。
本发明提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板和核酸聚合酶，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列；
b)使所述核酸模板与四种不同的经标记的核苷酸类似物接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，(B)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基以及通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记和锚定物，(C)pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，以及(D)pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基以及通过可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记和锚定物，其中所述可切割接头可由相同的切割剂切割；
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记和锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记和锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述可切割接头和所述3'-O阻断基可由相同的切割剂切割；或者
(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基以及在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记和锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基以及在所述阻断基的远端与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基以及在所述阻断基的远端与所述碱基连接的pH响应性荧光标记和锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述可切割接头可由相同的切割剂切割，
c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)在所述pH响应性荧光标记不具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)在所述pH响应性荧光标记具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号，其中步骤(d)和(e)可以以相反的顺序执行；
f)使来自步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物与锚定物结合基团接触，所述锚定物结合基团结合到步骤(b)的所述核苷酸类似物的所述锚定物，其中所述锚定物结合基团包括使步骤(b)的所述荧光标记的核苷酸类似物的所述荧光标记猝灭的部分；
g)在所述pH响应性荧光标记具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未结合的包括猝灭部分的锚定物结合基团，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
h)使所掺入的核苷酸类似物与切割所述可切割接头和任何3'-O阻断基的切割剂接触；以及
i)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(h)，
由此获得所述核酸的序列。
在一个实施例中，步骤(b)的核苷酸类似物选自由图50或图82的核苷酸类似物组成的组。在一个实施例中，所述具有pH响应性荧光的标记是HCyC-646，并且具有pH不响应性荧光的标记是Cy5。
本发明提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板和核酸聚合酶，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列；
b)使所述核酸模板与两种不同的经标记的核苷酸类似物接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，以及(B)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基以及通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记和锚定物，其中所述可切割的接头可由相同的切割剂切割；
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记和锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述可切割接头和所述3'-O阻断基可由相同的切割剂切割；或者
(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基以及在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记和锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述可切割接头可由相同的切割剂切割，
c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)鉴定由于掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)用两种不同的经标记的核苷酸类似物重复步骤(b)-(d)，所述两种不同的经标记的核苷酸类似物不同于来自步骤(b)的先前迭代的所述两种不同的经标记的核苷酸类似物；
f)使来自步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物与锚定物结合基团接触，所述锚定物结合基团结合到步骤(b)的所述核苷酸类似物的所述锚定物，其中所述锚定物结合基团包括使步骤(b)的所述荧光标记的核苷酸类似物的所述荧光标记猝灭的部分；
g)鉴定由于在步骤(b)中掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
h)从所掺入的核苷酸类似物中切割所述可切割接头，由此从步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物中去除任何标记、锚定物或阻断基；
i)从来自步骤(c)的任何掺入的核苷酸类似物中切割所述3'-O阻断基；以及
j)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(i)，
由此获得所述核酸的序列。
在一个实施例中，步骤(b)的核苷酸类似物选自由图86的核苷酸类似物组成的组。
本发明提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列，并且提供核酸聚合酶；
b)使所述核酸模板与四种不同的经标记的核苷酸类似物(A、C、T、G)接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，(B)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过不可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，(C)锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，所述锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的锚定物，以及(D)锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，所述锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过不可切割接头与所述碱基连接的锚定物；
c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)鉴定由于在步骤(b)中掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)使来自步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物与锚定物结合基团接触，所述锚定物结合基团结合到步骤(b)的所述锚定物标记的核苷酸类似物的所述锚定物；
f)鉴定由于在步骤(b)中掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
g)使步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物与切割步骤(b)的所述核苷酸类似物的所述可切割接头并切割步骤(c)的所述核苷酸类似物的所述3'-O阻断基的试剂接触；
h)鉴定由于在步骤(b)中掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
i)光漂白步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物以由此光漂白任何剩余的荧光标记；以及
j)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(i)，
由此获得所述核酸的序列。
在一个实施例中，步骤(b)的核苷酸类似物选自由图28的核苷酸类似物组成的组。在一个实施例中，步骤(c)在步骤(b)之前发生。在一个实施例中，步骤(c)在步骤(b)之后发生。在一个实施例中，将在步骤(c)中添加的所述核苷酸类似物掺入到大于90％的所述核酸模板的引物中。在一个实施例中，将在步骤(c)中添加的所述核苷酸类似物掺入到大于95％的所述核酸模板的引物中。
在一个实施例中，如果存在锚定物，则所述锚定物包括生物素、TCO、四嗪或DBCO，并且对应的锚定物结合分子包括链霉亲和素、叠氮化物、四嗪和TCO。在一个实施例中，所述荧光染料包括包含黄嘌呤、花青和ATTO染料的有机染料、量子点以及有机染料和量子点的簇。
本发明提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板和核酸聚合酶，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列；
b)使所述核酸模板与两种不同的经标记的核苷酸类似物接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，以及(B)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的不同的荧光标记，其中所述可切割接头可由相同的切割剂切割；
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的不同的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述可切割接头和所述3'-O阻断基可由相同的切割剂切割；或者
(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基以及在所述阻断基的远端与所述碱基连接的不同的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述可切割接头可由相同的切割剂切割；
c)使所述核酸模板与不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的未标记的核苷酸类似物(A、C、T、G)接触，其中所述3'-O阻断基能由与步骤(b)的所述两种经标记的核苷酸类似物的所述可切割接头和/或所述阻断基相同的切割剂切割，并且用所述未标记的核苷酸类似物延伸任何未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)鉴定由于掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)用不同于来自步骤(b)的先前迭代的所述两种不同的经标记的核苷酸类似物的两种不同的经标记的核苷酸类似物重复步骤(b)-(d)，但仅使用与此步骤中添加的所述两种经标记的核苷酸类似物不同的包括3'-O阻断基的两种未标记的核苷酸进行重复；
f)从所掺入的核苷酸类似物中切割所述可切割接头，由此从步骤(b)和(c)的所掺入的核苷酸类似物中去除任何标记或阻断基；
g)鉴定由于在步骤(b)中掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；以及
h)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(g)，
由此获得所述核酸的序列。
在一个实施例中，步骤(b)的核苷酸类似物选自由图30的核苷酸类似物组成的组。
本发明提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列，并且提供核酸聚合酶；
b)使所述核酸模板与四种不同的经标记的核苷酸类似物(A、C、T、G)接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，(B)pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，(C)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基以及通过可切割接头与所述碱基连接接的荧光标记和锚定物，以及(D)pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基以及通过可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记和相同的锚定物，
其中所述可切割接头可由相同的切割剂切割；
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记和锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记和相同的锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，
其中所述可切割接头和所述3'-O阻断基可由相同的切割剂切割；或者
(iii)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和与所述阻断基远端的碱基接头连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基以及在所述阻断基的远端与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基以及在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记和锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基以及在所述阻断基的远端与所述碱基连接的pH响应性荧光标记和相同的锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，
其中所述可切割接头可由相同的切割剂切割；
c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)在所述pH响应性荧光标记不具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)在所述pH响应性荧光标记具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的锚定物标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
f)使所掺入的核苷酸类似物与锚定物结合基团接触，所述锚定物结合基团结合到步骤(b)的所述核苷酸类似物的所述锚定物并且包括使与所述锚定物结合基团连接到的所述核苷酸类似物连接的任何荧光标记的所述荧光信号猝灭的部分，并且鉴定由于掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
g)使所掺入的核苷酸类似物与切割所述可切割接头和任何3'-O阻断基的切割剂接触；以及
h)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(g)，
由此获得所述核酸的序列。
在一个实施例中，步骤(b)的核苷酸类似物选自由图50的核苷酸类似物组成的组。
本发明提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板；
b)使所述核酸模板与两种不同的经标记的核苷酸类似物接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)两种荧光标记的核苷酸类似物，所述两种荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的用作能量转移供体的荧光标记、用于连接能量转移受体标记的锚定物、以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，
其中所述可切割接头和所述3'-O阻断基可由相同的切割剂切割；
其中所述核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物具有不同的锚定物；或者
(ii)两种荧光标记的核苷酸类似物，所述两种荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基、以及在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光能量转移供体标记和用于连接能量转移受体标记的锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，
其中所述可切割接头可由相同的切割剂切割，并且
其中所述核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物具有不同的锚定物；
c)洗去任何未掺入的核苷酸类似物并且使所掺入的核苷酸类似物与两种锚定物结合基团接触，所述两种锚定物结合基团特异性地结合到步骤(b)的所述核苷酸类似物的所述锚定物中的每一种锚定物并且包括用作能量转移受体的部分，
其中所述锚定物结合基团中的一种锚定物结合基团上的所述能量转移受体是pH不响应性标记，并且另一种锚定物结合基团上的所述能量转移受体是pH响应性标记；
d)在所述pH响应性荧光能量转移受体染料标记具有与所述pH不响应性荧光能量转移受体标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何游离标记；
e)将所掺入的核苷酸暴露于能够激发所述能量转移供体染料的波长，并且鉴定由于因在步骤(c)中执行的标记反应而与所述核苷酸类似物连接的所述能量转移受体染料的能量转移和发射而产生的任何荧光信号；
f)用两种不同的经标记的核苷酸类似物重复步骤(b)到(e)，所述两种不同的经标记的核苷酸类似物不同于(b)中的所述两种不同的经标记的核苷酸类似物，但除此之外具有(b)中所描述的所有其它性质；
g)将缓冲液改变到所述pH响应性荧光标记不具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述pH不响应性荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线时的pH，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)或(f)的锚定物标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号，其中步骤(e)和(g)的顺序可以相反；
h)使所掺入的核苷酸类似物与切割所述可切割接头和所述3'-O阻断基的切割剂接触；以及
i)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(h)，
由此获得所述核酸的序列。
在一个实施例中，步骤(b)的核苷酸类似物选自由图118或图122的核苷酸类似物组成的组。
本发明提供了一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列，并且提供核酸聚合酶；
b)使所述核酸模板与四种不同的经标记的核苷酸类似物(A、C、G、T)接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、和通过第一可切割接头(可切割接头1)与所述碱基连接的用作能量转移供体的荧光标记和用于连接pH不响应性能量转移受体标记的锚定物(锚定物1)、以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、和通过相同的可切割接头(可切割接头1)与所述碱基连接的用作能量转移供体的荧光标记和用于连接pH响应性能量转移受体标记的第二锚定物(锚定物2)两者、以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、和通过第二可切割接头(可切割接头2)与所述碱基连接的用作能量转移供体的荧光标记和用于连接pH不响应性能量转移受体标记的所述第一锚定物(锚定物1)两者、以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、和通过所述第二可切割接头(可切割接头2)与所述碱基连接的用作能量转移供体的荧光标记、用于连接pH响应性能量转移受体标记的所述第二锚定物(锚定物2)两者、以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，
其中所述第一可切割接头和所述3'-O阻断基可由相同的切割剂切割，并且所述第二可切割接头可由不同的切割剂切割；或者
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过第一可切割接头(可切割接头1)与所述碱基连接的阻断基、以及与所述阻断基远端的碱基接头连接的荧光能量转移供体标记和用于连接pH不响应性能量转移受体标记的锚定物(锚定物1)，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过第一可切割接头(可切割接头1)与所述碱基连接的阻断基、以及与所述阻断基远端的碱基接头连接的荧光能量转移供体标记和用于连接pH响应性能量转移受体标记的第二锚定物(锚定物2)，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过第二可切割接头(可切割接头2)与所述碱基连接的阻断基、以及与所述阻断基远端的碱基接头连接的荧光能量转移供体标记和用于连接pH不响应性能量转移受体标记的所述第一锚定物(锚定物1)，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过第二可切割接头(可切割接头2)与所述碱基连接的阻断基、以及与所述阻断基远端的碱基接头连接的荧光能量转移供体标记和用于连接pH响应性能量转移受体标记的所述第二锚定物(锚定物2)，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，
其中每个可切割接头可由不同的切割剂切割；
c)洗去任何未掺入的核苷酸类似物并且使所掺入的核苷酸类似物与两种锚定物结合基团接触，所述两种锚定物结合基团特异性地结合到步骤(b)的所述核苷酸类似物的所述锚定物中的每一种锚定物并且包括用作能量转移受体的部分，
其中所述锚定物结合基团中的一种锚定物结合基团上的所述能量转移受体是pH不响应性标记，并且另一种锚定物结合基团上的所述能量转移受体是pH响应性标记；
d)在所述pH响应性荧光能量转移受体染料标记具有与所述pH不响应性荧光能量转移受体标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何游离标记；
e)将所掺入的核苷酸暴露于能够激发所述能量转移供体染料的波长，并且鉴定由于因在步骤(c)中执行的标记反应而与步骤(b)中掺入的所述核苷酸类似物连接的所述能量转移受体染料的能量转移和发射而产生的任何荧光信号；
f)将缓冲液改变到所述pH响应性荧光标记不具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述pH不响应性荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线时的pH，并且鉴定由于因在步骤(c)中执行的标记反应而掺入来自步骤(b)的锚定物标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号，其中步骤(d)和(f)可以相反；
g)使所掺入的核苷酸类似物与切割所述第二可切割接头的切割剂接触；
h)在所述pH响应性荧光能量转移受体染料标记具有与所述pH不响应性荧光能量转移受体标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去所述切割剂和所释放的标记；
i)重复步骤(e)；
j)使所掺入的核苷酸类似物与切割所述第一可切割接头和所述3'-O阻断基的切割剂接触；以及
k)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(j)，
由此获得所述核酸的序列。
在一个实施例中，步骤(b)的核苷酸类似物选自由图126或图130的核苷酸类似物组成的组。
本发明提供了一种用于根据图88-103中的任一幅图的方案合成核苷酸类似物的方法。
术语
本文所使用的缩写具有它们在化学领域和生物学领域内的常规含义。本文所述的化学结构和式是根据化学领域中已知的化学价的标准规则构建的。
如本文所使用的并且除非另有说明，否则以下术语中的每个术语都应该具有以下所阐述的定义。
A-腺嘌呤；
C-胞嘧啶；
G-鸟嘌呤；
T-胸腺嘧啶；
U-尿嘧啶；
DNA-脱氧核糖核酸；
RNA-核糖核酸；
贯穿本申请，U和T有时可根据上下文互换地使用，例如，当参考化学结构图时通常使用U，而T通常用于附图和方案中。
除非另有说明，否则“核酸”应意指任何核酸分子，包含但不限于DNA、RNA和其杂交体。在一个实施例中，形成核酸分子的核酸碱基可以是碱基A、C、G、T和U以及其衍生物。
这些碱基的“衍生物”或“类似物”是本领域熟知的，并且例示在PCR系统、试剂和消耗品(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer)目录1996-1997，美国新泽西州布兰奇堡罗氏分子系统公司(Roche Molecular Systems，Inc.))中。
“核苷酸残基”是在掺入到多核苷酸中并由此成为多核苷酸单体后在其存在的状态下的单个核苷酸。因此，核苷酸残基是多核苷酸(例如，DNA)的核苷酸单体，所述核苷酸单体通过其糖的3'位置处的磷酸二酯键与多核苷酸的相邻核苷酸单体结合，并且通过其磷酸基团与第二相邻核苷酸单体结合，除了(i)3'端核苷酸残基仅通过来自其磷酸基团的磷酸二酯键与多核苷酸的一个相邻核苷酸单体结合，并且(ii)5'端核苷酸残基仅通过其糖的3'位置处的磷酸二酯键与多核苷酸的一个相邻核苷酸单体结合之外。
“底物”或“表面”应意指固相中存在的可以附着核酸或药剂的任何合适的介质。非限制性实例包含芯片、珠粒、纳米孔结构和柱。在一个实施例中，固体底物可以存在于溶液中，所述溶液包含水溶液、凝胶或流体。
“杂交”应意指基于众所周知的序列互补性原理将一种单链核酸粘接到另一种核酸。在一个实施例中，另一种核酸是单链核酸。核酸之间杂交的倾向取决于其环境的温度和离子强度、核酸的长度和互补性程度。这些参数对杂交的影响是本领域中众所周知的(参见Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T.1989.《分子克隆：实验室手册(Molecular cloning：a laboratory manual)》.冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress)，纽约)。如本文所使用的，引物序列或DNA延伸产物与另一核酸的杂交应意指充分粘接使得引物或DNA延伸产物分别可通过与能够形成磷酸二酯键的可用的核苷酸或核苷酸类似物产生磷酸二酯键而延伸。
如本文所使用的，除非另有说明，否则“独特的”或“不同于”另一个碱基或所列举的碱基列表的碱基应意指所述碱基具有不同于另一个或多个碱基的结构。例如，“独特的”或“不同于”腺嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶的碱基将包含鸟嘌呤碱基或尿嘧啶碱基。
如本文所使用的，除非另有说明，否则与参考分子的标记或标签部分“不同”的标记或标签部分意指所述标记或标签部分具有与其它/参考标记或标签部分的化学结构不同的化学结构。
如本文所使用的，除非另有说明，否则“引物”意指寡核苷酸，当与多核苷酸模板形成双链体时，所述寡核苷酸能够作为聚合酶掺入点并且从其3'端沿模板延伸，由此产生延伸的双链体。贯穿本申请，经常提到“模板-环-引物”。然而，其它模板-引物布置也包含在本发明的范围内(例如，结合到表面连接的线性或环状模板的线性引物)。
如本文所使用的，除非另有说明，否则“烷基”本身或作为另一个取代基的一部分的“烷基”是指直链(即，无支链)或支链碳链(或碳)或其组合，其可以是完全饱和的、单不饱和的或多不饱和的，并且可以包含具有指定碳原子数的单价、二价和多价自由基(即，C1-C10意指一到十个碳)。烷基是未环化的链。饱和烃基的实例包含但不限于如以下等基团：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和异构体。不饱和烷基为具有一个或多个双键或三键的烷基。不饱和烷基的实例包含但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基以及更高级的同系物和异构体。烷氧基是通过氧接头(-O-)与分子的其余部分连接的烷基。烷基部分可以是烯基部分。烷基部分可以是炔基部分。烷基部分可以是完全饱和的。烯基可以包含多于一个双键和/或除一个或多个双键外的一个或多个三键。炔基可以包含多于一个三键和/或除一个或多个三键外的一个或多个双键。
如本文所使用的，“烯基”是指直链或支链的非芳香族烃基，其含有至少1个碳-碳双键，并且可以存在多达最多可能数量的非芳香族碳-碳双键，并且可以是未经取代的或经取代的。例如，“C2-C5烯基”意指具有2个、3个、4个或5个碳原子和分别至多1个、2个、3个或4个碳-碳双键的烯基。烯基包含乙烯基、丙烯基和丁烯基。
术语“炔基”是指直链或支链的烃基，其含有至少1个碳-碳三键，并且可以存在多达最多可能数量的非芳香族碳-碳三键，并且可以是未经取代的或经取代的。因此，“C2-C5炔基”意指具有2个或3个碳原子和1个碳-碳三键或具有4个或5个碳原子和至多2个碳-碳三键的炔基。炔基包含乙炔基、丙炔基和丁炔基。
“类似物(Analog/analogue)”是根据其在化学和生物学内的通常含义来使用，并且是指结构上类似于另一化合物(即，所谓的“参考”化合物)但组成不同，例如不同之处在于一个原子被不同元素原子置换，或存在特定官能团，或一个官能团被另一官能团置换，或参考化合物的一个或多个手性中心的绝对立体化学的化合物。因此，类似物是与参考化合物在功能和外观上类似或相当，但在结构或来源上不类似或不相当的化合物。
术语“经取代的”是指如上所述的如烷基或烃基等官能团，其中所含有的与氢原子的至少一个键被与非氢或非碳原子的键所替代，条件是维持正常的化合价并且取代产生稳定的化合物。经取代的基团还包含其中与碳原子或氢原子的一个或多个键被与杂原子的一个或多个键(包含双键或三键)替代的基团。取代基的非限制性实例包含上述官能团以及例如N例如以便形成-CN。
“可检测剂”、“可检测化合物”、“可检测标记”或“可检测部分”是可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学、磁共振成像或其它物理手段检测的组合物。例如，可检测剂包含18F、32P、33P、45Ti、47Sc、52Fe、59Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、77As、86Y、90Y、89Sr、89Zr、94Tc、94Tc、99mTc、99Mo、105Pd、105Rh、111Ag、111In、123I、124I、125I、131I、142Pr、143Pr、149Pm、153Sm、154-1581Gd、161Tb、166Dy、166Ho、169Er、175Lu、177Lu、186Re、188Re、189Re、194Ir、198Au、199Au、211At、211Pb、212Bi、212Pb、213Bi、223Ra、225Ac、Cr、V、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、32P、荧光团(例如，荧光染料)、经修饰的寡核苷酸(例如，通过引用并入本文的PCT/US2015/022063中所述的部分)、电子致密试剂、酶(例如，ELISA中常用的酶)、生物素、地高辛(digoxigenin)、顺磁性分子、顺磁性纳米颗粒、超小型超顺磁性氧化铁(“USPIO”)纳米颗粒、USPIO纳米颗粒聚集体、超顺磁性氧化铁(“SPIO”)纳米颗粒、SPIO纳米颗粒聚集体、单晶体氧化铁纳米颗粒、单晶体氧化铁、纳米颗粒造影剂、含有钆螯合物(“Gd-螯合物”)分子的脂质体或其它递送媒剂、钆、放射性同位素、放射性核素(例如碳-11、氮-13、氧-15、氟-18、铷-82)、氟脱氧葡萄糖(例如，氟-18标记的)、任何发射γ射线的放射性核素、发射正电子的放射性核素、放射性标记的葡萄糖、放射性标记的水、放射性标记的氨、生物胶体、微泡(例如包含微泡壳，包含白蛋白、半乳糖、脂质和/或聚合物；微泡气芯，包含空气、重气体、全氟化碳、氮气、八氟丙烷、全氟烷脂质微球，全氟醚等)、碘化造影剂(例如，碘海醇、碘克沙醇、碘佛醇、碘帕醇、碘昔兰、碘普罗胺、泛影酸盐、甲泛影酸、碘克酸)、硫酸钡、二氧化钍、金、金纳米颗粒、金纳米颗粒聚集体、荧光团、双光子荧光团或半抗原和蛋白质或其它实体，所述其它实体可例如通过将放射性标记掺入与靶肽特异性具有反应性的肽或抗体中而检测到。
可检测剂的实例包含成像剂，包含荧光和发光物质，包含但不限于通常被称为“染料”、“标记”或“指示剂”的各种有机或无机小分子。实例包含荧光素、罗丹明(rhodamine)、吖啶染料、Alexa染料和花青染料。在实施例中，可检测部分是荧光分子(例如，吖啶染料、花青染料、氟染料、噁嗪染料、菲啶染料或罗丹明染料)。在实施例中，可检测部分是荧光分子(例如，吖啶染料、花青染料、氟染料、噁嗪染料、菲啶染料或罗丹明染料)。在实施例中，可检测部分是荧光素异硫氰酸盐部分、四甲基罗丹明-5-(和6)-异硫氰酸盐部分、Cy2部分、Cy3部分、Cy5部分、Cy7部分、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚部分、Hoechst 33258部分、Hoechst33342部分、Hoechst 34580部分、碘化丙啶部分或吖啶橙部分。在实施例中，可检测部分为Indo-1、Ca饱和部分、Indo-1 Ca2+部分、瀑布蓝BSA pH 7.0部分、瀑布蓝部分、LysoTrackerBlue部分、Alexa 405部分、LysoSensor Blue pH 5.0部分、LysoSensor Blue部分、DyLight405部分、DyLight 350部分、BFP(蓝色荧光蛋白)部分、Alexa 350部分、7-氨基-4-甲基香豆素pH 7.0部分、氨基香豆素部分、AMCA缀合物部分、香豆素部分、7-羟基-4-甲基香豆素部分、7-羟基-4-甲基香豆素pH 9.0部分、6，8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素pH 9.0部分、Hoechst 33342部分、Pacific Blue部分、Hoechst 33258部分、Hoechst 33258-DNA部分、Pacific Blue抗体缀合物pH 8.0部分、PO-PRO-1部分、PO-PRO-1-DNA部分、POPO-1部分、POPO-1-DNA部分、DAPI-DNA部分、DAPI部分、Marina Blue部分、SYTOX Blue-DNA部分、CFP(青色荧光蛋白)部分、eCFP(增强型青色荧光蛋白)部分、1-苯胺萘-8-磺酸(1，8-ANS)部分、Indo-1、无Ca部分、1，8-ANS(1-苯胺萘-8-磺酸)部分、BO-PRO-1-DNA部分、BOPRO-1部分、BOBO-1-DNA部分、SYTO 45-DNA部分、evoglow-Pp1部分、evoglow-Bs1部分、evoglow-Bs2部分、Auramine O部分、DiO部分、LysoSensor Green pH 5.0部分、Cy 2部分、LysoSensorGreen部分、Fura-2、高Ca部分、Fura-2 Ca2+sup>部分、SYTO 13-DNA部分、YO-PRO-1-DNA部分、YOYO-1-DNA部分、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)部分、LysoTracker Green部分、GFP(S65T)部分、BODIPY FL、MeOH部分、Sapphire部分、BODIPY FL缀合物部分、MitoTrackerGreen部分、MitoTracker Green FM、MeOH部分、荧光素0.1M NaOH部分、钙黄绿素pH 9.0部分、荧光素pH 9.0部分、钙黄绿素部分、Fura-2、无Ca部分、Fluo-4部分、FDA部分、DTAF部分、荧光素部分、CFDA部分、FITC部分、Alexa Fluor 488酰肼-水部分、DyLight 488部分、5-FAMpH 9.0部分、Alexa488部分、罗丹明110部分、罗丹明110pH 7.0部分、吖啶橙部分、BCECF pH5.5部分、PicoGreendsDNA定量试剂部分、SYBR Green I部分、Rhodaminen Green pH 7.0部分、CyQUANT GR-DNA部分、NeuroTrace 500/525、绿色荧光Nissl染色-RNA部分、DansylCadaverine部分、Fluoro-Emerald部分、Nissl部分、荧光素右旋糖酐pH 8.0部分、罗丹明Green部分、5-(和-6)-羧基-2'，7'-二氯荧光素pH 9.0部分、DansylCadaverine、MeOH部分、eYFP(增强型黄色荧光蛋白)部分、Oregon Green 488部分、Fluo-3部分、BCECF pH9.0部分、SBFI-Na+部分、Fluo-3 Ca2+部分、罗丹明123MeOH部分、FlAsH部分、CalciumGreen-1 Ca2+部分、Magnesium Green部分、DM-NERF pH 4.0部分、Calcium Green部分、Citrine部分、LysoSensor Yellow pH 9.0部分、TO-PRO-1-DNA部分、Magnesium Green Mg2+部分、Sodium Green Na+部分、TOTO-1-DNA部分、Oregon Green514部分、Oregon Green514抗体缀合物pH 8.0部分、NBD-X部分、DM-NERF pH 7.0部分、NBD-X、MeOH部分、CI-NERFpH 6.0部分、Alexa 430部分、CI-NERF pH 2.5部分、Lucifer Yellow、CH部分、LysoSensorYellow pH 3.0部分、6-TET、SE pH 9.0部分、曙红抗体缀合物pH 8.0部分、曙红部分、6-羧基罗丹明6G pH 7.0部分、6-羧基罗丹明6G、盐酸盐部分、Bodipy R6G SE部分、BODIPY R6GMeOH部分、6JOE部分、Cascade Yellow部分、mBanana部分、Alexa 532部分、赤藓红-5-异硫氰酸盐pH 9.0部分、6-HEX、SE pH 9.0部分、mOrange部分、mHoneydew部分、Cy 3部分、罗丹明B部分、DiI部分、5-TAMRA-MeOH部分、Alexa 555部分、DyLight 549部分、BODIPY TMR-X、SE部分、BODIPY TMR-X MeOH部分、PO-PRO-3-DNA部分、PO-PRO-3部分、罗丹明部分、POPO-3部分、Alexa 546部分、Calcium Orange Ca2+部分、TRITC部分、Calcium Orange部分、Rhodaminephalloidin pH 7.0部分、MitoTracker Orange部分、MitoTracker Orange MeOH部分、藻红蛋白部分、Magnesium Orange部分、R-藻红蛋白pH 7.5部分、5-TAMRA pH 7.0部分、5-TAMRA部分、Rhod-2部分、FM 1-43部分、Rhod-2Ca2+部分、FM 1-43脂质部分、LOLO-1-DNA部分、dTomato部分、DsRed部分、达巴氧基(2-氨乙基)磺胺部分、四甲基罗丹明右旋糖酐pH 7.0部分、Fluor-Ruby部分、Resorufin部分、Resorufin pH 9.0部分、mTangerine部分、LysoTracker Red部分、Lissaminerhodamine部分、Cy 3.5部分、罗丹明Red-X抗体缀合物pH8.0部分、Sulfo罗丹明101EtOH部分、JC-1pH 8.2部分、JC-1部分、mStrawberry部分、MitoTracker Red部分、MitoTracker Red、MeOH部分、X-Rhod-1 Ca2+部分、Alexa 568部分、5-ROX pH 7.0部分、5-ROX(5-羧基-X-罗丹明、三乙基铵盐)部分、BO-PRO-3-DNA部分、BOPRO-3部分、BOBO-3-DNA部分、溴化乙锭部分、ReAsH部分、Calcium Crimson部分、CalciumCrimson Ca2+部分、mRFP部分、mCherry部分、HcRed部分、DyLight 594部分、乙啡啶同型二聚体-1-DNA部分、乙啡啶同型二聚体部分、碘化丙啶部分、SYPRO Ruby部分、碘化丙啶-DNA部分、Alexa 594部分、BODIPY TR-X、SE部分、BODIPY TR-X、MeOH部分、BODIPY TR-X类鬼笔环肽pH 7.0部分、Alexa Fluor 610R-藻红蛋白链霉亲和素pH 7.2部分、YO-PRO-3-DNA部分、Di-8 ANEPPS部分、Di-8-ANEPPS-脂质部分、YOYO-3-DNA部分、尼罗红-脂质部分、尼罗红部分、DyLight 633部分、mPlum部分、TO-PRO-3-DNA部分、DDAO pH 9.0部分、Fura Red高Ca部分、别藻蓝蛋白pH 7.5部分、APC(别藻蓝蛋白)部分、Nile Blue、EtOH部分、TOTO-3-DNA部分、Cy 5部分、BODIPY 650/665-X、MeOH部分、Alexa Fluor 647R-藻红蛋白链霉亲和素pH7.2部分、DyLight 649部分、Alexa 647部分、Fura Red Ca2+部分、Atto 647部分、FuraRed、低Ca部分、羧基萘荧光素pH 10.0部分、Alexa 660部分、Cy 5.5部分、Alexa 680部分、DyLight 680部分、Alexa 700部分、FM 4-64、2％CHAPS部分或FM 4-64部分。在实施例中，可检测部分是以下的部分：1，1-二乙基-4，4-碘化羰花青、1，2-二苯基乙炔、1，4-二苯基丁二烯、1，4-二苯基丁二炔、1，6-二苯基己三烯、1，6-二苯基己三烯、1-苯胺萘-8-磺酸、2，7-二氯荧光素、2，5-二苯并噁唑、2-Di-1-ASP、2-十二烷基试卤灵、2-甲基苯并噁唑、3，3-二乙基噻二碳花青碘化物、4-二甲氨基-4-硝基二苯乙烯、5(6)-羧基荧光素、5(6)-羧基萘荧光素、5(6)-羧基四甲基罗丹明B、5-(和-6)-羧基-2'，7'-二氯荧光素、5-(和-6)-羧基-2，7-二氯荧光素、5-(N-十六酰基)氨基曙红、5-(N-十六酰基)氨基曙红、5-氯甲基荧光素、5-FAM、5-ROX、5-TAMRA、5-TAMRA、6，8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素、6，8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素、6-羧基罗丹明6G、6-HEX、6-JOE、6-JOE、6-TET、7-氨基放线菌素D、7-苄基氨基-4-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑、7-甲氧基香豆素-4-乙酸、8-苄氧基-5，7-二苯基喹啉、8-苄氧基-5，7-二苯基喹啉、9，10-双(苯乙炔基)蒽、9，10-二苯基蒽、9-甲基咔唑、(CS)2Ir(μ-Cl)2Ir(CS)2、AAA、吖啶橙、吖啶橙、吖啶黄、吖啶黄、亚当斯苹果红680(Adams Apple Red 680)、阿迪朗达克绿520(Adirondack Green 520)、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor405、AlexaFluor 430、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 480、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 488酰肼、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、AlexaFluor 546、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor610-R-PE、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 635、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 647-R-PE、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 680-APC、Alexa Fluor 680-R-PE、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、别藻蓝蛋白、AmCyan1、氨基甲基香豆素、Amplex Gold(产物)、Amplex红试剂、Amplex UltraRed、蒽、APC、APC-Seta-750、AsRed2、ATTO 390、ATTO 425、ATTO 430LS、ATTO 465、ATTO 488、ATTO490LS、ATTO 495、ATTO 514、ATTO 520、ATTO 532、ATTO 550、ATTO 565、ATTO 590、ATTO594、ATTO 610、ATTO620、ATTO 633、ATTO 635、ATTO 647、ATTO 647N、ATTO 655、ATTO 665、ATTO 680、ATTO 700、ATTO 725、ATTO 740、ATTO Oxa12、ATTO Rho3B、ATTO Rho6G、ATTORho11、ATTO Rho12、ATTO Rho13、ATTO Rho14、ATTO Rho101、ATTO Thio12、金胺O、AzamiGreen、单体Azami Green、B-藻红蛋白、BCECF、BCECF、Bex1、联苯、桦黄580、蓝绿藻、BO-PRO-1、BO-PRO-3、BOBO-1、BOBO-3、BODIPY 630 650-X、BODIPY 650/665-X、BODIPY FL、BODIPYFL、BODIPY R6G、BODIPY TMR-X、BODIPY TR-X、BODIPY TR-X Ph 7.0、BODIPY TR-X羟基毒肽、BODIPY-DiMe、BODIPY-苯基、BODIPY-TMSCC、C3-吲哚菁、C3-吲哚菁、C3-氧杂菁、C3-硫菁染料(EtOH)、C3-噻菁染料(PrOH)、C5-吲哚菁、C5-氧杂菁、C5-噻菁、C7-吲哚菁、C7-氧杂菁、C545T、C-藻青蛋白、钙黄绿素、钙黄绿素红橙、钙红(Calcium Crimson)、钙绿-1、钙橙、Calcofluor白2MR、羧基SNARF-1pH 6.0、羧基SNARF-1pH 9.0、羧萘氟荧光素、瀑布蓝、瀑布黄、卡茨基尔绿540、CBQCA、CellMask橙、CellTrace BODIPY TR甲酯、CellTrace钙黄绿素紫、CellTraceTM远红、CellTracker蓝、CellTracker红CMTPX、CellTracker紫BMQC、CF405M、CF405S、CF488A、CF543、CF555、CFP、CFSE、CFTM350、CFTM485、叶绿素A、叶绿素B、Chromeo488、Chromeo 494、Chromeo 505、Chromeo 546、Chromeo642、柠檬黄、柠檬黄、ClOH丁氧基氮杂-BODIPY、ClOH C12氮杂-BODIPY、CM-H2DCFDA、香豆素1、香豆素6、香豆素6、香豆素30、香豆素314、香豆素334、香豆素343、香豆素545T、甲酚紫高氯酸酯、CryptoLight CF1、CryptoLight CF2、CryptoLight CF3、CryptoLight CF4、CryptoLight CF5、CryptoLightCF6、结晶紫、香豆素153、Cy2、Cy3、Cy3、Cy3.5、Cy3B、Cy3B、Cy3Cy5 ET、Cy5、Cy5、Cy5.5、Cy7、花青3NHS酯、花青5羧酸、花青5NHS酯、梅尼小环藻(Cyclotella meneghiniana Kützing)、CypHer5、CypHer5 pH 9.15、CyQUANT GR、CyTrak橙、Dabcyl SE、DAF-FM、DAMC(Weiss)、丹酰尸胺、丹酰甘氨酸(二噁烷)、DAPI、DAPI、DAPI、DAPI、DAPI(DMSO)、DAPI(H2O)、Dapoxyl(2-氨乙基)磺酰胺、DCI、DCM、DCM、DCM(乙腈)、DCM(MeOH)、DDAO、深紫、双-8-ANEPPS、DiA、二氯三(1，10-菲咯啉)钌(II)、DiClOH C12氮杂-BODIPY、DiClOH丁氧基氮杂-BODIPY、DiD、DiI、DiIC18(3)、DiO、DiR、Diversa青-FP、Diversa绿-FP、DM-NERF pH 4.0、DOCI、阿霉素、DPPpH-探针590-7.5、DPP pH-探针590-9.0、DPP pH-探针590-11.0、DPP pH-探针590-11.0、龙绿(Dragon Green)、DRAQ5、DsRed、DsRed、DsRed、DsRed-Express、DsRed-Express2、DsRed-ExpressT1、dTomato、DY-350XL、DY-480、DY-480XL MegaStokes、DY-485、DY-485XLMegaStokes、DY-490、DY-490XL MegaStokes、DY-500、DY-500XL MegaStokes、DY-520、DY-520XL MegaStokes、DY-547、DY-549P1、DY-549P1、DY-554、DY-555、DY-557、DY-557、DY-590、DY-590、DY-615、DY-630、DY-631、DY-633、DY-635、DY-636、DY-647、DY-649P1、DY-649P1、DY-650、DY-651、DY-656、DY-673、DY-675、DY-676、DY-680、DY-681、DY-700、DY-701、DY-730、DY-731、DY-750、DY-751、DY-776、DY-782、染料-28、染料-33、染料-45、染料-304、染料-1041、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 594、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、E2-深红、E2-橙、E2-红/绿、EBFP、ECF、ECFP、ECL+、eGFP、ELF 97、祖母绿、艳羡绿(Envy Green)、曙红、曙红Y、黑附球菌酮(epicocconone)、EqFP611、赤藓红-5-异硫氰酸酯、溴化乙啶、乙啡锭同二聚体-1、乙基曙红、乙基曙红、乙基尼罗蓝A、对二甲氨基苯甲酸乙酯、对二甲氨基苯甲酸乙酯、Eu2O3纳米颗粒、Eu(Soini)、Eu(tta)3DEADIT、EvaGreen、EVOblue-30、EYFP、FAD、FITC、FITC、FlAsH(Adams)、Flash Red EX、FlAsH-CCPGCC、FlAsH-CCXXCC、Fluo-3、Fluo-4、Fluo-5F、荧光素、荧光素0.1NaOH、荧光素-二碱基、氟代-祖母绿、氟化钠5G、FluoSpheres蓝、FluoSpheres深红、FluoSpheres暗红、FluoSpheres橙、FluoSpheres红、FluoSpheres黄绿、CTC中的FM4-64、SDS中的FM4-64、FM 1-43、FM 4-64、Fort橙600、Fura红、无Ca的Fura红、fura-2、无Ca的Fura-2、钆双胺、Gd-Dtpa-Bma、钆双胺、Gd-Dtpa-Bma、GelGreenTM、GelRedTM、H9-40、HcRed1、Hemo红720、HiLyte Fluor 488、HiLyte Fluor 555、HiLyte Fluor 647、HiLyte Fluor 680、HiLyte Fluor 750、HiLyte+555、HiLyte+647、HiLyte+750、HmGFP、Hoechst 33258、Hoechst33342、Hoechst-33258、Hoechst-33258、啤酒花黄560、HPTS、HPTS、HPTS、HPTS、HPTS、indo-1、无Ca的Indo-1、Ir(Cn)2(acac)、Ir(Cs)2(acac)、IR-775氯化物、IR-806、Ir-OEP-CO-Cl、
650炔烃、
650叠氮化物、
650羧酸酯、
650DBCO、
650马来酰亚胺、
650NHS酯、
680LT羧酸酯、
680LT马来酰亚胺、
680LT NHS酯、
680RD炔烃、
680RD叠氮化物、
680RD羧酸酯、
680RD DBCO、
680RD马来酰亚胺、
680RD NHS酯、
700亚磷酰胺、
700DX、
700DX、
700DX羧酸酯、
700DX NHS酯、
750羧酸酯、
750马来酰亚胺、
750NHS酯、
800亚磷酰胺、
800CW、
800CW炔烃、
800CW叠氮化物、
800CW羧酸酯、
800CW DBCO、
800CW马来酰亚胺、
800CWNHS酯、
800RS、
800RS羧酸酯、
800RS NHS酯、
QC-1羧酸酯、
QC-1NHS酯、球等鞭金藻–Parke、JC-1、JC-1、JOJO-1、Jonamac红Evitag T2、Kaede绿、Kaede红、kusabira橙、Lake Placid 490、LDS 751、丽丝胺若丹明(LissamineRhodamine)(Weiss)、LOLO-1、荧光黄CH、荧光黄CH、荧光黄CH、荧光黄CH Dilitium盐、Lumio绿、Lumio红、Lumogen F橙、Lumogen红F300、Lumogen红F300、LysoSensor蓝DND-192、LysoSensor绿DND-153、LysoSensor绿DND-153、LysoSensor黄/蓝DND-160pH 3、LysoSensor黄蓝DND-160、LysoTracker蓝DND-22、LysoTracker蓝DND-22、LysoTracker绿DND-26、LysoTracker红DND-99、LysoTracker黄HCK-123、马考红Evitag T2、马高列斯荧光红G(Macrolex Fluorescence Red G)、马高列斯荧光黄10GN、马高列斯荧光黄10GN、镁绿、镁八乙基卟啉、镁橙、酞青镁、酞青镁、镁四甲基卟啉、镁四苯基卟啉、孔雀石绿异硫氰酸酯、枫红橙620、海蓝、mBanana、mBBr、mCherry、部花青素540、甲基绿、甲基绿、甲基绿、亚甲蓝、亚甲蓝、mHoneyDew、MitoTracker深红633、MitoTracker绿FM、MitoTracker橙CMTMRos、MitoTracke红CMXRos、单溴二胺、单氯二胺、单针藻、mOrange、mOrange2、mPlum、mRaspberry、mRFP、mRFP1、mRFP1.2(Wang)、mStrawberry(Shaner)、mTangerine(Shaner)、N，N-二(2，4，6-三甲基苯基)-3，4：9，10-苝双(二甲酰亚胺)、NADH、萘、萘、萘荧光素、萘荧光素、NBD-X、NeuroTrace 500525、高氯酸尼布劳(Nilblau perchlorate)、尼罗蓝、尼罗蓝、尼罗蓝(EtOH)、尼罗红、尼罗红、尼罗红、尼罗红、尼罗蓝A、NIR1、NIR2、NIR3、NIR4、NIR820、八乙基卟啉、OH丁氧基氮杂-BODIPY、OHC12氮杂-BODIPY、橙色荧光蛋白、Oregon Green 488、Oregon Green 488DHPE、Oregon Green 514、噁嗪1、噁嗪750、噁嗪1、噁嗪170、P4-3、对四苯基、对三苯基、PA-GFP(激活后)、PA-GFP(激活前)、太平洋橙、钯(II)中四苯基四苯并卟啉、PdOEPK、PdTFPP、PerCP-Cy5.5、苝、苝、苝酰亚胺pH-探针550-5.0、苝酰亚胺pH-探针550-5.5、苝酰亚胺pH-探针550-6.5、苝绿pH-探针720-5.5、苝绿标签pH-探针720-6.0、苝橙pH-探针550-2.0、苝橙标签550、苝红pH-探针600-5.5、苝酰亚胺、苝绿pH-探针740-5.5、苯酚、苯丙氨酸、pHrodo、琥珀酰亚胺酯、酞菁、PicoGreen dsDNA定量试剂、碘化频哪氰醇、吡罗昔康、铂(II)四苯基四苯并卟啉、李子紫、PO-PRO-1、PO-PRO-3、POPO-1、POPO-3、POPOP、卟吩、PPO、原黄素、PromoFluor-350、PromoFluor-405、PromoFluor-415、PromoFluor-488、PromoFluor-488 Premium、PromoFluor-488LSS、PromoFluor-500LSS、PromoFluor-505、PromoFluor-510LSS、PromoFluor-514LSS、PromoFluor-520LSS、PromoFluor-532、PromoFluor-546、PromoFluor-555、PromoFluor-590、PromoFluor-610、PromoFluor-633、PromoFluor-647、PromoFluor-670、PromoFluor-680、PromoFluor-700、PromoFluor-750、PromoFluor-770、PromoFluor-780、PromoFluor-840、碘化丙啶、原卟啉IX、PTIR475/UF、PTIR545/UF、PtOEP、PtOEPK、PtTFPP、芘、QD525、QD565、QD585、QD605、QD655、QD705、QD800、QD903、QD PbS 950、QDot 525、QDot 545、QDot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot655、Qdot 705、Qdot 800、QpyMe2、QSY 7、QSY 7、QSY 9、QSY 21、QSY 35、奎宁、硫酸奎宁、硫酸奎宁、R-藻红蛋白、R-藻红蛋白、ReAsH-CCPGCC、ReAsH-CCXXCC、红珠(Weiss)、雷蒙德红、试卤灵、试卤灵、rhod-2、罗丹明700高氯酸酯、罗丹明、罗丹明6G、罗丹明6G、罗丹明101、罗丹明110、罗丹明123、罗丹明123、罗丹明B、罗丹明绿、罗丹明pH探针585-7.0、罗丹明pH-探针585-7.5、罗丹明甲环肽、罗丹明红-X、罗丹明红-X、罗丹明标签pH-探针585-7.0、对甲氨基酚绿、核黄素、玫瑰红、宝石蓝、SBFI、SBFI零Na、栅藻物种、SensiLight PBXL-1、SensiLight PBXL-3、Seta 633-NHS、Seta-633-NHS、SeTau-380-NHS、SeTau-647-NHS、蛇眼红900、SNIR1、SNIR2、SNIR3、SNIR4、钠绿、沙拉菲尼尔黄素7GFE 500、光谱Aqua、光谱蓝、光谱FRed、光谱金、光谱绿、光谱橙、光谱红、方酸菁染料III、全染色剂、二苯乙烯衍生物、二苯乙烯、苯乙烯基8高氯酸酯、磺基花青3羧酸、磺基花青3羧酸、磺基花青3NHS酯、磺基花青5羧酸、磺基罗丹明101、磺基罗丹明101、磺基罗丹明B、磺基罗丹明G、Sunsocast黄、SuperGloBFP、SuperGlo GFP、Surf绿EX、SYBR金核酸凝胶染色剂、SYBR绿I、SYPRO深红、SYTO 9、SYTO11、SYTO 13、SYTO 16、SYTO 17、SYTO 45、SYTO 59、SYTO 60、SYTO 61、SYTO 62、SYTO 82、SYTO RNASelect、SYTO RNASelect、SYTOX蓝、SYTOX绿、SYTOX橙、SYTOX红、T-宝石蓝、Tb(Soini)、tCO、tdTomato、Terrylen、Terrylendiimid、测试染料、四-叔丁基氮杂卟啉、四-叔丁基氮杂酞菁、四苯、四(邻氨基苯基)卟啉、四甲磺酸基卟啉、四甲基罗丹明、四甲基罗丹明、四苯基卟啉、四苯基卟啉、德克萨斯红、德克萨斯红DHPE、德克萨斯红-X、ThiolTracker紫、乙酸硫堇酯、TMRE、TO-PRO-1、TO-PRO-3、甲苯、黄玉(Tsien1998)、TOTO-1、TOTO-3、三(2，2-联吡啶)氯化钌(II)、三(4，4-二苯基-2，2-联吡啶)氯化钌(II)、三(4，7-二苯基-1，10-邻菲罗啉)钌(II)TMS、TRITC(Weiss)、TRITC-葡聚糖(Weiss)、色氨酸、酪氨酸、Vex1、VybrantDyeCycle绿染色剂、Vybrant DyeCycle橙染色剂、Vybrant DyeCycle紫染色剂、WEGFP(激活后)、WellRED D2、WellRED D3、WellRED D4、WtGFP、WtGFP(Tsien1998)、X-rhod-1、Yakima黄、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YoYo-1、YoYo-1dsDNA、YoYo-1ssDNA、YOYO-3、八乙基卟啉锌、酞菁锌、四甲基卟啉锌、四苯基卟啉锌、ZsGreen1或ZsYellow1。
在实施例中，可检测标记是荧光染料。在实施例中，可检测标记是能够与另一种荧光染料交换能量的荧光染料(例如，荧光共振能量转移(FRET)发色团)。
在实施例中，可检测标记是荧光染料，所述荧光染料能够在一种条件下显示吸光度和发射，但在不同条件下不能显示吸光度和发射。实例是pH响应性染料。
在实施例中，可检测部分是以上紧接地描述的可检测部分中的一者的衍生物的部分，其中所述衍生物与以上紧接地描述的可检测部分中的一者的区别在于可检测部分与本文所述的化合物缀合而产生的修饰。
如本文所述的术语“花青”或“花青部分”是指含有被聚甲炔链分离的两个氮基团的化合物。在实施例中，花青部分具有3个次甲基结构(即，花青3或Cy3)。在实施例中，花青部分具有5个次甲基结构(即，花青5或Cy5)。在实施例中，花青部分具有7个次甲基结构(即，花青7或Cy7)。
“接触”根据其普通一般含义使用，并且是指使至少两个不同的物种(例如，包含生物分子或细胞的化学化合物)变得足够接近以进行反应、相互作用或物理触摸的过程。然而，应当理解，所得反应产物可以由所添加的试剂之间的反应直接产生，或由来自所添加的试剂中的一种或多种试剂的可以在反应混合物中产生的中间体产生。术语“接触”可以包含允许两个物种反应、相互作用或物理触摸，其中所述两个物种可以是如本文所述的化合物和蛋白质或酶。在一些实施例中，接触包含允许本文所述的化合物与信号传导路径中涉及的蛋白质或酶相互作用。
术语“链霉亲和素”和
是指能够结合生物素的四聚体蛋白质(包含同源物、同种型及其功能片段)。所述术语包含维持链霉亲和素活性(例如，与野生型链霉亲和素相比，至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％活性内)的任何重组形式或天然存在形式的链霉亲和素变体。
如本文所使用的，术语“锚定物部分”是指能够与第二任选地不同的化学部分(例如，互补锚定物部分结合物)相互作用(例如，共价或非共价)的化学部分。在实施例中，锚定物部分是能够与互补的生物缀合物反应性基团(例如，互补锚定物部分反应性基团)相互作用(例如，共价)的生物缀合物反应性基团。在实施例中，锚定物部分是点击化学反应物部分。在实施例中，锚定物部分(“亲和力锚定物部分”)能够与第二化学部分(例如，互补的亲和力锚定物部分结合物)非共价相互作用。锚定物部分的非限制性实例包含生物素、叠氮化物、反式环辛烯(TCO)和苯基硼酸(PBA)。在实施例中，亲和力锚定物部分(例如，生物素部分)与互补的亲和力锚定物部分结合物(例如，链霉亲和素部分)非共价相互作用。在实施例中，锚定物部分(例如，叠氮化物部分、反式环辛烯(TCO)部分、苯基硼酸(PBA)部分)共价结合互补锚定物部分结合物(例如，二苯并环辛炔(DBCO)部分、四嗪(TZ)部分、水杨基氧肟酸(SHA)部分)。
如本文所使用的，术语“可切割接头”或“可切割部分”分别是指能够被分离(例如，拆分、分裂、拆开、水解，部分内的稳定键断裂)成不同实体的二价或单价部分。可切割接头可响应于外部刺激(例如，酶、亲核/碱性试剂、还原剂、光照射、亲电子/酸性试剂、有机金属和金属试剂或氧化剂)而切割(例如，特异性切割)。化学可切割接头是指能够响应于化学物质(例如，酸、碱、氧化剂、还原剂、Pd(0)、三-(2-羧乙基)膦、稀亚硝酸、氟化物、三(3-羟丙基)膦)、连二亚硫酸钠(Na2S2O4)、肼(N2H4))的存在而分裂的接头。化学可切割接头是非酶促可切割的。在实施例中，通过将可切割接头与切割剂接触来切割可切割接头。在实施例中，切割剂是连二亚硫酸钠(Na2S2O4)、弱酸、肼(N2H4)、Pd(0)或光照射(例如，紫外线辐照)。
光可切割接头(例如，包含邻硝基苄基基团或由邻硝基苄基基团组成)是指能够响应于光照射(例如，紫外线辐照)而分裂的接头。酸可切割接头是指能够响应于pH的变化(例如，增加的酸度)而分裂的接头。碱可切割接头是指能够响应于pH的变化(例如，减小的酸度)而分裂的接头。氧化剂可切割接头是指能够响应于氧化剂的存在而分裂的接头。还原剂可切割接头是指能够响应于还原剂(例如，三(3-羟丙基)膦)的存在而分裂的接头。在实施例中，可切割接头是二烷基缩酮接头、偶氮基接头、烯丙基接头、氰乙基接头、1-(4，4-二甲基-2，6-二氧杂环己烷-1-亚基)乙基接头或硝基苄基接头。
如本文所使用的，术语“正交可切割接头(orthogonally cleavable linker或orthogonal cleavable linker)”是指在两种或更多种不同切割剂的混合物中被第一切割剂(例如，酶、亲核/碱性试剂、还原剂、光照射、亲电/酸性试剂、有机金属和金属试剂、氧化剂)切割并且在两种或更多种切割剂的混合物中不被任何其它不同的切割剂切割的可切割接头。例如，当两个不同的可切割接头的混合物与两种不同的切割剂反应，并且每个可切割接头仅被其中一种切割剂切割而不被另一种切割剂切割时，两个不同的可切割接头均为正交可切割接头。在实施例中，正交是在切割后两个分离的实体(例如，荧光染料、生物缀合物反应性基团)不进一步反应并形成新的正交可切割接头的可切割接头。
如本文所使用的，术语“正交结合基团”或“正交结合分子”是指在两个或更多个不同互补结合基团的混合物中能够结合第一互补结合基团(例如，互补锚定物部分结合物或锚定物部分)并且不能结合两个或更多个互补结合基团的混合物中的任何其它不同互补结合基团的结合基团(例如，锚定物部分或互补锚定物部分结合物)。例如，当两个不同结合基团的混合物与两个互补结合基团反应并且每个结合基团仅结合互补结合基团中的一个而不结合另一个互补结合基团时，两个不同结合基团均是正交结合基团。一组四个正交结合基团和一组正交互补结合基团的实例是结合基团生物素、叠氮化物、反式环辛烯(TCO)和苯基硼酸(PBA)，其特异性地且有效地分别与互补结合基团链霉亲和素、二苯并环辛炔(DBCO)、四嗪(TZ)和水杨基氧肟酸(SHA)结合或反应。
如本文所使用的，术语“正交可检测标记”或“正交可检测部分”是指能够在两种或更多种不同的可检测标记的混合物或组(单独样品的集合)中被检测和鉴定(例如，通过使用检测手段(例如，发射波长、物理特性测量))的可检测标记(例如，荧光染料或可检测染料)。例如，当两种不同的荧光染料的组经受被一种荧光染料吸收而不被另一种荧光染料吸收的光的波长并且导致从吸收光的荧光染料而不是另一种荧光染料发射光时，作为荧光染料的两种不同的可检测标记都是正交可检测标记。正交可检测标记可以通过正交可检测标记彼此相比时不同的吸光度或发射强度来分别鉴定，并且可以不仅是信号的绝对存在或不存在。一组四个正交可检测标记的实例是一组Rox标记的四嗪、Alexa488标记的SHA、Cy5标记的链霉亲和素和R6G标记的二苯并环辛炔。
贯穿本申请，各个方案中使用的许多核苷酸类似物含有在3'O位置处的二硫甲基(DTM(SS))阻断基，并且含有在碱基与染料或锚定物分子之间的接头中的可切割的DTM(SS)基团。先前的方法将SS基团放置在碱基与染料之间，但在切割后会形成游离的反应性-SH基团，在可以进行第二延伸反应之前，必须用碘乙酰胺对所述-SH基团进行封端(Mitra等人2003，Turcatti等人2008)。这限制了测序读段的长度。本申请中公开的碱基与荧光团之间的新的基于DTM的接头不需要在用THP切割后对所得游离SH基团进行封端，因为切割的产物会立即塌缩为稳定的OH基团。
先前已经描述了使用基于二硫键接头的核苷酸作为可逆终止子进行DNA测序(Ju等人WO 2017/058953 A1；Ju等人WO2017/205336A1)。尽管此部分示出的所有实例中的3'-阻断基都是叔丁基-二硫甲基，但也可以使用其它烷基，如甲基-二硫甲基或乙基-二硫甲基。
在本专利申请中，无论在何处提及DTM，其均可以指连接到3'-O位置的二硫甲基或各种烷基或其它经取代的二硫甲基。也可以使用其它阻断基(偶氮基、烯丙基、2-硝基苄基、叠氮基甲基)，特别是如果所述基团作为一般可切割基团存在于碱基与染料或锚定物之间的所有接头中。除了三磷酸核苷类似物外，四磷酸核苷、五磷酸核苷、六磷酸核苷和更高多磷酸核苷类似物也是可行的替代方案。
在一些图中，阳性荧光信号由数字1、灰色矩形、黑色圆圈或“信号”字样指示。在一些图中，背景信号由数字0、白色矩形和“空白”或“背景”字样指示。
在提供值的范围时，除非上下文另外明确规定，否则应理解，除非上下文另外明确规定，否则在那个范围的上限与下限之间的值的每个中介整数和值的每个中介整数的每个十分位以及那个所述范围中的任何其它所述或中介值涵盖于本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包含在更小的范围中，并且也涵盖在本发明内，这受制于所陈述的范围中的任何明确排除的限值。在所陈述范围包含极限中的一个或两个极限的情况下，排除那些被包含在内的极限中的(i)任一个或(ii)两个极限的范围也包含在本发明中。
本文中所描述的各种要素的所有组合在本发明的范围内。本文中所描述的各种要素的所有子组合也在本发明的范围内。
特此通过全文引用的方式并入的Ju等人，PCT/US2019/022326最近报道了若干种单色边合成边测序(SBS)方法。在那些方法中，其包含：(1)使用多组核苷酸的方法，所述核苷酸包括具有相同锚定物的两种核苷酸和具有相同染料的两种核苷酸，在碱基与染料或锚定物之间具有可切割接头的正交布置；以及(2)使用多组核苷酸的方法，所述核苷酸包括具有一种锚定物物种的两种核苷酸和具有不同锚定物物种的两种核苷酸，在碱基与两种锚定物之间具有可切割接头的正交布置。其中所公开的其它方法包含使用多于两种锚定物或多于两个可切割接头的方法、涉及染料或锚定物簇的方法、使用量子点的方法等。此外，上述方法包含：(a)仅使用具有与碱基连接的染料或锚定物和可逆地阻断的3'-OH基团的核苷酸类似物(核苷酸可逆终止子或NRT)的方法，(b)使用具有与碱基连接的染料或锚定物的双脱氧核苷酸类似物与非荧光NRT的组合的方法，以及(c)使用在碱基与染料/锚定物之间具有阻断基(阻断剂)但具有游离3'-OH基团(称为“虚拟终止子”)的核苷酸类似物的方法。
本文所公开的发明包含十一种涉及使用ddNTP类似物的新型单色SBS方案(实例1-3和5-12)，以及一种使用ddNTP类似物的另外的双色方案(实例4)。本发明进一步包含使用3'-阻断的核苷酸可逆终止子或虚拟终止子的实例1、2、6、8和9的等效方案。尽管本文没有明确呈现，但实例4、5、7、10、11和12也可以使用可逆终止子或虚拟终止子来执行。这些方案可能因例如以下而有所不同：其使用不同数量的锚定物和可切割接头、使用可以进行点击切割反应的TCO接头(实例5、8、9)、使用猝灭(实例6、7、11、12)、使用光漂白(实例3)、使用具有pH响应性荧光的染料(实例2、7、9、10、11)、多次延伸(实例1、10、12)以及其各种组合(实例7、9、10、11、12)。每个方案都有特定的优点，其中一些优点在每个实例的介绍部分中进行了描述。本发明还提供了用于SBS方案的新型核苷酸类似物，其中提供了示例结构。另外两个实例(实例13和14)描述了单分子能量转移方法，所述方法利用具有pH响应性和pH不响应性荧光的染料作为受体。先前已经描述了将能量转移染料用于单分子测序(US 6,627,748、US 2019/0153527 A1)。本文还公开并在本发明范围内提供了用于合成这些核苷酸类似物中的一些核苷酸类似物的若干种合成方案。
在所呈现的各个实例以及相关的实施例和权利要求中，描述了相对于未标记的3'-O阻断的核苷酸，添加染料或锚定物标记的核苷酸(ddNTP或3'-O阻断的dNTP或具有与碱基连接的阻断基的dNTP)的不同顺序，但不应将这些解释为唯一的添加顺序。因此，在许多实例中，据说未标记的3'-O阻断的核苷酸是在经标记的核苷酸“之前或之后”添加的，但这并不意味着排除其同时添加。类似地，在一些实例中，示出两组核苷酸类似物一起添加，但这并不排除其以任一顺序连续添加。对本领域技术人员显而易见的是，经标记的核苷酸和3'-O阻断的核苷酸的比率根据添加顺序进行调整，以确保在多个循环中进行同步边合成边测序并确保在每个边合成边测序循环中进行足够的标记检测。
实例1：用未标记的NRT和荧光ddNTP、一种锚定物和一个可切割接头，使用混合方法进行单色荧光边合成边测序(SBS)
此方法的示例性示意图是图2中所呈现的单色方案，所述方案示出为使用四种叠氮基甲基-dNTP(NRT)和四种ddNTP类似物，Cy5通过SS接头与ddNTP类似物中的两种连接，并且生物素也通过SS接头与其它两种ddNTP类似物连接。这些ddNTP类似物的一般结构在图1中呈现。在这种情况下，存在两个延伸步骤和两个标记步骤。为了便于呈现，ddNTP类似物呈现为ddATP-SS-生物素、ddTTP-SS-Cy5、ddCTP-SS-生物素和ddGTP-SS-Cy5。在第一个延伸步骤中，在四种叠氮基甲基-dNTP过量存在的情况下，仅添加ddATP-SS-生物素和ddTTP-SS-Cy5(图3)。接下来是第一个成像步骤，其中阳性信号将揭示T的掺入。接下来用链霉亲和素-Cy5进行标记。执行第二个成像步骤，并且新的荧光信号的出现将揭示A的掺入。接下来，在更高浓度的叠氮基甲基-dATP和叠氮基甲基-dTTP存在的情况下，用ddCTP-SS-生物素和ddGTP-SS-Cy5执行第二个延伸步骤。执行第三个成像步骤；新的阳性信号将指示G的掺入。接下来，再次用链霉亲和素-Cy5进行标记。执行第四个成像步骤；新的阳性信号将指示C的掺入。最后，将用THP执行切割以切割所有接头，从而去除任何Cy5并还切割NRT上的叠氮基甲基阻断基。
大部分NRT被掺入(>95％)，其中含有足够量的ddNTP类似物以获得令人满意的信号，因为任何用ddNTP类似物延伸的引物都会在进一步的测序循环中损失。此方法的优点是仅需要一种切割剂，从而避免了任何交叉切割的可能性，如果交叉切割足够高，则可能会导致不正确的碱基识别。先前已经描述了SS键的THP切割(Ju等人US2018/0274024；Ju等人PCT/US2019/022326)。
此SBS方案的另一个详细实施例在图4中呈现。尽管在此实例中使用了Cy5，但也可以使用许多其它荧光染料。可以使用多种锚定物来代替生物素，如在Ju等人US2018/0274024和Ju等人PCT/US2019/022326中所描述的，所述参考文献中的每一个均通过引用整体并入本文。尽管所述实例中的可切割接头含有SS基团，但替代性可切割基团可以存在于接头中，所述接头包含烯丙基、2-硝基苄基和先前描述的其它基团，如在Ju等人US2018/0274024和Ju等人PCT/US2019/022326中所描述的基团。
在本文所公开的本发明的其它实施利中，使用依赖于点击切割策略的TCO可切割接头。本文还公开并由本发明所提供的是使用虚拟终止子(含有与碱基连接以抑制聚合酶反应的化学可切割的阻断基的核苷酸)的类似方法，如在图5-8中示出，以及使用3'-阻断的核苷酸可逆终止子的另一种类似方法，如在图9-12中示出。在这些情况下，将最佳量的未标记的核苷酸可逆终止子与经标记的核苷酸类似物一起添加以保持聚合酶反应的保真度。
实例1：实验结果(图104)：通过执行以下步骤，证明了通过用连接到染料(在这种情况下为Cy5)或锚定物(在这种情况下为生物素)的同一可切割接头进行边合成边测序的能力：(1)第一延伸：添加Therminator IX DNA聚合酶和3'-阻断的可逆终止子；(2)第二延伸：添加Thermo Sequenase，即Cy5标记的ddNTP中的一种、生物素标记的ddNTP中的一种和其它两种可逆终止子以维持保真度；(3)第一标记：添加Cy5-锚定物结合分子以标记用生物素标记的ddNTP延伸的任何DNA引物；(4)第三延伸：对剩余的Cy5标记的和生物素标记的核苷酸类似物重复延伸步骤2；(5)第二标记：重复标记步骤3；(6)追加延伸：重复延伸步骤1；以及(7)使用THP以切割SS接头以去除染料并恢复掺入的可逆终止子上的3'-OH基团。
尽管在大多数方面与图2和图4中所呈现的方案相同，但在这种情况下，在掺入步骤中添加了所有四种未标记的3'-O-叔丁基二硫甲基可逆终止子，其中在第二掺入步骤中添加了第一对经标记的ddNTP和可逆终止子中的两种。以下四种经标记的ddNTP核苷酸(ddCTP-5-SS-Cy5、ddGTP-7-SS-Cy5、ddATP-7-SS-生物素和ddTTP-5-SS-生物素)是使用先前描述的方案合成的(Ju等人2017a，b，2018，2019)。一组3'-O-叠氮基甲基dNTP(商购)用于确保每个延伸步骤的同步。如Ju等人PCT/US2019/022326中所描述的，将具有以下序列的引物-环-模板连接到显微镜载玻片，其中模板链中的下一可用位置以粗体示出。
执行了以下详细的SBS方案：
首先，制备了三种溶液。
溶液A：5μl 3'-O-CH2-N3-dATP(100μM)、5μl 3'-O-CH2-N3-dCTP(100μM)、5μl3'-O-CH2-N3-dGTP(100μM)、5μl 3'-O-CH2-N3-dTTP(100μM)、80μl水。
溶液B：4μl ddATP-SS-生物素(2μM)、4μl ddCTP-SS-Cy5(2μM)、5μl3'-O-CH2-N3-dGTP(2μM)、5μl 3'-O-CH2-N3-dTTP(2μM)。
溶液C：4μl ddTTP-SS-生物素(2μM)、4μl ddGTP-SS-Cy5(2μM)、5μl3'-O-CH2-N3-dATP(2μM)、5μl 3'-O-CH2-N3-dCTP(2μM)。
对于第一延伸，向载玻片上的DNA添加由40μl溶液A、6μl 10x ThermoPol缓冲液、6μl Therminator IX(1单位/μl)和8μl水组成的溶液，并允许在65℃下进行10分钟温育。这一步骤的目的是允许在约95％的增长的引物链中掺入核苷酸可逆终止子。
接下来，在通过在37℃下将载玻片浸入在1x PBS pH 7.4，0.1％Tween 20的溶液中持续10分钟并用水彻底冲洗来洗涤所述载玻片之后，然后通过向载玻片上的DNA添加由5μl溶液B、6μl 10x Thermo Sequenase缓冲液、6μl Thermo Sequenase(1单位/μl)和43μl水组成的溶液，在65℃下进行第二延伸步骤，持续10分钟。执行另一个洗涤步骤，将载玻片干燥并成像(633 nm激光和中心约670 nm的发射窗口)，以揭示因C的掺入而产生的任何Cy5荧光。
接下来，通过向载玻片上的DNA添加由6μl链霉亲和素-Cy5(2μM)、6μl 10x PBSpH7.4和48μl水组成的溶液，在37℃下进行第一标记步骤，持续6分钟。如上将载玻片洗涤，干燥并使用相同条件重新成像以揭示因A的掺入和标记而产生的任何Cy5荧光。
通过向载玻片上的DNA添加由5μl溶液C、6μl 10x Thermo Sequenase缓冲液、6μlThermo Sequenase(1单位/μl)和43μl水组成的溶液，在65℃下进行第三延伸步骤，持续10分钟。如上将载玻片洗涤，干燥并使用相同条件重新成像以揭示因G的掺入而产生的任何Cy5荧光。
接下来，以与第一标记步骤相同的方式执行第二标记步骤，随后进行相同的洗涤和成像方案以揭示因T的掺入和标记而产生的任何Cy5荧光。通过向载玻片上的DNA添加由40μl溶液A、6μl 10x ThermoPol缓冲液、6μl Therminator IX(1单位/μl)和8μl水组成的溶液，在65℃下执行确保基本上每个DNA引物都延伸的追加延伸步骤，持续10分钟。如上将载玻片洗涤。
最后，通过以下对ddNTP的接头中的SS基团进行切割以去除染料并恢复任何掺入的3'-O-叠氮基甲基dNTP上的3'-OH：向载玻片上的DNA添加由6μl THP(50mM)、6μl NaCl(200mM)、12μl硼酸钠(0.1M，pH 9)和36μl水组成的溶液；并在65℃下温育，持续5分钟。如上将载玻片洗涤，干燥并使用与先前描述的相同的条件重新成像以验证从染料标记的ddNTP或染料-锚定物标记的ddNTP中去除染料。
在对共价连接在载玻片的不同区域中的上述两个引物-环-模板重复此方案13个循环之后，获得了图104中所示的结果。在每个成像步骤中(在用A或C延伸之后、在第一标记之后、在用G或T延伸之后、在第二标记之后以及在THP切割之后)确定背景信号(0)或阳性信号(1)。前13个步骤的编码是：1111表示C、0111表示A、0011表示G，并且0001表示T。基于模板链的已知序列，在每个循环中均掺入了正确的ddNTP类似物。
实例2：用未标记的NRT和荧光ddNTP，使用混合方法进行单色荧光边合成边测序(SBS)，所述荧光ddNTP具有两种锚定物、一个可切割接头和两种染料，所述两种染料具有相同或类似荧光谱，其中一种染料是pH响应性的。
此方案利用了具有非常类似的谱特性，即基本上相同的吸收和发射曲线的两种染料，即Cy5和HCyC-646。然而，虽然Cy5会在很宽的pH范围内发出荧光，但HCyC-646仅以低于pH 6的其质子化形式发出大量的荧光(Hilderbrand等人2008)。HCyc-646的这种pH响应性特性用于开发一种不同的“单色”荧光SBS方法，所述方法利用一组ddNTP类似物，所述ddNTP类似物具有两种锚定物(例如，生物素和四嗪)中的任一种、两种染料(Cy5和HCyC-646)中的任一种(图13)，以及碱基与染料或锚定物之间的单个可切割接头。遵循基于混合ddNTP/NRT方法的示例性图14的逻辑，最初在导致延伸至少90％和至多约98％的扩增的模板分子的条件下，用四种可逆终止子(例如，3'-O-叠氮基甲基-dNTP或3'-O-烷基二硫代甲基-dNTP，其中烷基包含甲基、乙基或叔丁基部分)执行延伸反应。接下来，用ddATP-7-SS-生物素、ddTTP-5-SS-Cy5、ddCTP-5-SS-四嗪和ddGTP-7-SS-HCyC-646执行第二延伸。在pH 5下洗涤之后，成像将揭示G和T类似物的掺入的阳性荧光信号，但不会揭示掺入的是哪一种。接下来用链霉亲和素-Cy5和TCO-HCyC-646执行标记。进行另一次pH 5洗涤，随后成像将产生A和C的新信号，但同样无法在此步骤中判断是否掺入了A或C。接下来，在pH 8.5-9下进行洗涤，这将逆转现在携带HCyc-646的两种ddNTP类似物，即C类似物和G类似物的pH诱导的荧光。
因此，如果先前确定掺入了A或C并且荧光仍然存在，这指示A掺入；如果荧光消失，这指示掺入了C。类似地，如果先前确定掺入了G或T并且荧光仍然存在，这指示掺入了T；如果荧光损失，这指示掺入了G。
将用THP执行切割以切割所有接头，从而去除任何染料并且还切割NRT上的叠氮基甲基阻断基。如果阳性信号由整数1指示，并且背景信号由0指示，然后基于在用ddNTP类似物延伸和低pH洗涤之后、在标记和低pH洗涤之后以及在随后的高pH洗涤之后的成像，A将由011编码，C将由010编码，G将由110编码并且T将由111编码。
中间成像步骤并不重要，因为第一成像步骤和第三成像步骤将足以区分A(01)、C(00)、G(10)和T(11)。四种核苷酸类似物的结构呈现于图15中，并且本发明所提供的通用SBS方案的详细实施例呈现于图16中。
可以使用具有彼此基本上相同谱特性的任何一对染料，只要其中一种染料在特定的pH下有条件地发出荧光。虽然此实例中使用了生物素和四嗪，但也可以使用其它锚定物和锚定物结合分子对。尽管实例中的可切割接头含有SS基团，但所述接头中可以存在替代性可切割基团。
在此方法的变体中，第二pH 5洗涤和pH 9洗涤是相反的。在这种情况下，在pH 9洗涤之后的成像将指示直接或通过标记(ddA类似物和ddT类似物)的用Cy5标记的两种核苷酸类似物中的任一种的掺入。在随后的pH 5洗涤之后的成像将导致因ddC和ddT类似物上的HCyC-646而获得荧光，其中剩余荧光因ddA和ddG类似物上的Cy5而产生。所有其它步骤以及掺入哪种核苷酸类似物的最终测定与此实例中的上述步骤相同。对于此变体，来自三个成像步骤的数字编码将分别是：101表示G、001表示C、011表示A以及111表示T，并且实际上仅在延伸之后的初始pH 5洗涤和在标记之后的pH 9洗涤之后的图像足以进行序列测定(10表示G、00表示C、01表示A以及11表示T)。
生物素和四嗪锚定物可以用替代性锚定物置换，只要期望的染料分子连接到适当的锚定物结合分子。例如，如果锚定物是苯基二硼酸，则可以使用水杨基异羟肟酸-HCyC-646或水杨基异羟肟酸-Cy5，或者如果锚定物是叠氮化物，则可以使用二苯并环辛炔-HCyC-646或二苯并环辛炔-Cy5。
使用虚拟终止子的此SBS方法的另一示例性实施例在图17-20中公开。使用3'-阻断的核苷酸可逆终止子的类似方法在图21-25中公开。
实例3：用光漂白，用未标记的NRT和荧光ddNTP，使用混合方法进行单色荧光边合成边测序(SBS)，所述荧光ddNTP中的两个具有可切割接头，并且两个具有不可切割接头。
除了通过切割接头来消除荧光，由此去除染料外，两种其它方法还可以导致荧光信号的损失-光漂白和猝灭。在本发明的后续实例中的一些后续实例(实例6、7、11和12)中描述了单色SBS中猝灭方法的使用。本发明所提供的此方法的实例呈现了使用光漂白的单色SBS方法，如在图26中的示例性方案中所示。此方案的核苷酸的通式结构呈现于图27中。
在此实例中，核苷酸中的两个核苷酸具有通过SS接头连接的生物素或Cy5；其它两个核苷酸具有通过不可切割接头连接的生物素或Cy5。为了便于呈现，ddNTP类似物呈现为ddATP-SS-生物素、ddTTP-SS-Cy5、ddCTP-生物素和ddGTP-Cy5。将表面上的大多数模板-环-引物(或其它模板-结合引物布置中的引物)用可逆终止子延伸，之后用上述四种ddNTP类似物进行延伸，所述可逆终止子为例如，3'-O-叠氮基甲基-dNTP或3'-O-烷基二硫代甲基-dNTP，其中烷基包含甲基、乙基或叔丁基部分。成像将揭示通过ddG类似物或ddT类似物的掺入而产生的Cy5荧光。在与链霉亲和素-Cy5进行随后的标记反应以将Cy5连接到ddA类似物和ddC类似物上的生物素之后，第二轮成像将产生所有四个核苷酸的累积荧光。接下来，将二硫键切割以从ddA类似物和ddT类似物中去除染料分子并恢复用可逆终止子延伸的引物上的3'-OH基团。只有在掺入ddC类似物或ddG类似物的情况下，成像才会揭示Cy5荧光。最后，使用相同的激光发射执行光漂白，但功率更高或时间更长。这将消除ddC类似物和ddG类似物上残留的染料的荧光。系统现在设置为SBS的第二个循环。
使用其中1指示阳性Cy5信号并且0指示背景信号的典型的编码方案，用在延伸、标记和猝灭步骤之后的成像，A的掺入将由010编码，C的掺入将由011编码，G的掺入将由111编码，并且T的掺入将由110编码；考虑到这些成像步骤中的仅第一步骤和第三步骤，所述编码将是：00表示A，01表示C，11表示G以及10表示T。
ddNTP类似物的实例呈现于图28中，并且本发明所提供的方法的详细实施例呈现于图29中。任何可以有效光漂白的染料都可以用于此方法。尽管实例中的可切割接头含有SS基团，但所述接头中可以存在替代性可切割基团。
实例4：用未标记的NRT和荧光ddNTP以及一个可切割接头，使用混合方法进行双色荧光边合成边测序(SBS)。
此双色SBS方法的实例示出于示例性图31中，并且基本上与实例1中所提供的本发明的一般方法相同，除了在ddNTP类似物中的两种上连接第二染料而不是生物素之外，与第一染料相比，所述第二染料具有不同的吸光度和发射谱。此类核苷酸的通式结构呈现于图30中。只有在两个连续的延伸步骤之后才需要成像。为了便于呈现，ddNTP类似物是ddATP-SS-Alexa488、ddTTP-SS-Cy5、ddCTP-SS-Alexa488和ddGTP-SS-Cy5。在第一延伸步骤中，在存在过量的四种叠氮基甲基-dNTP(或其它核苷酸可逆终止子)的情况下，添加仅ddATP-SS-Alexa488和ddTTP-SS-Cy5。接下来是第一成像步骤，其中Alexa488的阳性信号将揭示A的掺入，并且Cy5的阳性信号将揭示T掺入。在存在较高浓度的叠氮基甲基-dATP和叠氮基甲基-dTTP的情况下，用ddCTP-SS-Alexa488和ddGTP-SS-Cy5执行第二延伸步骤。
执行第二成像步骤；Alexa488信号将指示C的掺入，并且Cy5信号将指示G的掺入。将用THP执行切割以切割所有接头，从而去除任何染料并且还切割NRT上的叠氮基甲基阻断基。如在实例1中，大部分(>95％)引物是通过NRT延伸的，其中掺入足够数量的具有ddNTP类似物的引物以获得令人满意的信号，因为任何用ddNTP类似物延伸的引物都会在另外的测序循环中损失。
此方法与实例1共享许多相同的优势。这些优势消除了第二可切割基团的使用和标记步骤的要求，尽管此方法需要两个标记。实例中使用的ddNTP类似物呈现于图30中。
其它染料对(例如，Cy5和BodipyFL)也可以用于这种双色方法。尽管实例中的可切割接头含有SS基团，但所述接头中可以存在替代性可切割基团。
相同的设计也可以与标准SBS设计中的NRT或者虚拟终止子一起使用。在这些情况下，将最佳量的未标记未标记的3'-O-叠氮基甲基dNTP或其它可逆终止子与经标记的核苷酸类似物一起添加以维持聚合酶反应的保真度，并且通常在添加经标记的核苷酸之后，用例如未标记的3'-O-叠氮基甲基dNTP进行另外的追加延伸步骤。
实例5：使用一组正交的ddNTP类似物，利用狄尔斯－阿尔德哒嗪消除反应(Diels-Alder Pyridazine Elimination Reaction)进行单色边合成边测序，所述一组正交的ddNTP类似物具有SS连接的染料或锚定物或TCO-氨基甲酸酯连接的染料或锚定物。
报道了一种新型“点击释放”化学(Rossin等人2016，2018；Versteegen等人2018)，其中与标签连接的TCO氨基甲酸酯键可以被四嗪切割，从而释放标签和二氧化碳。这些作者开发了用于触发抗体药物缀合物的药物释放的方法。
本文所公开的是，此概念可以意外地适用于创建一种完全新型方法，所述方法消除了用于执行单色SBS的偶氮基接头(或可以替代其它已建立的接头，如烯丙基或2-硝基苄基)的使用。在涉及双脱氧核苷酸的混合方法中描述并例示了此方法，如在此部分中所描述的并在图33中所例示的。
四种不同的核苷酸被设计成具有图32中所展示的通式结构。在此实例中，前两种被示出为ddNTP类似物，其中Cy5(示出为ddA)或生物素(示出为ddG)通过SS键连接到碱基。其它两种是ddNTP类似物，其中Cy5(示出为ddT)或生物素(示出为ddC)通过TCO-氨基甲酸酯接头连接到碱基。通常，将表面上的大多数模板-环-引物(或其它模板-结合引物布置中的引物)用可逆终止子，如3'-O-叠氮基甲基dNTP延伸，之后用上述四种ddNTP类似物进行延伸。在这一步骤之后，成像将揭示通过ddA类似物或ddT类似物的掺入而产生的Cy5荧光。用链霉亲和素-Cy5进行标记将染料连接到ddG类似物和ddC类似物上的生物素，从而产生所有四个核苷酸的累积荧光。接下来，将四嗪添加以点击TCO部分，从而触发消除二氧化碳，并从ddC类似物和ddT类似物中释放染料。最后，将二硫键切割以去除ddNTP类似物的所有染料分子，并恢复用可逆终止子延伸的引物上的3'-OH基团，以便进行下一个SBS循环。在这种情况下，考虑到延伸、标记和切割反应之后的成像，其中1是阳性Cy5信号并且0指示背景Cy5信号，A的掺入由111编码，C的掺入由010编码，T的掺入由110编码，并且G的掺入由011编码；考虑到这些成像步骤中的仅第一步骤和第三步骤，编码结果如下：11表示A，00表示C，10表示T，并且01表示G。可以在本发明的此一般SBS方法中使用的示例ddNTP类似物呈现于图34中。此一般SBS方案的详细实施例示出于图35中。也可以使用替代性染料和替代性锚定物以替代接头1中的SS可切割基团。
相同的设计也可以与标准SBS设计中的NRT或者虚拟终止子一起使用。在这些情况下，通常在添加经标记的核苷酸之后，用例如未标记的3'-O-叠氮基甲基dNTP进行追加延伸步骤。
实例6：利用染料猝灭剂，使用一组ddNTP类似物进行单色边合成边测序，所述一组ddNTP类似物均具有SS接头，一种具有仅染料，一种具有染料和锚定物1，一种具有仅锚定物1，以及一种具有锚定物1和锚定物2两者。
Carlson等人(2018)描述了使用BHQ-四嗪化合物进行先前方法中所描述的点击释放反应。本文公开了即使没有消除反应，BHQ-四嗪也可以意外地用作方便且有效的结合分子以通过其与TCO结合的能力使猝灭剂与核苷酸类似物上的染料足够接近，从而使另一种单色荧光SBS方法成为可能。
本发明所提供的此通用SBS方法首先在组合的ddNTP/NRT方法的上下文中进行描述，其实例示出于图37中的一般方案中。四种不同的核苷酸被设计成具有图36中所展示的通式结构。此实例中示出的前两种是ddNTP类似物，其中Cy5(示出为ddA)或生物素(示出为ddG)通过SS接头连接到碱基。第三种是新型ddNTP类似物(示出为ddT)，其中Cy5通过SS接头连接到碱基，并且其中TCO连接到Cy5。最后，第四种ddNTP类似物(示出为ddC)具有通过SS键连接到碱基的生物素和TCO，后者通过短支链连接到所述碱基。
在实例中，将表面上的大多数模板-环-引物用可逆终止子，如3'-O-叠氮基甲基dNTP延伸，之后用上述四种ddNTP类似物进行延伸。在这一步骤之后，成像将揭示通过ddA类似物或ddT类似物的掺入而产生的Cy5荧光。用链霉亲和素-Cy5进行标记将染料连接到ddG类似物和ddC类似物上的生物素，从而产生所有四个核苷酸的累积荧光。接下来用四嗪-BHQ猝灭剂进行温育，所述四嗪-BHQ猝灭剂将连接到ddT类似物和ddC类似物上的TCO基团，从而猝灭这些分子中的Cy5荧光，同时不影响ddA类似物和ddG类似物上Cy5的荧光。最后，将二硫键切割以去除ddNTP类似物的所有染料分子，并恢复用可逆终止子延伸的引物上的3'-OH基团，以便进行下一个SBS循环。
使用其中1指示阳性Cy5信号并且0指示背景信号的典型的编码方案，用在延伸、标记和猝灭步骤之后的成像，A的掺入将由111编码，C的掺入将由010编码，G的掺入将由011编码，并且T的掺入将由110编码；考虑到这些成像步骤中的仅第一步骤和第三步骤，所述编码将是：11表示A，00表示C，01表示G，并且10表示T。
在此SBS方法中，可以使用Cy5和BHQ以外的染料-猝灭剂组合。此SBS方法中有用的示例性核苷酸呈现于图38中。此SBS方法的详细实施例呈现于图39中。可以使用锚定物1和SS可切割基团的其它染料和替代物。此外，锚定物2不限于TCO。任何锚定物都可以用来结合猝灭剂。实际上，如在实例11和12中所示，四嗪用作锚定物，并且TCO-BHQ3是锚定物结合分子-猝灭剂。
本发明还提供了使用可逆终止子替代双脱氧核苷酸类似物的类似SBS方法，例如：(1)使用虚拟终止子类似物的方法，其中可切割的阻断基连接到碱基，如图40-43中例示的；以及(2)使用3'-O-叔丁基-dNTP类似物的方法，如图44-47中例示的。所述方案基本上与ddNTP类似物的方案相同，不同之处在于仅在追加延伸步骤期间需要非荧光可逆终止子。
实例7：使用与四嗪连接的染料猝灭剂，使用一组ddNTP类似物进行单色边合成边测序，所述一组ddNTP类似物中的一种具有Cy5，一种具有pH响应性荧光染料HCyC-646，一种具有Cy5和TCO锚定物并且一种具有HCyC-646和TCO锚定物，均通过SS接头与碱基连接。
通过使用荧光染料，即HCyC-646(实例2)以及使用猝灭剂，即BHQ(实例6)来描述本发明所提供的并在上文例示的SBS方法中的一些方法，所述荧光染料HCyC-646在pH 5-6下显示出荧光，但在更高pH下不显示荧光。在此SBS方法中，将这些概念组合起来以生成另一种新型单色SBS方法。
出于说明目的，使用组合的ddNTP/NRT方法来描述此方法，如在图49中的一般方案中例示的。四种不同的核苷酸被设计成具有图48中所展示的通式结构。前两种核苷酸是ddNTP类似物，其中Cy5(示出为ddA)或HCyC-646(示出为ddT)通过SS接头连接到碱基。其它两种核苷酸还具有通过SS接头连接到碱基的Cy5(示出为ddG)或HCyC-646(示出为ddC)，但具有连接到染料的TCO锚定物。在此示例性方案中，将表面上的大多数模板-环-引物(或其它模板-结合引物布置)用可逆终止子，如3'-O-叠氮基甲基dNTP延伸，之后用上述四种ddNTP类似物进行延伸。在HCyC-646在大约670nm处不发出荧光的pH 9下进行洗涤之后，成像将揭示通过ddA或ddG类似物的掺入而产生的Cy5荧光。随后在pH 5下洗涤将产生ddT和ddC上的HCyC-646的荧光，从而产生所有四种核苷酸的累积荧光。接下来用四嗪-BHQ猝灭剂进行温育，所述四嗪-BHQ猝灭剂将连接到ddG和ddC类似物上的TCO基团，从而猝灭这些分子中的Cy5；在pH 5下洗涤之后，仅ddA和ddT核苷酸类似物将显示荧光。最后，将二硫键切割以去除ddNTP类似物的所有染料分子，并恢复用可逆终止子延伸的引物上的3'-OH基团，以便进行下一个SBS循环。
使用其中1指示阳性Cy5信号并且0指示背景信号的编码方案，用在延伸、标记和猝灭步骤之后的成像，A将由111编码，C将由010编码，G将由110编码，并且T将由011编码；考虑到这些成像步骤中的仅第一步骤和第三步骤，所述编码将是：11表示A，00表示C，10表示G，并且01表示T。此SBS方法中有用的ddNTP类似物的实例呈现于图50中。此SBS方法的详细示例性方案呈现于图51中。可以使用除Cy5和HCyC-646之外的染料、除SS之外的可切割基团和除TCO之外的锚定物。
在此方法的变体中，pH 9洗涤和第一pH 5洗涤是相反的。在这种情况下，在pH 5洗涤之后的成像将指示四种核苷酸类似物中的任一种的掺入。在pH 9洗涤之后的成像将导致损失ddC和ddT类似物上的HCyC-646的荧光，其中剩余荧光因ddA和ddG类似物上的Cy5而产生。所有其它步骤以及掺入哪种核苷酸类似物的最终测定与此实例中的上述步骤相同。在此变体中，基于三个成像步骤的编码将是：111表示A的掺入、100表示C的掺入、110表示G的掺入，并且101表示T的掺入，从技术上讲，仅最后两个成像步骤就足够了(11表示A、00表示C、10表示G，并且01表示T)。
TCO锚定物可以用替代性锚定物置换，只要猝灭剂连接到适当的锚定物结合分子。例如，如果锚定物是生物素，则可以使用链霉亲和素-BHQ，或者如果锚定物是叠氮化物，则可以使用二苯并环辛炔-BHQ。
此通用SBS方法也可以使用NRT或虚拟终止子。在这些情况下，通常在添加经标记的核苷酸之后，用例如未标记的3'-O-叠氮基甲基dNTP进行追加延伸步骤。
实例8：使用一组正交的ddNTP类似物进行单色边合成边测序，所述一组正交ddNTP类似物中的两种具有Cy5(一种具有SS接头并且一种具有SS-TCO接头)，并且两种具有生物素(一种具有SS接头并且一种具有SS-TCO接头)。
上文的实例5介绍了TCO氨基甲酸酯接头的新颖用途和点击切割的概念。尽管TCO接头应被四嗪有效地切割，但在未完全切割的情况下，在此实例中，SS基团位于靠近TCO基团的接头内(即，更靠近碱基)。以这种方式，用THP进行最后的切割应去除所有剩余的染料。此概念在本文中以组合的ddNTP/NRT方法在上下文中示出，所述方法在图53中的一般方案中例示。
四种不同的核苷酸被设计成具有图52中所展示的通式结构。前两种核苷酸是ddNTP类似物，其中Cy5(示出为ddA)或生物素(示出为ddT)通过SS接头连接到碱基。但在这种情况下，其它两种核苷酸还具有通过含有近端SS基团和更远端TCO基团两者的接头连接到碱基的Cy5(示出为G)或生物素(示出为C)。在此示例性方案中，将表面上的大多数模板-环-引物(或其它模板-结合引物布置中的引物)用可逆终止子，如3'-O-叠氮基甲基dNTP延伸，之后用上述四种ddNTP类似物进行延伸。在洗涤之后，成像将揭示通过ddA类似物或ddG类似物的掺入而产生的Cy5荧光。随后用链霉亲和素-Cy5进行标记将Cy5连接到ddT类似物和ddC类似物，从而产生所有四个核苷酸的累积荧光。接下来用四嗪化合物进行温育，所述四嗪化合物将与ddG类似物和ddC类似物上的TCO基团反应，从而去除Cy5；在洗涤步骤之后，成像将产生仅ddA和ddT核苷酸类似物的荧光。最后，将二硫键切割以从ddNTP类似物中去除所有染料分子，并恢复用可逆终止子延伸的引物上的3'-OH基团，以便进行下一个SBS循环。使用其中1指示阳性Cy5信号并且0指示背景信号的典型的编码方案，用在延伸、标记和猝灭步骤之后的成像，A将由111编码，C将由010编码，G将由110编码，并且T将由011编码；考虑到这些成像步骤中的仅第一步骤和第三步骤，所述编码将是：11表示A，00表示C，10表示G，并且01表示T。
在本发明所提供的此SBS方法中有用的ddNTP类似物的实例呈现于图54中。此SBS方法的详细实施例呈现于图55中。可以使用除Cy5之外的染料、除SS之外的可切割基团和除生物素之外的锚定物。此外，其它可切割基团可以置换TCO，前提是其被高效且特异性地切割。
本文公开了本发明所提供的类似的SBS方法。使用虚拟终止子类似物替代双脱氧核苷酸类似物的方法在图56-59中例示。使用3'-O-叔丁基-dNTP类似物的方法在图60-63中例示。所述方案基本上与ddNTP类似物的方案相同，不同之处在于仅在追加延伸步骤期间需要非荧光可逆终止子。
实例9：使用一组正交的ddNTP类似物进行单色边合成边测序，所述一组正交的ddNTP类似物中的两种具有Cy5(一种具有SS接头并且一种具有SS-TCO氨基甲酸酯接头)，并且两种具有HCyC-646(一种具有SS接头并且一种具有SS-TCO氨基甲酸酯接头)。
本发明所提供的此SBS方法组合了使用HCyC-646的上述方案的特征，以及利用新型点击释放TCO接头的特征，所述HCyC-646是一种具有pH响应性荧光的染料。如在先前的实例中，含有SS接头和TCO接头两者的接头用于ddNTP类似物中的两种。本文在图65中的示例性方案中示出了一种使用组合的ddNTP/NRT格式的此概念的方法。
四种不同的核苷酸被设计成具有图64中所展示的通式结构。前两种核苷酸是ddNTP类似物，其中Cy5(示出为ddA)或HCyC-646(示出为ddT)通过SS接头连接到碱基。但在这种情况下，其它两种核苷酸还具有通过含有近端SS基团(靠近碱基)和更远端TCO基团(靠近染料)两者的接头连接到碱基的Cy5(示出为ddG)或HCyC-646(示出为C)。在此示例性方案中，将表面上的大多数模板-环-引物(或其它模板-结合引物布置)用可逆终止子，如3'-O-叠氮基甲基dNTP延伸，之后用上述四种ddNTP类似物进行延伸。在pH 9下洗涤之后，成像将揭示通过ddA类似物或ddG类似物的掺入而产生的Cy5荧光。在pH 5洗涤之后的后续成像将允许ddT和ddC上的HCyC-646的荧光，从而产生所有四种核苷酸的累积荧光。接下来用四嗪化合物进行温育，所述四嗪化合物将与ddG类似物和ddC类似物上的TCO基团反应，从而去除Cy5；在pH 5下的洗涤步骤之后，成像将产生仅ddA和ddT核苷酸类似物的荧光。最后，将二硫键切割以去除ddNTP类似物的所有染料分子，并恢复用可逆终止子延伸的引物上的3'-OH基团，以便进行下一个SBS循环。
使用其中1指示阳性Cy5信号并且0指示背景信号的典型的编码方案，用在延伸、标记和猝灭步骤之后的成像，A将由111编码，C将由010编码，G将由110编码，并且T将由011编码；考虑到这些成像步骤中的仅第一步骤和第三步骤，所述编码将是：11表示A，00表示C，10表示G，并且01表示T。此SBS方法中有用的ddNTP类似物的实例呈现于图66中。此新型SBS方法的详细实例呈现于图67中。可以使用除Cy5之外的染料、除SS之外的可切割基团和除生物素之外的锚定物。也可以使用HCyC-646以外的有条件的荧光染料。
在此方法的变体中，pH 9洗涤和第一pH 5洗涤是相反的。在这种情况下，在pH 5洗涤之后的成像将指示四种核苷酸类似物中的任一种的掺入。在pH 9洗涤之后的成像将导致损失ddC和ddT类似物上的HCyC-646的荧光，其中剩余荧光因ddA和ddG类似物上的Cy5而产生。所有其它步骤以及掺入哪种核苷酸类似物的最终测定与此实例中的上述步骤相同。在此变体中，基于三个成像步骤的编码是：111表示A、100表示C、110表示G，并且101表示T。在仅第二成像步骤和第三成像步骤之后的成像就足够了，在这种情况下，编码将是：11表示A、00表示C，10表示G，并且01表示T。本文公开了此实例使用可逆终止子替代ddNTP混合方法的等效结构和方案：(1)在碱基与标记之间携带阻断基的虚拟终止子(图68-71)，或(2)3'-阻断的核苷酸可逆终止子(图72-75)。
实例9A使用一组正交的ddNTP类似物进行单色边合成边测序，所述一组正交ddNTP类似物中的两种具有Cy5(一种具有SS接头并且一种具有替代性可切割接头)，并且两种具有HCyC-646(一种具有SS接头并且一种具有替代性可切割接头)。
在实例9的此版本中，唯一的区别是在需要四嗪点击切割反应的核苷酸类似物中的两种上使用可切割基团，如偶氮基、2-硝基苄基或烯丙基而不是TCO氨基甲酸酯接头。其它两种核苷酸类似物仍然具有SS接头。具有替代性可切割基团的核苷酸可以另外在碱基与此第二可切割基团之间具有SS基团。SBS方案和数字编码在其它方面与在实例9中示出的相同，其中在点击切割反应中不使用四嗪，而是用连二亚硫酸钠对偶氮基进行切割，用340nm光对2-硝基苄基进行切割，或用Pd(0)对烯丙基进行切割。
实例10：用两个延伸步骤，使用一组ddNTP类似物进行单色边合成边测序，所述一组ddNTP类似物均具有SS接头，两种具有Cy5并且两种具有HCyC-646。
此实例避免了使用标记步骤或猝灭步骤，有利的是仅需要在不同pH下进行洗涤，并在最后进行常规THP切割。为了实现这一点，一次添加核苷酸类似物中的两种。出于说明目的，此新颖SBS方法以组合的ddNTP/NRT格式示出，如在图77中例示。四种不同的核苷酸被设计成具有图76中所展示的通式结构。所有核苷酸是ddNTP类似物，其中Cy5(示出为ddA和ddG)或HCyC-646(示出为ddT和ddC)通过容易切割的SS接头连接到碱基。在存在足够的3'-O-叠氮基甲基dNTP的情况下，用ddA类似物和ddT类似物进行第一延伸以使表面上的大多数(>95％)模板-环-引物(或其它模板-结合引物布置中的引物)用可逆终止子延伸，其中充分掺入ddATP类似物或ddTTP类似物以揭示荧光。在pH 5下洗涤之后，成像将揭示Cy5和HCyC-646荧光，从而分别指示ddA类似物或ddT类似物的掺入。接下来，向ddCTP类似物和ddGTP类似物中添加过量的3'-O-叠氮基甲基dA和dT以确保高保真掺入。在pH 5洗涤之后的成像将揭示Cy5或HCyC-646荧光，从而指示ddC或ddG的掺入。切换到pH 9将使HCyC-646荧光降低到接近背景水平。因此，如果先前确定掺入了ddT或ddA，则荧光信号的损失将指示ddT的掺入；并且如果先前确定掺入了ddC或ddG，则所述荧光信号的损失将指示ddC的掺入。最后，将二硫键切割以从ddNTP类似物中去除所有染料分子，并恢复用可逆终止子延伸的引物上的3'-OH基团，以便进行下一个SBS循环。使用其中1指示阳性Cy5或HCyC-646荧光信号并且0指示背景信号的编码方案，用在延伸步骤和pH切换步骤之后的成像，A将由111编码，C将由010编码，G将由011编码，并且T将由110编码。
在此SBS方法中有用的ddNTP类似物的实例呈现于图78中。本发明所提供的此SBS方法的详细实例呈现于示例性图79中。还可以使用除Cy5之外的染料、除SS之外的可切割基团和除HCyC-646之外的有条件的荧光染料。
在此方法的变体中，在其中任一个或两个延伸步骤之后进行的pH 5洗涤和pH 9洗涤可以颠倒。取决于pH 5和pH 9洗涤的顺序，A、C、G和T将获得不同的编码，但所有编码都同样容易解码，虽然在pH 9下进行第一次洗涤，需要额外的洗涤，并且需要4步编码。例如，如果在第一延伸之后，在第一延伸之后在pH 9下的成像，在切换至pH5之后的成像，在第二延伸之后在pH 9下的成像，以及在另一次切换至pH 5之后的成像将导致1111的编码表示A的掺入，0011的编码表示G的掺入，0101的编码表示T的掺入，并且0001的编码表示C的掺入。相同的设计也可以与标准SBS设计中的NRT或者虚拟终止子一起使用。在这些情况下，将最佳量的未标记的3'-O-叠氮基甲基dNTP或其它可逆终止子与经标记的核苷酸类似物一起添加以维持聚合酶反应的保真度，并且通常在添加经标记的核苷酸之后，用例如未标记的3'-O-叠氮基甲基dNTP进行另外的追加延伸步骤。
作为实例，呈现了用可切割荧光3'-叔丁基-SS-dNTP(可逆终止子)替代可切割荧光ddNTP的方法。包含图132中一组通用的染料标记的可切割可逆终止子、图133中方案的简化表示、图134中此变体中使用的可逆终止子的示例结构以及示例性图135中此SBS方法的详细实例。最后，使用此方法，在图136中展示了准确的边合成边测序的20个循环。
实例10-实验结果：展示了合成pH响应性染料HCyC-646并将其连接到ddNTP的能力，以及这些经修饰的ddNTP要通过DNA聚合酶掺入的能力，以及其可以用于在表面上进行边合成边测序方案的证据：
合成了两种HCyC-646标记的ddNTP(ddATP-SS-HCyC-646和ddTTP-SS-HCyC-646)以用于包含ddGTP-SS-Cy5和ddCTP-SS-Cy5以及3'-O-叠氮基甲基dNTP的SBS方案。[这与图77和79基本上相同，但请注意，此处使用的核苷酸类似物与图76和78所示的核苷酸类似物不同。]这些核苷酸类似物的结构呈现于图105中，并且可以使用其的通用SBS方案呈现于图106中。
简而言之，在存在Therminator IX的情况下，将四个3'-O-叠氮基甲基dNTP掺入到大多数引物链(约95％)之后，在存在Thermo Sequenase的情况下添加核苷酸中的两种，即ddATP-SS-HCyC-646和ddCTP-SS-Cy5，以及3'-O-叠氮基甲基dTTP和3'-O-叠氮基甲基dGTP。在pH 5下洗涤之后，成像将产生由于ddATP-SS-HCyC-646或ddCTP-SS-Cy5的掺入而获得的荧光信号。接下来，在存在Thermo Sequenase的情况下，添加剩余的经标记的核苷酸，即ddTTP-SS-HCyC-646和ddGTP-SS-Cy5，以及3'-O-叠氮基甲基dATP和3'-O-叠氮基甲基dCTP。在pH 5下洗涤之后，成像将产生由于ddTTP-SS-HCyC-646或ddGTP-SS-Cy5的掺入而获得的荧光信号。随后的洗涤步骤在pH 9下执行，这将消除用HCyC-646标记的两种ddNTP类似物的荧光。因此，如果先前确定掺入了A或C，则信号损失指示其为A并且剩余信号指示C。类似地，如果先前确定掺入了T或G，则信号损失指示其为T并且剩余信号指示G。最后，接头中SS键的切割将去除染料并且同时恢复用3'-O-叠氮基甲基dNTP中的一个延伸的大多数引物链中的3'-OH基团。
HCyC-646(图107)的合成及其与ddTTP(图107)或与ddATP(图108)缀合的详细合成方案如下：
pH响应性HCyC-646染料的合成基本上以与所报道的方法基本上相同的方式进行(Hilderbrand等人2008)，其中如此处所描述的进行了一些修改(图107)。起始吲哚，即2，3，3-三甲基吲哚鎓-5-磺酸酯(A)和1-(ε-羧戊基)-2，3，3-三甲基吲哚-5-磺酸酯(B)根据所公开的程序制备(Mujumdar等人1993)。
a)HCyC-646甲酯(C)：向1-(ε-羧戊基)-2，3，3-三甲基吲哚-5-磺酸酯(B，884mg，2.5mmol)于甲醇(15ml)中的溶液添加氯丙二醛(266mg，2.5mmol)，并将溶液在厚壁玻璃压力反应器中在70℃下加热30分钟，从而得到青黄色溶液。在冷却之后，添加2，3，3-三甲基吲哚-5-磺酸酯(A，598mg，2.5mmol)并将压力反应器重新密封，并在70℃下加热5小时，从而得到深蓝色溶液。在冷却之后，将溶液在反相C18柱(玻璃柱中填充50g RPC-C18)上浓缩并纯化，其中乙腈于水中的浓度不断增加(0，5-15％)。将用5-15％乙腈于水中洗脱的级分合并，并在真空中浓缩，以得到褐色固体。MALDI TOF MS：C32H38ClN2O8S2计算值为677，实测值为679。
b)HCyC-646酸，D：将上述获得的HCyC-646甲酯(C)在80℃下用1M NaOH(7ml)水解1.5小时。在冷却之后，将溶液用10％水溶液酸化。将HCl和溶液在真空中浓缩。将蓝色溶液在反相C18柱(玻璃柱中填充50g RPC-C18)上纯化，其中乙腈于水中的浓度不断增加(0，5-20％)。将最后洗脱的深蓝色溶液收集并浓缩。这进一步进行阳离子交换色谱法(Dowex 50WX8 H+树脂)，以获得纯D。MALDI TOF MS：计算值为C31H36ClN2O8S2，663.15，实测值为663.5
c)HCyC-646NHS和与5-氨基-SS-ddTTP的缀合(图107和108)：将经干燥的HCyC-646酸(D，11mg，16.5μmol，1当量)溶解于200μL无水DMF中，并且向溶液添加5.5mg的预干燥的N，N-二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)(5.5mg，21.6μmol，1.3当量)和16μL三乙胺(11.7mg，116.2μmol，7当量)。将反应混合物在30℃下搅拌40分钟。使用二氯甲烷和甲醇(4∶1)通过薄层色谱法监测HCyC-646-NHS酯(E)的形成。然后，将溶解于250μL的NaHCO3/NaCO3缓冲液(pH 8.5)中的ddTTP-SS-NH2(Ju等人2018)(1.3mg，1.9μmol)添加到HCyC-646-NHS酯反应混合物中(图107)。将反应在30℃下避光搅拌过夜。使用离子交换色谱法执行纯化，之后进行反相HPLC(HFIP缓冲液和MeOH)。化合物ddTTP-SS-HCyC-646(F)的特征在于MALDI-TOF MS(计算值：1298Da，实测值：1302Da)。所获得的质谱示出于图109中。
类似地，将溶解于无水DMF中的HCyC-646-NHS酯(E)在250μL的NaHCO3/NaCO3缓冲液(pH 8.5)中与ddATP-SS-NH2(1.48mg，2.15μmol)进行反应(图108)。将反应在30℃下避光搅拌过夜。使用离子交换色谱法执行纯化，之后进行反相HPLC纯化(HFIP缓冲液和MeOH)。化合物ddATP-SS-HCyC-646的特征在于MALDI-TOF MS(计算值：1326Da，实测值：1321Da)。所获得的质谱示出于图110中。
具有与HCyC-646缀合的可切割接头的其它类型的核苷酸的合成基本上可以如上所述进行。呈非质子化形式的染料HCyC-646是非荧光的(pH>7)，并且当其是质子化时(pH<6)会变成荧光。HCyC-646的pKa值为6.2。非质子化的和质子化的染料的结构示出于图111中。
接下来执行ddTTP-SS-HCyC-646的延伸和THP切割的溶液测试。
与ddTTP-SS-HCyC-646的延伸反应：
基于如下所示的人p53基因的外显子8的一部分，使用引物E8TT(5'-GATAGGACTCATCACCA-3'[SEQ ID NO：5])和合成DNA模板(5'-ACGGAGAACGAAGAGAAAAGGATAGGACTCATCACCATTAGATGACCCTGCCTTGCCTTGTCGAACTCCACGCACAAACACGGACAGGACCCTCTCTGGCCGCGTGTCTCCTTC-3'[SEQ ID NO∶6])，用ddTTP-SS-HCyC-646执行单碱基DNA延伸反应(SBE)。将2μL的10x浓缩缓冲液、1μL的引物E8TT(MW：5163，100μM)、3μL的外显子8模板(20μM)、1.5μL的核苷酸(ddTTP-SS-HCyC-646，167μM)、1μL的突变DNA聚合酶T9(10U/L)和11.5μL的dH2O合并，总体积为20μL。所述反应由在65℃下持续30秒和在45℃下持续30秒的38个循环组成。MALDI-TOF MS(图112)证实了单碱基延伸，如在谱中6287Da(计算值：6286Da)处的主峰所指示的。未观察到引物峰(5163Da)，从而指示基本上所有引物均进行了延伸并且掺入率为100％。
在载玻片上固定DNA的详细方法：
将5'-氨基修饰的自引发模板DNA溶解于pH为9.0，浓度为30μM的50mM磷酸钠缓冲液中，并使用SpotArray 72微阵列打印机器人(马萨诸塞州的珀金埃尔默公司(PerkinElmer，MA))将其点样在NHS酯衍生的CodeLink载玻片(明尼苏达州的苏莫迪克公司(Surmodics Inc.，MN))上。将载玻片在含有饱和氯化钠溶液的湿度室(humid chamber)中在37℃下温育过夜以固定DNA。通过将载玻片在环境温度下在50mM 3-氨基-1-丙醇于pH为9.0的100mM tris-HCl缓冲液中的溶液中温育2小时来猝灭未反应的NHS酯基。将载玻片在沸水中短暂冲洗，在压缩空气下风干，并在黑暗容器中干燥储存直至使用。将四种不同的模板点样在载玻片上的不同矩形区域中。这些引物-环-模板(自引发模板)被设计成使得SBS反应中第一个掺入的核苷酸类似物将分别是T、G、C和A；第二个掺入的核苷酸类似物将分别是A、A、A和T；并且第三个掺入的核苷酸类似物将分别是G、G、T和T。
在载玻片上测试ddTTP-SS-HCyC-646：为了测试与HCyC-646缀合的核苷酸类似物对SBS反应的效用，在上述载玻片上进行了以下一系列反应、洗涤和成像步骤，其中结果呈现于图113中。通过将60μl的相关溶液放置在覆盖载玻片的所有四个点样的区域的室内来进行所有延伸反应。通过将载玻片浸渍在缓冲溶液中持续不同时间段来执行洗涤。HCyC-646的成像是将载玻片在四色荧光扫描仪中干燥之后进行的，所述四色荧光扫描仪使用633nm激光和中心约670nm的发射窗口。
步骤1：用ddTTP-SS-HCyC-646延伸：将由以下组成的60μL溶液在65℃下持续10分钟：2μL 2μM ddT-SS-HCyC-646、6μL 1U/ul Therminator IX、6μL 10X Thermo Pol缓冲液、46μL水。
步骤2：用Milli-Q水(pH约6)洗涤并执行第一次扫描。
步骤3：在pH为5的0.1M MES(2-[N-吗啉基]乙烷磺酸水合物缓冲液中浸渍3分钟，并执行第二次扫描。
步骤4：在pH为9.8的50mM MES(钠盐)中浸渍3分钟，并执行第三次扫描。
步骤5：用PBS中的0.1％Tween-20洗涤，然后用Milli-Q水洗涤。
步骤6：追加延伸：将由以下组成的60μL溶液在65℃下持续10分钟：5μL各1μM3'-O-N3-dATP、3'-O-N3-dCTP、3'-O-N3-dTTP和3'-O-N3-dGTP、6μL 1U/μL Therminator IX、6μL10X Thermo Pol缓冲液、8μL水)。
步骤7：用PBS中的0.1％Tween-20洗涤，然后用Milli-Q水洗涤。
步骤8：THP切割：将由以下组成的60μL溶液在65℃下持续10分钟并执行第四次扫描：6μL 10X THP、6μL 200mM NaCl、12μL 100mM硼酸钠、36μL水。
步骤9：针对SBS的第二个循环和第三个循环重复步骤1-8(仅在图113中的这些循环中的延伸和pH变化步骤之后示出扫描)。
如图113中所见，第一延伸步骤(面板A)之后的成像仅在载玻片的左侧矩形区域中产生阳性荧光信号，从而指示ddTTP-SS-HCyC-646核苷酸的成功和特异性掺入。在pH 5洗涤之后的成像(面板B)未示出载玻片左侧点样的区域中的荧光信号有任何另外的增加。在pH9.8洗涤之后的成像(面板C)导致荧光信号损失，正如针对HCyC-646染料所预期的那样。最后，在追加延伸和THP切割之后的成像(面板D)再次示出了载玻片的所有区域中的背景荧光信号。在第二个循环中，在再次用ddTTP-SS-HCyC-646延伸并用水(pH 6)洗涤之后的成像(面板E)揭示了仅在载玻片的右侧矩形区域中出现阳性信号，正如针对第二个循环中的T掺入所预期的那样。在pH 9.8洗涤之后的成像(面板F)示出了HCyC-646染料的预期荧光损失。在第三个循环中，在再次用ddTTP-SS-HCyC-646延伸并用水(pH 6)洗涤之后的成像(面板G)揭示了在载玻片最右侧的两个点样的区域中出现阳性信号，正如针对第三个循环中的T掺入所预期的那样。最后，在pH为9.4的tris缓冲液洗涤之后的成像(面板H)导致荧光损失，正如针对HCyC-646所预期的那样。
使用实例10中的单色SBS方法用ddATP-7-SS-HCyC-646、ddTTP-5-SS-HCyC-646、ddCTP-5-SS-Cy5、ddGTP-7-SS-Cy5和四个3'-O-叠氮基甲基dNTP在载玻片上进行连续边合成边测序。使用图106中所展示的方案，如在图114和图115中所展示的，获得了连续边合成边测序结果。在SBS的每个循环中执行以下步骤：
步骤1：将如上文所描述的制备的载玻片与由以下组成的60μl的溶液在65℃下温育10分钟：1μl ddATP-SS-HCyC-646(1μM)、4μl ddCTP-SS-Cy5(0.1μM)、4μl 3'-O-叠氮基甲基-dGTP(0.1μM)、4μl 3'-O-叠氮基甲基-dTTP(0.1μM)、6μl Thermo Sequenase(1单位/μl)、6μl 10x Thermo Sequenase缓冲液、35μl水。将所述载玻片在pH为5的10mM Tris-HCl缓冲液中洗涤，在所述pH下，Cy5和HCyC-646均显示荧光，并且如上文所描述的将所述载玻片成像以检测Cy5或HCyC-646荧光。
步骤2：将载玻片与由以下组成的60μl的溶液在65℃下温育10分钟：1μlddTTP-SS-HCyC-646(1μM)、4μl ddGTP-SS-Cy5(0.1μM)、4μl 3'-O-叠氮基甲基-dCTP(0.1μM)、4μl 3'-O-叠氮基甲基-dATP(0.1μM)、6μl Thermo Sequenase(1单位/μl)、6μl 10x ThermoSequenase缓冲液、35μl水。将所述载玻片在pH为5的10mM Tris-HCl缓冲液中洗涤，在所述pH下，Cy5和HCyC-646均显示荧光，并将所述载玻片重新成像。
步骤3：将所述载玻片用pH为9的10mM Tris缓冲液洗涤，在所述pH下，Cy5而非HCyC-646显示荧光，并将所述载玻片重新成像。
步骤4：将载玻片与由以下组成的60μL的溶液在65℃下温育10分钟并重新成像：6μL 10X THP、6μL 200mM NaCl、12μL 100mM硼酸钠、36μL水。
典型循环的结果如在图114中所展示。在步骤1之后的成像在上图中示出。载玻片最右侧的两个区域示出荧光，从而指示A或C的掺入，因为仅添加了ddATP类似物和ddCTP类似物，并且两者具有在pH 5下发出荧光的染料(分别为HCyC-646和Cy5)。步骤2之后的成像在下一个图中示出。现在荧光出现在载玻片的最左侧的两个区域，从而指示T或G的掺入，因为在这一步骤中添加了ddTTP类似物和ddGTP类似物，并且两者再次都含有在pH 5下发出荧光的染料(分别为HCyC-646和Cy5)。在步骤3之后的成像指示载玻片左侧和右侧区域的荧光损失。因为预期HCyC-646不会在pH 9下显示荧光，而Cy5将在此pH下显示荧光，这揭示了在载玻片的四个区域中的每个区域，即从左到右的T、G、C和A中掺入了哪个碱基。在步骤4之后的成像仅显示由于THP切割染料而产生的背景荧光。
图115示出了单色SBS的4个连续循环的结果，其中左上角、左下角、右下角和右上角的条形图分别指示循环1、2、3和4的结果。在每个条形图中，每组的3个条形指示点样在载玻片的不同区域中的模板，其中六组三个条形从左到右表示模板1、模板2、模板3、模板3、模板4和模板4(模板中的两个模板点样在重复区域中)。在每个条形图中，成像结果(y轴上的任意单位)示出在步骤1(每组3个条形中的左侧条形)之后、步骤2(每组3个条形中的中间条形)之后和步骤3(每组3个条形中的右侧条形)之后。每组3个条形下的编码指示掺入的核苷酸(010表示T，011表示G，111表示C，并且110表示A)。因此，模板1示出了循环1中T的掺入，循环2中A的掺入，循环3中G的掺入以及循环4中A的掺入。在四个连续的SBS循环中的每一个中，获得了针对每个模板的正确的掺入结果。
使用实例10的单色SBS方法，用3'-tBu-SS-dATP-7-SS-HCyC-646、3'-tBu-SS-dCTP-5-SS-Cy5、3'-tBu-SS-dGTP-7-SS-Cy5、3'-tBu-SS-dTTP-5-SS-HCyC-646和四个3'-O-叠氮基甲基dNTP在载玻片上进行连续边合成边测序。
使用图133中所展示的方案的轻微变体，获得了20个碱基的连续边合成边测序结果，如图136中所展示的。
实施了以下程序：
步骤1：将如上文所描述的制备的载玻片与由以下组成的40μl的溶液在65℃下温育10分钟：1μl 0.5μM 3'-tBu-SS-dATP-7-SS-HCyC-646、1μl 0.5μM3'-tBu-SS-dCTP-5-SS-Cy5、4单位的Therminator IX、4μl 10X ThermoPol缓冲液、4μl 20mM MnCl2。
步骤2：将载玻片用pH为5的20μM柠檬酸缓冲液洗涤，并成像。
步骤3：将载玻片与由以下组成的40μl的溶液在65℃下温育10分钟：1μl 0.5μM3'-tBu-SS-dGTP-7-SS-Cy5、1μl 0.5μM 3'-tBu-SS-dTTP-5-SS-HCyC-646、4单位的Therminator IX、4μl 10X ThermoPol缓冲液、4μl 20mM MnCl2。
步骤4：将载玻片用pH为5的20μM柠檬酸缓冲液洗涤，并重新成像。
步骤5：将载玻片用pH为9的20μM Tris缓冲液洗涤，并重新成像。
步骤6：将载玻片与由以下组成的60μl的追加延伸溶液在65℃下温育10分钟，然后在PBS中用0.1％Tween-20洗涤，并用Milli-Q水冲洗：5μl各1μM 3'-O-N3-dATP、3'-O-N3-dCTP、3'-O-N3-dGTP和3'-O-N3-dTTP、6μl 1U/μl Therminator IX、6μl 10XThermoPol缓冲液、8μl水。
步骤7：将载玻片与由以下组成的60μL的溶液在65℃下温育5分钟并重新成像：6μL10X THP、6μL 200mM NaCl、12μL 100mM硼酸钠、36μL水。
荧光核苷酸类似物的浓度在每个循环中都有所增加，从开始时的125nM到第20个循环时的750nM不等。
实例11：用一个延伸步骤和一个猝灭步骤，使用一组ddNTP类似物进行单色边合成边测序，所述一组ddNTP类似物均具有SS接头，两种具有Cy5并且两种具有HCyC-646。
在此实例中，需要一个猝灭步骤，但有利的是，可以同时添加所有四种ddNTP类似物，并且不需要单独的标记步骤。此SBS方法再次利用了有条件的荧光染料，如HCyC-646。如在实例10中，有利的是，仅需要最后的SS切割步骤。
出于说明目的，本发明所提供的此新型SBS方法以组合的ddNTP/NRT格式进行描述，如在图81中所示的方案中例示。四种不同的核苷酸被设计成具有图80中所展示的通式结构。两种核苷酸具有Cy5(ddA和ddG)，并且两种核苷酸具有HCyC-646(ddT和ddC)，然而，虽然所有的核苷酸具有用于结合TCO-BHQ3的四嗪锚定物，均通过SS接头连接到碱基，但一种核苷酸具有Cy5(ddG)并且一种核苷酸具有HCyC-646(ddC)，这将猝灭染料。在此示例性方案中，将表面上的大多数模板-环-引物(或其它模板-结合引物布置中的引物)用可逆终止子，如3'-O-叠氮基甲基dNTP延伸，之后用上述四种ddNTP类似物进行延伸。在pH 9下洗涤之后，成像将揭示通过ddA类似物或ddG类似物的掺入而产生的Cy5荧光。在pH 5洗涤之后的后续成像将允许ddT和ddC上的HCyC-646的荧光，从而产生所有四种核苷酸的累积荧光。TCO-BHQ与ddC和ddG的结合并在pH 5时温育将导致由于这两种核苷酸类似物的猝灭而导致的荧光损失，从而导致荧光仅保留在ddA和ddT类似物上。最后，将二硫键切割以从ddNTP类似物中去除所有染料分子，并恢复用可逆终止子延伸的引物上的3'-OH基团，以便进行下一个SBS循环。使用其中1指示阳性Cy5信号并且0指示背景信号的编码方案，用在延伸、标记和猝灭步骤之后的成像，A将由111编码，C将由010编码，G将由110编码，并且T将由011编码；考虑到这些成像步骤中的仅第一步骤和第三步骤，所述编码将是：11表示A，00表示C，10表示G，并且01表示T。
在此新颖SBS方法中有用的ddNTP类似物的实例呈现于图82中。此SBS方法的详细实例呈现于示例性图83中。可以使用除Cy5之外的染料、除HCyC-646之外的有条件的荧光染料、除SS之外的可切割基团、除四嗪之外的锚定物，以及对所连接的染料具有特异性的各种替代性猝灭剂。
在此方法的变体中，pH 9洗涤和第一pH 5洗涤是相反的。在这种情况下，在pH 5洗涤之后的成像将指示四种核苷酸类似物中的任一种的掺入。在pH 9洗涤之后的成像将导致损失ddC和ddT类似物上的HCyC-646的荧光，其中剩余荧光因ddA和ddG类似物上的Cy5而产生。所有其它步骤以及掺入哪种核苷酸类似物的最终测定与此实例中的上述步骤相同。在此变体中，基于三个成像步骤的编码将是：111表示A、100表示C、110表示G，并且101表示T；如果只考虑最后两个成像步骤，编码将是：11表示A、00表示C、10表示G，并且01表示T。
四嗪锚定物可以用替代性锚定物置换，只要猝灭剂连接到适当的锚定物结合分子。例如，如果锚定物是生物素，则可以使用链霉亲和素-BHQ，或者如果锚定物是叠氮化物，则可以使用二苯并环辛炔-BHQ。
相同的设计也可以与标准SBS设计中的NRT或者虚拟终止子一起使用。在这些情况下，通常在添加经标记的核苷酸之后，用例如未标记的3'-O-叠氮基甲基dNTP进行追加延伸步骤。
实例12：使用一组ddNTP类似物进行单色边合成边测序，从而需要两个延伸步骤、一个标记步骤和一个猝灭步骤，所述一组ddNTP类似物均具有SS接头，两种具有染料并且两种具有染料和锚定物。
在本发明所提供的此新型SBS方法中，与实例10中所提供的方法类似，一次添加ddNTP类似物中的两种。然而，在此方法中，使用了标记和猝灭步骤，而不是使用具有条件荧光的染料。出于说明目的，本文以组合的ddNTP/NRT格式来描述此方法，如在图85中示出的方案中例示的。四种不同的核苷酸被设计成具有图84中所展示的通式结构。所有核苷酸均是ddNTP类似物，其中Cy5通过容易切割的SS接头连接到碱基。但对于这些中的两种(ddC和ddT)，锚定物四嗪还通过相同的接头连接，所述锚定物四嗪被设计成用于连接猝灭剂。在存在足够的3'-O-叠氮基甲基dNTP的情况下，用ddA类似物和ddT类似物进行第一延伸以使表面上的大多数(>95％)模板-环-引物(或其它模板-结合引物布置)用可逆终止子延伸，其中充分掺入ddATP类似物或ddTTP类似物以揭示荧光。接下来，向ddCTP类似物和ddGTP类似物中添加过量的3'-O-叠氮基甲基dA和dT以确保高保真掺入。在洗涤之后的成像将揭示Cy5荧光，从而指示ddC或ddG的掺入。与TCO-BHQ3温育将导致ddC类似物和ddT类似物上的Cy5猝灭，从而产生仅针对ddA类似物和ddG类似物的完全荧光。最后，将二硫键切割以从ddNTP类似物中去除所有染料分子，并恢复用可逆终止子延伸的引物上的3'-OH基团，以便进行下一个SBS循环。使用其中1指示阳性Cy5信号并且0指示背景信号的编码方案，用在延伸、标记和猝灭步骤之后的成像，A将由111编码，C将由010编码，G将由011编码，并且T将由110编码；考虑到这些成像步骤中的仅第一步骤和第三步骤，所述编码将是：11表示A，00表示C，01表示G，并且10表示T。
在此新颖SBS方法中有用的ddNTP类似物的实例呈现于图86中。此SBS方法的更详细的实例呈现于示例性图87中。除Cy5之外的染料、除SS之外的可切割基团以及除四嗪之外的锚定物可以与此方案一起使用。
相同的设计也可以与标准SBS设计中的NRT或者虚拟终止子一起使用。在这些情况下，将最佳量的未标记未标记的3'-O-叠氮基甲基dNTP或其它可逆终止子与经标记的核苷酸类似物一起添加以维持聚合酶反应的保真度，并且通常在添加经标记的核苷酸之后，用例如未标记的3'-O-叠氮基甲基dNTP进行另外的追加延伸步骤。
实例13：使用虚拟终止子核苷酸类似物进行单分子能量转移DNA边合成边测序，从而需要两个延伸步骤和两个标记步骤来连接pH响应性或pH不响应性能量转移受体染料，所述核苷酸类似物含有能量转移供体染料和通过二硫接头连接到碱基的两种锚定物中的任一种。
在上述实例中的一些实例中描述了pH响应性染料HCyC-646的用途。此处，此染料与pH不响应性染料，如Cy5和Cy3一起用于通过完成基于单分子能量转移的DNA边合成边测序。此处描述了虚拟终止子(具有连接到碱基的极大地降低掺入效率的可切割阻断基的核苷酸以及3'-阻断的核苷酸可逆终止子)的方法。由于这是一种单分子方法，所以ddNTP不能用于此方案或实例14中的类似方案。
此方法利用了能量转移(ET)的关键特性。在受体染料具有可忽略的吸光度的波长下激发供体染料；然而，如果这些染料放置在附近，从供体到受体的ET会导致受体染料的发射。这种大的谱分离(“斯托克斯位移(Stokes shift)”)消除了由于存在含有未结合的受体染料的分子而产生的非特异性荧光。由于供体染料的吸收和受体染料的发射之间存在较宽的谱间隙，因此可以使用较宽的带通滤波器来收集更多光子以提高灵敏度，同时避免干涉谱的不期望部分以降低背景荧光，从而允许更高的信噪比和更准确的碱基识别，从而产生单分子SBS。锚定物被用来将供体染料和受体染料带到10nm范围内以实现高效的能量转移。
在虚拟终止子的情况下，将供体染料Cy3和所呈现的实例(图116)中的两种锚定物，即生物素或四嗪中的任一种连接到阻断剂远端的碱基。核苷酸中的两个具有生物素和Cy3，并且其它两个核苷酸具有TCO和Cy3。遵循示例性图117的逻辑，用虚拟终止子中的两个(A和T)执行延伸，两者均具有Cy3，A具有生物素并且T具有四嗪。同时添加链霉亲和素-Cy5和TCO-HCyC-646执行标记步骤。然后用pH为5的缓冲液替换标记缓冲液以允许在激发供体染料Cy3之后从Cy5和HCyC-646两者发射荧光。对剩余的两个虚拟终止子(C和G)重复上述步骤，其与第一对一样，两者均具有Cy3，但C具有生物素并且G具有TCO。用链霉亲和素-Cy5和TCO-HCyC-646执行另一个标记步骤，之后利用能量转移进行另一个pH 5缓冲液洗涤和成像步骤。在pH 9下的最终缓冲液洗涤以及第三成像步骤将澄清掺入了四个虚拟终止子中的哪一个，因为在此pH下，Cy5(在A和C上)将具有阳性荧光信号，但HCyC-646(在T和G上)将仅显示背景荧光。
因此，如果先前确定掺入了A或T并且荧光仍然存在，这指示A掺入；如果荧光损失，这指示掺入了T。类似地，如果先前确定掺入了C或T并且荧光仍然存在，这指示掺入了C；如果荧光损失，这指示掺入了G。
由于两种受体染料的发射曲线几乎相同，就像本文所公开的大多数方法一样，这本质上是一种单色方法。
最后，将用THP执行切割以切割所有接头，从而去除任何染料并且还恢复3'-OH基团。如果阳性信号由整数1指示，并且背景信号由0指示，然后基于在第一延伸步骤和标记步骤以及低pH洗涤之后、在第二延伸步骤和标记步骤以及在低pH洗涤之后以及在随后的高pH洗涤之后的成像，A的掺入将由111编码，C的掺入将由011编码，G的掺入将由010编码，并且T的掺入将由110编码。
中间成像步骤并不重要，因为第一成像步骤和第三成像步骤将足以区分A(11)、C(01)、G(00)和T(10)的掺入。四种核苷酸类似物的结构呈现于图118中，并且本发明所提供的通用SBS方案的详细实施例呈现于图119中。
本文还包含此方案的变体，在所述变体中，第二pH 5温育和pH 9温育的顺序颠倒。在类似的编码方案中，在所有3个成像步骤的情况下，A的掺入将表示为111，C的掺入将表示为011，G的掺入将表示为001，并且T的掺入将表示为101，并且如果仅使用前两个成像步骤，则11表示A，01表示C，00表示G，并且10表示T。
使用3'-阻断的可逆终止子的此SBS方法的另一示例性实施例在图120-123中公开。
在此SBS方法的另一个实施例中，可以用Cy3和已连接在距Cy3的适当距离处的Cy5或HCyC-646合成核苷酸以进行高效的能量转移；在这种情况下，不需要标记步骤。
在此SBS方法的又另一个实施例中，供体染料簇和锚定物以最佳距离相隔，对于单分子SBS可以产生更高的信号和更好的灵敏度。
实例14：使用一组正交的虚拟终止子核苷酸类似物进行单分子能量转移DNA边合成边测序，所述核苷酸类似物含有能量转移供体染料和通过二硫接头或偶氮基接头连接到碱基的两种锚定物中的任一种，所述单分子能量转移DNA边合成边测序需要一个延伸步骤和用于连接pH响应性或pH不响应性能量转移受体染料的一个标记步骤和两个可切割步骤。
此方法类似于实例13，再次涉及使用能量转移和pH响应性和pH不响应性染料作为能量转移受体。然而，在此方案中，除了存在于所有四种核苷酸类似物上的Cy3供体染料外，核苷酸类似物中的每一种还具有不同的接头和锚定物的组合；这允许同时添加所有四种虚拟终止子类似物。
此方法利用了能量转移的关键特性。在受体染料具有可忽略的吸光度的波长下激发供体染料；然而，如果这些染料放置在附近，从供体到受体的ET会导致受体染料的发射。这种大的谱分离(“斯托克斯位移(Stokes shift)”)消除了由于存在含有未结合的受体染料的分子而产生的非特异性荧光。由于供体染料的吸收和受体染料的发射之间存在较宽的谱间隙，因此可以使用较宽的带通滤波器来收集更多光子以提高灵敏度，同时避免干涉谱的不期望部分以降低背景荧光，从而允许更高的信噪比和更准确的碱基识别，从而产生单分子SBS。利用锚定物将供体和受体染料带到10nm范围内以实现高效的能量转移。
在虚拟终止子的情况下，将供体染料Cy3和所呈现的实例(图124)中的两种锚定物，即生物素或四嗪中的任一种连接到阻断剂远端的碱基。在所示实例中，核苷酸(A)中的一个具有通过SS接头连接的生物素和Cy3，第二核苷酸(C)具有通过SS接头连接的四嗪和Cy3，第三核苷酸(G)具有通过偶氮基接头连接的四嗪和Cy3，并且第四核苷酸(T)具有通过偶氮基接头连接的生物素和Cy3。遵循示例性图125的逻辑，同时用四个虚拟终止子执行延伸。同时添加链霉亲和素-Cy5和TCO-HCyC-646执行标记步骤。然后用pH为5的缓冲液替换缓冲液以允许在激发供体染料Cy3之后从Cy5和HCyC-646两者发射荧光。在此成像步骤中，无论掺入了哪种核苷酸，都将获得阳性荧光信号，因为Cy5和HCyC-646两者在此pH下都能很好地发出荧光。将缓冲液切换至pH 9，并且第二成像将导致仅来自C和G核苷酸类似物上的HCyC-646的背景荧光。因此，在此步骤中，阳性荧光信号将指示A或T的掺入，并且背景荧光将指示C或G的掺入。接下来，连二亚硫酸钠对偶氮基接头的切割和在pH 5下的成像将澄清掺入了四个虚拟终止子中的哪一个。
因此，如果先前确定掺入了A或T并且荧光仍然存在，这指示A掺入；如果荧光损失，这指示掺入了T。类似地，如果先前确定掺入了C或T并且荧光仍然存在，这指示掺入了C；如果荧光损失，这指示掺入了G。
由于两种受体染料的发射曲线几乎相同，就像本文所公开的大多数方法一样，这本质上是一种单色方法。
最后，将用THP执行切割以切割SS接头，从而去除任何剩余的染料并且还恢复3'-OH基团。如果阳性信号由整数1指示，并且背景信号由0指示，然后基于在延伸步骤和标记步骤以及低pH洗涤之后、在高pH洗涤之后以及在偶氮基切割和低pH洗涤之后的成像，A的掺入将由111编码，C的掺入将由101编码，G的掺入将由100编码，并且T的掺入将由110编码。
第一成像步骤并不重要，因为第二成像步骤和第三成像步骤将足以区分A(11)、C(01)、G(00)和T(10)的掺入。四种核苷酸类似物的结构呈现于图126中，并且本发明所提供的通用SBS方案的详细实施例呈现于图127中。
本文还包含此方案的变体，其中第一pH 5温育和pH 9温育的顺序颠倒。在类似的编码方案中，在所有3个成像步骤的情况下，A的掺入将表示为111，C的掺入将表示为011，G的掺入将表示为010，并且T的掺入将表示为110，并且如果仅使用第一和第三成像步骤，则11表示A，01表示C，00表示G，并且10表示T。
在这些图中，SS基团在阻断剂的近端(更靠近碱基)，并且偶氮基团在阻断剂的远端(更靠近染料和锚定物)，并且SS基团甚至存在于含有偶氮基接头的分子中。在此构型中，虽然含有偶氮基接头的核苷酸上的染料通过连二亚硫酸钠特异性地去除，但所有核苷酸上的阻断剂在最后的THP处理步骤中被去除。
可以使用具有彼此基本上相同谱特性的任何一对染料，只要其中一种染料在特定的pH下有条件地发出荧光。虽然此实例中使用了生物素和四嗪，但也可以使用其它锚定物和锚定物结合分子对。例如，如果锚定物是苯基二硼酸，则可以使用水杨基异羟肟酸-Cy5或水杨基异羟肟酸-Cy5，或者如果锚定物是叠氮化物，则可以使用二苯并环辛炔-HCyC-646或二苯并环辛炔-Cy5。尽管实例中的可切割接头含有SS基团，但所述接头中可以存在替代性可切割基团。
使用3'-阻断的可逆终止子的此SBS方法的另一示例性实施例在图128-131中公开。
在此SBS方法的另一个实施例中，可以用Cy3和已连接在距Cy3的适当距离处的Cy5或HCyC-646合成核苷酸以进行高效的能量转移；在这种情况下，不需要标记步骤。
在此SBS方法的又另一个实施例中，供体染料簇和锚定物以最佳距离相隔，对于单分子SBS可以产生更高的信号和更好的灵敏度。
核苷酸类似物合成
用于合成本文所呈现的一些新型核苷酸类似物的方法可以在图88-103和以下描述中找到。
ddNTP-SS-标记(染料或锚定物)-TCO(图88、图89和图90)的合成开始于5-羟基-TCO，其通过用DSC和TEA处理，通过氨基甲酸酯键与α-氨基保护性赖氨酸的6-NH2偶联。在用哌啶去除α-氨基保护基Fmoc之后，染料(例如，Cy5)NHS酯或锚定物(例如，生物素)NHS酯用于标记TCO衍生的赖氨酸，从而得到染料(例如，Cy5)或锚定物(例如，生物素)标记的TCO-赖氨酸，其进一步用TFA NHS处理，从而产生染料或锚定物标记的TCO-赖氨酸-NHS酯。染料或锚定物标记的TCO-赖氨酸-NHS酯可以用于与氨基-SS(DTM)接头偶联，并进一步转化为染料或锚定物标记的TCO-SS(DTM)接头-NHS酯，其可以与氨基衍生的ddNTP(ddNTP-NH2)偶联以产生ddNTP-SS-标记(染料或锚定物)-TCO(图88)。染料或锚定物标记的TCO-赖氨酸-NHS酯也可以用于与氨基-SS(DTM)接头衍生的ddNTP(ddNTP-SS-NH2)偶联以产生ddNTP-SS-标记(染料或锚定物)-TCO(图89、图90)。
四嗪BHQ3缀合物可以通过偶联可商购获得的BHQ3 NHS酯和四嗪-NH2来合成(图91)。BHQ3 NHS酯和HCyC646 NHS酯可以与可商购获得的TCO-PEG-NH2偶联以产生TCO-HCyC646和TCO-BHQ3缀合物(图92、图93)。HCyc-646 NHS酯的合成示出于图94中。
氨基-SS(DTM)接头衍生的ddNTP(ddNTP-SS-NH2)的合成开始于炔丙醇衍生的SS(DTM)接头，所述接头首先与叠氮基丙酸偶联，然后转化为TFA保护的氨基-SS(DTM)接头NHS酯。所得SS接头NHS酯可以与氨基衍生的ddNTP(ddNTP-NH2)偶联以产生氨基-SS(DTM)接头衍生的ddNTP(ddNTP-SS-NH2)。HCyC-646NHS酯和ddNTP-SS-NH2的偶联产生ddNTP-SS-HCyC-646(图95)。
NHS-反式环辛烯-标记(染料或锚定物)的合成(图96)：遵循所报道的方法(Rossin2016)，从羧酸环辛烯开始，在羧酸环辛烯附近引入甲基以防止内酯水解期间的差向异构化，并实现区域选择性缀合。碘内酯化和随后的碘化氢消除会产生烯内酯。水解得到期望的开环环辛烯，其中羟基相对于甲酯顺式定位。UV照射提供了两种可能的TCO异构体的混合物，其中羟基分别位于轴向和赤道位置中，并且甲酯分别位于赤道和轴向位置中。在甲酯水解之后，直接分离得到预期的异构体(HOOC-TCO-OH)。DSC激活导致TCO的双NHS衍生物，并且随后与1当量染料-NH2(Cy5)或锚定物-NH2(生物素)反应以相对于位阻型NHS酯与NHS-碳酸酯进行期望的选择性反应，从而产生轴向NHS-TCO-染料或NHS-TCO-锚定物(图96)。
NHS-TCO-染料或NHS-TCO-锚定物用于在DMF/0.1M Na2CO3/NaHCO3缓冲液(pH8.8)中与ddNTP-NH2偶联，以得到ddNTP-TCO-染料(或锚定物)(图97)。
ddNTP-SS-标记(染料或锚定物)-四嗪(图98，图99)的合成开始于羧酸衍生的四嗪，其通过用DSC和TEA处理，通过酰胺键与α-氨基保护性赖氨酸的6-NH2偶联。在用哌啶去除α-氨基保护基Fmoc之后，染料(例如，Cy5)NHS酯或锚定物(例如，生物素)NHS酯用于标记四嗪衍生的赖氨酸，从而得到染料(例如，Cy5)或锚定物(例如，生物素)标记的四嗪-赖氨酸，其进一步用TFA NHS处理，从而产生染料或锚定物标记的四嗪-赖氨酸-NHS酯。染料或锚定物标记的四嗪-赖氨酸-NHS酯可以用于与氨基-SS(DTM)接头偶联，并进一步转化为染料或锚定物标记的四嗪-SS(DTM)接头-NHS酯，其可以与氨基衍生的ddNTP(ddNTP-NH2)偶联以产生ddNTP-SS-标记(染料或锚定物)-四嗪(图98)。染料或锚定物标记的四嗪-赖氨酸-NHS酯也可以用于与氨基-SS(DTM)接头衍生的ddNTP(ddNTP-SS-NH2)偶联以产生ddNTP-SS-标记(染料或锚定物)-四嗪(图99)。
NHS-TCO-染料或NHS-TCO-锚定物用于与氨基和末端炔衍生的3'，5'-二磷酸核苷酸(作为虚拟终止子中的掺入阻断部分)两者偶联以得到炔烃-二磷酸-TCO-染料(或锚定物)，其通过Cu(I)催化的点击反应进一步与叠氮基和SS(DTM)衍生的dNTP(dNTP-SS-N3)偶联，以产生dNTP-SS-阻断剂-TCO-锚定物(以生物素为例)和dNTP-SS-阻断剂-TCO-染料(以HCyC-646为例)(以图100和图101为例)。
NHS-TCO-染料或NHS-TCO-锚定物用于在DMF/0.1M Na2CO3/NaHCO3缓冲液(pH8.8)中与3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS-NH2偶联，以得到3'-O-SS(DTM)-dNTP-SS-TCO-染料(或锚定物)(以图102、图103为例)。
从上文应当理解，虽然已经展示和描述了特定实施方案，但是可以对其进行各种修改并且在本文中设想到。本发明也并不旨在受说明书内提供的具体实例限制。尽管已经参考上述说明书描述了本发明，但本文中的优选实施例的描述和说明并不打算以限制意义理解。此外，应当理解，本发明的所有方面不限于本文所阐述的取决于各种条件和变量的特定描绘、配置或相对比例。本发明的实施例的形式和细节的各种修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的。因此，可设想到，本发明还应覆盖任何此类修改、变化和等效物。以下权利要求旨在限定本发明的范围并且由此覆盖在这些权利要求和其等效物的范围内的方法和结构。
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Claims (138)
1.一种核苷酸类似物，其具有以下结构：
其中：
碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或其类似物；
可切割接头包括DTM、偶氮基、2-硝基苄基、烯丙基、叠氮基甲基或TCO衍生物并通过嘧啶(C、U)的5位置或去氮嘌呤(A、G、I)的7位置连接到所述碱基；并且
标记包括荧光染料、pH响应性荧光染料、荧光染料簇、pH响应性荧光染料簇、用于染料连接的锚定物、用于染料连接的锚定物簇、或锚定物和染料。
2.根据权利要求1所述的核苷酸类似物，其中标记选自荧光素、罗丹明、花青、ATTO和Dyomics染料。
3.根据权利要求1所述的核苷酸类似物，其中标记包括Cy3、Cy5或HCyC-646。
4.根据权利要求1所述的核苷酸类似物，其中标记是具有供体染料和受体染料的能量转移染料或能量转移染料簇，其中所述供体染料可以是量子点。
5.根据权利要求4所述的核苷酸类似物，其中标记是能量转移染料，并且所述供体染料是荧光素、CyA、Cy3，并且所述受体染料是罗丹明110、R6G、TAMRA、ROX、Cy5、HCyC-646、Alexa647。
6.根据权利要求1所述的核苷酸类似物，其中标记是锚定物，并且所述锚定物包括生物素、DBCO、TCO或四嗪，并且其中锚定物结合分子包括链霉亲和素、叠氮化物、四嗪或TCO并且进一步包括单一染料、单一染料簇或能量转移染料。
7.根据权利要求6所述的核苷酸类似物，其中所述锚定物结合分子用有机染料或量子点标记。
8.根据权利要求1到6中任一项所述的核苷酸类似物，其中可切割接头是基于DTM的。
9.根据权利要求1到6中任一项所述的核苷酸类似物，其中可切割接头是基于偶氮基的。
10.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求1所述的核苷酸类似物，其中所述四种不同的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物连接有不同的染料。
11.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求1所述的核苷酸类似物，其中所述核苷酸类似物中的两种核苷酸类似物包括第一染料，并且其余两种核苷酸类似物包括第二染料。
12.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求1所述的核苷酸类似物，其中一种类型的染料通过相同的可切割接头连接到所述四种核苷酸中的每一种核苷酸。
13.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求1所述的核苷酸类似物，其中一种类型的染料通过不同的可切割接头连接到所述四种核苷酸中的每一种核苷酸。
14.一种核苷酸类似物，其具有以下结构：
其中：
碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或其类似物；
R包括甲基、乙基、丙基、叔丁基、芳基、烷基芳基；
可切割接头包括DTM、偶氮基、2-硝基苄基、烯丙基、叠氮基甲基或TCO衍生物；并且
标记包括荧光染料、pH响应性荧光染料、荧光染料簇、pH响应性荧光染料簇、用于连接荧光染料的锚定物、用于连接荧光染料的锚定物簇、或锚定物和染料。
15.根据权利要求14所述的核苷酸类似物，其中标记选自荧光素、罗丹明、花青、ATTO和Dyomics染料。
16.根据权利要求14所述的核苷酸类似物，其中标记包括Cy3、Cy5或HCyC-646。
17.根据权利要求14所述的核苷酸类似物，其中标记是具有供体染料和受体染料的能量转移染料或能量转移染料簇，其中所述供体染料可以是量子点。
18.根据权利要求17所述的核苷酸类似物，其中标记是能量转移染料，并且所述供体染料是荧光素、CyA、Cy3，并且所述受体染料是罗丹明110、R6G、TAMRA、ROX、Cy5、HCyC-646、Alexa 647。
19.根据权利要求14所述的核苷酸类似物，其中标记是锚定物，并且所述锚定物包括生物素、DBCO、TCO或四嗪，并且其中锚定物结合分子包括链霉亲和素、叠氮化物、四嗪或TCO并且进一步包括单一染料、单一染料簇或能量转移染料。
20.根据权利要求19所述的核苷酸类似物，其中所述锚定物结合分子用有机染料或量子点标记。
21.根据权利要求14到19中任一项所述的核苷酸类似物，其中可切割接头是基于DTM的。
22.根据权利要求14到19中任一项所述的核苷酸类似物，其中可切割接头是基于偶氮基的。
23.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求14所述的核苷酸类似物，其中所述四种不同的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物连接有不同的染料。
24.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求14所述的核苷酸类似物，其中所述核苷酸类似物中的两种核苷酸类似物包括第一染料，并且其余两种核苷酸类似物包括第二染料。
25.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求14所述的核苷酸类似物，其中一种类型的染料通过相同的可切割接头连接到所述四种核苷酸中的每一种核苷酸。
26.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求14所述的核苷酸类似物，其中一种类型的染料通过不同的可切割接头连接到所述四种核苷酸中的每一种核苷酸。
27.一种核苷酸类似物，其具有以下结构：
其中：
碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或其类似物；
可切割接头包括DTM、偶氮基、2-硝基苄基、烯丙基、叠氮基甲基或TCO衍生物或这些可切割接头中的多于一个可切割接头，包含其中一个可切割接头存在于所述碱基与阻断剂之间并且第二个不同的可切割接头存在于所述阻断剂与标记之间的特殊情况；
阻断剂是包括无碱基糖或经修饰的核苷或其组合的2-50个单体单元的核苷酸或寡核苷酸；并且阻断剂通过可切割接头连接到嘧啶(C、U)的5位置和去氮嘌呤(A、G、I)的7位置；
其中阻断剂是在掺入之后防止另外的核苷酸或核苷酸类似物进一步掺入到引物链中的部分；并且
标记包括荧光染料、pH响应性荧光染料、荧光染料簇、pH响应性荧光染料簇、用于连接荧光染料的锚定物、用于连接荧光染料的锚定物簇、或锚定物和染料，其中所述标记连接到所述阻断剂。
28.根据权利要求27所述的核苷酸类似物，其中标记选自荧光素、罗丹明、花青、ATTO和Dyomics染料。
29.根据权利要求27所述的核苷酸类似物，其中标记包括Cy3、Cy5或HCyC-646。
30.根据权利要求27所述的核苷酸类似物，其中标记是具有供体染料和受体染料的能量转移染料或能量转移染料簇，其中所述供体染料可以是量子点。
31.根据权利要求30所述的核苷酸类似物，其中标记是能量转移染料，并且所述供体染料是荧光素、CyA、Cy3，并且所述受体染料是罗丹明110、R6G、TAMRA、ROX、Cy5、HCyC-646、Alexa 647。
32.根据权利要求27所述的核苷酸类似物，其中标记是锚定物，并且所述锚定物包括生物素、DBCO、TCO或四嗪，并且其中锚定物结合分子包括链霉亲和素、叠氮化物、四嗪或TCO并且进一步包括单一染料、单一染料簇或能量转移染料。
33.根据权利要求32所述的核苷酸类似物，其中所述锚定物结合分子用有机染料或量子点标记。
34.根据权利要求27到32中任一项所述的核苷酸类似物，其中可切割接头是基于DTM的。
35.根据权利要求27到32中任一项所述的核苷酸类似物，其中可切割接头是基于偶氮基的。
36.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求27所述的核苷酸类似物，其中所述四种不同的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物连接有不同的染料。
37.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求27所述的核苷酸类似物，其中所述核苷酸类似物中的两种核苷酸类似物包括第一染料，并且其余两种核苷酸类似物包括第二染料。
38.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求27所述的核苷酸类似物，其中一种类型的染料通过相同的可切割接头连接到所述四种核苷酸中的每一种核苷酸。
39.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求27所述的核苷酸类似物，其中一种类型的染料通过不同的可切割接头连接到所述四种核苷酸中的每一种核苷酸。
40.一种核苷酸类似物，其具有以下结构：
其中：
碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、次黄嘌呤或其类似物；并且
R是可切割化学基团，所述可切割化学基团包括烷基DTM、偶氮基、2-硝基苄基、烯丙基和叠氮基甲基衍生物。
41.一种以下结构的核苷酸类似物：
其中：
碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或其类似物；并且
标记包括荧光染料、pH响应性荧光染料、荧光染料簇、pH响应性荧光染料簇、用于染料连接的锚定物、用于染料连接的锚定物簇、或锚定物和染料。
42.根据权利要求41所述的核苷酸类似物，其中标记选自荧光素、罗丹明、花青、ATTO和Dyomics染料。
43.根据权利要求41所述的核苷酸类似物，其中标记包括Cy3、Cy5或HCyC-646。
44.根据权利要求41所述的核苷酸类似物，其中标记是具有供体染料和受体染料的能量转移染料或能量转移染料簇，其中所述供体染料可以是量子点。
45.根据权利要求44所述的核苷酸类似物，其中标记是能量转移染料，并且所述供体染料是荧光素、CyA、Cy3，并且所述受体染料是罗丹明110、R6G、TAMRA、ROX、Cy5、HCyC-646、Alexa 647。
46.根据权利要求41所述的核苷酸类似物，其中标记是锚定物，并且所述锚定物包括生物素、DBCO、TCO或四嗪，并且其中锚定物结合分子包括链霉亲和素、叠氮化物、四嗪或TCO并且进一步包括单一染料、单一染料簇或能量转移染料。
47.根据权利要求46所述的核苷酸类似物，其中所述锚定物结合分子用有机染料或量子点标记。
48.根据权利要求41到46中任一项所述的核苷酸类似物，其中可切割接头是基于DTM的。
49.根据权利要求41到46中任一项所述的核苷酸类似物，其中可切割接头是基于偶氮基的。
50.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求41所述的核苷酸类似物，其中所述四种不同的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物连接有不同的染料。
51.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求41所述的核苷酸类似物，其中所述核苷酸类似物中的两种核苷酸类似物包括第一染料，并且其余两种核苷酸类似物包括第二染料。
52.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求41所述的核苷酸类似物，其中一种类型的染料通过相同的可切割接头连接到所述四种核苷酸中的每一种核苷酸。
53.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求41所述的核苷酸类似物，其中一种类型的染料通过不同的可切割接头连接到所述四种核苷酸中的每一种核苷酸。
54.一种以下结构的核苷酸类似物：
其中碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或其类似物。
55.一种以下结构的核苷酸类似物：
其中：
碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或其类似物；
标记包括荧光染料、pH响应性荧光染料、荧光染料簇、pH响应性荧光染料簇、用于染料连接的锚定物、用于染料连接的锚定物簇、或锚定物和染料；并且
R包括甲基、乙基、丙基、叔丁基、芳基、烷基芳基。
56.根据权利要求55所述的核苷酸类似物，其中标记选自荧光素、罗丹明、花青、ATTO和Dyomics染料。
57.根据权利要求55所述的核苷酸类似物，其中标记包括Cy3、Cy5或HCyC-646。
58.根据权利要求55所述的核苷酸类似物，其中标记是具有供体染料和受体染料的能量转移染料或能量转移染料簇，其中所述供体染料可以是量子点。
59.根据权利要求58所述的核苷酸类似物，其中标记是能量转移染料，并且所述供体染料是荧光素、CyA、Cy3，并且所述受体染料是罗丹明110、R6G、TAMRA、ROX、Cy5、HCyC-646、Alexa 647。
60.根据权利要求55所述的核苷酸类似物，其中标记是锚定物，并且所述锚定物包括生物素、DBCO、TCO或四嗪，并且其中锚定物结合分子包括链霉亲和素、叠氮化物、四嗪或TCO并且进一步包括单一染料、单一染料簇或能量转移染料。
61.根据权利要求60所述的核苷酸类似物，其中所述锚定物结合分子用有机染料或量子点标记。
62.根据权利要求55到60中任一项所述的核苷酸类似物，其中可切割接头是基于DTM的。
63.根据权利要求55到60中任一项所述的核苷酸类似物，其中可切割接头是基于偶氮基的。
64.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求55所述的核苷酸类似物，其中所述四种不同的核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物连接有不同的染料。
65.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求55所述的核苷酸类似物，其中所述核苷酸类似物中的两种核苷酸类似物包括第一染料，并且其余两种核苷酸类似物包括第二染料。
66.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求55所述的核苷酸类似物，其中一种类型的染料通过相同的可切割接头连接到所述四种核苷酸中的每一种核苷酸。
67.一种组合物，其包括四种不同类型的根据权利要求55所述的核苷酸类似物，其中一种类型的染料通过不同的可切割接头连接到所述四种核苷酸中的每一种核苷酸。
68.一种以下结构的核苷酸类似物：
其中：
碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或其类似物；并且
R包括甲基、乙基、丙基、叔丁基、芳基、烷基芳基。
69.一种以下结构的核苷酸类似物：
其中碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或其类似物。
70.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板和核酸聚合酶，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列；
b)使所述核酸模板与两种不同的经标记的核苷酸类似物接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，以及(B)锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，所述锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的锚定物，
其中所述可切割接头能由相同的切割剂切割；
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(B)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，
其中所述可切割接头和所述3'-OH基团能由相同的切割剂切割；或者
(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(B)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，
其中所述可切割接头能由相同的切割剂切割；
c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)鉴定由于掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)使来自步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物与锚定物结合基团接触，所述锚定物结合基团结合到步骤(b)的所提供的锚定物标记的核苷酸类似物的所述锚定物，其中所述锚定物结合基团包括与步骤(b)的所述荧光标记的核苷酸类似物的所述荧光标记相同的荧光标记；
f)鉴定由于所述锚定物结合基团与步骤(b)的任何掺入的锚定物标记的核苷酸类似物的所述锚定物的结合而产生的任何荧光信号；
g)用两种不同的经标记的核苷酸类似物重复步骤(b)-(f)，所述两种不同的经标记的核苷酸类似物不同于来自步骤(b)的先前迭代的所述两种不同的经标记的核苷酸类似物；
h)从所掺入的核苷酸类似物中切割所述可切割接头，由此从步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物中去除任何标记、锚定物或阻断基；
i)从来自步骤(c)的任何掺入的核苷酸类似物中切割所述3'-O阻断基；以及
j)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(i)，
由此获得所述核酸的序列。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(I)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求1到9或41到49中任一项所述的核苷酸类似物。
72.根据权利要求70所述的方法，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(II)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求14到22或55到63中任一项所述的核苷酸类似物。
73.根据权利要求70所述的方法，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(III)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求27到35中任一项所述的核苷酸类似物。
74.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列，并且提供核酸聚合酶；
b)使所述核酸模板与四种不同的经标记的核苷酸类似物(A、C、T、G)接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，(B)pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，(C)两种不同的锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，其中每种类似物包括通过可切割接头与碱基连接的不同锚定物，
其中所述可切割接头能由相同的切割剂切割；
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，和(B)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(C)两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物，所述两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中每种类似物包括通过可切割接头与所述碱基连接的不同锚定物，
其中所述可切割接头和所述3'-O阻断基能由相同的切割剂切割；或者
(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(C)两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物，所述两种不同的锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中每种类似物包括通过可切割接头与所述碱基连接的不同锚定物，
其中所述可切割接头能由相同的切割剂切割；
c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)在所述pH响应性荧光标记具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)使来自步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物与以下接触：(A)与步骤(b)的所述锚定物标记的核苷酸类似物中的仅一种锚定物标记的核苷酸类似物的所述锚定物结合的锚定物结合基团，其中所述锚定物结合基团包括与步骤(b)的所述荧光标记的核苷酸类似物相同的荧光标记；以及(B)仅与剩余的锚定物标记的核苷酸类似物的所述锚定物结合的锚定物结合基团，其中所述锚定物结合基团包括与步骤(b)的所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物相同的pH响应性荧光标记；
f)在所述pH响应性荧光标记具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的锚定物标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
g)在所述pH响应性荧光标记不再具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗涤来自步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
h)从所掺入的核苷酸类似物中切割所述可切割接头，由此从步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物中去除任何标记、锚定物或阻断基；
i)从来自步骤(c)的任何掺入的核苷酸类似物中切割所述3'-O阻断基；以及
j)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(i)，
由此获得所述核酸的序列。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(I)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求1到9或41到49中任一项所述的核苷酸类似物。
76.根据权利要求74所述的方法，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(II)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求14到22或55到63中任一项所述的核苷酸类似物。
77.根据权利要求74所述的方法，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(III)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求27到35中任一项所述的核苷酸类似物。
78.根据权利要求74所述的方法，其中所述具有pH响应性荧光的标记是HCyC-646，并且具有pH不响应性荧光的标记是Cy5。
79.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板和核酸聚合酶，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列；
b)使所述核酸模板与两种不同的经标记的核苷酸类似物接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，以及(B)pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，
其中所述可切割接头能由相同的切割剂切割；
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(B)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，
其中所述可切割接头和所述3'-O阻断基能由相同的切割剂切割；或者
(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(B)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述可切割接头能由相同的切割剂切割；
c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)在所述pH响应性荧光标记具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)用两种不同的经标记的核苷酸类似物重复步骤(b)-(d)，所述两种不同的经标记的核苷酸类似物不同于来自步骤(b)的先前迭代的所述两种不同的经标记的核苷酸类似物；
f)在所述pH响应性荧光标记具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
其中步骤(e)和(f)可以以相反的顺序执行；
g)从所掺入的核苷酸类似物中切割所述可切割接头，由此从步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物中去除任何标记或阻断基；
h)从来自步骤(c)的任何掺入的核苷酸类似物中切割所述3'-O阻断基；以及
i)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(h)，
由此获得所述核酸的序列。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(I)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求1到9或41到49中任一项所述的核苷酸类似物。
81.根据权利要求79所述的方法，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(II)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求14到22或55到63中任一项所述的核苷酸类似物。
82.根据权利要求79所述的方法，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(III)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求27到35中任一项所述的核苷酸类似物。
83.根据权利要求79所述的方法，其中所述具有pH响应性荧光的标记是HCyC-646，并且具有pH不响应性荧光的标记是Cy5。
84.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板和核酸聚合酶，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列；
b)使所述核酸模板与四种不同的经标记的核苷酸类似物接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过第一可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，(B)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的荧光标记，(C)锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，所述锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头与所述碱基连接的锚定物，以及(D)锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，所述锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的锚定物；
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过第一可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头与所述碱基连接的锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述3'-O阻断基和所述第一可切割接头能由相同的切割剂切割；或者
(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过第一可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基、通过第一可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基、通过氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，
其中每种类似物上的所述荧光标记是相同的，
其中每种类似物上的所述锚定物是相同的；
c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)鉴定由于掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)使来自步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物与锚定物结合基团接触，所述锚定物结合基团结合到步骤(b)的所提供的锚定物标记的核苷酸类似物的所述锚定物，其中所述锚定物结合基团包括与步骤(b)的所述荧光标记的核苷酸类似物的所述荧光标记相同的荧光标记；
f)鉴定由于所述锚定物结合基团与步骤(b)的任何掺入的锚定物标记的核苷酸类似物的所述锚定物的结合而产生的任何荧光信号；
g)使所掺入的核苷酸类似物与四嗪衍生物接触以点击所述氨甲酰基TCO接头的TCO部分以释放通过氨甲酰基TCO接头连接的任何标记或锚定物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
h)使所掺入的核苷酸类似物与切割所述第一可切割接头和任何3'-O阻断基的切割剂接触；以及
i)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(h)，
由此获得所述核酸的序列。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(I)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求1到9或41到49中任一项所述的核苷酸类似物。
86.根据权利要求84所述的方法，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(II)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求14到22或55到63中任一项所述的核苷酸类似物。
87.根据权利要求84所述的方法，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(III)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求27到35中任一项所述的核苷酸类似物。
88.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板和核酸聚合酶，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列；
b)使所述核酸模板与四种不同的经标记的核苷酸类似物接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，(B)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基以及通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记和第一锚定物，(C)锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，所述锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基以及通过可切割接头与所述碱基连接的所述第一锚定物和第二锚定物，以及(D)锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，所述锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的所述第二锚定物，其中所述可切割接头能由相同的切割剂切割；
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记和第一锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述可切割接头与所述碱基连接的所述第一锚定物和第二锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的所述第二锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述可切割接头和所述3'-O阻断基能由相同的切割剂切割；或者
(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基以及在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记和第一锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基以及在所述阻断基的远端与所述碱基连接的所述第一锚定物和第二锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链，以及(D)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的所述第二锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述可切割接头能由相同的切割剂切割，
其中每种类似物上的所述荧光标记是相同的；
c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)鉴定由于掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)使来自步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物与锚定物结合基团接触，所述锚定物结合基团结合到步骤(b)的所述核苷酸类似物的所述第二锚定物，其中所述锚定物结合基团包括与步骤(b)的所述荧光标记的核苷酸类似物的荧光标记相同的荧光标记；
f)鉴定由于所述锚定物结合基团与步骤(b)的任何掺入的核苷酸类似物的所述锚定物的结合而产生的任何荧光信号；
g)使所掺入的核苷酸类似物与第二锚定物结合基团接触，所述第二锚定物结合基团结合到步骤(b)的所述核苷酸类似物的所述第一锚定物并且包括使与所述锚定物结合基团连接到的所述核苷酸类似物连接的任何荧光标记的所述荧光信号猝灭的部分，并且鉴定由于掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
h)使所掺入的核苷酸类似物与切割所述可切割接头和任何3'-O阻断基的切割剂接触；以及
i)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(h)，
由此获得所述核酸的序列。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(I)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求1到9或41到49中任一项所述的核苷酸类似物。
90.根据权利要求88所述的方法，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(II)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求14到22或55到63中任一项所述的核苷酸类似物。
91.根据权利要求88所述的方法，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(III)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求27到35中任一项所述的核苷酸类似物。
92.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板和核酸聚合酶，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列；
b)使所述核酸模板与四种不同的经标记的核苷酸类似物接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过第一可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，(B)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头和在所述第一可切割接头的远端连接的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的荧光标记，(C)锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，所述锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头和在所述第一可切割接头的远端连接的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的锚定物，以及(D)锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，所述锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头与所述碱基连接的锚定物；
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过第一可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头和在所述第一可切割接头的远端连接的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头与所述碱基连接的锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头和在所述第一可切割接头的远端连接的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述3'-OH阻断基和所述第一可切割接头能由相同的试剂切割；或者
(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过第一可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过所述第一可切割接头与所述碱基连接的阻断基和通过所述阻断基远端的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基、通过第一可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)锚定物标记的核苷酸类似物，所述锚定物标记的核苷酸类似物包括碱基、通过所述第一可切割接头与所述碱基连接的阻断基和通过所述阻断基远端的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中每种类似物上的所述荧光标记是相同的，
其中每种类似物上的所述锚定物是相同的；
c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)鉴定由于在步骤(b)中掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)使来自步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物与锚定物结合基团接触，所述锚定物结合基团结合到步骤(b)的所提供的锚定物标记的核苷酸类似物的所述锚定物，其中所述锚定物结合基团包括与步骤(b)的所述荧光标记的核苷酸类似物的所述荧光标记相同的荧光标记；
f)鉴定由于所述锚定物结合基团与步骤(b)的任何掺入的锚定物标记的核苷酸类似物的所述锚定物的结合而产生的任何荧光信号；
g)使所掺入的核苷酸类似物与四嗪衍生物接触以点击所述氨甲酰基TCO接头的TCO部分以释放通过氨甲酰基TCO接头连接的任何标记或锚定物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
h)使所掺入的核苷酸类似物与切割所述第一可切割接头和任何3'-O阻断基的切割剂接触；以及
i)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(h)，
由此获得所述核酸的序列。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(I)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求1到9或41到49中任一项所述的核苷酸类似物。
94.根据权利要求92所述的方法，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(II)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求14到22或55到63中任一项所述的核苷酸类似物。
95.根据权利要求92所述的方法，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(III)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求27到35中任一项所述的核苷酸类似物。
96.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板和核酸聚合酶，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列；
b)使所述核酸模板与四种不同的经标记的核苷酸类似物接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过第一可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，(B)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头和在所述第一可切割接头的远端连接的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的荧光标记，(C)pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头和在所述第一可切割接头的远端连接的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，以及(D)pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记；
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过第一可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头和在所述第一可切割接头的远端连接的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过所述第一可切割接头和在所述第一可切割接头的远端连接的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述3'-OH阻断基和所述第一可切割接头能由相同的试剂切割；或者
(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过第一可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过所述第一可切割接头与所述碱基连接的阻断基和通过所述阻断基远端的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物核苷酸类似物包括碱基、通过第一可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过所述第一可切割接头与所述碱基连接的阻断基和通过所述阻断基远端的氨甲酰基TCO接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，
c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)在所述pH响应性荧光标记不具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)在所述pH响应性荧光标记具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号，其中步骤(d)和(e)可以以相反的顺序执行；
f)使所掺入的核苷酸类似物与四嗪接触以点击所述氨甲酰基TCO接头的TCO部分以释放通过氨甲酰基TCO接头连接的任何标记；
g)在所述pH响应性荧光标记具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
h)使所掺入的核苷酸类似物与切割所述第一可切割接头和任何3'-O阻断基的切割剂接触；以及
i)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(h)，
由此获得所述核酸的序列。
97.根据权利要求96所述的方法，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(I)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求1到9或41到49中任一项所述的核苷酸类似物。
98.根据权利要求96所述的方法，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(II)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求14到22或55到63中任一项所述的核苷酸类似物。
99.根据权利要求96所述的方法，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(III)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求27到35中任一项所述的核苷酸类似物。
100.根据权利要求96所述的方法，其中所述具有pH响应性荧光的标记是HCyC-646，并且具有pH不响应性荧光的标记是Cy5。
101.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板和核酸聚合酶，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列；
b)使所述核酸模板与四种不同的经标记的核苷酸类似物接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，(B)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基以及通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记和锚定物，(C)pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，以及(D)pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基以及通过可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记和锚定物，其中所述可切割接头能由相同的切割剂切割；
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记和锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记和锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述可切割接头和所述3'-O阻断基能由相同的切割剂切割；或者
(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基以及在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记和锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基以及在所述阻断基的远端与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基以及在所述阻断基的远端与所述碱基连接的pH响应性荧光标记和锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述可切割接头能由相同的切割剂切割，
c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)在所述pH响应性荧光标记不具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)在所述pH响应性荧光标记具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号，其中步骤(d)和(e)可以以相反的顺序执行；
f)使来自步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物与锚定物结合基团接触，所述锚定物结合基团结合到步骤(b)的所述核苷酸类似物的所述锚定物，其中所述锚定物结合基团包括使步骤(b)的所述荧光标记的核苷酸类似物的所述荧光标记猝灭的部分；
g)在所述pH响应性荧光标记具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未结合的包括猝灭部分的锚定物结合基团，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
h)使所掺入的核苷酸类似物与切割所述可切割接头和任何3'-O阻断基的切割剂接触；以及
i)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(h)，
由此获得所述核酸的序列。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(I)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求1到9或41到49中任一项所述的核苷酸类似物。
103.根据权利要求101所述的方法，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(II)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求14到22或55到63中任一项所述的核苷酸类似物。
104.根据权利要求101所述的方法，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(III)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求27到35中任一项所述的核苷酸类似物。
105.根据权利要求101所述的方法，其中所述具有pH响应性荧光的标记是HCyC-646，并且具有pH不响应性荧光的标记是Cy5。
106.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板和核酸聚合酶，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列；
b)使所述核酸模板与两种不同的经标记的核苷酸类似物接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，以及(B)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基以及通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记和锚定物，其中所述可切割的接头能由相同的切割剂切割；
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记和锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述可切割接头和所述3'-O阻断基能由相同的切割剂切割；或者
(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基以及在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记和锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述可切割接头能由相同的切割剂切割，
c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)鉴定由于掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)用两种不同的经标记的核苷酸类似物重复步骤(b)-(d)，所述两种不同的经标记的核苷酸类似物不同于来自步骤(b)的先前迭代的所述两种不同的经标记的核苷酸类似物；
f)使来自步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物与锚定物结合基团接触，所述锚定物结合基团结合到步骤(b)的所述核苷酸类似物的所述锚定物，其中所述锚定物结合基团包括使步骤(b)的所述荧光标记的核苷酸类似物的所述荧光标记猝灭的部分；
g)鉴定由于在步骤(b)中掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
h)从所掺入的核苷酸类似物中切割所述可切割接头，由此从步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物中去除任何标记、锚定物或阻断基；
i)从来自步骤(c)的任何掺入的核苷酸类似物中切割所述3'-O阻断基；以及
j)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(i)，
由此获得所述核酸的序列。
107.根据权利要求106所述的方法，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(I)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求1到9或41到49中任一项所述的核苷酸类似物。
108.根据权利要求106所述的方法，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(II)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求14到22或55到63中任一项所述的核苷酸类似物。
109.根据权利要求106所述的方法，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(III)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求27到35中任一项所述的核苷酸类似物。
110.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列，并且提供核酸聚合酶；
b)使所述核酸模板与四种不同的经标记的核苷酸类似物(A、C、T、G)接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，(B)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过不可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，(C)锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，所述锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的锚定物，以及(D)锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物，所述锚定物标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过不可切割接头与所述碱基连接的锚定物；
c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)鉴定由于在步骤(b)中掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)使来自步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物与锚定物结合基团接触，所述锚定物结合基团结合到步骤(b)的所述锚定物标记的核苷酸类似物的所述锚定物；
f)鉴定由于在步骤(b)中掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
g)使步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物与切割步骤(b)的所述核苷酸类似物的所述可切割接头并切割步骤(c)的所述核苷酸类似物的所述3'-O阻断基的试剂接触；
h)鉴定由于在步骤(b)中掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
i)光漂白步骤(b)的所掺入的核苷酸类似物以由此光漂白任何剩余的荧光标记；以及
j)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(i)，
由此获得所述核酸的序列。
111.根据权利要求110所述的方法，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物选自根据权利要求1到9或41到49中任一项所述的核苷酸类似物。
112.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板和核酸聚合酶，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列；
b)使所述核酸模板与两种不同的经标记的核苷酸类似物接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，以及(B)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的不同的荧光标记，其中所述可切割接头能由相同的切割剂切割；
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的不同的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述可切割接头和所述3'-O阻断基能由相同的切割剂切割；或者
(iii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基以及在所述阻断基的远端与所述碱基连接的不同的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，其中所述可切割接头能由相同的切割剂切割；
c)使所述核酸模板与不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的未标记的核苷酸类似物(A、C、T、G)接触，其中所述3'-O阻断基能由与步骤(b)的所述两种经标记的核苷酸类似物的所述可切割接头和/或所述阻断基相同的切割剂切割，并且用所述未标记的核苷酸类似物延伸任何未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)鉴定由于掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)用不同于来自步骤(b)的先前迭代的所述两种不同的经标记的核苷酸类似物的两种不同的经标记的核苷酸类似物重复步骤(b)-(d)，但仅使用与此步骤中添加的所述两种经标记的核苷酸类似物不同的包括3'-O阻断基的两种未标记的核苷酸进行重复；
f)从所掺入的核苷酸类似物中切割所述可切割接头，由此从步骤(b)和(c)的所掺入的核苷酸类似物中去除任何标记或阻断基；
g)鉴定由于在步骤(b)中掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；以及
h)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(g)，
由此获得所述核酸的序列。
113.根据权利要求112所述的方法，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(I)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求1到9或41到49中任一项所述的核苷酸类似物。
114.根据权利要求112所述的方法，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(II)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求14到22或55到63中任一项所述的核苷酸类似物。
115.根据权利要求112所述的方法，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(III)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求27到35中任一项所述的核苷酸类似物。
116.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列，并且提供核酸聚合酶；
b)使所述核酸模板与四种不同的经标记的核苷酸类似物(A、C、T、G)接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)(A)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记，(B)pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，(C)荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基以及通过可切割接头与所述碱基连接接的荧光标记和锚定物，以及(D)pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的双脱氧核苷酸类似物包括碱基以及通过可切割接头与所述碱基连接的pH响应性荧光标记和相同的锚定物，
其中所述可切割接头能由相同的切割剂切割；
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记和锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的荧光标记和相同的锚定物以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，
其中所述可切割接头和所述3'-O阻断基能由相同的切割剂切割；或者
(iii)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基和在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基以及在所述阻断基的远端与所述碱基连接的pH响应性荧光标记，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基以及在所述阻断基的远端与所述碱基连接的荧光标记和锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)pH响应性荧光标记的核苷酸类似物，所述pH响应性荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基以及在所述阻断基的远端与所述碱基连接的pH响应性荧光标记和相同的锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，
其中所述可切割接头能由相同的切割剂切割；
c)用不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的核苷酸类似物延伸未延伸的引物，其中步骤(c)在步骤(b)之前、同时或之后发生；
d)在所述pH响应性荧光标记不具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的经标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
e)在所述pH响应性荧光标记具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何未掺入的核苷酸类似物，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)的锚定物标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
f)使所掺入的核苷酸类似物与锚定物结合基团接触，所述锚定物结合基团结合到步骤(b)的所述核苷酸类似物的所述锚定物并且包括使与所述锚定物结合基团连接到的所述核苷酸类似物连接的任何荧光标记的所述荧光信号猝灭的部分，并且鉴定由于掺入荧光标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号；
g)使所掺入的核苷酸类似物与切割所述可切割接头和任何3'-O阻断基的切割剂接触；以及
h)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(g)，
由此获得所述核酸的序列。
117.根据权利要求116所述的方法，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(I)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求1到9或41到49中任一项所述的核苷酸类似物。
118.根据权利要求116所述的方法，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(II)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求14到22或55到63中任一项所述的核苷酸类似物。
119.根据权利要求116所述的方法，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(III)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求27到35中任一项所述的核苷酸类似物。
120.根据权利要求116所述的方法，其中所述具有pH响应性荧光的标记是HCyC-646，并且具有pH不响应性荧光的标记是Cy5。
121.根据权利要求70到120中任一项所述的方法，其中步骤(c)在步骤(b)之前发生。
122.根据权利要求70到120中任一项所述的方法，其中步骤(c)在步骤(b)之后发生。
123.根据权利要求70到122中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的不具有任何碱基修饰并且包括3'-O阻断基的所述核苷酸类似物是选自权利要求40的核苷酸类似物。
124.根据权利要求70到123中任一项所述的方法，其中将在步骤(c)中添加的所述核苷酸类似物掺入到大于90％的所述核酸模板的引物中。
125.根据权利要求70到124中任一项所述的方法，其中将在步骤(c)中添加的所述核苷酸类似物掺入到大于95％的所述核酸模板的引物中。
126.根据权利要求70到125中任一项所述的方法，其中如果存在锚定物，则所述锚定物包括生物素、TCO、四嗪或DBCO，并且对应的锚定物结合分子包括链霉亲和素、叠氮化物、四嗪和TCO。
127.根据权利要求70到126中任一项所述的方法，其中所述荧光染料包括包含黄嘌呤、花青和ATTO染料的有机染料、量子点以及有机染料和量子点的簇。
128.一种试剂盒，其包括进行根据权利要求70到127中任一项所述的边合成边测序反应所需的适当的核苷酸、标记试剂、猝灭试剂和其它缓冲组分。
129.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板；
b)使所述核酸模板与两种不同的经标记的核苷酸类似物接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)两种荧光标记的核苷酸类似物，所述两种荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头与所述碱基连接的用作能量转移供体的荧光标记、用于连接能量转移受体标记的锚定物、以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，
其中所述可切割接头和所述3'-O阻断基能由相同的切割剂切割；
其中所述核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物具有不同的锚定物；或者
(ii)两种荧光标记的核苷酸类似物，所述两种荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过可切割接头与所述碱基连接的阻断基、以及与所述阻断基远端的碱基接头连接的荧光能量转移供体标记和用于连接能量转移受体标记的锚定物，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，
其中所述可切割接头能由相同的切割剂切割，并且
其中所述核苷酸类似物中的每一种核苷酸类似物具有不同的锚定物；
c)洗去任何未掺入的核苷酸类似物并且使所掺入的核苷酸类似物与两种锚定物结合基团接触，所述两种锚定物结合基团特异性地结合到步骤(b)的所述核苷酸类似物的所述锚定物中的每一种锚定物并且包括用作能量转移受体的部分，
其中所述锚定物结合基团中的一种锚定物结合基团上的所述能量转移受体是pH不响应性标记，并且另一种锚定物结合基团上的所述能量转移受体是pH响应性标记；
d)在所述pH响应性荧光能量转移受体染料标记具有与所述pH不响应性荧光能量转移受体标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何游离标记；
e)将所掺入的核苷酸暴露于能够激发所述能量转移供体染料的波长，并且鉴定由于因在步骤(c)中执行的标记反应而与所述核苷酸类似物连接的所述能量转移受体染料的能量转移和发射而产生的任何荧光信号；
f)用两种不同的经标记的核苷酸类似物重复步骤(b)到(e)，所述两种不同的经标记的核苷酸类似物不同于(b)中的所述两种不同的经标记的核苷酸类似物，但除此之外具有(b)中所描述的所有其它性质；
g)将缓冲液改变到所述pH响应性荧光标记不具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述pH不响应性荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线时的pH，并且鉴定由于掺入来自步骤(b)或(f)的锚定物标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号，其中步骤(e)和(g)的顺序可以相反；
h)使所掺入的核苷酸类似物与切割所述可切割接头和所述3'-O阻断基的切割剂接触；以及
i)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(h)，
由此获得所述核酸的序列。
130.根据权利要求129所述的方法，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(I)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求14到22或55到63中任一项所述的核苷酸类似物。
131.根据权利要求129所述的方法，其中所述两种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(II)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求27到35中任一项所述的核苷酸类似物。
132.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：
a)提供各自与引物杂交的多个核酸模板，其中每个模板具有与待测序的所述核酸相同的序列，并且提供核酸聚合酶；
b)使所述核酸模板与四种不同的经标记的核苷酸类似物(A、C、G、T)接触，并且所述接触在以下条件下进行：如果所述经标记的核苷酸类似物中的一种核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则允许所述核酸聚合酶用所述核苷酸类似物延伸所述引物，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是：
(i)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、和通过第一可切割接头(可切割接头1)与所述碱基连接的用作能量转移供体的荧光标记和用于连接pH不响应性能量转移受体标记的锚定物(锚定物1)、以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、和通过相同的可切割接头(可切割接头1)与所述碱基连接的用作能量转移供体的荧光标记和用于连接pH响应性能量转移受体标记的第二锚定物(锚定物2)两者、以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、和通过第二可切割接头(可切割接头2)与所述碱基连接的用作能量转移供体的荧光标记和用于连接pH不响应性能量转移受体标记的所述第一锚定物(锚定物1)两者、以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、和通过所述第二可切割接头(可切割接头2)与所述碱基连接的用作能量转移供体的荧光标记、用于连接pH响应性能量转移受体标记的所述第二锚定物(锚定物2)两者、以及在3'-OH位置处的阻断基，其中所述阻断基防止随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，
其中所述第一可切割接头和所述3'-O阻断基能由相同的切割剂切割，并且所述第二可切割接头能由不同的切割剂切割；或者
(ii)(A)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过第一可切割接头(可切割接头1)与所述碱基连接的阻断基、以及与所述阻断基远端的碱基接头连接的荧光能量转移供体标记和用于连接pH不响应性能量转移受体标记的锚定物(锚定物1)，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(B)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过第一可切割接头(可切割接头1)与所述碱基连接的阻断基、以及与所述阻断基远端的碱基接头连接的荧光能量转移供体标记和用于连接pH响应性能量转移受体标记的第二锚定物(锚定物2)，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，(C)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过第二可切割接头(可切割接头2)与所述碱基连接的阻断基、以及与所述阻断基远端的碱基接头连接的荧光能量转移供体标记和用于连接pH不响应性能量转移受体标记的所述第一锚定物(锚定物1)，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，以及(D)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基、通过第二可切割接头(可切割接头2)与所述碱基连接的阻断基、以及与所述阻断基远端的碱基接头连接的荧光能量转移供体标记和用于连接pH响应性能量转移受体标记的所述第二锚定物(锚定物2)，其中所述阻断基防止或极大地减少随后的核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中，
其中每个可切割接头能由不同的切割剂切割；
c)洗去任何未掺入的核苷酸类似物并且使所掺入的核苷酸类似物与两种锚定物结合基团接触，所述两种锚定物结合基团特异性地结合到步骤(b)的所述核苷酸类似物的所述锚定物中的每一种锚定物并且包括用作能量转移受体的部分，
其中所述锚定物结合基团中的一种锚定物结合基团上的所述能量转移受体是pH不响应性标记，并且另一种锚定物结合基团上的所述能量转移受体是pH响应性标记；
d)在所述pH响应性荧光能量转移受体染料标记具有与所述pH不响应性荧光能量转移受体标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去任何游离标记；
e)将所掺入的核苷酸暴露于能够激发所述能量转移供体染料的波长，并且鉴定由于因在步骤(c)中执行的标记反应而与步骤(b)中掺入的所述核苷酸类似物连接的所述能量转移受体染料的能量转移和发射而产生的任何荧光信号；
f)将缓冲液改变到所述pH响应性荧光标记不具有与所述荧光标记的核苷酸类似物上的所述pH不响应性荧光标记相同或相似的吸收和发射曲线时的pH，并且鉴定由于因在步骤(c)中执行的标记反应而掺入来自步骤(b)的锚定物标记的核苷酸类似物而产生的任何荧光信号，其中步骤(d)和(f)可以相反；
g)使所掺入的核苷酸类似物与切割所述第二可切割接头的切割剂接触；
h)在所述pH响应性荧光能量转移受体染料标记具有与所述pH不响应性荧光能量转移受体标记相同或相似的吸收和发射曲线的pH下洗去所述切割剂和所释放的标记；
i)重复步骤(e)；
j)使所掺入的核苷酸类似物与切割所述第一可切割接头和所述3'-O阻断基的切割剂接触；以及
k)针对待测序的所述核酸的每个残基迭代地重复步骤(b)到(j)，
由此获得所述核酸的序列。
133.根据权利要求132所述的方法，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(I)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求14到22或55到63中任一项所述的核苷酸类似物。
134.根据权利要求132所述的方法，其中所述四种不同的经标记的核苷酸类似物是步骤(b)(II)的所述核苷酸类似物，并且选自根据权利要求27到35中任一项所述的核苷酸类似物。
135.根据权利要求129到134中任一项所述的方法，其中所述核酸模板分子作为单分子存在于表面上以执行基于单分子能量转移的边合成边测序。
136.根据权利要求129到135中任一项所述的方法，其中所述能量转移供体染料是Cy3，所述pH不响应性能量转移受体染料是Cy5，并且所述pH响应性能量转移受体染料是HCyC-646。
137.根据权利要求129到136中任一项所述的方法，其中所述供体染料和所述受体染料从一开始就存在于所述核苷酸类似物上，由此消除了所述标记步骤。
138.一种试剂盒，其包括进行根据权利要求129到137中任一项所述的边合成边测序反应所需的适当的核苷酸、标记试剂和其它缓冲组分。
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